JP4489353B2 - 融合タンパク質 - Google Patents
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Description
Saito他、1995年、FEBS Lett、371:105〜109頁 Wilde他、2000年、J.Biol.Chem.、275:16478頁 Boston life science、2000年9月6日、プレスリリース Clark他、2000年、Nature、406:532〜535頁 Uehata他、1997年、Nature、389:990頁 Lee他、FASEB J.、15:1886〜1884頁
-細胞内で薬物送達構築体、コンジュゲートまたは融合タンパク質(ポリペプチド)の発現をもたらす条件の下に宿主細胞(細菌または真核生物の)を培養すること(また、薬物送達構築体、コンジュゲートまたは融合タンパク質(ポリペプチド)は、例えば、家畜の乳における組み換えタンパク質の生成などのように、動物において生産するために発現させることができる)および、
精製ステップによって薬物送達構築体、コンジュゲートまたは融合タンパク質(ポリペプチド)を回収することを含む方法に関する。
-細胞内でポリペプチドの発現をもたらす条件の下に宿主細胞を培養すること、および
-精製ステップによってポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。
(1)疎水性:ノルロイシン、メチオニン(Met)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)
(2)中性親水性:システイン(Cys)、セリン(Ser)、スレオニン(Thr)
(3)酸性:アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)
(4)塩基性:アルパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、ヒスチジン(His)、リジン(Lys)、アルギニン(Arg)
(5)鎖の配向性に影響する残基:グリシン(Gly)、プロリン(Pro);および
(6)芳香族:トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)
変異体ポリペプチドは、1つまたは複数の変異を有し、変異は、アミノ酸残基の欠失(例えば、切断)、挿入(例えば、付加)、または置換である。変異体は、天然に存在する(すなわち、自然源から精製または単離される)、または合成(例えば、コード化DNAに対し部位特異的変異誘発を行うことにより、または化学合成などの他の合成法によって製造される)による。したがって、本発明のポリペプチドは、天然に存在するか、あるいは組み換え(すなわち、組み換えDNA技法から調製される)であることは明らかである。
-50個までの塩基単位を含む配列に関しては、各々およびあらゆる個別単位、ならびに単位の部分的範囲を本明細書に具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-反応時間に関しては、1分以上の時間は、各々およびあらゆる個別時間、ならびに、例えば、1分、3から15分、1分から20時間、1から3時間、16時間、3時間から20時間などの1分以上の部分的範囲を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-ポリペプチドに関しては、特定の配列を含み、そのアミノ末端またはそのカルボキシ末端において少なくとも1つのアミノ酸の付加を有するポリペプチド類似体は、例えば、1、2、3、10、18、40などの各々およびあらゆる個別の可能性を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-ポリペプチドに関しては、特定のアミノ酸配列と一致する少なくとも90%のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体は、例えば、特定のアミノ酸配列と一致する90%、90.5%、91%、93.7%、97%、99%などのアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体などの各々およびあらゆる個別の可能性(100%は除く)を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-ポリペプチドに関しては、特定のアミノ酸配列と一致する少なくとも70%のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体は、例えば、特定のアミノ酸配列と一致する70%、72.3%、73%、88.6%、98%などのアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体などの各々およびあらゆる個別の可能性(100%は除く)を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-ポリペプチドに関しては、特定のアミノ酸配列と一致する少なくとも50%のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体は、例えば、特定のアミノ酸配列と一致する50%、54%、66.7%、70.2%、84%、93%などのアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体などの各々およびあらゆる個別の可能性(100%は除く)を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-ポリペプチドに関しては、少なくとも1つの輸送剤領域を含むポリペプチドは、例えば、1、2、5、10個の輸送剤領域を有するポリペプチドなどの各々およびあらゆる個別の可能性を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-低圧、濃度、要素などの他のパラメータに関しても同様である。
a)上記のように成長阻害性基質上で細胞を培養し、Rhoアンタゴニスト候補に曝露する。
b)ステップa)の細胞をホモジナイズし、プルダウンアッセイを行う。このアッセイは、GST-RhotektinのGTP結合Rhoとの結合能に基づいている。組み換えGST-rhotekitinまたはGST rhotektin結合ドメイン(GST-RBD)を、a)と同様に培養した細胞から作製した細胞ホモジネートに加える。阻害性基質はRhoを活性化し、この活性化RhoはGST-RBDによってプルダウンされることが分かっている。RhoアンタゴニストはRhoの活性化を妨害するはずであり、したがって、上記のa)に記載したように細胞を培養した場合に、有効なRhoアンタゴニストはRhoの検出を妨害するはずである。
c)このプルダウンアッセイの代替法は、(DiekmannおよびHall、1995年、Methods in Enzymology、第256巻、パートB、207〜215頁)に記載のように、活性化RhoをプルダウンするアッセイにおけるおとりとしてGTPアーゼ活性化タンパク質Rho-GAPを用いるものである。
a)形質移入により、mycエピトープタグ、またはGSTタグもしくは任意の好適なタグを付けられた組み換えRhoキナーゼをHeLa細胞または別の好適な細胞タイプ中で発現させる。
b)特異的タグ(例えば、mycタグまたはGSTタグ)を対象とする抗体を用いる免疫沈降により、細胞ホモジネートからキナーゼを精製する。
c)b)から回収した免疫沈降物を、Rhoキナーゼ阻害剤の存在下または非存在下で基質としての[32P]ATPおよび2型ヒストンと共にインキュベートする。Rhoキナーゼ阻害剤活性の非存在下では、Rhoキナーゼはヒストンをリン酸化した。Rhoキナーゼ阻害剤活性の存在下では、Rhoキナーゼのリン酸化活性(すなわち、ヒストンのリン酸化)は妨害され、このようにして化合物がRhoキナーゼアンタゴニストであると識別される。
C3APLは、C3をコードするcDNA(DillonおよびFeig、1995年、256:174〜184頁)を、アンテナペディアホメオドメインをコードするcDNA(Bloch-Gallego、1993年、120:485〜492頁)とライゲーションすることによって作製されたタンパク質に与えられた名前である。DNAの3'末端における終止コドンは、プライマー(オリゴヌクレオチド)5'GAATTCTTTAGGATTGATAGCTGTGCC3'(配列番号1)および5'GGTGGCGACCATCCTCCAAAA3'(配列番号2)を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってEcoR I部位で置き換えた。PCR産物をpSTBlue-1ベクター(Novage、市)中にサブクローニングし、次いでBamH IおよびNot I制限部位を用いてpGEX-4Tベクター中にクローニングした。このベクターをpGEX-4T/C3と呼んだ。pGEX-4T/C3におけるC3の3'末端に付加するのに用いたアンテナペディア配列は、pET-3aベクター(Bloch-Gallego、1993年、120:485〜492頁、Derossi、1994年、269:10444〜10450頁)からPCRによって作製し、pSTBlue-1平滑末端ベクター中にサブクローニングし、次いで制限部位EcoR IおよびSal Iを用いてpGEX-4T/C3中にクローニングし、pGEX-4T/C3APLを作製した。フレームシフト変異を有する別のクローン(C3APLT)を選択し、タンパク質を作製して試験した。変異にもかかわらず培養液が陽性であった場合には、変異を確認するために別の会社により再度クローンの配列決定を行い、このクローンをC3APLTと呼んだ。C3APLTの配列を確認するため、両鎖からのコード配列を配列決定した。このクローンの配列を実施例16および17に示す(C3APLTのヌクレオチド配列;配列番号42、C3APLTのアミノ酸配列;配列番号43)。
C3APLT、C3APS、C3-TLおよびC3-TSの有効性を試験するため、成長阻害性基質上で培養されたニューロンの細胞系であるPC-12細胞を用いて多くの実験を行った(Lehmann他、同上参照)。PC-12細胞は、前述のミエリン基質上で平板培養した(Lehmann他、同上参照)。摩砕せずに、様々な濃度でC3、C3APLT、C3APS、C3-TLまたはC3-TSを加えた(用いた濃度については図4、5および8を参照されたい)。この方法で受動的に培地に添加されたC3は、成長阻害性基質における神経突起成長を促進できなかったが、それはC3が細胞に入り活性であるためには細胞を摩砕しなければならないためである(図1)。C3APLTとC3APSは共に、RhoをADPリボシル化し、RhoAの分子量にシフトをもたらした(図2)。C3APLTとC3APSは共に、神経突起成長を促進し、培地に受動的に添加された後でニューロンに入った(図3、図4および5)。0.25ng/ml、2.5ng/ml、25ng/ml、250ng/mlならびに2.5μg/mlおよび25μg/mlの濃度を試験した用量反応実験から、C3APLTおよびC3APSがC3の10,000分の1以下の用量でニューロンが神経突起を分化するのを助けたことが分かった(図4)。0.25ng/ml、2.5ng/ml、25ng/ml、250ng/mlならびに2.5μg/mlおよび25μg/mlの濃度を試験した用量反応実験から、0.0025ug/mlの最低濃度で添加された場合にもC3APLTは長い神経突起成長を促進できることが分かった(図5)。C3APLTおよびC3APSのこれらの濃度2.5ng/mlおよび25ng/mlは、C3で必要な用量のそれぞれ10,000分の1および1,000分の1以下に相当する。さらに、最高試験濃度の50ug/mlでは、これら2つの新たなRhoアンタゴニストは、PC-12細胞に対して毒性作用を示さず、成長阻害性基質上で神経突起成長を促進することができた。
C3APLTが脊髄損傷後の修復を促進するかどうかを試験するため、完全な成体マウスを用いた(実施例6に関して記載のように)。背部片側切断をT8(胸椎レベル8)において行い、前述のようにマウスをフィブリングルー中の様々な量(図7)のC3APLTで処理した(McKerracher、米国特許継続中(デリバリーパテント))。以前から知られているC3の実験では、視神経における解剖学的再生を促進するためには40〜50μgが必要であることが分かった(Lehmann他、同上)。我々は、1μgから50μgの様々な用量(図7を参照)のC3APLTを試験し、BBBスケール(Basso、1995年、12:1〜21頁)に従い行動回復について動物を評価した。
C3APLのヌクレオチド配列。
長い種類のアンテナペディア輸送配列が神経突起成長を亢進できることが報告されている(Bloch-Gallego、E.、LeRoux、I.、Joliot、A.H.、Volovitch、M.、Henderson、C.E.、Prochiants、A.、1993年、J.Cell Biol.、120:485頁)。したがって、この配列は、神経突起成長を亢進することが予想される。以下に示す配列の場合、開始部位はプラスミドのGST配列中にある(図示せず)。GST配列を含むベクターは市販されていることから、開始を含む全GST配列は配列決定しなかった。GST配列からC3コンジュゲートを遊離するトロンビン切断部位に対して3'に位置する配列のみを決定することが望まれた。GST配列は、トロンビンで切断される。
APL輸送配列(配列番号44)は以下の通りである。
「配列表1」
C3APLのヌクレオチド配列(配列番号3)
「配列表2」
C3APLのアミノ酸配列(配列番号4)
「配列表3」
C3APLの物理的特性
分子量34098.03ダルトン
295個のアミノ酸
48個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
28個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
89個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
94個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.847等電点
20.524 PH7.0における電荷
Davis, Botstein, Roth融解温度79.48℃
C3APSのヌクレオチド配列(配列番号5)。開始部位は、本明細書で図示しないプラスミドのGST配列中にある。
「配列表4」
APS輸送配列(配列番号45)は以下の通りである。
「配列表5」
C3APSのアミノ酸配列(配列番号6)
「配列表6」
C3APSの物理的特性
分子量29088.22ダルトン
257個のアミノ酸
38個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
23個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
79個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
83個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.745等電点
15.211 PH7.0における電荷
Davis, Botstein, Roth融解温度78.34℃
C3APL(アミノ酸配列:配列番号4)およびC3APS(アミノ酸配列:配列番号37)は、以下の方法でC3トランスフェラーゼの機能性ドメインとアンテナペディアと呼ばれる転写因子のホメオボックス領域(Bloch-Gallego、1993年、120:485〜492頁)をライゲーションすることによって作製されたcDNAによってコードされるタンパク質に与えられた名前である。プラスミドベクターpGEX-2T中にクローニングされた、C3をコードするcDNA(DillonおよびFeig、1995年、256:174〜184頁)をキメラタンパク質のC3部分として用いた。DNAの3'末端における終止コドンは、プライマー5'GAATTCTTTAGGATTGATAGCTGTGCC3'(配列番号1)および5'GGTGGCGACCATCCTCCAAAA3'(配列番号2)を用いるポリメラーゼ連鎖反応によってEcoR I部位で置き換えた。PCR産物をpSTBlue-1ベクター(Novage、市)中にサブクローニングし、次いでBamH IおよびNot I制限部位を用いてpGEX-4Tベクター中にクローニングした。このベクターをpGEX-4T/C3と呼んだ。pGEX-4Tベクターは、親和性精製で用いるための5'グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)配列を有している。pGEX-4T/C3におけるC3の3'末端に付加するのに用いたアンテナペディア配列は、pET-3aベクター(Bloch-Gallego、1993年、120:485〜492頁、Derossi、1994年、269:10444〜10450頁)からPCRによって作製した。用いるプライマーは、5'GAATCCCGCAAACGCGCAAGGCAG3'(配列番号7)および5'TCAGTTCTCCTTCTTCCACTTCATGCG3'(配列番号2)とした。反応から得られたPCR産物をpSTBlue-1平滑末端ベクター中にサブクローニングし、次いで制限部位EcoR IおよびSal Iを用いてpGEX-4T/C3中にクローニングし、pGEX-4T/C3APLおよびC3APLTを作製した。プロリンに富む輸送領域部分をもたらすフレームシフト変異の存在についてC3APLTを選択した。
成長阻害に打ち勝つC3APLTおよびC3APSの能力を試験するため、成長阻害性基質であるミエリン上でPC-12細胞を平板培養した。ミエリンは、ウシの脳から精製した(NortonおよびPoduslo、1973年、21:749〜757頁)。他の実験では、購入したタンパク質組成物(Chemicon)からコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)基質を作製した。カバーガラスまたは96ウエルプレートのウエルをコーティングする前に、ポリ-L-リジン(0.025μg/ml)(Sigma、St.Louis、MO)でコーティングし、水で洗浄して乾燥させた。-80℃において1mg/ml溶液として保存したミエリンを37℃で解凍し、ボルテックスした。8ウエルのチャンバーLab-Tekスライド(Nuc、Naperville、IL)中8ug/ウエルでミエリンを平板培養した。ミエリン溶液は、無菌組織培養フード中で一夜乾燥させた。翌朝、リン酸緩衝食塩水で基質を静かに洗浄し、次いで培地中の細胞を基質に加えた。PC-12細胞(Lehmann他、1999年)は、10%ウマ血清(HS)および5%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM中で培養した。使用する2日前に50ng/mlの神経成長因子(NGF)によりPC-12細胞を分化させた。細胞を初回刺激した後、培養皿にトリプシン5mlを加えて細胞を引き離し、細胞をペレット化して、1%HSおよび神経成長因子50ng/mlを含むDMEM2ml中に再懸濁した。次いで、約5000から7000個の細胞を、ミエリンでコーティングした8ウエルのチャンバーLab-Tekスライド(Nuc、Naperville、IL)上で平板培養した。試験基質上に37℃で3〜4時間細胞を置き、細胞を定着させた。細胞を破壊しないように注意しながら吸引によって始めの培地を注意深く除去し、1%HS、NGF 50ng/mlおよび望ましい用量に応じた様々な量のC3、C3APLT、またはC3APSを含むDMEMで置き換えた。2日後、細胞を固定した(4%パラホルムアルデヒドおよび0.5%グルタルアルデヒド)。非修飾C3による対照実験については、NGFで初回刺激したPC-12細胞をトリプシン処理して培養皿から引き離し、細胞をスクレープローディング緩衝液(114mM KCL、15mM NaCl、5.5mM MgCl2、および10mM Tris-HCl)で1回洗浄し、次いでC3 25または50μg/mlの存在下でゴム冠ポリスマンによりスクレーピング緩衝液0.5ml中に削り取った。細胞をペレット化し、平板培養の前にDMEM 2ml、1%HSおよび50ng/ml神経成長因子中に再懸濁した。各処置について少なくとも4実験を分析した。各ウエルについて、Zeiss Axiovert顕微鏡を用い20倍の対物レンズで12枚の画像を集めた。各画像について、神経突起のある細胞と無い細胞数をカウントし、神経突起の長さを測定した。ミエリンは濃厚相(phase dense)であることから、ミエリン基質上で平板培養された細胞を分析の前に抗βIIIチューブリンで免疫染色した。神経突起成長の定性分析には、Northern Eclipseソフトウェア(Empix Imaging、Mississauga、Ontario、Canada)を用いた。データ分析および統計にはMicrosoft Excelを用いた。
実施例4に記載のようにミエリン基質を作製し、組織培養チャンバースライド上で平板培養した。P1からP3のラットの子を断頭し、頭をエタノールで洗浄し、眼を摘出してHanks緩衝食塩溶液(HBSS、Gibcoから)と共にペトリ皿に入れた。角膜に穴を開けて、水晶体を取り出し、網膜をひねり出した。典型的には、1調製物当たり4枚の網膜を用いた。網膜を15mlの管に移し、容積を7mlにした。解離酵素およびパパイン7mlをさらに加えた。解離酵素溶液は以下のように作製した。DLシステイン30mgを15mlの管に加え(Sigma DLシステイン塩酸塩)、HBSS70ml、10mg.mlウシ血清アルブミン280ulを加えて溶液を混ぜ、0.3N NaOHでpHを7に調整した。解離溶液を濾過滅菌し、7mlの分量として冷凍保存し、使用前に1ml当たりパパイン(Worthington)12.5単位を加えた。網膜に解離溶液を加えた後、ロッキングトレイ上で37℃において30分間管をインキュベートした。次いで、網膜を軽く摩砕し、遠心分離してHBSSで洗浄した。C3APLTまたはC3APSの存在下、または非存在下に、HBSSを成長培地(DMEM(Gibco)、10%ウシ胎児血清、および50mg/ml脳由来神経栄養因子(BDNF)ビタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン)で置き換えた。上記の実施例4に記載のように調製したチャンバースライド中の試験基質、ミエリンまたはCSPG上で細胞を平板培養した。定量分析は上記実施例4に記載のように完了した。成長する網膜神経節細胞(RGC)を検出する抗βIIIチューブリンによる蛍光顕微鏡によってニューロンを可視化した。結果を図6に示す。
成体Balb-cマウスを0.6ml/kg hypnorm、2.5mg/kgジアゼパムおよび35mg/kgケタミンで麻酔した。この用量により、全操作に十分な約30分の麻酔が得られる。微小骨鉗子(microrongeurs)(Fine Science Tools)による椎骨および棘突起(spinus process)の除去によって胸部脊柱の一部を露出させた。次いで、背部に脊髄病変を作製し、よく切れるハサミで中心管を過ぎるまで広げ、よく切れるナイフで病変を再切断した。この病変は、すべての対照動物を下半身不随にする。脊椎傍筋肉を再吸収可能な縫合によって閉じ、皮膚を2.0絹縫合によって閉じた。手術後、動物が回復するまで、通常2〜3日は8〜10時間毎に膀胱を手で空にした。近づきやすいように食餌はケージ内に置き、手術後に水に近づきやすいようにスポンジ-水を用いた。また、始めの3日間は、8〜12時間毎にブプレノルフィン(0.05〜0.1mg/kg)の皮下注射を動物に行った。体重が15〜20%減少した動物はすべて致死せしめた。
スコアの説明
1 観察可能な後肢(HL)の動きなし。
2 1または2関節のわずかな動き。
3 1関節の広範囲な動きおよび/または他の1関節のわずかな動き。
4 2関節の広範囲な動き。
5 HLの3関節すべてのわずかな動き。
6 2関節のわずかな動きおよび3番目の関節の広範囲な動き。
7 2関節の広範囲な動きおよび3番目の関節のわずかな動き。
8 HLの3関節すべての広範囲な動き、歩行するが体重を支えられず。
9 3関節すべての広範囲な動き、体重を支えての歩行。
10 体重を支えての頻回から一貫した背面足踏み(dorsal stepping)。
11 体重を支えての頻回な足底足踏み(plantar stepping)。
12 体重を支えての一貫した足底足踏み、協調無し。
13 一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、時々のFL-HL協調。
14 一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、頻回のFL-HL協調。
15 一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、一貫したFL-HL協調;歩行運動中の支配的な足の位置は内側もしくは外側に回転し、または時々の背面足踏みを伴う一貫したFL-HL協調。
16 一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、一貫したFL-HL協調;支配的な足の位置は身体と並行である;頻回から一貫したつま先を引きずり、またはつま先折れ(curled toes)、胴体の不安定性。
17 一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、一貫したFL-HL協調;支配的な足の位置は身体と平行であり、つま先の引きずりなし、またはつま先折れ、ある程度の胴体不安定性。
18 一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、一貫したFL-HL協調;支配的な足の位置は身体と並行であり、つま先の引きずりなし、および歩行運動における一貫した安定性。
実施例6について記載したように脊髄損傷を受け、対照としてまたはC3APLTで治療されたマウスを、瘢痕への形態学的変化および軸索再生について評価した。軸索再生を検討するため、順行性標識によって皮質脊髄軸索を識別した。順行性標識試験の場合には、上記のように動物を麻酔し、運動皮質を覆う頭蓋を切除した。細いガラスのマイクロピペッター(直径約100um)により、コムギ胚芽凝集素(2%)にコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼ2〜4ulを大脳皮質に注入すると、マーカーは神経細胞によって取り込まれ、脊髄中に広がる軸索中へ順行的に輸送される。順行性トレーサーの注入後、頭蓋を元に戻し、皮膚を5〜0絹縫合により閉じる。48時間後に抱水クロラール(4.9mg/10g)で動物を致死せしめ、固定液としてのリン酸緩衝液に溶かした4%パラホルムアルデヒドを灌流した。脊髄を摘出し、ショ糖で凍結保護し、クリオスタット切片を組織学的検査用のスライド上に置いた。
C3APLのヌクレオチド配列
Tatコード配列は、全HIV-1 Tatコード配列を含むプラスミドSVCMV-TAT(Universite de MontrealのDr. Eric Cohenから入手)のポリメラーゼ連鎖反応より取得した。Tatタンパク質の輸送配列を単離するため、PCRを用いた。使用した第一プライマー(5'GAATCCAAGCACCAGGAAGTCAGCC3'(配列番号11))および第二プライマー(5'ACCAGCCACCACCTTCTGATA3'(配列番号12))は、HIV Tatタンパク質のアミノ酸27〜72に対応していた。検証および精製し、PCR産物をpSTBlue-1平滑末端ベクター中にサブクローニングした。次いで、Tatタンパク質のこの輸送セグメントを、制限部位EcoR IおよびSac Iを用いてC3の3'末端においてpGEX-4T/C3中にクローニングした。新たなC3-Tat融合タンパク質をC3-TLと呼んだ。組み換えタンパク質は、実施例3に記載のように作製した。
C3-TLのDNA配列(配列番号13)
「配列表7」
TL輸送ペプチド配列自体は以下の通りである:(配列番号46)
「配列表8」
C3-TLのタンパク質配列(配列番号14)
「配列表9」
分子量32721.40ダルトン
291個のアミノ酸
43個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
21個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
82個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
104個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.688等電点
22.655 PH7.0における電荷
翻訳された塩基の総数は876個である
%A=37.44 [328]
%G=17.58 [154]
%T=28.31 [248]
%C=16.67 [146]
より短いTat構築物も作製した(C3-TS)。より短いC3 Tat融合タンパク質を作製するため、以下のオリゴヌクレオチドは、5'AATTCTATGGTCGTAAAAAACGTCGTCAACGTCGTCGTG3'(配列番号15)および5'GATACCAGCATTTTTTGCAGCAGTTGCAGCAGCACAGCT3'(配列番号16)とした。同量のオリゴヌクレオチドを混ぜ、72℃で5分間加熱し、次いで室温に15分間オリゴヌクレオチド溶液を放置することにより2本のオリゴヌクレオチド鎖をアニールした。オリゴヌクレオチドをC3の3'末端においてpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションした。構築物を配列決定した。すべてのプラスミドをXL-1 blueコンピテント細胞中に形質転換した。組み換えタンパク質は、実施例3に記載のように作製した。
C3-TSのヌクレオチド配列(配列番号17)
「配列表10」
TS輸送ペプチド配列自体は以下の通りである:(配列番号47)
「配列表11」
C3-TSのタンパク質配列(配列番号18)
「配列表12」
分子量26866.62ダルトン
238個のアミノ酸
36個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
21個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
71個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
78個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.802等電点
15.212 PH7.0における電荷
翻訳された塩基の総数は717個である
%A=38.91 [279]
%G=17.43 [125]
%T=28.45 [204]
%C=15.20 [109]
核酸配列:(配列番号19)
1413塩基対
一本鎖
線状配列
「配列表13」
アミノ酸配列:(配列番号20)
479個のアミノ酸
線状、一本鎖
「配列表14」
分子量53813.02ダルトン
470個のアミノ酸
68個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
55個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
149個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
121個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.137等電点
14.106 PH7.0における電荷
翻訳された塩基の総数は1413個である
%A=34.61 [489]
%G=19.75 [279]
%T=29.51 [417]
%C=15.99 [226]
%不明=0.14 [2]
%A+T=64.12 [906]
%C+G=35.74 [505]
Davis, Botstein, Roth融解温度79.20℃
以下の配列を、C3またはその酵素活性を保持する切断型C3のアミノ末端またはカルボキシ末端に付加することができると考えられる。
1)(Wender他、2000年、97:13003〜13008頁)に記載のポリアルギニンの配列。これらは、6から9個以上のアルギニンであってもよい。
2)ポリリジンの配列
3)ポリヒスチジンの配列
4)アルギニンおよびリジンの混合配列。
5)付加された配列が輸送特性を保持する非塩基性アミノ酸ストレッチを含むアミノ酸の塩基性ストレッチ。
6)少なくとも50%の塩基性アミノ酸を含む5〜15個のアミノ酸の配列。
7)少なくとも30%の塩基性アミノ酸を含む15〜30個のアミノ酸より長い配列。
8)少なくとも18%の塩基性アミノ酸を含む50個のアミノ酸より長い配列。
9)シクロヘキシル側鎖、他の側鎖、様々なアルキルスペーサーの付加によるなど、アミノ酸が化学的に修飾されている上記のいずれか。
10)有効な輸送体としての役割を果たすためのヘリックス構造を壊す傾向を有するプロリン残基を有する配列。
C3Basic1:ランダムに設計された塩基性尾部と融合したC3
C3Basic2:ランダムに設計された塩基性尾部と融合したC3
C3Basic3:逆Tat配列と融合したC3
我々は、膜輸送特性を有するキメラC3をコードする以下のDNAを設計した。このタンパク質はC3Basic1と命名されている。この配列は、ランダム塩基配列と融合したC3について設計した。以下に示すタンパク質をコードする構築物を作製した。
「配列表15」
この構築物は、以下に示す2つのオリゴヌクレオチドを合成し、それらを一緒にアニールし、付加されたヒスチジンタグを有するpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションすることによって作製した。
「配列表16」
C3Basic1のDNA配列:(配列番号24)
「配列表17」
C3Basic1のたんぱく質配列:(配列番号25)
「配列表18」
分子量29897.03ダルトン
263個のアミノ酸
44個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
23個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
75個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
79個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
10.024等電点
22.209 PH7.0における電荷
Davis, Botstein, Roth融解温度78.56℃
我々は、膜輸送特性を有するキメラC3をコードする以下のDNAを設計した。このタンパク質はC3Basic2と命名されている。この配列は、ランダム塩基配列と融合したC3について設計した。以下に示すタンパク質をコードする構築物を作製した。
「配列表19」
この構築物は、以下に示す2つのオリゴヌクレオチドを合成し、それらを一緒にアニールし、付加されたヒスチジンタグを有するpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションすることによって作製した。
「配列表20」
C3Basic2のDNA配列:(配列番号29)
「配列表21」
C3Basic2のたんぱく質配列:(配列番号30)
「配列表22」
分子量29572.61ダルトン
260個のアミノ酸
42個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
23個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
74個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
80個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.956等電点
20.210 PH7.0における電荷
Davis, Botstein, Roth融解温度78.45℃
我々は、膜輸送特性を有するキメラC3をコードする以下のDNAを設計した。このタンパク質はC3Basic3と命名されている。この配列は、逆Tat配列と融合したC3について設計した。以下に示すタンパク質をコードする構築物を作製した。
「配列表23」
この構築物は、以下に示す2つのオリゴヌクレオチドを合成し、それらを一緒にアニールし、付加されたヒスチジンタグを有するpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションし、次いでpGEX-4T/C3中でサブクローニングすることによって作製した。
「配列表24」
C3Basic3のDNA配列:(配列番号34)
「配列表25」
C3Basic3のたんぱく質配列:(配列番号35)
「配列表26」
分子量29441.47ダルトン
260個のアミノ酸
39個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
23個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
76個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
80個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.833等電点
17.211 PH7.0における電荷
Davis, Botstein, Roth融解温度78.29℃
pGEX中へのC3APLのサブクローニングから選択されたクローンの1つは、予想した大きさではないが良好な生物活性を有するタンパク質をコードした。このクローンは、切断につながるフレームシフト変異を有し、このクローンはC3APLTと呼ばれた。このクローンを再び配列決定し、クロマトグラムを分析して配列を確認した。C3APLTの配列を確認するため、pGEX-4T/C3APLTの両鎖からのコード配列を、完全長クローンの二重鎖配列決定によって配列決定した(BioS&T、Montreal、Quebec)。
C3APLTのDNA配列は以下の通りである(配列番号36)。
「配列表27」
APLT輸送ペプチド配列自体は以下の通りである(配列番号48)。
「配列表28」
C3APLTのタンパク質配列は以下のとおりである(配列番号37)。
「配列表29」
分子量27574.42ダルトン
248個のアミノ酸
33個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
21個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
76個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
80個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.636等電点
12.379 PH7.0における電荷
C3は、pGEX系列とpET系列ベクターの双方により大腸菌中で安定に発現されることが報告されている(例えば、DillonおよびFeig、1995年、Meth. Enzymol. 256:174〜184頁、Small GTPases and their Regulators. Part.B. Rho Family. W.E.Balch、C.J.Der、およびA.Hall、編; Lehmann他、1999年、同上; Han他、2001年、J.Mol.Biol.、395:95〜107頁)。融合タンパク質は、合成および試験のためには、pGEXベクター中で十分に発現された。しかしながら、大規模な産生のためには、産生されるタンパク質の大きさを増加させる親和性タグなしに組み換えタンパク質を合成することがより効率的である。また、自動FPLCシステムを用いる親和性クロマトグラフィによって大規模にタンパク質を合成することがより経済的である。ポリメラーゼ連鎖反応を用い、pET T7ポリメラーゼをベースとする大腸菌発現系(Studier他、1990年、Meth. Enzymol.、185:60〜89頁。Gene Expression Technology。D.V.Goeddel、編により概説されている)に組み換え構築物C3APLTを移動した。同様のPCR手法は、輸送配列を有する融合タンパク質系列のC3をベースとする構築物における他のものにも適している。pET3aベクターDNAは、McGill UniversityのDr.Jerry Pelletierより入手した。PCRプライマーは、Invtrogenから入手した。上流(5')プライマーは、5'-GGATCTGGTTCCGCGTCATATGTCTAGAGTCGACCTG-3(37b)(配列番号38)とした。下線は、pGEX4T-C3APLT中のBamHI部位と置き換えるためにプライマー中に導入されたNde I部位である。下流プライマーは、5'-CGCGGATCCATTAGTTCTCCTTCTTCCACTTC-3'(32b)(配列番号39)とした。このプライマーは、pGEX4T-C3APLTの有意鎖DNAに2つの変化を導入し、pGEX4T-C3APLTからのEcoRI部位をBamH I部位(下線部分)で置き換え、TGA終止コドンを強力な終止配列TAAT(相補的プライマー中のイタリック体を使用したATTA配列)で置き換えている。pGEX4T-C3APLTと比較すると、pET3a-C3APLTの予想N末端配列は、Gly-Ser-SerではなくMet-Serであり、1つのセリンが失われGlyがMetで置換されている。C3APLTのC末端におけるアミノ酸配列は変化していなかった。
実施例1、2、8、9、10、11、12および13、15および16で得られたいずれの配列もC3酵素活性および効果的な輸送配列を保持するように修飾することができた。例えば、クローニングで使用された制限部位の翻訳に相当する配列の3'末端におけるDNAによってコードされるアミノ酸は、活性に影響を及ぼすことなく除去することができる。アミノ末端アミノ酸の一部も、活性に影響を及ぼすことなく除去することができる。融合タンパク質のC3部分の生物活性に必要な最低量の配列は不明であるが、知られている技法によって容易に決定できるであろう。例えば、C3をコードするcDNAの5'末端をだんだんと除去し、得られるタンパク質を作製して生物活性を試験する。同様に、3'末端をだんだんと除去し、断片の生物活性を試験する。次に、中央領域を試験する断片をC3活性の保持について試験する。したがって、タンパク質のC3部分は、活性に必要なだけのアミノ酸が含まれるように切断することができる。あるいは、C3のコード領域において変異を行わせ、得られるタンパク質の活性を試験する。輸送配列は、1つまたは複数のアミノ酸を付加もしくは除去し、または輸送ペプチドを完全に変えるが、我々の組織培養バイオアッセイ(実施例4)におけるC3と比較した有効量の点で輸送特性を保持するように修飾することができる。新たな輸送配列を生物活性について試験し、実施例4に記載のようにニューロンを平板培養し、阻害性基質上でそれらを試験することによってC3活性の効率を改善することができる。
Claims (11)
- アミノ酸配列が配列番号37または配列番号43で示されるポリペプチドからなる薬物送達構築物。
- 請求項1に記載の薬物送達構築物からなるニューロンの軸索成長阻害の抑制、軸索成長促進、神経損傷治療、脳卒中に関係する虚血損傷治療、または緑内障治療のための薬剤。
- 請求項1に規定されるポリペプチドを調製するための方法であって、
−細胞内でポリペプチドの発現をもたらす条件の下に宿主細胞を培養すること、および
−精製ステップによってポリペプチドを回収することを含む方法。 - 薬剤組成物の製造のための、請求項1に記載の薬物送達構築物の使用。
- ニューロンの軸索成長の阻害を抑制する薬物、軸索成長を促進するための薬物、神経損傷を治療する薬物または緑内障を治療する薬物の製造のための、請求項1に記載の薬物送達構築物の使用。
- 薬剤として許容可能な担体および有効量の請求項1に記載の薬物送達構築物を含む薬剤組成物。
- 生物学的接着剤をさらに含む、請求項6に記載の薬剤組成物。
- フィブリンをさらに含む、請求項6に記載の薬剤組成物。
- 配列番号36または配列番号42のポリヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項9に記載の単離されたポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
- 配列番号37または配列番号43で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
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