JP2001515018A - 中枢神経軸索再生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 急性又は慢性脊髄損傷外傷性脳損傷及び白質発作を含む種々の中枢神経系障害の治療用軸索再生促進する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

関連出願日 本出願は１９９７年８月１３日に出願された米国特許出願第６０／０５５，２
６８号の優先権を主張するものである。

【０００２】 発明の技術分野 本発明は成長コーンシグナル変換タンパク機能のしゅしょくを生ずるアデノウ
ィルス媒介遺伝子治療を含む、中枢神経系軸索生成を促進する治療に関する。こ
の治療方法は特に重大な慢性の脊柱索状組織の損傷外傷性の脳損傷及び白質発作
からの回復に関する。

【０００３】 脊柱の索状組織機能はこれらの細胞の延ばされた軸索過程を通して１つの神経
細胞から他への電気的条件を必要とする。成人の脊柱索状組織への損傷の後、こ
れらの連結は中断され、そして残存する神経細胞は筋肉を管理し、感覚を供給す
るためにお互いに情報伝達できなくなる。以前の研究は神経細胞は適当な環境が
与えられた場合に、それらの軸索を延ばすことができることを示している。残念
ながら、成人の脊柱索状組織は抑性分子が非神経単位の補助細胞によってしぼり
出されているので不適当な環境である。このように、その抑制の影響が克服され
れば、軸索の再生及び機能回復は結果として生じるだろう。

【０００４】

【従来の技術】

発明の背景 脊柱索状組織は、その中で多数の軸索が中断されている状態の模範的な例であ
るが、神経細胞体の大多数がそっくりそのまま残されている。大脳皮質中への皮
質脊柱錐体神経細胞及び背部のルート神経節中の大きな神経繊維知覚神経は大量
に現れるけれども、それらは、損傷した軸索を再生できない。慢性のまひ及び知
覚まひは、軸索の再生し損なった結果である。ラキュナ（Ｌａｃｕｎａｒ）白質
発作及び広がった外傷性脳損傷は軸索自体が損傷の主要な現場であるという意味
において類似している。脊椎動物の系においては、中枢神経系（ＣＮＳ）ではな
くて、末梢神経（ＰＮＳ）が損傷後軸索を再生する能力があることがよく知られ
ている。坐骨の神経移植片の損傷したＣＮＳ組織への移植はＣＮＳ軸索が末梢神
経を通して再生できることを証明している（Ｄａｖｉｄ及びＡｇｕａｙｏ、１９
８１年）。

【０００５】 いくつかのＣＮＳミエリン由来反発因子が確認されている。３５ｋＤａ（ＮＩ
−３５）及び２０５ｋＤａの抗原性に関連したＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のリポソーム
に対する抑制活性が再構成された（Ｃａｒｏｎｉ及びＳｃｈｗａｂ、１９８８
年）。ＮＩ−３５は軸索の伸張を抑制し、成長コーン虚脱を誘発する（ｉｄ及び
Ｂａｎｄｔｌｏｗ他、１９９３年）、ＮＩ−３５に対する抗体は脊柱索状組織の
トランスセクションの後この抑制の生理学上の関連性を証明しながら、いくつか
の軸索再生を促進する（Ｓｃｈｎｅｌｌ他、１９９４年）。脊柱索状組織損傷場
所での嗅覚被覆（ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ）細胞の移植は、多分、通常抑制物質
を生産する乏〔寡〕突起（神経）膠細胞の代わりをすることにより、ある程度の
軸索再生を促進する（Ｌｉ他、１９９７年；Ｉｍａｉｚｕｍｉ他、１９９８年；
Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ他、１９９４年）。

【０００６】 インビトロで、神経突起成長のＣＮＳミエリン抑制もミエリン関連糖タンパク
（ＭＡＧ；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ他、１９９４年；Ｍｃｋｅｒｒａｃｈｅｒ
他、１９９４年）によってある程度媒介されている。インビーボにおいて、ＭＡ
Ｇは、軸索再生のミエリン抑制に寄与する又はそうでないかもしれない（Ｂａｒ
ｔｓｈ他、１９９５年；Ｓｃｈａｆｅｒ他、１９９６年）。もし、軸索副産物に
対するＣＮＳミエリンの抑制効果がインビーボにおいて妨げらることができるな
ら、脊柱索状組織の外傷及び他のＣＮＳ軸索損傷の事例からの増加した回復も起
こりそうである。胎生の神経細胞の成人のＣＮＳミエリン索へのマイクロ移植に
関する最近のデータは成人ＣＮＳミエリン内でのいくらかの軸索伸長を提供して
いる（Ｄａｖｉｓ他、１９９７年）。乏突起（神経）膠細胞成分はもちろん星状
細胞傷跡も成人のＣＮＳ軸索再生不能に寄与していることが含まれている。反発
因子は主として成長する軸索の末梢部の先端で分化した成長コーンに作用すると
考えられている（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、１９９５年；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔ
ｔｅｒ、１９９６年）。

【０００７】 神経細胞の成長コーンは神経系の発達及び再生の間無数の潜在的な経路及びタ
ーゲットを区別するために、知覚器官を有している（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅ
ｒ、１９９５）。細胞外でのシグナルは、成長コーンのアクチン基材細胞骨格で
の変化を誘発し、これ故に、その組織及び運動性を誘発する。細胞外のクルーが
細胞骨格の再配置に変換される分子メカニズムが少し明らかにされた。

【０００８】 セマフォリン（ｓｅｍａｐｇｈｏｒｉｎ）／コラプシン（ｃｏｌｌａｐｓｉ
ｎ）属のタンパク質が、軸索生成及び末端の樹枝状分岐の重要な１つの陰性のレ
ギュレーターとして認められている（Ｌｕｏ他、１９９３年；Ｋｏｌｏｄｋｉｎ
他、１９９２、１９９３年）。ヒナコラプシン−１（ｃｈｉｃｋ ｃｏｌｌａｐ
ｓｉｎ−１）は、成長コーン虚脱そして少なくともＤＲＧ神経細胞の部分集合か
らは神経突起の生長の中断を誘発する（Ｒａｐｅｒ及びＫａｐｆｈａｍｍｅｒ、
１９９０年；Ｌｕｏ他、１９９３年）。昆虫セマフォリン（ｉｎｓｅｃｔ ｓｅ
ｍａｐｈｏｒｉｎ）は軸索の経路検索（ｐａｔｈｆｉｎｄｉｎｇ）及び対合的末
端分岐（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）間に証明
されたインビーボでの役割を有する（Ｋｏｌｏｄｋｉｎ他、１９９２年；Ｍａｔ
ｔｈｅｓ他、１９９５年）。少なくとも７つの脊椎動物セマフォリンが同定され
ており、２０程度のこのファミリーの仲間があるかも知れない（Ｐｕｓｃｈｅｌ
他、１９９５年；Ａｄａｍｓ他、１９９６年）。コラプシン−１の適用後アクチ
ンフィラメントの減少が提供されている（Ｆａｎ他、１９９３年）。非同定トラ
ンスメンブラン受容体に結合しているコラプシン−１がこの解重合の引き金とな
っているメカニズムは明らかでない。

【０００９】 非神経細胞において、ｒｈｏ亜科の単量体ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質
は、アクチン基材細胞骨格及び細胞形状に顕著な効果を有する（Ｈａｌｌ、１９
９０、１９９４年）。繊維芽細胞において、ｒｈｏ活性化は張力繊維形成及び焦
点接着（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）にリンクしており、ｒａｃ１活性化は
メンブランラフリング（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｕｆｆｌｉｎｇ）に、そしてｃｄ
ｃ４２活性化は、糸状仮足（ｆｉｌｏｐｏｄｉａｌ）形成にリンクしている（Ｎ
ｏｂｅｓ及びＨａｌｌ、１９９５年）。一つのアミノ酸置換がこれらのタンパク
質の各々の構造的な活性又は負の優性形を引き起こす。ボツリヌス菌ＡＤＰリボ
シレートｒｈｏ（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｅｓ
ｒｈｏ）からのＣ３転移酵素はＧタンパク質を非活性化する。

【００１０】 神経細胞成長コーン運動性のレギュレーションへの、このクラスのＧタンパク
質の寄与は現在研究されてきている。神経芽腫細胞においては、リゾフォスファ
チジン酸（ＬＰＡ）又はヘテロトリメリックＧタンパク質共役ｄ受容体（ｈｅｔ
ｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅ ｄ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ）に結合したトロンビンは迅速な神経突起の収縮を誘発する（Ｊａｌｉｎ
ｋ及びＭｏｏｌｅｎａａｒ、１９９２年；Ｊａｌｉｎｋ他、１９９４年）。その
ボツリヌス菌からのＣ３転移酵素はｒｈｏ活性化がこれらの細胞における神経突
起長のＬＰＡレギュレーションを成立させることを示しながらＬＰＡの作用を妨
げることが示されている（Ｊａｌｉｎｋ他、１９９４年）。活性化されたｒｈｏ
の下流部門でのターゲットは、ミオシンＬ鎖フォスフォリアーゼとして同定され
ており（Ｋｉｍｕｒａ他、１９９６年）ミオシンＬ鎖キナーゼ阻害物質、ＫＴ５
９２６はＬＰＡ誘発神経突起収縮を妨げる（Ｊａｌｉｎｋ他、１９９４年）。

【００１１】 神経突起生長のレギュレーションにおけるｒｈｏ関連小Ｇタンパク質（ｒｈｏ
−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｍａｌｌ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）のための更なる証拠がこ
れらのタンパク質の、インビーボでの活性化された又は負の優性形発現している
研究から生じている。ｒａｃ１活性の変性及びより少ないｃｄｃ４２活性への変
性は、ハエにおける多くの神経細胞からの軸索伸長における不能をもたらす（Ｌ
ｕｏ他、１９９４年）。小脳のプルキニエ細胞中の構成的な活性ｒａｃ１を発現
するマウスが樹皮状形態における変性を示した（Ｌｕｏ他、１９９６年）。

【００１２】 抑制（反発）分子が軸索の末梢先端（成長コーン）に作用する分子メカニズム
は、現在研究中である。ここに報告されている研究において、ＧＰＴ結合ｒｈｏ
タンパク質が多数の分子による軸索反発作用に要求されることが見出された（Ｊ
ｉｎ及びＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、１９９７年）。組織培養における軸索成長
についてのＣＮＳミエリンの抑制効果はｒｈｏタンパク質の抑制によって妨げら
れる。

【００１３】 発明の要約 本発明の目的は急性又は慢性脊髄損傷、外傷性脳損傷及び白質発作を含む種々
の中枢神経系障害の治療用軸索（アクソン）再生促進するためにこれらの発見を
利用することである。 これらの及び他の目的は本発明によって達成される。

【００１４】 本発明はｒｈｏ、ｒａｃ、ｃｄｃ４２インヒビター又はこれらのいずれかの混
合物の如き少なくとも１つのｒｈｏタンパクインヒビターの有効量を患者に投与
することによって軸索再生に必要な患者の中枢神経系軸索生成を促進する方法を
提供する。ｒｈｏタンパクインヒビターは軸索又はこれらの非神経保護組織に化
学的に導入され得るか、又はインヒビターを発現する複製−不十分なアデノ、ア
デノ−結合ウィルス又はヘルペスウィルスを投与することによって導入し得る。
一つの具体例では、このインヒビターはＣ．ボツリヌス菌Ｃ３外酵素、他の具体
例では、キラメＣ．ボツリヌス菌Ｃ２／Ｃ３インヒビターがある。

【００１５】 本発明は従って本明細書に記載した方法を用いることによって中枢神経系の治
療用ｒｈｏタンパクインヒビターを含有する医薬組成物を提供する。又は、ｒｈ
ｏインヒビター活性を検定することによって化合物のパネル中の軸索再生活性を
検出するために使用し得るスクリーンを提供する。

【００１６】 図面の記載 図１はコラプシン−１−誘発成長コーン虚脱がＫＴ５９２６及びＰＴＸによっ
て減衰され得ることを図解する線状グラフである。（Ａ）検定の２時間前、ＫＴ
５９２６の指示濃度はＤＲＧエクスプラント培養基に加えられた。ＫＴ５９２６
の低濃度がファクター５によってコラプシン投与応答曲線を右へシフトした。Ｋ
Ｔ５９２６はコラプシン−１の非存在下で成長コーンについて影響を示さなかっ
た。４−６の個別の実験からの平均が示される。（Ｂ）チックＤＲＧエクスプラ
ント培養を５００ｎｇ／ｍｌ百日咳ホロトキシンの添加又は５００ｎｇ／ｍｌの
オリゴマーＢサブフラクションの百日咳トキシンをもつ成長培養地中で３時間予
備インキュベートした。次いで、成長コーンコラプスを組換コラプシン−１−Ｈ
ｉｓ₆の所定の濃度の存在下で測定した。オリゴマーＢフラクションが影響をも
たなかったにもかかわらず、百日咳ホロトキシンは２００ｐＭコラプシン−１で
成長コーンコラプスを著しく増加した（ｐ＜０．０５スチューデントのトウ−テ
イルドｔテスト）。ＳＥＭによる５つの実験の平均を図解した。

【００１７】 図２はｒｈｏサブファミリータンパクでこすられたＤＲＧニューロン中の成長
コーンコラプス及び神経突起を示す。（Ａ）摩砕のために用いたタンパク調剤は
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって別けられ、ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色された。
４５、３６、２５及び２１ ｋＤａ Ｍｒ基準の移動は右側に示される。（Ｂ）
ＤＲＧニューロンをｒｈｏファミリータンパクの５ｍｇ／ｍｌ及びＣ３トランス
フェラーゼの０．１ｍｇ／ｍｌで所定のタンパクでこすった。培養４時間後、成
長コーンコラプスを２００ｐＭコラプシン−Ｈｉｓ₆に２０分間さらして（灰色
バー）、又はさらさないで（固体バー）評価した。これらのデータは３−９別々
の実験について平均＋ＳＥＭである。星印でしゆしされた値は同一の条件下での
バッファー−摩砕細胞と著しく異なる（ｐ＜０．０５、スチューデントのトウ−
テイルドｔテスト）。（Ｃ）ＤＲＧニューロンを所定のタンパクで摩砕し、Ｂで
記載した如くコランプシン−１にさらした。アクチンをＴＲＩＴＣ−ファロイジ
ンでホルマリン固定細胞を染色することによって視覚化した。拡大は５００倍。
（Ｄ）ＤＲＧニューロンをｒｈｏファミリータンパクの５ｍｇ／ｍｌ及びＣ３ト
ランスフェラーゼの０．１ｍｇ／ｍｌで所定のタンパクで摩砕した。培養２時間
後、ニューロンをさらに３時間０（固体バー）又は２００ｐＭ（灰色バー）にさ
らし、そして次いで細胞ごとに平均全神経突起生長を決定した（Ｇｏｓｈｉｍａ
他、１９９５）。データは３−９別々の実験について平均＋ＳＥＭである。星印
でしるしした値は同一の条件下でバッファー摩砕細胞と著しく異なる（ｐ＜０．
０５、スチューデントのトウ−テイルドｔテスト）。

【００１８】 図３は成長コーン運動性のコラプシン−１におけるｒａｃ１を示す。ＤＲＧニ
ューロンをバッファー又は所定のＧタンパクの種々の濃度で摩砕した。成長コー
ンコラプスをコラプシン−Ｈｉｓ₆にさらしまたはさらさないで図２の如く決定
した。データは２−４の別々の実験について平均＋ＳＥＭであった。（Ａ）Ｎ１
７ｒａｃタンパクの種々の濃度で摩砕後の成長コーンコラプスを２００ｐＭコラ
プシンにさらして（○）又はさらさないで（●）で決定した。（Ｂ）ＤＲＧニュ
ーロンを０又は２．５ｍｇ／ｍｌのＮ１７ｒａｃ及び次の構成活性Ｇタンパクの
０又は５ｍｇ／ｍｌで摩砕した。ＢはＮ１７ｒａｃ、ＣはＮ１７ｒａｃ＋Ｖ１４
ｒｈｏ、Ｄは１７ｒａｃ＋Ｖ１２ｒａｃ、及びＥはＮ１７ｒａｃ＋Ｖ１２ｃｄｃ
４２、そしてＡはバッファーである。成長コーンコラプスを２００ｐＭコラプシ
ン−１の非存在下（固体バー）又は存在下（灰色バー）中で決定した。Ｖ１２ｒ
ａｃがコラプシン誘発成長コーンコラプスのＮ１７ｒａｃ阻害を部分的に逆転す
ることを注意すべきである。（Ｃ）バッファー（●）、構成的に活性なＶ１２ｒ
ａｃ（◇）又は優性負Ｎ１７ｒａｃ（◆）による摩砕後、成長コーンコラプスが
所定の濃度のコラプシンにさらされたＤＲＧニューロンについて計量された。

【００１９】 図４はＤＲＧニューロンについてＣ３トランスフェラーゼを示す。ＤＲＧニュ
ーロンを図２に記載した如く摩砕し培養した。データは２−４の別々の実験につ
いて平均＋ＳＥＭである。（Ａ）Ｃ３トランスフェラーゼの所定の濃度がＤＲＧ
ニューロンの摩砕を通して存在した。２００ｐＭコラプシン−１の存在下及び非
存在下で成長コーンコラプスを図２における如く決定した。（Ｂ）バッファーに
よる摩砕後、４μｇ／ｍｌＣ３トランスフェラーゼ、５ｍｇ／ｍｌ Ｖ１４ｒｈ
ｏ、又は両タンパク、ニューロンを０（灰色バー）又は２００ｐＭ（固体バー）
コラプシン−Ｈｉｓ₆にさらし、そして成長コーンコラプスを定量した。Ｂ（Ｂ
及びＣ）において、Ａはバッファーであり、ＢはＣ３であり、ＣはＶ１４ｒｈｏ
であり、ＤはＣ３＋Ｖ１４ｒｈｏであり、ＥはＣ３＋Ｖ１２ｒａｃであり、そし
てＥはＣ３＋Ｖ１２ｃｄｃ４２である。（Ｃ）Ｂにおける如く摩砕された細胞ご
とに平均全神経突起生長を２００ｐＭコラプシン−Ｈｉｓ₆の存在下（灰色バ
ー）又は非存在下（固体バー）で培養した後に決定した。

【００２０】 図５はＣ３のトランスフェラーゼの効果がＮ１７ｒａｃによってブロックされ
ないことを示す。 ＤＲＧニューロンをバッファー、５ｍｇ／ｍｌのＮ１７ｒａｃ、０．１ｍｇ／
ｍｌのＣ３トランスフェラーゼ又は両タンパクで摩砕した。データは３−５別々
の実験についての平均＋ＳＥＭであった。（Ａ）ニューロンを４時間培養し、次
いで成長コーンコラプスを２０分間２００ｐＭコラプシン−Ｈｉｓ₆にさらし
（灰色バー）又はさらすことなく（固体バー）検定した。（Ｂ）所定のタンパク
で摩砕したニューロンの細胞につき平均全神経突起生長を培養後４時間後に決定
した。

【００２１】 図６はミエリン又はＬＰＡによる成長コーンコラプスがＮ１７ｒａｃによって
ブロックされないことを示す。ＤＲＧニューロンを図における如く所定のタンパ
クで摩砕した。データは３の別々の実験についての平均＋ＳＥＭである。（Ａ）
ニューロンを４時間培養し、そして成長コーンコラプスをバッファー（固体バ
ー）、又はＣＮＳミエリン抽出物（５μｇタンパク／ｍｌ、灰色バー）に３０分
間さらした後に検定した。（Ｂ）培養２時間後、ニューロンをさらに２時間ＣＮ
Ｓミエリン抽出物の０タンパク／ｍｌ（固体バー）又は５μｇタンパク／ｍｌ
（灰色バー）にさらした。細胞につき平均神経突起生長を４時間後に決定した。
（Ｃ）ニューロンを４時間培養し、そして成長コーンコラプスをバッファー（固
体バー）又はＬＰＡ（１μＭ、灰色バー）に３０分間さらした後に検定した。

【００２２】 図７はＤＲＧ成長コーン機能のｒｈｏ／ｒａｃについてのモデル図である。Ｄ
ＲＧ成長コーンについての三つの状態が形態学的に外観、神経突起割合、ｒｈｏ
活性化状態及びｒａｃ１活性によってクラス分けされる。

【００２３】 図８はタウ−ＥＧＥＰと供にＣ３細胞外酵素の発現のための主要要素を説明す
るアデノウィルス形質転換ベクターマップを図解的に説明する。多シストロン性
メッセージがコードされている。コザック翻訳開始部及び停止配列中のＣ３細胞
外酵素又はｒａｃ１末端のコード配列はリボソーム再入部位及び第２コザック翻
訳開始部分及びマーカータンパク用の配列で続く。マーカーはＧＦＰの増大した
螢光変異体を伴う軸索の標的用のタウタンパクのフラグメントからなる。

【００２４】 図９はｒａｃ１変異体のアデノウィルスに関する発現の免疫ブロットである。
ＣＯＳ−７細胞を野生型ｒａｃ１（レーン１）、Ｖ１２ｒａｃ１（レーン２）、
Ｎ１７ｒａｃ１（レーン３）又は非ｒａｃ１タンパク１（レーン４）を発現する
組換アデノウィルスによって感染させた。感染後２４時間の細胞分析はｒａｃ１
の低い内生的レベルが組換アデノウィルス感染によって著しく増大されることを
示す。

【００２５】 図１０はＣ３細胞外酵素のアデノウィルスに関する発現を示す。ＣＯＳ−７細
胞をＧＦＰ（コントロール、トップパネル）又はＣ３プラスＧＦＰ（ポトムパネ
ル）を発現する組換アデノウィルスで感染させた。感染後１日に、細胞を固定
し、そしてアクチンフィラメントをロダミン−パロイジン染色によって視覚化し
た。Ｃ３−発現細胞の変化した構造が知られ得る。細胞の９５％以上が培養中に
感染された。

【００２６】 図１１はＣ３を発現する組換アデノウィルスが神経突起生長のミエリン誘発阻
害を提供することを示す。ＤＲＧニューロン培養をＣ３／ＧＦＰで感染させ、次
いで４日間培養した。螢光顕微鏡はニューロン表現型（トップパネル）によって
細胞中にマーカータンパクの発現を示す。細胞をトリプシン化し、そして添加な
しに、コラプシン−１又はＣＮＳミエリンの抽出物と取り替えた。神経突起はこ
れらの阻害因子の添加によって減少しないことに注意すべきである（ボトムパネ
ル）。コントロール培養では、コラプシン及びＣＮＳミエリンが約６０％まで減
少した。

【００２７】 図１２はラットの大脳皮質中のＣ３組換アデノウィルスからの発現を示す。Ｃ
３／ＥＧＦＰアデノウィルスを８週年令のラットの大脳皮質に注入した。数日後
に、ラットを殺し、脳を螢光顕微鏡で試験した。大脳皮質中の注入部位での非常
に濃い細胞ＥＧＦＰ螢光を注目する。類似の結果が４週間まで数回得られてい
る。類似の発現がまた局所注入後にＤＲＧで得られる。

【００２８】 発明の詳細な記載 本発明はｒｈｏタンパク阻害が損傷した脊髄又は脳の機能回復を妨害する分子
の作用をブロックすることによって中枢神経損傷後に軸索再生を促進することを
発見したことに基づくものである。 本発明の１つの観点によれば、急性又は慢性の脊髄損傷、外傷性脳損傷、白質
発作、又は軸索を損傷した及び軸索路を崩壊した他の中枢神経系損傷等の治療に
必要な患者に少なくとも１つのｒｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することに
よって軸索が増大され且つ成長が促進される。「ｒｈｏタンパク阻害剤」はレセ
プターと結合するｒｈｏタンパク機能をもつ全ての阻害剤、類似体、タンパク又
はタンパクフラグメントに対する抗体等の全ての阻害剤を意味する。阻害剤の混
合物もまた使用でき、同様にｒｈｏタンパク合成又は安定剤の阻害剤も使用でき
る。ここで使用される「患者」は動物及びヒトの両者を含む。本発明は医薬及び
動物薬の適用の両者に有用である。 患者は少なくとも１つの阻害剤を局所的に又は全身的に投与することによって
治療し得る。全身的投与は当業者に周知の方法、例えばロゼンジン、錠剤、カプ
セル、顆粒、又は他の食用組成物の経口投与；皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内
投与、例えば減菌注射；流体等の非経口投与によって投与される。典型的な全身
投与は製薬的許容し得る担体に分散した又は溶解した阻害剤の使用を包含する。

【００２９】 局所的に投与する場合、少なくとも１つの阻害剤が軸索に又はこれらの非神経
保護組織中に導入される。阻害剤の局所投与は、しかしこれに限定されないが、
注入のような任意の手段を用いることによって阻害剤の機械的導入を包含する、
例えば、製薬的に許容し得る担体に、そしてしばしば浸透及び吸収及び／又は阻
害活性を増大させる成分と組合せて、阻害剤を含有する組成物を組織に灌流又は
注入することによって、そして組換えウィルス発現阻害剤の注入によって投与す
ることを包含する。

【００３０】 最後の方法は実施例２において下記に説明される。この方法では、ｒｈｏタン
パクを阻害するＣ．ボツリヌス菌Ｃ３インヒビターがこのＣ３を発現する複製不
完全なアデノウィルス、アデノ−関連ウィルス又はヘルペスウィルスを用いるこ
とによって患者に静脈内に導入される。組換えアデノウィルスは、例えば、ＣＮ
Ｓ中で制限された免疫学的反応によって数週間又は数カ月かけて外来遺伝子のニ
ューロン発現に向けるために利用されている（Ｃｈｉｏ−Ｌｕｍｄｂｅｒｇ他、
１９９７）。アデノ−関連ウィルスはこれらの低い毒性及び長期のタンパク発現
の故にいくつかの態様で使用される。 Ｃ３インヒビターの代わりは細胞表面を用いてボツリヌス菌Ｃ２毒素から成分
を結合させることによって最近開発されたＣ３外酵素の組換え２成分供給系であ
る（Ｂａｒｔｈ他、１９９８）。アクチン活性はＣ２毒素から除去され、Ｃ３酵
素活性が置換された。このＣ３キメラタンパクはＣ３外酵素それ自体よりも少な
くとも１００−倍効率的に非ニューロン細胞にすることが報告されている。この
態様の使用は神経系への分子の直接注入を包含することができ、ウィルス注入の
潜在性の非特異的効果なしにｒｈｏ阻害を達成できる。

【００３１】 治療処理を実施するために必要なインヒビターの量はそれ自体固定されないけ
れども、製薬担体、阻害作用及び／又は浸透を増大させるために投与される組成
物中の添加物と組合せて投与される組成物中の成分の濃度に必然的に依存する。
好ましい組成物は患者に許容し得ない毒性を生ずることなく阻害剤の有効を供給
する。浸透及び吸収増強剤及び／又は阻害活性増強剤に加えて、本発明の医薬組
成物又は製剤は他の担体、助剤、安定剤、保存薬、分散剤、及び論議されている
製剤の型に関する技術分野においての通常の薬剤を含有し得る。 本発明は軸索再生を刺激し且つ種々の中枢神経系損傷の対応する治療用方法及
び種々の治療に使用する医薬組成物を提供すると供にｒｈｏタパク阻害活性用の
検定に使用し得るスクリーンを提供する。本発明のこの観点において、種々の生
物学的物質を包含する天然又は合成化合物のパネルはｒａｃ１阻害のようなｒｈ
ｏたんぱク阻害検定を用いて軸索再生治療における潜在性のためにスクリーンさ
れる。スクリーンテストは定量又は定性であり得る。典型的方法はテスト化合物
のパネルによって観察された阻害をコントロール、例えばＣボツリヌス菌Ｃ３外
酵素、阻害と比較することによって行われる。阻害の存在は軸索再生の刺激のた
めのポテンシャル薬剤を示す。スクリーンで同定されたインヒビターは次いでさ
らにテストされ、局所及び／又は全身投与のいずれかで有効性について特にテス
トされる。

【００３２】

【実施例】

下記の実施例は本発明をさらに説明するために記載するものであり、いかなる
意味においても限定するものとして考慮されるべきではない。

【００３３】 実施例 １ この実施例はｒａｃ１がコラプシン−１−誘発成長コーンコラプスを媒介する
証拠を提供する。主として、コラプシン−１／セマホリンＩＩＩ（Ｄ）はニュー
ロン成長コーンラメリポジアル及びフィロポジアル構造を崩壊することによって
軸索生長を阻害する。成長コーンコラプスはアクチン脱重合と関連されるので、
ｒｈｏサブファミリーの小さなＧＴＰ−結合タンパクをコラプシン−１シグナル
形質導入におけるその関与を研究した。組換えｒｈｏ、ｒａｃ１及びｃｄｃ４２
タンパクを胚チックＤＲＧニューロン中に摩砕した。構造的に活性なｒａｃ１は
崩壊した成長コーンの割合を増加する、そして優性ネガディブｒａｃ１はコラプ
シン−１−誘発成長コラプス及びコラプシン−１阻害神経突起生長を阻害する。
優性ネガティブｒａｃ１で処理されたＤＲＧはミエリン誘発生長コーンコラプス
に感受性である。ｃｄｃ４２の類似変異体はコーン構造、神経突起伸長又はコラ
プシン感受性を変化しない。活性化ｒｈｏの添加は影響をもたないのに対してボ
ツリヌス菌Ｃ３トランスフェラーゼをもつｒｈｏの阻害はＤＲＧ神経突起の生長
を刺激する。Ｃ３−処理成長コーンはラメリポジアルスプリーデングをほとんど
又は全く阻害しないし、コラプシン−１及びミエリンに対してわずかに感受的で
ある。これらのデータは成長コーン運動性を調整においてｒｈｏ及びｒａｃ１に
ついて顕著な役割を示し、そしてｒａｃ１がコラプシン−１作用を媒介すること
を示す。

【００３４】 物質及び方法 タンパクの調整；Ｇタンパク、コラプシン．ミエリン．モノメリックヒトＧタ
ンパク及びボツリヌスＣ３トランスフェラーゼをＧＳＴ融合タンパクとしてバク
テリア中に作り、次いでトロンビンで処理してＧＳＴ部分を除去した（Ｎｏｂｅ
ｓ ａｎｄ Ｈａｌｌ、１９９５）。トロンビンをｐ−アミノベンズアミジン−
アガロースに吸収させてサンプルから除いた。次の誘導体を作った。野生型ｒｈ
ｏＡ（ｒｈｏ）、Ｖａｌ（Ｖ１４ｒｈｏ）に変性された位置１４でＧｌｙをもつ
構造的に活性な型のｒｈｏＡ、野生型ｒａｃ１（ｒａｃ）、Ｖａｌ（Ｖ１２ｒａ
ｃ）に変性された位置１２にＧｌｙをもつ構造的に活性型のｒａｃ１、Ａｓｎ
（Ｎ１７ｒａｃ）に変性された位置１７にｔｈｒをもつｒａｃ１の優性ネガティ
ブ型、野生型のｃｄｃ４２（ｃｄｃ４２）、Ｖａｌ（Ｖ１２ｃｄｃ４２）に変性
された位置１２にＧｌｙをもつｃｄｃ４２の構造的に活性型、Ａｓｎ（Ｎ１７ｃ
ｄｃ４２）に変性された位置１７にＴｈｒをもつｃｄｃ４２の優先ネガティブ
型、及びＣ．ボツリヌス（Ｃ３）からのＣ３外酵素。ｒｈｏ及びＶ１４ｒｈｏタ
ンパクはＥ．コリー中で安定性を増すためにＰｈｅの位置２５でＡｓｎの置換を
含有する。

【００３５】 コラプシン−Ｈｉｓ₆は先に記載した如く調整される（Ｇｏｓｈｉｍａ他、１
９９５）。ミエリンフラクションはウシ脳から調整され、そして２％オクチルグ
リコシドによって抽出されたタンパクを透析によって洗浄剤の除去後に成長コー
ンコラプス中でテストされた（Ｉｇａｒａｓｈｉ他、１９９２）。

【００３６】 ＤＲＧ培養条件及び摩砕方法。チックＥ７ＤＲＧエクスプラントの調整及び解
離したニューロン培養は先に記載されている（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ他、１
９９４ａ：Ｇｏｓｈｉｍａ他、１９９５）。摩砕実験について、ニューロンは５
ｍｇ／ｍｌ ｒｈｏサブファミリータンパク又は０．１ｍｇ／ｍｌ Ｃ３トラン
スフェラーゼをもつ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴのｐＨ７．５中に懸濁し、次いでギルソンＰ２
００ピペット先端を介して５０回通過させた（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ他、１
９９４ａ；Ｇｏｓｈｉｍａ他、１９９５）。摩砕後にニューロンを１００μ／ｍ
ｌポリ−Ｌ−リジン及び２０μ／ｍｌラミンで連続的に予備被覆したグラス表面
上に１０％ＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍｌ ７Ｓ−ＮＧＦによって２５容量のＦ１２
中に培養した。ＬＰＡによる実験について、摩砕されたニューロンを血清を含ま
ない媒質（１％脂肪酸を含まないＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍｌ ７Ｓ−ＮＧＦ）に
成長コーンコラプス検定前に３時間の間に移した。

【００３７】 神経突起生長及び成長コーンコラプス。生長検定について、摩砕した細胞を
１．５〜２時間培養し、次いで処理されるべき薬剤を媒質に加えた。インキュベ
ーションのさらなる２〜３時間後に細胞を固定し、ニューロンにつき全神経突起
を７５〜１５０細胞について測定した（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ他、１９９４
ａ；Ｇｏｓｈｉｍａ他、１９９５）。エクスプラント培養についての成長コーン
コラプス検定は詳細に記載される（Ｐａｐｅｒ及びＫａｐｆｈａｍｍｅｒ、１９
９０；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ他、１９９４ａ；Ｇｏｓｈｉｍａ他、１９９
５）。摩砕細胞について、ニューロンを２０〜３０分間テスト化合物に添加する
前に４時間培養した。崩壊した成長コーンのフラクションを培養に関して評点し
た。 免疫組織学。解離したチックＥ７ＤＧＲニューロンを２４時間培養し、次いで
３０分間ＰＢＳ中でアイス冷却４％パラホルムアルデヒド、２０％サッカロース
で固定した。サンプルを次いでヒトｒａｃ１を攻撃する４μｇ／ｍｌ抗−ｒａｃ
１マウスモノクローナル抗体でインキュベートした（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ある場合には、ｒａｃ１タンパクの１ｍｇ／ｍｌを染色
の特異性を示すために抗体をもつインキュベーションに加えた。結合した抗体を
ホースラディシュベルオキシダーゼ酵素及びジアミノベンジジン基質（Ｇｏｓｈ
ｉｍａ他、１９９５）によってアビジン−ビオチン複合体方法（ＶｅｃｔｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出した。第１抗体溶液に対する（ｍｇ／ｍｌ組換
えｒａｃ１タンパクの添加が全て染色を完全に破壊した。成長コーンはまた微分
干渉対比観測によって検出し得た。

【００３８】 ［結果］ ［コラプシン−１作用とＬＰＡ及びトロンビン作用との比較］ コラプシン作用における小Ｇ蛋白の割合を評価する第一の段階として、コラプ
シン−１作用に対する容易に利用できる薬理学的剤の効果を、ＬＰＡ及びトロン
ビン作用に対するそれらの作用に比較した。ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤ＫＴ５
９２６は、ＬＰＡ誘導ニューライト収縮を阻止し、そしてまた成長円錐崩壊因子
として組み換えコラプシン−１の能力を低下させる（図１Ａ）。多数の他の剤
は、チロシンキナーゼ阻害剤、蛋白キナーゼＡ阻害剤、電圧感受性Ｃａチャンネ
ルブロッカーを含むコラプシン−１作用及びＫＣｌとの脱分極に対して殆ど又は
全く作用しない。さらに一般的な蛋白キナーゼ阻害剤スタウロスポリン及び蛋白
キナーゼＣ活性剤ＴＰＡは、ともに１０ｎＭより低い濃度で成長円錐崩壊を誘導
したが、それらの作用はコラプシン−１と相乗的ではなかった。

【００３９】 ＬＰＡ及びトロンビンの作用は、ヘテロトリマー性Ｇ蛋白に結合する受容体に
より媒介される（Ｊａｌｉｎｋら、１９９４）。組み換えコラプシン−１作用が
またトリマー性Ｇ蛋白活性化を含むかどうかを考察した。百日咳毒素（ＰＴＸ）
は、Ｇｏ／ｉクラスのヘテロトリマー性Ｇ蛋白のサブユニットをＡＤＰ−リボシ
ル化し、そして受容体によりそれらの活性化を阻止する。粗全脳膜抽出物（コラ
プシン−１を含むＢＭＥ）による成長円錐崩壊は、ＰＴＸによりブロックされる
が（Ｉｇａｒａｓｈｉら、１９９２）、しかしこれは、Ｇ蛋白のその修飾よりむ
しろＰＴＸの細胞表面結合性による（Ｋｉｎｄｔ及びＬａｎｄｅｒ、１９９
５）。ＰＴＸの単離されたオリゴマーＢフラクションは、細胞表面結合ドメイン
を含むが、精製された組み換えコラプシン−１誘導成長円錐崩壊をブロックしな
い（図１Ｂ）。従って、未処理ＰＴＸによるコラプシン−１能力の低下は、コラ
プシン作用がヘテロトリマー性Ｇ蛋白を含むことを示唆し、ＬＰＡ及びトロンビ
ン作用との類似を強調する。高いコラプシン−１濃度におけるＰＴＸ遮断の失敗
は、ＰＴＸ不感受性Ｇ蛋白又は非Ｇ蛋白依存機構の何れにも帰することができ
る。ＢＭＥ作用のオリゴマーＢ遮断は、粗抽出物におけるコラプシン−１以外の
崩壊剤の阻害を反映している。

【００４０】 ［外因性ｒｈｏサブファミリー蛋白を含むＤＲＧニューロンにおける基底的な発
芽後成長］ ＤＲＧニューロンのｒｈｏサブファミリーＧ蛋白の活性を調整するために、精
製した組み換え蛋白は、単離されたニューロンにより粉砕（ｔｒｉｔｕｒａｔｉ
ｏｎ）された。ニューロンは、粉砕直後平板培養され、ニューライト拡張をし、
そして成長円錐形態を２−５時間後観察した（図２）。全ての粉砕された蛋白
は、９５％以上の純度を有した（図２Ａ）。平板培養４時間後、バッファーによ
り粉砕されたニューロンは、粉砕されなかった細胞との区別されない。組み換え
蛋白はどれも、これらの条件下でラミニン被覆表面に付着するニューロンの数に
影響しない。ｒｈｏ活性を改変する蛋白では、Ｃ３トランスフェラーゼのみが発
芽後成長を改変した。ニューライト拡張は、Ｃ３トランスフェラーゼ処理を２倍
にし（図２Ｄ）、そして殆ど全ての成長円錐は、非常に減少したラメリポジウム
性広がりを示す（図２Ｂ、Ｃ）。これらのデータは、基底的な条件下ではｒｈｏ
の顕著なフラクションは活性化されそうであるとの可能性が生ずる。ｒａｃ１蛋
白では、構成的に活性な形は、崩壊した外観を有する成長円錐の％を増加させ
（図２Ｂ、Ｃ）そして統計的に有意に達しない低下したニューライト拡張に向か
う僅かな傾向が存在する（図２Ｄ）。これらの弱いＶ１２ｒａｃ作用は、コラプ
シン−１の作用に良く似ている。同じ濃度でのｃｄｃ４２蛋白は、成長円錐の外
観又はニューライト拡張を改変しない。

【００４１】 ［ｒｈｏサブファミリー蛋白を含むＤＲＧニューロンにおけるコラプシン−１感
度］ ｒｈｏファミリーメンバーにより粉砕されたニューロンは、コラプシン−１に
曝され、次に成長円錐の形態及びニューライト拡張を調べた。コントロールの培
養では、３０分間コラプシン−１への曝露は、１５％から７０％へ崩壊した成長
円錐の％を増加させる（図２Ｂ、Ｃ）。平板培養後２−５時間の間隔中のコラプ
シン−１の曝露は、５０％発芽後成長の程度を低下させる（図２Ｄ）。成長円錐
崩壊及びニューライト発芽後成長におけるコラプシン−１誘導の変化は、優性ネ
ガティブＮ１７ｒａｃにより処理されたニューロンにおいて顕著に減衰される
（図２Ｂ−Ｄ）。対照的に、構成的に活性なＶ１２ｒａｃ処理及び野生型ｒａｃ
処理の範囲は、コラプシン−１に対して本質的に正常な応答を示す。ｃｄｃ４２
蛋白又はバッファーによる粉砕は、コラプシン−１感度を改変しない。同様に、
野生型及び活性化されたｒｈｏは、コラプシン−１作用を改変しなかった。しか
し、増大したニューライト発芽後成長を示すＣ３トランスフェラーゼ処理ニュー
ロンは、コラプシン−１の阻害作用に最低の感受性を有する（図２Ｄ）。Ｃ３処
理培養における成長円錐の低下したラメリポジウム性形態は、コラプシン−１に
より僅かに増大している（図２Ｂ、Ｃ）。

【００４２】 ［ＤＲＧニューロンにおけるｒａｃ１作用の特徴］ 優性ネガティブＮ１７ｒａｃ粉砕の作用は、粉砕中存在するｒａｃ蛋白の投与
量に依存し、１ｍＬあたりの１ｍｇより多い濃度の蛋白が、コラプシン−１誘導
成長円錐崩壊の５０％より大きい阻害を達成するのに要求される（図３Ａ）。内
因性ｒａｃ１経路に関するＮ１７ｒａｃ作用の特異性は、優性ネガティブＮ１７
ｃｄｃ４２の不活性により示唆される（図２Ｂ、Ｄ）。さらに、構成的に活性な
Ｖ１４ｒｈｏ又はＶ１２ｃｄｃ４２ではない、構成的に活性なＶ１２ｒａｃの共
粉砕は、コラプシン−１誘導成長円錐崩壊のＮ１７ｒａｃ阻害を部分的に逆転す
る（図３Ｂ）。

【００４３】 優性ネガティブＮ１７ｒａｃによる粉砕後、ＤＲＧ成長円錐崩壊に関するコラ
プシン−１用量反応曲線は、１５のファクターで右にシフトする（ＥＣ５０、６
０ｐＭ−２ｎＭ、図３Ｃ）。Ｎ１７ｒａｃ粉砕細胞の成長円錐崩壊因子としての
コラプシン−１の残存する弱い作用は、粉砕法により達成される不完全なｒａｃ
１遮断により、又は非ｒａｃ１依存コラプシン−１誘導成長円錐崩壊機構による
ものであろう。上記のように、構成的に活性なＶ１２ｒａｃによる粉砕は、成長
円錐の２０％の崩壊を誘導する（図２Ｂ）。コラプシン−１誘導成長円錐崩壊に
関する用量反応曲線は、構成的に活性なＶ１２ｒａｃによる粉砕後２のファクタ
ーで左にシフトする（ＥＣ５０、６０ｐＭ−３０ｐＭ、図３Ｃ）。

【００４４】 もしｒａｃ１がコラプシン−１誘導成長円錐崩壊の内因性モジュレータである
ならば、それは成長円錐に存在しなければならない。ｒａｃ１の組織学的染色
は、蛋白が成長円錐に見いだされそして成長円錐のその尖端でフィロポジウム的
構造で存在することを立証する。そのため、蛋白はコラプシン−１作用を仲介す
る位置にある。

【００４５】 ［ＤＲＧニューロンにおけるＣ３作用］ 神経芽細胞腫細胞を含む哺乳動物の細胞においてｒｈｏを特異的にＡＤＰ−リ
ボシル化するＣ３エキソ酵素の能力は、すでに立証されている（Ｊａｌｉｎｋ
ら、１９９４）。ＤＲＧニューロンにおけるＣ３トランスフェラーゼの作用は、
粉砕中に存在するＣ３エキソ酵素の投与量に依存し、約１μｇ／ｍＬでもＤＲＧ
成長円錐の５０％以上を崩壊させる（図４Ａ）。構成的に活性なＶ１４ｒｈｏ
は、基底成長円錐崩壊又は発芽後成長を改変しないが（図２Ｂ、Ｄ）、この蛋白
による粉砕は、発芽後成長及び崩壊に対するＣ３作用を逆転する（図４Ｂ、
Ｃ）。構成的に活性なＶ１２ｒａｃ又はＶ１２ｃｄｃ４２の何れも、Ｃ３トラン
スフェラーゼの作用を逆転しない。一緒にして、これらのデータは、ＤＲＧニュ
ーロン中への粉砕後、ｒｈｏ阻害に対するＣ３トランスフェラーゼの特異性を支
持する。

【００４６】 ［優性ネガティブｒａｃ１はｒｈｏ不活性化の作用を遮断しない］ Ｃ３トランスフェラーゼ処理により生ずる成長円錐領域の低下は、増大したニ
ューライト拡張を伴うが、コラプシン−１により生ずるそれは、低下した拡張を
伴う。優性ネガティブｒａｃ１が、それがコラプシン−１作用を遮断するよう
に、Ｃ３トランスフェラーゼによるｒｈｏ阻害の作用を遮断できるかどうかが考
えられた。Ｃ３トランスフェラーゼ及びＮ１７ｒａｃがともに粉砕されるとき、
ＤＲＧニューライトはＣ３粉砕ニューライトに似ている（図５）。そのため、ｒ
ｈｏによるニューライト拡張のモジュレーションは、ｒａｃ１により主として仲
介されない。ｒｈｏは、成長円錐の形態及びニューライト拡張を調節するため
に、別の経路の一つ以上及び／又はｒａｃ１の機能の下流で作用するだろう。

【００４７】 ［ミエリンの阻害作用はｒｈｏファミリーメンバーにより仲介されない］ ＣＮＳミエリンの成分は、ニューライト再生に対する阻害的な影響を有しそし
てコラプシン−１と同様なやり方で培養されたＤＲＧニューロンの形態を改変す
る（Ｂａｎｄｔｌｏｗら、１９９３）。ＣＮＳミエリン抽出物への曝露後の成長
円錐崩壊は、Ｎ１７ｒａｃによる粉砕により改変されない（図６Ａ、Ｂ）。これ
は、ミエリンの阻害成分により利用されるＣａ⁺²ｉ依存経路（Ｂａｎｄｔｌｏｗ
ら、１９９３）が、コラプシン−１により利用されるｒａｃ１依存経路から区別
されることを示す。Ｃ３処理培養に存在する急速に成長する小さい成長円錐は、
ミエリンに対して不感受性である（図６Ａ、Ｂ）。リソホスファチジン酸（ＬＰ
Ａ）は、ＤＲＧ成長円錐の小さいフラクションの崩壊を誘導する（図６Ｃ）。こ
のフラクションは、Ｎ１７ｒａｃにより改変されず、ＬＰＡ誘導崩壊はコラプシ
ン−１誘導崩壊とは異なる経路を経て進むことを意味する。

【００４８】 ［討論］ ［ｒａｃ１はコラプシン−１作用を仲介する］ この研究からのデータのいくらかのラインは、ｒａｃ１はＤＲＧニューロンに
おけるコラプシン−１作用を仲介するという仮説を支持している。優性ネガティ
ブＮ１７ｒａｃの粉砕は、コラプシン−１による成長円錐崩壊を殆ど完全に破壊
し、そしてコラプシン−１によるニューライト発芽後成長阻害を極めて低下させ
る。他のｒｈｏサブファミリーメンバーは、これらの作用を有しない。成長円錐
中のｒａｃ１の存在は、コラプシン−１シグナルの役割と一致する。構成的に活
性なＶ１２ｒａｃは、コラプシン−１作用と僅かに似ている。少ない度合いのＶ
１２ｒａｃ作用は、（１）コラプシン−１誘導崩壊における非ｒａｃ１依存機構
の寄与、（２）粉砕法の非能率、又は（３）粉砕後３−５時間中に生ずる脱感作
機構によるだろう。コラプシン−１作用はＮ１７ｒａｃにより阻害されるが、同
じ形態的変化を誘導する他の細胞外蛋白の作用は、Ｎ１７ｒａｃによる粉砕によ
り遮断される。これは、ｒａｃ１がコラプシン−１作用に特異的に含まれそして
ＣＮＳミエリンの成分により誘導されるＣａ⁺²仲介成長円錐崩壊がこのモノマー
性Ｇ蛋白を利用しないことを示す。

【００４９】 ［ｒｈｏはニューライト発芽後成長を調節するが、コラプシン−１により改変さ
れない］ Ｃ３トランスフェラーゼによるｒｈｏの阻害は、またＤＲＧニューロンの形態
を改変する。これは、基底条件下でＤＲＧ成長円錐の顕著なレベルのｒｈｏ活性
化を意味する。さらに、データは、ｒｈｏ活性化が発芽後成長を低下させるが、
より大きな成長円錐の広がりを導くことを示唆する。ｒｈｏ活性を低下させるた
めの低投与量のＣ３により処理されたＤＲＧニューロンでは、構成的に活性なＶ
１４ｒｈｏは、成長円錐の広がりを増大させ、そしてニューライトの発芽後成長
を低下させる。低下した成長円錐の広がり及びｒｈｏ阻害ニューロンの増大した
発芽後成長速度は、コラプシン−１により最低でモジュレートされる。これらの
作用は、ｒｈｏ作用をｒａｃ１活性化及びコラプシン−１添加から区別する。ｒ
ｈｏはｒａｃ１及びコラプシン−１とは異なる作用を働くようであるが、成長円
錐の形態及び運動性は、添加ｒｈｏ及びｒａｃ調節を反映できる。ｒｈｏ活性化
は３Ｔ３繊維芽細胞におけるｒａｃ１活性化の下流であるが（Ｎｏｂｅｓ及びＨ
ａｌｌ、１９９５）、これはＤＲＧ成長円錐におけることではないように思われ
る。ｒｈｏは、コラプシン−１作用の主なメディエータであるように思われない
が、それは、ＬＰＡ及びトロンビンについて示唆されているように、他のＤＲＧ
成長円錐調節剤に関する目標であろう（Ｊａｌｉｎｋら、１９９４）。ミオシン
軽鎖キナーゼ阻害剤ＫＴ５９２６は、ｒｈｏによるミオシン軽鎖ホスホリラーゼ
調節を妨げるだろう（Ｋｉｍｕｒａら、１９９６）。そうすることにおいて、こ
の化合物は、Ｃ３トランスフェラーゼ作用を部分的に再生し、そしてコラプシン
−１感度を低下させる。

【００５０】 ［ｒｈｏ／ｒａｃ１活性化とＤＲＧ成長円錐運動性の三つの状態と相関性］ 現在の研究は、培養では、ＤＲＧ成長円錐に関する３種の交互の状態を同定す
る（図７）。基底条件下で、成長円錐は広がりそして中程度の速度で進む。コラ
プシン−１は、発芽後成長の速度を遅くし、そして成長円錐のラメリポジウム及
びフィロポジアを崩壊する。成長円錐の行動におけるコラプシン−１誘導改変
は、ｒａｃ１活性化により仲介され、そして優性ネガティブＮ１７ｒａｃの存在
により平滑化される。対照的に、Ｃ３トランスフェラーゼによるｒｈｏ機能の阻
害は、発芽後成長速度を増加させるが、一方成長円錐領域を減少させる。基底状
態は、ｒｈｏ活性化及びｒａｃ１不活性と相関しているように思われる。

【００５１】 ［ｒａｃ１活性化の機構：ｄｂ１蛋白、Ｇ蛋白カスケード、ＣＲＭＰ］ ｒａｃ１が細胞外コラプシン−１により活性化されるかも知れない機構は、不
明である。他の細胞タイプでは、ヒトＤｂ１に相同的なドメインを有する蛋白
は、グアニンヌクレオチド交換因子としてｒａｃ１の上流で作用するが（Ｂｏｇ
ｕｓｋｉ及びＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、１９９３）、ニューロン成長円錐におけるそ
れらの存在は、研究されていない。いくらかのクラスの受容体は、他の細胞でｒ
ａｃ１を活性化できると思われ、受容体チロシンキナーゼ、ヘテロトリマー性Ｇ
蛋白にカップリングしたセルペンチン受容体及びＴＮＦクラスのサイトカイン受
容体を含む。成長円錐シグナルトランスダクションにおけるヘテロトリマー性Ｇ
蛋白の中心的な役割は、多数の研究により支持されている（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔ
ｔｅｒら、１９９０；１９９３；１９９４ｂ；１９９５）。そこに提示されるデ
ータは、ヘテロトリマー性Ｇ蛋白（図１Ｂ）がコラプシンシグナル化に含まれる
であろうことを指示している。ニューロン性蛋白の細胞内ファミリーＣＲＭＰ
は、同定されており、これらはコラプシン作用を要するが、このシグナル化経路
の他のメンバーとのそれらの相互作用は、確立されていない（Ｇｏｓｈｉｍａ
ら、１９９５；Ｗａｎｇ及びＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、１９９６）。細胞内カ
ルシウムイオンレベルがコラプシン作用を仲介しているように思われることを示
すデータは存在しない。

【００５２】 ［ＤＲＧニューロン中のｒａｃ１エフェクター］ ｒａｃ１は、非ニューロン性細胞のアクチンに基づく細胞骨格を再組織でき、
そして多数の蛋白キナーゼを活性化できる（Ｎｏｂｅｓ及びＨａｌｌ、１９９
５；Ｈａｌｌ、１９９４；Ｃｏｓｃｏら、１９９５；Ｍｉｎｄｅｎら、１９９
５）。細胞の形状におけるコラプシン−１誘導変化は、蛋白キナーゼ例えばＰＡ
Ｋにより仲介できる（Ｍａｎｓｅｒら、１９９４）。ｒａｃ１による活性化後、
これらのキナーゼを、細胞骨格の機能を調節するように仮説を立てる。

【００５３】 実施例 ２ この実施例は、ｒｈｏ蛋白阻害に使用される組み換えＣ３アデノウィルスの発
現及び生物学的活性、そしてニューロン性ｒｈｏ蛋白活性の生体内モジュレーシ
ョンを報告する。 上記のように、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍからのＣ３エキソ酵素は、ｒｈｏを特
異的にＡＤＰ−リボシレートし、そしてこのＧ蛋白を不活性化する。ニューロン
性成長円錐運動性の調節へのこのクラスのＧ蛋白の寄与は、最近になってはじめ
て検討されている。神経芽細胞腫細胞において、リソホスファチジン酸は、ＧＰ
ＣＲを経て急速なニューライト収縮を誘導する（Ｊａｌｉｎｋら、１９９４）。
Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍからのＣ３エキソ酵素は、ＬＰＡの作用を遮断すること
が示され、ｒｈｏ活性化がこれらの細胞のニューライトの長さのＬＡＰ調節を仲
介することを指示する（Ｊａｌｉｎｋら、１９９４）。神経芽細胞腫細胞中への
ｒｈｏファミリー蛋白の注入は、実際に、成長円錐の形態及び軸索の発芽後成長
を改変する（Ｋｏｚｍａら、１９９７）。ニューライト発芽後成長の調節におけ
るｒｈｏ関連小Ｇ蛋白のさらなる証拠は、生体内のこれらの蛋白の活性化された
又は優性ネガティブの形を発現する研究から得られる。構成的に活性な又は優性
ネガティブ突然変異体の発現によるｒａｃ活性の改変は、ハエにおける多くのニ
ューロンからの軸索拡張で失敗する（Ｌｕｏら、１９９４）。小脳Ｐｕｒｋｉｎ
ｊｉｅ細胞における構成的に活性なｒａｃ１を発現するマウスは、樹状の形態に
おける改変を示す（Ｌｕｏら、１９９６）。 組み換えｒｈｏ、ｒａｃ１及びｃｄｃ４２蛋白は、粉砕されて実施例１の胚性
ヒヨコＤＲＧニューロン中に入れた。原型性の拡散可能な軸索リペレントである
コラプシン−１（セルナホリンＤ／ＩＩＩ）への軸索の応答を調べた。構成的に
活性なｒａｃ１は崩壊した成長円錐の割合を増大させ、そして優性ネガティブｒ
ａｃ１は、コラプシン誘導成長円錐の崩壊及びニューライトの発芽後成長のコラ
プシン阻害を遮断する。優性ネガティブｒａｃ１により処理されたＤＲＧニュー
ロンは、ミエリン誘導成長円錐崩壊に感受性を有したままである。ｃｄｃ４２の
同様な突然変異体は、成長円錐構造、ニューライト伸長又はコラプシン感度を改
変しない。活性化されたｒｈｏの添加は効果を有しないが、ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ
Ｃ３エキソ酵素によるｒｈｏの阻害は、ＤＲＧニューライトの発芽後成長を促
進する。

【００５４】 ニューライトの発芽後成長は、ｒｈｏ阻害後１５０％のコントロールレベルに
増加し、成長円錐のサイズは減少する。Ｃ３処理成長円錐は、殆ど又は全くラメ
リポジウム的広がりを示さず、そしてコラプシン又はＬＰＡに非感受性である。
ＣＮＳミエリン抽出物はコントロールニューロンから発芽後成長を５０％減少さ
せるが、この阻害性抽出物は、Ｃ３処理培養から発芽後成長を低下させない。 実施例１の培養の研究では、精製された蛋白は、機械的な手段によりニューロ
ン中に入れられる。それは、ニューロンに入らず又は個々の細胞の粉砕なしにｒ
ｈｏをＡＤＰリボシレートしない。酵素を伝達するために、Ｃ３蛋白を発現する
組み換えアデノ−及びヘルペスウィルスが由来された。これらのベクターは、緑
蛍光蛋白の増強した蛍光物（ＥＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とともにＣ３を発現
する。これらのベクターは、２週間（ＨＳＶ、Ｃａｒｌｅｚｏｎら、１９９７）
から２月間（アデノ、Ｃｈｏｉ−Ｌｕｍｂｄｂｅｒｇら、１９９７）、有害な作
用なしにニューロン中の他の外来蛋白の発現をさせた。アデノウィルスは、Ｅ１
及びＥ３欠損であり、それらは複製不能である（Ｈｅら、１９９８）。ヘルペス
ウィルスの調製品は、アンプリコン系を利用し、Ｃ３及びＥＧＦＰ配列はＨＳＶ
の即時型プロモータ４／５及びＨＳＶパッケージ部位を含むプラスミド中に挿入
された。組み換えウィルス調整品は、アンプリコンプラスミドによる配列トラン
スフェクション及びＨＳＶの即時型遺伝２欠損突然変異体による感染後、パッケ
ージ細胞系から得られる（Ｎｅｖｅら、１９９７）。

【００５５】 問題の蛋白の発現カセットは、アデノウィルスの主な後期プロモータにより駆
動される発現により、トランスファーベクターｐＱＢ１−ＡｄＢＭ５で構築され
た（図８；Ｍａｓｓｉｅら、１９９５）。線状のトランスファーベクターは、Ｈ
ＥＫ２９３細胞中にＣｌａＩ−切断Ｅ１／Ｅ３欠損ウィルス性ＤＮＡの長鎖と共
トランスフェクトされた。ウィルスは複製不能であるが、ウィルス粒子は、それ
らが安定にトランスフェクトされて、複製不能のウィルスから失われているＥ１
蛋白要素を発現するため、これらの細胞で増幅できる。ウィルスストックは、２
回プラーク精製され、塩化セシウム平衡遠心分離により増やされ、そして滴定さ
れた。

【００５６】 これらのウィルスストックは、ＣＯＳ−７腎細胞を感染するのに利用された。
感染２４時間以内に、９５％以上の細胞が、生細胞の輝緑色の蛍光により判断さ
れるように、ＧＦＰマーカー蛋白を発現する。ｒａｃ１蛋白の発現は、免疫プロ
ット分析により立証された（図９）。Ｃ３エキソ酵素の発現は、ウィルス感染細
胞のアクチン繊維染色における変化を観察することにより、間接的にドキュメン
トされた（図１０）。Ｃ３発現ＣＯＳ細胞は、コントロール培養に見られるラメ
リポジウム的広がりなしに拡張的突起を示す。

【００５７】 Ｃ３ウィルスは、培養中のＤＲＧ求心性ニューロンにおけるｒｈｏ機能をモジ
ュレートするのに使用された。１０−１００のＭＯＩ（感染多重度）のウィルス
感染５日後、ＤＲＧ培養中の本質的の全てのニューロン及び非ニューロン性細胞
は、ＧＦＰマーカー蛋白を発現する（図１１）。Ｃ３エキソ酵素発現ウィルスに
より感染された細胞からニューライトの発芽後成長は、阻害性因子コラプシン−
１及びＣＮＳミエリンに非感受性である（図１１）。

【００５８】 Ｃ３発現ウィルスは、皮質脊髄ピラミッドニューロンを感染する目的で、８週
令のオスラットの大脳皮質中に注入された。注入１週後、大多数の細胞はＧＦＰ
マーカーを発現する（図１２）。

【００５９】 結果は、Ｃ３ウィルスが、培養中の求心性ニューロンを感染せず、ＥＧＦＰの
直接的発現をせず、ニューロンをｓｅｒｎＤ及びＣＮＳミエリンに不感受性にす
ることを示す。成熟ラットの大脳皮質又はＤＲＧ中へのアデノウィルスの注入
が、少なくとも３週間ＥＧＦＰマーカーを発現させることは明らかである。予備
的研究では、Ｎｉｓｓｌ染色調製品では、ウィルス注入に伴う主な細胞の毒性は
存在しない。

【００６０】 上述は、当業者に本発明をいかに実施するかを教示する目的であり、そして記
述を読んで当業者に明らかになるその明白な変形及び変化のすべてをつくすこと
を目的としていない。しかし、全てのこれらの明白な変形及び変化が、以下の請
求の範囲に規定される本発明の範囲内に含まれることを目的とする。請求の範囲
は、記述が逆なことを特に指示していない限り、目的とする目標に合致するのに
有効な任意の配列の工程及び請求の範囲のコンポーネントをカバーすることを目
的とする。

【００６１】 Adams RH，Betz H，Puschel AW（1996）Mech Dev．57: 33-45. Bandtlow CE，Schimdt MF，Hassinger TD，Schwab ME，Kater SB（1993）Sc
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【００６２】 Hall A（1990）Science 249: 635-640. Hall A（1994）Annu Rev Cell Biol 10: 31-54. He TC，Zhou S，da Costa LT，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B（1998）Pr
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【００６３】 Li Y，Field PM，Raisman G（1997）Science 277: 2000-2002. Luo L，Hensch TK，Ackerman L，Barbel S，Jan LY，Jan YN（1996）Nature
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【００６４】 Schafer M，Fruttinger M，Montag D，Schachner M，Martini R（1996）Neu
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【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａはコプラシン(collapsin)−１誘発成長円錐（コーン）崩壊（コラプ
ス）がＫＴ５９２６よって減衰されることを図解するグラフである。

【図１Ｂ】 図１Ｂはコプラシン−１誘発成長円錐崩壊がＰＴＸによって減衰されることを
図解するグラフである。星印はオリゴマーＢフラクションが影響をもたなかった
にもかかわらず、ＰＴＸが２００ｐＭコラプシン−１で成長円錐崩壊を著しく減
少させたことを示す。

【図２Ａ】 図２Ａはｒｈｏサブファミリータンパクで摩砕（又は粉砕）されたＤＲＧニュ
ーロン中の成長円錐崩壊及び神経突起成長（又はニューライト発芽後成長）を示
す。粉砕に用いたタンパク調剤をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブルーで
染色した。４５、３６、２５及び２１ｋＤａのＭｒ基準の移動を右側に示す。

【図２Ｂ】 図２Ｂはｒｈｏファミリータンパクで粉砕したＤＲＧニューロン中の成長円錐
崩壊を示すグラフである。ＤＲＧニューロンをｒｈｏファミリータンパクの５ｍ
ｇ／ｍＬ及びＣ３トランスフェラーゼの０．１ｍｇ／ｍＬの量で所定のタンパク
で粉砕した。培養４時間後、成長円錐崩壊を２００ｐＭコラプシン−Ｈｉｓ₆に
２０分間さらして（灰色の棒）、又はさらさないで（濃色の棒）評価した。星印
で示す値は同一の条件下でのバッファー粉砕細胞と著しく異なることを示す。

【図２Ｃ】 ＤＲＧニューロンを所定のタンパクで粉砕し、図２Ｂで記載した如くコラプシ
ン−１にさらし、アクチンをＴＲＩＴＣ−ファロイジンでホルマリン固定細胞を
染色することによって視覚化した顕微鏡写真である。５００倍の拡大写真であ
る。

【図２Ｄ】 図２Ｄは、ＤＲＧニューロンをｒｈｏファミリータンパクの５ｍｇ／ｍＬ及び
Ｃ３トランスフェラーゼの０．１ｍｇ／ｍＬの量で所定のタンパクで粉砕し、培
養２時間後、ニューロンをさらに３時間コラプシン−Ｈｉｓ₆の０ｐＭ（濃色の
棒）又は２００ｐＭ（灰色の棒）にさらし、次いで細胞ごとに平均全神経突起成
長（ニューライト発芽後成長）を決定し、その結果を示すグラフである。星印で
示す値は同一の条件下でのバッファー粉砕細胞と著しく異なることを示す。

【図３Ａ】 図３ＡはＮ１７ｒａｃタンパクの各濃度で粉砕した後の成長円錐崩壊を２００
ｐＭコラプシンにさらし（〇）又はさらさないで（●）で決定した結果を示すグ
ラフである。

【図３Ｂ】 図３Ｂは成長円錐運動性のコラプシン−１調節におけるｒａｃ１を示すグラフ
である。ＤＲＧニューロンを０又は２．５ｍｇ／ｍＬのＮ１７ｒａｃ及び下記の
構造的に活性なＧタンパクの０又は５ｍｇ／ｍＬで粉砕した。ＢはＮ１７ｒａ
ｃ、ＣはＮ１７ｒａｃ＋Ｖ１４ｒｈｏ、ＤはＮ１７ｒａｃ＋Ｖ１２ｒａｃ、Ｅは
Ｎ１７ｒａｃ＋Ｖ１２ｃｄｃ４２、そしてＡはバッファーである。成長円錐崩壊
を２００ｐＭコラプシン−１の非存在下（濃色の棒）又は存在下（灰色の棒）で
決定した。Ｖ１２ｒａｃがコラプシン誘発成長円錐崩壊のＮ１７ｒａｃの阻害を
部分的に逆転することを示している。

【図３Ｃ】 図３Ｃは、バッファー（●）、構造的に活性なＶ１２ｒａｃ（◇）又は優性ネ
ガティブＮ１７ｒａｃ（◆）による粉砕後、成長円錐崩壊が所定の濃度のコラプ
シンにさらされたＤＲＧニューロンについて計量された結果を示すグラフであ
る。

【図４Ａ】 図４ＡはＤＲＧニューロンに関するＣ３トランスフェラーゼの活性を示すグラ
フである。Ｃ３トランスフェラーゼの所定の濃度をＤＲＧニューロンの粉砕を介
して存在させ、２００ｐＭコラプシン−１の存在下及び非存在下での成長円錐崩
壊を図２おける如く決定した。

【図４Ｂ】 図４ＢはＤＲＧニューロンについてのＣ３トランスフェラーゼの活性を示すグ
ラフである。バッファー、４μｇ／ｍＬのＣ３トランスフェラーゼ、５ｍｇ／ｍ
ＬのＶ１４ｒｈｏ、又は両タンパクによる粉砕ニューロンを０ｐＭ（灰色の棒）
又は２００ｐＭ（濃色の棒）コラプシン−Ｈｉｓ₆にさらし、成長円錐崩壊を定
量した結果を示す。Ａはバッファーであり、ＢはＣ３であり、ＣはＶ１４ｒｈｏ
であり、ＤはＣ３＋Ｖ１４ｒｈｏ、ＥはＣ３＋Ｖ１２ｒａｃであり、そしてＦは
Ｃ３＋Ｖ１２ｃｄｃ４２である。

【図４Ｃ】 図４ＣはＤＲＧニューロンについてのＣ３トランスフェラーゼの活性を示すグ
ラフである。図４Ｃは、図４Ｂにおける如く粉砕された細胞ごとに平均全神経突
起成長（ニューライト発芽後成長）を２００ｐＭコラプシン−Ｈｉｓ₆の存在下
（灰色の棒）又は非存在下（濃色の棒）で培養した後に決定した結果を示す。Ａ
はバッファーであり、ＢはＣ３であり、ＣはＶ１４ｒｈｏであり、ＤはＣ３＋Ｖ
１４ｒｈｏ、ＥはＣ３＋Ｖ１２ｒａｃであり、そしてＦはＣ３＋Ｖ１２ｃｄｃ４
２である。

【図５Ａ】 図５ＡはＣ３トランスフェラーゼの作用がＮ１７ｒａｃによってブロックされ
ないことを示すグラフである。図５Ａは、ＤＲＧニューロンをバッファー、５μ
ｇ／ｍＬのＮ１７ｒａｃ、０．１ｍｇ／ｍＬの３Ｃトランスフェラーゼ又は両タ
ンパクで粉砕し、ニューロンを４時間培養し、次いで成長円錐崩壊を２０分間２
００ｐＭコラプシン−Ｈｉｓ₆にさらし（灰色の棒）又はさらすことなく（濃色
の棒）検定した結果を示す。

【図５Ｂ】 図５ＢはＣ３トランスフェラーゼの作用がＮ１７ｒａｃによってブロックされ
ないことを示すグラフである。図５Ｂは所定のタンパクで粉砕したニューロンに
ついて細胞ごとに平均全神経突起成長（ニューライト発芽後成長）を培養後４時
間後に決定した結果を示す。

【図６Ａ】 図６Ａはミエリンによる成長円錐崩壊がＮ１７ｒａｃによってブロックされな
いことを示す。ＤＲＧニューロンを図に示す如く所定のタンパクで粉砕し、ニュ
ーロンを４時間培養し、そして成長円錐崩壊をバッファー（濃色の棒）又はＣＮ
Ｓミエリン抽出物（５μｇタンパク／ｍＬ、灰色の棒）に３０分にさらした後に
検定した結果を示す。

【図６Ｂ】 図６Ｂはミエリンによる成長円錐崩壊がＮ１７ｒａｃによってブロックされな
いことを示す図である。ＤＲＧニューロンを図に示す如く所定のタンパクで粉砕
し、ニューロンを２時間培養後、さらに２時間ＣＮＳミエリン抽出物の０タンパ
ク／ｍＬ（濃色の棒）又は５μｇタンパク／ｍＬ（灰色の棒）にさらし、細胞ご
とに平均全神経突起成長（ニューライ発芽後成長）を培養後４時間に決定し、そ
の結果を示す。

【図６Ｃ】 図６ＣはＬＰＡによる成長円錐崩壊がＮ１７ｒａｃによってブロックされない
ことを示す図である。ＤＲＧニューロンを図に示す如く所定のタンパクで粉砕
し、ニューロンを４時間培養し、そして成長円錐崩壊をバッファー（濃色の棒）
又はＬＰＡ（１μＭ、灰色の棒）に３０分間さらした後に検定した結果を示す。

【図７】 図７はＤＲＧ成長円錐機能のｒｈｏ／ｒａｃ調節についてのモデル図を示し、
ＤＲＧ成長円錐について三つの状態を形態学的に外観、神経突起速度（発芽後成
長速度）、ｒｈｏ活性化状態及びｒａｃ１活性化状態によってクラス分けしたも
のである。

【図８】 図８はタウー(tau)ＥＧＥＰと共にＣ３細胞外酵素（エキソ酵素）又はｒａｃ
１の発現のための主要素を説明するアデノウイルス転位ベクターマップを図解す
る。

【図９】 図９はｒａｃ１変異体のアデノウイルスについての発現の免疫ブロットを示
す。ＣＯＳ−７細胞を野性型ｒａｃ１（レーン１）、Ｖ１２ｒａｃ１（レーン
２）、Ｎ１７ｒａｃ１（レーン３）又は非ｒａｃ１タンパク（レーン４）を発現
する組換えアデノウイルスによって感染させ、感染後２４時間後の細胞分析はｒ
ａｃ１の低い内生的レベルが組換えアデノウイルスによって著しく増加されるこ
とを示す。

【図１０Ａ】 図１０ＡはＣ３細胞外酵素のアデノウイルスについての発現を組織学的に示
す。ＣＯＳ−７細胞をＧＦＰ（コントロール）を発現する組換えアデノウイルス
で感染させ、感染後１日目に細胞を固定し、アクチンフィラメントをロダミン−
パロイジン染色によって視覚化した。Ｃ３−発現細胞の変化した構造が見られ
る。細胞の９５％以上が培養中に感染された。

【図１０Ｂ】 図１０ＢはＣ３細胞外酵素のアデノウイルスについての発現を組織学的に示
す。ＣＯＳ−７細胞をＣ３＋ＧＦＰを発現する組換えアデノウイルスで感染さ
せ、感染後１日目に細胞を固定し、アクチンフィラメントをロダミン−パロイジ
ン染色によって視覚化した。Ｃ３−発現細胞の変化した構造が見られる。細胞の
９５％以上が培養中に感染された。

【図１１Ａ】 図１１ＡはＤＲＧニューロン培養をＣ３／ＧＦＰで感染させ、次いで４日間培
養した後、ニューロン表現型によって細胞中にマーカータンパクの発現を示す蛍
光顕微鏡写真である。

【図１１Ｂ】 図１１Ｂは組換えアデノウイルス発現Ｃ３が神経突起成長（ニューライト発芽
後成長）のミエリン誘発阻害を防止することを示す。ＤＲＧニューロン培養をＣ
３／ＧＦＰで感染させ、次いで４日間培養した後、細胞をトリプシン化し、そし
て添加せずに、コラプシン−１で又はＣＮＳミエリンの抽出物で置き換えた結果
を示す。神経突起成長（ニューライト発芽後成長）はこれらの阻害因子の添加に
よって減少しないことを示す。

【図１２】 図１２はＣ３／ＥＧＦＰアデノウイルスを８週齢のラットの大脳皮質に注入し
た後、数日後にラットを殺し、脳を蛍光顕微鏡で視覚化した顕微鏡写真である。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 患者に有効量の少なくとも一つのｒｈｏ蛋白阻害剤を投与す
   ることからなる軸索再生を必要とする患者の中枢神経系の軸索成長を促進する方
   法。
2. 【請求項２】 患者が、軸索又はかれらの非ニューロン性支持組織にｒｈｏ
   蛋白阻害剤を機械的に導入することにより治療される請求項１の方法。
3. 【請求項３】 ｒｈｏ蛋白阻害剤は、阻害剤を発現する複製不能のアデノウ
   ィルス、アデノ結合ウィルス又はヘルペスウィルスを患者に投与することにより
   導入される請求項１の方法。
4. 【請求項４】 阻害剤がアデノウィルスで発現される請求項３の方法。
5. 【請求項５】 阻害剤がアデノ結合ウィルスで発現される請求項３の方法。
6. 【請求項６】 ｒｈｏ蛋白阻害剤が、ｒｈｏ、ｒａｃ、及びｃｄｃ４２阻害
   剤及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項１−５の何れか一つの項の
   方法。
7. 【請求項７】 阻害剤が、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｃ３エキソ酵素である
   請求項１−５の何れか一つの項の方法。
8. 【請求項８】 患者が、患者にキメラＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｃ２／Ｃ３
   阻害剤を投与することにより治療される請求項７の方法。
9. 【請求項９】 患者が急性又は慢性の脊髄の損傷を受けた請求項１−５又は
   ８の何れか一つの項の方法。
10. 【請求項１０】 患者が白質の発作にかかっている請求項１−５又は８の何
    れか一つの項の方法。
11. 【請求項１１】 患者が外傷性脳の損傷を受けた請求項１−５又は８の何れ
    か一つの項の方法。
12. 【請求項１２】 製薬上許容される担体中のｒｈｏ蛋白阻害剤を含む中枢神
    経系の損傷の治療用の製薬組成物。
13. 【請求項１３】 Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｃ３エキソ酵素を含む請求項１
    ２の組成物。
14. 【請求項１４】 エキソ酵素が、複製不能のアデノウィルス、アデノ結合ウ
    ィルス又はヘルペスウィルスにより発現される請求項１３の組成物。
15. 【請求項１５】 エキソ酵素がアデノウィルスにより発現される請求項１４
    の組成物。
16. 【請求項１６】 エキソ酵素がアデノ結合ウィルスにより発現される請求項
    １４の組成物。
17. 【請求項１７】 キメラＣ２／Ｃ３ Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍエキソ酵素構
    築物を含む請求項１２の組成物。
18. 【請求項１８】 エキソ酵素構築物が、複製不能のアデノウィルス、アデノ
    結合ウィルス又はヘルペスウィルスにより発現される請求項１７の組成物。
19. 【請求項１９】 化合物のｒｈｏ蛋白阻害活性をアッセイすることを含む化
    合物の軸索再生活性の存在又は不存在をスクリーニングする方法。
20. 【請求項２０】 ｒｈｏ蛋白がｒａｃ１である請求項１９の方法。