JP2009529896A - 軸索の伸張阻害の収束的調節因子としてのｃｒｍｐ４の同定 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＲｈｏＡと物質的かつ機能的に相互作用して神経突起伸張の阻害を仲介するタンパク質としての細胞質リンタンパク質ＣＲＭＰ４の同定に関する。ｓｉＲＮＡは仲介するＣＲＭＰ４のノックダウンはミエリン支持体上での神経突起伸張を促進させ、これは神経突起伸張の阻害におけるＣＲＭＰ４の重要な役割を意味する。競合的阻害因子によるＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ結合の妨害は、ミエリン支持体およびアグリカン支持体上の神経突起伸張の阻害を弱める。Ｎｏｇｏによる神経細胞伸張円錐の刺激は、その伸張円錐のアクチンに富む中枢および末梢ドメイン内の離散的領域においてＣＲＭＰ４およびＲｈｏＡの共局在化を引き起こし、これは神経突起伸張の阻害の間の細胞骨格再配置における潜在的機能を示唆する。全体としてこれらのデータは、ＲｈｏＡ-ＣＲＭＰ４複合体が、伸張円錐環境において阻害性の攻撃に応答して形をなし、軸索伸張の阻害にとって必要なはっきり識別できる部位において細胞骨格の動態を調節することを意味する。ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ結合の競合的阻害は、ＣＮＳ損傷後の再生を促進するための新しい高度に特異的な治療達成手段を示唆している。

Description

本発明は、神経生物学分野における新規な応用分野に関する。より具体的には本発明は、新規なＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用と、そのミエリン阻害における役割の発見に関する。このＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用の特異的妨害が、ニューロン再生のミエリン依存性阻害を回避することを発見した。ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用およびＣＲＭＰ４活性の調節は、傷ついた中枢神経系(ＣＮＳ)または末梢神経系(ＰＮＳ)の軸索の修復を含めた複数の用途に役立つ可能性がある。ニューロンをミエリン依存性神経突起伸張の阻害に対して影響を受けなくする特異的ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ複合体アンタゴニストが同定されている。

関連出願の相互参照
本願は、２００６年３月１７日出願の米国仮出願第６０／７８３,０３０号に関する利益を請求し、本仮出願はその全体がこれにより参照により援用される。

成体哺乳動物の中枢神経系(ＣＮＳ)の外傷は、傷ついた軸索が自然に再生できないことが原因で臨床上の帰結に打撃を与えるという結果を生ずる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＣＳＰＧ)とそのミエリン関連阻害因子(ＭＡＩ)、ミエリン関連糖タンパク質(ＭＡＧ)(McKerracher等(1994)、Mukhopadhyay等(1994))、Ｎｏｇｏ-Ａ(Chen等(2000)、GrandPre等(2002)、Prinjha等(2000))、および希突起膠細胞-ミエリン糖タンパク質(ＯＭｇｐ)(Kottis等(2002)、Wang等(2002))は、軸索の再伸張を遮断する細胞内シグナル伝達のカスケードを開始して傷ついた軸索上に受容体分子を結合させる(MandemarkersおよびBarres(2005))。部分的にはＣＳＰＧおよびＭＡＩは、Ｒｈｏ-ＧＴＰアーゼ依存性細胞骨格の動態を乱すことによって軸索再生を阻害する。ＲｈｏＡおよび下流のエフェクターＲｈｏキナーゼ(ＲＯＣＫ)の遮断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で軸索の再生を促進させる(Dergham等(2002)、Borisoff等(2003)、Fournier等(2003))。しかしながら、ＲｈｏＡおよびＲＯＣＫが多くの細胞型において多重生理学的過程に影響を及ぼすことができること(RientoおよびRidley(2003))は、より特異的かつ効力のある治療達成方法を開発するために、神経突起伸張阻害の新規な細胞内シグナル伝達物質を同定する必要性に光を当てる。

ＣＲＭＰ類は細胞質リンタンパク質のファミリーであり、５種類の脊椎動物のファミリーメンバー(ＣＲＭＰ１〜５)を含む(Goshima等(1995)、Minturn等(1995)、Byk等(1996)、Gaetano等(1997)、Inatome等(2000))。ＣＲＭＰ１〜４の対立遺伝子はそれぞれ２種類の転写産物ａおよびｂを産生し、ＣＲＭＰｂバリアントは最初に同定されたＣＲＭＰａアイソフォームの長い方のアミノ末端バリアントである(Yuasa-Kawada等(2003))。ＣＲＭＰはジヒドロピリミジナーゼ(ＤＨＰアーゼ)すなわちピリミジン異化作用に関与する酵素と著しい配列類似性を共有するが、ＤＨＰアーゼの活性はＣＲＭＰについては何も述べられていない(WangおよびStrittmatter(1997))。もっと正確に言えば軸索の伸張および開通におけるＣＲＭＰの役割は明らかにされている。ＣＲＭＰは、ＵＮＣ-３３すなわちＣ.ｅｌｅｇａｎｓ中での軸索の誘導および伸展に影響を及ぼすタンパク質のホモログである(Hedgecock等(1985)、SiddiquiおよびCulotti(1991))。ＣＲＭＰ２は反発性ガイド因子(repulsive guidance cue)セマフォリン３Ａに応答して伸張円錐の崩壊を仲介し(Goshima等(1995))、またＣＲＭＰ２およびＣＲＭＰ４は神経突起伸張に影響を及ぼす(Mintum等(1995)、Quinn等(1999)、Quinn等(2003)、Yoshimura等(2005))。メカニズム的には、ＣＲＭＰ２はチューブリンヘテロダイマーと結合することができ、微小管集合体を作り上げて発生の間の軸索-樹状突起の結果を定着し(Fukata等(2002b)、Arimura等(2005))、またＣＲＭＰ４は、Ｆ-アクチン束形成を促進することができる(Rossienbroich等(2005))。さらにエンドサイトーシスにおけるＣＲＭＰ２の役割についても述べられており(Nushimura等(2003))、ＣＲＭＰ４ｂとインターセクチン、すなわちエンドサイトーシス-エキソサイトーシスアダプタータンパク質の関連性は、このアイソフォームのエンドサイトーシスの役割と一致している(Quinn等(2003))。

神経系の損傷および再生におけるＣＲＭＰタンパク質の役割は、広範囲には研究されていない。しかしながらＣＲＭＰ２ａは、ｉｎ ｖｉｖｏでの神経の再生において強力な神経突起伸展効果を有する(Suzuki等(2003))。ＣＲＭＰ１ａ、ＣＲＭＰ２ａ、およびＣＲＭＰ５ａのｍＲＮＡレベルは舌下神経損傷の後に増加し、またＣＲＭＰ４ａ発現は成人の坐骨神経運動ニューロンの再生の際に増加する(Minturn等(1995)、Suzuki等(2003))。これらは損傷に対するニューロンの応答におけるＣＲＭＰタンパク質のより全般的な役割を示唆している。

本発明の実施形態によればＣＮＳまたはＰＮＳの損傷後のニューロンの再生を促進する新規な方法が提供される。より具体的にはこの方法は、ニューロン再生のミエリンによる阻害を回避するためにＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用に対するアンタゴニストを使用(または投与)することを含む。Ｃ４ＲＩＰがこの型のアンタゴニストとして同定されている。

ＣＲＭＰ４ｂがＮｏｇｏ依存的な様式で、ＲｈｏＡと相互作用するという驚くべき発見の結果、ニューロン再生の阻害におけるこの複合体の潜在的な役割の研究に至った。続いてこれは、ＣＲＭＰ４の拮抗作用またはＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ相互作用の拮抗がニューロン再生の阻害を弱めるという次の判断をもたらした。このタンパク質-タンパク質相互作用は、ＣＮＳまたはＰＮＳ損傷後の治療の介入にとっての新規かつ特異的標的を提示する。

本発明の方法の利点の一つは、このアンタゴニストをニューロンの再生を促進するために損傷の部位(すなわちｉｎ ｓｉｔｕ)に直接適用できることにある。

本発明にはさらに、ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ相互作用を妨害する化合物、したがってニューロンの再生を促進するために用いることができる化合物を同定する方法が含まれる。

ＲｈｏＡと機能的に相互作用してニューロン再生の阻害を仲介する分子を同定するスクリーニングにおいて、コラプシン応答性仲介タンパク質４ｂ(ＣＲＭＰ４ｂ)が、Ｎｏｇｏ依存的様式でＲｈｏ ＧＴＰアーゼと相互作用する分子として同定された。

本発明の他の目的、利点、および特徴は、単に例として与えられるその好ましい実施形態の下記の非限定的な説明を添付の図面を参照して読めばより明らかになるはずである。

定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する当業界で普通の技能を持つ者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験においては本明細書中で記述されるものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料を次に記述する。本明細書中で述べるすべての刊行物は、それら刊行物中で報告され、かつ本発明に関連して使用することができる細胞系、ベクター、および方法体系を記述しまた開示する目的で参照により組み込まれる。本明細書中で使用される命名法は、単に特定の実施形態を記述するためであり、本発明の範囲を限定するものではない。

単数形「a」、「an」および「the」の使用には、その文脈が別にはっきり規定しない限り複数形への言及が含まれる。したがって、例えば「一の標的ポリヌクレオチド」についての言及には複数種の標的ポリヌクレオチドが含まれる。

本明細書および請求項中で使用される単語「含む（comprising）」(および「comprising」の任意の変化形、例えば「comprise」、「comprises」)、「有する(having)」(および「having」の任意の変化形、例えば「have」及び「has」)、「含む(including)」(および「including」の任意の変化形、例えば「include」及び「includes」)、または「含有する(containing)」(および「containing」の任意の変化形、例えば「contain」及び「contains」)は、包括的または無制約であり、さらなる列挙されていない要素または工程段階を排除しない。

用語「約」は、ある数値がその数値を求めるために使用される装置または方法の誤差の固有変動を含むことを示すために用いられる。

本明細書中で使用される用語「ＣＲＭＰ４」は、天然のＣＲＭＰ４ペプチド、ならびにこれらには限定されないがＣＲＭＰ４ａおよびＣＲＭＰ４ｂを含めたその任意の生物学的な活性のあるフラグメントまたはアナログを含むことを意図している。用語「フラグメント」と「アナログ」は、詳細な説明の中でより具体的に述べるように本発明の方法において有用なＣＲＭＰ４ペプチドを記述するために本明細書中では区別なく使用される。

用語「ＣＲＭＰ４」はまた、ＣＲＭＰ４ペプチドと相同のアミノ酸配列を有するＣＲＭＰ４のバリアントおよび機能アナログを包含する。したがって本発明には、置換体、欠失体、挿入体、逆位体、または環化体のような改変物を持つが、それにもかかわらず実質上ＣＲＭＰ４としての生物学的活性を有するこのようなＣＲＭＰ４のバリアントおよび機能アナログを含む医薬製剤が含まれる。用語Ｃ４ＲＩＰは、本発明の脈絡においてはＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ、すなわちＣＲＭＰ４ｂのユニークアミノ末端ドメイン内の最初の１２６個の残基を表すペプチドを意味する(図９参照)。本明細書中で使用される用語「Ｃ４ＲＩＰ」は、天然のＣ４ＲＩＰペプチドおよびその任意の生物学的な活性のあるフラグメントまたはアナログを含むことを意図している。

用語「フラグメント」および「アナログ」は、本発明の方法において有用なＣ４ＲＩＰペプチドを記述するために本明細書中では区別なく使用される。したがって本発明には、置換体、欠失体、挿入体、逆位体、または環化体のような改変物を坦持するが、それにもかかわらず実質上Ｃ４ＲＩＰとしての生物学的活性を有するこのようなＣ４ＲＩＰのバリアントおよび機能アナログを含む医薬製剤が含まれる。

用語「アナログ」は、ＣＲＭＰ４と関係があるが、改変されているペプチドを指す。しかしながらこの改変は、相互作用ドメインの生物学的活性を変えない。これら改変の理由には、これらには限定されないがペプチドの安定性および溶解度を増すこと、変性の確率を減らすこと、それが翻訳後に改変を受ける能力を変えること、製造コストを下げること、および大規模生産を向上させることが挙げられる。

本明細書中で使用される用語「ＲｈｏＡ」は、天然のＲｈｏＡペプチドおよびその任意の生物学的な活性のあるフラグメントまたはアナログを含むことを意図している。用語「フラグメント」および「アナログ」は、本発明の方法において有用なＲｈｏＡペプチドを記述するために本明細書中では区別なく使用される。

用語「ＲｈｏＡ」はまた、ＲｈｏＡペプチドと相同のアミノ酸配列を有するＲｈｏＡのバリアントおよび機能アナログを包含する。したがって本発明には、置換体、欠失体、挿入体、逆位体、または環化体のような改変物を持つが、それにもかかわらず実質上ＲｈｏＡとしての生物学的活性を有するこのようなＲｈｏＡのバリアントおよび機能アナログを含む医薬製剤が含まれる。

用語「アンタゴニスト」は、本発明の脈絡においてはＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ複合体形成または相互作用に普段関連している生物学的活性を阻害する、またはＣＲＭＰ４機能を阻害する分子を指す。アンタゴニストの例には、これらには限定されないがＣ４ＲＩＰ、Ｃ４ＲＩＰアナログ、およびＣ４ＲＩＰ誘導体が挙げられる。

用語「ｓｉＲＮＡ」は、本出願の脈絡においては低分子干渉ＲＮＡを意味する。遺伝子抑制またはノックダウンは、合成の低分子干渉ＲＮＡの使用により達成することができる。

用語「誘導体」は、核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと配列の機能誘導体の脈絡においては、元の配列と実質上類似の生物学的活性(機能または構造のいずれか)を保持している分子を意味する。この機能誘導体または等価物は、天然の誘導体であってもよく、また合成的に調製されてもよい。このような誘導体には、１または複数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列、ならびにそのタンパク質の生物学的活性が保存されるならば化学的模倣物が含まれる。同じことは、その配列の生物学的活性が全般に維持されるという条件で１または複数個のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有することができる核酸配列の誘導体にも当てはまる。タンパク質配列に関する場合、一般にその置換用アミノ酸は置換されるアミノ酸と似た物理化学的特性を有する。この類似の物理化学的特性には、電荷、かさ高さ、疎水性、親水性などが挙げられる。誘導体という用語は、本発明の主題のフラグメント、セグメント、バリアント、アナログ、または非ペプチド化学誘導体を含めた化学誘導体を含むことを意図している。

本発明の目的の場合、用語「神経突起の伸張」および「ニューロンの再生」は同義に使用される。

本明細書中で使用される用語「バリアント」は、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとはそれぞれ異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。或るポリヌクレオチドの典型的なバリアントは、別の基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。そのバリアントのヌクレオチド配列の違いは、その基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えてもまた変えなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、下記で考察するように、その基準配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、挿入、欠失、融合、および切り詰めを引き起こす。或るポリペプチドの典型的なバリアントは、別の基準ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般にその違いは、基準ポリペプチドとそのバリアントの配列が全体としてきわめて似ており、多くの領域では同一であるようなものである。バリアントおよび基準ポリペプチドは、任意に組み合わせた１または複数個の置換、付加、挿入、欠失によってアミノ酸配列が異なる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、その遺伝暗号によってコードされるものでもよく、またそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、１または複数の塩基に多型または突然変異を含む対立または偽対立バリアントなどの天然に存在するものであってもよく、また天然に存在することが知られていないバリアントであってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しないバリアントを突然変異誘発技術によってまたは直接合成によって生成することができる。用語「突然変異体」は、非天然のバリアントの上記定義に包含される。

後に言及する用語「スプライスバリアント」は、ある特定の遺伝子中に存在するエキソンのディファレンシャルまたは選択的スプライシングおよび集合に起因するバリアントである。一般に、コード化されたタンパク質は、大部分の領域においては全体的同一性を示すはずであるが、異なるエキソンによってコードされる特異的領域においては同一性を低下させる。

本明細書中で使用される「欠失」は、基準のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比べてそれぞれ１または複数個のアミノ酸またはヌクレオチド残基が不在のアミノ酸またはヌクレオチドの配列のいずれかの変化を指す。

本明細書中で使用される「挿入」または「付加」は、基準のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比べてそれぞれ１または複数個のアミノ酸またはヌクレオチド残基の付加を引き起こすアミノ酸またはヌクレオチドの配列の変化を指す。

本明細書中で使用される「置換」は、基準のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比べてそれぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドによる１または複数個のアミノ酸またはヌクレオチドの置き換えを指す。

本明細書中で使用される用語「誘導体」は、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの化学的改変物を指す。このような改変の実例は、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置き換えであることになる。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの誘導体はまた、適切に改変されたＤＮＡ構築物を用いて組換え系の中で発現させることによって産生することもできる。これら誘導体は、天然の分子の本質的な生物学的特徴の一部または全部を保持してもよく、またしなくてもよい。

本明細書中で使用される用語「同一性」は、２種類以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が共通して有する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の度合の尺度を指す。一般にそれら配列は、「アライメント」と呼ばれる最高度の合致が得られるように整列する。このような最適アライメントにはギャップが利用され、それらを挿入してSmith-Watermanアライメント法などの局所相同性アルゴリズムを用いて合致数を最大にする。用語「同一性」または「類似性」または「相同性」または「アライメント」は当業者にはよく知られており、またアライメントを実施し、同一性を測定する方法は、文献、すなわちDayhoff等の論文Meth Enzymol 1983, 91, 524、Lipman D JおよびPearson W Rの論文Science 1985, 227, 1435、Altschul等の論文J Mol Biol 1990, 215, 403、Pearson W Rの論文Genomics 1991, 11, 635、Gribskov MおよびDevreux J編 (1992) Sequence Analysis Primer, WH Freeman & Cie, New-York、Altschul等の論文Nature Gen 1994, 6, 119中に広く記述されまた教示されている。さらにアライメントを実施し、同一性および類似性を求める方法は、コンピュータプログラムおよびソフトウェアパッケージ中で体系化されており、それらの幾つかはインターネット上でウェブベースで見ることもでき、またアクセス可能である。好ましいソフトウェアには、これらには限定されないが、Blastn、Blastp、Blastx、tBlastnを含めたBLAST(Basic Local Alignment Search Tools)(Altschul等の論文J Mol Biol 1990, 215, 403)、FastAおよびTfastA(PearsonおよびLipmanの論文PNAS 1988, 85, 2444)、Lasergene99(DNASTAR, Madison Wis.)、Omiga 2.0またはMacVector(Oxford Molecular Group, Cambridge, UK)、Wisconsin Package(Genetic Computer Group (GCG), Madison, Wis.)、Vector NTI Suite(InforＭax Inc., N. Bethesta, Md.)、GeneJockey II(Biosoft, Cambridge, UK)が挙げられる。

実例として配列番号３、配列番号４、または配列番号６の基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに関して言えば、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、このポリヌクレオチド配列が配列番号３、配列番号４、または配列番号６の基準ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個当たり５箇所までの突然変異(または分岐型ヌクレオチド)を含むことができることを除いてその基準配列と同一であるものである。換言すれば基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、その基準配列中のヌクレオチドの５％まで欠失または別のヌクレオチドで置換することができ、あるいは基準配列中の全ヌクレオチドの５％まで複数個のヌクレオチドをその基準配列中に挿入することができることを意図している。

基準配列のこれら突然変異は、その基準ヌクレオチド配列の５′または３′末端位置か、あるいはその基準配列中のヌクレオチド間に個々に、またはその基準配列内の１または複数の連続した集団中に散らばってこれら末端位置間のどこかで起こることができる。

同様に配列番号１、配列番号２、または配列番号５の基準アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば９５％の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに関して言えば、そのポリペプチド配列が、配列番号１、配列番号２、または配列番号５の基準アミノ酸配列のアミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸の変更を含むことができることを除いてその基準配列と同一であるものである。換言すれば基準アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、その基準配列中のアミノ酸残基の５％まで欠失または別のアミノ酸で置換することができ、あるいは基準配列中の全アミノ酸残基の５％まで複数個のアミノ酸をその基準配列中に挿入することができることを意図している。基準配列のこれらの変更は、その基準アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置か、あるいはその基準配列中の残基間に個々に、またはその基準配列内の１または複数の連続した集団中に散らばってこれら末端位置間のどこかで起こることができる。

本明細書中で使用される用語「生物学的な活性のある」または「生物学的活性」は、天然に存在する分子の構造的、制御的、生化学的、電気生理学的な機能、または細胞機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的な活性のある」とは、適切な動物または細胞において特異的免疫応答を誘発する、また特異的抗体と結合する天然の、組換えの、または合成のＣＲＭＰ４、Ｃ４ＲＩＰ、またはＲｈｏＡ、あるいはその任意のオリゴペプチドの能力を指す。

本明細書中で使用される用語「調節する」とは、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの生物学的活性の変化または変更を指す。調節は、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰのタンパク質活性の増加または低下、その結合特性の変化、あるいはその生物学的、機能的、または免疫的特性の任意の他の変化を指す。

タンパク質に関して本明細書中で使用される用語「部分」(「ある特定のタンパク質の一部」の場合のように)は、そのタンパク質のフラグメントを指す。そのフラグメントのサイズは、アミノ酸残基４個から、全アミノ酸配列から１個のアミノ酸が抜けたものまでの範囲にわたることができる。したがって「配列番号１、配列番号２、または配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む」タンパク質は、完全長のＣＲＭＰ４、Ｃ４ＲＩＰ、またはそれらのフラグメントを包含する。

本発明の別の実施形態では、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰ、あるいはその融合タンパク質またはそれらの機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを組換えＤＮＡ分子中で使用して、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの発現を仕向けることができる。遺伝暗号の固有の縮重のため、実質的に同一または機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を生成し、それらの配列を用いてＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをクローン化し、また発現させることができる。

本発明の別の実施形態では、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする天然、改変、または組換えポリヌクレオチドを異種配列に結合して融合タンパク質をコードすることもできる。例えばＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用の阻害因子に関してペプチドライブラリーをスクリーニングするには、市販の抗体により認識することができるキメラＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰタンパク質をコードするのが便利なこともある。融合タンパク質はまた、そのＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰを切断し精製して異種部分から離すことができるように、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰコーディング配列とその異種タンパク質配列の間に位置した切断部位を含有するように操作することもできる。

別の実施形態では、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰのコーディング配列を、当業界でよく知られている化学的方法を用いて全部または一部合成することができる(Caruthers等の論文Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 1980, 215~23、Horn等の論文Nuc. Acids Res. Symp. Ser.1980, 225~232参照)。別法ではＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰのアミノ酸配列あるいはその部分を合成するための化学的方法を用いてそのタンパク質自体を生成することができる。例えばペプチドの合成を様々な固相技術(Roberge等の論文Science 1995, 269, 202)を用いて行うことができ、また自動合成は、例えばABI 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)を用いて達成することができる。

新たに合成されたペプチドは、分取高性能液体クロマトグラフィーにより実質上精製することができる(例えば、Creighton T.著 (1983)「Proteins, Structures and Molecular Principles」W. H. Freeman & Co., New York, N. Y.)。これら合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定により確めることができる(例えばエドマンの分解手順、Creighton T. (1983)上記))。さらにＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰのアミノ酸配列もしくはその部分を直接合成の間に変えて、かつ／または化学的方法を用いてそれを他のタンパク質もしくはその任意の部分由来の配列と結合させてバリアントポリペプチドを生成することができる。

生物学的な活性のあるＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰを発現させるには、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするヌクレオチド配列あるいは機能的等価物を適切な発現ベクター、すなわちその挿入されたコーディング配列の転写および翻訳にとって必要な要素を含有するベクター中に挿入することができる。

当業者によく知られている方法を用いてＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰコーディング配列および適切な転写および翻訳制御因子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉvｏ遺伝的組み換えが挙げられる。このような技術は、Sambrook J編「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」CSHL Press, 1989, Cold Spring Harbor, N. Y.およびAusubel等著「Current Protocols in Molecular Biology」John Wiley & Sons, 1989, New York, N. Y.中に記載されている。

ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰコーディング配列を入れ発現させるために様々な発現ベクター／宿主系を利用することができる。それらには、これらに限定されないが組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物、酵母発現ベクターで形質転換した酵母、ウィルス発現ベクター(例えばバキュロウィルス)に感染させた昆虫細胞系、ウィルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウィルス(ＣａＭＶ)、タバコモザイクウィルス(ＴＭＶ))もしくは細菌発現ベクター(例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド)で形質転換した植物細胞系、あるいは動物細胞系が挙げられる。

これら「制御因子」または「調節配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターのそれら非翻訳領域(エンハンサー、プロモーター、５′および３′非翻訳領域)である。このような要素は、それらの強度および特異性が変わる場合がある。利用されるベクター系および宿主に応じて、構成的および誘発性プロモーターを含めた任意の数の適切な転写および翻訳因子を使用することができる。例えば細菌系におけるクローニングの場合、Bluescript RTMファージミド(Stratagene, La Jolla, Calif.)またはpSport1 TMプラスミド(Gibco BRL)のハイブリッドｌａｃＺプロモーターおよびｐｔｒｐ-ｌａｃハイブリッド類などの誘発性プロモーター等を使用することができる。他の好ましい原核生物ベクターには、これらには限定されないがpQE-9、pQE60、pQE70(Quiagen)、pNH8A、pNH16a、pNH18a、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)が挙げられる。バキュロウィルスポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞中で使用することができる。植物細胞のゲノム(例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子)から得られる、あるいは植物ウィルス(例えば、ウィルスプロモーターまたはリーダー配列)から得られるプロモーターまたはエンハンサーをベクターの中にクローン化することができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウィルス由来のプロモーターが好ましい。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列の多重コピーを含有する細胞系を作製することが必要な場合には、ＳＶ４０またはＥＢＶ系のベクターを適切な選択マーカーと共に使用することができる。

細菌系では、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰ向けの用途に応じて多くの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体の誘発用に大量のＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰが必要な場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質の発現を目的とするベクターを使用することができる。このようなベクターには、これらには限定されないがBluescript RTM(Stratagene, La Jolla, Calif.)などの多機能Ｅ.ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクターが挙げられる。ここで、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列は、ハイブリッドタンパク質を産生するように、β-ガラクトシダーゼのアミノ末端メチオニンおよびそれに続く残基７個の配列とインフレームでベクター中へ結合させることができる。ｐＩＮベクター(Van HeekeおよびSchusterの論文J. Biol. Chem. 1989, 264, 5503)およびこれと同様のもの、ならびにｐＧＥＸベクター(Promega, Madison, Wis.)もまた、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用することができる。一般にこのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズへの吸着、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶離によって容易に溶解細胞から精製することができる。このような系中で作製されるタンパク質は、この考察対象のクローン化ポリペプチドを意のままにそのＧＳＴ部分から放出させることができるようにへパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計することができる。

細菌に加えて酵母などの真核微生物もまた、宿主として使用することができる。多くの他の株または種が市販されているが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ(パン酵母)の実験株が最もよく用いられる。例えばBroach等の２.mu.複製起点(Meth Enzymol 1983, 101, 307)または他の酵母適合性複製起点(例えば、Stinchcomb等の論文Nature, 1979, 282, 39、Tschmper等の論文Gene 1980, 10, 157、Clarke等の論文Mech Enzymol 1983, 101, 300参照)を使用することができる。酵母ベクターの制御配列には、解糖酵素合成用プロモーター(Hess等の論文J Adv Enzyme Reg 1968, 7, 149、Holland等の論文Biochemistry 1978, 17, 4900)が挙げられる。当業界で知られている更なるプロモーターには、３-ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hitzeman等の論文J Biol Chem 1980, 255, 2073)、アルコール酸化酵素、およびＰＧＨのプロモーターが挙げられる。伸張条件および／または遺伝的背景によって制御される転写の更なる利点を有する他のプロモーターは、アルコール脱水素酵素２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素の代謝に関連する分解酵素、α因子系、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素類のプロモーター領域である。また、ターミネーター配列はそのコーディング配列の３′末端にあることが望ましいと考えられる。このようなターミネーターは、酵母由来の遺伝子ではコーディング配列の後の３′非翻訳領域中に見いだされる。概説についてはAusubel等著「Current Protocols in Molecular Biology」John Willey & Sons, 1989, New York, N.Y.、Grant等の論文Meth Enzymol, 1987, 153, 516を参照されたい。

植物発現ベクターを使用する場合、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列の発現は、複数種のプロモーターのいずれかによって推進することができる。例えばＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウィルスプロモーターを単独またはＴＭＶ由来のωリーダー配列と組み合わせて使用することができる(Takamatsu等の論文EMBO J. 1987, 6, 307、Brisson等の論文Nature 1984, 310, 511)。別法ではＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる(Coruzzi等の論文EMBO J.. 1984, 3, 1671、Broglie等の論文Science 1984, 224, 838、Winter等の論文Results Probl. Cell Differ 1991, 17,85)。これらの構築物を、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションによって植物細胞中に導入することができる。このような技術は、複数の一般に入手可能な概説中に記載されている(例えば、「McGraw Hill Yearbook of Science and Technology」中のHobbs SまたはMurry L Eの記述(McGraw Hill, 1992, New York, N.Y., pp.191~196)、あるいは「Methods for Plant Molecular Biology」中のWeissbachおよびWeissbachの記述(Academic Press, 1988, New York, N.Y., pp.421~463)を参照されたい)。

ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰを発現させるために昆虫系もまた使用することができる。例えばこのような一つの系では、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅ中で外来遺伝子を発現させるためにＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ核多角体病ウィルス(ＡｃＮＰＶ)がベクターとして使用される。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列を、ポリヘドリン遺伝子などのウィルスの非必須領域の中にクローン化し、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの挿入が成功すると、そのポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質を欠いた組換えウィルスを産生することになる。次いでこの組換えウィルスを用いて、例えばＳ.ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅに感染させることができ、その中でＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰを発現させることができる(Smith等の論文J. Virol 1983, 46, 584、Engelhard等の論文Proc Natl Acad Sci 1994, 91, 3224)。

哺乳動物の宿主細胞では、ウィルスを用いた複数の発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウィルスを使用する場合、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列を、後期プロモーターおよび三分節系リーダー配列からなるアデノウィルス転写／翻訳複合体中に結合することができる。ウィルスのゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域中への挿入を用いて、感染した宿主細胞中でＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰを発現させる能力のある生存可能なウィルスを得ることができる(LoganおよびShenkの論文Proc Natl Acad Sci 1984, 81, 3655)。さらにラウス肉腫ウィルス(ＲＳＶ)エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることができる。

また特異的開始シグナルを用いてＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列のより効率的な翻訳を達成することができる。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよびその隣接配列が挙げられる。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列、それらの開始コドン、および上流配列を適切な発現ベクター中に挿入する場合、追加の転写または翻訳制御シグナルが何も必要でない場合もある。しかしコーディング配列またはその一部分のみを挿入する場合には、ＡＴＧ開始コドンを含めた外因性翻訳制御シグナルが与えられるべきである。さらにその開始コドンは、全挿入断片の正しい翻訳を確実にするためにその正しい読み枠内に存在すべきである。外因性の翻訳因子および開始コドンは、天然および合成の様々な起源のものである場合がある。発現の効率は、使用されるその特定の細胞系にとって適切であるエンハンサー、例えば文献(Scharf等の論文Results Probl Cell Differ 1994, 20, 125、Bittner等の論文Meth Enzymol 1987, 153, 516)中に記載されているものなどを含めることにより高めることができる。

さらに宿主細胞株を、所望するやり方でその挿入された配列の発現を調節する能力、またはその発現したタンパク質をプロセスする能力に関して選択することができる。ポリぺプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられるがこれらには限定されない。また、タンパク質の「ｐｒｅｐｒｏ」体を切断する翻訳後プロセシングを用いて正しい挿入、折りたたみ、および／または機能を助長することもできる。外来タンパク質の正しい改変およびプロセシングを確実にするために、そのような翻訳後活性に対して特異的な細胞機構および独特の仕組みを有するＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、Ｗ１３８、およびＣＯＳなどの様々な宿主細胞を選択することができる。

組換えタンパク質を長期間にわたって高収率で産生させるためには安定した発現が好ましい。例えばウィルスの複製開始点および／または内因性の発現因子を含有することができる発現ベクターと、その同じまたは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子とを用いて、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰを安定して発現させる細胞系を形質転換することができる。ベクターの導入後、選択培地に変える前に細胞を強化培地中で１〜２日間伸張させることもできる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在は細胞の伸張および回収を可能にし、かつ導入された配列を成功裡に発現させる。安定して形質転換された細胞の抵抗性クローンを、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。

形質転換された細胞系を回収するために任意の数の選択システムを用いることができる。それらには、これらに限定されないが、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(Wigler等の論文Cell 1977, 11, 223)およびアデニンホスホ-リボシルトランスフェラーゼ(Lowy等の論文Cell 1980, 22, 817)の遺伝子があり、それぞれｔｋ＋-またはａｐｒｔ＋-細胞中で使用することができる。また代謝拮抗物質抵抗性、抗生物質抵抗性、または除草剤抵抗性、例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ(Wigler等の論文Proc Natl Acad Sci 1980, 77, 3567)や、アミノグリコシド(ネオマイシンおよびＧ４１８)に対する抵抗性を付与するｎｐｔ(Colbere-Garapin等の論文J Mol Biol 1981, 150, 1)や、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する抵抗性をそれぞれ付与するａｌｓまたはｐａｔ(Murry L E、上記)を選択の基準として用いることもできる。更なる選択遺伝子、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤが述べられている(HartmanおよびMulliganの論文Proc Natl Acad Sci 1988, 85, 8047)。最近、可視マーカーの使用のため、アントシアニン、β-グルクロニダーゼとその基質のＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質のルシフェリンなどのマーカーが人気を集めており、これらは形質転換細胞を同定するためだけでなく、特異的ベクター系に起因する過渡的または安定的なタンパク質発現の量を定量化するためにも広く使用される(Rhodes等の論文Methods Mol Biol 1995, 55, 121)。

マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、その問題の遺伝子が存在することを示唆するが、その存在および発現を確認する必要があることもある。例えばＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列を含有する組換え細胞をマーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。別法ではマーカー遺伝子を、単一プロモーターの制御下で、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列とタンデムに配列することもできる。誘発または選択を受けてのマーカー遺伝子の発現は、一般にそれに加えてタンデム遺伝子の発現も示す。

別法ではＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰのコーディング配列を含有し、かつＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰを発現させる宿主細胞は、当業者に知られている様々な手順によって同定することができる。それらの手順には、これらに限定されないがＤＮＡ-ＤＮＡまたはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド形成ならびにタンパク質のバイオアッセイまたはイムノアッセイ技術があり、これらにはその核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための膜、溶液、またはチップに基づく技術が含まれる。

ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするポリヌクレオチドのプローブ、あるいはその部分またはフラグメントを用いたＤＮＡ-ＤＮＡまたはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド形成または増幅によって検出することができる。核酸増幅によるアッセイは、ＣＲＭＰ４およびＣ４ＲＩＰコーディング配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用してＣＲＭＰ４およびＣ４ＲＩＰをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する形質転換細胞を検出することを伴う。本明細書中で使用する「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、プローブとして使用することができる少なくともヌクレオチド約１０個の、またヌクレオチド約６０個もの、好ましくはヌクレオチド約１５から３０個の、より好ましくはヌクレオチド約２０〜２５個の核酸配列を指す。

そのタンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いたＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの発現を検出および測定する様々なプロトコルが当業界で知られている。例には、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、放射性免疫検定法(ＲＩＡ)、および蛍光活性化細胞分取法(ＦＡＣＳ)が挙げられる。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰ上で２個の非干渉性エピトープと反応するモノクローナル抗体を利用したモノクローナルによる２部位イムノアッセイが好ましい場合もあるが、競合結合検定法を使用することもできる。これらのまた他のアッセイが、他の箇所(Hampton等の著「Serological Methods: A Laboratory Manual」APS Press, 1990, St-Paul, MichおよびMaddox等の論文J Exp Med 1983, 158, 1211)に記載されている。

種々様々な標識とそれらの接合技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸アッセイにおいて使用することができる。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするポリヌクレオチドに関係した配列を検出するための標識したハイブリッド形成またはＰＣＲのプローブを生成する手段には、標識ヌクレオチドを用いたオリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、またはＰＣＲ増幅が挙げられる。別法ではＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰもしくはその任意の部分をコードする配列を、ｍＲＮＡプローブ産生用のベクターの中にクローン化することもできる。このようなベクターは当業界で知られまた市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識したヌクレオチドの添加によってｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。これらの手順は、例えばPharmacia & Upjohn(Kalamazoo, Mich)、Promega(Madison Wis.)、およびU.S. Biochemical Corp.(Cleveland, Ohio)、あるいはAmbion(Austin, Tex.)から入手できる様々な市販のキットを用いて行うことができる。使用することができる好適なリポーター分子または標識には、放射性核種と、酵素と、蛍光、化学発光、または色素物質と、基質と、補因子と、阻害因子と、磁気粒子などがある。

ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、タンパク質の発現および細胞培養物からの回収に適した条件下で培養することができる。組換え細胞によって産生されるタンパク質は、その配列および／または使用されるベクターに応じて分泌することも、また細胞内に内蔵することもできる。当業者には明らかなようにＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通じてＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰを分泌することを指示するシグナル配列を含有するように設計することができる。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列を、ポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に接合するために他の組換え構築法を用いることもでき、これは可溶性タンパク質の精製を容易にするはずである。このような精製を容易にするドメインには、これらには限定されないが、固定化金属による精製を可能にするヒスチジン-トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリンによる精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸展／アフィニティー精製システム(Immunex Corp., Seattle, Wash.)において利用されるドメインが挙げられる。

組換え生成に加えて、固相技術を用いた直接ペプチド合成によりＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰのフラグメントを生成することもできる(Stewart等著「Solid-Phase Peptide Synthesis」WH Freeman & Co., 1969, San Francisco, Caif.、Merrifield等の論文J Am Chem Soc 1963, 85, 2149参照)。化学合成は、手操作による方法を用いて、または自動操作により行うことができる。自動操作による合成は、例えばApplied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)を用いて達成することができる。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの様々なフラグメントを化学的に別々に合成し、化学的方法を用いて結合して完全長の分子を生成することができる。

本発明の他の実施形態ではＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰもしくはそのフラグメントを、治療、診断、またはスクリーニングの目的に使用することができる。

抗体は、当業界でよく知られている方法を用いて産生することができる。そのような抗体には、これらには限定されないがポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントを含めることができる。中和抗体(すなわち二量体形成を阻害するもの)が、治療の用途にとっては特に好ましい。

抗体の産生に関してはヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含めた様々な宿主を、免疫原特性を有するＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰもしくはその任意のフラグメントまたはオリゴペプチドを注射することによって免疫にすることができる。宿主の種に応じて様々なアジュバントを用いて免疫応答を増すことができる。そのようなアジュバントには、これらに限定されないがフロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルと、リゾレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド、オイルエマルション、スカシ貝ヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの表面活性物質とが挙げられる。ヒトに使用されるアジュバントのなかではＢＣＧ(ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ-Ｇｕｅｒｉｎ)およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。

ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰに対する抗体を誘発するために用いられるペプチド、フラグメント、またはオリゴペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。それらはまた天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが好ましく、また小型の天然に存在する分子の全アミノ酸配列を含有することもできる。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰのアミノ酸の短い領域を、スカシ貝ヘモシアニンや、キメラ分子に対して産生される抗体などの別のタンパク質のものと融合させることもできる。

様々なイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングに使用することができる。確立された特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いた競合結合検定または放射性免疫検定のための数多くのプロトコルが当業界で知られている。このようなイムノアッセイは、一般にＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰとその特異的抗体との間の複合体の形成の測定を伴う。２個の非干渉性ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰエピトープと反応するモノクローナル抗体を利用したモノクローナルによる２部位イムノアッセイが好ましいが、競合結合検定法もまた使用することができる(Maddox、上記)。

本発明の別の実施形態では、ＣＲＭＰ４、Ｃ４ＲＩＰ、あるいはその任意のフラグメント、あるいはアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ配列を治療の目的に使用することができる。一態様では、タンパク質の合成を遮断することが望ましい状況においては、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスまたはｓｉＲＮＡを使用することができる。具体的には細胞を、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することができる。したがってアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ配列を、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの活性を調節するために、あるいは遺伝子機能の制御を達成するために使用することができる。このような技術は今では当業界でよく知られており、ｓｉＲＮＡ、センス、またはアンチセンスオリゴマー、あるいはより大型のフラグメントを、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列のコード領域または制御領域に沿って様々な箇所から設計することができる。

さらに治療の領域においてＣ４ＲＩＰ、あるいはＣ４ＲＩＰの誘導体、アナログ、バリアント、またはフラグメントを、固有の細胞膜転座配列(またはＭＴＳ)を含むように操作することができる。「インターナリゼーション」または「インターナライジング」配列とも呼ばれるこのようなＭＴＳを含めることは、細胞膜を横切って翻訳ペプチドを運ぶことを可能にする(Rojas等の論文1998、Winton等の論文2002)。これは、生物系での治療への応用の可能性を広げる。２つのＭＴＳの例をＣ４ＲＩＰの有無について図１０に示す。図１０ａ)はＣ３-０５インターナライジング配列を有するＣ４ＲＩＰ配列を示し、一方図１０ｃ)はカポジＭＴＳを有するＣ４ＲＩＰ配列を示す。図１０ｂ)およびｄ)は、それぞれＣ３-０５ＭＴＳおよびカポジＭＴＳを示す。他のインターナライジング配列はＣ４ＲＩＰにより機能すると予想され、したがって本発明の範囲は、細胞膜を横切ってＣ４ＲＩＰ、あるいはＣ４ＲＩＰの誘導体、アナログ、バリアント、またはフラグメントを運ぶ所望の効果を有するであろう任意のＭＴＳを包含することを意味する。

標的の器官、組織、または細胞集団へヌクレオチド配列を送達するためには、レトロウィルス、アデノウィルス、ヘルペス、またはワクチニアウィルスから得られる、あるいは様々な細菌プラスミドから得られる発現ベクターを使用することができる。当業者によく知られている方法を用いて、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドを発現させる組換えベクターを構築することができる。これらの手法は、Sambrook等の著書(上記)およびAusubel等の著書(上記)の両方に記載されている。

一過性の発現は、非複製型ベクターでは１か月以上、また適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合はもっと長期間さえ持続させることができる。

前述のように遺伝子発現の改変は、ＣＲＭＰ４をコードする遺伝子の制御領域、すなわちそのプロモーター、エンハンサー、およびイントロンに対して、アンチセンス分子すなわちＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡを設計することによって得ることができる。転写開始部位、例えば転写産物の５′末端から-１０と＋１０の位置の間から得られるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に阻害は、「三重らせん」塩基対合技術を用いて達成することができる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に開く能力を阻害するという結果をもたらすので役立つ。三重鎖ＤＮＡを使用する最近の治療の進歩は、文献(Huber, B. E.およびCarr, B. I.著Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.中のGee, J. E.等の記述 (1994))の中に記載されている。これらアンチセンス分子はまた、転写産物がリボソームと結合するのを妨げることによってｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計することができる。

またリボザイム、すなわち酵素作用を有するＲＮＡ分子を用いてＲＮＡの特異的切断を触媒することもできる。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリッド形成、続いてエンドヌクレオチドによる切断を伴う。使用することができる例には、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列のエンドヌクレオチドによる切断を特異的かつ効率的に触媒することができる人工的ハンマーヘッドモチーフリボザイムが挙げられる。

可能性のある任意のＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣ配列を含むリボザイム切断部位を求めて標的分子を走査することによって最初に同定される。いったん同定されたらその切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応するリボヌクレオチド１５個から２０個の間の短鎖ＲＮＡ配列を、そのオリゴヌクレオチドを作用不能にする可能性のある二次構造的特徴について評価することができる。候補となる標的の適切性はまた、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成への近づきやすさをリボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて試験することによって評価することができる。

本発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、ＲＮＡ分子の合成に対して当業界で知られている任意の方法により調製することができる。これらには、固相ホスホロアミダイト化学合成などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための手法が挙げられる。別法では、ＲＮＡ分子を、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写によって作製することができる。このようなＤＮＡ配列を、Ｔ７またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する種々様々なベクター中に組み込むことができる。別法では、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘発可能に合成するこれらｃＤＮＡ構築物を、細胞系、細胞、または組織中に導入することもできる。

ＲＮＡ分子を改変して細胞内安定性および半減期を増すことができる。可能な改変には、これらに限定されないが、分子の５′および／または３′末端にフランキング配列を加えることや、分子の骨格内にホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２′Ｏ-メチルを使用することが挙げられる。この概念はＰＮＡの産生にはもともと内在しているものであり、イノシン、ケオシン(queosine)、およびワイブトシンなどの在来のものでない塩基、ならびにアセチル、メチル、チオ改変形態、および内因性エンドヌクレアーゼによりそれほど容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンの同様の改変形態を含めることによってこれら分子のすべてに拡張することができる。

ベクターを細胞または組織中へ導入するための多くの方法が利用可能であり、それらはｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏで使用するのに等しく適している。ｅｘ ｖｉｖｏ療法の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞中に導入し、自己移植片をクローン増殖させてその同じ患者中に戻すことができる。トランスフェクションによる、またリポソーム注入による送達は、当業界でよく知られている方法を用いて達成することができる。

上記治療方法のいずれかを、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた任意の適切な被検体に適用することができる。

本発明のさらなる実施形態は、上記で考察した治療効果のいずれかのために医薬組成物を薬学的に許容できる担体と共に投与することに関する。このような医薬組成物は、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰ、あるいはＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰに対する抗体、模倣物、アゴニスト、アンタゴニスト、あるいはＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの阻害剤からなることができる。これら組成物は単独で、または安定化用化合物などの少なくとも１種類の他の薬品と組み合わせて投与することができる。それらは、これらに限定されないが生理的食塩水、緩衝生理的食塩水、デキストロース、および水を含めた任意の滅菌した生体適合性の医薬用担体に溶かして投与することができる。これら組成物は、患者に単独で、または他の薬品、薬物、またはホルモン類と組み合わせて投与することができる。

本発明の医薬組成物は、当業界で知られているやり方、例えば通常の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、磨砕、乳化、カプセル封入、閉じ込め(entrapping)、または凍結乾燥工程の手段によって製造することができる。

医薬組成物は塩として提供することができ、これらに限定されないが塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含めた多くの酸により形成することができる。塩は、水性またはプロトン性溶媒中でその対応する遊離塩基の形態よりも溶けやすい傾向がある。他の事例ではその好ましい製剤は、１〜５０ｍＭのヒスチジン、０.１〜２％のスクロース、および２〜７％のマンニトールのいずれかまたはすべてを含有することができ、使用に先立って緩衝液と混合されるｐＨ範囲４.５から５.５の凍結乾燥された散剤であることができる。

医薬組成物は調製後、適切な容器に入れ、表示された状態の治療のためのラベルを貼ることができる。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの投与の場合、このようなラベリングには投与の量、頻度、および方法が含まれることになる。本発明で使用するのに適した医薬組成物には、意図する目的を達成するのに有効な量の活性成分が含有された組成物が含まれる。有効投与量の決定は十分に当業者の能力の範囲内にある。

任意の化合物についてその治療に有効な用量は、細胞培養検定、例えば神経突起伸張の検定において、あるいは動物モデル、一般にはマウス、ラット、またはサルにおいて最初に見積もることができる。また動物モデルを用いて適切な濃度範囲および投与経路を決めることができる。次いでこのような情報を用いてヒトに投与するのに役立つ用量および経路を決めることができる。薬学的に有効な用量とは、その徴候または状態を改善する活性成分の量、例えばＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰあるいはそのフラグメント、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの抗体、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰのアゴニスト、アンタゴニスト、または阻害剤の量を指す。治療上の効力または毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えばＥＤ₅₀(集団の５０％で治療に有効な用量)およびＬＤ₅₀(集団の５０％を死に至らしめる用量)によって求めることができる。治療効果と毒性効果の間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀として表わすことができる。

大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するための用量範囲を処方する際に用いられる。このような組成物中に含有される用量は、毒性が殆どないか全くないＥＤ₅₀を含めた循環濃度の範囲内であることが好ましい。この用量は、使用される剤形、患者の感受性、および投与の経路に応じてこの範囲内で変わる。

正確な用量は、治療を必要とする被検体に関係のある因子に照らして医療従事者によって決められることになる。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を施与するように、または所望の効果を維持するように調整される。考慮に入れることができる因子には、病状の重篤度、被検体の全般的な健康状態、年齢、体重、および被検体の性別、食習慣、投与の時間および頻度、薬物の組合せ、応答敏感度、ならびに療法に対する耐性／反作用が挙げられる。長時間作用する医薬組成物を、その特定の処方の半減期およびクリアランス率に応じて３から４日に１回、週に１回、または２週間に1回投与することができる。

投与経路に応じて通常の投与量は、1回の用量０.１〜１００,０００μｇから合計用量約１ｇまで変わることができる。特定の用量および送達の方法に関する手引きは文献中で得られ、それらは当業界の実務者に一般に利用可能である。当業者は、タンパク質またはそれらの阻害剤の場合よりもヌクレオチドの場合は様々な処方を使用することになる。同様にポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所などに特異的であるはずである。

一態様ではＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰもしくは密接に関係する分子をコードするゲノム配列を含めたポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブとのハイブリッド形成を用いてＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする核酸配列を同定することができる。そのプローブが高度に特異的な領域、例えば５′調節領域中の１０個のユニークヌクレオチドから作られるとしても、またあまり特異的でない、例えば具体的には３′コード領域中の領域から作られるとしてもそのプローブの特異性と、そのハイブリッド形成または増幅のストリンジェンシー(最高の、高い、中間の、または低い)とが、そのプローブがＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする天然に存在する配列、対立遺伝子、または関係のある配列のみを同定するかどうかを決定することになる。

プローブはまた関係のある配列の検出のために用いることができ、それは好ましくはＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードする配列のいずれかに由来するヌクレオチドの少なくとも５０％を含有するべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡまたはＲＮＡであることができ、配列番号３、配列番号４、または配列番号６のヌクレオチド配列から、あるいは天然に存在するＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰのプロモーター、エンハンサー要素、およびイントロンを含めたゲノム配列から得ることができる。

ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするＤＮＡ用の特異的ハイブリダイゼーションプローブを産生する手段には、ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰ、あるいはＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの誘導体をコードする核酸配列を、ｍＲＮＡプローブの産生用のベクターの中にクローン化する方法が挙げられる。このようなベクターは当業界で知られまた市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼおよび適切な標識ヌクレオチドを加えることによって、それらをｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に使用することができる。ハイブリダイゼーションプローブは様々なリポーターグループ、例えば３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射線核種、あるいはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合させたアルカリ性ホスファターゼなどの酵素による標識等であることができる。ＣＲＭＰ４をコードするポリヌクレオチド配列をＣＲＭＰ４の発現にまつわる状態または疾患の診断のために使用することができる。そのような状態または疾患の例には、これらに限定されないが中枢および末梢神経系の傷害または損傷が挙げられる。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰをコードするポリヌクレオチド配列は、サザンまたはノーザン分析、ドットブロット、または他の膜を用いた技術において、ＰＣＲ技術において、あるいは変化したＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの発現を検出ために患者の生検材料由来の液体または組織を利用するディップスチック、ピン、ＥＬＩＳＡ、またはチップ検定において使用することができる。このような定性的または定量的方法は当業界でよく知られている。

ある特定の態様ではＣＲＭＰ４をコードするヌクレオチド配列は、様々な神経科的または他の非神経科的障害の活性化または誘発を検出するアッセイ、具体的には上記で述べたものにおいて役立つ可能性がある。ＣＲＭＰ４をコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法によって標識し、ハイブリッド形成複合体の形成に適した条件下で患者由来の液体または組織試料に加えることができる。適切なインキュベート期間の後、その試料を洗浄し、そのシグナルを定量し、標準値と比較する。生検または抽出試料におけるシグナル量が比較できる対照試料と著しく変わる場合、そのヌクレオチド配列は試料中のヌクレオチド配列とハイブリッドを形成しており、試料中のＣＲＭＰ４をコードするヌクレオチド配列のレベルの変化の存在は、関連する疾患の存在を示す。またこのようなアッセイを用いて、動物試験における、臨床試験における、または個々の患者の治療の監視における特定の療養上の治療計画の効力を評価することができる。

ＣＲＭＰ４の発現に関連した疾患の診断の根拠を提供するために発現の正常または標準的プロフィールを確立する。これは動物またはヒトのどちらかの正常な被検体から採取した体液または細胞抽出物を、ハイブリッド形成または増幅に適した条件下で、ＣＲＭＰ４をコードする配列またはそのフラグメントと結合させることによって達成することができる。標準的ハイブリッド形成は、正常な被検体から得られた数値を、既知量の実質上精製されたポリヌクレオチドを用いた実験から得られる数値と比較することによって定量化することができる。正常な試料から得られる標準値を、疾患の徴候のある患者由来の試料から得られる数値と比較することができる。標準値と被検体の数値の間の偏差を用いて疾患の存在を立証する。

いったん疾患が立証され、治療のプロトコルが始まると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返して、患者中の発現レベルが正常な患者中で観測される発現レベルに近づき始めるかどうかを評価することができる。継続的なアッセイから得られる結果を用いて数日から数か月の範囲の期間にわたる治療の効力を示すことができる。

神経科的疾患に関しては個体由来の生検組織中の比較的多量の転写物の存在はその疾患の進展の素質を示すことができ、また実際の臨床的徴候の現れる前に疾患を検出する手段を提供することができる。この型のより決定的な診断法は、医療従事者が早期に予防対策または積極的治療を採用することを可能にし、それによって疾患の進展またはさらなる進行を防ぐことができる。

ＣＲＭＰ４をコードするオリゴヌクレオチドの更なる診断用途は、ＰＣＲの使用を伴うことがある。このようなオリゴマーは、化学的に合成することも、酵素の働きにより産生させることも、または組換え供給源から生成することもできる。好ましくはこれらオリゴマーは、特異的遺伝子または状態の同定のために最適条件下で使用される、一方がセンス方向を有し、他方がアンチセンス方向を有する２つのヌクレオチド配列からなるはずである。同じ２個のオリゴマー、一組の入れ子型オリゴマー、または縮重したオリゴマーのプールさえも、複数の密接な関係のあるＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出および／または定量化のためのストリンジェントの低い条件下で使用することができる。

またＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰの発現を定量するために用いることができる方法には、ヌクレオチドの放射能標識化またはビオチン化、対照核酸の同時増幅、および標準曲線上での実験結果の補間が挙げられる(Melby, P. C.等の論文(1993)J. Immunol. Methods, 159, 235~244、Duplaa, C等の論文(1993)Anal. Biochem. 229~236)。複数試料の定量速度は、目的のオリゴマーが様々な希釈度で存在し、かつ吸光分光応答または比色応答が迅速な定量化を与えるＥＬＩＳＡの構成でアッセイを実施することによって速めることができる。

本発明の別の実施形態ではまた、ＣＲＭＰ４をコードする核酸配列を、天然に存在するゲノム配列をマップするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを産生させるために用いることもできる。この配列は、よく知られている手法を用いて特定の染色体にマップすること、またはその染色体の特異的領域にマップすることができる。このような手法には、ＦＩＳＨ、ＦＡＣＳ、または人工染色体構造物、例えばPrice, C. M.(1993, Blood Rev. 7, 127~134)およびTrask, B. J.(1991, Trends Genet. 7, 149~154)によって概説されている酵母の人工染色体、細菌の人工染色体、細菌のＰ１構造物、または単一の染色体ｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。

スクリーニングアッセイ
本発明の他の実施形態ではＣＲＭＰ４およびＣ４ＲＩＰ、それらの触媒性または免疫原性フラグメント、あるいはそれらのオリゴペプチドを、化合物ライブラリーのスクリーニングのために様々な薬物スクリーニング手法のいずれかにおいて用いることができる。このようなスクリーニングにおいて使用されるフラグメントは、液中で遊離していても、固体担体上に貼りつけられていても、細胞表面に付着させても、または細胞内に配置されてもよい。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰと試験される薬品との間の結合複合体の形成を測定することができる。したがって本発明のポリペプチドはまた、小型分子の基質とリガンド、例えば細胞、細胞を含まない調製物、化学的ライブラリー、および天然の産物の混合物中のリガンドとの結合を評価するために用いることができる。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガンドであってもよく、また構造的もしくは機能的模倣物であってもよい。一般にこのようなスクリーニング手順は、その表面で本発明の受容体ポリペプチドを発現させる適切な細胞を生み出すことを伴う。このような細胞には、哺乳動物、酵母、昆虫(すなわちＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ)、または細菌(すなわちＥ.ｃｏｌｉ)由来の細胞が挙げられる。次いで受容体を発現させる細胞(またはその発現した受容体を含有する細胞膜)を試験化合物と接触させて結合、あるいは機能的応答の刺激または阻害(例えばＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用への干渉)を観察する。

これらアッセイは、候補化合物の結合を簡単に試験することができる。当該アッセイでは、受容体を有する細胞に対する接着を、その候補化合物と直接的または間接的に結合された標識によって、または標識した競合物との競合を伴うアッセイにおいて検出する。さらにこれらのアッセイは、その候補化合物が受容体の活性化によって発生されるシグナルを生ずるかどうかを、それら表面に受容体の載った細胞に適した検出システムを用いて(例えばパッチクランプにより、または好ましくはイオンイメージングにより)試験することができる。活性化の阻害因子は一般に既知のアゴニスト(例えばプロトン類)の存在下でアッセイされ、そのアゴニストによって活性化に及ぼす候補化合物の影響が観察される。このようなスクリーニングアッセイを行うための標準的な方法は当業界でよく知られている。一般にはこの応答は、その細胞の電位固定のような測定手段を伴う微小電極技術の使用によって測定し、それによってイオンチャネルの活性化を、この微小電極を用いて検出される内向きまたは外向き電流により識別することができる。²²Ｎａ、⁸⁶Ｒｂ、⁴⁵Ｃａで放射能標識したカチオンあるいは¹⁴Ｃまたは³Ｈグアニジンを用いてこのようなイオン束を評価することができ、またナトリウム、カルシウム、またはカリウムイオン感受性染料(Ｆｕｒａ-２またはＩｎｄｏなど)を用いて受容体イオンチャネルを通るイオンの通過を観測するか、または電位感受性染料を用いて脱分極における場合などの電位の変化を観測することができる。

使用できる薬物スクリーニングのための別の手法は、国際出願公開第８４／０３５６４号に記載されている興味深いタンパク質との適切な結合親和性を有する化合物の高処理能力のスクリーニングを可能にする。ＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰに適用されるこの方法では、多数の異なる少量試験化合物を、プラスチック製のピンまたは何か他の表面など固体支持体上で合成する。この試験化合物をＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ抱合体と反応させ、洗浄する。次いで結合したＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ抱合体を当業界でよく知られている方法によって検出する。精製されたＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰはまた、プレート上に直接プレーティングして前述の薬物のスクリーニング技術で使用することができる。別法では非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、それを固体担体上に固定化することもできる。

別の実施形態では、ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ抱合体と特異的に結合することができる中和抗体がＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰとの結合に関して試験化合物と競合する競合薬物スクリーニング検定法を用いることができる。このやり方ではこれら抗体を、１または複数個の抗原決定基をＣＲＭＰ４またはＣ４ＲＩＰと分かち合う任意のペプチドの存在を検出するために用いることができる。

上記薬物検定法またはスクリーニング法、ならびに当業者に知られておりかつ本発明を実施するのに適している可能性のある任意の他の方法をキットにパッケージすることができる。この種のすべてのキットは本発明の範囲内に包含されることを意図している。

本発明はＣＮＳに対する特定の言及に関して記載されているが、ＭＡＩおよびＣＳＰＧの収束標的である細胞内シグナル基質を標的した他のアンタゴニストがＣＮＳおよびＰＮＳの両方の再生モデルにおいて効力を実証した(Madura等(2007)、Hiraga等(2006)、Dergham等(2002)、Fournier等(2003))ので、それはまたＰＮＳにおいても用途を見出すはずであると考えられる。

方法および材料
プラスミドの構築：
ＣＲＭＰ-Ｖ5発現ベクターを構築するために、ｃＤＮＡをラットｐＥＧＦＰ-ＣＲＭＰ構築物(Dr. Peter McPherson, McGill Universityから提供された)からポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって増幅した。このＰＣＲ産物をＣＲＭＰ1ａ、ＣＲＭＰ２ａ、およびＣＲＭＰ３ａのｐｃＤＮＡ 3.１Ｖ５-ＨｉｓのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｈｏｌ部位中に、またＣＲＭＰ４ａのｐｃＤＮＡ 3.１Ｖ５-ＨｉｓのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位中に結合した。ＣＲＭＰ４ｂのｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ 3.１ＣＲＭＰ４ｂＶ５-ＨｉｓＴＯＰＯから増幅し(Quinn等(2003))、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位のｐｃＤＮＡ ３.１Ｖ５-Ｈｉｓ中にＶ５-Ｈｉｓタグと読み枠に合わせて結合した。ＣＲＭＰ１ｂ-Ｖ５をＥＳＴクローン(IMAGE:5686818)からＰＣＲによりそのコーディング配列を増幅することによって構築し、ｐｃＤＮＡ ３.１Ｖ５-ＨｉｓのＥｃｏＲＩ部位およびＨｈｏＩ部位中に結合した。

ｐｃＤＮＡ ｍｙｃ野生型ＲｈｏＡ(ｗｔ)をUMR cDNA Resource Center(http://www.cdna.org/)から得た。ｐＲＫ５ ｍｙｃ-Ｒａｃ１(ｗｔ)、ｐＲＫ５ ｍｙｃ-Ｃｄｃ４２(ｗｔ)、ｐＲＫ５ ｍｙｃ-ＲｈｏＡ６３Ｌ、ｐＲＫ５ ｍｙｃ-ＲｈｏＡＮ１９、ｐＲＫ５ ｍｙｃ-ＲａｃＱ６１Ｌ、ｐＲＫ５ ｍｙｃ-ＲａｃＮ１７、ｐＲＫ５ ｍｙｃ-Ｃｄｃ４２Ｑ６１Ｌ、およびｐＲＫ５ ｍｙｃ-Ｃｄｃ４２Ｎ１７構築物は、Dr. Nathalie Lamarche-Vane(McGill University)から提供された。ＦＬＡＧ-ＲｈｏＡ６３Ｌは、ＲｈｏＡ６３ＬをｐｃＤＮＡ３ＦＬＡＧのＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位の中にサブクローン化することによって産生させた。ｐＣＡＧ-ｍｙｃ-ｍＲＯＣＫ ＩＩ構築物は、Dr. Shuh Narumiya(Kyoto University)によって提供された。

Ｃ４ＲＩＰ-Ｖ５を生成させるためにＣＲＭＰ４ｂのユニークアミノ末端ドメイン(残基第１〜１２６)を、ｐｃＤＮＡ ３.１ Ｖ５-ＨｉｓのＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位中に導入した。ｐＨＳＶＣ４ＲＩＰは、Ｃ４ＲＩＰ-Ｖ５をｐＨＳＶＰｒＰＵＣのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＳａＩＩ部位の中にサブクローン化することによって産生させた。ｐＨＳＶＣＲＭＰ４ｂＧＦＰは、ＣＲＭＰ４ｂをｐＥＧＦＰ Ｎ２(Clonetech)のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位の中にサブクローン化し、続いてｐＨＳＶＰｒＰＵＣのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｂａＩ部位の中にサブクローン化することによって産生させた。キメラＣＲＭＰ４ｂＮＣＲＭＰ２-Ｖ５は、ＰＣＲによりＣＲＭＰ２ａの残基第１４〜５７２をＣ４ＲＩＰ-Ｖ５のＥｃｏＲＩ部位およびＸｈｏＩ部位中に結合することによって構築した。ＣＲＭＰ４ΔＮは、その最初の１２個の残基がただ1個のメチオニンによって置き換えられたＣＲＭＰ４ａからなる。ＣＲＭＰ４ΔＮをＰＣＲによって増幅し、ｐｃＤＮＡ ３.１Ｖ５-ＨｉｓのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位中に結合した。

単純ヘルペスウィルスの調製
ｐＨＳＶＰｒＰＵＣプラスミドを２-２Ｖｅｒｏ細胞中にトランスフェクションし、１日後に５ｄｌ １.２ＨＳＶヘルパーウィルスに重感染させた。以前の記載(Neve等(1997))と同様に組換えウィルスを３継代を通じて増幅し、-８０℃で保存した。

組換えタンパク質の調製
抑制反応を調べるための刺激を、安定的に移入された２９３細胞あるいはＮｏｇｏ-Ｐ４ペプチドまたはミエリンから精製したアルカリ性ホスファターゼ複合Ｎｏｇｏ-６６(ＡＰ-Ｎｏｇｏ-６６)により行った。ＡＰ-Ｎｏｇｏ-６６またはＡＰは、以前の記載(Nakamura等(1998)、Fournier等(2001))と同様にＮｉ²⁺アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。すべての処理についてＡＰ-Ｎｏｇｏ６６-Ｈｉｓ(８ｎＭ)またはＡＰ(８ｎＭ)は、１００ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＡＰで予め凝集させた(Niederost等(2002))。Ｎｏｇｏ-Ｐ４(Alpha Diagnostics, San Antonio, TX)は、Ｎｏｇｏ-Ａの有力な阻害成分であるＮｏｇｏ-６６の阻害特性を仲介するのに十分なアミノ酸２５個の阻害ペプチド配列(Ｎｏｇｏ-６６の残基第３１〜５５)である(GrandPre等(2000))。ミエリン抽出物は、以前の記載(Igarashi等(1993)、Hsieh等(2006))と同様にウシの脳から調製した。

ＧＳＴ、ＧＳＴ-ＲｈｏＡＷＴ、およびＧＳＴ-ＲＨＯＡ６３Ｌ(Dr. Keith Burridge, University of North Carolina, Chapel Hillにより提供された構築物)を、以前の記載(Arthur等(2002)、Wennerburg等(2002))と同様にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で発現させ、グルタチオン-セファロース上で精製した。オーバーレイアッセイの場合、ＲｈｏＡはトロンビン切断によりＧＳＴ部分から切断した。アグリカンはSigma Chemical Co.(Oakville, Ontario)から購入した。

ＧＳＴ-ＲｈｏＡプルダウンアッセイ
ＰＣ１２細胞を、Ｌ-グルタミンを補い、かつ１０％ウマ血清、５％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、および１％ペニシリン／スプレプトマイシンを含有するＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｅｄｉａ(ＲＰＭＩ)１６４０(Invitrogen, Burlington, Ontario)中でコラーゲン塗布プレート上でのサブコンフルエンスまで伸張させ、その後１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)フラクションＶおよび５０ｎｇ／ｍｌの神経伸張因子(ＮＧＦ)を補ったＲＰＭＩ(Upstate Biotechnology, Waltham, MA)を用いて２４時間分化を誘発させた。ＧＳＴ-ＲｈｏＡ６３Ｌプルダウンを、以前の記載(Arthur等(2002))と同様に行った。手短に言えばＡＰ-Ｎｏｇｏ-６６による刺激の後、細胞を氷冷したＨｅｐｅｓ緩衝生理的食塩水(ＨＢＳ)中で２回洗浄し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(ｐＨ７.３)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１％(ｖ／ｖ)トリトンＸ-１００、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)を含有し、コンプリートプロテアーゼインヒビター(Roche Products, Laval, Quebec)を補った１ｍｌの氷冷した細胞溶解緩衝液中に回収した。次いでＧＳＴプレクリアー溶解産物を、セファロースビーズに４℃で１時間結合させた３０μｇのＧＳＴ-ＲｈｏＡ６３Ｌ融合タンパク質と混合した。沈澱したタンパク質を２Ｘサンプルバッファーで溶出し、４〜１５％勾配ゲル上でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ、続いて銀染色法により分析した。

ＣＲＭＰ-Ｒｈｏ同時免疫沈降検定
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をサブコンフルエンスまで伸張させ、製造者の使用説明書(Invitrogen, Burlington, Ontario)に従ってLipofectamine 2000でトランスフェクションし、氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解緩衝液Ａ(５０ｍＭトリス(ｐＨ７.４)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％(ｖ／ｖ)トリトンＸ-１００、１ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、およびコンプリートプロテアーゼインヒビター(Roche Products, Laval, PQ))中で溶解した。溶解産物をプロテインＡ／Ｇアガロース(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)でプレクリアーし、ｍｙｃ-アガロースまたはＶ５-アガロース(Sigma Chemical Co., Oakville, Ontario)による免疫沈降にかけた。氷冷したＰＢＳで３回洗浄した後、結合したタンパク質をＳＤＳで溶離し、抗Ｍｙｃ(９Ｅ１０、１：１０００、Sigma Chemical Co., Oakville, Ontario)または抗Ｖ５(１：５０００、Invitrogen, Burlington, Ontario)で免疫ブロットした。経時変化実験の場合、ＰＣ１２細胞を、Lipofectamine 2000(Invitrogen, Burlington, Ontario)を用いて２４時間トランスフェクションし、５０ｎｇ／ｍｌの神経伸張因子(ＮＧＦ、Upstate Biotechnology, Waltham, MA)で２４時間分化させた。細胞を、Ｎｏｇｏ-Ｐ４ペプチドで３７℃において指定の期間処理した。次いで細胞を溶解し、タンパク質を上記と同様に免疫沈降させた。

ファーウェスタン
ＲｈｏＡによるＣＲＭＰ４のオーバーレイを、以前の記載(McPherson等(1994))と同様に行った。手短に言えばＣＲＭＰ４ａ-Ｖ５、ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５、または空のベクターをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解産物を、Ｖ５-アガロース(Sigma Chemical Co., Oakville, Ontario)による免疫沈降にかけた。それら免疫沈降物をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜へ転写し、細菌で精製した１０μｇ／ｍｌのＲｈｏＡで室温で１時間覆った。ＲｈｏＡをウサギ抗ＲｈｏＡ抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)で検出した。

神経突起伸張および伸張円錐崩壊検定
神経突起伸張検定の場合、ミエリンをポリ-Ｌ-リシン被覆支持体上で乾燥した。支持体を洗浄し、１０μｇ／ｍｌのラミニンで１時間被覆した。アグリカン上での伸張の場合、ポリ-Ｌ-リシン被覆支持体をアグリカンで被覆し、１０μｇ／ｍｌのラミニンで３７℃で２時間被覆した。解離したＥ１３ヒナＤＲＧニューロンを、ＤＲＧ培地(Ｆ-１２培地、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／スプレプトマイシン、１％Ｌ-グルタミン、５０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ)中でウィルスの存在下で２４時間培養し、ＰＢＳに溶かした４％パラホルムアルデヒド／２０％スクロースで固定し、抗βＩＩＩチューブリン(Covance, Berkeley, CA)および抗Ｖ５抗体(Sigma Chemical Co., Oakville, Ontario)で二重染色した。細胞ごとの神経突起伸張の長さを、以前の記載(Fournier等(2003))と同様に、公有ドメインのＪＡＶＡ（登録商標）画像処理プログラムであるＩｍａｇｅ Ｊ(http://rsb.info.nih.gov/ij/)を用いて評価した。

伸張円錐崩壊検定の場合、ヒナＥ７ ＤＲＧを、４ウェルのガラスチャンバースライド上のＤＲＧ培地中で１８時間培養し、続いて上記と同様にＰＬＬおよびラミニンで被覆した。Ｓｅｍａ３Ａ-ＡＰまたはＡＰ馴化培地を以前の記載(Takahashi等(1998))と同様に調製した。外殖片をＳｅｍａ３Ａ-ＡＰまたはＡＰ馴化培地を用いて指定の濃度で２０分間刺激し、４％パラホルムアルデヒド、２０％スクロース、および０.１％ ＮａＰＯ₄で固定した。以前の記載(Luo等(1993))と同様にそれら外殖片をローダミン、ファロイジンで染色し、伸張円錐崩壊について評価した。

ＣＲＭＰ-４のｓｉＲＮＡ
ＣＲＭＰ-４ａおよびＣＲＭＰ-４ｂのノックダウンの場合、ラットＣＲＭＰ-４に対するsilencer pre-designed siRNAを使用した(siRNA ID: 48833、Ambion, Austin, TX)。対照は、スクランブルｓｉＲＮＡ(ＣＡＧＣＡＵＧＧＵＧＧＵＡＣＧＣＵＵＧＵＡＡＧＣＡ)(配列番号７)ＣＲＭＰ-４ｂ標的ｓｉＲＮＡが、ＢＬＯＣＫ-ＩＴアルゴリズム(Invitrogen, Burlington, Ontario)を用いて設計された。ｓｉＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で２４時間、それらｓｉＲＮＡにＣＲＭＰ４-Ｖ５を同時トランスフェクションすることによって検証された。細胞溶解産物をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｖ５抗体により分析した。ニューロンにおけるｓｉＲＮＡの効力を検証するために、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＤＲＧにＨＳＶＣＲＭＰ４ｂ-ＧＦＰを同時感染させた。感染の２４時間後、ＧＦＰの蛍光を、蛍光顕微鏡によって測定した。神経突起伸張検定の場合、以前の記載(Hsieh等(2006))と同様にＰ５で解離したラットＤＲＧを調製し、ラミニン支持体上に播種した。４時間後、ＤＲＧは血清飢餓状態(Ｆ-１２培地および５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ中で)になり、Lipofectamine 2000を用いて指定のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの５時間後、培地を新しいＤＲＧ培地に替えた。トランスフェクションの２４時間後、ＤＲＧをＥＤＴＡによりプレートから取り出し、ミエリン支持体上に再播種した。さらに１８時間ニューロンを伸張するに任せ、上記と同様に神経突起伸張分析用に処理した。

免疫蛍光
Ｅ-１３ヒナＤＲＧ外殖片を、ポリＬ-リシンおよびラミニンで被覆した支持体上のＤＲＧ培地中で１８時間培養した。ウィルス感染の場合、プレーティングの１時間後に培地に組換えウィルス調製物を加えた。１８時間後、培養物をミエリンで処理し、４％パラホルムアルデヒド／２０％スクロース／ＰＢＳで固定し、０.２％トリトンＸ-１００で浸透性を上げ、ポリクローナル抗ＲｈｏＡ抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)および抗ＣＲＭＰ-４ｂまたはＶ５抗体で二重染色した。糸状仮足および分枝分析の場合、ＧＦＰおよびＣＲＭＰ-４ｂＶ５に感染させた伸張円錐をローダミン-ファロイジン(Molecular Probes, Eugene, OR)および抗Ｖ５抗体で二重染色した。伸張円錐ごとの糸状仮足の長さをImage Jを用いて評価した。その伸張円錐ごとの糸状仮足の長さは、伸張円錐ごとの糸状仮足の合計数で平均した伸張円錐ごとの合計糸状仮足長さを測定することによる。神経突起の分枝は、神経突起ごとの全枝芽を数えることによって定量化した。

結果
ＣＲＭＰ-４ｂとＲｈｏＡの間の新規なＮｏｇｏ依存性相互作用
ＲｈｏＡと機能的に相互作用して神経突起伸張の阻害を仲介する分子を同定するために、Ｎｏｇｏ-Ａの有力な阻害フラグメントであるＮｏｇｏ-６６(GrandPre等(2000))で処理した後に、ＲｈｏＡの構成的に活性なＧＴＰアーゼ欠失突然変異体に対して高い親和性を有するタンパク質をスクリーニングした(ＲｈｏＡ６３Ｌ、Khosravi-Far等(2000))。細菌で精製したｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ-Ｓ-ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ-ＲｈｏＡ６３Ｌ(ＧＳＴ-ＲｈｏＡ６３Ｌ)を、アルカリ性ホスファターゼと融合したＮｏｇｏ-６６(ＡＰ-Ｎｏｇｏ-６６)で刺激した後でＰＣ１２細胞からタンパク質を沈殿させるための餌として用いた。ＰＣ１２細胞は、それらのＭＡＩ受容体の発現(Hsieh等(2006))と、神経突起伸張検定(GrandPre等(2000))およびＲｈｏＧＴＰレベルを測定する生化学的検定(Fournier等(2003))におけるＮｏｇｏに対するそれらの応答性とに基づく生化学的スクリ-ニング用に選択された。ＧＳＴ-ＲｈｏＡ６３Ｌと相互作用するタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、銀染色法により可視化した。Ｎｏｇｏ-６６の処理後にＧＳＴ-ＲｈｏＡ６３Ｌに対して高い親和性を有する７５ｋＤａタンパク質(図１ａ)をタンデム質量分析法によりＣＲＭＰ４ｂとして同定した。この高いＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡの相互作用は、７５ｋＤａのＣＲＭＰｂアイソフォームおよび６５ｋＤａのＣＲＭＰａアイソフォームを認識する汎ＣＲＭＰ抗体(Dr. Peter McPherson, McGill Universityによって提供された)により検証した(図１ｂ)。７５ｋＤａおよび６５ｋＤａの両方のＣＲＭＰアイソフォームはＧＳＴ-ＲｈｏＡ６３Ｌにより特異的に沈殿し、一方、７５ｋＤａのＣＲＭＰｂアイソフォームとＲｈｏＡの間の相互作用はＮｏｇｏの刺激によって高められる(図１ｂ)。

ＣＲＭＰｂ-ＲｈｏＡの相互作用の特異性を評価するために、他のＣＲＭＰのメンバーがＲｈｏＡと相互作用する能力を分析した。野生型ｍｙｃ-ＲｈｏＡ構築物およびＣＲＭＰ-Ｖ５構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクションした。ｍｙｃ-ＲｈｏＡを細胞溶解産物から免疫沈降させ、それら免疫複合体をＣＲＭＰ-Ｖ５について分析した。ＲｈｏＡは、ＣＲＭＰ４ファミリーメンバーと選択的に相互作用し、ＣＲＭＰ４ａと比較してＣＲＭＰ４ｂとより強く結合する(図２ａ)。ＲｈｏＡは、他のＣＲＭＰａアイソフォームとは結合できず、またＣＲＭＰ１ｂとは弱く結合する(図２ａ)。アミノ末端にタグを付けたＧＦＰ-ＣＲＭＰ４ｂはＲｈｏＡと結合できず、これはアミノ末端のタグがこの結合相互作用を妨げることを示唆している(データ未掲載)。

ＣＲＭＰ４とＲｈｏＡの間の相互作用の特異性が、ＲａｃおよびＣｄｃ４２、すなわちアクチン細胞骨格を調節しかつ神経突起の伸張を前向きに調節する小型Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの他の２種類のメンバーとのＣＲＭＰ４の結合により評価された(BishopおよびHall(2000))。ＣＲＭＰ４ａ-Ｖ５およびＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５を、ＲｈｏＡ(ｍｙｃ-ＲｈｏＡ６３Ｌ)、Ｒａｃ１(ｍｙｃ-Ｒａｃ１Ｑ６１Ｌ)、およびＣｄｃ４２(ｍｙｃ-Ｃｄｃ４２Ｑ６１Ｌ)のｍｙｃタグが付けられＧＴＰに結合した活性形態との結合について試験した。ＣＲＭＰ４のＲｈｏＡとの結合は、Ｒａｃ１またはＣｄｃ４２との結合よりも際立って強い(図２ｂ)。同様に野生型およびＧＤＰに結合した形態、すなわちＲａｃおよびＣｄｃ４２とのＣＲＭＰ４の結合は無視できる(データ未掲載)。全体として考えればこれらの結果は、ＣＲＭＰ４ａとＣＲＭＰ４ｂの両方がＲｈｏＡと特異的に結合し、ＣＲＭＰ４ｂがＣＲＭＰ４ａよりも強く結合していることを示している。

ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ結合はヌクレオチド非依存性、ホスホ依存性、かつ直接的である
Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼは、不活性なＧＤＰ結合状態と活性なＧＴＰ結合状態の間を循環する。Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの下流エフェクターは、活性なＧＴＰ結合状態においてＲｈｏ ＧＴＰアーゼと結合し、一方、グアニンヌクレオチド交換因子は、ヌクレオチドのない状態またはＧＴＰ結合状態においてＲｈｏ ＧＴＰアーゼの方を好む(Hall(1994))。ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ相互作用のヌクレオチド依存性を調べるために、構成的に活性なｍｙｃ-ＲｈｏＡ６３Ｌまたは優性ネガティブｍｙｃ-ＲｈｏＡＮ１９とのＣＲＭＰ４の結合を評価した(FeigおよびCooper(1988))。ＣＲＭＰ４ａ-Ｖ５およびＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５は、ｍｙｃ-ＲｈｏＡ６３Ｌおよびｍｙｃ-ＲｈｏＡＮ１９の両方と相互作用し(図２ｃ)、これはＣＲＭＰ４とＲｈｏＡの間の相互作用がヌクレオチド非依存性であることを示している。

ＣＲＭＰ４とＲｈｏＡの間の結合相互作用が直接的であるかどうかを評価するためにＲｈｏＡオーバーレイアッセイを、２９３Ｔ細胞から免疫沈降させたＣＲＭＰ-Ｖ５上で行った(図２ｄ)。オーバーレイアッセイにおいてＲｈｏＡは、ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５およびＣＲＭＰ４ａ-Ｖ５と特異的に結合し、またＣＲＭＰ２ａとは結合できず、これはＣＲＭＰ４ｂとＲｈｏＡの間の相互作用が直接的かつ特異的であることを示している。

相互作用のホスホ依存性は、ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５の免疫沈降の前に、ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５発現性２９３Ｔ細胞を、セリン／スレオニンホスファターゼ阻害剤であるカリキュリンＡで刺激することによって測定した。カリキュリン依存性ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５のリン酸化は、ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５タンパク質の上方への易動度シフトによって示される(図２ｄ、Ｖ５免疫ブロット)。ＲｈｏＡは、オーバーレイにおいてＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５のリン酸化した種と結合できず、これはリン酸化ＣＲＭＰ４ｂがＲｈｏＡと結合できないことを示している。

ＮｏｇｏはＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ相互作用を特異的に調節する
ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ相互作用に及ぼすＮｏｇｏの効果の特異性および経時変化をさらに明確にするためにＰＣ１２細胞に野生型ｍｙｃ-ＲｈｏＡおよびＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５を同時トランスフェクションし、Ｎｏｇｏ-６６依存性応答にとって必要なＮｏｇｏ-６６の最小配列であるＮｏｇｏ-Ｐ４ペプチドで刺激した(GrandPre等(2000))。ｍｙｃ-ＲｈｏＡを免疫沈降させ、それら免疫複合体をＣＲＭＰ４-Ｖ５について分析した。ｍｙｃ-ＲｈｏＡと共に免疫沈降するＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５の急速な増加は、Ｎｏｇｏによる刺激の１分後までに検出され、１０分まで持続された(図３ａ)。Ｎｏｇｏによる刺激はｍｙｃ-ＲｈｏＡとＣＲＭＰ４ａ-Ｖ５の間の相互作用を調節しない(図３ｂ)。同様の結果は、ＡＰ-Ｎｏｇｏ-６６による刺激に関して、また活性形態のＲｈｏＡに関して得られ(データ未掲載)、これはＣＲＭＰ４ｂが、ＧＴＰ結合状態に対するＮｏｇｏ依存性ＲｈｏＡ循環には関係なく調節されることを示している。このＮｏｇｏ調節性ＲｈｏＡ-ＣＲＭＰ４ｂ相互作用は、さらにＮｏｇｏ-Ｐ４処理Ｐ８ラットの小脳培養物中での内因性タンパク質の同時免疫沈降によって確認され、その場合ＣＲＭＰ４ｂとＲｈｏＡは刺激１分および１０分後に複合体を形成する(図３ｃ)。

ＣＲＭＰ４のｓｉＲＮＡ介在ノックダウンは神経突起伸張の阻害を弱める
ＣＲＭＰ４機能がＮｏｇｏ依存性応答にとって必要であるかどうかを評価するためにミエリン支持体上での神経突起の伸張をＣＲＭＰ４特異的ｓｉＲＮＡの脈絡の中で評価した。ＣＲＭＰ４特異的ｓｉＲＮＡの効力を、形質トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞中で検証した。ＣＲＭＰ４ａおよびＣＲＭＰ４ｂの両方の発現を強く阻害する或る一つのｓｉＲＮＡを同定した(図４ａ)。Lipofectamineが介在するｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、Ｐ４ラットの背根頸胸神経節ニューロン(ＤＲＧ)を効率的に標的し、このやり方で導入されたＣＲＭＰ４ ｓｉＲＮＡは、ＨＳＶが媒介する感染によって導入されたＣＲＭＰ４-ＧＦＰの発現を減少させる(図４ｂ)。ラットのＤＲＧを、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後２４時間伸張させ、ＥＤＴＡにより支持体から取り出し、ミエリン支持体上に再播種してさらに１８時間伸張させた。ラットＤＲＧニューロンの伸張は、このプロトコルを用いて１μｇ／ｍｌのミエリンで被覆した支持体上では約５０％阻害され(図４ｅ)、解離したＤＲＧニューロンをミエリン支持体上に直接プレーティングする場合よりも控えめな阻害応答である(図８、Hsieh等(2066))。対照のラミニン支持体上でのニューロンの伸張は、ＣＲＭＰ４ ｓｉＲＮＡの導入によってあまり影響されない(図４ｄ)。しかしＣＲＭＰ４ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＰ４ラットのＤＲＧは、ミエリン支持体上においてスクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたものよりもずっと顕著に伸張し(図４ｃ、ｅ)、これはＣＲＭＰ４がミエリン依存性阻害にとって必要であることを示している。このＣＲＭＰ４ ｓｉＲＮＡの効力(図４ｅ)は、ＤＲＧニューロンの１００％にトランスフェクションすることはできないせいで過小評価される可能性がある(図４ｂ)。

ＣＲＭＰ４ｂは伸張円錐のアクチン細胞骨格に影響する
ＣＲＭＰタンパク質は、微小管重合、アクチン束化、およびエンドサイトーシス、すなわち伸張円錐の動態および神経突起の伸張に影響を及ぼす３つの過程の調節に広く影響を与えている(Fukata等(2002b)、Nishimura等(2003)、Rosslenbroich等(2005))。ＣＲＭＰ４ｂが神経突起伸張の阻害にどのように影響を及ぼしているかを洞察するためにＤＲＧ伸張円錐中のＣＲＭＰ４ｂの分布を評価した。以前に述べたとおり内因性ＣＲＭＰ４ｂは、中枢および末梢ドメインの至るところに伸びる伸張円錐内に点状模様を有する(図５ａ)(Quinn等(2003))。ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５(図５ｂ)融合タンパク質およびＣＲＭＰ４ｂ-ＧＦＰ(図５ｃ、ｄ)融合タンパク質はまた、過剰発現の典型的な例では恐らく高い細胞質ＣＲＭＰ４ｂレベルのせいであまりはっきり識別できない点状分布を有する全伸張円錐を標識する。カルボキシ末端にタグを付けたＣＲＭＰ４ｂ-ＧＦＰは、チューブリンよりも広範囲に伸張円錐を標識し(図５ｄ)、伸張円錐内の点の部分集合においてアクチンと同じ場所に位置(図５ｃ、矢印)してアクチンに富む末梢ドメイン中に伸びる(図５ｃ)。興味深いことにＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５過剰発現は伸張円錐からの糸状仮足の伸展を促進させ、その糸状仮足はＧＦＰに感染させた伸張円錐中の糸状仮足よりも平均で７０％長い(図５ｅ、ｆ、ｇ)。またこの表現型は、正常でない場所に起こるアクチンに富む分枝が形成されるＤＲＧ神経突起の伸張においても明らかにされる(図５ｅ、ｆ、ｇ、矢印)。同様の表現型は、ＣＲＭＰ４ｂ-ＧＦＰ過剰発現によっても増進される(データ未掲載)。ＧＦＰに感染させた神経突起上の神経突起当たり平均２個の分枝と比較して、ＣＲＭＰ４ｂに感染させた神経突起では神経突起当たり８個の分枝を検出することができる(図５ｇ)。伸張円錐内のＣＲＭＰ４ｂの局在化は、微小管またはアクチンの動態における役割とも一致している。しかしＣＲＭＰ４ｂの過剰発現によって増進されるこの糸状仮足および分枝の表現型は、ＣＲＭＰ４ｂがアクチンに基づく機構を介してニューロンの表現型に影響を及ぼす可能性があることを示唆しており、これはＣＲＭＰが微小管およびアクチンの動態の両方の調節に関係しているので重要な所見である(Fukata等(2002a)、Rosslenbroich等(2005))。これら融合タンパク質が天然のＣＲＭＰ４ｂとは異なった挙動を示す可能性は無視できないが、ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５およびＣＲＭＰ４ｂ-ＧＦＰの両方が内因性ＣＲＭＰと似た分布を有しており、類似の伸張円錐表現型を増進させる。これはＣＲＭＰ４ｂが、主にアクチンの細胞骨格と機能的に相互作用することを示唆している。

神経突起伸張の阻害におけるＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ複合体の潜在的役割にさらに取り組むためにＮｏｇｏ依存性伸張円錐崩壊の間のＣＲＭＰ４ｂおよびＲｈｏＡの分布を調べた。非感染およびＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５感染ＤＲＧ伸張円錐を固定し、内因性ＲｈｏＡおよびＣＲＭＰ４ｂあるいはそのＶ５エピトープタグを染色した。刺激する前は内因性ＲｈｏＡおよびＣＲＭＰ４ｂは、無視できる共局在化を有する伸張円錐内のはっきり識別できる分布を有する(図６ａ)。非刺激(対照)伸張円錐では過剰発現したＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５もまた、内因性ＲｈｏＡと比較してはっきり識別できる分布を有する(図６ｂ)。ミエリンによる刺激後、ＲｈｏＡおよびＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５は、伸張円錐の中枢および末梢ドメイン内のはっきり識別できる点の部分集合に共局在化し(図６ｂ、矢印)、これはＲｈｏＡ-ＣＲＭＰ４ｂ複合体が伸張円錐中で形をなし、その複合体が阻害性の攻撃に応答してアクチン細胞骨格の動態を調節することを示唆している。

ＣＲＭＰ-Ｖ５はＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ結合を弱める
ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ相互作用のＮｏｇｏの調節は、ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ複合体形成が阻害シグナルにとって重要である可能性を高める。ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ結合の特異的増大は、その高い親和性がＣＲＭＰ４ｂアミノ末端の伸展によって仲介される可能性があることを示唆する。したがってＣＲＭＰ４ｂアミノ末端がＲｈｏＡの結合を仲介する能力を評価した。ＣＲＭＰ２に融合したＣＲＭＰ４ｂアミノ末端からなるキメラＣＲＭＰ分子(ＣＲＭＰ４ｂＮＣＲＭＰ２)と、ＣＲＭＰ４ａおよびＣＲＭＰ４ｂの共通領域からなるＣＲＭＰ４構築物(ＣＲＭＰ４ａΔＮ、図７ａ)とを産生させた。ＣＲＭＰ４ｂＮＣＲＭＰ２およびＣＲＭＰ４ａΔＮの両方がＲｈｏＡと共に同時免疫沈降する。ただし両タンパク質は完全長のＣＲＭＰ４ｂよりも弱くＲｈｏＡに結合する(図７ｂ)。これは、ＣＲＭＰ４ｂ分子内の２つの独立したＲｈｏＡ結合部位がＲｈｏＡの結合にとって十分であること、またその２つの部位が協働して最高のＲｈｏＡの結合を仲介する可能性があることを示す。しかしＣＲＭＰ４ｂのこのアミノ末端領域がＲｈｏＡへのＮｏｇｏ依存性の動員を仲介するその決定的な部位であるように思われる(図３)。

完全長のＣＲＭＰ４ｂとＲｈｏＡとの間のＮｏｇｏ依存性相互作用を特異的に妨害するために構築物を作製して、Ｖ５エピトープタグに融合したＣＲＭＰ４ｂのユニークアミノ末端ドメイン(Ｃ４ＲＩＰ：ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ、図７ａ)を発現させた。予想されるようにＣ４ＲＩＰ-Ｖ５の同時トランスフェクションは、多分ＲｈｏＡ結合部位を獲得するために争うことによってＣＲＭＰ４ａとの結合に影響を与えることなく完全長ＣＲＭＰ４ｂとのＲｈｏＡの結合を著しく減少させる(図７ｃ)。

次いでＣ４ＲＩＰ-Ｖ５の特異性を、それがＦＬＡＧ-ＲｈｏＡ６３Ｌと、ｍｙｃ-Ｒｈｏキナーゼ(ｍｙｃ-ＲＯＣＫ)、すなわちミエリン阻害にとって重要なＲｈｏＡエフェクター分子との間の結合に及ぼす効果を調べることによって評価した。Ｃ４ＲＩＰ-Ｖ５は、ＦＬＡＧ-ＲｈｏＡ６３Ｌとｍｙｃ-ＲＯＣＫの間の結合を減少させない(図７ｄ)。同様にＣ４ＲＩＰ-Ｖ５の過剰発現は、ＦＬＡＧ-ＲｈｏＡ６３Ｌとｍｙｃ-ＲＯＣＫの間の結合に影響を与えず、これはＣＲＭＰ４ｂが、この下流のエフェクターと相互作用するＲｈｏＡの能力を変えないことを指す。
Ｃ４ＲＩＰ-Ｖ５は神経突起伸張の阻害を弱める：

Ｃ４ＲＩＰ-Ｖ５がＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡの結合を弱める能力は、ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ複合体形成がそのミエリン阻害における役割にとって必要であるかどうかを判定するための有用なツールを提供する。ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５またはＣ４ＲＩＰ-Ｖ５を、解離したＥ１３ヒナＤＲＧニューロン中へ組換えＨＳＶウィルスを介して導入し(図８ａ)、神経突起の伸張をミエリン支持体上で評価した(図８ｂ、ｄ)。ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５は、多分それがＲｈｏＡとの相互作用を増すことができない(図６ｂ)せいで擬態ミエリン阻害応答に対しては十分でない(図８ｂ、ｃ)。Ｃ４ＲＩＰは、ＧＦＰに感染させたまたは完全長ＣＲＭＰ４ｂに感染させたニューロンと比べてミエリン依存性伸張の阻害を著しく弱める(図８ｂ、ｄ)。以前に特徴を明らかにしたＲｈｏおよびＲＯＣＫアンタゴニストとは異なり、Ｃ４ＲＩＰは許容性対照支持体上で基底ＤＲＧ伸張を促進しない(図８ｂ、ｃ、Lehmann等(1999)、Fournier等(2003))。ＨＳＶＣ４ＲＩＰに感染させた、またはＨＳＶ優性ネガティブＲＯＣＫ(ＨＳＶ-ＤＮＲＯＣＫ、Alabed等(2006))に感染させたＤＲＧニューロンは、両方ともミエリン阻害から保護される。しかしＨＳＶ-ＤＮＲＯＣＫは、基底伸張を約５０％促進させる。

神経突起伸張阻害の細胞内媒介物を標的する利点は収束標的としてのそれらの可能性であり、多重阻害の影響を減ずることができる。Ｃ４ＲＩＰ-Ｖ５がＣＮＳ損傷に関連した追加の阻害シグナルを遮断することができるかどうかを測定するためにアグリカン、すなわちグリア性瘢痕の阻害性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンによって仲介される神経突起伸張阻害に及ぼすＣ４ＲＩＰ-Ｖ５の影響を調べた。驚くべきことにＣ４ＲＩＰはまた、アグリカン上でも神経突起伸張を促進することが分かった(図８ｅ)。

Ｃ４ＲＩＰの特異性を評価するために、それがＥ８ヒナＤＲＧニューロンにおけるＳｅｍａ３Ａ依存性伸張円錐崩壊を遮断する能力を試験した。Ｓｅｍａ３Ａによるニューロンの刺激は、Ｒａｃ１ ＧＴＰアーゼとＣＲＭＰ２アイソフォームを連結させる(Huber等(2003))。Ｃ４ＲＩＰはＳｅｍａ３Ａ依存性伸張円錐崩壊に何も効果がないことが分かった(図８ｆ)。全体として考えればこれらの結果は、ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ相互作用の妨害が、ＲｈｏＡ ＧＴＰアーゼを介してシグナルを送る阻害作用からニューロンを保護することを示している。

考察
ＣＮＳの外傷後の再生は、その細胞骨格に的を絞った改変を介して軸索の伸展を遮断する傷ついたニューロン内の細胞内経路の活性化によって制限される(Hsieh等(2006))。軸索伸張阻害因子の細胞内標的に対するアンタゴニストの開発は、その大グリア性瘢痕およびＭＡＩの阻害性の影響を回避する有効な手法である(Dergham等(2002)、Niederost等(2002)、Borisoff等(2003)、Fournier等(2003))。ここでＣＲＭＰ４ｂが、神経突起伸張阻害の必要な細胞内介在物であることが実証された。本発明の発見は、ＣＲＭＰ４ｂとＲｈｏＡの間の複合体形成が伸張の阻害にとって重要であること、およびこの阻害がアクチン依存性表現型を介して仲介される可能性があることを示唆している。この決定的に重要な意味をもつＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡの結合相互作用を標的することによって、阻害性支持体上で神経突起伸張を特異的に促進させるＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ結合の競合的アンタゴニストを開発した。これはＣＮＳ損傷後の神経修復のためのエキサイティングな新しい治療標的を示唆している。

ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ相互作用の動態
本発明は、ＲｈｏＡとＣＲＭＰ４ｂの間の特異的タンパク質相互作用について述べているが、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの他の密接な関係のあるファミリーメンバーにも、また他のＣＲＭＰファミリーメンバーにも適用されない。Ｎｏｇｏ刺激の存在しない場合、内因性ＣＲＭＰ４ｂとＲｈｏＡの間の基線相互作用は、小脳ニューロンおよびＤＲＧ伸張円錐中では無視できる。形質トランスフェクションされた２９３ＴおよびＰＣ１２細胞ではＮｏｇｏの存在しない場合、ＣＲＭＰ４ｂとＲｈｏＡは相互作用しない。しかしこの相互作用はタンパク質過剰発現の関数である可能性はある。

驚くべきことにＲｈｏＡ-ＣＲＭＰ４ｂ相互作用は、ＲｈｏＡのヌクレオチド結合状態には左右されず、むしろその相互作用はＣＲＭＰ４ｂのリン酸化状態に左右される。これは、基線相互作用の強度が、様々な細胞型においてキナーゼおよびホスファターゼの補体の関数として変わるという別の可能性を高める。

タンパク質相互作用子をスクリーニングするために用いられるＲｈｏＡは細菌中で精製されるので、脱リン酸化ＲｈｏＡがＣＲＭＰ４ｂにとって都合のよい結合相手であることもまた想像できる。これは、これまでその焦点が主としてＭＡＩがＲｈｏＡをＧＴＰ結合形態に変換する能力にあったミエリン阻害因子に応じた新規レベルのＲｈｏＡ調節の可能性を高める(Dergham等(2002)、Niederost等(2002)、Fournier等(2003))。この考えは、ＲｈｏＡがＰＫＡによりＳｅｒ第１８８においてリン酸化され、かつＲｈｏＡリン酸化がその内因性阻害因子、すなわちＲｈｏグアニンヌクレオチド解離因子(ＲｈｏＧＤＩ)との結合を変更する(Ellerbroek等(2003)、Nusser等(2006))という発見と矛盾しない。ＣＲＭＰ４ｂは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-３βによるリン酸化、およびＰＰ２Ａホスファターゼによる脱リン酸化を受ける(Hill等(2006))。リン酸化がＣＲＭＰ２との類似性に基づいてその結合特性を変える(Uchida等(2005))という仮説を立てることは道理に合っている。全体としてこれは、ＣＲＭＰおよび／またはＲｈｏに向けられたホスファターゼのＮｏｇｏ依存性の関与がそれによってＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ複合体の形成を促進することができるというモデルを示唆する。このモデルの予測によれば、適切な翻訳後改変が存在しない場合、そのＲｈｏＡとの対合は十分には高くならないので、ＣＲＭＰ４ｂ過剰発現はＤＲＧニューロンにおけるミエリン阻害を模倣することができないことになり、これが観察されたものである(図６、８)。

ＣＲＭＰタンパク質のＮ末端バリアントの役割
ラットにおけるまたヒナにおける原ＣＲＭＰメンバーの新規なアミノ末端バリアントの最近の発見(Quinn等(2003)、Yuasa-Kawada等(2003))は、ＣＲＭＰのさらなる潜在的機能を明らかにした。ＣＲＭＰｂアイソフォームのユニークアミノ末端の伸展は、さらなるタンパク質相互作用を仲介することによって各ＣＲＭＰバリアントに補足の機能を与えることができる。妥当な可能性は、いかにそのＣＲＭＰ４ｂのアミノ末端領域が伸張円錐内の適切な細胞骨格要素への動員にとって必要であろうとも、ＣＲＭＰ４ａおよびＣＲＭＰ４ｂが同類の細胞骨格の再配列を仲介することができることである。これは、ＣＲＭＰ４ａでなくＣＲＭＰ４ｂの過剰発現が、神経突起の分枝の増加につながるという発見と矛盾しない(Quinn等(2003)。

治療薬としてのＣ４ＲＩＰ
Ｃ４ＲＩＰでＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡを標的することは、治療的介入にとって可能性のある達成手段である。Ｃ４ＲＩＰがＭａＩおよびＣＳＰＧの両方に応じて阻害を弱める能力は、ＣＮＳ傷害後の複雑な阻害環境において明らかな利点である。神経系におけるＣＲＭＰ発現の質を高めることは、ＲｈｏＡまたはＲＯＣＫなどの遍在分子を標的することに比べて他の細胞型に及ぼす追加の副作用を制限することができる可能性を高める。Ｃ４ＲＩＰのユニークな特徴は、それが基底神経突起伸張に影響を及ぼすことができないことである。これは、阻害因子依存性の神経突起伸張経路によって特異的に生じたものとみなすことができる細胞内分子の最初の例と思われる。

ミエリン依存性阻害におけるＣＲＭＰ４ｂの機能
ミエリンの阻害におけるＣＲＭＰ４機能についての合理的な仮説には、微小管の動態、アクチンの動態、および／またはエンドサイトーシスに及ぼす効果が含まれる。ＣＲＭＰ２はチューブリンヘテロダイマーと結合することができ、発生の間の軸索樹状突起の結果を定着させるための微小管集合体の重要なオルガナイザーである(Fukata等(2002b)、Arimura等(2005))。これは、チューブリンヘテロダイマーと結合させ、微小管集合体を増進させることによって部分的には仲介される(Fukata等(2002b))。実際にＣＲＭＰ２は、Ｎｏｇｏ-６６およびＭＡＧに応じてＲＯＣＫ依存性リン酸化を受け、続いて微小管の動態を調節すると仮定された(Mimura等(2006))。すべてのＣＲＭＰメンバーがチューブリンと結合することができるが、ＣＲＭＰ４はＲＯＣＫのための基質ではなく、Ｎｏｇｏ-６６の刺激に応答したＣＲＭＰ４とチューブリンの間の親和性の変化は、ＰＣ１２細胞における同時免疫沈降分析によって何も検出されなかった(データ未掲載)。これはＮｏｇｏ-６６がＣＲＭＰ４依存性の微小管の動態に影響を及ぼさないことを示唆する。ただしその相互作用が神経突起または伸張円錐内で局所的に調節される場合、同時免疫沈降によるこの検出は可能ではなかった可能性はある。

上記データは、ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ複合体が、アクチン依存性の過程を介して神経突起伸張の阻害に関係する可能性があることを示唆する。ＣＲＭＰ４ｂと、インターセクチンすなわちエンドサイトーシス-エキソサイトーシスアダプタータンパク質(Quinn等(2003))との間の対合は、ＣＲＭＰ４ｂがエンドサイトーシスの調節において役割を演じることができる可能性を高める。神経突起阻害の間のエンドサイトーシスは、膜の動態を調節するために重要である可能性があり(Fournier等(2000))、あるいは細胞表面受容体または細胞接着分子のインターナリゼーションを標的し、ＭＡＩに応じてそれらの時間的および空間的調節を可能にする可能性もある。妥当と思われるモデルは、ＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ複合体が、伸張円錐の末梢から中枢ドメインへの局在化アクチンの再配置、ならびに後続の伸張円錐崩壊および神経突起停止に必要なエンドサイトーシス事象を調節するというものである。

上記で本発明をその好ましい実施形態を手段にして述べてきたが、これは別添の特許請求の範囲中で規定される本発明の精神、範囲、および本質から逸脱することなく修正することができる。

新規なＲｈｏＡ-ＣＲＭＰ４相互作用がＮｏｇｏ-６６によって増大することを示す図である。(ａ)ＡＰ(＋溶解産物)またはＡＰ-Ｎｏｇｏ-６６(＋Ｎｏｇｏ溶解産物)で刺激されたＰＣ１２細胞からのＧＳＴＲｈｏＡ６３Ｌのプルダウン。タンデム質量分析によってＣＲＭＰ４ｂとして同定された７５ｋＤａタンパク質の沈降は、ＡＰ-Ｎｏｇｏ-６６で刺激した溶解産物中で増大する(矢印)。このタンパク質は、ＧＳＴＲｈｏＡ６３Ｌ精製物由来の非特異的タンパク質よりわずか下に達しており、これはすべてのレーンにおいて見られる。ＧＳＴＲｈｏＡ６３Ｌのレーンは、溶解産物と共にインキュベートされなかったビーズを表す。(ｂ)汎ＣＲＭＰ抗体で免疫ブロットしたＰＣ１２細胞溶解産物由来のＧＳＴおよびＧＳＴＲｈｏＡ６３Ｌのプルダウン。ＣＲＭＰａ(６５ｋＤａ)およびＣＲＭＰｂ(７５ｋＤａ)のバンドがＰＣ１２インプットおよびプルダウンレーン中に示される(矢印)。 ＲｈｏＡ-ＣＲＭＰ４相互作用が、高度に特異的であり、ヌクレオチド非依存性であり、ホスホ依存性であり、かつ直接的であることを示す図である。(ａ〜ｃ)ＣＲＭＰ-Ｖ５構築物と、ｍｙｃタグを付けた野生型の変形と、突然変異Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼとを同時トランスフェクションし、ｍｙｃ-免疫沈降にかけたＨＥＫ２９３Ｔ細胞。(ａ)ＣＲＭＰ４は選択的にＲｈｏＡと結合する。２つの別個のブロット由来のデータは縦線によって分離されている。(ｂ)ＲｈｏＡはＣＲＭＰ４にとって好ましい結合相手である。(ｃ)ＣＲＭＰ４のＲｈｏＡとの結合はヌクレオチド非依存性である。(ｄ)ＣＲＭＰ-Ｖ５は対照から、またはカリキュリンで処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から免疫沈降され、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離され、組換えＲｈｏＡで覆われた。ＲｈｏＡはＣＲＭＰ４ａおよびＣＲＭＰ４ｂと直接結合するが、リン酸化ＣＲＭＰ４ｂ(ＩＰ：免疫沈降)とは結合できない。 Ｎｏｇｏ-Ｐ４ペプチドが、ＣＲＭＰ４ｂとＲｈｏＡの相互作用を増大させることを示す図である。(ａ、ｂ)ｍｙｃ-ＲｈｏＡと、ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５(ａ)またはＣＲＭＰ４ａ-Ｖ５(ｂ)とをトランスフェクションし、Ｎｏｇｏ-Ｐ４ペプチドで０、１、または１０分間刺激し、ｍｙｃ-免疫沈降にかけたＰＣ１２細胞。(ｃ)Ｎｏｇｏ-Ｐ４ペプチドで刺激し、ＲｈｏＡ免疫沈降にかけ、ＲｈｏＡおよびＣＲＭＰ４ｂ(ＩＰ、免疫沈降)について分析したＰ８ラットの小脳培養物。 ＣＲＭＰ４発現のｓｉＲＮＡ性ノックダウンが、ミエリン上での神経突起伸張を促進させることを示す図である。(ａ)ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５と、スクランブル(scrambled)ｓｉＲＮＡまたはＣＲＭＰ４を標的とするｓｉＲＮＡとを同時トランスフェクションし、抗Ｖ５抗体で免疫ブロッティングすることによって分析したＨＥＫ２９３Ｔ細胞。(ｂ)ＨＳＶＣＲＭＰ４ｂ-ＧＦＰに感染させ、スクランブルｓｉＲＮＡまたはＣＲＭＰ４のｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたラットの単離ＤＲＧニューロン(スケールバー＝１００μｍ)。(ｃ)スクランブルｓｉＲＮＡまたはＣＲＭＰ４のｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、１８時間の神経突起伸張アッセイのためにラミニン(対照)またはミエリン支持体上に播種したβＩＩＩチューブリンで染色し単離したラットのＤＲＧニューロン(スケールバー＝１００μｍ)。(ｄ)スクランブルｓｉＲＮＡ(Scram)またはＣＲＭＰ４のｓｉＲＮＡによる対照支持体上でのＤＲＧ伸張の定量化。(ｅ)スクランブルｓｉＲＮＡまたはＣＲＭＰ４のｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたニューロンからのミエリン上でのＤＲＧ伸張の定量化。数値は、各実験についてその対照ラミネン支持体の基線の伸張に対して正規化されている。測定は、３回の試験を２回行った結果による。スチューデントｔ検定によりスクランブルｓｉＲＮＡと比較した（^*ｐ＜０.０１）。 ＣＲＭＰ４ｂ過剰発現が、ニューロン伸張円錐および神経突起中でアクチン系糸状仮足表現型を増進させることを示す図である。(ａ)抗ＣＲＭＰ４ｂ抗体で染色したＥ１３ヒナＤＲＧ。(ｂ)ＨＳＶ-ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５に感染させ、抗Ｖ５抗体で染色したＥ７ヒナＤＲＧニューロン。(ｃ〜ｄ)ＨＳＶ-ＣＲＭＰ４ｂ-ＧＦＰに感染させ、ローダミン、ファロイジンで二重染色(ｃ)してＦ-アクチンまたは抗βＩＩＩチューブリン抗体を標識(ｄ)したＥ７ヒナＤＲＧニューロン。(ｅ)ＨＳＶ-ＧＦＰまたはＨＳＶ-ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５に感染させたＥ１３ヒナＤＲＧニューロン。ＧＦＰおよびＣＲＭＰ４ｂに感染させた伸張円錐をローダミン、ファロイジンで染色した(赤色)。ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５を抗Ｖ５抗体で染色した(緑色)(スケールバー＝１０μｍ)。(ｆ)パネル(ｄ)中の囲まれた領域を拡大したものは、ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５に感染させたＤＲＧニューロンにおいて神経突起の分枝および糸状仮足の伸展が進んだことを実証している。(ｇ)ＧＦＰにまたはＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５に感染させたＤＲＧニューロンの神経突起および糸状仮足の長さ当たりの分枝数の定量化。 ＣＲＭＰ４ｂおよびＲｈｏＡが、ミエリン依存性の伸張円錐の崩壊の間、分離した殻孔に共存することを示す図である。対照またはミエリンで刺激されたＥ１３ヒナＤＲＧ伸張円錐における内因性のＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ(ａ)、またはＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５およびＲｈｏＡ(ｂ)の免疫蛍光検出結果。合成したパネル中の矢印は、ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５-ＲｈｏＡ共存領域を示す。 ＣＲＭＰ４ｂのアミノ末端ドメインが、ＲｈｏＡの結合にとって十分であり、組換え融合タンパク質として発現される場合に完全長のＣＲＭＰ４ｂ-ＲｈｏＡ結合を妨害することを示す図である。(ａ)ＲｈｏＡ結合に関与するＣＲＭＰ４ｂドメインを評価するために作成したＣＲＭＰ構築物の図式。(ｂ)(ａ)で述べたｍｙｃ-ＲｈｏＡ６３ＬおよびＣＲＭＰ-Ｖ５構築物を同時トランスフェクションし、ｍｙｃ-免疫沈降にかけたＨＥＫ２９３Ｔ細胞。(ｃ)ＲｈｏＡとの完全長ＣＲＭＰ４の結合に及ぼすＣ４ＲＩＰの影響を評価するためにｍｙｃ-ＲｈｏＡＷＴ、ＣＲＭＰ４-Ｖ５、およびＣ４ＲＩＰ-Ｖ５を同時トランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞。(ｄ)ＲＯＣＫとのＲｈｏＡの結合に及ぼすＣ４ＲＩＰの影響を評価するためにＦＬＡＧ-ＲｈｏＡ６３Ｌ、ｍｙｃ-ＲＯＣＫ、およびＣ４ＲＩＰ-Ｖ５を同時トランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞。 Ｃ４ＲＩＰ-Ｖ５がミエリンの阻害を弱めることを示す図である。(ａ)ＨＳＶ-Ｃ４ＲＩＰ-Ｖ５またはＨＳＶ-ＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５に感染させ、ニューロンの感染を検証するために抗Ｖ５抗体および抗βＩＩＩチューブリン抗体で二重染色したＥ１３ヒナの単離ＤＲＧニューロン。(ｂ)Ｃ４ＲＩＰ-Ｖ５またはＣＲＭＰ４ｂ-Ｖ５に感染させ、ラミニン(対照)またはミエリン支持体上にプレートし、神経突起伸張を可視化するために抗βＩＩＩチューブリンで染色したＥ１３ヒナの単離ＤＲＧニューロン。(ｃ〜ｅ)ラミニン(ｃ)、ミエリン(ｄ)、またはアグリカン(ｅ)支持体上でＧＦＰ、Ｃ４ＲＩＰ、またはＣＲＭＰ４ｂに感染させたニューロンからの神経突起の伸張の定量化。(ｃ)では細胞当たりの神経突起の伸張は、各実験についてＧＦＰに感染させたニューロンの伸張(１００％)に対して正規化されている。(ｄ)および(ｅ)では神経突起の伸張は、各用量曲線についてラミニン支持体上の伸張(１００％)に対して正規化されている。測定は、４回の独立した試験の結果による。スケールバー＝１００μｍ。スチューデントｔ検定により、ＧＦＰと比較した（^*ｐ＜０.０５および^**ｐ＜０.０１）。(ｆ)ＨＳＶ-ＧＦＰまたはＨＳＶ-Ｃ４ＲＩＰに感染させ、対照ＡＰリガンドまたはＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａリガンドで２０秒間刺激したＥ８ヒナＤＲＧニューロンにおける伸張円錐崩壊の定量化。測定は、３回の独立した試験を重複して行った結果による。 ラットのＣＲＭＰ４ｂアミノ酸およびｃＤＮＡ配列データを示す図である。(ａ)Ｃ４ＲＩＰを灰色で影付きとしたラットのＣＲＭＰ４ｂのアミノ酸配列(配列番号１)、(ｂ)ラットのＣ４ＲＩＰのアミノ酸配列(配列番号２)。 ラットのＣＲＭＰ４ｂアミノ酸およびｃＤＮＡ配列データを示す図である。(ｃ)Ｃ４ＲＩＰを灰色の影付きとしたラットのＣＲＭＰ４ｂのｃＤＮＡ配列(配列番号３)、(ｄ)ラットのＣ４ＲＩＰのｃＤＮＡ配列(配列番号４)、(ｅ)ラットのＣＲＭＰ４ａのアミノ酸配列(配列番号５)。 ラットのＣＲＭＰ４ｂアミノ酸およびｃＤＮＡ配列データを示す図である。(ｆ)ラットＣＲＭＰ４ａのｃＤＮＡヌクレオチド配列(配列番号６)。 Ｃ４ＲＩＰあるいはＣ４ＲＩＰの誘導体、アナログ、バリアント、またはフラグメントに関係する治療用途に適している可能性のある膜転座配列の例を示す図である。(ａ)Ｃ３-０５インターナライジング配列を有するＣ４ＲＩＰ配列(配列番号８および９)、(ｂ)Ｃ３-０５ＭＴＳ(配列番号１０)、(ｃ)カポジＭＴＳを有するＣ４ＲＩＰ配列(配列番号１１および１２)、および(ｄ)カポジＭＴＳ。

Claims (28)

1. 配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いはその誘導体、アナログ、バリアント、又はフラグメント。
2. 配列番号４のヌクレオチド配列又はその縮重バリアントによってコードされる、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 膜転座配列(ＭＴＳ)をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
4. 前記ＭＴＳが、配列番号１０又は配列番号１３のヌクレオチド配列、或いはその縮重バリアントによってコードされる、請求項３に記載のポリペプチド。
5. 発現制御配列と作用可能なように結合された配列番号４のヌクレオチド配列又はその縮重バリアントを含む発現ベクター。
6. 発現制御配列と作用可能なように結合された配列番号４またはその縮重バリアントのヌクレオチド配列と膜転座配列(ＭＴＳ)とを含む発現ベクター。
7. 前記ＭＴＳが、配列番号１０又は配列番号１３のヌクレオチド配列、あるいはその縮重バリアントを有する、請求項６に記載の発現ベクター。
8. 前記ベクターが単純ヘルペスウィルス(ＨＳＶ)から得られる、請求項５〜７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
9. 請求項５〜８のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む培養細胞。
10. タンパク質の産生方法であって、当該タンパク質の発現を可能にする条件下で請求項９に記載の細胞を培養することを含む、前記方法。
11. 前記細胞または前記細胞の培養液から前記タンパク質を精製することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 中枢または末梢神経系の損傷または疾患後にニューロンの再生を促進させるためにＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用またはＣＲＭＰ４の他の機能を妨害する化合物の使用。
13. 前記化合物がＣ４ＲＩＰ、或いはその誘導体、アナログ、バリアント、又はフラグメントである、請求項１２に記載の使用。
14. 前記化合物が、配列番号２のアミノ酸配列を有するか、あるいはその誘導体、アナログ、バリアント、またはフラグメントである、請求項１２に記載の使用。
15. ニューロンの再生を促進するためにＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用またはＣＲＭＰ４の他の機能を妨害する化合物の有効量を損傷部位に投与することを含む、それが必要な患者の中枢または末梢神経損傷の修復方法。
16. 前記化合物がＣ４ＲＩＰ、或いはその誘導体、アナログ、バリアント、又はフラグメントである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記化合物が、配列番号２のアミノ酸配列を有するか、或いはその誘導体、アナログ、バリアント、又はフラグメントである、請求項１５に記載の方法。
18. ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡアンタゴニストまたはＣＲＭＰ４アンタゴニストの有効量を神経伸張環境へ送達するステップを含む、ニューロン再生のミエリン依存性阻害の抑制方法。
19. 前記化合物がＣ４ＲＩＰ、或いはその誘導体、アナログ、バリアント、又はフラグメントである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記化合物が、配列番号２のアミノ酸配列を有するか、或いはその誘導体、アナログ、バリアント、又はフラグメントである、請求項１８に記載の方法。
21. ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用またはＣＲＭＰ４の他の機能を阻害する化合物の同定方法であって、
    ａ、ＣＲＭＰ４およびＲｈｏＡを発現する細胞を準備し、そして
    ｂ、上記細胞を試験化合物と接触させて当該化合物がＣＲＭＰ４とＲｈｏＡの間の相互作用またはＣＲＭＰ４の他の機能を妨害するかどうかを調べる
    を含む、前記方法。
22. ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用またはＣＲＭＰ４の他の機能を阻害する化合物の同定方法であって、
    ａ、ＣＲＭＰ４およびＲｈｏＡを発現させる細胞を準備し、
    ｂ、上記細胞を、ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用またはＣＲＭＰ４の他の機能のいずれかを阻害することが知られている多量の化合物と接触させ、その効果を測定し、
    ｃ、別の容器中で上記細胞を試験化合物と接触させ、その効果を測定し、そして
    ｄ、(ｂ)および(ｃ)の結果を比較して上記試験化合物もまた阻害剤であるかどうかを判定する
    を含む、前記方法。
23. ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用またはＣＲＭＰ４の他の機能を阻害することが知られている前記化合物が、Ｃ４ＲＩＰもしくはその誘導体、アナログ、バリアント、またはフラグメントであるか、あるいは前記阻害剤が前記細胞のＤＮＡ中に挿入された構築物を介して内生的に発現される、請求項２２に記載の方法。
24. ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用またはＣ４ＲＩＰの他の機能を阻害することが知られている前記化合物が、配列番号２のアミノ酸配列、あるいはその誘導体、アナログ、バリアント、またはフラグメントを有する、請求項２３に記載の方法。
25. キット中に包含される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 中枢または末梢神経系の損傷または疾患の治療方法であって、ＣＲＭＰ４-ＲｈｏＡ相互作用またはＣＲＭＰ４の他の機能を妨害する化合物の治療に有効な量を投与することを含む、前記方法。
27. 前記化合物が、Ｃ４ＲＩＰ或いはその誘導体、アナログ、バリアント、又はフラグメントである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記化合物が、配列番号２のアミノ酸配列を有するか、或いはその誘導体、アナログ、バリアント、又はフラグメントである、請求項２６に記載の方法。

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