CN115645104A - 一种小鼠肺脏脱细胞基质支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小鼠肺脏脱细胞基质支架及其制备方法和应用。该制备方法包括：取处死小鼠开放胸腔，使用26G滞留针沿肺动脉刺入2mm，留滞留针套管于肺动脉内，夹钳固定后推注肝素钠溶液，待肺组织由粉红色逐渐充盈至白色后，完整分离出肺组织，该过程在1分钟内完成。分离出的肺组织连接到体外灌流系统，保持恒流恒温依次灌注灌注液，获得小鼠全肺脏脱细胞基质支架。本发明通过采用非离体小鼠肺动脉插管，彻底替换肺脏毛细血管内部血液，避免离体操作导致的毛细血管内部血液凝固堵塞，为有效的得到毛细血管网络结构完整、清晰可见，以及肺泡基质结构完整的小鼠肺脏脱细胞基质支架提供有利保障，大大提高小鼠肺脏脱细胞基质支架获取成功率。
Description
技术领域
本发明涉及脱细胞基质支架制备技术领域，特别是涉及一种小鼠肺脏脱细胞基质支架及其制备方法和应用。
背景技术
脱细胞基质技术是指应用一定方法对器官或组织进行处理，除去其中的细胞、酶等物质，保留细胞外基质(ECM)的结构、成分和某些功能，形成一个天然的细胞外基质支架。因其成分相较于人工合成的ECM而言更接近天然状态，故应用较为广泛。
目前，该脱细胞基质技术的常见方法为物理法、化学法、生物法三种，通过这些方法的复合作用，达到破坏细胞膜，清除其他细胞成分的效果。物理法包括冷冻、物理搅拌、直接冲洗和离心等物理方法，其基本原理是通过机械性作用，将组织或器官中细胞的膜结构损坏，随后通过溶液的冲洗脱去组织或器官中的细胞。化学法的原理是利用一些化学试剂如酸、碱、表面活性剂、去污剂等，破坏细胞的磷脂双分子层和细胞膜蛋白，致使细胞破碎，然后通过振荡洗涤等方法实现脱细胞。生物法，又称酶解法，即通过加入外源性消化酶如胰蛋白酶、核酸酶等，破坏细胞膜结构和细胞器等，从而达到脱细胞效果。
现在对于研究肝脏、肾脏脱细胞基质的技术较多，而肺脏由于其内部丰富的肺泡毛细血管网，制备时容易导致毛细血管内部凝血，导致肺脏脱细胞技术一直发展缓慢。而对于肺脏脱细胞基质支架制备的研究，也大多是基于大鼠肺、猪肺等较大型动物肺脏的研究，而没有针对小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备研究。主要原因在于：现有肺脏脱细胞基质支架的制备均是先离体肺组织后进行灌注处理，而小鼠肺脏体积太小，全肺仅1cm左右，体积仅占大鼠肺脏体积的1/4。又由于肺脏内分布丰富的毛细血管，操作过程中易因血液凝固而影响后续的灌注效果，造成脱细胞基质支架的制备成功率很低，故小鼠肺脏脱细胞基质支架的应用受到限制。
本申请就是在此基础上，创设一种新的小鼠肺脏脱细胞基质支架及其制备方法和应用，使其通过非离体小鼠肺动脉插管灌注，最大程度的降低肺脏内凝血现象，提高小鼠肺脏支架获取成功率，为小鼠肺脏脱细胞基质支架的应用提供有利条件。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法，使其通过非离体小鼠肺动脉插管灌注，最大程度的降低肺脏内凝血现象，提高小鼠肺脏支架获取成功率，为小鼠肺脏脱细胞基质支架的应用提供有利条件，从而克服现有的肺脏脱细胞基质支架的局限性。
为解决上述技术问题，本发明提供一种小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法，所述制备方法包括：
(1)取3月龄股动脉放血处死的小鼠，开放胸腔，于左心耳上方寻找肺动脉，使用26G滞留针沿肺动脉刺入2mm，抽取出刺针，留滞留针套管于肺动脉内，夹钳固定后，注射口连接注射器并推注50U/mL肝素钠溶液2-5mL，待肺组织由粉红色逐渐充盈至白色后，完整分离出肺组织；
(2)将分离出的肺组织连接到体外灌流系统，保持灌注液的恒流恒温灌注，灌注液依次为：50U/mL肝素化PBS溶液，灌注5-15min；0.5-1.5％脱氧胆酸钠溶液，灌注60-150min；PBS溶液，灌注15min；1％Triton X-100溶液，灌注5-10min；PBS溶液，灌注15min；DNaseⅠ冲洗液，灌注30-60min；PBS溶液，灌注15min；抗生素冲洗液，灌注30-60min，停止灌流，获得小鼠全肺脏脱细胞基质支架。
进一步改进，所述步骤(1)中从小鼠处死至分离出肺组织在1分钟内完成。
进一步改进，所述步骤(1)中小鼠在处死前30min时，腹腔注射10-15mg/mL肝素钠溶液0.5-1mL。
进一步改进，所述步骤(2)中灌注条件为：流速0.5mL/min，室温22-25℃。
进一步改进，所述步骤(2)获得的小鼠全肺脏脱细胞基质支架放入PBS溶液中，于4℃冰箱保存备用。
本发明还要解决的技术问题是提供一种小鼠肺脏脱细胞基质支架，所述小鼠肺脏脱细胞基质支架采用上述的小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法制备得到。
本发明还要解决的技术问题是提供上述小鼠肺脏脱细胞基质支架在用于构建工程化肺脏组织或类器官中的应用。
采用这样的设计后，本发明至少具有以下优点：
本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法通过采用非离体小鼠肺动脉插管，利用留置针套管灌注肝素钠溶液，能彻底的替换肺脏毛细血管内部血液，避免离体操作导致的肺脏毛细血管内部血液凝固堵塞，为有效的得到毛细血管网络结构完整、清晰可见，以及肺泡基质结构完整的小鼠肺脏脱细胞基质支架提供有利保障，能最大程度的降低肺脏内凝血现象，大大提高小鼠肺脏脱细胞基质支架获取的成功率。
本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法得到的小鼠肺脏脱细胞基质支架能用于构建工程化肺脏组织或类器官，使构建的工程化肺脏组织或类器官能更好的模拟体内肺脏细胞的生长环境，对呼吸系统疾病的体外模型构建具有推动作用。
附图说明
上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1是本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法中寻找并对肺动脉固定的操作过程示意图。
图2是本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法中非离体灌注心肺组织的操作过程示意图。
图3是本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法中游离出的心肺组织示意图。
图4是本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法中灌注肺组织的过程示意图。
图5是本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法得到的小鼠肺脏脱细胞基质全景示意图。
图6是本发明采用离体灌注方法得到的小鼠肺脏脱细胞基质示意图。
图7为本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法得到的小鼠全肺脏脱细胞基质支架100μm电镜下的肺泡基质结构电镜图。
图8为本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法得到的小鼠全肺脏脱细胞基质支架50μm电镜下的肺泡基质结构电镜图。
图9为本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法得到的小鼠全肺脏脱细胞基质支架30μm电镜下的肺组织毛细血管网络结构电镜图。
图10为本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法得到的小鼠全肺脏脱细胞基质支架5μm电镜下的肺泡基质结构中基质纤维素结构电镜图。
图11为本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架经低温研磨成微粒后的扫描电镜图。
图12为本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架经低温研磨成微粒后进行3D培养的光镜观察图。
图13为本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架培养成脱细胞基质微球后的不同放大倍数的扫描电镜图。
图14为本发明小鼠肺脏脱细胞基质支架培养成脱细胞基质微球后通过不同染色法得到的微球内部结构图。
具体实施方式
实施例一
(1)取经三溴乙醇深度麻醉后，行股动脉放血处死的3月龄小鼠，快速开放胸腔，于左心耳上方寻找肺动脉，使用26G滞留针(带刺针)沿肺动脉刺入2mm左右，抽取出刺针，留滞留针套管于肺动脉内，夹钳固定。如附图1所示，图中A、B、C、D依次为寻找肺动脉、刺入滞留针、留滞留针套管，夹钳固定。然后注射口连接注射器，推注50U/mL肝素钠溶液2mL，待肺组织由粉红色逐渐充盈至白色后，如附图2所示，完整游离出心肺组织，如附图3所示，得到完整的小鼠心肺组织。
其中，小鼠在处死前的30min，腹腔注射10mg/mL肝素化PBS溶液0.5mL。
并且该步骤中从小鼠处死至分离出肺组织需在1分钟内完成。
(2)将分离出的肺组织连接到Langendorff体外灌流系统，采用仿生理流速0.5mL/min，且在25℃室温条件下保持恒流恒温灌注，依次使用50U/mL肝素化PBS溶液灌注15min，1％脱氧胆酸钠溶液120min，PBS溶液15min,1％ Triton X-100溶液10min，PBS溶液15min,DNaseⅠ冲洗液60min，PBS溶液15min,抗生素冲洗液60min。如附图4所示，图中A、B、C、D依次为灌注开始、30min、60min、180min的状态图。
其中，抗生素冲洗液采用溶于PBS溶液的两性霉素B和青链霉素混合液。具体配置方法为：称取12.5mg两性霉素B，再吸取5mL青链霉素，混合溶于500mL的PBS溶液中。
(3)停止灌流，即获得小鼠全肺脏脱细胞基质支架，如附图5所示，放入PBS溶液中，于4℃冰箱保存，备用。
实施例二
(1)取经三溴乙醇深度麻醉后，行股动脉放血处死的3月龄小鼠，快速开放胸腔，于左心耳上方寻找肺动脉，使用26G滞留针(带刺针)沿肺动脉刺入2mm左右，抽取出刺针，留滞留针套管于肺动脉内，夹钳固定后，注射口连接注射器，推注50U/mL肝素钠溶液5mL，待肺组织由粉红色逐渐充盈至白色后，完整游离出心肺组织。
其中，小鼠在处死前的60min，腹腔注射15mg/mL肝素化PBS溶液0.5mL。
并且该步骤中从小鼠处死至分离出肺组织需在1分钟内完成。
(2)将分离出的肺组织连接到Langendorff体外灌流系统，采用仿生理流速0.5mL/min，且在22℃室温条件下保持恒流恒温灌注，依次使用50U/mL肝素化PBS溶液灌注5min，0.5％脱氧胆酸钠溶液150min，PBS溶液15min,1％ Triton X-100溶液5min，PBS溶液15min,DNaseⅠ冲洗液30min，PBS溶液15min,抗生素冲洗液30min。
其中，抗生素冲洗液同实施例一。
(3)停止灌流，即获得小鼠全肺脏脱细胞基质支架，放入PBS溶液中，于4℃冰箱保存，备用。
实施例三
(1)取经三溴乙醇深度麻醉后，行股动脉放血处死的3月龄小鼠，快速开放胸腔，于左心耳上方寻找肺动脉，使用26G滞留针(带刺针)沿肺动脉刺入2mm左右，抽取出刺针，留滞留针套管于肺动脉内，夹钳固定后，注射口连接注射器，推注50U/mL肝素钠溶液3mL，待肺组织由粉红色逐渐充盈至白色后，完整游离出心肺组织。
其中，小鼠在处死前的50min，腹腔注射10mg/mL肝素化PBS溶液1.0mL。
并且该步骤中从小鼠处死至分离出肺组织需在1分钟内完成。
(2)将分离出的肺组织连接到Langendorff体外灌流系统，采用仿生理流速0.5mL/min，且在25℃室温条件下保持恒流恒温灌注，依次使用50U/mL肝素化PBS溶液灌注10min，1.5％脱氧胆酸钠溶液60min，PBS溶液15min,1％Triton X-100溶液8min，PBS溶液15min,DNaseⅠ冲洗液50min，PBS溶液15min,抗生素冲洗液50min。
其中，抗生素冲洗液同实施例一。
(3)停止灌流，即获得小鼠全肺脏脱细胞基质支架，放入福尔马林溶液中，于4℃冰箱保存，备用。
对比例一
同样，3月龄小鼠在处死前的30min，腹腔注射10mg/mL肝素化PBS溶液0.5mL。
小鼠经三溴乙醇深度麻醉后，行股动脉放血处死，快速开放胸腔，完整游离出心肺组织，需要从小鼠处死至分离出心肺组织不超过1分钟。然后使用26G滞留针(带刺针)沿肺动脉刺入2mm左右，抽取出刺针，留滞留针套管于肺动脉内，夹钳固定后，注射口连接注射器，推注50U/mL肝素钠溶液2mL，并将肺组织连接到Langendorff体外灌流系统。采用仿生理流速0.5mL/min，且在25℃室温条件下保持恒流恒温灌注，依次使用50U/mL肝素化PBS溶液灌注15min，1％脱氧胆酸钠溶液120min，PBS溶液15min,1％ Triton X-100溶液10min，PBS溶液15min,DNaseⅠ冲洗液60min，PBS溶液15min,抗生素冲洗液60min。停止灌流，获得的小鼠全肺脏脱细胞基质支架如附图6所示。
从对比例可看出，通过该离体肺组织灌注方法小鼠肺组织的毛细血管已存在血凝堵塞现象，无法完全灌注到毛细血管的全部部位，该小鼠全肺脏脱细胞基质支架制备不成功。
取上述实施例1制备得到的小鼠全肺脏脱细胞基质支架进行扫描电镜观察，结果如附图7、8、9、10。其中，附图7为该小鼠全肺脏脱细胞基质支架100μm电镜下的肺泡的基质结构。附图8为该小鼠全肺脏脱细胞基质支架50μm电镜下的肺泡的基质结构。从附图7和8中可清楚的看出，该肺泡基质结构完整，基质上存在细胞留下的细胞印记。附图9为该小鼠全肺脏脱细胞基质支架30μm电镜下的肺组织毛细血管网络结构。从附图9可清楚的看出，该肺组织脉管、神经网络结构清晰可见。附图10为该小鼠全肺脏脱细胞基质支架5μm电镜下的肺泡基质结构中基质纤维素结构。从附图10可清楚的看出，该肺泡基质结构中基质纤维素呈螺旋结构。
本申请小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法是针对小鼠全肺脱细胞基质支架的制备，能将小鼠肺脏脱细胞基质支架的成功率从离体制备的20％提高至60-80％，使小鼠肺脏脱细胞基质支架的广泛应用成为可能，提升肺脏脱细胞基质支架的可获取性，突破现有肺脏脱细胞基质支架的局限性，降低应用成本。
并且，本申请制备方法得到的小鼠全肺脱细胞基质支架可用于构建工程化肺脏组织或类器官。如将得到的小鼠肺脏脱细胞基质支架低温研磨成微粒，联合超低吸附板建立3D培养胚肺成纤维细胞的体外模型，构建微球样肺的类器官。该方法构建的肺微球样类器官与普通3D培养得到的胚肺成纤维细胞的区别在于：本申请得到的小鼠全肺脱细胞基质支架在3D细胞培养过程中增加了天然细胞外基质成分，可以更好的模拟体内肺脏细胞的生长环境，对呼吸系统疾病的体外模型构建具有推动作用。
具体应用实施例
取上述实施例1制备得到的小鼠全肺脏脱细胞基质支架，通过低温液氮研磨获得脱细胞基质微粒，微粒粒径分布为5-50μm，在扫描电镜下观察，如附图11所示，该脱细胞基质微粒呈现散在的片状分布，进一步放大观察到呈束状缠绕分布的胶原纤维样结构，表明成功获取了脱细胞基质微粒。
然后，将胚肺成纤维细胞系经传统2D培养方式传代培养至第3代后，如附图12中图A，于超低吸附板进行3D微球培养。培养4天后，采用不同浓度的脱细胞基质微粒组，如附图12中图C、D、E，与附图12中图B所示的相同细胞数无基质组微球相比，该脱细胞基质微粒组的微球的直径更长，且微球体积随添加基质浓度的增加而逐渐更大。
又通过扫描电镜观察发现，如附图13所示，微球表面可观察到较长的脱细胞基质纤维束样结构，表明脱细胞基质微粒能够作为组织微环境载体参与体外细胞的3D培养。
在体外培养上述微球7天后，取出微球并通过石蜡包埋、切片、染色进一步观察其内部结构。如附图14所示，HE染色结果显示脱细胞基质微粒可形成稳定的微球核心，支撑细胞于微球球周生长；Masson染色结果也表明球心核区以蓝色胶原类物质为主；还通过检测Ki67蛋白的免疫荧光成像反应观察细胞的增殖状态(Ki67是一种细胞增殖相关的核蛋白抗原，是反映细胞增殖活性的客观指标)，与无基质组相比，含小鼠全肺脏脱细胞基质组微球细胞增殖显著，且球周数层细胞均有发生增殖，表明本申请制备的小鼠肺脏脱细胞基质微粒能够作为细胞体外3D培养的载体，促进细胞的增殖，为构建工程化肺脏组织或类器官其重要作用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)取3月龄股动脉放血处死的小鼠，开放胸腔，于左心耳上方寻找肺动脉，使用26G滞留针沿肺动脉刺入2mm，抽取出刺针，留滞留针套管于肺动脉内，夹钳固定后，注射口连接注射器并推注50U/mL肝素钠溶液2-5mL，待肺组织由粉红色逐渐充盈至白色后，完整分离出肺组织；
(2)将分离出的肺组织连接到体外灌流系统，保持灌注液的恒流恒温灌注，灌注液依次为：50U/mL肝素化PBS溶液，灌注5-15min；0.5-1.5％脱氧胆酸钠溶液，灌注60-150min；PBS溶液，灌注15min；1％Triton X-100溶液，灌注5-10min；PBS溶液，灌注15min；DNaseⅠ冲洗液，灌注30-60min；PBS溶液，灌注15min；抗生素冲洗液，灌注30-60min，停止灌流，获得小鼠全肺脏脱细胞基质支架。
2.根据权利要求1所述的小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中从小鼠处死至分离出肺组织在1分钟内完成。
3.根据权利要求2所述的小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中小鼠在处死前30-60min时，腹腔注射10-15mg/mL肝素化PBS溶液0.5-1mL。
4.根据权利要求1所述的小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中灌注条件为：流速0.5mL/min，室温22-25℃。
5.根据权利要求1所述的小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)获得的小鼠全肺脏脱细胞基质支架放入PBS溶液中，于4℃冰箱保存备用。
6.一种小鼠肺脏脱细胞基质支架，其特征在于，采用权利要求1至5任一项所述的小鼠肺脏脱细胞基质支架的制备方法制备得到。
7.权利要求6所述的小鼠肺脏脱细胞基质支架在用于构建工程化肺脏组织或类器官中的应用。
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| CN117100912A (zh) * | 2023-06-08 | 2023-11-24 | 北京科昕恒业生物科技有限公司 | 一种肺脏脱细胞基质及其制备方法 |
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- 2022-10-31 CN CN202211350469.9A patent/CN115645104A/zh active Pending
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