JP2009535391A - 乳癌の治療に使用するためのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の阻害剤 - Google Patents

乳癌の治療に使用するためのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の阻害剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、癌細胞の転移を阻害する薬剤であって、該薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する薬剤を提供する。好ましい実施態様において、該薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写、翻訳、及び／又は結合特性を変化させる。好ましくは、該薬剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、及びｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７又はその受容体に対して結合親和性を有する化合物から成る群から選択される。本発明は、患者の癌細胞の転移を阻害する方法、並びに癌を診断する方法及びキットを更に提供する。

Description

本発明は、癌の治療に使用するための薬剤に関する。特に、本発明は、癌細胞の転移を阻害することができる薬剤を提供する。
抗微生物タンパク質は先天性免疫系の中心的エフェクターである。ヒトで唯一既知のカテリシジンである、ヒトカテリシジン抗微生物タンパク質ｈＣＡＰ１８は、保存カテリンドメイン及び可変Ｃ末端から成り、ＬＬ−３７と呼ばれる (Gudmundsson et al., 1996, Eur J Biochem 1238: 325-32; Zanetti et al., 1995, FEBS Lett 374: 1-5)。ホロタンパク質の細胞外タンパク質分解プロセシングはＬＬ−３７ペプチドを遊離するが、これは広範な抗微生物活性を有する(Gudmundsson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92: 7085-9; Agerberth et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92: 195-99) と共に、宿主細胞に効果を有し、この中の１部はＧタンパク質共役受容体、ホルミルペプチド受容体様１（ＦＰＲＬ１）によって媒介される (Yang et al., 2000, J Exp Med 192: 1069-74; Koczulla et al., 2003, J Clin Invest 111: 1665-72)。ｈＣＡＰ１８は、白血球に存在し(Cowland et al., 1995, FEBS Lett 368: 173-76) 、そして皮膚及び他の上皮に発現し、そこでは先天性バリア保護の役割と一致して、炎症(Cowland et al., 1995, FEBS Lett 368: 173-76; Frohm et al., 1997, J Biol Chem 272: 15258-63) 及び損傷 (Dorschner et al., 2001, J Invest Dermatol 117: 91-97; Heilborn et al., 2003, J Invest Dermatol 120: 379-89) と関連してアップレギュレートされる。最近、カテリシジン類を含む抗微生物タンパク質は、腫瘍に対して非特異的に宿主防御の役割をも果たすと提案されている (Winder et al., 1998, Biochem Biophys Res Commun 242: 608-12; Ohtake et al., 1999, Br J Cancer 181: 393-403)。
本発明の第１の態様は、癌細胞の転移を阻害する薬剤であって、該薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生理活性を阻害する（即ち、インビボで阻害することができる）薬剤を提供する。
「転移」とは、被験者の体内の原発腫瘍部位由来の癌細胞から、（該細胞が次いで二次性腫瘍を形成することができる）人体内の１つ又はそれ以上の他の領域への移動又は移行(例えば、浸潤性)を意味する。このように、１つの実施態様において、本発明は、癌を有する被験者の二次性腫瘍の形成を、全体又は一部において阻害する薬剤及び方法を提供する。当業者には当然のことながら、「転移」に対する本明細書に記載の薬剤の効果は、該薬剤が癌細胞増殖、即ち癌細胞の数に効果を及ぼす又は及ぼさないいずれの効果とも異なるものである。
「薬剤」には、全ての化学物質、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、及び低分子化合物が含まれる。
このように、本発明は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を直接的に（例えば、タンパク質の生物活性を低下させることによって）又は間接的に（例えば、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現を低下させることによって）阻害することができる薬剤を提供する。
１つの好ましい実施態様において、該薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写、翻訳、切断及び／又は結合特性を変化させることによって、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する。
当該薬剤は、例えば：
（ａ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７ｍＲＮＡの発現レベルに対する試験用薬剤の効果を測定することによって、例えば、ノーザンブロット法又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって；
（ｂ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質のレベルに対する試験用薬剤の効果を測定することによって、例えば、抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７抗体を用いるイムノアッセイによって；及び
（ｃ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７活性の機能的マーカー、例えば、ＥｒｂＢ２のリン酸化に対する試験用薬剤の効果を測定することによって；
業界で周知の方法を用いて同定することができる。
本発明の１つの好ましい実施態様において、該薬剤はｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写の阻害剤である。
本発明の別の実施態様において、該薬剤はｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の翻訳の阻害剤である。
本発明の更なる実施態様において、該薬剤はｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の結合特性の阻害剤である。例えば、該薬剤は、その受容体にもはや結合できないようにｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の立体配座を変化させることができる。
当業者には当然のことながら、該薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体機能を直接遮断することによって、即ち、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体アンタゴニストとして作用することによって、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害することもできる。１つの実施態様において、該ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体はＦＲＰファミリーの受容体である。
本発明の尚更なる実施態様において、該薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７又はそのｍＲＮＡの安定性を調節する(例えば、低下させる)ことによって、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する。例えば、該薬剤はカテリシジンタンパク質分解プロセシングの阻害剤、例えばプロテアーゼ阻害剤(プロテイナーゼ３など)であってもよい。
該薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を選択的に阻害することができることが有利である。
「選択的」とは、該薬剤が、癌細胞において他のタンパク質の活性を調節するよりも大きくｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害することを意味する。好ましくは、該薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性だけを阻害し、一方で当然のことながら、癌細胞内の他のタンパク質の発現及び活性は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の選択的阻害の下流の結果として変化し得る。それ故、遺伝子発現及び／又は癌細胞転移に対して非特異的影響を有する薬剤は除外する。
当業者には当然のこととして、本発明の薬剤によるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性の阻害は、全体又は一部であってよい。例えば、該薬剤は、該薬剤に曝露されていない癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性に比べて、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％、及び最も好ましくは１００％阻害し得る。好ましい実施態様において、該薬剤は、該薬剤に曝露されていない癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性に比べて、５０％又はそれ以上ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害することができる。
好ましくは、該薬剤は以下のタイプ：
（ａ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子；
（ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチド；及び
（ｃ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対して結合親和性を有する、ポリペプチドなどの化合物；
の薬剤から選択される。
代わりに、該薬剤は、ビタミンＤのアンタゴニスト、例えば、ＺＫ１５９２２２(Schering AG) 、及びＴＥＩ−９６４７(Tejin Institute for Medical Research, Tokyo)、並びにビタミンＡのアンタゴニスト、例えば、ＡＧＮ１９３１０９(Allergen Pharmaceuticals)などの小分子阻害化合物であってもよい。
本発明の第１の態様の１つの好ましい実施態様において、該薬剤は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。
ＲＮＡ干渉は２工程のプロセスである。第１の工程は開始工程と呼ばれ、インプットｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮアーゼＩＩＩファミリーの１メンバーであって、ＡＴＰ依存的にｄｓＲＮＡ（直接又はトランスジーン若しくはウイルスを介して導入される）をプロセシング(切断)する、恐らくダイサー（Dicer）の作用によって、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと消化される。連続切断事象は、ＲＮＡを各々２−ヌクレオチド３'オーバーハングを有する１９〜２１ｂｐ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）へと分解する(Hutvagner & Zamore, 2002, Curr. Opin. Genetics and Development 12: 225-232; Bernstein, 2001, Nature 409: 363-366)。
エフェクター工程では、該ｓｉＲＮＡ二本鎖はヌクレアーゼ複合体に結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡ二本鎖のＡＴＰ依存的巻き戻しはＲＩＳＣの活性化に必要である。活性ＲＩＳＣは、次に塩基対相互作用により相同転写物を標的とし、ｓｉＲＮＡの３'末端からｍＲＮＡを１２ヌクレオチドフラグメントへ切断する(Hutvagner & Zamore, 2002, supra.; Hammond et al., 2001, Nat. Rev. Gen. 2: 110-119 (2001); Sharp, 2001, Genes. Dev. 15: 485-90)。切断のメカニズムは未だ解明されていないが、研究結果は、各ＲＩＳＣが単一ｓｉＲＮＡ及びＲＮアーゼを含有することを示している(Hutvagner & Zamore, 2002, 上記を参照)。
ＲＮＡｉの顕著な効力の点から、ＲＮＡｉ経路内の増幅工程が示唆されている。増幅は、より多くのｓｉＲＮＡを発生する可能性のあるインプットｄｓＲＮＡのコピーによって、又は形成されたｓｉＲＮＡの複製によって起こり得る。代わりに、又は更に、増幅はＲＩＳＣの多重ターンオーバー事象によってもたらされ得る (Hammond et al., 2001, supra.; Hutvagner & Zamore, 2002, 上記を参照)。ＲＮＡｉに関する更なる情報は、以下のレビューに見出すことができる：Tuschl, 2001, Chem. Biochem. 2: 239-245, Cullen, 2002, Nat. Immunol. 3: 597-599 and Brantl, 2002, Biochem. Biophys Act. 1575: 15-25。
本発明で使用するための適切なＲＮＡｉ分子の合成は、以下のように達成することができる。先ず、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡ配列が、ＡＡジヌクレオチド配列に対するＡＵＧ開始コドンの下流でスキャンされる。各ＡＡ及び３'隣接１９ヌクレオチドの生成が、潜在的ｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。好ましくは、非翻訳領域（ＵＴＲ）が調節タンパク質結合部位に豊富なことから、ｓｉＲＮＡ標的部位はオープンリーディングフレームから選択される。ＵＴＲ結合タンパク質及び／又は翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害すると考えられる (Tuschl, ChemBiochem. 2: 239-245)。しかしながら、当然のことながら、非翻訳領域に向けられたｓｉＲＮＡｓもまた有効と考えられる。
第２の潜在的標的部位は、BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)などの配列アラインメントソフトウェアを用いて、適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラット、等）と比較される。他のコード配列に顕著な相同性を示す推定標的部位は除外される。
適格な標識配列がｓｉＲＮＡ合成の鋳型として選択される。好ましい配列は低いＧ／Ｃ含量を含むものであり、これらは５５％より高いＧ／Ｃ含量のものに比べて遺伝子サイレンシングを媒介するのにより有効なことが証明されている。幾つかの標的部位は、好ましくは評価のための標的遺伝子の長さに沿って選択される。選択されたｓｉＲＮＡのより優れた評価のために、ネガティブコントロールが好ましくは同時に使用される。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡは、好ましくはｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムに対して顕著な相同性を欠いている。従って、それがいずれか他の遺伝子に対して顕著な相同性を示さない条件で、ｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列が好ましく使用される。
好ましくは、該ｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１のヌクレオチド配列のフラグメント、又はそのようなフラグメントの変異体を含む。
ＨＣＡＰ１８／ＬＬ−３７ｍＲＮＡ（取得番号ＭＮ００４３４５）
Figure 2009535391
代わりに、該ｓｉＲＮＡ分子は、ＥＮＳＧ０００００１６４０４７（ゲノム配列）から転写したヌクレオチド配列のフラグメントを含む。
「フラグメント」とは、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドを意味する。
「変異体」とは、該ヌクレオチド配列が、配列番号１のフラグメントと少なくとも９０％の配列同一性、又は配列番号１のフラグメントと少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。
２ポリヌクレオチド間のパーセント配列は、適切なコンピュータープログラム、例えばUniversity of Wisconsin Genetic Computing GroupのＧＡＰプログラムを用いて決定することができ、また当然のことながら、パーセント同一性は、その配列が最適にアラインメントされたポリヌクレオチドに関連付けて算出される。
代わりに、該アラインメントは、Clustal Wプログラムを用いて実施することができる(Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680に記載されているように) 。
使用されるパラメーターを以下に示す：
高速対アラインメントパラメーター：Ｋ−組（語）サイズ；１、ウインドウサイズ；５、ギャップペナルティー；３、トップダイアゴナル数；５、採点法：ｘパーセント。
多重アラインメントパラメーター：ギャップオープニングペナルティー；１０、ギャップ拡大ペナルティー；０.０５。
採点マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
代わりに、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを、局所的配列アラインメントを決定するために使用してもよい。
該ｓｉＲＮＡ分子の長さは、１９〜２３ヌクレオチドが有利である。
本発明の第１の態様の別の好ましい実施態様において、該薬剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のレベル／活性を効果的に低下させるために使用できる、アンチセンス分子のデザインは、アンチセンスアプローチに重要な２側面の検討を必要とする。第１の態様は癌細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの送達であるのに対して、第２の態様は、その翻訳を阻害するやり方で、細胞内に指定したｍＲＮＡを特異的に結合するオリゴヌクレオチドのデザインである。
従来技術は、オリゴヌクレオチドを多種多様な細胞型へ効率的に送達するために使用できる数多くの送達方法を教えている (例えば、 Luft, 1998, J Mol Med 76:75-6; Kronenwett et al., 1998, Blood 91: 852-62; Rajur et al., 1997, Bioconjug Chem 8: 935-40; Lavigne et al., 1997, Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71; Aoki et al., 1997, Biochem Biophys Res Commun 231: 540-5を参照)。
加えて、該標的ｍＲＮＡ及び該オリゴヌクレオチドの両方の構造変化のエネルギー論を説明する熱力学サイクルに基づき、それらの標的ｍＲＮＡに対する最大予測結合親和性を有する、それらの配列を同定するアルゴリズムが入手可能である (例えば、 Walton et al., 1999, Biotechnol Bioeng 65: 1-9を参照)。
インビトロ系を用いた特異的オリゴヌクレオチドの効率を設計しそして予測する幾つかのアプローチも公知である (例えば、Matveeva et al., 1998, Nature biotechnology 16: 1374-1375を参照)。
幾つかの臨床治験は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実行可能性及び活性を証明している。例えば、癌の治療に適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドが使用され奏功している (Holmlund et al., 1999, Curr Opin Mol Ther 1: 372-85; Gerwitz, 1999, Curr Opin Mol Ther 1: 297-306)。更に最近になって、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス介在抑制が、マウスモデルでヒト癌細胞の胸膜播種を阻害することが報告された (Uno et al., 2001, Cancer Res 61: 7855-60)。
このように、当業者は、直ちに、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現をダウンレギュレートするための適切なアンチセンス法を設計し実施することができる。
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチドのフラグメント、又は当該フラグメントの変異体を含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、１５〜３５塩基長が有利である。例えば、２０マーのオリゴヌクレオチドは、上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの発現を阻害することが示され (Witters et al, Breast Cancer Res Treat 53: 41-50 (1999)) 、また２５マーオリゴヌクレオチドは、９０％より多く副腎皮質刺激ホルモンの発現を低下させることが示されている (Frankel et al., J Neurosurg 91: 261-7 (1999))。しかし、当然のことながら、この範囲外、例えば１０、１１、１２、１３若しくは１４塩基、又は３６、３７、３８、３９若しくは４０塩基の長さのオリゴヌクレオチドを使用することも望ましい。
当業者には更に当然のことながら、オリゴヌクレオチドは細胞内内因性ヌクレアーゼにより分解又は不活化を受ける。この問題に対応するために、例えば、天然に存在するホスホジエステル結合を別の結合と置換して、ヌクレオチド間結合を変化させた、修飾オリゴヌクレオチドを用いることが可能である。例えば、Agrawal et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083は、オリゴヌクレオチドホスホルアミダート及びホスホロチオエートを用いたＨＩＶ−１の組織培養における、阻害の増加を実証した。Sarin et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451 は、オリゴヌクレオチドメチルホスホネートを用いたＨＩＶ−１の阻害の増加を実証した。Agrawal et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7790-7794 は、ヌクレオチド配列特異的オリゴヌクレオチドホスホロチオエートを用いて、初期感染及び慢性感染細胞培養の両方におけるＨＩＶ−１複製の阻害を実証した。Leither et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434 は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートによるインフルエンザウイルス複製の、組織培養における阻害を報告している。
人工結合を有するオリゴヌクレオチドは、インビボで分解に抵抗することが示されている。例えば、Shaw et al., (1991) , in Nucleic Acids Res. 19, 747-750は、他の非修飾オリゴヌクレオチドが、特定のキャッピング構造により３'末端でブロックされた場合、インビボでヌクレアーゼにより抵抗性になること、及び非キャップ化オリゴヌクレオチドホスホロチオエートがインビボで分解されないことを報告している。
オリゴヌクレオシドホスホロチオエートを合成するためのＨ−ホスホネート法の詳細な記述は、Agrawal and Tang, (1990), Tetrahedron Letters 31, 7541-7544において提供されており、その教えるところは、参照することにより本明細書に組み入れられている。オリゴヌクレオチドメチルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミダート、リン酸エステル、架橋ホスホルアミダート及び架橋ホスホロチオエートの合成は、業界で公知である。例えば、Agrawal and Goodchild, (1987), Tetrahedron Letters 28, 3539;
Nielsen et al., (1988), Tetrahedron Letters 29, 2911; Jager et al., (1988), Biochemistry 27, 7237; Uznanski et al., (1987), Tetrahedron Letters 28, 3401; Bannwarth ,(1988), Helv. Chim. Acta. 71, 1517; Crosstick and Vyle, (1989), Tetrahedron Letters 30, 4693; Agrawal et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405を参照、そしてその教えるところは、参照することにより本明細書に組み入れられている。合成又は製造のための他の方法もまた可能である。好ましい実施態様において、該オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるが、リボ核酸（ＲＮＡ）配列も合成及び適用可能である。
本発明において有用なオリゴヌクレオチドは、内因性核酸分解酵素による分解に抵抗するように適切に設計される。オリゴヌクレオチドのインビボ分解は、縮小した長さのオリゴヌクレオチド崩壊産物を産生する。このような崩壊産物は非特異的ハイブリダイゼーションに関与している可能性が非常に高く、そしてそれらの完全長の対応物に比べて有効性が低い可能性がある。このように、体内の分解に抵抗して標的細胞に到達することができるオリゴヌクレオチドを用いることが望ましい。本オリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステル結合を１つ又はそれ以上の内部の人工ヌクレオチド間結合に置き換えることにより、例えば、結合中のホスフェートを硫黄に置き換えることによって、インビボ分解に対してより抵抗性を与えることができる。使用可能な結合の例としては、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、サルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、種々のホスホルアミダート、リン酸エステル、架橋ホスホロチオエート及び架橋ホスホルアミダートが挙げられる。他のヌクレオチド間結合は業界で周知のことから、このような例は限定することなく例証される。ホスホジエステルのヌクレオチド間結合を置き換える１つ又はそれ以上のこれらの結合を有するオリゴヌクレオチドの合成は、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを製造する合成経路を含めて業界で周知である。
オリゴヌクレオチドは、５′又は３′末端ヌクレオチドに類似の基を「キャッピング」又は取り込むことによって、内因性酵素による伸長に抵抗性となり得る。キャッピング用試薬は、Applied BioSystems Inc, Foster City, CA社製のAmino-Link IITMとして市販されている。キャッピング方法は、例えば、 Shaw et al., (1991), Nucleic Acids Res. 19, 747-750 及びAgrawal et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(17), 7595-7599によって記載されている。
オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼの攻撃に対して抵抗性にする更なる方法は、Tang et al., (1993), Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735に記載のように、それらを「自己安定化」することである。自己安定化オリゴヌクレオチドはそれらの３′末端にヘアピンループ構造を有し、そしてヘビ毒ホスホジエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ及びウシ胎仔血清による分解に対して抵抗性の増加を示す。オリゴヌクレオチドの自己安定化領域は、相補的核酸によるハイブリダイゼーションを妨害せず、またマウスでの薬物動力学及び安定性研究では、それらの直線状対応物に対して自己安定化オリゴヌクレオチドのインビボ持続性の増加を示した。
例えば、本発明のｓｉＲＮＡ分子及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の表（その配列は添付の実施例にも記載されている）から選択される配列を含み又はそれらから成ってもよい：
Figure 2009535391
本発明の薬剤の更に好ましい実施態様において、該薬剤は、タンパク質及び炭水化物などの、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対して結合親和性を有する化合物である。
「結合親和性を有する化合物」とは、インビボで、即ち、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７が癌細胞内部に存在する生理的条件下で、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合できる化合物を意味する。
例えば、該化合物は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性部位に実質的に可逆的に又は実質的に不可逆的に結合してもよい。更なる実施例において、該化合物は、リガンド又は受容体へのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の結合を妨害しないように、活性部位ではないｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の一部分に結合してもよい。尚更なる実施例において、該化合物は、アロステリック効果によりタンパク質活性を低下するように、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の一部分に結合してもよい。このアロステリック効果は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性の自然調節に、例えば「上流アクチベータ」によるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性化に関与するアロステリック効果であると考えられる。
試験化合物とｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７との間の相互作用を検出する方法は、業界で周知である。例えば、イオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法を用いる限外濾過法又は他の物理的及び分析的方法を使用してもよい。加えて、蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）法が使用可能であり、そこでは２つの蛍光標識体の結合が、相互に接近した場合に蛍光標識の相互作用を測定することによって評価可能である。
高分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及びリン脂質へのポリペプチドの結合を検出する別の方法としては、例えば、Plant et al., 1995, Analyt Biochem 226(2), 342-348に記載の表面プラズモン共鳴分析が挙げられる。方法としては、例えば、放射性又は蛍光標識により標識されたポリペプチドを利用してもよい。
該ポリペプチドに結合することができる化合物の更なる同定方法は、該ポリペプチドが該化合物に曝され、そして前記ポリペプチドへの該化合物のいずれかの結合が検出及び／又は測定されるものである。該ポリペプチドへの該化合物の結合に対する結合定数を定量することができる。ポリペプチドへの化合物の結合を検出及び／又は測定(定量化)する適切な方法は業界で周知であり、そして、例えば、ハイスループット操作の可能な方法、例えばマイクロチップを用いた方法を使用して行なうことができる。VLSIPS(登録商標)と呼ばれる新技術は、数十万又はそれ以上の異なる分子プローブを含む極小型チップの製造を可能にしている。これらの生物学的チップ又はアレイは、アレイに配置されたプローブを有し、各プローブは特定の位置を決定する。各位置が例えば１０ミクロンのスケールを有する生物学的チップが製造されている。該チップは、標的分子がチップ上でいずれのプローブと相互作用するかを明らかにするために使用することができる。該アレイを選択された試験条件下標的分子に曝露後、スキャンニング装置がアレイ中の各位置を調べ、標的分子がその位置でプローブと相互作用するかを測定することができる。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対する結合親和性で化合物を同定する別法は、本発明のポリペプチドが、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７を結合するタンパク質を「捕獲する」ために使用することができる、酵母ツーハイブリッド法である。酵母ツーハイブリッド法は、Fields & Song, Nature 340: 245-246 (1989)に記載されている。
本発明のこの態様の１つの好ましい実施態様において、該薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対してリガンド結合能を有する化合物である。
例えば、該薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体の可溶性フラグメント（ＦＰＲＬ１など）であってもよい。代わりに、該薬剤は、抗体を模倣する高親和性分子（いわゆる「アフィボディ」）であってもよい(例えば 米国特許第５,８３１,０１２号及び www.affibody.se)。これらのリガンドは、プロテインＡ（細菌のStaphylococcus aureus由来の表面タンパク質）のＩｇＧ結合ドメインの１つのスカフォールド（scaffold）に基づく３つのヘリックス束から構成される小さな単純タンパク質である。このスカフォールドは親和性リガンドとして優れた特徴を有し、そして高い親和性であらゆる既知の標的タンパク質に結合することが意図されている。
しかしながら、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対して結合親和性を有する該化合物は、ポリペプチドであり又はポリペプチドを含むことが有利である。
例えば、該化合物は、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、又はその抗原結合フラグメントなどの抗体でもよい。
「抗体」としては、実質的に完全抗体分子、並びにキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（少なくとも１つのアミノ酸は天然のヒト抗体に比べて変異している）、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は軽鎖のホモダイマー及びヘテロダイマー、並びに抗原結合フラグメント及びその誘導体が含まれる。
「抗原結合フラグメント」とは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対して結合できる抗体の機能性フラグメントを意味する。
好ましくは、抗原結合フラグメントは、Ｆｖフラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ'フラグメント及びＦ（ａｂ）2フラグメント）、単一可変領域（例えば、ＶH及びＶLドメイン）及びドメイン抗体（単一及び二重フォーマット[即ち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ]を含むｄＡｂｓ）から成る群から選択される。
全抗体よりもむしろ抗体フラグメントを用いる利点は、数倍大きい。小サイズのフラグメントは、固形組織への優れた透過性など、薬理学的特性の改良をもたらす可能性がある。更に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びｄＡｂ抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントはE. coliに発現し分泌され得ることから、大量の前記フラグメントの容易な産生を可能にする。
例えば、ポリエチレングリコール又は他の適切なポリマーの共有結合によって修飾された、抗体の改良体及びその抗原結合フラグメントも、本発明の範囲内に含まれる。
抗体及び抗体フラグメントの生成方法は業界で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のインビボ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Orlandi. et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349: 293-299）、又は培養細胞系によるモノクローナル抗体分子の生成を用いる、幾つかの方法のうちのいずれか１つを介して生成され得る。これらは、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術 (Kohler et al., 1975. Nature 256: 4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120)を含むが、これらに限定されるものではない。
選択抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、例えば、「モノクローナル抗体：技術マニュアル」、H Zola (CRC Press, 1988) 及び「モノクローナル・ハイブリドーマ抗体：技術と応用 」、J G R Hurrell (CRC Press, 1982)に開示されている公知技術によって製造することができる。
抗体フラグメントは、業界において周知の方法 (例えば、 Harlow & Lane, 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照)を用いて得ることができる。例えば、本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質加水分解によるか、又は該フラグメントをコードするＤＮＡのE. coli若しくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養又は他のタンパク質発現系）における発現によって製造することができる。代わりに、抗体フラグメントは、従来法による全抗体のペプシン又はパパイン消化によって得られる。
当業者には当然のことながら、ヒトの治療又は診断に対して、ヒト化抗体が適切に使用される。ヒト以外(例えば、マウス)の抗体のヒト化型は、ヒト以外の抗体由来の最小単位を好ましく有する、遺伝子工学的キメラ抗体又は抗体フラグメントである。ヒト化抗体は、ヒト抗体(レシピエント抗体)の相補性決定領域が、所望の機能性を有するマウス、ラット又はウサギなどのヒト以外の種(ドナー抗体)の相補性決定領域由来の残基によって置換された抗体を含む。幾つかの例において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基は、対応するヒト以外の残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、外来性相補性決定領域又はフレームワーク配列にも認められない残基を含んでもよい。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域のすべてを実質的に含むと考えられ、そこでは相補性決定領域のすべて、又は実質的にすべてがヒト以外の抗体の領域に相当し、そしてフレームワーク領域の全て、又は実質的に全ては、関連ヒトコンセンサス配列の領域に相当する。ヒト化抗体は、最適には、主としてヒト抗体から由来するＦｃ領域などの抗体定常領域の少なくとも一部分をも含む(例えば、Jones et al., 1986. Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596を参照)。
ヒト以外の抗体をヒト化する方法は、業界で周知である。一般的に、ヒト化抗体は、ヒト以外の起源から導入された１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。しばしば外来性残基といわれるヒト以外のアミノ酸残基は、主として外来性可変領域から取リ込まれる。ヒト化は、記載されているように(例えば、 Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525;
Reichmann et al., 1988. Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536l; 米国特許第４,８１６,５６７号を参照)、ヒト相補性決定領域を対応するげっ歯類の相補性決定領域と置き換えることによって基本的には実施される。従って、当該ヒト化抗体はキメラ抗体であって、実質的にインタクトなヒト可変領域以外がヒト以外の種由来の対応する配列によって置き換えられる。実際には、ヒト化抗体は一般的にヒト抗体であって、幾つかの相補性決定領域残基及び可能な幾つかのフレームワーク残基がげっ歯類抗体の類似部位由来の残基によって置き換えられる。
ヒト抗体は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー(例えば、Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147: 86-95を参照)を含み、業界で公知の種々の技術を用いて同定することもできる。
適切な抗体が得られた時点で、例えば、ＥＬＩＳＡによって、活性を試験することができる。
本発明の第１の態様の特に好ましい実施態様において、該薬剤は、癌細胞に選択的に送達され又は選択的に活性化することができる。
「選択的」とは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性に対する該薬剤の阻害作用が、癌細胞において又は細胞内で優先的に行なわれる（癌細胞の部位への該薬剤の局所投与による以外）ことを意味する。
癌細胞など特別な細胞型へ薬剤をターゲッティングする方法は、業界で周知である (例えば、Vasir & Labhasetwar, 2005, Technol Cancer Res Treat. 4(4): 363-74; Brannon-Peppas & Blanchette, 2004, Adv Drug Deliv Rev. 56(11): 1649-59 and Zhao & Lee, 2004, Adv Drug Deliv Rev. 56(8): 1193-204を参照) 。
例えば、該薬剤は標的細胞特異的部位を含むことができる。「標的細胞特異的」部位とは、標的癌細胞上で実体を認識しまた結合する、１つ又はそれ以上の結合部位を含む該薬剤の部位を意味する。標的細胞と接触することにより、標的細胞特異的部位は阻害部位と共に内在化することができる。
標的細胞特異的部位によって認識される該実体は、優先的にそして好ましくは排他的に標的癌細胞上に発現する。標的細胞特異的部位は、同じ標的細胞型上に発現する異なる実体に対して１つ若しくはそれ以上の結合部位を、又は２つ若しくはそれ以上の異なる標的細胞型上に発現する異なる実体に対して１つ若しくはそれ以上の結合部位を含んでもよい。
好ましくは、標的細胞特異的部位は、高い結合活性を有する標的細胞を認識する。「高い結合活性」とは、標的細胞特異的部位が、少なくともＫd＝１０-6Ｍ、好ましくは少なくともＫd＝１０-9Ｍ、適切にはＫd＝１０-10Ｍ、更に適切にはＫd＝１０-11Ｍ、更により適切にはＫd＝１０-12Ｍ、そしてより好ましくはＫd＝１０-15Ｍ又は尚更にＫd＝１０-18Ｍの結合定数の標的細胞を認識することを意味する。
認識される該実体は、腫瘍細胞によって発現するいずれの適切な実体であってもよい。時に、認識される該実体は抗原であり得る。
抗原の例としては、表１にリストアップされたものが挙げられる。
Figure 2009535391
他の抗原としては、アルファフェトプロテイン、Ｃａ−１２５、前立腺特異抗原、及び上皮増殖因子受容体ファミリーのメンバー、即ち、ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ２及びｅｒｂＢ４が含まれる。
標的細胞特異的部位は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントが有利である。好ましくは、該抗体はヒト化抗体である。
標的細胞特異的部位は、標的細胞特異的部位が抗体又はその二価のフラグメントである、該標的細胞に対して２つ又はそれ以上の結合部位を含むことが好都合である。上記標的細胞特異的部位は、互いに同じ実体を認識し、又は異なる実態を認識する個別の「アーム」を有してもよい。
本発明の薬剤の１つの実施態様において、標的細胞特異的部位は、同じ標的細胞上の分子がその細胞型に限定されないで多少の他の細胞型に生じることもある、同じ標的細胞上で異なる分子を認識する２つの「アーム」を有する。例えば、標的細胞特異的部位の１つの「アーム」は、細胞型Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ上の分子を認識し得るが、他の「アーム」は、細胞型Ｉ、ＩＶ及びＶ上の分子を認識し得る。従って、このような標的細胞特異的部位を含む本発明の薬剤は、細胞型ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに比べて細胞型Ｉに対して大きな特異性を有する可能性がある。本発明のこの態様は、発見されている完全に標的細胞特異的な分子が非常に少ないことから特に有用であるが、一方で多少の細胞型上に生じ、また本発明のこの態様に有用な分子は周知である。当該分子は、交差反応性抗体が知られている通常の細胞表面抗原である。
表１に挙げられた該抗原の多くに結合するモノクローナル抗体は既知であるが、いずれにせよ、モノクローナル抗体技術に関連する今日の技術により、大部分の抗原に対する抗体が製造し得る（上記参照）。
認識される該実体は、抗原性かどうか分からないが、他の様式で認識され、また選択的に結合され得る。例えば、それはメラノーマ細胞の多数に発現するメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）に対する受容体などの特徴的細胞表面受容体であり得る。代わりに、該実体は、標的細胞に誘導される実体であってよい。従って、細胞特異的部位は、非免疫的意味で、例えば、細胞表面酵素に対する基質若しくはそのアナログとして又はメッセンジャーとして、実体に特異的に結合する化合物又はその一部であってよい。
好ましくは、高結合活性標的細胞特異的部位は、標的細胞に対する２つ又はそれ以上の異なる結合部位を含む。
標的細胞に対する異なる結合部位は、標的細胞に発現する異なる実体に向けられた、２つ又はそれ以上の異なる抗体、又はそのフラグメントかどうか確かではない。代わりに、標的細胞に対する異なる結合部位は、他の何か非免疫的意味において細胞を認識し、また選択的に結合することができる。
当然のことながら、標的部位は、２部位の機能的活性を保持するいずれかの適切な手段により、本発明の阻害剤に結合し得る。例えば、標的部位及び阻害部位が両者ともにポリペプチドの場合では、それらは互いに融合して融合タンパク質を作りだすことができる。当該融合の例は、当業者に周知である。
本発明に関する選択的阻害剤の別の実施態様において、該薬剤は癌細胞によって選択的に活性化されるプロドラッグである。
本出願で使用される「プロドラッグ」なる用語は、親薬剤に比べて癌細胞に対して低毒性で、酵素的に活性化され、又はより活性な原型に変換される、薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体型を表す(例えば、 D.E.V. Wilman “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions 14, 375-382 (615th Meeting, Belfast 1986) and V.J. Stella et al “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery” Directed Drug Delivery R. Borchardt et al (ed.) pages 247-267 (Humana Press 1985)を参照)。
当該プロドラッグ剤を製造するための適切な方法は、業界で周知である (例えば、Denny, 2004, Cancer Invest. 22(4):604-19; Rooseboom et al., 2004, Pharmacol Rev. 2004 56(1): 53-102; 国際特許第０３／１０６４９１号を参照)。
プロドラッグ活性化用の酵素を選択する場合には、幾つかの要因を考慮に入れる必要がある。これらは、酵素の分子量と物理的性質、生理的条件下でのその活性と安定性、及び酵素が生成する薬物の性質を含む。
この戦略の適応性は、多数の機構的に別々の抗癌剤を放出する能力を有する様々な酵素の採用に便宜を提供する。単一のＭａｂ−酵素複合体は、相乗活性を有する機構的に異なる抗癌剤の治療的有効量を生成することができるという事実は、特に価値が高い。これは、免疫原性の根拠にとって重要性を証明する。これらの点に関して、多くのβ−ラクタマーゼは、それらの有利な動力学及び広い基質特異性、並びにセファロスポリン基質の３′−位に付加した置換基を除去する能力があるので、かなりのポテンシャルを有している(Svensson et al (1992) “Mab-β-lactamase conjugates for the activation of a cephalosporin mustard prodrug” Bioconjugate Chem. 3, 176-181を参照)。
哺乳類及び非哺乳類起源の酵素はいずれも、広範囲のプロドラッグの活性化に使用されている (Senter et al, 1993. Generation of cytotoxic agents by targeted enzymes. Bioconjugate 4, 3-9; Senter et al, 1991. Activation of prodrugs by antibody-enzyme conjugates. In Immunobiology of Proteins and Peptides VI, ed. M.Z.Atassi. Plenum Press, New York, pp 97-105)。哺乳類起源の酵素は、低い免疫原性の故に有利になり得るが、それらが作用する該プロドラッグは、対応する内因性酵素の基質であってもよい。
当業者には当然のことながら、本発明の薬剤は、異なるタイプの癌細胞の転移を阻害するために使用することができる。１つの好ましい実施態様において、しかしながら、癌細胞（癌腫細胞）は上皮細胞又は扁平上皮細胞である。
該癌細胞は、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器官、肺と気道、皮膚、胆嚢、肝臓、鼻咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺及び胃腸管の癌細胞からなる群から選択されることが有利である。
好ましくは、癌細胞は乳癌細胞である。更に好ましくは、乳癌細胞はElstonグレードＩＩＩ細胞である。最も好ましくは、乳癌細胞は転移性である。
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に記載の薬剤及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。従って、本発明は、更に癌細胞の転移を阻害する薬物を提供する。
本明細書で使用する「医薬製剤」とは、本発明による治療効果のある製剤を意味する。
本明細書で使用される「治療的有効量」、又は「有効量」、又は「治療上有効」とは、特定の条件及び投与レジメンに対し治療効果をもたらす当該量を意味する。これは、所要の添加剤及び希釈剤、即ち担体又は投与賦形剤と共同して所望の治療効果をもたらすと計算される活性物質の所定の量である。更に、宿主の活動、機能及び反応の臨床上重大な欠如を低減し、また最も好ましくは予防するのに十分な量を意味することを意図している。代わりに、治療的有効量は、宿主の臨床上重大な状態の改善をもたらすのに十分である。当業者には当然なことながら、化合物の量はその特異的な活性に依存して変動し得る。適切な投与量は、所要の希釈剤と共同して所望の治療効果をもたらすと計算される活性組成物の所定の量を含むことができる。本発明の組成物の製造方法及び使用において、活性成分の治療的有効量が提供される。治療的有効量は、業界で周知の年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患等患者の特性に基づいて、通常の熟達した医学又は獣医学従事者によって決定され得る。
従って、好ましい実施態様において、本発明は、癌細胞においてｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性を阻害するのに十分な、本発明の薬剤の量及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。
当業者には当然のことながら、該薬剤又はその製剤の当該有効量は単回ボーラス投与量（即ち急性投与）で、又はより好ましくは、一連の長期にわたる投与量（即ち慢性投与）で送達することができる。
本発明の薬剤は、使用する化合物の有効性／毒性及びそれが使用される適応症に応じて、種々の濃度で製剤化することができる。好ましくは、該製剤は、０.１μＭと１ｍＭの間、更に好ましくは１μＭと１００μＭの間、５μＭと５０μＭの間、１０μＭと５０μＭの間、２０μＭと４０μＭの間、及び最も好ましくは約３０μＭの濃度で本発明の薬剤を含む。インビトロ適用では、製剤は、低濃度の本発明の化合物を、例えば０.００２５μＭと１μＭの間で含む。
当業者には当然のことながら、本発明の薬剤は、一般的に所望の投与経路及び標準薬務に関して選択される適切な医薬品賦形剤、希釈剤又は担体と混合して投与される（例えば、 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USAを参照）。
例えば、本発明の薬剤は、錠剤、カプセル剤、膣坐剤、エリキシル剤、液剤又は懸濁剤の形態で、経口、口腔内又は舌下にて投与でき、それらは即時−、遅延−又は徐放適用のために香味剤又は着色剤を含有することができる。本発明の該薬剤は、静脈内注射により投与することもできる。
当該錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム及びグリシンなどの賦形剤、澱粉（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカ澱粉）、グリコール酸澱粉ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び特定の複合珪酸塩などの崩壊剤、及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＭＰＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、蔗糖、ゼラチン及びアカシアなどの造粒結合剤を含有してもよい。
更に、ステアリン酸マグネシウム、ステリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルクなどの滑沢剤が含まれてもよい。
類似型の固体組成物も、ゼラチンカプセルのフィラーとして用いてもよい。この関連での好ましい賦形剤としては、ラクトース、澱粉、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液及び／又はエリキシルでは、本発明の化合物は、種々の甘味剤又は着香料、着色料又は色素と、乳化剤及び／又は懸濁化剤と、ならびに水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリンなどの希釈剤と組み合わせてもよく、そしてそれらの組合せでもよい。
本発明の該薬剤は、例えば、静脈内、関節内、動脈内、腹腔内、髄膜内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内又は皮下など非経口投与することもでき、又は輸注法によって投与することもできる。それらは、他の物質、例えば、血液と等張の溶液を作製するために十分な塩又はグルコースを含有する、滅菌水溶液の形態での使用に最も適している。水溶液は、必要に応じて、適切に緩衝化（好ましくはｐＨ３から９まで）される。滅菌状態での適切な非経口製剤の製造は、当業者に周知の標準的製剤技術によって容易に達成される。
非経口投与に適切な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び予定のレシピエントの血液と等張な処方にする溶質を含有してもよい、水性及び非水性無菌注射液；並びに懸濁化剤及び増粘剤を含んでもよい、水性及び非水性無菌懸濁剤が挙げられる。該製剤は、単回量又は多回服用量容器、例えば密封アンプル及びバイアルで提供されてよく、そして滅菌液体担体、例えば注射用水の使用直前の添加のみが必要な凍結乾燥(lyophilised)条件で保存してもよい。即製の注射液及び懸濁液は、前述の種類の無菌粉末剤、顆粒剤及び錠剤から調製しても良い。
ヒト患者に対する経口及び非経口的投与では、本発明の薬剤の１日量レベルは、通常１から１０００ｍｇ／成人まで(即ち、約０.０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ)であり、単回又は分割投与される。
本発明の薬剤は、経鼻又は吸入投与も可能であり、そして加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーから、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン（例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３）又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３））、二酸化炭素又は他の適切なガスの使用により、ドライパウダー吸入器又はエアロゾルスプレープレゼンテーションの形態で適宜送達される。加圧エアロゾルの場合には、投与単位は一定量を送達するバルブを付けて定量することもできる。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーは、当該活性化合物の溶液又は懸濁液を、例えば溶媒としてエタノールと噴霧剤の混合物を用いて含有することができ、更に滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンを含有してもよい。インへラー又はインサフレーターで用いるカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチン製）は、本発明の化合物及びラクトース又は澱粉などの適切な粉末基剤の粉体混合体を含有して製剤化することができる。
エアロゾル又はドライパウダー製剤は、各計量又は「１吸入」が患者に送達するために少なくとも１ｍｇの本発明の化合物を含有するように、適切に調整される。当然のことながら、エアロゾルによる全１日量は患者毎に変動し、そして単回量又はより多い頻度で、１日を通して分割投与される。
代わりに、本発明の薬剤は、坐剤又はペッサリーの形態で投与することができ、又はローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏又は散布剤の形態で局所塗布してもよい。本発明の化合物は、例えば、皮膚用パッチ剤の使用により経皮的に投与してもよい。それらは眼経路によっても投与可能である。
眼科用としては、本発明の薬剤は、等張、ｐＨ調整、無菌生理食塩水での微粉化懸濁液として、又は、好ましくは、等張、ｐＨ調整、無菌生理食塩水での溶液として、場合により、塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤との組合せで、製剤化することができる。代わりに、それらはワセリンなどの軟膏剤に製剤化してもよい。
皮膚への局所塗布用には、本発明の該薬剤は、例えば、以下の：鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水、の１つ又はそれ以上との混合物に懸濁又は溶解した活性化合物を含有する適切な軟膏剤として、製剤化することができる。代わりに、それらは、例えば、以下の：鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水、の１つ又はそれ以上との混合物に懸濁又は溶解した適切なローション剤又はクリーム剤として、製剤化することができる。
口腔内の局所適用に適切な製剤としては、フレーバー基剤、通常蔗糖及びアカシア又はトラガカント中に有効成分を含むトローチ剤；ゼラチン及びグリセリン、又は蔗糖及びアカシアなどの不活性基剤に有効成分を含む芳香錠、及び適切な液体担体に有効成分を含むうがい薬、が挙げられる。
該薬剤がポリペプチドの場合、ミクロスフェアなどの持続放出ドラッグ送達システムを使用することが好ましい。これらは、特に注射の頻度を減らすために設計される。当該システムの例は、注射後に持続期間にわたってｒｈＧＨを緩徐に放出する、生分解性ミクロスフェア中に組換ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）をカプセル化したNutropin Depotである。
代わりに、本発明のポリペプチド薬剤は、所要の部位に該薬剤を直接放出する外科的埋め込み装置によって投与することができる。
エレクトロポレーション治療（ＥＰＴ）システムは、タンパク質及びポリペプチドの投与用に用いることもできる。パルス電場を細胞に送る装置は細胞膜に対する薬物の透過性を増加させ、細胞内薬物送達の著明な増強をもたらす。
タンパク質及びポリペプチドは、エレクトロインコーポレーション（ＥＩ）によって送達することもできる。ＥＩは、皮膚表面上で３０μ径までの小粒子が、エレクトロポレーションで使用されるものと同一又は類似の電気パルスを受けた場合に起こる。ＥＩにおいて、これらの粒子は、角質層を介して皮膚の深部層に導かれる。該粒子は、薬物又は遺伝子で負荷され若しくは被覆され、又は薬物が侵入する皮膚に細孔を作り出す「弾丸」として簡易に作用することができる。
タンパク質及びポリペプチド送達の別法は、感熱性ReGel注射剤である。体温より低温ではReGelは注射可能な液体であるが、体温では直ちにゲル貯水池を形成し、これは緩やかに浸食され、そして公知の安全な生分解性ポリマーに溶解する。該活性薬物は、バイオポリマーが溶解している時間にわたって送達される。
タンパク質及びポリペプチド薬剤は、経口でも送達することができる。１つの当該システムは、タンパク質及びポリペプチドを同時輸送するために、体内でビタミンＢ１２を経口で取込む自然過程を用いる。ビタミンＢ１２取込みシステムに乗ることによって、該タンパク質及びポリペプチドは腸壁を介して移動することができる。ビタミンＢ１２アナログと該薬物間に、該複合体のビタミンＢ１２部分の内因子（ＩＦ）に対する顕著な親和性及び該複合体の薬物部分の顕著な生物活性の両方を保持する複合体が形成される。
本発明のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド薬剤を投与する方法も、業界で周知である (Dass, 2002, J Pharm Pharmacol. 54(1): 3-27; Dass, 2001, Drug Deliv. 8(4): 191-213; Lebedeva et al., 2000, Eur J Pharm Biopharm. 50(1): 101-19; Pierce et al., 2005, Mini Rev Med Chem. 5(1): 41-55; Lysik & Wu-Pong, 2003, J Pharm Sci. 2003 2(8): 1559-73; Dass, 2004, Biotechnol Appl Biochem. 40(Pt 2): 113-22; Medina, 2004, Curr Pharm Des. 10(24): 2981-9を参照)。
例えば、本発明の構築物は、該構築物が細胞のゲノムに挿入できるように、レトロウイルスを関与させる方法によって細胞内に導入可能である。例えば、Kuriyama et al (1991) Cell Struc. and Func. 16, 503-510では、精製レトロウイルスが投与される。上記のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスＤＮＡ構築物は、業界で周知の方法を用いて作製することができる。かかる構築物から活性レトロウイルスを産生するためには、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するDulbecco変法Eagle培地（ＤＭＥＭ）で増殖する、エコトロピックｐｓｉ２パッケージング細胞系を使用することが通例である。該細胞系のトランスフェクションは、適切なリン酸カルシウム共沈法よるものであり、そして安定な形質転換体が、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌ（レトロウイルス構築物がneo(登録商標)遺伝子を含有すると仮定して）の最終濃度で添加することによって選択される。単独コロニーを分離して拡大し、そして培養上清を除去し、更に０.４５μｍ細孔径フィルターを介して濾過して−７０℃で保存する。レトロウイルスの腫瘍細胞への導入には、１０μｇ／ｍｌのPolybreneを添加したレトロウイルス上清を直接注入するのが便利である。１０ｍｍ径を超える腫瘍では、０.１ｍｌから１ｍｌの間のレトロウイルス上清；好ましくは０.５ｍｌを注入するのが妥当である。
代わりに、Culver et al (1992) Science 256, 1550-1552に記載のように、レトロウイルスを産生する細胞が注入される。このように導入されたレトロウイルス産生細胞は、ベクターの連続産生がその場（in situ）で腫瘍の腫瘤内で起こるように、レトロウイルスベクター粒子を活発に産生するために処理される。このように、増殖性細胞は、レトロウイルスベクター産生細胞と混合すれば、インビボで形質導入が奏功し得る。
標的レトロウイルスも、本発明での使用に利用することができる；例えば、特異的結合親和性を有する配列は、先在ウイルスenv遺伝子中に工学的操作をすることができる (Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199 for a review of this and other targeted vectors for gene therapyを参照)。
他の方法は、該構築物を細胞内へ単純に送達し、限られた時間そこで発現させるか、又はそれに続いてゲノムへの組み込みを行いより長時間発現させるかを包含する。後者のアプローチの例は、リポソームを含む (Nassander et al (1992) Cancer Res. 52, 646-653)。
免疫リポソームの製造としては、ＭＰＢＰＥ−ＰＥ（Ｎ−[４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル]−ホスファチジルエタノールアミン）が、Martin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257, 286-288の方法によって合成される。ＭＰＢＰＥ−ＰＥをリポソーム二分子膜に取り込み、リポソーム表面上に抗体又はそのフラグメントを共有結合させる。該リポソームは、標的細胞へ送達するために、例えば、該薬剤の溶液中に前記リポソームを形成し、続いて０.８ＭＰａまでの窒素圧下０.６μｍ及び０.２μｍの細孔径のポリカーボネート薄膜フィルターを介して逐次押出しすることにより、都合よく本発明の薬剤（ＤＮＡ又は他の遺伝的構築物など）を負荷する。押出し後、封入したＤＮＡ構築物は、８００００×ｇで４５分間の超遠心分離により、遊離ＤＮＡ構築物から分離する。脱酸素緩衝液中で新たに製造したＭＰＢＰＥ−ＰＥ−リポソームを、新たに作製した抗体（又はそのフラグメント）と混合し、一定のエンドオーバーエンド回転下４℃において窒素雰囲気で一夜カップリング反応を行なう。免疫リポソームを、８００００×ｇで４５分間の超遠心分離により非結合抗体から分離する。免疫リポソームを腹腔内又は直接腫瘍に注射してもよい。
他の送達方法としては、抗体−ポリリジン架橋を介する外部ＤＮＡを運搬するアデノウイルス(Curiel Prog. Med. Virol. 40, 1-18を参照)、及び担体としてトランスフェリン−ポリカチオン複合体 (Wagner et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414) が挙げられる。これらの方法の最初には、ポリカチオン−抗体複合体が本発明のオリゴヌクレオチド薬剤により形成され、そこでは、該抗体は、その抗体を結合する新しいエピトープが導入される野生型アデノウイルスか又は変異型アデノウイルスに対して特異的である。ポリカチオン部分はホスフェート骨格と静電的相互作用を介してオリゴヌクレオチド薬剤を結合する。アデノウイルスは、変質していない線維及びペントンタンパク質を含有することから、細胞中へインターナリゼーションされ、それにより本発明のオリゴヌクレオチド薬剤を細胞内に運び入れる。ポリカチオンはポリリジンであることが好ましい。
オリゴヌクレオチド薬剤は、例えば、下記のように、アデノウイルス粒子内に存在するアデノウイルスによって送達されてもよい。
別法では、細胞内にＤＮＡ高分子を運搬する受容体媒介エンドサイトーシスを使用する、高効率核酸送達システムが用いられる。これは、鉄輸送タンパク質トランスフェリンを、核酸を結合するポリカチオンに結合させることによって達成される。ヒトトランスフェリン若しくはニワトリのホモログコンアルブミン、又はその組合せが、小型ＤＮＡ結合タンパク質のプロタミン又は種々のサイズのポリリジンにジスルフィド結合を介して共有結合される。これらの修飾トランスフェリン分子は、それらの同族受容体を結合し、また細胞内への効率的な鉄輸送を媒介する能力を維持する。該トランスフェリン−ポリカチオン分子は、本発明のＤＮＡ構築物又は遺伝的構築物と、核酸サイズに無関係に電気泳動的に安定な複合体を形成する（短オリゴヌクレオチドから２１キロ塩基対のＤＮＡまで）。トランスフェリン−ポリカチオンと本発明のＤＮＡ構築物又は他の遺伝的構築物との複合体が腫瘍細胞に供給される場合、細胞中の該構築物からの高レベルの発現が期待される。
Cotten et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6094-6098の方法により産生される欠損又は化学的不活性化アデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を用いた、本発明のＤＮＡ構築物又は他の遺伝的構築物の高効率受容体媒介送達を使用してもよい。この方法は、アデノウイルスがリソソームを通過せずにエンドソームからそれらのＤＮＡを放出するのに適しており、そして、例えば、本発明のＤＮＡ構築物又は他の遺伝的構築物に結合したトランスフェリンの存在下に、該構築物がアデノウイルス粒子として同じ経路により細胞に取り込まれる、という事実に基づいている。
この方法は、複雑なレトロウイルス構築物を使用する必要がない；レトロウイルス感染で起こるゲノムの永続的修飾がない；そして標的発現系が標的送達系と連動して、他の細胞型への毒性を低減する、という利点を有する。
当然のことながら、「裸のＤＮＡ」並びにカチオン性及び中性脂質と複合体化したＤＮＡは、本発明のＤＮＡを治療した個体の細胞に導入するのにも有用である。遺伝子治療に対する非ウイルス法は、Ledley (1995) Human Gene Therapy 6, 1129-1144に記載されている。
代わりの標的化導入システムも、通常、該ＤＮＡがアデノウイルス、又はアデノウイルス様粒子内に運ばれる、ＷＯ９４／１０３２３に記載の修飾アデノウイルス系などとして知られている。Michael et al., (1995), Gene Therapy 2, 660-668は、細胞選択的部分を線維タンパク質に加えるアデノウイルスの修飾を記載している。Bischoff et al., (1996), Science 274, 373-376に記載されているもののような、ｐ５３欠損ヒト腫瘍細胞中に選択的に複製する変異型アデノウイルスも、本発明の遺伝的構築物を細胞に送達するのに有用である。従って、当然のことながら、本発明の更なる態様は、本発明の遺伝的構築物を含むウイルス又はウイルス様粒子を提供する。他の適切なウイルス又はウイルス様粒子としては、ＨＳＶ、ＡＡＶ、ワクシニア及びパルボウイルスが挙げられる。
更なる実施態様において、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の機能を選択的に阻害する該薬剤は、標的化ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡ又はＤＮＡの切断が可能なリボザイムである。遺伝子発現する前記のリボザイムは、アンチセンス分子に対するのと実質的に同じで、また実質的に同じ賦形剤を用いて投与してよい。
本明細書に開示されたウイルス又はウイルス様粒子のゲノムにコードされると考えられるリボザイムは、米国特許第５,１８０,８１８号、米国特許第５,１６８,０５３号、米国特許第５,１４９,７９６号、 米国特許第５,１１６,７４２号、米国特許第５,０９３,２
４６号及び米国特許第４,９８７,０７１号に記載されている。
当然のことながら、アンチセンス分子又はリボザイムは、細胞特異的プロモーター要素から発現されることが望ましい。
本発明の製剤の特に好ましい実施態様において、該製剤は、癌細胞へ本発明の薬剤を標的化送達することができる。
当業者には更に当然のことながら、本発明の薬剤及び医薬製剤は、医学及び獣医学分野の両分野において有用性を有する。従って、本発明の薬剤は、ヒト及びヒト以外の動物（ウマ、イヌ及びネコなど）の両方の治療に使用することができる。しかしながら、好ましくは、該患者はヒトである。
本発明の第３の態様は、患者において癌細胞の転移を阻害する方法、即ち本発明の第１の態様の薬剤、又は本発明の第２の態様の医薬製剤を患者に投与することを含む方法を提供する。
好ましくは、該患者はヒトである。
該薬剤は、癌細胞に選択的に送達されるか又は癌細胞によって選択的に活性化されることが有利である。
このように、本発明は、医療用として本発明の第１の態様に記載の薬剤を更に提供する。
好ましくは、該薬剤は癌の治療用である。
「治療」には、患者の治療及び予防的処置の両方が含まれる。「予防的」なる用語は、患者又は被験者における癌、及び特に転移癌の可能性を防止するか又は低減する、本明細書に記載のポリペプチド又は製剤の使用を包含するために使用される。
上記のように、「有効量」なる用語は、治療した疾患又は状態の好ましい変化をもたらすために使用し得る、本発明の化合物の濃度又は量を記述するために本明細書に使用されるものであり、その変化とは、治療した疾患又は状態に応じた、寛解、好ましい生理学的結果、治療した病態又は病状の反転又は減弱、状況又は病態惹起の可能性の防止又は低減である。本発明の薬剤を併用で使用する場合、各薬剤は有効量で使用できるが、有効量は相乗的量を含む。
本発明の尚更なる態様は、癌脂肪の転移を阻害する薬剤の製造において、本発明の第１の態様に記載の薬剤を提供する。
該癌細胞(癌腫細胞)は上皮細胞であることが有利である。代わりに、該癌細胞は扁平上皮細胞であってもよい。
該癌細胞は、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器官、肺と気道、皮膚、胆嚢、肝臓、鼻咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺及び胃腸管の癌細胞から成る群から選択されることが好都合である。
好ましくは、該癌細胞は乳癌細胞である。より好ましくは、該乳癌細胞はElstonグレードＩＩＩ細胞である。最も好ましくは、該乳癌細胞は転移性である。
本発明の好ましい態様を、以下の非限定的な実施例の中で、以下の図面に準拠して説明する：
図１
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌に高度に発現する。
（ａ）腺管乳癌グレードＩＩＩの切片（患者番号７、表２）は、間質島（ｓｔ）周囲の腫瘍細胞において、ｈＣＡＰ１８タンパク質に対して強い免疫反応性（赤沈降）を呈する。（ｂ）その場（in situ）ハイブリダイゼーションは、同じ組織の切片において、ｈＣＡＰ１８ｍＲＮＡにマッチングするシグナルを示す。強いオートラジオグラフィーシグナルが暗視野照明下に白粒として現われる。（ｃ）癌細胞の高出力観察は、免疫反応性を欠く腫瘍細胞に隣接した免疫反応性細胞を強く示す。（ｄ）血管内のｈＣＡＰ１８免疫反応性乳癌細胞。（ｅ）カテリン組換ペプチドによる免疫吸着は、ｈＣＡＰ１８免疫反応性を完全に停止させた（図１ａと同じ組織）。（ｆ）免疫吸着時の陽性対照としてのｈＣＡＰ１８に対する均一な免疫染色（図１ａと同じ組織）。（ｇ）正常乳腺上皮は、ｈＣＡＰ１８に対して弱い免疫反応性を示す。顕微鏡写真（ａ、ｃ〜ｇ）は、１：５００希釈においてｈＣＡＰ１８抗体で得られた結果を示す。スケールバー（ａ、ｂ）＝１００μｍ；（ｃ、ｄ）＝２５μｍ；（ｅ、ｆ、ｇ）＝１０μｍ。
図２
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌で免疫ブロット法により検出される。
患者の臨床データを表２に示す（試料１〜１０）。組換カテリン（Ｃ）及びＬＬ−３７ペプチド（Ｌ）をサイズ基準として使用した。正常乳房組織をレーン１に示す。ElstonグレードＩ腫瘍はレーン２，４及び５に示す。グレードＩＩ腫瘍はレーン３に、またグレードＩＩＩ腫瘍はレーン６〜１０に示す。全組織中に、無傷の非処理１８ｋＤａホロタンパク質に相当する免疫反応バンドが認められた。処理したＬＬ−３７ペプチド（４ｋＤ）は、５グレードＩＩＩ腫瘍のうち４つに認められた(番号７〜１０)。
図３
上皮細胞におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現は、細胞増殖を増加させる。
（ａ）上パネル、左レーン；抗ＬＬ−３７抗血清によるＨＥＫ２９３抽出物の免疫ブロット法。ビシストロンベクターｈＣＡＰ１８＋ＥＧＦＰ（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）によるトランスフェクト細胞は、ｈＣＡＰ１８タンパク質発現を示す。上パネル、右レーン；ＥＧＦＰ（Ｅ）のみでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞。下方パネル；ＨＥＫ２９３細胞（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）は、対照細胞（Ｅ）に比べて非常に高い増殖速度（フローサイトメトリーで評価）を示す。ポンソー染色をローディング対照として示す。（ｂ）上パネル、左レーン；（ａ）に記載のトランスフェクトＨａＣａＴ細胞。下方パネル；ｈＣＡＰ１８トランスフェクトＨａＣａＴ細胞は、対照細胞に比べて非常に高い増殖速度（３Ｈ−チミジン取り込みで評価）を示す。
図４
合成ＬＬ−３７ペプチドによる処置は、上皮細胞の細胞増殖を増加させる。
血清飢餓により７２時間同期化し、次いで１０μｇ／ｍｌの合成の生物活性ＬＬ−３７ペプチドで３６時間処理した（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴ中）ＨａＣａＴ細胞は、非処理(対照)ＨａＣａＴ細胞に比べて細胞増殖の顕著な増加を示す。増殖速度は[3Ｈ]−チミジン取り込みで評価した。
図５
ＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は、乳癌及び正常乳腺上皮に発現する。
（ａ）腫瘍細胞のＦＰＲＬ１受容体に対して顕著な免疫反応性を呈する（赤沈降）、腺管乳癌Elstonグレード２の切片（患者番号１２、表２）。（ｂ）腺管領域のＦＰＲＬ１に対して免疫反応性を呈する正常乳腺上皮の切片（赤沈降）。顕微鏡写真は、１：４００希釈においてＦＰＲＬ１抗血清で得られた結果を示す。スケールバー（ａ）＝５０μｍ；（ｂ）＝１０μｍ。（ｃ）免疫ブロット法は、ＬＬ−３７受容体、ＦＰＲＬ１が、正常（Ｎ）及び乳癌細胞（Ｔ）組織の両方に発現することを示した。（ｄ）ビシストロンベクターｈＣＡＰ１８＋ＥＧＦＰ（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）によりトランスフェクトしたＨａＣａＴは、リアルタイムＰＣＲによりＦＰＲＬ１受容体のｍＲＮＡ発現の顕著な増加を示す。ＨａＣａＴ細胞は、対照として機能するＥＧＦＰ（Ｅ）のみでトランスフェクトした。
図６
エストロゲン受容体（ＥＲ）及びリンパ節(Ｎ)陽性乳房腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現増加（対数目盛りで表示）。
ＲＮＡを１４０の乳房腫瘍及び４非罹患乳房組織試料から抽出し、プライマーとしてのランダムヘキサマーを用いて逆転写した。ｈＣＡＰ１８転写物の発現を、標準プロトコールにより１０ｎｇのｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲによって測定した。試料を１８Ｓ−ＲＮＡの定量化により正規化した。非罹患試料の平均発現を任意に１に設定した。平均と偏差は、分散分析統計によって評価する。
図７
ＬＬ−３７は、ＨＥＫ細胞（Ａ）及びＨａＣａＴ細胞（Ｂ）においてカンプトテシン誘導アポトーシスを阻害する。
Ａ. 半密集度細胞を２４時間異なる濃度のＬＬ−３７（１、２及び４μＭ）で処理した。培地単独で処理した細胞は、対照細胞として使用した（ａ）。次いで、該細胞を６μＭのカンプトテシンの不在下（ａ〜ｄ）又は存在下（ｅ〜ｈ）に２４時間更に培養した。回収した細胞を２色アポトーシス分析及びフローサイトメトリーにかけて、そして蛍光強度に合致する四分円解析によって、生存性（蛍光なしか少ない）、アポトーシス性（ＦＬ−１ ＹＯＰＲＯ色素に陽性）及び壊死性（ＦＬ−１及びＰＩ蛍光に陽性）に分類した。図は、各々３重複で行なった３つの独立した実験の代表例を示す。
Ｂ. アポトーシス細胞の定量分析。
図８
ＬＬ−３７によるＨＥＫｎ細胞の前処理がカンプトテシン誘導アポトーシスから保護するということを示す、ＨＥＫｎ細胞のフローサイトメトリー解析。
１又は２μＭのＬＬ−３７で２４時間処理した細胞（ｂ、ｃ、ｅ、ｆ）及び未処理細胞（ａ、ｄ）を、２４時間カンプトテシン処理（ｄ〜ｆ）によりアポトーシスを受けるように誘導した。次いで細胞をフローサイトメトリーによって解析し、非アポトーシス（２Ｎ〜４Ｎ）及びアポトーシス集団（サブ２Ｎ）を検出した。グラフは、各々３重複で行なった３つの実験の代表的結果である。
図９
ＬＬ−３７は、ＨＥＫｎ細胞におけるカスパーゼ−３のカンプトテシン活性化を低下させる。
該細胞をＬＬ−３７及びカンプトテシンの存在下又は不在下に培養し、次いで回収してＶＤＶＡＤ−ＡＭＣのインビトロ加水分解によりカスパーゼ−３活性を解析した。カンプトテシンとの２４時間の培養により誘導されたカスパーゼの活性化は、ＬＬ−３７による細胞の処理により低下した。数値は、各々３重複で行なった３つの異なる実験の平均である。
図１０
ＬＬ−３７処理はＩＡＰ２の発現を増加させる。
ＨＥＫｎ細胞を２μＭのＬＬ−３７で処理し、刺激後の異なる時点で回収した。これらの細胞由来のＲＮＡを逆転写し、ＩＡＰ−２の発現をリアルタイムＰＣＲによって測定した。各時点でのＩＡＰ−２の転写レベルを１８Ｓ−ＲＮＡに対して正規化し、そして未処理細胞と比較して示す（対照は各時点で１と設定した）。
図１１
ＬＬ−３７は、ＨＥＫ細胞におけるプロスタグランジン・エンドペルオキシド・シンターゼ−２（ＣＯＸ−２）発現を増加させる。
ＨＥＫｎ細胞を２μＭのＬＬ−３７で処理し、刺激後６、１２及び２４時間で回収した。未処理細胞を各時点の対照として使用した（ライトグレーカラム）。これらの細胞由来のＲＮＡを逆転写化し、対照に対するＣＯＸ−２の相対発現を上記のようにｑＰＣＲによって測定した。
図１２
ＣＯＸ−２阻害は、ＬＬ−３７で誘導したＩＡＰ−２の増加を抑制する。
ＨＥＫｎ細胞を特異的ＣＯＸ−２阻害剤ＳＣ−７９１（２５ｎＭ）の有り又は無しの条件下で処理し、更にＬＬ−３７（２μＭ）の有り又は無しの条件下で６時間インキュベートした。ＩＡＰ−２−ｍＲＮＡ遺伝子のレベルをＲＴ−ＰＣＲによって解析し、未処理対照試料と比較して表示する。
図１３
ＬＬ−３７は、ヘレグリンを介するＥＧＦＲシグナル伝達システムの活性化を賦活化する。
乳癌系ＺＲ７５−１の抽出物を、図のようにリン酸化タンパク質に対するウェスタンブロット分析によって解析した。
図１４
ウェスタンブロット分析によるＥＲＢＢ２リン酸化（Ｔｙｒ−１２４８）の定量化。
化学ルミネセンス・シグナルをポンソー染色に対して正規化した後、定量化した。
図１５
ＬＬ−３７は、ＥＧＦＲファミリーを介してＭＡＰＫを活性化する。
ＬＬ−３７はＥＧＦＲファミリーを介してＭＡＰＫを活性化し、その活性化はチロシンキナーゼ阻害剤ＰＤ１５３０３５によって完全にブロックできる。完全阻害に必要な濃度は２.５μＭであり、これはＥＧＦＲに要するよりも高いが、ＥＲＢＢ２の活性をブロックする必要がある。
図１６
ＬＬ−３７は、乳癌細胞の足場非依存性増殖の表現型変化を誘導する。
ＬＬ−３７の腫瘍形成能を、乳癌系ＺＲ７５−１を用いてコロニー形成検定法で調べた。低血清濃度で、ＬＬ−３７はそのままでコロニーの数を減少させたが、ＬＬ−３７とヘレグリンの組合せはコロニーの数を増加させた(図Ａ参照)。より劇的なのは表現型の変化であった。ＬＬ−３７の存在下、コロニーのコンパックト構造が破壊され、単数細胞サテライトが現れた(図Ｂ参照)。ヘレグリンはコロニーの密度を回復させたが、しかし、ＬＬ−３７が存在した場合、単数細胞のエスケープを禁止しなかった。
図１７
ｈＣＡＰ１８の発現ベクターの構築。
ｈＣＡＰ１８の発現ベクターの構築のために、５′−非翻訳領域の１６ｂｐを含む全コード配列を含有するイメージクローン３０５７９３１−１９のＢｆａ１フラグメントが、ビシストロンベクターｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰのＳｍａｌ部位にサブクローニングされた(BD Biosciences, Bedford, MA)。
図１８
インビボでの二次性腫瘍の形成
（Ａ）親ＭＣＦ７を注射したＳＣＩＤマウスにおける原発腫瘍。
（Ｂ）多発転移によるＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーンを注射したＳＣＩＤマウス。
（Ｃ）ｈＣＡＰ１８でトランスフェクトしそれを過剰発現する乳癌細胞を注射した、ＳＣＩＤマウスから回収したトランスフェクト腹水細胞におけるＬＬ−３７の発現。ＭＣＦ７腹水細胞におけるｈＣＡＰ１８の活性転写（上図）が、マーカー、緑色発光タンパク質の共発現により確認された（下図）。
図１９
ｓｉＲＮＡによる腫瘍中のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質発現の阻害。
ｈＣＡＰ１８ｍＲＮＡに特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による用量依存性の強い阻害は、既にＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーン細胞の処理の４８時間後に既に見られたか、さもなければｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質を過剰発現していた（実施例Ｇにおける、ＭＣＦ７派生細胞におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現のセクションのＭ＆Ｍを参照）。ＨＰＬＣ精製した二重の容易に使用できるネガティブコントロールのｓｉＲＮＡおよび４つのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７特異的ｓｉＲＮＡは、最適化トランスフェクション効率と再現性のためのｓｉＰＯＲＴ ＮｅｏＦＸトランスフェクション剤を含めて、(Ambion, Austin, USA)から購入した。
４つのｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰ（ｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰ１−４；実施例Ｈに記載）を全て、非特定的効果を最小化するためにカクテルとしてプール化し、同様にネガティブｓｉＲＮＡ−対照とした。トランスフェクション最適化の指示は、ｓｉＰＯＲＴトランスフェクション剤に添付された詳細プロトコールにて与えられている。実験操作は全てメーカーの説明書に準じて行なわれた。ｓｉＲＮＡの最終濃度は、１０ｎＭ、２５ｎＭ又は１００ｎＭであった。処理した乳癌細胞の細胞抽出物は、Ｍ＆Ｍ、実施例Ｃに記載のように、１／２,０００希釈でｈＣＡＰ１８に対する抗体を用いて、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質のウェスタンブロットで解析した。増強した化学ルミネセンス（ＥＣＬ）シグナル(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) は、ＣＣＤカメラ(Fujifilm, Tokyo, Japan) で捕捉され、ポンソー染色に対して正規化した後に定量化した。
図２０
ヒト抗微生物タンパク質ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は、ｈＣＡＰ１８特異的ｓｉＲＮＡによって反転できる乳癌の転移性表現型を誘導する。
（Ａ）乳癌細胞中のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の過剰発現は、癌細胞において多くの転移性表現型を導く。
Matrigel 浸潤アッセイを実施し、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７非発現ＭＣＦ７−ＩＲＥＳトランスジーン対照細胞に比べて、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質を過剰発現するＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーン細胞の転移能を評価した。（実施例Ｇにおける、ＭＣＦ７派生細胞中のｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現のＭ＆Ｍを参照）。
BioCoat Matrigel Invasion Chamber キット(Becton Dickinson Bioscience, Bedford,
MA, USA)は、全てメーカー説明書に準じて使用した。細胞のMatrigelフィルターへの移動前に、細胞をＦＣＳなしでＤＭＥＭ(Gibco-BRL)中で２４時間飢餓させた。細胞を使用した日にそれらを０.２５％Tryp−ＥＤＴＡ(Invitrogen, cat# 25200-056)でトリプシン処理し、５０μｌのトリプシン阻害剤及び１００μｌのＤＭＥＭを添加することによって停止させた。２２０,０００細胞／ｍｌの細胞懸濁液のうち２００μｌを、Matrigelでコーティングしたフィルター付きのトランスウェル・インサート・チャンバーに播種し、そして５％ＦＣＳ含有の７５０μｌのＤＭＥＭで満たした下位チャンバーに置いた。チャンバーを５％ＣＯ2雰囲気下３７℃で４８時間インキュベートした。その後挿入物を除去し、フィルターの上部に残った非浸潤癌細胞を削り落とした。フィルターの下部に浸潤していた細胞を染色し、位相差顕微鏡下に観察し計数した。癌細胞の浸潤能は、フィルターの下部に浸潤した細胞の平均数として表現した。その試験は３重複で行なった。
（Ｂ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の阻害は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７特異的ｓｉＲＮＡによる処理で乳癌細胞中に浸潤性転移性表現型を誘導した。
発現した腫瘍の減少を介する癌細胞の転移能を阻害する能力を証明するために、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７ＲＮＡ干渉が用いられた。
ＲＮＡ干渉に対して、４つのｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰを全て、非特異作用を最小化するために１０ｎＭのカクテルとして同時使用し、そして同様にネガティブｓｉＲＮＡ対照とした。ｓｉＲＮＡ処理(図１９を参照)を、（Ａ）に記載のMatrigel 浸潤アッセイを行なう前に４０時間実施した。ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉は、浸潤腫瘍細胞の数の減少により癌細胞の転移能を阻害する明らかな能力を示した。（詳細は、実施例Ｃ、転写後阻害試験及び浸潤性の誘導セクションを参照）。
実施例
〔実施例Ａ〕
抗微生物タンパク質ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌に高度に発現し、上皮細胞に対する推定増殖因子となる。
イントロダクション
本実施例では、一連の乳癌におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現パターンを調べ、隣接間質ではなく腫瘍細胞でのｈＣＡＰ１８ｍＲＮＡ及びタンパク質の顕著なアップレギュレーションを実証する。興味深いことに、最大レベルのｈＣＡＰ１８タンパク質が最大の組織学的悪性度の腫瘍中に認められたが、一部の低悪性度の腫瘍中のｈＣＡＰ１８レベルは正常乳房組織に認められたものと同等であった。これらの結果は、明らかに抗微生物ペプチドで示された想定抗腫瘍効果と対比するものであるが、上皮修復及び血管新生におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の役割を示唆する最近の結果と一致するものである5,10。更に成長促進因子としてのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７を支持するものとして、ここでは上皮細胞の増殖が、合成の生物活性を有するＬＬ−３７ペプチドによる処理で、およびｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現の両方で顕著に強化されることを実証する。
材料及び方法
組織
２８名の乳癌患者の凍結腫瘍組織を、Department of Pathology, Danderyd Hospital, Stockholm, Swedenから取得した(表２)から得た。腫瘍は以下に設定されたガイドラインに基づきElston and Ellis Ｉ〜ＩＩＩに準じてスコアリングした13。サイクリンＡを増殖マーカーとして使用した(Nova-Castra Laboratories, Newcastle upon Tyne, UK)。エストロゲン受容体の状態を、常法で加工したパラフィン切片で評価した。乳房縮小術を受けた８名の乳癌患者及び２名の健常者由来の無関与乳房組織を対照とした。全試料は、同じ病理学者（Ｂ.Ｓ.）が検査して正常として分類された(表２)。書面により、インフォームドコンセントが全患者から得られた。本研究は地域倫理委員会によって承認された。
ｈＣＡＰ１８のその場（in situ）ハイブリダイゼーション
pBluescriptにサブクローニングされた４３５−ｂｐのｈＣＡＰ１８の完全長ｃＤＮＡを用いて、インビトロで[35Ｓ]−標識アンチセンス及びセンスプローブを転写し、そしてその場（in situ）ハイブリダイゼーションを試料０〜１７で基本的に既述8のように実施した(表２)。
免疫組織化学
免疫組織化学を試料０〜１７で実施した(表２)。組換ｈＣＡＰ１８14に対するカテリンアフィニティー精製ウサギ抗血清を、Vectastainキット(Vector Laboratories, Burlingame, USA)を用いる間接ペルオキシダーゼ法に従って既述10のように１：５００希釈で使用した。染色の特異性を確認するために、免疫吸着を既報10のように実施した。ＦＰＲＬ１受容体の検出のために、アフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体を、間接ペルオキシダーゼ法に従って１：４００希釈(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) で使用した。
タンパク質抽出及びウェスタンブロット分析
凍結腫瘍組織、１６〜６０ｍｇを、リジン緩衝液中で電気ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。腫瘍組織と細胞系のタンパク質を、標準プロトコール15によりＳＤＳ含有サンプル緩衝液で抽出した。そのタンパク質濃度を分光学的定量法により測定し、ＳＤＳ含有試料緩衝液で等量タンパク質濃度16に調整した。ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の検出のために、抽出物を１６.５％のTris-Tricine Ready ゲル (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)で分離した。組換カテリン17及び合成ＬＬ−３７ペプチドをサイズ基準として使用した。ＥＲＫ１／２及びＦＰＲＬ１の検出のために、タンパク質をそれぞれ１２％及び８％のTris-Tricine ゲルで分離した。各試料中のタンパク質の殆ど等量がブロットされたことを確認するために、一次抗体でインキュベートする前に、フィルターを３％ＴＣＡ中で３％ポンソーＳ溶液(Sigma Aldrich, USA)で可逆的に染色した。アフィニティー精製抗カテリン抗血清17、アフィニティー精製抗ＬＬ−３７抗血清10、抗ＦＰＲＬ１抗血清(sc18191, Santa Cruz Biotechnology, CA)及びモノクローナル抗ＥＲＫ１／２抗体(Cell Signaling Technology, Beverly MA) を、全て１：１,０００希釈で使用した。ニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)での電気ブロッティング後、並びに一次抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＩｇＧ(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)で逐次インキュベーション後、強調化学ルミネセンス(ECL, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) からのシグナルを、ＣＣＤカメラ(LAS 1000, Fujifilm, Tokyo, Japan)で捉えた。
ＥＬＩＳＡ
既述17のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、正常乳腺及び腫瘍組織由来の抽出タンパク質中のｈＣＡＰ１８を定量化した。
リアルタイムＰＣＲによるｈＣＡＰ１８の発現解析
正常試料及び４腫瘍のＲＮＡをQiagen RNeasy キット(Operon Biotechnologies, Cologne, Germany)で抽出し、一本鎖合成キット(Amersham Biosciences, Norwalk, CT)で逆転写した。標準プロトコールに従って１０ｎｇのｃＤＮＡを用いて、ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)でリアルタイムＰＣＲによりＲＮＡを定量化した。試料は３重複で評価した。配列は、プライマーでは５′−ＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡ−３′[配列番号２]及び５′−ＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＣＡＴＡ−３′[配列番号３]、並びに蛍光発生プローブでは６−ＦＡＭ−５′−ＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴ−３′−ＢＨＱ１[配列番号４]であった。該試料は、１８Ｓ−ＲＮＡ(Assay on Demand, Applied Biosystems)の定量によって正規化した。正常試料の平均発現は、任意に１にセットした。
合成ＬＬ−３７ペプチド
ＬＬ−３７ペプチドは合成して、ＨＰＬＣにより９８％の純度まで精製した(PolyPeptide Laboratories A/S, Hilleroed, Denmark)。該ペプチドの生物活性は抗細菌試験18によって確認した。
上皮細胞のＬＬ−３７ペプチド処理
自然に不死化したヒトケラチン細胞系（ＨａＣａＴ）19を、１０％ＦＣＳ(ウシ胎仔血清, Hy-Clone, Boule Nordic AB Huddinge, Sweden)及び抗体 (PEST＝ペニシリン50 U／l 及びストレプトマイシン 50mg／ml, Gibco BRL)を補足したＤＭＥＭ(Dulbecco変法Eagle培地, Gibco BRL, Life Technologies, Scotland) で培養した。細胞を７０％密集度で回収し、９６ウェルプレート、１００μｌ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ及びＰＥＳＴ）中２,０００細胞で播種した。１２時間後、培地を無血清培地（ＤＭＥＭ＋ＰＥＳＴ）に交換し、細胞を７２時間血清飢餓によりＧ０／Ｇ１に同期化し、次いで１０μｇ／ｍｌの合成生物活性ＬＬ−３７ペプチドを含有する１００μｌの培地（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴ）で処理した。ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ及びＰＥＳＴだけで処理した細胞を対照として用いた。この実験を４重複で行なった。細胞増殖は[3Ｈ]−チミジン取り込みによって評価した。細胞を１μＣｉ／ウェルの[3Ｈ]−チミジン（２０.００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Perkin Elmer Life Sciences Inc. Boston, MA）で１２時間にわたって処理し、ガラス繊維フィルター(Wallac Oy Turku, Finland)上で回収した(Harvester 96, Tomtec, Orage, CT)。[3Ｈ]−チミジンの取り込みは、液体シンチレーションカウンター(Microbeta Pluss, Wallac Sveriges AB)を用いて測定した。この実験は６重複で２回繰り返した。
ＨＥＫ２９３及びＨａＣａＴ細胞におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現
１６ｂｐの５′−非翻訳領域を含む全コード配列を含有するイメージクローン３０５７９３１20のＢｆａ１フラグメントを、ビシストロンベクターｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ (BD Biosciences, Bedford, MA)のＳｍａ１部位にサブクローニングした。ＨＥＫ２９３及びＨａＣａＴ細胞をFugene (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)を用いて標準条件下でトランスフェクトし、４００ｎｇ／ｍｌのＧ４１８ (Invitrogen, Paisley, UK)で２週間セレクトした。データ解析のためにSummit(登録商標)ソフトウェアを用いてMoFlo(登録商標)高速セルソーティング・フローサイトメーター(DakoCytomation, Fort Collins, CO) により、ソフトウェア細胞をＥＧＦＰ発現でソーティングし、そしてＣＡＰ１８のそれらの発現を免疫ブロット法により定量化した。対照細胞系は、ＥＧＦＰだけを発現するベクターによるトランスフェクションで同様に樹立した。該細胞系は、いずれの選択もなしに、継続培養の数か月にわたってＣＡＰ１８の安定な発現を維持した。この実験は３０重複で２回繰り返した。
ｈＣＡＰ１８で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３及びＨａＣａＴ細胞の増殖分析 ｈＣＡＰ１８でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を７０％密集度で回収し、２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を交換して、細胞を５％ＦＣＳ及びＰＥＳＴを補足した２ｍｌの培地(Optimem, Gibco BRL, Life Technologies, Scotland)で培養した。細胞を６日目に回収して、フローサイトメトリー（(Becton Dickinson, Bedford, MA)によりカウントした。細胞の生存をTrypan Blueで測定した；全ての条件下において５％未満の細胞がTrypan Blue陽性であった。全条件を３重複で行なった。ＥＧＦＰだけを発現するベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を対照として使用した。
ｈＣＡＰ１８でトランスフェクトしたＨａＣａＴ細胞を７０％密集度で回収し、１０％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴのＤＭＥＭ中９６ウェルプレートにおいて、ウェル当り２,０００細胞を播種した。培地は、５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴを補足したＤＭＥＭに１２時間後に交換した。培養２４時間後、細胞を１μＣｉ／ウェルの[3Ｈ]−チミジンで１２時間処理して回収し、更に上記のように解析した。ＥＧＦＰだけを発現するベクターでトランスフェクトしたＨａＣａＴ細胞を対照とした。
ＦＰＲＬ１の発現解析
ＨａＣａＴ細胞のＲＮＡを、RNeasy キット(Qiagen)で抽出し、一本鎖合成キット(Amersham-Pharmacia)で逆転写した。ＦＰＲＬ１−ＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで定量化し、１８Ｓ−ＲＮＡで上記のように正規化した。配列は、プライマーでは５′−ＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＴＣＴＧＣ−３′[配列番号２]及び５′−ＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧ−３′[配列番号３]、並びに蛍光発生プローブでは６−ＦＡＭ−５′−ＣＣＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡ−３′−ＢＨＱ１[配列番号４]であった。
百日咳毒素測定
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７によって誘導された上皮細胞増殖の促進を媒介する場合におけるＦＰＲＬ１の関与を評価するために、ＨａＣａＴ細胞をＧタンパク質共役受容体阻害百日咳毒素で処理した。細胞を２０ｎｇ／ｍｌの最終毒素濃度の百日咳毒素(Sigma-Aldrich, Switzerland)で、ＬＬ−３７処理の２４時間前にプレインキュベートした。培地を細胞播種の４８時間後に交換し、ＨａＣａＴ細胞をそれぞれ５又は１０μｇ／ｍｌの合成生物活性ＬＬ−３７ペプチドを含有する１００μｌの培地（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ及びＰＥＳＴ）で処理した。ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ及びＰＥＳＴだけで処理した細胞を対照とした。
ＬＬ−３７処理したＨａＣａＴ細胞中のリン酸化ＥＲＫ１／２の分析
ＨａＣａＴ細胞を１０％密集度で播種し、０.２％ＦＣＳのＤＭＥＭ中で３６時間保持した。次の４８時間、細胞をそれぞれ１％又は５％ＦＣＳのＤＭＥＭにて培養し、そして１０μｇ／ｍｌのＬＬ−３７の存在下又は不在下に毎日培地を交換して培養した。１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを陽性対照として使用した。リン酸化ＥＲＫ１／２の発現を、マウスモノクローナル抗体(Cell Signaling Technology, Beverly MA)でウェスタンブロット分析により評価した。
統計解析
数値は、細胞の平均数又は分当りのカウント（ＣＰＭ）プラス若しくはマイナスＳＤとして表示する。群間の比較は両側ｔ−検定によって解析した。結果はＰ値＜０.０５で統計的有意と見なした。腫瘍内発現の解析では、片側ｔ−検定はｈＣＡＰ１８タンパク質レベルに対して有意水準＜０.０５で行なわれた。
結果
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌に発現する
患者の詳細を表２に示す。
その場（in situ）ハイブリダイゼーションにより、健常対照（図１ｇ）及び非関与乳癌(図示せず)の乳房組織において、ｈＣＡＰ１８ｍＲＮＡの低シグナル（図示せず）及びｈＣＡＰ１８タンパク質の弱い免疫反応性が見られた。全ての乳癌組織は、腫瘍細胞においてｈＣＡＰ１８と免疫反応性を示し、間質にはなかった（図１ａ、ｃ、ｄ）。腫瘍細胞集団はｈＣＡＰ１８免疫反応性について均一ではなく、検出可能なｈＣＡＰ１８を欠いた細胞に隣接して強い陽性細胞が認められた（図１ｃ）。カテリン組換タンパク質との免疫吸着は、ｈＣＡＰ１８免疫反応性を停止させた（図１ｅ、ｆ）。その場（in situ）ハイブリダイゼーションにより、ｈＣＡＰ１８ｍＲＮＡに対する陽性シグナルが、免疫組織化学で得られた発現パターンと密接にマッチする同じ領域に認められた（図１ｂ）。シグナル強度は変動し、高悪性度の腫瘍中で最も顕著であった。センスｈＣＡＰ１８ｃＲＮＡプローブでハイブリダイズした対照切片は、ｈＣＡＰ１８ｍＲＮＡに対する特異的シグナルを欠いていた（図示せず）。
ＥＬＩＳＡによる乳癌組織抽出物中のｈＣＡＰ１８タンパク質の定量化は、ElstonＩとＩＩグレードの腫瘍間で差がなかったが、最大悪性度の腫瘍では明らかに高いｈＣＡＰ１８レベルを示した(表２)。ElstonＩＩＩグレードと残存腫瘍間の差は統計的に有意であった（ｐ＜０.０１）。１３のグレードＩＩＩ腫瘍のうち１０は、５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質のｈＣＡＰ１８濃度に達したか又は超えていた。残りの１８腫瘍試料では２つの試料だけがこのレベルに達した。またElstonＩ又はＩＩ腫瘍と類似レベルを示した健常乳房組織の４標本を分析した。ＥＬＩＳＡによって得られた発現パターンを検証するために、４つの正常試料と４つの腫瘍試料についてリアルタイムＰＣＲを実施した。転写物定量の結果は、タンパク質発現のデータと一致した(表２)。
免疫ブロット法により、調べた全ての腫瘍と正常乳房組織は、無傷の非処理１８ｋＤａホロタンパク質に相当する免疫反応バンドを示した(図２)。調べた５つの試料のグレードＩＩＩ腫瘍のうち４つの試料において（表２、試料６〜１０）、ＬＬ−３７、処理ｈＣＡＰ１８タンパク質に相当するバンドを検出した(図２)。使用した抗血清はｈＣＡＰ１８ホロタンパク質に対して上昇し、カテリンペプチド10に対してアフィニティー精製されているにもかかわらず高濃度でＬＬ−３７を検出する。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は上皮細胞の増殖を増加させる
ｈＣＡＰ１８（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）発現ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３及びＨａＣａＴ細胞は、ＥＧＦＰ（Ｅ）だけを発現するベクターでトランスフェクトした対照細胞より有意に高い増殖速度を示した（図３Ａ及びＢ）。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３及びＨａＣａＴ細胞由来のタンパク質抽出物の免疫ブロット法により、これらのｈＣＡＰ１８ベクター含有細胞がホロタンパク質を産生し（図３Ａ及びＢ）、ＬＬ−３７に相当する４ｋＤの免疫反応性バンドが細胞培地中に検出されることを確認した(データ表示せず)。更に、５％ウシ胎仔血清で培養し、そして１０μｇ／ｍｌの合成生物活性ＬＬ−３７で処理したＨａＣａＴ細胞は、細胞増殖の著しい増加を示した(図４)。
Figure 2009535391
Figure 2009535391
ＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は乳癌に発現する
Ｇタンパク質共役受容体、ＦＰＲＬ１は、真核細胞4,5においてＬＬ−３７誘起効果を媒介することが示されており、そこで本セッティングにおけるその可能性を評価するために、乳房組織中のＦＰＲＬ１タンパク質の発現を検討し、その結果乳癌細胞及び正常腺上皮の両方において、ＦＰＲＬ１に対し強い免疫反応性を認めた（図５ａ、ｂ）。免疫ブロット法で、ＦＰＲＬ１が両組織において発現することを確認した（図５ｃ）。その上、ｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７シグナル伝達におけるＦＰＲＬ１の関与を更に支持すると考えられる、ＨａＣａＴ細胞中のＦＰＲＬ１−ｍＲＮＡの発現を顕著に増加させた（図５ｄ）。しかしながら、百日咳毒素によるＨａＣａＴ細胞の前処理は、これらの細胞の増殖を停止させず約５０％抑制した(図示せず)ことから、ＦＰＲＬ１がこれらの細胞においてｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の増殖促進効果の媒介に特別な関与をしていない可能性を示した。上皮細胞増殖の活性化におけるＥＲＫ１／２の関与の可能性を試験するために、合成生物活性ＬＬ−３７でＨａＣａＴ細胞を処理したが、ＥＲＫ１／２の顕著な活性化は認められなかったことから、ＥＧＦＲはＨａＣａＴ細胞増殖に対してＬＬ−３７の促進効果の媒介に関与しないことを示唆する。
考察
本研究では、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７が、構成的に正常乳腺上皮に産生することを実証する。これはヒトの抗微生物バリア保護におけるＬＬ−３７の役割と合致し、損傷及び炎症に関連して見られる顕著な発現と対照的に、ＬＬ−３７の低い構成的発現が正常な静止上皮で見出されたという過去の報告と一致する7-10。抗微生物ペプチドの構成的発現は、汗腺中のヒトカテリシジンＬＬ−３７、マウス唾液腺中のカテリシジンＣＲＡＭＰ及びヒト唾液腺中のβデフェンシン類などの、種々の外分泌腺に既に認められている21-23。乳腺中のヒトβデフェンシン−２（ｈＢＤ−２）ｍＲＮＡの発現は、１９９８年にBals et al.により報告され、また最近他のグループは非授乳女性の乳腺組織中、並びに授乳時の乳房組織及び母乳中に構成的ｈＢＤ−１の発現を見出した24-26。
興味深いことに、ｈＣＡＰ１８の産生は、正常乳腺上皮又は低悪性度の腫瘍に比べて、抗悪性度の腫瘍の乳腺上皮において最も顕著に増加していた。ｈＣＡＰ１８の発現は、しかしながら普遍的でも均一でもなく、即ち、全ての癌細胞がｈＣＡＰ１８に陽性ではなく、際立って陽性の細胞が検出可能なｈＣＡＰ１８−ｍＲＮＡ及びタンパク質を欠いた細胞に隣接して認められ(図１ｃ)、また発現の程度は、全ての腫瘍型の細胞中で著しく変動した。このことはｈＣＡＰ１８の複雑であるが厳密にコントロールされた調節を反映する可能性が、腎細胞癌におけるヒトαデフェンシンで示唆されている27。
本発明者らの研究では、最大のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７レベルが、最大の組織学的悪性度の腫瘍で認められた。一方においては、高悪性度腫瘍と低悪性度及び正常乳房組織間のｈＣＡＰ１８発現の差は統計的に有意であり、厳密な相関はない。全ての群内で健常試料のレベルでｈＣＡＰ１８を発現する腫瘍が認められ、またグレードＩ腫瘍の２つは、グレードＩＩＩ腫瘍中だけで別に観察された相対的に高い発現を示した。しかしながら、試料数の制限を考えると、本発明者らの観察結果は、悪性度の度合いとｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現間の相関可能性を示唆する。乳癌におけるｈＣＡＰ１８の過剰発現が、ｈＣＡＰ１８の調節に影響を及ぼす細胞内経路の不全に起因する可能性、及びｈＣＡＰ１８発現が腫瘍に対して増殖優位をもたらすよりもこれらの変動を反映するということには、議論の余地がある。しかしながら、ここで示されるインビトロ検討に加えて、該データは腫瘍増殖を促進するＬＬ−３７の潜在的役割を明確に示すものといえる。
高いｈＢＤ−２タンパク質濃度及びヒトα−及びβ−デフェンシン類の両方に対する顕著な免疫反応性は種々の口腔癌で見出され、またこれらの抗微生物ペプチドのレベル増加は感染及び／又はサイトカインによる刺激の結果である可能性が示唆された28-30。他の研究では、昆虫から単離された抗微生物ペプチド、例えば、メリチン及びセクロピン関連
ペプチドが哺乳動物腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果を発揮することを示した31-34。更に、ヒト膀胱癌細胞系におけるセクロピン及びメリチンのコード配列のベクター媒介導入及び発現が、ヌードマウスの腫瘍原性を抑制した11。同様に、ブタのカテリシジンＰＲ−３９のトランスジェニック発現は、ヒト肝細胞癌の浸潤能を低下させた12。
これらペプチドに対し癌における抗微生物ペプチドの多機能的役割は、益々明白になってきている。直接膜作用を介する病原体不活化に加えて、ＬＬ−３７は、ヒト好中球、単球、Ｔ細胞サブセット及び肥満細胞の移動を誘導し、インビトロで走化性効果を発揮する4,35,36。この遊走能は、ＦＰＲＬ１、百日咳毒素感受性、膜結合Ｇタンパク質共役受容体に対するＬＬ−３７の結合に依存性である4。ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の更なる想定機能としては、皮膚創傷の再上皮化及び新血管形成を促進することによる上皮修復及び血管新生の役割が挙げられる5,10。
本明細書に示される乳癌細胞中の顕著なｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現は、これら腫瘍細胞の増殖優位を反映する。この仮説を検証するために、ヒト上皮細胞系ＨＥＫ２９３及びＨａＣａＴをｈＣＡＰ１８発現ベクターでトランスフェクトし、トランスフェクト細胞の増殖の顕著な増加を見出した。更に、合成生物活性ＬＬ−３７ペプチドは、ＨａＣａＴ細胞の増殖を顕著に増加させた。これらの結果は、明らかに抗微生物ペプチドで示される想定抗腫瘍効果と対照的であるが、ヒトαデフェンシン類が腎細胞癌（ＲＣＣ）の進行を調節することを示唆するMuller et al.による最近の結果と一致する。これらのデフェンシンは、ＲＣＣの腫瘍細胞中、並びに腎臓の正常尿細管上皮中に、また生理的濃度で刺激した腫瘍細胞増殖で認められた27。
本発明者らのインビトロ研究では、百日咳毒素による受容体のブロッキングが、恐らく他の受容体の関与もあって、内因性ＬＬ−３７増殖作用を約５０％低下させたことから、ＬＬ−３７は一部ＦＰＲＬ１を介して上皮細胞の増殖を促進することを示唆する。最近の研究では、ＬＬ−３７が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の転写促進を介してマイトジェン活性タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ＝ＭＥＫ）の活性化によって気道上皮細胞を活性化することを示唆した37。
結論として、ここに提示された結果は、ＬＬ−３７が腫瘍増殖を促進することを示す。
参考文献
1. Gudmundsson GH, Agerberth B, Odeberg J, Bergman T, Olsson B, Salcedo R. The human gene FALL39 and processing of the cathelin precursor to the antibacterial peptide LL-37 in granulocytes. Eur J Biochem 1996; 238: 325-32.
2. Zanetti M, Gennaro R, Romeo D. Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain. FEBS Lett 1995;
374: 1-5.
3. Agerberth B, Gunne H, Odeberg J, Kogner P, Boman HG, Gudmundsson GH. FALL-39,
a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 195-99.
4. Yang D, Chen Q, Schmidt AP, Anderson GM, Wang JM, Wooters J, Oppenheim JJ, Chertov O. LL-37, the neutrophil granule- and epithelial cell-derived cathelicidin, utilizes formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) as a receptor to chemoattract human peripheral blood neutrophils, monocytes, and T cells. J Exp Med 2000; 192:
1069-74.
5. Koczulla R, von Degenfeld G, Kupatt C, Krotz F, Zahler S, Gloe T, Issbrucker K, Unterberger P, Zaiou M, Lebherz C, Karl A, Raake P, et al. An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18. J Clin Invest 2003; 111: 1665-7
2.
6. Cowland JB, Johnsen AH, Borregaard N. hCAP-18, a cathelin/pro- bactenecin- like protein of human neutrophil specific granules. FEBS Lett 1995; 368: 173-76.
7. Frohm M, Agerberth B, Ahangari G, Stahle-Backdahl M, Liden S, Wigzell H, Gudmundsson GH. The expression of the gene coding for the antibacterial peptide LL-37 is induced in human keratinocytes during inflammatory disorders. J Biol Chem 1997; 272: 15258-63.
8. Frohm Nilsson M, Sandstedt B, Sorensen O, Weber G, Borregaard N, Stahle-Backdahl M. The human cationic antimicrobial protein (hCAP18), a peptide antibiotic, is widely expressed in human squamous epithelia and colocalizes with interleukin-6. Infect Immun 1999; 67: 2561-66.
9. Dorschner RA, Pestonjamasp VK, Tamakuwala S, Ohtake T, Rudisill J, Nizet V, Agerberth B, Gudmundsson GH, Gallo RL. Cutaneous injury induces the release of cathelicidin anti-microbial peptides active against group A Streptococcus. J Invest Dermatol 2001; 117: 91-97.
10. Heilborn JD, Nilsson MF, Kratz G, Weber G, Sorensen O, Borregaard N, Stahle-Backdahl M. The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol 2003; 120: 379-89.
11. Winder D, Gunzburg WH, Erfle V, Salmons B. Expression of antimicrobial peptides has an antitumour effect in human cells. Biochem Biophys Res Commun 1998; 242: 608-12.
12. Ohtake T, Fujimoto Y, Ikuta K, Saito H, Ohhira M, Ono M, Kohgo Y. Proline-rich antimicrobial peptide, PR-39 gene transduction altered invasive activity and actin structure in human hepatocellular carcinoma cells. Br J Cancer 1999; 81: 393-403.
13. Pathology NCGfBS. Pathology reporting in breast cancer screening. second edition,NHSBSP Publication 1995.
14. Sorensen O, Bratt T, Johnsen AH, Madsen MT, Borregaard N. The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is bound to lipoproteins in plasma. J Biol Chem 1999; 274: 22445-51.
15. Ausubel FM, Brent R, R.E. K, Moore DM, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology: Wiley & Sons, Hoboken, NJ., 2003.
16. Schaffner W, Weissmann C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Anal Biochem 1973; 56: 502-14.
17. Sorensen O, Cowland JB, Askaa J, Borregaard N. An ELISA for hCAP-18, the cathelicidin present in human neutrophils and plasma. J Immunol Methods 1997; 206: 53-59.
18. Frohm M, Gunne H, Bergman AC, Agerberth B, Bergman T, Boman A, Liden S, Jornvall H, Boman HG. Biochemical and antibacterial analysis of human wound and blister fluid. Eur J Biochem 1996; 237: 86-92.
19. Boukamp P, Petrussevska RT, Breitkreutz D, Hornung J, Markham A, Fusenig NE.
Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol 1988; 106: 761-71.
20. Lennon G, Auffray C, Polymeropoulos M, Soares MB. The I.M.A.G.E. Consortium:
an integrated molecular analysis of genomes and their expression. Genomics 1996; 33: 151-2.
21. Murakami M, Ohtake T, Dorschner RA, Gallo RL. Cathelicidin antimicrobial peptides are expressed in salivary glands and saliva. J Dent Res 2002; 81: 845-50.
22. Murakami M, Ohtake T, Dorschner RA, Schittek B, Garbe C, Gallo RL. Cathelici
din anti-microbial peptide expression in sweat, an innate defense system for the
skin. J Invest Dermatol 2002; 119: 1090-5.
23. Sahasrabudhe KS, Kimball JR, Morton TH, Weinberg A, Dale BA. Expression of the antimicrobial peptide, human beta-defensin 1, in duct cells of minor salivary glands and detection in saliva. J Dent Res 2000; 79: 1669-74.
24. Bals R, Wang X, Wu Z, Freeman T, Bafna V, Zasloff M, Wilson JM. Human beta-defensin 2 is a salt-sensitive peptide antibiotic expressed in human lung. J Clin Invest 1998; 102: 874-80.
25. Tunzi CR, Harper PA, Bar-Oz B, Valore EV, Semple JL, Watson-MacDonell J, Ganz T, Ito S. Beta-defensin expression in human mammary gland epithelia. Pediatr Res 2000; 48: 30-5.
26. Jia HP, Starner T, Ackermann M, Kirby P, Tack BF, McCray PB, Jr. Abundant human beta-defensin-1 expression in milk and mammary gland epithelium. J Pediatr 2001; 138: 109-12.
27. Muller CA, Markovic-Lipkovski J, Klatt T, Gamper J, Schwarz G, Beck H, Deeg M, Kalbacher H, Widmann S, Wessels JT, Becker V, Muller GA, et al. Human alpha-defensins HNPs-1, -2, and -3 in renal cell carcinoma: influences on tumour cell proliferation. Am J Pathol 2002; 160: 1311-24.
28. Mizukawa N, Sawaki K, Yamachika E, Fukunaga J, Ueno T, Takagi S, Sugahara T.
Presence of human beta-defensin-2 in oral squamous cell carcinoma. Anticancer Res 2000; 20: 2005-7.
29. Mizukawa N, Sawaki K, Nagatsuka H, Kamio M, Yamachika E, Fukunaga J, Ueno T,
Takagi S, Sugahara T. Human alpha-and beta-defensin immunoreactivity in oral mucoepidermoid carcinomas. Anticancer Res 2001; 21: 2171-4.
30. Sawaki K, Mizukawa N, Yamaai T, Yoshimoto T, Nakano M, Sugahara T. High concentration of beta-defensin-2 in oral squamous cell carcinoma. Anticancer Res 2002; 22: 2103-7.
31. Jaynes JM, Julian GR, Jeffers GW, White KL, Enright FM. In vitro cytocidal effect of lytic peptides on several transformed mammalian cell lines. Pept Res 1989; 2: 157-60.
32. Sharma SV. Melittin-induced hyperactivation of phospholipase A2 activity and
calcium influx in ras-transformed cells. Oncogene 1993; 8: 939-47.
33. Moore AJ, Devine DA, Bibby MC. Preliminary experimental anticancer activity of cecropins. Pept Res 1994; 7: 265-9.
34. Hui L, Leung K, Chen HM. The combined effects of antibacterial peptide cecropin A and anti-cancer agents on leukemia cells. Anticancer Res 2002; 22: 2811-6.35. Agerberth B, Charo J, Werr J, Olsson B, Idali F, Lindbom L, Kiessling R, Jornvall H, Wigzell H, Gudmundsson GH. The human antimicrobial and chemotactic peptides LL-37 and alpha- defensins are expressed by specific lymphocyte and monocyte populations. Blood 2000; 96: 3086-93.
36. Niyonsaba F, Iwabuchi K, Someya A, Hirata M, Matsuda H, Ogawa H, Nagaoka I. A cathelicidin family of human antibacterial peptide LL-37 induces mast cell chemotaxis. Immunology 2002; 106: 20-6.
37. Tjabringa GS, Aarbiou J, Ninaber DK, Drijfhout JW, Sorensen OE, Borregaard N, Rabe KF, Hiemstra PS. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol 2003; 171: 6690-6.
〔実施例Ｂ〕
エストロゲン受容体（ＥＲ）及びリンパ節（Ｎ）陽性乳房腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現増加
材料及び方法
ＲＮＡを１４０乳房腫瘍及び４非罹患乳房組織試料から抽出し、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて逆転写した。ｈＣＡＰ１８転写物の発現を、標準プロトコールに従って１０ｎｇのｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲによって測定した(上記の通り)。結果と考察
結果を図６に示す。非罹患試料の平均発現は任意に１に設定した。平均及び偏差は分散分析統計法により評価した。
ｈＣＡＰ１８の発現は、リンパ節無しよりもリンパ節発現した場合に、ＥＲ陽性腫瘍で統計的に有意であった（約５倍）。
〔実施例Ｃ〕
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７活性を阻害する薬剤の同定
多くの優れたインビトロ及びインビボアッセイが、腫瘍進展へのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の多方面の寄与、即ち、既知のシグナル伝達経路の誘導、細胞増殖の促進とアポトーシスの抑制、コロニー増殖と足場非依存性増殖の促進、基底膜を介する浸潤性の賦活化、及び最終的にマウスにおける腫瘍増殖と転移の増強、を実証するために使用できる。
初代ケラチン細胞及び上皮細胞系に対し、既にｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に起因した上記特性は、乳癌細胞系でも証明することができる。適切な標的細胞系は、ＭＣＦ−７、ｈＣＡＰ１８を発現しない低悪性エストロゲン受容体陽性細胞系である。上記側面を検討するために、組換プラスミド由来のｈＣＡＰ１８を発現するＭＣＦ−７の派生細胞が樹立されている。ｈＣＡＰ１８タンパク質のオートクリン活性及びパラクリンＬＬ−３７は異なることから、細胞中の内因性産生による代わりにこれが実験の性質によって許されるならば、ＬＬ−３７の内因性添加によるインビトロアッセイも実施される。
上記実験がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の完全腫瘍形成能を評価することに関わる一方で、更なる実験が、抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７活性を有する薬剤によるこれらの作用を阻害することを実証するために行ない得る。例えば、合成された活性タンパク質ＬＬ−３７は抗体による阻害の標的と考えることができる。更に、このタンパク質の産生は、プロモーターの遮断を介するｈＣＡＰ１８遺伝子の転写、並びにＲＮＡ干渉による転写物の転写後ダウンレギュレーションを阻害することによって阻止することができる。
従って、実験は、作用メカニズム及び標的を明らかにするためにインビトロの、そして体内での作用を明らかにするためにマウスの腫瘍でのインビボの、両方で実施することができる。当該インビトロ実験は、上記のＭＣＦ−７派生細胞で実施してもよい。ｈＣＡＰ１８遺伝子に関する調節実験では、低いが明らかに検出できるレベルでｈＣＡＰ１８を発現する乳癌細胞系ＺＲ７５−１が使用される。
下記の実験では、特に明記しない限り、以下の条件が使用される：細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有するDulbecco変法Eagle培地で増殖させる。形質転換系統用の培地は、トランスジーンを維持するために１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン及び４００μｇ／ｍｌのゲネチシンを含有する。３日未満の間続く実験では、該抗生物質を細胞の使用の２４時間前に除去し、そしてウシ胎仔血清濃度を各特定の実験に必要な濃度に調整する。ＬＬ−３７を２μＭの濃度で添加する。
細胞増殖の促進（Heilborn 2005を参照）
トランスジェニック細胞系及び細胞系は７０％密集度で回収し、１０％ＦＣＳのＤＭＥＭにおいて９６ウェルプレート中に２,０００／ウェルで播種する。２４時間後、ＬＬ−３７の有り又は無しの条件で、５％ＦＣＳを含む培地に交換する。２４時間の培養後、細胞を１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジン、２０Ｃｉ／ｍｍｏｌで１２時間処理し、ガラス繊維フィルター上(Wallac, Turku, Finland)で回収する(Harvester 96; Tomtec, Orage, CT)。［３Ｈ］−チミジンの取り込みを、液体シンチレーションカウンター(Microbeta Plus, Wallac)を用いて測定する。実験の統計的有意差を確認するために、各条件／細胞系に対して２４ウェルを使用する。
細胞増殖試験(Lu 2005, Ludes-Meyers 2002を参照)
この試験は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７による細胞増殖の促進を明らかにするために、［３Ｈ］−チミジンの取り込み試験の補完として行なわれる。ＭＣＦ−７派生細胞を、各時点に対して３重複で５０細胞／ｍｍ2(６ウェル平板に約５０,０００細胞／ウェル)の密度でプレートする。総細胞数を血球計数器で２日おきに定量化する。細胞の生存を、トリパンブルーを用いて評価する。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７によるアポトーシスの阻害
アポトーシスの誘導のために、５％ＦＣＳを含む６ウェル平板培地中に２５,０００細胞／ウェルを播種して、トポイソメラーゼＩ阻害剤のカンプトテシン（ＣＡＭ）を６μＭで２４時間処理する。
２アポトーシスパラメータ、ＤＮＡ含量及びカスパーゼ−３活性を評価して、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７によるアポトーシスの抑制を確定する。実験は全て統計的有差を確認するために６系列で実施される。
フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量の解析(Warburton 2005を参照)
プロピジウムヨージド（ＰＩ）／ＲＮアーゼ染色緩衝液(Becton Dickinson, San Jose,
CA) を本解析で使用する。トリプシン処理細胞を冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールで固定化し、使用するまで４℃で保存する。ＤＮＡ含量は、ＤＮＡへのＰＩの取り込みを介して測定される。蛍光分析を、FACScanフロー・サイトメーター (Becton and Dickinson, Mountain View, CA, USA)で実施する。粒子のＦＳＣ（前方光散乱）及びＳＳＣ（側方光散乱）を同時に測定して、細胞のサイズと粒度を測定する。ＰＩ染色核の赤色蛍光をＦＬ−４ウインドウ（６００ｎｍバンドパスフィルター及び３５ｎｍバンド幅）で検出する。蛍光強度は、細胞内ＤＮＡ含量に比例する。各ヒストグラムは２つの部分に分割される：（１）非同期、非アポトーシス、生細胞（２Ｎから４Ｎに相当するＤＮＡ含量を有するＧ１、Ｓ及びＧ２期の細胞）を示すＭ１領域；及び（２）生細胞に比べて少ない量のＤＮＡを有するアポトーシス細胞を示すＭ２領域。
カスパーゼ−３活性アッセイ
カスパーゼ−３酵素活性は、蛍光基質ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（１００μＭ）及びＤＥＶＤ−ＡＭＣ（５０μＭ）を用いて測定される。細胞溶解物は反応緩衝液（１００ｍＭＨＥＰＥＳ、１０％蔗糖、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０−６％ＮＰ−４０、及び０.１％ＣＨＡＰＳ、（ｐＨ７.２５））中に合せ、マイクロタイタープレートに添加した。蛍光基質の開裂は、Fluoroscan IIプレートリーダー (Labsystems, Stockholm, Sweden)にてＡＭＣ遊離によってモニターされる。蛍光単位は、遊離ＡＭＣから得られた標準曲線を用いてｐｍｏｌのＡＭＣに変換される。データは、直線回帰によって解析する。
コロニー形成アッセイ(Ludes-Meyers 2002, Wang 2005を参照)
本アッセイを用いて、支持隣接細胞の不在下における細胞の持続増殖能を測定する。この性質は細胞の腫瘍形成能を反映すると考えられる。
トランスジェニック細胞は半密集度条件下に維持され、最大で７０％の密集度でトリプシン処理され、次いで、５、１０、及び２５細胞／ｍｌ増殖培地の濃度に希釈される。細胞を３日から７日間（基本的に３から４の倍加に十分）増殖させ、コロニー当りの細胞数を測定する。組換プラスミドが緑色蛍光タンパク質を発現する場合、細胞とコロニーは蛍光顕微鏡で計数する。コロニー形成の結果は、コロニー当りの蛍光細胞の分布として表示され、そして培地中のＬＬ−３７の存在又は不在下に異なる形質転換系統間の分布を比較するために、ウィルコクソンの順位和検定が使用される。ＭＣＦ−７細胞はβエストロゲンの存在だけで腫瘍を形成することが知られていることから、トランスジェニック細胞の増殖に対する１−５ｎＭのエストロゲンの効果をアッセイできる。
足場非依存性増殖のアッセイ (Fiucci 2002を参照)
本試験は、細胞の転移形成能を反映する。細胞を、３００ｕ／ｍｌトリプシン、２０ｕ／ｍｌエラスターゼ、及び１ｍＭのＥＤＴＡの混合物で処理することによって調製する。エラスターゼの存在は、細胞の単細胞懸濁液への分離を促進する。細胞を増殖培地中に懸濁して、融解した０.７％Seaplaque低融解温度アガロースを含有する増殖培地と１：１で混合し、５００細胞／ｍｌ及び０.３５％アガロースの最終濃度にする。このミックスの１ｍｌを、２ｍｌ層の固体培地／０.６％アガロース一面に６ウェル平板にプレートする。該細胞に１００μｌの増殖培地を添加することによって３〜４日おきにフィードする。２週後培養物の最上層を０.２％ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット(Sigma)で染色し、そして１００μＭ径より大きいコロニーをカウントする。このアッセイは３重複で行なわれ、２回繰り返す。
浸潤性の誘導 (Fiucci 2002を参照)
Matrigelは基底膜と考えられ、ＥＨＳ肉腫から発生する。Matrigelは基底膜成分 (コラーゲン、ラミニン、及びプロテオグリカン) だけでなく、マトリックス分解酵素／その阻害剤及び成長因子をも含有する。Matrigelへの腫瘍細胞の浸潤は、腫瘍進行の役割を果たす細胞外マトリックス受容体及びマトリックス分解酵素の関与を特徴付けるために使用されている。
Matrigelを無血清低温増殖培地で２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして１００μｌを２４ウェルのトランスウェルの上部チャンバーに置き、ゲル化のため一夜３７℃でインキュベートする。細胞を回収して、１０6／ｍｌの密度で１％ＦＣＳを含有する培地に再懸濁する。Matrigelを加温無血清培地で洗浄後、１００μｌの細胞懸濁液は上部に置かれる。下方チャンバーは、化学誘引物質として馴化培地を含有する６００μｌの増殖培地で満たされる。該チャンバーは６時間から２４時間の間細胞インキュベーターで培養される。該トランスウェルを染色 (Diff-Quick staining solution, Fisher Scientific) して、非浸潤細胞を消毒綿でかき取り後、浸潤細胞を光学顕微鏡でカウントする。
ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖 (Wang 2005 Warburton 2005を参照)
半密集度に増殖した細胞を回収し、冷ＰＢＳ中において２.５×１０7細胞／ｍｌで懸濁する。２００μｌ部が４〜６週齢の雌性ＳＣＩＤマウスの脂肪体、又は尾静脈に皮下注射される。ＭＣＦ−７細胞の腫瘍形成は一般的にエストロゲンに依存することから、１.７ｍｇのβ−エストラジオール／日を６０日にわたって遊離するように皮下にペレットが埋め込まれている。このマウスを週に２回触診して、最初の触知可能腫瘍が生じた日時を記録する。腫瘍増殖は手動でモニターし、そしてマウスを１ｃｍの腫瘍径になった直近に屠殺する。腫瘍の数、サイズ及び分布を記録する。小転移はマウスを切片にして検出し、また組換プラスミドから発現するＧＦＰ由来の蛍光を誘導するためスキャンする。更に、脾臓と肝臓を膠原化して、単細胞懸濁液を蛍光細胞数の測定のためにＦＡＣＳソーターで評価する。
ｈＣＡＰ１８転写に対するアンタゴニストによる阻害研究 (Agarwal 1998, Andela 2004,
Toell 2001, Ishizuka 2005, Weber 2005を参照)
現在知られているｈＣＡＰ１８転写の最強インジューサーはビタミンＤである。ビタミンＤ受容体は、ｈＣＡＰ１８プロモーターの応答要素に結合することによってｈＣＡＰ１８転写を直接活性化する。このように小分子はｈＣＡＰ１８の発現を調節できることから、阻害化合物の体系的スクリーニングの意義は大きい。初期の研究では、エストロゲン及びその幾つかの代謝物は効果が無いことを示した。ビタミンＡは皮膚ケラチン細胞における転写を阻害するが、乳癌細胞系ＺＲ−７５−１における転写を活性化する。これらの結果に基づき、ＺＫ１５９２２２(Schering AG)、及びＴＥＩ−９６４７(Tejin Institute for Medical Research, Tokyo)などのビタミンＤのアンタゴニスト、並びにＡＧＮ１９３１０９(Allergen Pharmaceuticals)などのビタミンＡのアンタゴニストは、本発明の方法に用いられる有望な薬剤である。
ｈＣＡＰ１８転写の阻害剤のスクリーニング (Weber 2005を参照)
ＺＲ７５−１細胞を２５％の密集度でプレートし、そして１００μＭのイソプロパノール又はＤＭＳＯに溶解し、最終濃度を１００ｎＭとした有望な阻害剤で処理される。２４時間後、ＲＮＡをQiagen Rneasyキット(Operon Biotechnologies, Cologne, Germany) で抽出し、第一鎖合成キット(Amersham Biosciences, Norwalk, CT)で逆転写する。ＲＮＡを、標準プロトコールに従って５ｎｇのｃＤＮＡを用いABI Prism 7700 (Applied Biosystems) でリアルタイムＰＣＲによって定量化する。該試料は３重複で評価される。配列は、プライマーでは５′−ＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡ−３′[配列番号２]及び５′−ＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＣＡＴＡ−３′[配列番号３]、並びに蛍光発生プローブでは６−ＦＡＭ−５′−ＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴ−３′−ＢＨＱ１[配列番号４]である。該試料は、１８Ｓ−ＲＮＡ(Assay on Demand, Applied Biosystems)の定量化によって正規化される。
阻害の調節メカニズムを調べるために、ｈＣＡＰ１８プロモーターがルシフェラーゼレポーター遺伝子をコントロールする組換プラスミドの使用によって、プロモーターの活性が測定される。ＺＲ７５−１細胞は２５%の密集度で６ウェル平板にプレートされ、そして６μｌのjetPEI (qBiogene)で複合化したレポータープラスミドにより、１ウェル当り３μｇでトランスフェクトされる。トランスフェクションから１４時間経って、阻害剤が上記のように添加される。２４時間後に細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をアッセイシステム(Promega)で測定する。活性は、２００ｎｇのコトランスフェクトしたプラスミド(pEF1/lacZ, Invitrogen) から発現した、β−ガラクトシダーゼに対して正規化される。各実験は、各アッセイで少なくとも２回及び３重複で実施される。
転写後阻害研究 (Wang 2005, Zhang 2005, Roh 2000を参照)
今日の最も有効な転写後阻害は、標的ｍＲＮＡの配列特異的及び触媒的分解を基本的に誘導するＲＮＡ干渉である。転写産物中の最も有効な標的部位は、低分子干渉ＲＮＡがトランスフェクトされる細胞系で最も容易にスクリーニングされ得る。ＲＮＡ干渉の効率は、定量的ＰＣＲ及びウェスタンブロット分析によってモニターされる。奏功標的部位は、腫瘍部位で標的分子を発現する目的で設計され、次いで組換ベクターに発現し得る。
低分子干渉ＲＮＡは、ｈＣＡＰ１８のコード配列に基づいて設計され合成される。このＲＮＡは二本鎖１９マーで、両側に２塩基ｄＴｄＴ−オーバーハングをプラスして構成される。そのデザインでは、標的部位が事前選択される市販のｓｉＲＮＡデータベースが、最も簡単に使用可能である（ｈＣＡＰ１８に対して、例えば、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ. １４５８６、１４４０２、１４６３６５ from Ambion）。ＺＲ７５−１細胞又はトランスジェニックＭＣＦ−７細胞は、インターフェロン関連経路などの非特異反応を回避するために、最大で１０ｎＭの最終濃度でｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされる。対照ｓｉＲＮＡは標的配列中に２〜３のミスマッチを含む。細胞はトランスフェクション後２４〜７２時間で回収され、そしてｈＣＡＰ１８の発現は上記のリアルタイムＰＣＲ、及び定量的ウェスタンブロット分析によって測定される。ウェスタンブロット分析のために、タンパク質をＳＤＳ含有試料緩衝液で抽出し、１５％Tris-Glycineゲルで分離し、更に上記のようにニトロセルロースフィルター上で電気ブロッティングする。フィルターを、アフィニティー精製抗ＬＬ−３７抗血清を用いて、１／１,０００希釈でインキュベート前に３％ポンスーＳにより可逆的に染色する。増強化学ルミネッセンスを用いて、ＨＲＰ結合二次ＩｇＧからのシグナルを捕獲し、上記のように評価する。
インビボ実験が、ｈＣＡＰ１８発現の最も有効な転写阻害剤に対して組み立てられる。１２マウスにトランスジェニックｈＣＡＰ１８を発現するＭＣＦ−７細胞を注射する。半分のマウスには、５０μｌのオリーブオイル(Sigma)に溶解した３０ｍｇの阻害剤を、連日皮下注射で与える。腫瘍形成の開始、サイズ及び分布は、上記のように測定する。インビボアプローチに有効なｓｉＲＮＡは、ｈＣＡＰ１８発現を少なくとも９０％ダウンレギュレートすると考えられる。
マウスにおける腫瘍形成を阻止するためには、ｈＣＡＰ１８発現のダウンレギュレーションを数週間維持することが必要である。尾静脈内への高い量のｓｉＲＮＡの連日注射が可能なことは証明されているが、治療的アプローチには殆ど現実的ではない。代わりの方法は、生物／腫瘍細胞におけるｓｉＲＮＡの安定発現である。ヘアピンにＲＮＡを発現し、次いで細胞内でｓｉＲＮＡに変換する、プラスミドが設計されている(例えば pSuper, OriGene Inc)。本発明者らの初期アプローチでは、上記実験によって決められた標的ｓｉＲＮＡ配列はpSuperにクローニングされ、そして腫瘍細胞はマウスへ移植前にこの構築物でトランスフェクトされる。治療的アプローチ、即ち腫瘍形成を過ぎた発現ベクターの送達は現時点ではまだ開発されていないが、この目的のためにリポソームによるプラスミド、並びにレトロウイルス及びアデノウイルスベクターの構築物の送達が世界的に検討されている。
ＲＮＡｉに代わる方法は「古典的な」アンチセンス法である。標的転写物に相補的な、２０−３ｂｐ長の一本鎖オリゴヌクレオチドが、細胞培地に直接添加されるか又はマウスに注射される。オリゴヌクレオチドの骨格は、その分解を阻害しまた担体基質無しでその取り込みを促進するために、通常修飾される。しかしながら、この方法は、阻害機構が非触媒的であることから高投与量を必要とし、そして骨格修飾は細胞毒性及び非特異的副作用を増大させる。マウス実験では、標準的な投与範囲は１００〜５００μｇ／動物／日である。
抗体によるＬＬ−３７活性の阻害 (Warburton 2005を参照)
ニワトリ抗体を、予定の実験に十分なように、大規模に製造しアフィニティー精製した。ＬＬ−３７に対する抗体はＬＬ−３７の活性を阻害できることが既に示されている。従ってインビトロ実験は必要ではない。
インビボ実験では、上記のマウスに腫瘍が誘発される。腫瘍が触知可能な場合には、始めに１〜１００ｍｇ／ｋｇの抗体を用いて、抗体が週２回注射される。
次いで、腫瘍成長に対する抗体の効果を評価する。
参考文献
1. Agarwal C et al.: AGN193109 is a highly effective antagonist of retinoid action in human ectocervical epithelial cells. J Biol Chem 271: 12209-12212 (1996).
2. Andela VB, Rosier RN: The proteosome inhibitor MGI32 attenuates retinoic acid
receptor trans-activation and enhances trans-repression of nuclear factor B. Potential relevance to chemo-preventive interventions with retinoids. Molecular Cancer 3: 8-19 (2004).
3. Fiucci G, Ravid D, Reich R, Liscovitch M: Caveolin-1 inhibits anchorage-indep
endent growth, anoikis and invasiveness in MCF-7 human breast cancer cells. Oncogene 21: 2365-2375 (2002).
4. Heilborn J et al.: Antimicrobial protein hCAP18/LL-37 is highly expressed in breast cancer and is a putative growth factor for epithelial cells. Int J Cancer
114: 713-9 (2005).
5. Ishizuka S et al.: (23S)-25-Dehydro-1[alpha]-hydroxyvitamin D3-26, 23-lactone, a vitamin D receptor antagonist that inhibits osteoclast formation and bone resorption in bone marrow cultures from patients with Paget's disease. Endocrinology. 146: 2023-2030 (2005).
6. Lu C, Shen Q et al.: cFos is critical for MCF-7 breast cancer cell growth. Oncogene 24: 6516-6524 (2005).
7. Ludes-Meyers JH et al.: AP-1 blockade inhibits the growth of normal and malignant breast cells. Oncogene 20: 2771-2780 (2001).
8. Roh H et al.: HER2/neu antisense targeting of human breast carcinoma. Oncogene. 2000 Dec 11; 19(53): 6138-43.
9. Toell A et al.: Different molecular mechanisms of vitamin D3 receptor antagonists. Mol Pharmacol 59: 1478-1485 (2001).
10. Wang Y-h et al.: Knockdown of c-Myc expression by RNAi inhibits MCF-7 breast
tumour cells growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Res 7: R220-R228 (2005).
11. Warburton C et al.: Treatment of HER-2/neu overexpressing breast cancer xenograft models with trastuzumab (Herceptin) and gefitinib (ZD1839): drug combination effects on tumour growth, HER-2/neu and epidermal growth factor receptor expression, and viable hypoxic cell fraction. Clin Cancer Res. 10: 2512-24 (2004).
12. Weber G et al.: Vitamin D induces the antimicrobial protein hCAP18 in human skin. J Invest Dermatol. 124: 1080-2 (2005).
13. Zhang M et al.: Silencing the epidermal growth factor receptor gene
with RNAi may be developed as a potential therapy for non small cell lung cancer. Genet Vaccines Ther. 3: 5-16 (2005).
〔実施例Ｄ〕
ヒト抗微生物ペプチドＬＬ−３７は、培養ヒトケラチン細胞において、アポトーシスを阻害し、またアポトーシスタンパク質インヒビター（ＩＡＰ−２）の発現をアップレギュレーションする。
イントロダクション
カテリシジン類は、多くの哺乳類種に見出されている抗微生物ペプチドの１ファミリーである。それらは、高度に保持されたアミノ末端ドメイン、カテリン、及び抗微生物活性を与えるようにタンパク質分解により遊離する可変性カルボキシ末端ドメインから構成されている（１、２）。このファミリーの唯一のヒトメンバー、１８ｋＤａヒトカチオン性抗微生物タンパク質（ｈＣＡＰ１８）は、主として好中球、数種の上皮及び粘膜細胞（皮膚、気管支、頬粘膜、食道、頚部、膣、epidimus及び唾液腺）で産生する（３〜８）。Ｃ末端の３７アミノ酸ドメイン、ＬＬ−３７は、広範囲の微生物に対して、膜安定性の破壊を介して（１１、１２）抗微生物活性を示す（９、１０）。
抗微生物機能を超えて、このペプチドは、血液及び上皮細胞における走化性及びサイトカイン遊離（８、１３）、上皮細胞増殖の誘導（１４）、並びに血管新生（１５）などの他の生物活性に関与する。最近の研究は、ＬＬ−３７が創傷治癒時に高度に発現し、ヒトケラチン細胞のインビトロ増殖に影響を与え、そして創傷の再上皮化に関与することを示している（１６、１７）。
材料及び方法
細胞培養
包皮の表皮角化細胞は、Cascade Biologics (Cascade Biologics, Eugene, OR)から入手し、そして０.０６ｍＭのカルシウム、０.２％ｖ／ｖＢＰＥ、５μｇ／ｍｌウシインシュリン、０.１８μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍｌウシトランスフェリン、０.２ｎｇ／ｍｌヒト上皮細胞増殖因子、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、及び０.２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ(全てCascade Biologics)を補足したEpilife基礎培地(Cascade Biologics,. ) 中にて、３７℃及び５％ＣＯ2で培養した。細胞は、０.０２５％（ｗ／ｖ）トリプシン及び０.０１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ(Cascade Biologics)を用いて、週に１度継代した。
ＨａＣａＴケラチン細胞を、１０％ウシ胎仔血清(hyClone, Boule Nordic AB Huddinge, Sweden)、２ｍＭグルタミン、ペニシリン(５０Ｕ／Ｌ Gibco-BRL)及び ストレプトマイシン(５０ｍｇ／ｍｌ、Gibco-BRL)を補足した、ＤＭＥＭ(Dulbecco's 変法Eagle's 培地; Gibco-BRL Technology, Paisley, UK)で培養した。
細胞処理
２５,０００細胞／ウェルを６ウェル平板培養皿にプレートした。プレイティングの４８時間後に、細胞を０、０.２３、０.４６、０.６９、０.９、１.１５、２.３、４.６及び１１.５μＭのＬＬ−３７で処理した。その配列を以下に示す。
Figure 2009535391
各処理は３重複で行なわれた。該ペプチドは、培地（ＨａＣａＴ細胞に５％ＦＣＳのＤＭＥＭ及びＨＥＫｎ細胞に０.１％ＦＣＳを補足したEpilife基礎培地）で希釈された。細胞は全部で２４時間の間処理された。ＬＬ−３７で刺激後、ジメチルスルホキシド中のトポイソメラーゼＩ阻害剤カンプトテシン（ＣＡＭ）(Sigma Chemical Co., St. Luis, MO)を、最終６μＭ濃度まで細胞に添加した。更に、細胞を分析前の２４時間インキュベートした。
フローサイトメトリーによるアポトーシスの評価
２つのアポトーシス・パラメータ、膜完全性の欠如及びＤＮＡ減少をフローサイトメトリーで評価した。
膜完全性の評価：ＬＬ−３７で刺激後、及びＣＡＭで処理後、細胞をトリプシン処理により回収した。次いで細胞を冷Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、それから血球計算板(Hausser Scientific, Horsham, PA)でカウントした。細胞密度をＰＢＳ中１×１０6細胞／ｍｌに調整した。アポトーシスは、プロピジウム・ヨージド及びＹＯ−ＰＲＯ−１色素(Molecular Probes, Eugene, OR)で染色しで検出した。染色された細胞はFACScan (Beckton-Dickinson, San Jose, CA)で解析した。細胞は、前方（ＦＣＳ）及び側方光散乱特性（ＳＣＣ）に基づいてゲート解析された。ＹＯ−ＰＲＯ及びプロピジウム・ヨージド（ＰＩ）発現細胞の解析は、Cell Quest ソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて行なわれ、ＹＯ−ＰＲＯ及びＰＩ陽性細胞の百分率を示した。ＹＯ−ＰＲＯで緑色染色した細胞は、アポトーシス性と考えられた。またプロピジウム・ヨージドで赤色染色した細胞は、壊死性であった。生細胞は殆ど又は全く色素を取り込まない。
フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量の解析：
ＰＩ／ＲＮアーゼ染色緩衝液(Becton Dickinson) をこの分析に使用した。トリプシン処理細胞を冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで固定し、使用するまで４℃にて保存した。ＤＮＡ含量は、ＤＮＡへのプロピジウム・ヨージドの取り込みを介して測定した。蛍光分析は、FACScan フローサイトメーター (Becton and Dickinson, Mountain View, CA, USA)を用いて実施した。粒子のＦＳＣ（前方光散乱）及びＳＣＣ（側方光散乱）を同時に測定して、細胞のサイズと粒度を定量した。ＰＩ染色核の赤色蛍光をＦＬ−４ウインドウ（６００ｎｍバンドパスフィルター及び３５ｎｍバンド幅）で検出した。蛍光強度は細胞内のＤＮＡ含量に比例していた。各ヒストグラムは２部分に分割された：（１）非同期性、非アポトーシス性生細胞（２Ｎから４Ｎに等しいＤＮＡ含量を有するＧ１、Ｓ及びＧ２期の細胞）；及び（２）生細胞に比べて少量のＤＮＡを有するアポトーシス細胞を示すＭ２域。
カスパーゼ−３活性アッセイ
カスパーゼ−３酵素活性は、既述のように蛍光基質ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（１００μＭ）及びＢＥＶＤ−ＡＭＣ（５０μＭ）を用いて評価した。
要約すれば、細胞溶解物は反応緩衝液（１００ｍＭＨＥＰＥＳ、１０％蔗糖、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０〜６％ＮＰ−４０、及び０.１％ＣＨＡＰＳ、（ｐＨ７.２５））中に合せ、マイクロタイタープレートに添加した。蛍光基質の開裂は、Fluoroscan IIプレートリーダー(Labsystems, Stockholm, Sweden)にてＡＭＣ放出によってモニターした。蛍光単位は、放出ＡＭＣから得た標準曲線を用いてｐｍｏｌのＡＭＣに変換した。データは、直線回帰によって解析し、分当りのｐｍｏｌのＡＭＣ放出として表示した。
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、Quiagen RNasy キット(Operon Biotechnologies, Cologne, Germany)を用いることにより、メーカー使用法に従って種々の処理後に細胞から分離した。逆転写は第一鎖合成キット(Amershan Biosciences)により実施した。
結果
ＬＬ−３７によるＣＡＭ誘導アポトーシスの阻害
アポトーシス誘導剤として広く使用されている薬物の、ＣＡＭで誘導した細胞死及びアポトーシスに対するＬＬ−３７の効果を調べた。処理後、膜完全性及びＤＮＡ断片化を、２方法を用いてフローサイトメトリーにより解析した。第１の方法は、細胞膜透過性増加を識別することを可能にする２染色システムであった；未処理細胞の染色強度を解析して（図７）３タイプに類別した：非染色生細胞、アポトーシスＹＯ−ＰＲＯ染色細胞並びにＹＯ−ＰＲＯ及びＰＩの両方で染色した壊死細胞。第２の方法では、エタノール透過細胞中のＤＮＡ含量をＰＩによって解析した。アポトーシス細胞は、断片化により少ない量のＤＮＡを示した。
濃度及び時点実験を、ＨａＣａＴ及びＨＥＫｎ細胞にアポトーシスを誘導する用量及び時間を選択するために、前もって実施した(データ表示せず)。２４時間６μＭのＣＡＭに曝露した場合、ＨａＣａＴ及びケラチン細胞の両者は、膜完全性及びＤＮＡプロファイルの変化などアポトーシスの形態変化特性を示した(図７)。細胞をＬＬ−３７単独で又はＬＬ−３７とＣＡＭで同時に２４時間処理した場合、アポトーシス細胞の量の変化は認められなかった(データ表示せず)。しかしながら、高濃度のＬＬ−３７（４.６及び１１.５μＭ）は細胞傷害性であり、アポトーシス細胞ではなく壊死細胞のフラクションの増加をもたらした。同時処理に代えて、細胞をＣＡＭによるアポトーシス誘導前に２４時間ＬＬ−３７に曝露した場合、結果は異なっていた。０.２３μＭから２.３μＭまでの濃度では、ＬＬ−３７はＨＥＫｎ及びＨａＣａＴ細胞において、ＤＮＡ断片化及び膜透過性の両方を阻害した（図７及び８）。またこれらの条件下に、ＬＬ−３７は高濃度（４.６μＭ及び１１.５μＭ））で細胞死を引き起こした。毒性濃度においても、アポトーシス細胞のフラクションは低い状態であったことから、ＬＬ−３７による細胞死は非アポトーシス機構によって起こることを示唆した。
ＬＬ−３７は、ＨａＣａＴ及びＨＥＫｎ細胞中のＣＡＭによるカスパーゼ−３の誘導を阻害する
カスパーゼ−３はアポトーシス経路における鍵タンパク質の１つで、またアポトーシスの早期指標であることから、ＬＬ−３７の有り又は無しで処理したケラチン細胞のカスパーゼ−３活性を測定することを決めた。カスパーゼ活性はＣＡＭ処理の最初の１２時間内にケラチン細胞で顕著に増加し、２４時間でピークに達した。２.３μＭのＬＬ−３７の前処理で、カンプトテシン誘導カスパーゼ活性化が低下した（図９ａ及びｂ）。これらのデータは、ＬＬ−３７が、カスパーゼ活性を低下させることによってヒトケラチン細胞のアポトーシスを阻害することを示唆する。
ＬＬ−３７はヒトケラチン細胞におけるＩＡＰ−２発現を誘導する
アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）のメンバーは、アポトーシスの主要調節因子と記述されている。このファミリーはカスパーゼ−３の活性阻害能を有する。ブタのカテリシジンメンバーのＰＲ３９の抗アポトーシス機能は、ＩＡＰ−２発現の誘導に関連している。従って、種々の濃度のＬＬ−３７及び異なる時点で処理したケラチン細胞中のＩＡＰ−２のＨＥＫｎ細胞における発現を、ＲＴ−ＰＣＲで解析した。２.３μＭのＬＬ−３７による刺激は、刺激後６時間から１２時間までＩＡＰ−２ｍＲＮＡを増加させた(図１０)。２.３μＭ未満のＬＬ−３７の濃度は、ｃＩＡＰ−２レベルに影響を与えなかった（データ表示せず）。
ＬＬ−３７で刺激したケラチン細胞は、ＣＯＸ−２をアップレギュレートする
以前の研究では、上皮細胞におけるＣＯＸ−２の阻害がＩＡＰ−２発現を低下させたことから、ＣＯＸ−２をＩＡＰ−２発現のレギュレーターと特定した。そこで、２.３μＭのＬＬ−３７で処理したＨＥＫｎ中のＣＯＸ−２の発現を解析した。ｍＲＮＡレベルの時間依存性増加が、１２時間後に明らかに最大レベルで認められた(図１１)。ＣＯＸ−２がＬＬ−３７刺激後にＩＡＰ−２の発現増加を媒介するかを評価するために、ＨＥＫｎ細胞を２５ｎＭの特異的ＣＯＸ−２阻害剤ＳＣ−７９１で１２時間前処理し、次いで２μＭのＬＬ−３７で刺激した。これらの条件下、ＬＬ−３７処理は、以前に認められたＩＡＰ−２ｍＲＮＡレベルを増加させなかった(図１２)。これらのデータは、ＬＬ−３７が、ＣＯＸ−２酵素の発現の増加を介してＩＡＰ−２レベルを増加させることを示唆する。
考察
抗微生物ペプチドＬＬ−３７の発現増加が、皮膚損傷に続いて報告されていた。本ペプチドの発現は、感染の防止を介してだけでなく、走化性、マイグレーション、血管新生及び再上皮化などの種々の創傷治癒関連過程への活発な関与を介して、創傷治癒の促進に関連している。
本データは、ＬＬ−３７も、アポトーシスに対する阻害作用を介してケラチン細胞での細胞生存促進に関与することを示す。
略語
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７：ヒトカテリシジン抗微生物ペプチド１８ｋＤａ／ＬＬ−３７；ＩＡＰ−２：アポトーシス阻害タンパク質−２；ＣＯＸ−２：シクロオキシゲナーゼ−２；ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ：カスパーゼ３基質；ＨＥＫｎ：ヒト新生児表皮角化細胞；ＤＭＥＮ：Dulbecco's 変法Eagle培地；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ＤＥＶＤアーゼ：Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐプロテアーゼ活性；ＣＨＡＰＳ：３-［(３-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ］-1-プロパンスルホン酸；ＣＡＭ：カンプトテシン。
参考文献
1. Zanetti, M., Gennaro, R., and Romeo, D. (1995) FEBS Lett 374(1), 1-5
2. Sorensen, O. E., Follin, P., Johnsen, A. H., Calafat, J., Tjabringa, G. S., Hiemstra, P. S., and Borregaard, N. (2001) Blood 97(12), 3951-3959
3. Sorensen, O., Arnljots, K., Cowland, J. B., Bainton, D. F., and Borregaard, N. (1997) Blood 90(7), 2796-2803
4. Bals, R., Wang, X., Zasloff, M., and Wilson, J. M. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(16), 9541-9546
5. Frohm, M., Agerberth, B., Ahangari, G., Stahle-Backdahl, M., Liden, S., Wigzell, H., and Gudmundsson, G. H. (1997) J Biol Chem 272(24), 15258-15263
6. Agerberth, B., Gunne, H., Odeberg, J., Kogner, P., Boman, H. G., and Gudmundsson, G. H. (1995) Proc Natl Acad Sci U S A 92(1), 195-199
7. Frohm Nilsson, M., Sandstedt, B., Sorensen, O., Weber, G., Borregaard, N., and Stahle-Backdahl, M. (1999) Infect Immun 67(5), 2561-2566
8. De, Y., Chen, Q., Schmidt, A. P., Anderson, G. M., Wang, J. M., Wooters, J., Oppenheim, J. J., and Chertov, O. (2000) J Exp Med 192(7), 1069-1074
9. Zasloff, M. (2002) Nature 415(6870), 389-395
10. Dorschner, R. A., Pestonjamasp, V. K., Tamakuwala, S., Ohtake, T., Rudisill,
J., Nizet, V., Agerberth, B., Gudmundsson, G. H., and Gallo, R. L. (2001) J Invest Dermatol 117(1), 91-97
11. Oren, Z., Lerman, J. C., Gudmundsson, G. H., Agerberth, B., and Shai, Y. (1999) Biochem J 341 ( Pt 3), 501-513
12. Ramanathan, B., Davis, E. G., Ross, C. R., and Blecha, F. (2002) Microbes Infect 4(3), 361-372
13. Braff, M. H., Hawkins, M. A., Di Nardo, A., Lopez-Garcia, B., Howell, M. D.,
Wong, C., Lin, K., Streib, J. E., Dorschner, R., Leung, D. Y., and Gallo, R. L.
(2005) J Immunol 174(7), 4271-4278
14. Shaykhiev, R., Beisswenger, C., Kandler, K., Senske, J., Puchner, A., Damm, T., Behr, J., and Bals, R. (2005) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 289(5), L842-L848
15. Koczulla, R., von Degenfeld, G., Kupatt, C., Krotz, F., Zahler, S., Gloe, T., Issbrucker, K., Unterberger, P., Zaiou, M., Lebherz, C., Karl, A., Raake, P., Pfosser, A., Boekstegers, P., Welsch, U., Hiemstra, P. S., Vogelmeier, C., Gallo, R. L., Clauss, M., and Bals, R. (2003) J Clin Invest 111(11), 1665-1672
16. Heilborn, J. D., Nilsson, M. F., Jimenez, C. I., Sandstedt, B., Borregaard, N., Tham, E., Sorensen, O. E., Weber, G., and Stahle, M. (2005) Int J Cancer 114(5), 713-719
17. Heilborn, J. D., Nilsson, M. F., Kratz, G., Weber, G., Sorensen, O., Borregaard, N., and Stahle-Backdahl, M. (2003) J Invest Dermatol 120(3), 379-389
〔実施例Ｅ〕
ＥＦＧ受容体活性に対するＬＬ−３７及びヘレグリンによるコインキュベーションの効果材料及び方法
リン酸化のウェスタンブロット分析
ＥＲＢＢ２、ＳＴＡＴ３、ｐ４２／ｐ４４ＭＡＰＫ（＝ＥＲＫ１／２）、要約プロトコール：
低悪性度乳癌細胞系ＺＲ７５−１（ＡＴＣＣから入手）が本研究を通じて使用される。ＺＲ７５−１は低レベルでｈＣＡＰ１８及びＥＲＢＢ２の両者を発現する。
処理：
全実験は３重複で実施される。細胞はOptimem+１０％ＦＣＳ中で増殖され、５０％密集度で１２ウェル平板にプレートされる。再付着後、細胞はＦＣＳの無いＤＭＥＭで４８時間飢餓にされる。誘導実験では、ＰＢＳに溶解した予熱基質を培地に添加し、細胞を２０分間インキュベートした。ＬＬ−３７の最終濃度は１０μｇ／ｍｌで、ヘレグリンでは２又は２０ｎｇ／ｍｌであった。
ＬＬ−３７は自家合成した。組換ヘレグリン−β（ＥＧＦドメイン、ａｃ１７８−２４１）は、Upstate, Lake Placid, NYから入手した。
細胞を、ホスファターゼ阻害剤を含む氷冷ＰＢＳ（１ｍＭＮａＦ＋１ｍＭＮａ3ＶＯ4）、プラスプロテアーゼ阻害剤として２ｍＭのＰＭＳＦで洗浄し、そして上記の阻害剤を含む２００μｌのＳＤＳ試料緩衝液で溶解した。試料は８０℃でホモジナイズして変性させ、次いで５０μｌの試料を７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけて分離し、そして標準手順によりニトロセルロース上でブロットした。
ＴＢＳ／０.１％Tween 20、４％ＮＦＤＭにてブロッキング後、膜を一次抗体と４℃で一夜インキュベートした。
使用した抗体：
ｐＥＲＢＢ２(ｐＴｙｒ１２４８)、ウサギ、Upstate (cat no. 06-229)１／２,０００で使用した−を再使用できる。
ｐＭＡＰＫ１／２(ｐＴｈｒ２０２／ｐＴｙｒ２０４)、Cell Signalling Inc.。
ＨＲＰ−結合二次抗体で洗浄及び２時間インキュベーション後、膜をＥＣＬ (Amersham)で展開した。シグナルを、定量化プログラム(Fujifilm, Tokyo)を用いてＣＣＤカメラで測定した。
化学ルミネセンス・シグナルはポンスー染色に対して正規化した。
１つの実験では、チロシンキナーゼ阻害剤ＰＤ１５３０３５(Merck Biosciences)が、２０ｎＭから２.５μＭまでの漸増濃度で添加された。
結果
ＬＬ−３７及びヘレグリンの併用処理の効果を、図１３に示す。定量データを図１４に示す。
図１３は、ＬＬ−３７、ヘレグリン又はその併用で処理後、ＺＲ７５−１細胞におけるＥＲＢＢ２及びＭＡＰＫの活性化を示す。細胞抽出物は、リン酸化ＥＲＢＢ２及びＭＡＰＫに対するウェスタンブロットで解析した。そのシグナルは、ＣＣＤカメラで捉え、ポンスー染色で正規化後定量化した。３重複での評価結果を図１４に示したが、ＬＬ−３７及びヘレグリンは、活性に関して協働することを示す。
ＥＲＢＢ２リン酸化は、チロシンキナーゼ阻害剤ＰＤ１５３０３５によって阻害されることが認められ、シグナル伝達におけるＭＡＰＫの役割を示す。
〔実施例Ｆ〕
インビトロにおける乳癌細胞の転移に対するＬＬ−３７の作用
材料及び方法
足場非依存性増殖のアッセイ
本試験は細胞の転移形成能を反映する。細胞は、３００ｕ／ｍｌトリプシン、２０ｕ／ｍｌエラスターゼ、及び１ｍＭＥＤＴＡの混合物で処理して調製する。エラスターゼの存在は、単一細胞懸濁液への細胞の解離を促進する。
１.４％Seaplaqueアガロースを、Optimem（添加物なし）中で７０℃の湯浴にて溶解して、４２℃に冷却し、そして最終濃度の２倍でＦＣＳ及び添加物を含有する予熱培地により１：１で混合する。この混合物の４ｍｌを、底部寒天とするグリッド入り４ｃｍペトリ皿に注いで放置固化させる。
トリプシン処理細胞を細胞濾過器に通し、１,０００細胞／ｍｌの最終濃度で培地（２倍濃縮添加物を含む）に懸濁させる。細胞懸濁液を３７℃に加温して、上記で調製した０.７％アガロース溶液と１：１で混合する。２ｍｌを底部寒天上に層状に載せ、室温で３０分放置して最上層を固化させる。このプレートをインキュベータに入れ、細胞に１００μｌの増殖培地を添加することによって３〜４日毎にフィードした。２週後、培養最上層を０.２％ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット(Sigma)で染色し、直径で１００μＭより大きいコロニーをカウントする。本試験は３重複で行なわれ、２回繰り返される。
添加物：
ＦＣＳ：１〜８％
Fungizone #（アンホテリシンＢ）：０.５μｇ／ｍｌ
ハイグロマイシンＢ（トランスジェニックＭＣＦ７株で行う場合）：１５０μｇ／ｍｌ
ペニシリンＧ／ストレプトマイシン（ＺＲ７５−１株で行う場合）：１％原液(Invitrogen)
ＬＬ−３７：１０μｇ／ｍｌ
ヘレグリン(組換タンパク質、 Upstate)：２ｎｇ／ｍｌ
足場非依存性増殖をアッセイする方法も、Fiucci et al., 2002, Oncogene 21: 2365-2375に記載されている。
結果
結果を図１６に示す。腫瘍原性に対するＬＬ−３７の作用を、軟寒天で乳癌細胞系ＺＲ７５−１のコロニー形成への影響をアッセイすることにより、インビトロで調べた。その作用は、ＦＣＳ及びヘレグリンなど他の因子の存在によって大きく調節された。図１６ａは、２％ＦＣＳでのコロニー数の影響を示す。ヘレグリンの不在下、ＬＬ−３７それ自体はコロニー数を顕著に減少させた。ＬＬ−３７のマイナス効果は、ヘレグリンの存在下で完全に除去されたことから、それらの機能的協力が必要なことが示された。
ＬＬ−３７及びヘレグリンは、軟寒天コロニーの出現に劇的に影響を及ぼした。図１６ｂは、培養１４日後に得られた軟寒天コロニー及びその生細胞染色の代表例を示す。そのままでのＬＬ−３７の曝露は、コロニーの染色が弱く、また出現が低密度であったことから、コロニー密度の強い減少をもたらした。代わりに、特異細胞のコロナが母系クローンの周囲に出現した。ヘレグリンそれ自体は殆ど効果はなかった。ヘレグリン及びＬＬ−３７を併用した場合、母系コロニーが未処理コロニーと同様に染色された。しかしながら、単細胞のＬＬ−３７誘導コロナは維持された。健常母系クローン由来の特異細胞の離脱は、腫瘍からの転移細胞の発生に類似／模倣する。総合すれば、ＬＬ−３７は原発腫瘍の増殖に寄与せずに、その転移誘起能を顕著に活性化すると思われる。ＬＬ−３７の阻害剤は、従って乳癌の転移の発生を低減すると考えられる。転移は、原発腫瘍と違って、通常乳癌の死因となる。
〔実施例Ｇ〕
インビボでの乳癌細胞の転移に対するＬＬ−３７の作用
材料及び方法
ＭＣＦ７派生細胞におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現
細胞系ＭＪ１１１７ [M Egeblad（Int J Cancer 86, 617-625 (2000)参照）により供与された] は、エピソーム発現ベクターからＥＲＢＢ２を発現するＭＣＦ７の派生細胞である。ＭＪ１００５は、空対照ベクターを有する対応する対照株である。これらの細胞系は、Optimem、５〜１０％ＦＣＳ、プラスハイグロマイシンＢ、１５０μｇ／ｍｌで培養された。
ｈＣＡＰ１８(図１７を参照)の発現ベクターの構築のために、１６ｂｐの５′−非翻訳領域を含む全コード配列を含有するイメージクローン３０５７９３１ １９由来のＢｆａ１フラグメントが、ビシストロン性ベクターｐＲＥＳ２−ＥＧＦＰ(BD Biosciences, Bedford, MA)のＳｍａ１部位にサブクローニングされた。この細胞系は、Fugene (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)を用いて標準条件下にトランスフェクトされ、４００ｎｇ／ｍｌのＧ４１８ (Invitrogen, Paisley, UK)を用いて２週間セレクトされた。細胞を、データ解析用のSummit(登録商標)ソフトウェアを用いてMoFlo(登録商標)高速セル・ソーティング・フロー・サイトメーター(DakoCytomation, Fort Collins, CO) によりＥＧＦＰ発現でソートし、ＣＡＰ１８のそれらの発現を免疫ブロット法で定量化した。対照細胞系は、ＥＧＦＰだけを発現するベクターを用いるトランスフェクションにより同様に樹立した。該細胞系は、いずれの選択もない連続培養の数ヶ月中ＣＡＰ１８の安定な発現を維持した。
ＥＧＦＰ及びｈＣＡＰ１８の同時発現は、細胞選択を促進し維持するだけでなく、マウスの実験中に血液及び臓器中の単一転移細胞の検出を可能にする。
ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍原性研究
細胞を、Optimem／１０％ＦＣＳ／ハイグロマイシン１５０μｇ／ｍｌ／Ｇ４１８：４００μｇ／ｍｌで増殖させた。抗生物質を、５０％密集度で回収する２４時間前に除去した。細胞を、５０ミリオン／ｍｌのＰＢＳ／１ｍＭ ＭｇＣｌ2でトリプシン処理し懸濁した。１０ミリオンの細胞（２００μｌ）をマウスの皮下に注射した。ＭＣＦ７細胞は、腫瘍形成にβエストロゲンを必要とする。
デポジットピル（１.７ｍｇ／日）は感染前日にマウスに埋め込まれた。マウスを日毎に観察し、週２回腫瘍形成を触診した。注射部位に触知可能な浸潤が既に注射の１週後に認められたが、およそ４０日後には持続的に増殖する腫瘍が認められた。腫瘍サイズがおよそ１ｃｍ3に達した時点でマウスを屠殺した。全腫瘍は、マウスの注射部位か又は進展部位のいずれも摘出し又は瞬間凍結した。更に、脾臓と肝臓をホモジナイズして、それから０.１７％ＮＨ4Ｃｌで赤血球の溶解及び遠心分離による破片の除去後に、ＦＡＣＳ解析によるＥＧＦＰ発現細胞の存在を解析した。
結果
結果を図１８に示す。
図１８ａは、ＭＣＦ７の派生細胞、対照株ＭＪ１００５ ＩＲＥＳからＳＣＩＤマウスに進展した腫瘍の例を示す。二次性腫瘍、又は肝臓及び脾臓における転移細胞は、これまで対照マウスに認められなかった。図１８ｂは、同じ細胞系におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現の影響を示す。原発腫瘍は、対照株由来よりも攻撃的に増殖しない。しかしながら、二次性腫瘍は複数部位に出現し、中でも原発腫瘍近傍のリンパ節及び反対側腹部、並びに大きな腹部腫瘤に現れる。腹水(図１８ｃ)は、ｈＣＡＰ１８トランスジーンと同時に産生される、緑色蛍光タンパク質を発現する大量の細胞を含んでいた。ｈＣＡＰ１８産生株に感染したＳＣＩＤマウスの３／４は、脾臓及び肝臓への転移腫瘍か又は転移細胞の広がりを示している。これらの観察に基づき、結論すれば、ＬＬ−３７は原発腫瘍由来の転移細胞の生成を引き起こす。従って、ＬＬ−３７の阻害剤は他の部位に広がった癌細胞を抑制すると考えられる。
〔実施例Ｈ〕
ｓｉＲＮＡによる腫瘍及び乳癌細胞中のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の阻害
１．ｓｉＲＮＡによる腫瘍中のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質発現の阻害
ｈＣＡＰ１８ｍＲＮＡに特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による用量依存性の強い阻害は、ＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーン細胞の処理の４８時間後に既に見られたか、さもなければｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質を過剰発現していた。（実施例Ｇにおける、ＭＣＦ７派生細胞におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現のセクションのＭ＆Ｍを参照）。ＨＰＬＣ精製した二重の容易に使用できるネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ、並びに４種のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７特異的ｓｉＲＮＡは、最適化トランスフェクション効率と再現性のためのsiPORT NeoFXトランスフェクション剤を含めて、(Ambion, Austin, USA)から購入した。
Figure 2009535391
全４種のｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰは、非特異作用を最小化するためにカクテルとしてプールし、また同様にネガティブｓｉＲＮＡ−対照用とした。トランスフェクション最適化の指示は、ｓｉＰＯＲＴトランスフェクション剤に添付の詳細プロトコールで与えられている。実験手順は全てメーカー説明書に従って行なわれた。ｓｉＲＮＡの最終濃度は１０ｎＭ、２５ｎＭ又は１００ｎＭであった。処理乳癌細胞の細胞抽出液は、実施例ＣのＭ＆Ｍに記載のように１／２,０００希釈でｈＣＡＰ１８に対する抗体を用いて、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質に対するウェスタンブロットで解析された。増強した化学ルミネセンス（ＥＣＬ）シグナル (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) をＣＣＤカメラ (Fujifilm, Tokyo, Japan)によって捉え、ポンソー染色で正規化後定量化した。結果を図１９に示す。
２．ヒト抗微生物タンパク質ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は、ｈＣＡＰ１８特異的ｓｉＲＮＡによって反転できる乳癌に転移性表現型を誘導する
結果を図２０に示す。
（Ａ）乳癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の過剰発現は、癌細胞により転移性の表現型をもたらす。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７を発現しないＭＣＦ７−ＩＲＥＳトランスジーン対照細胞に比べて、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質を過剰発現するＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーン細胞の転移能を評価するために、Matrigel浸潤アッセイを実施した。（実施例ＧのＭ＆Ｍで、ＭＣＦ７派生細胞内のｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現を参照）。
BioCoat Matrigel Invasion Chamber キット(Becton Dickinson Bioscience, Bedford,MA, USA) を、全てメーカー説明書に従って使用した。Matrigelフィルターへ細胞を移す前に、細胞をＦＣＳなしのＤＭＥＭ (Gibco-BRL) 中で２４時間飢餓させた。細胞使用日に、それらを０.２５％Tryp-EDTA (Invitrogen, cat# 25200-056) でトリプシン処理し、そして５０μlのトリプシン阻害剤及び１００μｌＤＭＥＭを添加することによって停止させた。２２０,０００細胞／ｍｌ細胞の懸濁液のうち２００μｌを、Matrigelでコーティングしたフィルターによりトランスウェル・インサート・チャンバーに播種し、５％ＦＣＳを含む７５０μｌのＤＭＥＭを満たした下方チャンバーに入れた。チャンバーを５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で４８時間インキュベートした。その後、挿入物を除去して、フィルターの上部に残る非浸潤癌細胞を削り落とした。フィルターの下部に浸潤した細胞を染色し、位相差顕微鏡下に観察してカウントした。癌細胞の浸潤能を、フィルターの下部に浸潤した平均細胞数で表わした。試験は３重複で行なった。
（Ｂ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７特異的ｓｉＲＮＡの処理による、乳癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７誘導浸潤性転移性表現型の阻害
腫瘍発現ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の減少を介する癌細胞の転移能を阻害する能力を証明するために、ＲＮＡ干渉を使用した。
ＲＮＡ干渉のために、４種全てのｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰが、非特異作用を最小化するために１０ｎＭのカクテルで併用され、同時にネガティブｓｉＲＮＡ−対照に対して実施された。ＳｉＲＮＡ処理（図１９を参照）を、Matrigel浸潤アッセイを実施する前に、（Ａ）に記載のように４０時間行なった。ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉の結果は、浸潤腫瘍細胞数の減少によって、癌細胞の転移能を阻害する明瞭な能力を証明した。
(詳細は、実施例Ｃ、転写後阻害研究及び浸潤性の誘導セクションをも参照されたい)。
〔実施例Ｉ〕
本発明の薬剤のインビボ産生及び使用
抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７抗体の発現
抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７抗体はＮＳＯ骨髄腫細胞に発現される。
要するに、ＮＳＯ骨髄腫細胞は、融合タンパク質の構成的重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターによるエレクトロポレーションによってコトランスフェクトされる。次いでトランスフェクトーマが選択され、ＥＬＩＳＡアッセイにより抗体産生がスクリーニングされる。
患者への投与
該抗体は水溶性滅菌注射液に製剤化される。
次いで、該製剤は、乳癌罹患患者へ静脈内（ＩＶ）注射により９０分にわたって投与される。
該用量は、医師の決定により、各患者の個々の必要量に従って選択される。しかしながら、通常は、初回投与量として４ｍｇ／ｋｇが使用され、その後２ｍｇ／ｋｇの週１回の維持投与量が使用される。
疾患進行のモニタリング
乳癌進行に対する抗体による治療の影響、次いで特に癌細胞の転移が、従来の走査／ＮＭＲによってモニターされる。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌に高度に発現する。 （ａ）腺管乳癌グレードＩＩＩの切片（患者番号７、表２）は、間質島（ｓｔ）周囲の腫瘍細胞において、ｈＣＡＰ１８タンパク質に対して強い免疫反応性（赤沈降）を呈する。（ｂ）その場（in situ）ハイブリダイゼーションは、同じ組織の切片において、ｈＣＡＰ１８ｍＲＮＡにマッチングするシグナルを示す。強いオートラジオグラフィーシグナルが暗視野照明下に白粒として現われる。（ｃ）癌細胞の高出力観察は、免疫反応性を欠く腫瘍細胞に隣接した免疫反応性細胞を強く示す。（ｄ）血管内のｈＣＡＰ１８免疫反応性乳癌細胞。（ｅ）カテリン組換ペプチドによる免疫吸着は、ｈＣＡＰ１８免疫反応性を完全に停止させた（図１ａと同じ組織）。（ｆ）免疫吸着時の陽性対照としてのｈＣＡＰ１８に対する均一な免疫染色（図１ａと同じ組織）。（ｇ）正常乳腺上皮は、ｈＣＡＰ１８に対して弱い免疫反応性を示す。顕微鏡写真（ａ、ｃ〜ｇ）は、１：５００希釈においてｈＣＡＰ１８抗体で得られた結果を示す。スケールバー（ａ、ｂ）＝１００μｍ；（ｃ、ｄ）＝２５μｍ；（ｅ、ｆ、ｇ）＝１０μｍ。 ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌で免疫ブロット法により検出される。 患者の臨床データを表２に示す（試料１〜１０）。組換カテリン（Ｃ）及びＬＬ−３７ペプチド（Ｌ）をサイズ基準として使用した。正常乳房組織をレーン１に示す。ElstonグレードＩ腫瘍はレーン２，４及び５に示す。グレードＩＩ腫瘍はレーン３に、またグレードＩＩＩ腫瘍はレーン６〜１０に示す。全組織中に、無傷の非処理１８ｋＤａホロタンパク質に相当する免疫反応バンドが認められた。処理したＬＬ−３７ペプチド（４ｋＤ）は、５グレードＩＩＩ腫瘍のうち４つに認められた(番号７〜１０)。 上皮細胞におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現は、細胞増殖を増加させる。 Ａ：上パネル、左レーン；抗ＬＬ−３７抗血清によるＨＥＫ２９３抽出物の免疫ブロット法。ビシストロンベクターｈＣＡＰ１８＋ＥＧＦＰ（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）によるトランスフェクト細胞は、ｈＣＡＰ１８タンパク質発現を示す。上パネル、右レーン；ＥＧＦＰ（Ｅ）のみでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞。下方パネル；ＨＥＫ２９３細胞（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）は、対照細胞（Ｅ）に比べて非常に高い増殖速度（フローサイトメトリーで評価）を示す。ポンソー染色をローディング対照として示す。Ｂ：上パネル、左レーン；Ａに記載のトランスフェクトＨａＣａＴ細胞。下方パネル；ｈＣＡＰ１８トランスフェクトＨａＣａＴ細胞は、対照細胞に比べて非常に高い増殖速度（３Ｈ−チミジン取り込みで評価）を示す。 合成ＬＬ−３７ペプチドによる処置は、上皮細胞の細胞増殖を増加させる。 血清飢餓により７２時間同期化し、次いで１０μｇ／ｍｌの合成の生物活性ＬＬ−３７ペプチドで３６時間処理した（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴ中）ＨａＣａＴ細胞は、非処理(対照)ＨａＣａＴ細胞に比べて細胞増殖の顕著な増加を示す。増殖速度は[3Ｈ]−チミジン取り込みで評価した。 ＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は、乳癌及び正常乳腺上皮に発現する。 Ａ：腫瘍細胞のＦＰＲＬ１受容体に対して顕著な免疫反応性を呈する（赤沈降）、腺管乳癌Elstonグレード２の切片（患者番号１２、表２）。Ｂ：腺管領域のＦＰＲＬ１に対して免疫反応性を呈する正常乳腺上皮の切片（赤沈降）。顕微鏡写真は、１：４００希釈においてＦＰＲＬ１抗血清で得られた結果を示す。スケールバー（Ａ）＝５０μｍ；（Ｂ）＝１０μｍ。 図５−１の続き。 Ｃ：免疫ブロット法は、ＬＬ−３７受容体、ＦＰＲＬ１が、正常（Ｎ）及び乳癌細胞（Ｔ）組織の両方に発現することを示した。Ｄ：ビシストロンベクターｈＣＡＰ１８＋ＥＧＦＰ（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）によりトランスフェクトしたＨａＣａＴは、リアルタイムＰＣＲによりＦＰＲＬ１受容体のｍＲＮＡ発現の顕著な増加を示す。ＨａＣａＴ細胞は、対照として機能するＥＧＦＰ（Ｅ）のみでトランスフェクトした。 エストロゲン受容体（ＥＲ）及びリンパ節(Ｎ)陽性乳房腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現増加（対数目盛りで表示）。 ＲＮＡを１４０の乳房腫瘍及び４非罹患乳房組織試料から抽出し、プライマーとしてのランダムヘキサマーを用いて逆転写した。ｈＣＡＰ１８転写物の発現を、標準プロトコールにより１０ｎｇのｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲによって測定した。試料を１８Ｓ−ＲＮＡの定量化により正規化した。非罹患試料の平均発現を任意に１に設定した。平均と偏差は、分散分析統計によって評価する。 ＬＬ−３７は、ＨＥＫ細胞においてカンプトテシン誘導アポトーシスを阻害する。 Ａ. 半密集度細胞を２４時間異なる濃度のＬＬ−３７（１、２及び４μＭ）で処理した。培地単独で処理した細胞は、対照細胞として使用した（ａ）。次いで、該細胞を６μＭのカンプトテシンの不在下（ａ〜ｄ）又は存在下（ｅ〜ｈ）に２４時間更に培養した。回収した細胞を２色アポトーシス分析及びフローサイトメトリーにかけて、そして蛍光強度に合致する四分円解析によって、生存性（蛍光なしか少ない）、アポトーシス性（ＦＬ−１ ＹＯＰＲＯ色素に陽性）及び壊死性（ＦＬ−１及びＰＩ蛍光に陽性）に分類した。図は、各々３重複で行なった３つの独立した実験の代表例を示す。 ＬＬ−３７は、ＨａＣａＴ細胞においてカンプトテシン誘導アポトーシスを阻害する。 Ｂ. アポトーシス細胞の定量分析。 ＬＬ−３７によるＨＥＫｎ細胞の前処理がカンプトテシン誘導アポトーシスから保護するということを示す、ＨＥＫｎ細胞のフローサイトメトリー解析。 １又は２μＭのＬＬ−３７で２４時間処理した細胞（ｂ、ｃ、ｅ、ｆ）及び未処理細胞（ａ、ｄ）を、２４時間カンプトテシン処理（ｄ〜ｆ）によりアポトーシスを受けるように誘導した。次いで細胞をフローサイトメトリーによって解析し、非アポトーシス（２Ｎ〜４Ｎ）及びアポトーシス集団（サブ２Ｎ）を検出した。グラフは、各々３重複で行なった３つの実験の代表的結果である。 ＬＬ−３７は、ＨＥＫｎ細胞におけるカスパーゼ−３のカンプトテシン活性化を低下させる。 細胞をＬＬ−３７及びカンプトテシンの存在下又は不在下に培養し、次いで回収してＶＤＶＡＤ−ＡＭＣのインビトロ加水分解によりカスパーゼ−３活性を解析した。カンプトテシンとの２４時間の培養により誘導されたカスパーゼの活性化は、ＬＬ−３７による細胞の処理により低下した。数値は、各々３重複で行なった３つの異なる実験の平均である。 ＬＬ−３７処理はＩＡＰ２の発現を増加させる。 ＨＥＫｎ細胞を２μＭのＬＬ−３７で処理し、刺激後の異なる時点で回収した。これらの細胞由来のＲＮＡを逆転写し、ＩＡＰ−２の発現をリアルタイムＰＣＲによって測定した。各時点でのＩＡＰ−２の転写レベルを１８Ｓ−ＲＮＡに対して正規化し、そして未処理細胞と比較して示す（対照は各時点で１と設定した）。 ＬＬ−３７は、ＨＥＫ細胞におけるプロスタグランジン・エンドペルオキシド・シンターゼ−２（ＣＯＸ−２）発現を増加させる。 ＨＥＫｎ細胞を２μＭのＬＬ−３７で処理し、刺激後６、１２及び２４時間で回収した。未処理細胞を各時点の対照として使用した（ライトグレーカラム）。これらの細胞由来のＲＮＡを逆転写化し、対照に対するＣＯＸ−２の相対発現を上記のようにｑＰＣＲによって測定した。 ＣＯＸ−２阻害は、ＬＬ−３７で誘導したＩＡＰ−２の増加を抑制する。 ＨＥＫｎ細胞を特異的ＣＯＸ−２阻害剤ＳＣ−７９１（２５ｎＭ）の有り又は無しの条件下で処理し、更にＬＬ−３７（２μＭ）の有り又は無しの条件下で６時間インキュベートした。ＩＡＰ−２−ｍＲＮＡ遺伝子のレベルをＲＴ−ＰＣＲによって解析し、未処理対照試料と比較して表示する。 ＬＬ−３７は、ヘレグリンを介するＥＧＦＲシグナル伝達システムの活性化を賦活化する。 乳癌系ＺＲ７５−１の抽出物を、図のようにリン酸化タンパク質に対するウェスタンブロット分析によって解析した。 ウェスタンブロット分析によるＥＲＢＢ２リン酸化（Ｔｙｒ−１２４８）の定量化。 化学ルミネセンス・シグナルをポンソー染色に対して正規化した後、定量化した。 ＬＬ−３７は、ＥＧＦＲファミリーを介してＭＡＰＫを活性化する。 ＬＬ−３７はＥＧＦＲファミリーを介してＭＡＰＫを活性化し、その活性化はチロシンキナーゼ阻害剤ＰＤ１５３０３５によって完全にブロックできる。完全阻害に必要な濃度は２.５μＭであり、これはＥＧＦＲに要するよりも高いが、ＥＲＢＢ２の活性をブロックする必要がある。 ＬＬ−３７は、乳癌細胞の足場非依存性増殖の表現型変化を誘導する。 ＬＬ−３７の腫瘍形成能を、乳癌系ＺＲ７５−１を用いてコロニー形成検定法で調べた。低血清濃度で、ＬＬ−３７はそのままでコロニーの数を減少させたが、ＬＬ−３７とヘレグリンの組合せはコロニーの数を増加させた。 ＬＬ−３７は、乳癌細胞の足場非依存性増殖の表現型変化を誘導する。 より劇的なのは表現型の変化であった。ＬＬ−３７の存在下、コロニーのコンパックト構造が破壊され、単数細胞サテライトが現れた。ヘレグリンはコロニーの密度を回復させたが、しかし、ＬＬ−３７が存在した場合、単数細胞のエスケープを禁止しなかった。 ｈＣＡＰ１８の発現ベクターの構築。 ｈＣＡＰ１８の発現ベクターの構築のために、５′−非翻訳領域の１６ｂｐを含む全コード配列を含有するイメージクローン３０５７９３１−１９のＢｆａ１フラグメントが、ビシストロンベクターｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰのＳｍａｌ部位にサブクローニングされた(BD Biosciences, Bedford, MA)。 インビボでの二次性腫瘍の形成 親ＭＣＦ７を注射したＳＣＩＤマウスにおける原発腫瘍。 多発転移によるＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーンを注射したＳＣＩＤマウス。 ｈＣＡＰ１８でトランスフェクトしそれを過剰発現する乳癌細胞を注射した、ＳＣＩＤマウスから回収したトランスフェクト腹水細胞におけるＬＬ−３７の発現。ＭＣＦ７腹水細胞におけるｈＣＡＰ１８の活性転写（上図）が、マーカー、緑色発光タンパク質の共発現により確認された（下図）。 ｓｉＲＮＡによる腫瘍中のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質発現の阻害。 ｈＣＡＰ１８ｍＲＮＡに特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による用量依存性の強い阻害は、既にＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーン細胞の処理の４８時間後に既に見られたか、さもなければｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質を過剰発現していた（実施例Ｇにおける、ＭＣＦ７派生細胞におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現のセクションのＭ＆Ｍを参照）。ＨＰＬＣ精製した二重の容易に使用できるネガティブコントロールのｓｉＲＮＡおよび４つのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７特異的ｓｉＲＮＡは、最適化トランスフェクション効率と再現性のためのｓｉＰＯＲＴ ＮｅｏＦＸトランスフェクション剤を含めて、(Ambion, Austin, USA)から購入した。 ４つのｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰ（ｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰ１−４；実施例Ｈに記載）を全て、非特定的効果を最小化するためにカクテルとしてプール化し、同様にネガティブｓｉＲＮＡ−対照とした。トランスフェクション最適化の指示は、ｓｉＰＯＲＴトランスフェクション剤に添付された詳細プロトコールにて与えられている。実験操作は全てメーカーの説明書に準じて行なわれた。ｓｉＲＮＡの最終濃度は、１０ｎＭ、２５ｎＭ又は１００ｎＭであった。処理した乳癌細胞の細胞抽出物は、Ｍ＆Ｍ、実施例Ｃに記載のように、１／２,０００希釈でｈＣＡＰ１８に対する抗体を用いて、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質のウェスタンブロットで解析した。増強した化学ルミネセンス（ＥＣＬ）シグナル(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) は、ＣＣＤカメラ(Fujifilm, Tokyo, Japan) で捕捉され、ポンソー染色に対して正規化した後に定量化した。 ヒト抗微生物タンパク質ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は、ｈＣＡＰ１８特異的ｓｉＲＮＡによって反転できる乳癌の転移性表現型を誘導する。 （Ａ）乳癌細胞中のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の過剰発現は、癌細胞において多くの転移性表現型を導く。 Matrigel 浸潤アッセイを実施し、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７非発現ＭＣＦ７−ＩＲＥＳトランスジーン対照細胞に比べて、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質を過剰発現するＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーン細胞の転移能を評価した。（実施例Ｇにおける、ＭＣＦ７派生細胞中のｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現のＭ＆Ｍを参照）。 BioCoat Matrigel Invasion Chamber キット(Becton Dickinson Bioscience, Bedford, MA, USA)は、全てメーカー説明書に準じて使用した。細胞のMatrigelフィルターへの移動前に、細胞をＦＣＳなしでＤＭＥＭ(Gibco-BRL)中で２４時間飢餓させた。細胞を使用した日にそれらを０.２５％Tryp−ＥＤＴＡ(Invitrogen, cat# 25200-056)でトリプシン処理し、５０μｌのトリプシン阻害剤及び１００μｌのＤＭＥＭを添加することによって停止させた。２２０,０００細胞／ｍｌの細胞懸濁液のうち２００μｌを、Matrigelでコーティングしたフィルター付きのトランスウェル・インサート・チャンバーに播種し、そして５％ＦＣＳ含有の７５０μｌのＤＭＥＭで満たした下位チャンバーに置いた。チャンバーを５％ＣＯ2雰囲気下３７℃で４８時間インキュベートした。その後挿入物を除去し、フィルターの上部に残った非浸潤癌細胞を削り落とした。フィルターの下部に浸潤していた細胞を染色し、位相差顕微鏡下に観察し計数した。癌細胞の浸潤能は、フィルターの下部に浸潤した細胞の平均数として表現した。その試験は３重複で行なった。 （Ｂ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の阻害は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７特異的ｓｉＲＮＡによる処理で乳癌細胞中に浸潤性転移性表現型を誘導した。 発現した腫瘍の減少を介する癌細胞の転移能を阻害する能力を証明するために、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７ＲＮＡ干渉が用いられた。 ＲＮＡ干渉に対して、４つのｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰを全て、非特異作用を最小化するために１０ｎＭのカクテルとして同時使用し、そして同様にネガティブｓｉＲＮＡ対照とした。ｓｉＲＮＡ処理(図１９を参照)を、（Ａ）に記載のMatrigel 浸潤アッセイを行なう前に４０時間実施した。ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉は、浸潤腫瘍細胞の数の減少により癌細胞の転移能を阻害する明らかな能力を示した。（詳細は、実施例Ｃ、転写後阻害試験及び浸潤性の誘導セクションを参照）。

Claims (51)

  1. 癌細胞の転移を阻害する薬剤であって、該薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する薬剤。
  2. 薬剤が、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写、翻訳、切断及び／又は結合特性を変化させることによってｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する、請求項１に記載の薬剤。
  3. 薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写の阻害剤である、請求項１又は２に記載の薬剤。
  4. 薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の翻訳の阻害剤である、請求項１又は２に記載の薬剤。
  5. 薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の結合特性の阻害剤である、請求項１又は２に記載の薬剤。
  6. 薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体アンタゴニストである、請求項１に記載の薬剤。
  7. ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体がＦＰＲファミリーのメンバーである、請求項６に記載の薬剤。
  8. 薬剤が、癌細胞においてｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を選択的に阻害することができる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤。
  9. 薬剤に曝露されていない癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性に比べて、該薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を５０％又はそれ以上阻害することができる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤。
  10. 薬剤が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対して結合親和性を有する化合物、及び小分子阻害化合物から成る群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤。
  11. 薬剤が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬剤。
  12. ｓｉＲＮＡ分子が配列番号１のヌクレオチド配列のフラグメント又はその変異体を含む、請求項１１に記載の薬剤。
  13. ｓｉＲＮＡ分子が１９〜２３ヌクレオチドの長さである、請求項１１又は１２に記載の薬剤。
  14. 薬剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬剤。
  15. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチドのフラグメント又はその変異体を含む、請求項１４に記載の薬剤。
  16. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１５〜３５ヌクレオチドの長さである、請求項１４又は１５に記載の薬剤。
  17. 薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対して結合親和性を有する化合物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬剤。
  18. 薬剤が小分子阻害化合物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬剤。
  19. 化合物がポリペプチドである、請求項１７に記載の薬剤。
  20. ポリペプチドが抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１９に記載の薬剤。
  21. 抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ様フラグメント、単一可変ドメイン及びドメイン抗体から成る群から選択される、請求項２０に記載の薬剤。
  22. 抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト化されている、請求項２０又は２１に記載の薬剤。
  23. 化合物がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対してリガンド結合能を有する、請求項１７に記載の薬剤。
  24. 薬剤が選択的に癌細胞に送達され又は選択的に癌細胞によって活性化され得る、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の薬剤。
  25. 薬剤が標的細胞特異的部位を含む、請求項２４に記載の薬剤。
  26. 標的細胞特異的部位が抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項２５に記載の薬剤。
  27. 抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト化されている、請求項２６に記載の薬剤。
  28. 抗体又はその抗原結合フラグメントが癌細胞の表面に発現した抗原に対して特異性を有する、請求項２６又は２７に記載の薬剤。
  29. 癌細胞の表面に発現する抗原が、Ｃ４６、８５Ａ１２、Ｈ１７Ｅ２、ＮＲ−ＬＵ−１０、ＨＭＦＧ１、ＳＭ−３（ＩｇＧ１）、Ｗ１４、Ｌ６（ＩｇＧ２ａ）、１Ｆ５（ＩｇＧ２ａ）、アルファフェトプロテイン、Ｃａ−１２５、前立腺特異抗原及び上皮増殖因子受容体ファミリーのメンバーから成る群から選択される、請求項２８に記載の薬剤。
  30. 薬剤が癌細胞によって選択的に活性化されたプロドラッグである、請求項２４に記載の薬剤。
  31. 癌細胞が上皮細胞である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の薬剤。
  32. 癌細胞が扁平上皮細胞である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の薬剤。
  33. 癌細胞が、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器官、肺と気道、皮膚、胆嚢、肝臓、鼻咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺及び胃腸管の癌細胞から成る群から選択される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の薬剤。
  34. 癌細胞が乳癌細胞である、請求項３３に記載の薬剤。
  35. 乳癌細胞がElstonグレードＩＩＩ細胞である、請求項３４に記載の薬剤。
  36. 乳癌細胞が転移性である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の薬剤。
  37. 請求項１〜３６のいずれか１項に記載の薬剤、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む医薬組成物。
  38. 非経口投与に適切な、請求項３７に記載の医薬組成物。
  39. 製剤が癌細胞への薬剤の標的化送達を可能にする、請求項３７又は３８に記載の医薬組成物。
  40. 患者の癌細胞の転移を阻害する方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の薬剤、又は請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の医薬製剤を患者に投与することを含む方法。
  41. 患者がヒトである、請求項４０に記載の方法。
  42. 薬剤が癌細胞に選択的に送達されるか又は癌細胞によって選択的に活性化される、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 医薬に使用するための、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の薬剤。
  44. 癌の治療に使用するための、請求項４３に記載の薬剤。
  45. 癌細胞の転移を阻害する治療薬の製造における、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の薬剤の使用。
  46. 癌細胞が上皮細胞である、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法又は請求項４５に記載の使用。
  47. 癌細胞が扁平上皮細胞である、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法又は請求項４５に記載の使用。
  48. 癌細胞が、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器官、肺と気道、皮膚、胆嚢、肝臓、鼻咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺及び胃腸管の癌細胞から成る群から選択される、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法又は請求項４５に記載の使用。
  49. 癌細胞が乳癌細胞である、請求項４８に記載の方法又は使用。
  50. 乳癌細胞がElstonグレードＩＩＩ細胞である、請求項４９に記載の方法又は使用。
  51. 乳癌細胞が転移性である、請求項４９又は５０に記載の方法又は使用。
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