PL178438B1 - Preparat dwuwarstwy lipidowej, środek farmaceutyczny zawierający preparat dwuwarstwy lipidowej i sposób wytwarzania środka farmaceutycznego - Google Patents

Abstract

1. Preparat dwuwarstwy lipidowej zawierajacy lipidy i polarny rozpuszczalnik, o za- wartosci materialu tworzacego dwuwarstwe lipidowa wynoszacej 0,01-90% wagowych, ko- rzystnie 0,1-50%, w polarnym rozpuszczalniku, stanowiacy nosnik substancji czynnej do stosowania zwlaszcza w srodkach farmaceutycznych, znamienny tym, ze jako material tworzacy dwuwarstwe lipidowa zawiera material galaktolipidowy ze zbóz zawierajacy co najmniej 50% digalaktozylodiacylogliceryn i inne polarne lipidy jako reszte. 4. Srodek farmaceutyczny zawierajacy preparat dwuwarstwy lipidowej zawierajacy li- pidy i polarny rozpuszczalnik, o zawartosci materialu tworzacego dwuwarstwe lipidowa wy- noszacej 0,01-90% wagowych, korzystnie 0,1-50%, w polarnym rozpuszczalniku, substancje czynna i ewentualnie srodek izotoniczny, znamienny tym, ze jako material tworzacy dwuwa- rstwe lipidowa zawiera material galaktolipidowy ze zbóz zawierajacy co najmniej 50% digalaktozylodiacylogliceryn i inne polarne lipidy jako reszte. 9. Sposób wytwarzania srodka farmaceutycznego zawierajacego preparat dwuwar- stwy lipidowej zawierajacy lipidy i polarny rozpuszczalnik, o zawartosci materialu tworzacego dwuwarstwe lipidowa wynoszacej 0,01-90% wagowych, korzystnie 0,1-50%, w polarnym rozpuszczalniku, substancje czynna i ewentualnie srodek izotoniczny, droga mie- szania skladników, znamienny tym, ze jako material tworzacy dwuwarstwe lipidowa stosuje sie material galaktolipidowy ze zbóz zawierajacy co najmniej 50% digalaktozylodiacylo- gliceryn i inne polarne lipidy jako reszte. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są preparat dwuwarstwy lipidowej, środek farmaceutyczny zawierający preparat dwuwarstwy lipidowej i sposób wytwarzania środka farmaceutycznego. Preparat zawiera lipidy w polarnym rozpuszczalniku i nadaje się do stosowania jako nośnik substancji czynnej w środkach farmaceutycznych, a także w produktach odżywczych, kosmetycznych, spożywczych i rolniczych.

Naturalne amfifilowe lipidowe zarobki są stosowane do wytwarzania środków farmaceutycznych i kosmetycznych jedynie w ograniczonym zakresie. Powodem tego jest w wielu przypadkach brak odpowiedniego surowca oraz wysokie koszty produkcji, a także niezadowalające właściwości użytkowe gotowego materiału lipidowego.

Spośród naturalnych polarnych lipidów dwuwarstwy lipidowej, czyli lipidów amfifilowych, najczęściej stosuje się w produktach farmaceutycznych i kosmetycznych fosfolipidy. Dzięki zdolności tworzenia dwuwarstwy te polarne lipidy można stosować do wytwarzania różnego rodzaju agregatów i cząstek, takich jak pęcherzyki i ciekłe kryształy, które znajdują wiele zastosowań technicznych.

Jednakże zastosowanie żeli lipidowych opartych na fosfolipidach do wytwarzania farmaceutyków jest ograniczone, głównie ze względu na niezadowalającą zdolność do tworzenia żelu oraz słabą trwałość chemiczną. Głównie stosowany dotychczas naturalny, polarny lipid tworzący··, dwuwarstwę, fosfatydylocholina z żółtek jaj lub soi, jest nieco zbyt lipofilowa, aby mogła być 'optymalnie spęczniana przez wodę i tworzyć elastyczne warstwy podwójne, które tworzą ciekłokrystaliczne struktury blaszkowe.

Liposomy stanowią dyspersję dwuwarstw lub faz blaszkowych w nadmiarze roztworu wodnego, toteż stosowanie faz blaszkowych opartych na fosfolipidach do wytwarzania liposomów nie jest optymalne. Spęcznianie przebiega powoli, a często konieczne jest użycie dużej ilości energii mechanicznej jeśli pragnie się uzyskać liposomy i pęcherzyki z materiału fosfolipidowego w rozsądnym okresie czasu.

Naturalne fosfolipidy, takie jak fosfatydylocholina z żółtek jaj, są wysoce nienasycone. Nienasycenie łańcuchów acylowych w fosfolipidziejest niezbędne, aby powstała ciekłokrystaliczna faza blaszkowa w temperaturze pokojowej. Oznacza to jednak również, że błony dwuwarstwowe tworzone przez naturalne fosfolipidy wykazują wysoką przepuszczalność dla leków rozpuszczalnych w wodzie, gdyż łańcuchy acylowe znajdują się w nieuporządkowanym, ciekłym stanie. Zatem liposomy wytworzone z naturalnych fosfolipidów charakteryzują się niską skutecznością kapsułkowania ze względu na przenikanie wprowadzonych do nich leków przez dwuwarstwę liposomu warstwy podwójnej. Normalnie przy wprowadzaniu 'leków do naturalnych liposomów fosfolipidowych konieczne jest ich stabilizowanie przez dodawanie dużych ilości cholesterolu, 30-50% molowych w przeliczeniu na całość kompozycji lipidowej.

Odnosi się to również do substancji czynnych innych niż leki, które z pewnych względów trzeba wprowadzić do liposomów lub innych struktur dwuwarstwowych.

Pęcherzyki i liposomy oparte na fosfolipidach zazwyczaj wykazują bardzo krótki czas trwania po wprowadzeniu do krwioobiegu. Szybki klirens z krwi jest spowodowany ich wchłanianiem przez układ siateczkowo-śródbłonkowy (RES) wątroby i śledziony. Aby tego uniknąć można stabilizować liposomy sterycznie, dodając gangliozydów zawierających kilka grup węglowodanowych, albo hydrofitowych polimerów, takich jak politlenek etylenu lub pululan (polisacharyd). Te ostatnie środki są zazwyczaj kowalencyjnie związane z fosfatydyloetanoloaminą. W zasadzie takie rozwiązanie jest bardzo skuteczne i modyfikowane liposomy mogą uniknąć wychwycenia przez RES. W praktyce, ze względu na bezpieczeństwo i koszty, jest jednak niekorzystne wprowadzanie do kompozycji liposomowej dodatkowych składników, naturalnych i rzadkich, a więc drogich, albo syntetycznych, a więc nie zawsze biokompatybilnych.

Zastosowanie fosfolipidów i innych polarnych lipidów do wytwarzania ciekłych kryształów i liposomów jest dobrze znane.

W EP-B1-0 126 751 ujawniono kompozycję o regulowanym uwalnianiu substancji czynnej, która to kompozycja może zawierać substancję amfifilową takąjak galaktolipidy, fosfolipi4

178 438 dy i monoglicerydy. Wspomniany opis patentowy dotyczy regularnych i odwrotnych heksagonalnych faz ciekłokrystalicznych, trwałych w rozcieńczonym roztworze wodnym.

W WO 91/11993 ujawniono alkoholowo-wodną kompozycję fosfolipidową typu żelu. Jako alkohol zawiera ona etanol, 1-propanol lub 2-propanol. Zawartość fosfolipidu wynosi 15-30% wagowych. Ujawniono również zastosowanie kompozycji fosfolipidowej do wytwarzania liposomów drogą rozcieńczania wodnym roztworem, a także preparaty do stosowania miejscowego zawierające taki żel.

W WO 91/04013 ujawniono hybrydowe kilkublaszkowe pęcherzyki lipidowe zawierające fosfo- lub glikolipid oraz niejonowy, anionowy lub amfoteryczny środek powierzchniowo czynny w dwuwarstwach lipidowych. Do korzystnych glikolipidów należą cerebrozydy, gangliozydy i sulfatydy, wszystkie należące do grupy glikosfingolipidów.

Glikozyloglicerydy to typ glikolipidów stanowiących dobrze znane składniki błon komórek roślinnych. Bardzo rozpowszechnione są dwa typy oparte na galaktozie, monogalaktozylodiacylogliceryna, MGDG, oraz digalaktozylodiacylogliceryna, DGDG, stanowiące do 40% suchej masy błon tylakoidowych.

Glikolipidy roślinne zawierają ugrupowania węglowodanu, głównie galaktozy, połączone z gliceryną. W MGDG pierścień galaktozy jest połączony przez pozycję 1 wiązaniem β z gliceryną natomiast w DGDG występuje wiązanie a,l->6 pomiędzy cukrami. Składnikiem występującym w mniejszej ilości jest sulfolipid roślinny, właściwiej określany jako sulfochinowozylodiacylogliceryna, SQDG, zawierający zamiast grupy hydroksylowej grupę suIfonianowąpołączonąz węglem 6 końcowego ugrupowania dezoksyglukozy. Większość glikolipidów roślinnych można przedstawić ogólnym wzorem

Rj-O—CHj

R.-O-CH

L ąc-

n w którym R, i R₂ niezależnie oznaczają grupy acylowe pochodzące z nasyconych lub nienasyconych kwasów tłuszczowych o 2-24 atomach węgla i 0-6 wiązaniach podwójnych oraz zestryfikowanych hydroksykwasów, czyli estolidów, albo atom wodoru, węglowodan oznacza ugrupowanie monocukru, η = 1 - 5, a R₃ oznacza grupę hydroksylową lub sulfonianową

Wiadomo, że lipidy ze zbóż mogą oddziaływać z wodą dzięki stosunkowo wysokiemu udziałowi składników polarnych tworzących blaszkową fazę ciekłokrystaliczną (G. Jayasinghe i inni, J. Disp. Sci. Technol., 1991, 12,443-451).

W SE 9400368-8 ujawniono możliwy do zastosowania w przemyśle sposób wytwarzania materiału glikolipidowego z roślin, korzystnie ze zbóż, przez ekstrakcję i rozdzielanie chromatograficzne. Wytworzony w ten sposób materiał glikolipidowy można stosować jako amfiflilowy materiał w produktach farmaceutycznych, kosmetycznych i spożywczych.

W badaniach nad oddziaływaniem glikozyloglicerydów z wodą i innymi polarnymi rozpuszczalnikami nieoczekiwanie stwierdzono, że określone materiały glikolipidowe ze zbóż wykazują szczególne właściwości, dzięki którym te materiały lipidowe można z łatwością stosować jako nośniki w środkach farmaceutycznych, a także w innych produktach, takich jak produkty kosmetyczne, rolnicze, odżywcze i spożywcze.

Zgodny z wynalazkiem preparat dwuwarstwy lipidowej zawierający lipidy i polarny rozpuszczalnik, zawiera 0,01-90% wagowych, korzystnie 0,1-50%, materiału tworzącego dwuwarstwę lipidową w polarnym rozpuszczalniku, stanowiący nośnik substancji czynnej do stosowania zwłaszcza w środkach farmaceutycznych, a cechą tego preparatu jest to, że jako materiał tworzący dwuwarstwę lipidową zawiera materiał galaktolipidowy ze zbóż zawierający co najmniej 50% digalaktozylodiacylogliceryn i inne polarne lipidy jako resztę.

178 438

Korzystny preparat zawiera materiał galaktolipidowy zawierający około 70-80% digalaktozylodiacylogliceryn i 20-30% innych polarnych lipidów, a nawet do 100% digalaktozylodiacylogliceryn.

Środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera preparat dwuwarstwy lipidowej zawierający lipidy i polarny rozpuszczalnik, o zawartości materiału tworzącego dwuwarstwę lipidową wynoszącej 0,01-90% wagowych, korzystnie 0,1-50%, w polarnym rozpuszczalniku, substancję czynną i ewentualnie środek izotoniczny, a cechą tego środka jest to, jako materiał tworzący dwuwarstwę lipidową zawiera materiał galaktolipidowy ze zbóż zawierający co najmniej 50% digalaktozylodiacylogliceryn i inne polarne lipidy jako resztę.

Korzystny środek farmaceutyczny zawiera korzystny preparat określony powyżej.

Korzystnie środek farmaceutyczny zawiera 1-50% wagowych, a zwłaszcza poniżej 25% wagowych, materiału galaktolipidowego w przeliczeniu na masę tego środka.

Sposób wytwarzania wyżej określonego środka farmaceutycznego polega na mieszaniu składników, a jego cechąjest to, że jako materiał tworzący dwuwarstwę lipidową stosuje się materiał galaktolipidowy ze zbóż zawierający co najmniej 50% digalaktozylodiacylogliceryn i inne polarne lipidy jako resztę.

Korzystnie stosuje się materiał galaktolipidowy w ilości potrzebnej do wytworzenia korzystnego preparatu i środka farmaceutycznego określonych powyżej.

Digalaktozylodiacylogliceryny można przedstawić ogólnym wzorem

Rj-O-CH, —O—CH

--O—ugrupowanie galaktozy—CH;— w którym R i R₂ niezależnie oznaczają grupy acylowe pochodzące z nasyconych lub nienasyconych kwasów tłuszczowych o 10-22 atomach węgla i 0-4 wiązaniach podwójnych albo atom wodoru, a R3 oznacza grupę hydroksylową lub sulfonianową.

Jako korzystne przykłady grup Rj i R₂ można wymienić grupy acylowe pochodzące z kwasów tłuszczowych występujących w przyrodzie, takie jak grupy pochodzące z kwasów nasyconych, palmitynowego (0,¾ CO); 16:0) i stearynowego (C₁₇H3₅CO; 18:0) od mononienasyconego kwasu oleinowego (^T^CO; 18:1) oraz od wielonienasyconego kwasu linolowego (C₁₇H₃₁CO; 18:2) i linolenowego (C1₇H₂₉CO; 18:3). Takie grupy acylowe mogąrównież stanowić połączone z ugrupowaniem gliceryny grupy acylowe pochodizące z hydroksykwasów, których grupy hydroksylowe są zestryfikowane innymi kwasami tłuszczowymi, czyli ugrupowania tak zwanych estolidów.

Inne polarne lipidy wchodzące w skład materiału galaktolipidowego stanowią mieszaninę różnych gliko- i fosfolipidów, takich jak MGDG i fosfatydylocholiny. Skład zależy od wyjściowego materiału i od sposobu wytwarzania galaktolipidów.

Konkretne proporcje składników materiału galaktolipidowego nie mają większego znaczenia dla niniejszego wynalazku, o ile zawartość DGDG wynosi co najmniej 50%. Jednakże w wielu zastosowaniach maksymalne korzyści uzyskuje się przy wysokiej zawartości DGDG, najważniejszego składnika tworzącego warstwę podwójną.

Materiał galaktolipidowy można wyekstrahować z dowolnego materiału roślinnego. Do korzystnych materiałów roślinnych należą nasiona i ziarna zbóż i roślin zbożowych, np. pszenicy, żyta, owsa, kukurydzy, ryżu, prosa i sezamu. Kasza owsiana oraz gluten pszeniczny zawierają duże ilości lipidów i z tego względu są korzystnie stosowane w procesie wytwarzania. Digalaktozylodiacylogliceryny w materiale galaktolipidowym mogą również, gdy jest to potrzebne, być pochodzenia syntetycznego.

178 438

Materiał galaktolipidowy można stosować jako polarny składnik lipidowy w różnie zorganizowanych roztworach, w których lipid tworzy zorganizowane cząstki zdyspergowane w rozcieńczonym, uśrednionym roztworze, np. w wodzie, etanolu, glicerynie i innych polarnych rozpuszczalnikach, albo w ich mieszaninach. Pod względem geometrycznym cząsteczka DGDG przypomina stożek ścięty, co stwarza możliwość tworzenia elastycznych warstw podwójnych, to znaczy blaszkowych faz ciekłokrystalicznych, oraz liposomów lub pęcherzyków, w roztworach wodnych w warunkach fizjologicznych.

Galaktolipidy pęczniejąc mogą przyjmować duże ilości polarnego rozpuszczalnika, takiego jak woda. Dodatek wody do galaktolipidów prowadzi do samorzutnego tworzenia się klarownego, lepkiego żelu. Żel zawiera blaszkową fazę ciekłokrystaliczną La, w której strukturę blaszkową tworzą dwuwarstwy lipidowe na przemian z wodą. Faza La, łatwo wykrywalna w polaryzacyjnym mikroskopie optycznym, jest termodynamicznie trwała.

Pęcznienie przebiega stosunkowo powoli ze względu na wysoką lepkość blaszkowej struktury krystalicznej żelu; można jednak wytworzyć klarowne, jednorodne próbki w postaci roztworu zawierającego zaledwie 10% wagowych wodnego roztworu przez powolne mieszanie w ciągu 24 godzin. Wytworzony żeljest wyjątkowo odporny na rozkład chemiczny i mikrobiologiczny, a więc zachowuje jednorodność fizyczną przez długi okres czasu.

Istnienie naprzemiennych warstw galaktozyloacylogliceryn i polarnego rozpuszczalnika powoduje, że do struktury żelu można wprowadzić zarówno lipofilowe, jak i hydrofitowe substancje biologicznie czynne. Struktura blaszkowa ma stosunkowo niską lepkość przy wysokich szybkościach ścinania, co umożliwia wstrzykiwanie żelu za pomocą strzykawki z cienką igłą. Preparat można stosować do wprowadzania leków w różne miejsca organizmów ludzi i zwierząt.

Do polarnych rozpuszczalników korzystnie należą te, które sąbiokompatybilne i sprawdzone w stosowaniu w środkach farmaceutycznych, kosmetycznych lub spożywczych, takie jak woda, etanol, 1-propanol, 1,2-propanodiol, gliceryna i ich mieszaniny.

Korzystnąpostaciąpreparatu według wynalazkujest preparat żelowy zawierający 25-90% wagowych materiału galaktolipidowego w polarnym rozpuszczalniku.

Żele łatwo wytwarza się dodając polarny rozpuszczalnik taki jak woda lub wodny roztwór, do suchego materiału galaktolipidowego do uzyskania końcowego stężenia lipidu w zakresie 25-90% wagowych. Mieszaniny pozostawia się do spęcznienia na 1-24 godziny w temperaturze pokojowej, w trakcie łagodnego mieszania, w odpowiednim pojemniku, np. w szklanej kolbie lub odkrytej zlewce. Żele można także wytwarzać w probówkach szklanych przez mieszanie pręcikiem i odwirowanie w temperaturze pokojowej.

Żele sąpseudoplastyczne i bardzo trwałe pod względem wyglądu fizycznego i odporności mikrobiologicznej. Na lepkości żeli umiarkowane zmiany temperatury nie wpływają znacząco, tak że można je przenosić bezpośrednio z lodówki do strzykawki lub innego urządzenia do podawania.

Preparaty według wynalazku w postaci żelu mogą działać jako ośrodki o regulowanym uwalnianiu wprowadzonych składników aktywnych, skuteczniejsze niż żele wytworzone z fosfolipidów

Do takich żeli można wprowadzać wiele różnych składników terapeutycznie czynnych, takich jak składniki lipofilowe, chlorowodorki, azotany, związki amfifilowe, białka i peptydy.

Inną korzystną postacią preparatu według wynalazku jest preparat liposomowy zawierający 0,01-25% wagowych materiału galaktolipidowego w polarnym rozpuszczalniku.

Korzystnącechąwłaściwągalatkozyloacyloglicerynomjest obecność ugrupowań galaktozy stanowiących polarną głowę każdej cząsteczki lipidowej, która może sterycznie stabilizować liposomy, zapewniając w ten sposób zwiększony czas trwania po wstrzyknięciu do krwioobiegu.

Liposomy, będące wieloblaszkowymi pęcherzykami, wytwarza się przez bezpośrednie uwodnienie. Polarny rozpuszczalnik, taki jak woda lub roztwór wodny, dodaje się do suchego materiału galaktolipidowego do uzyskania końcowego stężenia lipidu w zakresie 0,01-25% wagowych. Mieszaniny pozostawia się do spęcznienia i dojścia do równowagi w temperaturze pokojowej na 1-24 godziny w trakcie łagodnego mieszania i otrzymuje się dyspersję liposomową.

Liposomy można także wytworzyć dodając nadmiar polarnego rozpuszczalnika do żelu uzyskanego w sposób opisany powyżej, czyli po prostu przez rozcieńczanie żelu wodą.

Jednoblaszkowe pęcherzyki wytwarza się z dyspersji wieloblaszkowych pęcherzyków np. drogą wyciskania przez membranę lub wysokociśnieniowej homogenizacji.

Niezwykłe i nieoczekiwane właściwości pęcznienia materiału galaktolipidowego powodują, że wyjątkowo łatwo wytwarza się dyspersję liposomowe i żele wodne. Przykładowo, samorzutne tworzenie się liposomów w wodzie jest nieoczekiwanie przydatne przy wytwarzaniu dyspersji liposomowych nawet w dużej skali. Różni się to znacznie od sposobów wytwarzania liposomów z fosfolipidów, w których stosuje się rozpuszczalniki organiczne, takiejak chloroform, eter, etanol lub ich kombinacje. Powiększenie skali wytwarzania znanych fosfolipidowych preparatów liposomowych stanowi znany problem i w celu jego rozwiązania zaproponowano wiele różnych metod. Wynalazek umożliwia wytwarzanie dyspersji liposomowych w prosty i powtarzalny sposób, co może odgrywać istotną rolę przy praktycznym wykorzystaniu liposomów, np. jako nośników leków.

Preparaty według wynalazku w postaci liposomów wykazująnieoczekiwanie dobrą skuteczność kapsułkowania.

Ponadto preparaty według wynalazku w postaci liposomów nieoczekiwanie i znacząco zwiększają trwałość składników aktywnych, nawet gdy pęcherzyki wytwarza się w roztworze tych składników, a więc tylko część składników jest kapsułkowana przez pęcherzyki.

Stwierdzono również, że preparaty według wynalazku w postaci liposomów zmniejszają toksyczność silnego leku przeciwrakowego bez obniżania jego działania farmakologicznego.

Preparaty według wynalazku w postaci liposomów sąbioprzylepne, co pozwala rozwiązać problem odpowiedniej dostępności przy wprowadzaniu składnika aktywnego na pewne powierzchnie biologiczne, np. na rogówkę i śluzówkę.

Do takich preparatów w postaci liposomów nieoczekiwanie można wprowadzać wiele różnych składników aktywnych, takich jak składniki lipofilowe, chlorowodorki, azotany, związki amfifilowe, białka, peptydy itp.

Zgodnie z wynalazkiem można stosować również syntetyczne diglikozylodiacylogliceryny oparte na galaktozie lub dowolnym innym ugrupowaniu monosacharydu, takiego jak glukoza, oraz naturalne glikozyloglicerydy wyodrębnione z dowolnego źródła, oparte na ugrupowaniach węglowodanu innego niż galaktoza, np. glukozy.

Materiał galaktolipidowy

Materiał galaktolipidowe wytworzone z różnych zbóż w sposób podany poniżej zastosowano do wytwarzania preparatów nośnikowych i środków farmaceutycznych według wynalazku w sposób opisany w przykładach. W opisie procenty są procentami wagowymi, o ile ' nie zaznaczono inaczej. Proporcje rozpuszczalników w mieszaninach rozpuszczalników podane sąw częściach objętościowych.

Materiał galaktolipidowy z owsa

200 kg ziaren owsa (Kungsornen AB, Szwecja) zmielono i wyekstrahowano 1000 litrów 95% etanolu w 70°C w ciągu 3 godzin w zbiorniku ekstrakcyjnym z mieszadłem. Zawiesinę odwirowano na ciepło w celu oddzielenia cząstek stałych. Ciekłą frakcję odparowano w 60°C i uzyskano około 10 kg jasnobrunatnego oleju.

Olej wprowadzono do kolumny ze stali nierdzewnej zawierającej 6,25 kg żelu krzemionkowego (Matrex Silica Si, wielkość cząstek 20-45 mm, średnica porów 60 x 10’¹⁰ m, z Amicon Corp., USA). Temperatura kolumny wynosiła 50°C. Kolumnę przemyto 30 litrami mieszaniny heksan:izopropanol (90:10) w celu usunięcia wszystkich niepolarnych lipidów.

Materiał galaktolipidowy wyeluowano z kolumny 20 litrami mieszaniny heksan:izopropanol (60:40) i uzyskano frakcję galaktozylodiacyloglicerynową. W wyniku odparowania tej frakcji otrzymano około 700 g DGDG, głównego lipidu. Materiał galaktolipidowy zdyspergowano następnie w wodzie i po liofilizacji otrzymano sypki proszek.

178 438

Wzbogacanie galaktolipidu w DGDG g galaktolipidów z owsa otrzymanych w sposób opisany powyżej, o zawartości DGDG około 70%, rozpuszczono w 250 ml mieszaniny heksan:izopropanol (70:30), do uzyskania łącznej objętości 300 ml. Uzyskany roztwór wprowadzono do kolumny z żelem krzemionkowym (110 g) i mniej polarne składniki wyeluowano 1 litrem mieszaniny heksan:izopropanol 70:30. Frakcję wzbogaconą w DGDG wyeluowano 2 litrami acetonu. Frakcję acetonową odparowano i zliofilizowano. Otrzymano łącznie 17 g prawie czystego DGDG.

Uwodornianie galaktolipidów

200 g mieszaniny galaktolipidów z owsa otrzymanej w sposób opisany powyżej rozpuszczono w 2 litrach ciepłego izopropanolu. 15 g katalizatora w postaci palladu na węglu (15% Pd, 53% wilgoci, Engelhard Rome s.r.i., Włochy) umieszczono na dnie ciśnieniowego reaktora (Model nr 4552M, Parr Instrument Co., USA) wyposażonego w dwa wirniki na wale mieszadła. Roztwór przeniesiono następnie do reaktora w atmosferze azotu, aby zmniejszyć niebezpieczeństwo pożaru. Reaktor szczelnie zamknięto i napełniono trzykrotnie azotem pod ciśnieniem w celu usunięcia powietrza, a następnie trzykrotnie wodorem (Plus 4.5, z AGA Gas AB, Szwecja). Utrzymując ciśnienie wodoru 600 kPa mieszadło nastawiono na 600 obrotów/minutę i mieszaninę ogrzano do 70°C. Mieszanina reakcyjna osiągnęła wymaganą temperaturę w ciągu 14 minut. Uwodornianie prowadzono przez 6 godzin, po czym produkt reakcji przesączono przez filtr 0,45 pm w celu usunięcia cząstek węgla i palladu. Rozpuszczalnik odparowano w wyparce obrotowej, a stałą pozostałość zdyspergowano w 1600 ml dejonizowanej wody i zliofilizowano.

Po przesączeniu i liofilizacji otrzymano 155 g uwodornionych galaktolipidów. Skuteczność uwodornienia oceniono metodąchromatografii gazowej; w produkcie uwodorniania można było wykryć jedynie nasycone kwasy tłuszczowe.

Galaktolipidy z glutenu pszenicznego kg sproszkowanego glutenu pszenicznego (AB sk&nebrannerier, Szwecja) wyekstrahowano w zlewce 4 litrami 95% etanolu w 70°C przez 3 godziny. Zawiesinę przesączono pod ciśnieniem 400-500 kPa, a uzyskany placek filtracyjny przemyto 1 litrem 95% etanolu. Połączone roztwory etanolowe odparowano w temperaturze nie przewyższającej 60°C i otrzymano około 60 g żółtego oleju.

Olej wprowadzono do kolumny ze stali nierdzewnej zawierającej 45 g żelu krzemionkowego (Matrex Silica Si, wielkość cząstek 20-45 pm, średnica porów 60 x 10‘¹⁰ m, z Amicon Corp., USA). Kolumnę przemyto 700 ml mieszaniny heksan:izopropanol (90:10) w celu usunięcia obojętnych lipidów.

W celu usunięcia MGDG i pewnych innych polarnych lipidów kolumnę przemyto następnie 1000 ml mieszaniny heksan:izopropanol (70:30). Eluowanie DGDG przeprowadzono przy użyciu 1000 ml czystego acetonu. Po odparowaniu uzyskano około 4 g prawie czystego produktu DGDG.

Galaktolipidy z żyta

100 g płatków żytnich (Kungsornen AB, Szwecja) mieszano przez 60 minut z mieszaniną technicznego heksanu z izopropanolem (90:10). Zawiesinę przesączono i po odparowaniu uzyskano 0,5 g polarnych lipidów. Pozostałość rozpuszczono w 10 ml mieszaniny heksanu z izopropanolem (70:30) i wprowadzono do 3 kolumn Sep-pak Silica plus (Millipore Corp., USA) połączonych szeregowo, przemyto 20 ml tej samej mieszaniny rozpuszczalników i wyeluowano 15 ml acetonu. Eluat odparowano i po liofilizacji otrzymano 47 mg galaktolipidów.

Analiza chemiczna i fizykochemiczna różnych materiałów galaktolipidowych

Analiza grupy lipidów

Analizę grupy lipidów przeprowadzono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, HPLC, stosując kolumnę wypełnioną krzemionką modyfikowaną diolem (LiChrosphere 100 DIOL, 5 pm, 250 mm x 4 mm (średnica wewnętrzna); E. Merck, Niemcy). Kolumna znajdowała się na łaźni wodnej utrzymywanej w 75°C. Układ analityczny obejmował pompę HPLC, CM 4000 (LDC/Milton Roy, USA) i wtryskiwacz, model 7125 z 20 p pętlą wtrysku (Rheodyne Inc., USA). Jako detektor rozproszenia światła w parach zastosowano Sedex 45 (S.E.D.E.R.E.,

178 438

Francja) wyposażony w komorę rozpylania Sedex 55, z temperaturąprobówki roboczej 97°C i ciśnieniem powietrza wlotowego 200 kPa.

Podczas analizy przepływ fazy ruchomej wynosił 1 ml/minutę. Zastosowano binarny gradient rozpuszczalników, zmiana liniowa w ciągu 25 minut od 100% A do 100% B, gdzie A=mieszanina heksan:izopropanol:n-butanol:tetrahydrofuran:izooktan:woda (64:20:6:4,5:4,5:1), a B = mieszanina izopropanol:n-butanol:tetrahydrofuran:izooktan:woda (75:6:4,5:4,5:10). Obydwa rozpuszczalniki zawierały octan amonu w ilości 180 mg/litr.

Do zbierania i obróbki danych wykorzystano system Gynko-Soft Data, wersja 4.22 (Softron GmbH, Niemcy). Zazwyczaj wykonując analizę wstrzykiwano próbkę 100 pg. Identyfikację przeprowadzano porównując czas retencji z autentycznymi wzorcami (Karlshamns LipidTeknik AB, Szwecja). W układzie nie wykrywano składników lotnych. Oznaczenia ilościowe oparte były na pomiarach powierzchni pików.

Potencjały ζ oznaczano w aparacie Zetasizer 4 (Malvern Instruments Ltd., W. Brytania), stosując rozcieńczone wodne dyspersje galaktolipidu.

Tabela 1

Charakterystyka różnych materiałów galaktolipidowych

	o-GL	o-h-GL	o-DGDG	w-GL	w-DGDG	r-Gl
Zawartość DGDG % powierzchni	73.	70	72	100	80	100	67
Potencjał ζ, mV	-74	-76	-30	-51	-75	-38	-37

W tabeli 1, a także w poniższej tabeli 2, zastosowano następujące skróty:

o-GL = galaktolipidy z owsa o-h-GL = uwodornione galaktolipidy z owsa o-DGDG = wzbogacone galaktolipidy z owsa w-GL = galaktolipidy z pszenicy w-DGDG = wzbogacone galaktolipidy z pszenicy r-GL = galaktolipidy z żyta

Analiza kwasów tłuszczowych

Analizę profilu kwasów tłuszczowych wykonano metodą, chromatografii gazowej po transestryfikacji lipidów prowadzącej do estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Estry te rozdzielono i oznaczono ilościowo metodą chromatografii gazowej w kolumnie kapilarnej w aparacie Varian 3500 Capillary Gas Chromatograph wyposażonym w kolumnę kapilarną 30 m x 0,25 mm (średnica wewnętrzna) (DB-WAX; J&W Scientific, USA), wtryskiwacz i detektor zjonizacją płomieniową. Jako gaz nośny zastosowano hel. Całkowanie wykonano stosując system GynkoSoft Data, wersja 4.22 (Softron GmbH, Niemcy). Transestryfikację przeprowadzono dodając próbkę 1 mg lipidu do 2 ml mieszaniny węglan dimetylu:izooktan (1:1). Dodano 1 ml roztworu (przygotowanego przez rozpuszczenie 2,3 g sodu w 200 ml metanolu) i probówkę wytrząsano intensywnie przez 30 s, po czym pozostawiono ją w temperaturze pokojowej na 15 minut, aby zapewnić zajście reakcji do końca. Dodano 3 ml wody, zawartość wymieszano przez wytrząsanie, po czym probówkę poddano wirowaniu przy 2 x g. 0,5 pl warstwy organicznej wstrzyknięto do chromatografu, w którym rozdział przeprowadzono w następujących warunkach. Temperatura pieca była zaprogramowana następująco: początek w 130°C (2 minuty), wzrost do 150°C (30°/minutę) i do 220°C (3,2°/minutę), utrzymywanie przez 10 minut. Temperatura wtryskiwacza wynosiła 130°C, a temperatura detektora 250°C. Wyjściowy przepływ gazu wynosił 2,7 ml/minutę. Wyniki przedstawiano jako znormalizowane procenty wagowe, wykorzystując metodę wzorca zewnętrznego. Nie stosowano współczynników korekcyjnych w odniesieniu do ubocznych składników, dla których wzorce były niedostępne lub niedostatecznie czyste.

Tabela 2

Charakterystyka składu kwasów tłuszczowych

Skład kwasów tłuszczowych, % wagowe	o-GL	o-h-GL	o-DGDG	w-GL	w-DGDG	r-GL
C 14:0						1
C 16:0	20	21	21	16	15	13	12
C 18:0	1	1	74	2	1	1
C 18:1 n-9	17	17		19	6	5	8
C 18:1 n-7	1	1		1	1	1	1
C 18:2 n-6	53	52		58	71	68	69
C 18:3 n-3	2	2		3	3	3	5
Składniki uboczne, <1% i nie zidentyfikowane	6	6	5	1	3	8	5

Spektroskopia NMR digalaktozylodiacylogliceryn

Jednowymiarowe widma ¹³C NMR z odprzęganiem protonowym naturalnych wielkości względnych zarejestrowano w spektometrze Bruker AM-400 (Bruker Analytische Messtechnik, GmbH, Niemcy) przy częstotliwości ¹³C 100,614 MHz. Kąt pulsu wynosił 36°, czas powtarzania pulsu 1,0 s, a rozdzielczość 1,526 Hz na punkt pomiarowy. Przy obróbce przyjęto poszerzenie linii 3 Hz. Próbki (10-40 mg) rozcieńczono w mieszaninie 730 pl DMSO-d₆ (Aldrich Chemical Comp., Inc., USA) i 20 pl D2O (Aldrich Chemical Comp., Inc., USA) i przenoszono do probówki do pomiarów nMr (średnica wewnętrzna 5 mm).

Tabela 3

Przesunięcia chemiczne ^l3C (PPM) digalaktozylodiacylogliceryn z pszenicy i owsa

Sygnał	w-DGDG	o-DGDG
1	2	3
Ugrupowania kwasów tłuszczowych
C(n)	13,8	13,7
C(n-1)	21,9	21,9
C(n-2)	30,8	30,8
C, metylen	28,3-28,9	28,4-29,0
C, allilowy	26,5	26,5
C, podwójny allilowy	25,1	25,1
C, olefinowy	127,6-129,6	127,6-129,5
C3	24,3	24,3
C2	33,3, 33,5	33,3, 33,5
C1	172,2, 172,5	172,1, 172,4
Ugrupowanie gliceryny
sn-1	62,3	62,4
sn-2	69,8	69,8
sn-3	66,6	66,6

Tabela 3 (ciąg dalszy)

1	2	3
Ugrupowanie digalaktozylowe
Cl (wewnętrzny)	103,6	103,6
Cl' (zewnętrzny)	99,4	99,4
Inne	60,4, 66,3, 67,7, 68,2, 68,6,	60,4, 66,3, 67,7, 68,2, 68,6,
	69,3,70,1,71,1,72,8, 72,8	69,3,70,1,71,1,72,8,72,9

Przykłady

Przykład 1. Wytwarzanie żelu wodnego

Materiał galaktolipidowy otrzymany z owsa wymieszano z różnymi ilościami wody w celu zbadania spęczniania wodą. Próbki lipidowo-wodne otrzymano przez odważenie składników w szklanych probówkach. Próbki na przemian mieszano pręcikiem i odwirowywano w temperaturze pokojowej aż do uzyskania wyraźnie jednorodnych układów. Wygląd fizyczny próbek oceniano po przechowywaniu przez 6 miesięcy w temperaturze pokojowej. Obecność płytkowej fazy ciekłokrystalicznej oznaczano metodąpolaryzacyjnej mikroskopii optycznej. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli.

Materiał galaktolipidowy	Wygląd
1,0	Drobna dyspersja; nieznaczna sedymentacja
4,8	Drobna dyspersja; nieznaczna sedymentacja
10,5	Faza blaszkowa i wodna w równych objętościach
19,3	Faza blaszkowa i wodna; faza wodna < 10% objętościowych
24,8	Faza blaszkowa
45,0	Faza blaszkowa

Oznacza to, żejednorodny, jednofazowy żel uzyskano przy zawartości galaktolipidu około 25% lub powyżej.

Przykład 2. Właściwości lepkościowe wodnego żelu

Żel galaktolipidowy zawierający 55% wody otrzymano w sposób podany w przykładzie 1. Pomiary lepkości przeprowadzono w reometrze Bohlin VOR (Bohlin Reologi AB, Szwecja) wyposażonym w koncentryczny cylinder (C14; element obrotowy: 91 gcm) przy różnych szybkościach ścinania i w różnych temperaturach. Lepkość mierzono 24 godziny po otrzymaniu żelu. Lepkości przy stałym przepływie (w Pa«) zestawiono poniżej:

Szybkość ścinania, l/s	20°C	40°C	60°C
0,292	98,8	84,5	77,0
0,581	65,7	54,5	42,1
2,312	46,0	34,0	19,5
9,207	37,4	29,6	15,0

Można stwierdzić, że próbka ulega rozrzedzeniu przy wzroście szybkości ścinania (jest pseudoplastyczna), czyli lepkość zależy od szybkości ścinania; sąto właściwości reologiczne typowe dla blaszkowych faz ciekłokrystalicznych. Ponadto wzrost temperatury powoduje jedynie nieznaczny spadek lepkości, co świadczy o tym, że w badanym zakresie temperatur nie zachodzą przemiany fazowe. Po przechowywaniu przez 18 miesięcy w temperaturze pokojowej żel oce12

178 438 niono wzrokowo. Nie zaobserwowano wzrostu drobnoustrojów. Okazało się, że wygląd fizyczny nie zmienia się w czasie starzenia, cojest warte podkreślenia, gdyż nie podjęto żadnych środków ostrożności jeśli chodzi o temperaturę przechowywania, zastosowanie antyutleniaczy, konserwantów itp.

Świadczy to o doskonałej trwałości materiału galaktolipidowego nawet w środowisku wodnym, które może powodować np. hydrolizę łańcuchów acylowych lub degradację drobnoustrojową.

Przykład 3. Test uwalniania

Testy in vitro uwalniania rozpuszczalnego w wodzie barwnika, błękitu metylenowego (E. Merck, Niemcy) przeprowadzono dla żeli galaktolipidowych i fosfolipidowych zawierających początkowo 60% lipidu i 50 mM błękitu metylenowego. Materiał galaktolipidowy otrzymano z owsa. Jako fosfolipid zastosowano oczyszczoną chromatograficznie fosfatydylocholinę sojową (s-PC, Karlshamns LipidTeknik AB, Szwecja). Ośrodek dyfuzji stanowiła przefiltrowana przez membranę woda doprowadzona do równowagi w 37°C. Celkę dyfuzyjną stanowiła membrana rurowa wykonana z regenerowanej celulozy (Spectra/Por; frakcja o masie cząsteczkowej 6 000-8 000; szerokość po spłaszczeniu 1,0 cm) zawierająca około 2,5 g żelu. Rurkę zanurzono w termostatowanej zlewce (średnica wewnętrzna 10 cm) zawierającej 250 g ośrodka, mocując ją około 3 cm od dna. Zlewkę umieszczono na mieszadle magnetycznym obracającym się z szybkością 200 obrotów/minutę. W ustalonych odstępach czasu pobierano próbki i analizowanoje spektrofotometrycznie przy 665 nm. W celach kontrolnych wykonano także pomiar uwalniania błękitu metylenowego z rurki celulozowej zawierającej 50 mM wodny roztwór błękitu metylenowego.

Po 2,5 godzinach nie można było wykryć uwalniania barwnika z żelu galaktolipidowego, podczas gdy z żelu s-PC uwolniło się 1,3% barwnika. Po 5 godzinach żel galaktolipidowy uwolnił jedynie 0,13% zawartego barwnika, około 12 razy mniej niż żel s-PC.

Oznacza to, że preparat galaktolipidowy może zapewnić powolne uwalnianie materiału biologicznie czynnego przy podawaniu in vivo, toteż może być przydatny jako preparat typu depot.

Przykład 4. Test uwalniania

Test in vitro uwalniania leku rozpuszczalnego w wodzie, monohydratu chlorowodorku remoksyprydu (Astra AB, Szwecja) przeprowadzono dla żelu galaktolipidowego zawierającego wyjściowo 60% lipidu, 15% chlorowodorku remoksyprydu i 25% wody.

Jako ośrodek dyfuzji zastosowano bufor fosforanowy (pH 7,4, siła jonowa 0,05 M) doprowadzony do równowagi w 37°C. Celkę dyfuzyjnąstanowiła membrana rurowa wykonana z regenerowanej celulozy (Spectra/Por 3; frakcja o masie cząsteczkowej 3 500; szerokość po spłaszczeniu 1,0 cm, długość 4 cm) zawierająca około 1 ml żelu. Rurkę zamknięto na obydwu końcach klamrami obciążającymi i umieszczono na dnie termostatowanej łaźni do rozpuszczania (Sotax AT 6, średnica wewnętrzna 10 cm) zawierającej 600 ml buforu fosforanowego. Roztwór buforowy mieszano za pomocą łopatek obracających się z szybkością 50 obrotów/minutę. W ustalonych odstępach czasu pobierano do analizy próbki 1 ml roztworu. Każdą próbkę zastępowano 1 ml buforu. Stężenie remoksyprydu oznaczano metodąchromatografii z odwróceniem faz w kolumnie μ-Bondpak C18. Jako eluent zastosowano mieszaninę buforu fosforanowego o pH 1,8 i acetonitrylu w stosunku 4:1. Zastosowano detektor spektrofotometryczny nastawiony na długość fali 254 nm.

Żel zapewnia zaskakująco powolne uwalnianie wprowadzonego leku. Po 2 godzinach z żelu galaktolipidowego uwolniło się poniżej 2% wprowadzonego leku. Po 4 godzinach ilość uwolnionego leku wynosiła około 3%.

Wyniki te wskazują, że preparat galaktolipidowy nadaje się do stosowania jako pozajelitowy depot do przedłużonego uwalniania materiału biologicznie czynnego, którego przykład stanowi chlorowodorek remoksyprydu.

Przykład 5. Wytwarzanie liposomów

Liposomy czyli wieloblaszkowe pęcherzyki wytworzono i zbadano w następujący sposób. Wodę dodano do galaktolipidów z owsa do uzyskania ostatecznego stężenia lipidu 1,0 i 10,0%.

178 438

Próbki pozostawiono na 24 godziny do osiągnięcia stanu równowagi w temperaturze pokojowej stosując łagodne mieszanie; uzyskano dyspersje liposomowe.

W celu otrzymania jednoblaszkowych pęcherzyków część dyspersji przeniesiono do szklanej probówki i rozbito w urządzeniu ultradźwiękowym (XL-2020, Heat System Inc., USA) wyposażonym w sondę mikrokońcówkową, w atmosferze azotu, w 0°C. Obróbkę prowadzono w następujących warunkach: nastawa 3,2, czas obróbki 3x2 minuty, przerwy 2x4 minuty.

Rozkład wielkości cząstek uzyskanych dyspersji liposomowych oznaczano metodą dynamicznego rozproszenia światła (Zetasizer 4, Malvern Instruments, W. Brytania) pod kątem 90° w temperaturze pokojowej, stosując celkę ZET5110 i analizę wielomodalną. Uzyskano następujące wyniki, przedstawione jako Z-średnie.

Przed obróbką ultradźwiękami	Wielkość, nm
Dyspersja 1,0%	467
Dyspersja 10,0%	551
Po obróbce ultradźwiękami
Dyspersja 1,0%	144
Dyspersja 10,0%	148

Uzyskane dyspersje przed i po obróbce ultradźwiękami zbadano pod mikroskopem optycznym (40-100 x, Olympus CH-2, Japonia). Niewielką ilość dyspersji liposomowej nanoszono na szkiełko przedmiotowe. Obserwowano wygląd próbki między skrzyżowanymi polaryzatorami. Tylko w przypadku liposomów nie poddanych obróbce ultradźwiękami można było zaobserwować obrazy w kształcie typowych krzyży maltańskich. Zdolność galaktolipidów do tworzenia pęcherzyków potwierdziła również transmisyjna mikroskopia elektronowa przełomu zamrożonej próbki.

Wyniki te wskazują na doskonałą zdolność galaktolipidów do tworzenia wieloblaszkowych pęcherzyków przy zastosowaniu prostego, bezpośredniego uwadniania, bez dodawania lotnych rozpuszczalników organicznych lub współ-środków powierzchniowo czynnych. Wytwarza się z nich w prosty sposób małe jednoblaszkowe pęcherzyki przez obróbkę ultradźwiękami w sposób opisany powyżej lub dowolnym innym znanym sposobem, np. na drodze wyciskania przez membranę poliwęglanową.

Przykład 6. Zdolność do kapsułkowania

Zbadano zdolność do kapsułkowania barwnika wprowadzonego do pęcherzyków z materiału galaktolipidowego wytworzonego z owsa. Materiał galaktolipidowy bezpośrednio uwodniono w 20 mM wodnym roztworze fluoresceiny, w stężeniu 4,8%. Dyspersję pozostawiono do spęcznienia na 24 godziny w temperaturze pokojowej.

Pęcherzyki z barwnikiem oddzielono od nie wbudowanego barwnika przez filtrację żelowąw kolumnie Sephadex G 50 (wysokość 560 cm, średnica wewnętrzna 1,5 cm) w temperaturze pokojowej. Jako eluent zastosowano bufor EDTA (1 mM EDTA, 5 mM Tris, 150 mM NaCl) o pH 7,4. Do kolumny wprowadzono stężoną dyspersję liposomów z barwnikiem, a następnie buforowany roztwór EDTA. Eluent z kolumny monitorowano w sposób ciągły przy 240 nm za pomocą spektrofotometru UV wyposażonego w celkę mikroprzepływową oraz rejestrator z kartą wykresową, a następnie zbierano w automatycznym urządzeniu do zbierania próbek. Dwie frakcje, pęcherzyki z barwnikiem i roztwór nie związanego barwnika, zebrano osobno i doprowadzono do określonych objętości. Stężenia barwnika oznaczano spektrofotometrycznie przy

285,2 nm i na podstawie uzyskanych wyników wyliczono wychwyconą objętość i skuteczność kapsułkowania. Uzyskano następujące wyniki: wychwycona objętość 2,1 pl/mg lipidu oraz skuteczność kapsułkowania 11%. Wielkość pęcherzyków (Z-średnia) wynosiła 509 nm.

W wyniku bezpośredniego uwodnienia galaktolipidów powstają wieloblaszkowe pęcherzyki, jak to opisano w przykładzie 5. Powyższe wyniki wskazują, że pęcherzyki takie zapew14

178 438 niająo wiele wyższą wychwyconą objętość i skuteczność kapsułkowania niż zwykłe pęcherzyki oparte na fosfolipidach, w przypadku których wychwycona objętość wynosi około 0,5 pl/mg lipidu.

Sposób wytwarzania wieloblaszkowych pęcherzyków na drodze bezpośredniego uwadniania jest technicznie prostym i szybkim sposobem, w związku z czym nadaje się do wykorzystania w przemyśle. Wykorzystując w tym sposobie materiał galaktolipidowy można także uzyskać o wiele wyższąwychwyconą objętość, a więc skuteczność kapsułkowania lepszą od tej, która stanowiła dotychczas istotną wadę przy stosowaniu fosfolipidów do wytwarzania wieloblaszkowych pęcherzyków:

Przykład 7. Wytwarzanie dyspersji wodnych

Wzbogacony materiał galaktolipidowy, DGDG z owsa, wymieszano z wodą w celu zbadaniajego pęcznienia w wodzie. Próbki lipidu w wodzie otrzymano w sposób podany w przykładzie 1. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli:

Wzbogacony galaktolipid, %	Wygląd
1,1	Drobna mleczna dyspersja
9,6	Nieznacznie lepka mleczna dyspersja
21,2	Lepka mleczna dyspersja

Podobnie jak w przypadku materiału nie wzbogaconego spęcznianie w wodzie materiału wzbogaconego jest wyjątkowo dobre, toteż łatwo uzyskuje się jednorodne dyspersje.

Przykład 8. Wytwarzanie wodnych dyspersji

Uwodorniony materiał galaktolipidowy z owsa wymieszano z wodąw celu zbadania jego pęcznienia w wodzie. Próbki lipidu w wodzie otrzymano w sposób podany w przykładzie 1.

Uwodorniony galaktolipid, %	Wygląd
1,3	Drobna biała dyspersja
5,7	Nieznacznie lepka biała dyspersja
10,2	Lepka mleczna dyspersja

Podobnie jak w przypadku nie uwodornionego materiału spęcznienie w wodzie materiału uwodornionego jest wyjątkowo dobre. Materiał ten zawiera reszty wyłącznie nasyconych kwasów tłuszczowych, co oznacza, że zwiększa się skłonność do tworzenia wysoce uporządkowanej struktury krystalicznej, zarówno w stanie stałym jak i w obecności wody. Temperatura topnienia łańcuchów uwodornionego materiału w postaci dyspersji w wodzie, oznaczana metodą kalorymetrii różnicowej, wynosi około 55°C. Odpowiednia wartość dla materiału nie uwodornionego wynosi znacznie poniżej 0°C.

Przykład 9. Wytwarzanie bezwodnej lepkiej dyspersji

Lepkie dyspersje przygotowano według następujących receptur:

Składnik	%
Galaktolipidy	10,0
Gliceryna 99%	90,0
Składnik	%
Galaktolipidy	20,0
Gliceryna 99%	80,0

178 438

Galaktolipidy otrzymane z owsa i glicerynę na przemian mieszano pręcikiem i odwirowywano w temperaturze pokojowej aż do uzyskania bardzo lepkich, jednorodnych i pozornie izotropowych cieczy. Obydwie ciecze stanowiły dyspersję fazy blaszkowej w glicerynie, to jest pęcherzyków wieloblaszkowych, jak to wynika z ich tekstur w polaryzacyjnym mikroskopie optycznym. Wygląd fizyczny próbek oceniano po ich przechowywaniu przez rok w temperaturze pokojowej. Nie można było stwierdzić sedymentacji, niezależnie od stężenia galaktolipidu, co świadczy o tym, że gliceryna wywiera działanie stabilizujące na dyspersję pęcherzyków.

Przykład 10. Wytwarzanie bezwodnej kompozycji do stosowania dla poprawy stanu śluzówki

Środki zawierające grupę sulfhydrylową, takie jak DL-cysteina i N-acetylo-L-cysteina, mogą pobudzać zdrowienie i zapobiegać nawrotowi owrzodzenia dwunastnicy u ludzi. Wrzody żołądka mogą być spowodowane przez niedokrwienie lub substancje szkodliwe, takie jak etanol i kwas acetylosalicylowy, które uszkadzają i usuwają błonę śluzową dwunastnicy.

Przygotowano kompozycję zawierającą następujące składniki:

Składnik	%
Galaktolipidy z owsa	10,0
N-acetylo-L—cysteina	10,0
Gliceryna 99%	80,0

N-acetylo-L-cysteinę rozpuszczono w glicerynie z łagodnym mieszaniem i ogrzewaniem do około 60°C w odkrytej zlewce. Następnie dodano materiał galaktolipidowy i uzyskanąpozornie klarowną ciecz przeniesiono do szklanego pojemnika z plastikowym przykryciem. Preparat w postaci dyspersji, co potwierdziła polaryzacyjna mikroskopia optyczna, przechowywano w lodówce przez ponad 6 miesięcy.

Glicerynę wybrano jako rozpuszczalnik z tego względu, że substancje zawierające grupę sulfhydrylową, takie jak N-acetylo-L-cysteina, sąnietrwałe w roztworze wodnym i mogą przekształcić się w substancje nie wywierające działania farmakologicznego na śluzówkę.

Sam materiał galaktolipidowy wykazuje korzystny wpływ, gdyż badania in vivo na szczurach wykazały, że ma on działanie ochronne na błonę śluzową żołądka.

Różne preparaty do stosowania miejscowego z hydrokortyzonem, lekiem przeciwzapalnym, otrzymano w sposób opisany w przykładach 11-14. Materiał galaktolipidowy otrzymano z owsa. Wszystkie preparaty wykazywały trwałość przez ponad 2 miesiące w temperaturze pokojowej.

Przykład 11

Składnik	%
Galaktolipidy	10,3
Hydrokortyzon	1,0
Woda	88,7

Hydrokortyzon i galaktolipidy wymieszano dokładnie w mikserze. Po dodaniu wody preparat na przemian miksowano, odwirowywano i łagodnie ogrzewano aż do uzyskania mlecznej dyspersji.

178 438

Przykład 12

Składnik	%
Galaktolipidy	22,1
Hydrokortyzon	1,2
1-propanol	16,1
Woda	60,6

Hydrokortyzon rozpuszczono w 1 -propanolu z łagodnym ogrzewaniem i mieszaniem. Po dodaniu wody i galaktolipidów mieszankę na przemian miksowano, odwirowywano i łagodnie ogrzewano aż do uzyskania matowego, bardzo lepkiego żelu.

Przykład 13

Składnik	%
Galaktolipidy	18,9
Hydrokortyzon	0,8
1,2-propanodiol	26,3
Woda	54,0

Hydrokortyzon rozpuszczono w 1,2-propanodiolu z łagodnym ogrzewaniem i mieszaniem. Po dodaniu wody i materiału galaktolipidowego mieszankę na przemian miksowano, odwirowywano i łagodnie ogrzewano aż, do uzyskania żółtawego, prawie przezroczystego żelu.

Przykład 14.

Składnik	%
Galaktolipidy	26,8
Hydrokortyzon	1,2
Etanol	20,7
Woda	51,3

Hydrokortyzon rozpuszczono w etanolu z łagodnym ogrzewaniem i mieszaniem. Po dodaniu wody i galaktolipidów mieszankę na przemian miksowano, odwirowywano i łagodnie ogrzewano aż do uzyskania jasnobrunatnego, przezroczystego żelu.

W przykładach 15-17 opisano różne bezwodne preparaty do stosowania miejscowego. Jako modelowy lek wybrano ponownie hydrokortyzon. Zastosowano galaktolipidy otrzymane z owsa. Wszystkie preparaty wykazywały stabilność ponad 2 miesiące w temperaturze pokojowej.

Przykład 15

Składnik	%
Galaktolipidy	7,0
Hydrokortyzon	0,8
Gliceryna 99% (wagowo)	92,2

Galaktolipidy zdyspergowano w glicerynie. Po uzyskaniu jednorodnej fazy żelu dodano hydrokortyzon. Mieszaninę łagodnie ogrzewano, a następnie mieszano w mikserze. Uzyskany preparat, zawiesina w postaci żółtawego, lepkiego żelu, zawierał silnie zdyspergowane stałe cząstki hydrokortyzonu.

Przykład 16

Składnik	%
Galaktolipidy	13,5
Hydrokortyzon	1,1
Gliceryna 99% (wagowo)	85,4

Preparat wytworzono w sposób opisany w przykładzie 15. Uzyskano preparat w postaci mętnego, bardzo lepkiego żelu o barwie jasnożółtej.

Przykład 17

Składnik	%
Galaktolipidy	21,8
Hydrokortyzon	1,1
Propanol	14,5
Gliceryna 99% (wagowo)	62,6

Hydrokortyzon częściowo rozpuszczono w propanolu z łagodnym ogrzewaniem i mieszaniem. Po dodaniu galaktolipidów i intensywnym wymieszaniu dodano glicerynę. Następnie preparat miksowano, odwirowano i ogrzewano aż do uzyskania żółtej żelo-podobnej fazy. Żel zawierał silnie zdyspergowane cząstki hydrokortyzonu.

Przykład 18. Preparat przeciwgrzybiczy do stosowania dopochwowego

Składnik	%
Galaktolipidy	45,6
Azotan mikonazolu	1,8
Woda	52,6

Azotan mikonazolu i galaktolipidy otrzymane z owsa dokładnie wymieszano w mikserze. Po dodaniu wody preparat na przemian miksowano i mieszano aż do uzyskania brązowawego, jednorodnego i bardzo lepkiego żelu.

Przykład 19. Preparat przeciwbakteryjny jako opatrunek na rany

Składnik	%
Galaktolipidy	42,8
Chlorowodorek doksocykliny	1,7
Woda	55,5

178 438

Chlorowodorek doksocykliny rozpuszczono w wodzie uzyskując żółty roztwór. Po dodaniu galaktolipidów otrzymanych z owsa mieszankę na przemian miksowano i mieszano aż do uzyskania jasno brązowawego, bardzo lepkiego żelu.

Przykład 20. Preparat przeciwbakteryjny do stosowania do zewnętrznego przewodu słuchowego

Składnik	%
Galaktolipidy	2,0
Chlorowodorek doksocykliny	2,0
Woda	96,0

Chlorowodorek doksocykliny rozpuszczono w wodzie -uzyskując żółty roztwór. Po dodaniu galaktolipidów otrzymanych z owsa mieszankę miksowano aż do uzyskania żółtej dyspersji pęcherzyków zawierających doksocyklinę.

Przykład 21. Preparat przeciwcukrzycowy do stosowania do nosa

Składnik	%
Galaktolipidy	3,5
Roztwór insuliny, 100 IU/ml (Actrapid Human, Novo Nordisk AS, Dania)	2,0

Galaktolipidy otrzymane z owsa uwodniono w handlowym roztworze insuliny z łagodnym mieszaniem przez· 24 godziny. Uzyskaną dyspersję przeniesiono do zwykłego rozpylacza donosowego, z którego uzyskać można silnie rozpylony aerozol.

Przykład 22. Preparat plemnikobójczy

Składnik	%
Galaktolipidy	22,5
Nonoksynol	5,0
Woda	72,5

Mieszankę 3 składników na przemian miksowano, odwirowywano i łagodnie ogrzewano aż do uzyskania jasnobrązowawego, przezroczystego żelu.

Przykład 23. Preparat znieczulający do podawania doodbytniczego

Składnik	%
Galaktolipidy	43,4
Paracetamol	2,9
Woda	53,7

Galaktolipidy otrzymane z owsa i paracetamol dokładnie wymieszano. Po dodaniu wody preparat na przemian mieszano pręcikiem, łagodnie ogrzewano i odwirowywano w temperaturze pokojowej aż do uzyskania żółto-brązowego, bardzo lepkiego żelu.

178 438

Lepkość preparatów galaktolipidowych nie zmienia się znacząco przy umiarkowanych zmianach temperatury. Preparat trzymany w lodówce łatwo przenosi się do strzykawki lub innego podobnego urządzenia, po czym można go podawać doodbytniczo po ogrzaniu do temperatury ciała, bez utraty lepkości lub konsystencji.

Przykład 24. Preparat przeciw jaskrze do podawania do oka

Składnik	%
Galaktolipidy	1,00
Maleinian timololu	0,34
Woda	98,66

Galaktolipidy otrzymane z owsa zdyspergowano w części wody i pozostawiono na noc do spęcznienia w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem. Dodano maleinian timololu rozpuszczony w reszcie wody i uzyskaną dyspersję liposomów przeniesiono do szklanej probówki, a następnie rozbito w urządzeniu ultradźwiękowym (XL-2020, Heat System Inc., USA) wyposażonym w sondę mikrokońcówkową, w atmosferze azotu, w 0°C w ciągu 10 minut.

Uzyskano klarowną dyspersję zawierającą drobne jednoblaszkowe pęcherzyki i lek w farmakologicznie skutecznej ilości, do stosowania jako krople do oczu. Galaktolipidy zapewniają zarówno zwiększoną lepkość preparatu, jak i lepszą bioprzyczepność, co może zapewnić lepszą biodostępność leku z uwagi na przedłużony czas przebywania na rogówce.

Przykład25. Wprowadzanie soli litowej kwasu γ -linolenowego do liposomów galaktolipidowych

Składnik	%
Li-GLA	1,5
Wzbogacone galaktolipidy	10,0
2,3% gliceryna w wodzie	do 100,0

Li-GLA o zawartości kwasu γ-linolenowego wynoszącej 75% uzyskano z Callanish Ltd., Szkocja. Wzbogacony materiał galaktolipidowy otrzymany z owsa oraz Li-GLA wymieszano, po czym dodano 2,3% roztworu gliceryny. Mieszaninę pozostawiono do uwodnienia (spęcznienia) na 8 godzin. Po mieszaniu z intensywnym ścinaniem, z szybkością 12 000 obrotów/minutę przez 30 s dyspersję liposomową homogenizowano pod ciśnieniem 86 Mpa przez 3 minuty (EmulsiFlex-C30, Avestin Inc., Kanada). Zawartość Li-GLA 1,5% odpowiada stężeniu 53 mM.

Zbadano działanie hemolityczne dyspersji liposomowej in vitro, a jego wyniki przedstawiono poniżej w teście 6.

Przykład 26. Wytwarzanie dyspersji zawierającej 10% L-tyrozyny

Dyspersję otrzymano w następujący sposób:

Składnik	%
Galaktolipidy z owsa	6,4
L-tyrozyna	10,0
Woda	83,6

178 438

Wszystkie składniki wymieszano, a następnie homogenizowano przez mieszanie z intensywnym ścinaniem, z szybkością 15 000 obrotów/minutę przez 3 minuty, uzyskując jednorodną dyspersję. Uzyskana dyspersja zachowuje trwałość przez kilka tygodni.

Krótki opis rysunków

Na figurze 1 pokazano obraz mikrofotograficzny w świetle spolaryzowanym liposomów otrzymanych w przykładzie 9 z 10% wagowymi galaktolipidów w glicerynie, przy powiększeniu x 100. Kuliste kształty z krzyżami maltańskimi są charakterystyczne dla liposomów.

Na figurze 2 pokazano wpływ środka miejscowego znieczulającego na blokowanie nerwu w teście modelowym na szczurach z przewlekłym wszczepem dooponowym opisanym poniżej w teście 3.

Testy biologiczne

Test 1. Podrażnienie skóry in vivo

Aby ocenić toksyczność galaktolipidów według wynalazku dla skóry przeprowadzono następujący test.

Galaktolipidy z owsa wymieszano z wodą do iniekcji uzyskując 10% żel, który naniesiono w dawce 0,5 ml/zwierzę na nienaruszoną skórę samców białego królika nowozelandzkiego, a potem utrzymywano go pod półokluzyjnym bandażem przez 4 godziny. Zaczerwienienia i obrzęk skóry oceniano w 1, 24,48 i 72 godziny po zdjęciu bandażu. Następnie wyliczono wielkości średnie oceny zmian chorobowych skóry po 24,48 i 72 godzinach. Wyniki zestawiono poniżej w tabeli 5.

Tabela 5

Podtażnienie skóry u królików

	Zaczerwienienie	Obrzęk
24 godziny	0	0
48 godzin	0	0
72 godziny	0	0

Z powyższych wyników można wywnioskować, że stosowanie żelu galaktolipidowego nie wywołuje jakiegokolwiek znaczącego podrażnienia.

Test 2. Ocena klirensu liposomów galaktolipidowych in vivo

Wytwarzanie DGDG z ³H-znaczonym kwasem tłuszczowym

500 mg galaktolipidów z owsa znaczono trytem przez katalityczną redukcję wiązań podwójnych w grupach kwasu tłuszczowego gazowym trytem (Amersham Tritium Labeling Service, W. Brytania). Aktywność właściwa wynosiła 30-60 Ci/mmol zredukowanego wiązania podwójnego. 3H-DGDG oczyszczano metodą dwuwymiarowej chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelu krzemionkowego 60. Fazę ruchomąwjednym kierunku stanowiła mieszanina chloroform:metanol:woda (65:25:4, objętościowo), a w drugim kierunku mieszanina chloroform:metanol:kwas octowy:woda (85:15:10:3,5, objętościowo). Plamkę DGDG eluowano kolejno mieszaniną chloroform:metanol:woda (65:25:4, objętościowo) i (50:50:10, objętościowo), czystym metanolem i mieszaniną metanol:woda (objętościowo). Udział ³H w lipofilowej części cząsteczki galaktolipidu oznaczano w sposób następujący: 18 nCi ³3ł-znaczonego DGDG i 2 mg materiału nie znaczonego poddawano hydrolizie alkalicznej w 1ml 1M KOH w 60°C przez 4 godziny. Po zobojętnieniu 0,2 ml 5 M HCl dodawano 5 ml chloroformu, 1,5 ml etanolu i 2,5 ml wody. W tej dwufazowej mieszaninie 97% radioaktywności odzyskano w dolnej fazie (chloroformowej).

Nie znaczone galaktolipidy i 3H-DGDG w łącznym stężeniu 2,0% wagowych zdyspergowano w 2,5% (wagowo) glicerynie w wodzie. Dyspersję liposomowądoprowadzano do równowagi przez 36 godzin w 4°C. Dyspersję poddawano obróbce ultradźwiękami za pomocą sondy z mikrokońcówką (3x2 minuty z przerwami po 4 minuty) w atmosferze azotu w 0°C.

Test na szczurach

Głodzone samce szczura Sprague Dawley o wadze około 250 g uśpiono eterem dietylowym. 0,5 ml dyspersji poddanej obróbce ultradźwiękami o radioaktywności 1,8-2,7 pCi wstrzyknięto do zewnętrznej żyły szyjnej. Zwierzęta uśmiercano przebijając ich aorty po 2 minutach, 15 minutach, 60 minutach, 4 godzinach i 20 godzinach. Lipidy z wątroby i próbek plazmy krwi ekstrahowano mieszaninąchloroform:metanol (1:1, objętościowo). Ekstrakty suszono w atmosferze azotu, pozostałość rozpuszczano w chloroformie i poddawano chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelu krzemionkowego 60 stosując do rozwijania mieszaninę chloroform:metanol:woda:kwas octowy (65:25:4:4, objętościowo). Plamę DGDG zdrapywano do fiolek do zliczania; dodawano 1 ml mieszaniny metanol:woda (1:1, objętościowo) i mieszankę miksowano przed dodaniem 10 ml mieszanki toluen:Instagel (Packard Instruments B.V., Holandia) (1:1, objętościowo). Radioaktywność oznaczano w cieczowym liczniku scyntylacyjnym Packard TriCarb. Wyniki przedstawiono jako % wstrzykniętej dawki 3H-DGDG w 10 ml plazmy krwi (4% całkowitej wagi ciała) i całej wątrobie w różnych czasach; zestawionoje w tabeli poniżej.

Tabela 6

Procent wstrzykniętego H-DGDG w 10 ml plazmie krwi (4% całkowitej wagi ciała) i wątrobie w różnych czasach.

Wyniki przedstawiono jako wielkości średnie ± odchylenie standardowe (n = 3).

	2 minuty	15 minut	60 minut	4 godziny	24 godziny
Plazma	57,8±9,0	47,7±5,4	17,4±1,9	2,0±0,4	0,04±0,04
Wątroba	9,9±2,2	17,2±2,2	13,0±1,6	2,1±0,5	0,16±0,03

Wyniki sugerują, że pęcherzyki zawierające DGDG wykazują okres półtrwania około 30 minut po wstrzyknięciu dożylnym szczurom. Oczywiste jest ponadto, że pęcherzyki galaktolipidowe usuwane sąz krwioobiegu i sąskutecznie degradowane, głównie w wątrobie.

Test 3. Preparaty z lekiem miejscowo znieczulającym oraz badanie in vivo znieczulenia kręgowego u szczurów

Przygotowane różne preparaty z chlorowodorkiem bupiwakainy, lekiem miejscowo znieczulającym, o następującym składzie

	Kompozycja A	Kompozycja B	Kompozycja C
Składnik	%	%	%
Bupiwakaina.HCl	1,00	0,50	-
Galaktolipidy	10,00	-	10,00
Gliceryna 99%	2,57	2,48	2,59
Woda	86,47	97,02	87,41

Zdolność preparatów do wydłużania czasu trwania miejscowego znieczulenia rdzenia kręgowego i korzeni nerwowych zbadano w kontrolnym doświadczeniu na szczurach z przewlekłym wszczepem dooponowym cewników.

grupy samców szczura Sprague-Dawley (o wadze 235-300 g) zbadano w tydzień po wszczepieniu dooponowych cewników zgodnie z metodą T.L. Yaksha i T.A. Rudy'ego (Physiol. Behav., 1976,17,1031-1036). Dwóm grupom szczurów podano różne dawki bupiwakainy w postaci kompozycji galaktolipidowej (kompozycji A), trzeciej grupie podano bupiwakainę w roztworze wodnym (kompozycja B), a czwartej grupie preparat galaktolipidowy bez środka miejscowo znieczulającego (kompozycja C), w sposób podany w poniższej tabeli.

178 438

Grupa	Liczba szczurów	Kompozycja	Wstrzyknięta objętość, pl	Wstrzyknięta ilość bupiwakainy, μ}»
Duża dawka	7	A	20	200
Niska dawka	7	A	10	100
Kontrolna	8	B	20	100
Placebo	6	C	20	0

Szczury przydzielono losowo do jednej z 4 grup. Badane substancje podawano w dolny lędźwiowy obszar worka opony twardej przez wszczepiony cewnik. Wpływ badanej substancji na czynności ruchowe obserwowano w regularnych odstępach czasu i oceniano w skali 0,1,2,3 i 4, gdzie 0=brak wpływu na ruch, a 4 = paraliż nóg zarówno tylnych, jak i przednich. Szczury obserwowano przez co najmniej 90 minut.

Wyniki przedstawiono na fig. 2. U wszystkich zwierząt, którym podano aktywną substancję miejscowo znieczulającą, obserwowano znaczące zaburzenie czynności ruchowych wkrótce po podaniu. Jednakże czas trwania tego efektu znacząco różnił się dla 3 grup, przy czym dla grupy z największądawkąokres ten był najdłuższy, a dla grupy kontrolnej okres paraliżu był najkrótszy. Po 90 minutach wszystkie zwierzęta odzyskały zdolność ruchu. Różnice były statystycznie znaczące dla grupy z wysoką dawką i dla grupy z niską dawką w stosunku do grupy kontrolnej w 20 minucie (test znakowanych rang Wilcoxona). Grupa z wysokądawkąróżniła się także od grupy kontrolnej w 30 minucie. Dla grupy z placebo nie zaobserwowano żadnych efektów dla wszystkich przedziałów czasowych. Nie zaobserwowano żadnych efektów nieoczekiwanych lub toksycznych, a wszystkie efekty były odwracalne.

Wniosek: Preparat galaktolipidowy z bupiwakarnąmoże znacząco wydłużyć czas blokowania nerwu przez bupiwakainę w teście modelowym na szczurach z przewlekłym wszczepem dooponowym. Wykazuje to ponadto, że preparat galaktolipidowyjest przydatny w przedłużaniu działania składników biologicznie czynnych.

Test 4. Test hemolizy in vitro z liposomami zawierającymi Li-GLA

Działanie hemolityczne liposomowego preparatu Li-GLA otrzymanego w przykładzie 25 zbadano i porównano z wolnym Li-GLA na próbkach pełnej krwi człowieka zgodnie z następującą procedurą.

Ludzką krew od zdrowych ochotników zebrano w 10-ml probówkach Vacutainer (Becton Dickinson, Kanada) zawierających 143 jednostki USP heparyny sodowej. Próbki po 2 ml przeniesiono do 25-ml kolb Erlenmeyera, po czym dodano 1,0 ml badanego preparatu rozcieńczonego 0,9% roztworem soli do uzyskania stężenia wymaganego w teście. Następnie próbki inkubowano w 37°C we wzbogaconej atmosferze 95:5 tlen:ditlenek węgla, przepływ 3 litry/minutę, przez 1 godzinę ze stałym łagodnym wytrząsaniem. Pod koniec okresu inkubowania do μΐ mieszaniny krwi przeniesiono do 500 μΐ roztworu soli w 1,5-ml probówce Eppendorfa. Wzorce zapewniające 100%o hemolizy otrzymano dodając 10 μ) krwi do 500 μΐ czystej wody w 1,5-ml probówce Eppendorfa. Wszystkie próbki odwirowywano przez 2 minuty w wirówce Eppendorf Microfuge (Brinkman Instruments Ltd., Kanada), a następnie analizowano w analizatorze odśrodkowym (Cobas Bioanalyser; Hoffman-La Roche Ltd., Kanada) z przeszukiwaniem UV przy 540 nm. Wyniki przedstawiono poniżej.

Stężenie Li-GLA, mM	Hemoliza, %
1,0	0,8
5,0	1,1
10,0	2,8
12,0	6,9
15,0	21,9
17,5	38,8

178 438

Li-GLA rozpuszczony w 0,9% roztworze soli powoduje 100% hemolizy przy stężeniu około 4-5 mM. W związku z tym aktywność hemolityczna Li-GLA w liposomach jest znacznie zmniejszona. Zmniejszona aktywność hemolityczna liposomowego Li-GLA została potwierdzono wstępnymi badaniami in vivo na szczurach; hemoliza zmniejsza się o 50-80% przy zastosowaniu preparatu liposomowego zamiast wolnego Li-GLA. Preparat liposomowy nie powoduje występowania „czerwonego moczu” u szczurów, co wywołuje wolny Li-GLA. Dodatkowo wykazano, że działanie w stosunku do komórek rakowych in vitro w przypadku wolnego Li-GLA i liposomowego Li-GLA jest prawie identyczne. Testy te sugerują, że liposomowy preparat galaktolipidowy zmniejsza hemolizę, poważne działanie uboczne leku bez wpływania na jego skuteczność farmakologiczną.

Wniosek

W podsumowaniu odkryć związanych z wynalazkiem można stwierdzić, że preparaty lipidu z polarnym rozpuszczalnikiem oparte na materiale galaktolipidowym według wynalazku przewyższają preparaty fosfolipidowe pod wszystkimi takimi względami jak trwałość fizyczna preparatów, skuteczność wprowadzania leków oraz powolne uwalnianie wprowadzonych leków.

178 438

Fig. 1

Blokada

Fig. 2

Czas (minuty)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Preparat dwuwarstwy lipidowej zawierający lipidy i polarny rozpuszczalnik, o zawartości materiału tworzącego dwuwarstwę lipidową wynoszącej 0,01-90% wagowych, korzystnie 0,1-50%, w polarnym rozpuszczalniku, stanowiący nośnik substancji czynnej do stosowania zwłaszcza w środkach farmaceutycznych, znamienny tym, że jako materiał tworzący dwuwarstwę lipidową zawiera materiał galaktolipidowy ze zbóż zawierający co najmniej 50% digalaktozylodiacylogliceryn i inne polarne lipidy jako resztę.
2. 2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera materiał galaktolipidowy zawierający około 70-80% digalaktozylodiacylogliceryn i 20-30% innych polarnych lipidów.
3. 3. Preparat według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera materiał galaktolipidowy zawierający do 100% digalaktozylodiacylogliceryn.
4. 4. Środek farmaceutyczny zawierający preparat dwuwarstwy lipidowej zawierający lipidy i polarny rozpuszczalnik, o zawartości materiału tworzącego dwuwarstwę lipidową wynoszącej 0,01-90% wagowych, korzystnie 0,1-50%, w polarnym rozpuszczalniku, substancję czynną i ewentualnie środek izotoniczny, znamienny tym, że jako materiał tworzący dwuwarstwę lipidową zawiera materiał galaktolipidowy ze zbóż zawierający co najmniej 50% digalaktozylodiacylogliceryn i inne polarne lipidy jako resztę.
5. 5. Środek farmaceutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że zawiera materiał galaktolipidowy zawierający około 70-80% digalaktozylodiacylogliceryn i 20-30% innych polarnych lipidów.
6. 6. Środek farmaceutyczny według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że zawiera materiał galaktolipidowy zawierający do 100% digalaktozylodiacylogliceryn.
7. 7. Środek farmaceutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że zawiera 1-50% wagowych materiału galaktolipidowego w przeliczeniu na masę tego środka.
8. 8. Środek farmaceutyczny według zastrz. 4 albo 7, znamienny tym, że zawiera poniżej 25% wagowych materiału galaktolipidowego w przeliczeniu na masę tego środka.
9. 9. Sposób wytwarzania środka farmaceutycznego zawierającego preparat dwuwarstwy lipidowej zawierający lipidy i polarny rozpuszczalnik, o zawartości materiału tworzącego dwuwarstwę lipidową wynoszącej 0,01-90% wagowych, korzystnie 0,1-50%, w polarnym rozpuszczalniku, substancję czynną i ewentualnie środek izotoniczny, drogą mieszania składników, znamienny tym, że jako materiał tworzący dwuwarstwę lipidową stosuje się materiał galaktolipidowy ze zbóż zawierający co najmniej 50% digalaktozylodiacylogliceryn i inne polarne lipidy jako resztę.
10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się materiał galaktolipidowy zawierający około 70-80% digalaktozylodiacylogliceryn i 20-30% innych polarnych lipidów.
11. 11. Sposób według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że stosuje się materiał galaktolipidowy zawierający do 100% digalaktozylodiacylogliceryn.
12. 12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się 1-50% wagowych materiału galaktolipidowego w przeliczeniu na masę środka farmaceutycznego.
13. 13. Sposób według zastrz. 8 albo 12, znamienny tym, że stosuje się poniżej 25% wagowych materiału galaktolipidowego w przeliczeniu na masę środka farmaceutycznego.

    * * *

    178 438