NO312494B1 - Anvendelse av en tolags lipid/polar-lösningsmiddelblanding, farmasöytisk blanding som omfatter tolagslipid/polarlösningsmiddelblanding, samt fremgangsmåte forfremstilling av en sådan - Google Patents

Abstract

Det beskrives en tolags lipid/polar-løsningsmiddel-blanding som består av 0,01-90 vekti, fortrinnsvis 0,1-50 vekt%, av et tolags-dannende materiale i et polart løsningsmiddel, hvor det tolags-dannende materialet er et galaktolipidmateriale fra cerealier bestående av minst 50% digalaktosyldiacylglyceroler, hvor det gjenværende er andre polare lipider. Tolags-blandingen kan benyttes som en bærer for en aktiv substans i et farmasøytisk eller kosmetisk produkt, næringsmiddel eller landbruksprodukt. Det beskrives også en farmasøytisk blanding som omfatter et terapeutisk virkestoff i blanding med nevnte tolags-blanding.

Description

Denne oppfinnelse vedrører anvendelse av tolags lipid/polar-løsnings-middelblandinger. Disse blandingene er egnet for bruk som bærere for virkestoffer i farmasøytiske blandinger, og dessuten i kosttilskudd, kosmetika, næringsmidler og landbruksprodukter. Videre vedrører oppfinnelsen farmasøytisk blanding som omfatter tolags lipid/polar-løsningsmiddelblanding, samt fremgangsmåte for fremstilling av en sådan.

Det har kun vært gjort begrenset bruk av naturlige amfifile lipide hjelpestoffer ved fremstilling av farmasøytika og kosmetikk. Grunnene har i mange tilfeller vært mangel på råstoffer og høye fremstillingsomkostninger, så vel som uegnede egenskaper ved det endelige lipidmateriale.

Blant de naturlig polare tolags-dannende lipidene, dvs. amfifile lipider, er fosfolipidene de vanligste innen farmasøytisk og kosmetisk bruk. Som følge av deres tolags-dannende egenskaper kan disse polare lipidene benyttes for å danne ulike typer aggregater og partikler, som f.eks. vesikler og flytende krystaller, noe som har funnet mange tekniske anvendelser.

Innen den farmasøytiske teknologi har det imidlertid bare vært begrenset anvendelse av lipidgel på basis av fosfolipider, hovedsakelig som følge av utilstrekkelige gel-dannende egenskaper og dårlig kjemisk stabilitet. Det hittil mest benyttede naturlige polare, tolags-dannende lipid, fosfatidylcholin fra eggeplomme eller soyabønne, er litt for lipofilt for optimal svelling i vann og for dannelse av de fleksible dobbeltlag som de lamellære strukturer i flytende krystaller utgjøres av.

Siden liposomer er dispersjoner av tolags- eller lamellære faser i et overskudd av vandig løsning, er det derfor ikke optimalt å benytte fosfolipidbaserte lamellære faser når det skal dannes liposomer. Svellingsprosessen er langsom, og det fordres ofte betydelig mekanisk energi for innen rimelig tid, å danne liposomer og vesikler av et fosfolipidmateriale.

Naturlige fosfolipider, som fosfatidylcholin fra eggeplomme, er sterkt umettede. Umetning av acylkjedene i fosfolipidet er en forutsetning for dannelse av en lamellær flytende krystallfase ved romtemperatur. Dette betyr imidlertid også at tolags-membraner dannet av naturlige fosfolipider har en høy permeabilitet overfor vannløselige medikamenter, i og med at acylkjedene foreligger i en uordnet væsketilstand. Liposomer fremstillet av naturlige fosfolipider kjennetegnes derfor ved en lav innkapslingseffektivitet som følge av at inkorporert medikament lekker ut gjennom det liposomale dobbeltlag. Dersom medikamenter skal inkorporeres i naturlige fosfolipidliposomer, må de stabiliseres ved tilsetning av store mengder kolesterol på 30-50 mol% av hele lipidblandingen.

Dette gjelder også andre virksomme substanser enn medikamenter som av en eller annen grunn skal inkorporeres i liposomer eller andre tolags strukturer.

Fosfolipidbaserte vesikler og liposomer har vanligvis en meget kort levetid etter at de er ført inn,i blod-kretsløpet. Den hurtige utskillelse fra blodet skyldes at de tas opp av det retikulo-endoteliale system (RES) i leveren og milten. For å unngå dette kan liposomene stabiliseres sterisk ved tilsetning av gangliosider, inneholdende flere karbohydratenheter, eller hydrofile polymerer som f .eks. polyetylenoksyd eller pullulan. De sistnevnte midler bindes normalt kovalent til fosfatidyletanolamin. I prinsippet er dette en meget effektiv metode, og de modifiserte liposomene kan unngå å bli tatt opp av RES. I praksis er det imidlertid både fra et sikkerhetsmessig og økonomisk synspunkt uheldig å tilsette ytterligere komponenter, enten de er naturlige og skjeldne, og følgelig kostbare, eller syntetiske, og følgelig ikke nødvendigvis bioforlikelige, til liposomformuleringen.

Anvendelsen av fosfolipider og andre polare lipider for fremstilling av flytende krystaller og liposomer er velkjent.

EP-B1-0 126 751 omtaleren blanding med kontrollert frigjøring som kan innbefatte amfifile substanser som galaktolipider, fosfolipider og monoglycerider. Dette patentet er rettet mot kubiske og omvendte heksagonale flytende krystallinske faser som er stabile i overskudd av vandig løsning.

W091/11993 omtaler en alkoholisk, vandig fosfolipidblanding av geltype. Alkoholen eretanol, 1-propanol eller 2-propanol. Fosfolipidinnholdet ligger i området 15 til 30 vekt%. Anvendelsen av fosfolipidblandingen for fremstilling av liposomer ved fortynning med en vandig løsning, så vel som preparater for lokal anvendelse som inneholder gelen, er også beskrevet.

WO 91/04013 omtaler hybride paucilamellare lipidvesikler som inneholder et fosfo- eller glykolipid og et ikke-ionisk, anionisk eller zwitterionisk overflateaktivt middel i de lipide dobbeltlag. Foretrukne glykolipider er cerebrosider, gangliosider og sulfatider som alle tilhører glykosfingolipidfamilien.

Glykosylglycerider er en type av glykolipider som er velkjente bestanddeler av plantecellemembraner. To typer basert på galaktose er meget vanlige, nemlig monogalaktosyl-diacylglycerol, MGDG, og digalaktosyldiacylglycerol, DGDG, som representerer opp til 40% av tørrvekten av thylakoid-membranene.

Planteglykolipider har karbohydratenheter, hovedsakelig av galaktose, bundet til glycerol. I MGDG har galaktoseringens 1-stilling en /?-binding til glycerol, og i DGDG forekommer en a,1->6-binding mellom sukkerne. En mindre bestanddel er plantesulfolipidet som har den mer korrekte betegnelsen sulfo-kinovosyldiacylglycerol, SQDG, som inneholderen sulfonatgruppe i stedet for en hydroksylgruppe bundet til karbon 6 i den terminale deoksyglukoserest. De fleste planteglykolipider kan gjengis med den generelle formel

hvor R-i og R2 uavhengig av hverandre, er mettede eller umettede fettsyrerester med 2-24 karbonatomer og 0-6 dobbeltbindinger, ytterligere forestrede hydroksysyrer, det vil si estolider, eller hydrogen; karbohydratet er en monosakkaridenhet;

n = 1-5; og R3 er en hydroksyl- eller sulfonatgruppe.

Ved undersøkelse av interaksjonen mellom glykosylglycerider og vann og andre polare løsningsmidler, har vi gjort det overraskende funn at bestemte glykolipidmaterialerfra cerealier har en egenskap som gjør nevnte lipidmaterialer hensiktsmessige og enkle å benytte som bærermateriale, spesielt for farmasøytiske blandinger og også for andre formuleringer, så som anvendelser innen kosmetikk, landbruk, diett og næringsmidler.

Det er velkjent at lipider fra cerealier som følge av deres relativt høye andel av polare komponenter, kan reagere med vann under dannelse av en lamellær flytende krystallinsk fase (G. Jayasinghe et al., J, Disp. Sei. Technol., 1991, Vol. 12, s. 443-451).

SE 9400368-8 omtaler en industrielt anvendelig fremgangsmåte for fremstilling av et glykolipidmateriale fra planter, fortrinnsvis cerealier, ved hjelp av ekstraksjon og kromatografiske separasjoner. Det således fremstillede glykolipid-materialet kan benyttes som et amfifilt materiale i farmasøytiske produkter, kosmetika og næringsmidler.

Denne oppfinnelse vedrører anvendelse av en tolags lipid/polar-løsningsmiddelblanding som består av 0,01-90 vekt%, fortrinnsvis 0,1-50%, av et tolags-dannende materiale i et polart løsningsmiddel, som kjennetegnes ved at det tolags-dannende materialet er et galaktolipidmateriale fra cerealier bestående av minst 50% digalaktosyldiacylglyceroler, hvor det gjenværende er andre polare lipider, som en bærer for en aktiv substans i et farmasøytisk eller kosmetisk produkt eller næringsmiddel.

I en foretrukket anvendelse av blandingen, består galaktolipidmaterialet av ca. 70-80% digalaktosyldiacylglyceroler og 20-30% andre polare lipider.

I en annen foretrukket anvendelse av blandingen, består galaktolipid-materialet av opp til 100% digalaktosyldiacylglyceroler.

Digalaktosyldiacylglycerolene kan gjengis med den generelle formel

hvor Ri og R2 uavhengig av hverandre, er mettede eller umettede fettsyrerester med 10-22 karbonatomer og 0-4 dobbeltbindinger, eller hydrogen; og R3 er en hydroksyl- eller sulfonatgruppe.

Som foretrukne eksempler på fettsyrerestene Ri og R2, kan nevnes naturlig forekommende fettacylgrupper, som f.eks. rester av de mettede syrene palmitin (C15H31CO; 16:0) og stearinsyre (C17H35CO; 18:0); fra de mono-umettede syrene oljesyre (C17H33CO; 18:1); og fra de poly-umettede syrene linolsyre (C17H31CO; 18:2) og linolensyre (C17H29CO; 18:3). Fettsyrerestene kan også inneholde hydroksysyrer bundet til glyceroldelen, hvor deres hydroksylgrupper er forestret med ytterligere fettsyrer, såkalte estolider.

De andre polare lipidene som utgjør del av galaktolipid-materialet, er en blanding av ulike glyko- og fosfolipider, som f.eks. MGDG og fosfatidylcholiner. Blandingen avhenger av utgangsmaterialet og den anvendte fremgangsmåte for fremstilling av galaktolipidene.

De nøyaktige forhold mellom komponentene av galaktolipid-materialet er ikke avgjørende for foreliggende oppfinnelse så lenge innholdet av DGDG er minst 50%. For mange anvendelser oppnås imidlertid de maksimale fordeler ved et høyt innhold av DGDG, den viktigste dobbeltlag-dannende komponent.

Galaktolipidmaterialet kan ekstraheres fra nesten hvilket som helst plantemateriale. Foretrukne plantematerialer er frø og kjerner fra korn og cerealier, for eksempel hvete, rug, havre, mais, ris, hirse og sesam. Havregryn har i likhet med hvetegluten, en høy lipidkonsentrasjon, og er derfor fordelaktig å benytte ved framstillingsprosessen. Digalaktosyldiacylglycerolene av galaktolipidmaterialet kan også være av syntetisk opprinnelse.

Galaktolipidmaterialet kan benyttes som den polare lipidkomponent i ulikt organiserte løsninger, hvor lipidene danner organiserte partikler som er dispergert i en fortynnet, tilfeldig blandet løsning, så som vann, etanol, glycerol og andre polare løsningsmidler eller blandinger av slike. Den molekylære geometri av DGDG ligner en avkortet kjegle som gjør det mulig å danne fleksible dobbeltlag, hvilket vil si lamellære flytende krystallinske faser, samt liposomer eller vesikler, i vandige løsninger under fysiologiske betingelser.

Galaktolipidene kan oppta slik at de sveller, en betydelig mengde av et polart løsningsmiddel som f.eks. vann. Tilsetning av vann til galaktolipidene fører til spontan dannelse av en klar viskøs gel. Gelen består av en lamellær flytende krystallinsk fase, La, hvor det lipide dobbeltlag alternerer med vann i en lamellær struktur. La-fasen som lett lar seg påvise ved mikroskopi i polarisert lys, er termodynamisk stabil. . Svellingsprosessen er relativt langsom som følge av den høye viskositeten av gelens lamellære flytende krystallinske struktur, men det er imidlertid mulig å fremstille klare, homogene prøver som inneholder helt ned til 10 vekt% vandig løsning ved langsom omrøring i 24 timer. Når gelen først er dannet, er den ekstremt stabil mot kjemisk og mikrobiell nedbrytning og beholder således sin fysiske integritet over et langt tidsrom.

Alternerende lag av galaktosylacylglyceroler og polare løsningsmidler gjør gelstrukturen egnet for inkorporering av både lipofile og hydrofile bioaktive substanser. Den lamellære struktur har en relativt lav viskositet ved høye skjærhastigheter, hvilket gjør det mulig å injisere gelen ved hjelp av en sprøyte med en tynn nål. Formuleringen kan benyttes for administrering av medikamenter til forskjellige steder i mennesker og dyr.

De polare løsningsmidlene er fortrinnsvis slike som er biokompatible og godkjent for bruk i farmasøytiske, kosmetiske eller dietetiske formuleringer, som f.eks. vann, etanol, 1-propanol, 1,2-propandiol, glycerol og blandinger derav.

I henhold til en foretrukket utførelsesform, vedrører oppfinnelsen en farmasøytisk blanding som omfatter en tolags lipid/polar-løsningsmiddelblanding som består av 0,01-90 vekt%, fortrinnsvis 0,1-50 vekt%, av et tolags-dannende materiale i et polart løsningsmiddel, hvor det tolags-dannende materialet er et galaktolipidmateriale fra cerealier bestående av minst 50% digalaktosyldiacylglyceroler, hvor det gjenværende er andre polare lipider, i blanding med en terapeutisk aktiv substans.

I en foretrukket utførelse, omfatter den farmasøytiske blandingen et galaktolipidmateriale som består av ca. 70-80% digalaktosyldiacylglyceroler og 20-30% andre polare lipider.

I henhold til en annen foretrukket utførelse, omfatter den farmasøytiske blandingen et galaktolipidmateriale som består av opptil 100% digalaktosyldiacylglyceroler.

Foretrukket i henhold til oppfinnelsen er også en farmasøytisk blanding som omfatter

en terapeutisk aktiv substans i en terapeutisk effektiv mengde;

et galaktolipidmateriale, som utgjør 1-50 vekt% av hele blandingen;

et polart løsningsmiddel; og

et isotonitetsbevirkende middel i en isotonitetsbevirkende effektiv mengde.

. Den farmasøytiske blandingen i henhold til oppfinnelsen kan administreres peroralt, enteralt, parenteralt, rektalt, vaginalt, lokalt, okulært, nasalt eller aurikulært.

I henhold til et ytterligere foretrukket aspekt av den farmasøytiske blandingen i henhold til foreliggende oppfinnelse, omfatter den en terapeutisk aktiv substans som er et salt eller en ester av ^-linolensyre, og mengden av galaktolipidmaterialet utgjør mindre enn 25 vekt% av hele blandingen.

Endelig omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk liposomblanding hvor 0,01-25 vekt% av galaktolipidmaterialet blandes med den aktive substans og det polare løsningsmiddel i en mengde på opptil 100 vekt%.

Gel lar seg lett fremstille ved å tilsette et polart løsningsmiddel som f.eks. vann, eller en vandig løsning, til det tørre galaktolipidmaterialet, for å gi endelige lipidkonsentrasjoner i området 25-90 vekt%. Blandingene får svelle i 1-24 timer ved romtemperatur under forsiktig omrøring i en passende beholder, f.eks. en glasskolbe eller et åpent begerglass. Slike gel kan også fremstilles i glassrør ved blanding med en stav og sentrifugering ved romtemperatur.

Gelene er pseudoplastiske og bemerkelsesverdig stabile når det gjelder fysisk utseende og mikrobiell resistens. Viskositeten av disse gel påvirkes ikke vesentlig ved moderate temperaturendringer og kan derfor for eksempel overføres direkte fra kjøleskapet til en injeksjonssprøyte eller annen

administrasjonsanordning.

Det vises dessuten at gelen kan virke som langsomt frigivende medium for inkorporerte virkestoffer på en gunstigere måte enn gel fremstillet av fosfolipider.

Det vises dessuten at gelene kan inkorporere et stort utvalg av terapeutiske virkestoffer, inklusivt lipofile komponenter, hydroklorider, nitrater, amfifiler, proteiner og peptider.

En gunstig naturlig side ved galaktosylacylglycerolene er galaktose-enhetene som omfatter den polare hodegruppe i hvert lipidmolekyl, og som kan stabilisere liposomene sterisk og således føre til forlenget levetid ved injeksjon i blodstrømmen.

Liposomer, det vil si multilamellære vesikler, fremstilles ved direkte hydratisering. Et polart løsningsmiddel som f.eks. vann eller en vandig løsning, tilsettes til det tørre galaktolipidmateriale for å gi endelige lipidkonsentrasjoner i området 0,01-25 vekt%. Blandingene får svelle og likevektsinnstilles ved romtemperatur i 1-24 timer under forsiktig omrøring, hvorved det oppnås en liposomdispersjon. Liposomer kan også fremstilles ved å tilsette et overskudd av polart løsningsmiddel til en gel fremstillet som ovenfor, dvs. ved en enkel fortynning av gelen.

Unilamellære vesikler fremstilles fra en multilamellær vesikkeldispersjon, f.eks. ved membran-ekstrudering eller høytrykks homogenisering.

De uvanlige og overraskende svellingsegenskapene til galaktolipid-materialet gjør det bemerkelsesverdig lett å fremstille liposomdispersjoner og vandige gel. Den spontane dannelse av liposomer i vann er for eksempel forbausende anvendelig ved fremstillingen av liposomdispersjoner selv i større skala. Dette avviker fra de fremgangsmåter som trengs for å danne liposomer fra fosfolipider, hvor det benyttes organiske løsningsmidler, som f.eks. kloroform, eter, etanol eller en kombinasjon av disse. Opp-skaleringen av konvensjonelle fosfolipidliposom-fremstillinger er et velkjent problem, og det har vært foreslått mange forskjellige fremgangsmåter for å løse vanskelighetene. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer liposomdispersjoner på en enkel og reproduserbar måte som kan ha vesentlig betydning ved den praktiske utnyttelse av liposomer, for eksempel som medikamentbærere.

Det er her vist at de beskrevne liposomer har en forbausende god innkapslingseffekt.

Det er dessuten vist at liposomene overraskende og klart forlenger levetiden for aktive komponenter, selv dersom vesiklene frembringes i en løsning av disse komponentene, og bare en del av komponentene således innkapsles av vesiklene.

Det er videre vist at liposomene reduserer toksisiteten av et potent anticancer-medikament uten å redusere den farmakologiske effekt.

Liposomene er biologisk klebrige og kan derfor løse problemet med riktig tilgjengelighet av et inkorporert virkestoff til visse biologiske overflater, som for eksempel hornhinne og slimhinner.

Liposomene kan inkorporere et stort utvalg av terapeutiske virkestoffer, inklusivt lipofile komponenter, hydroklorider, nitrater, amfifiler, proteiner, peptider og andre.

Syntetiske diglykosyldiacylglyceroler på basis av galaktose eller andre monosakkarid-enheter, som f.eks. glukose, og naturlige glykosylglycerider, isolert fra en hvilken som helst kilde, på basis av andre karbohydrat-enheter enn galaktose, som f.eks. glukose, kan benyttes i henhold til oppfinnelsen.

Galaktolipidmaterialer

Galaktolipidmaterialer er som angitt nedenfor, fremstillet fra ulike cerealier og benyttet til fremstilling av bærerblandinger og farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen, slik som angitt i eksemplene. I denne beskrivelse refererer % seg til vekt% om intet annet er angitt. Forholdet mellom løsningsmidler i løsningsmiddel-blandinger er angitt i volumdeler.

Galaktolipidmateriale fra havre

200 kg havrekorn (Kungsornen AB, Sverige) ble oppmalt og ekstrahert med 1000 L 95% etanol ved 70°C i en ekstraksjonstank under omrøring i 3 timer. Oppslemmingen ble sentrifugert mens den enda var varm og skilt fra faste partikler. Væskefraksjonen ble inndampet ved 60°C, hvilket ga ca. 10 kg lysebrun olje.

Oljen ble overført til en kolonne av rustfritt stål inneholdende 6,25 kg silikagel (Matrex Silika, Si, partikkelstørrelse 20-45 mm, porediameter 60 Å fra Amicon Corp., USA). Kolonnetemperaturen var 50°C. Kolonnen ble deretter vasket med 30 L av en blanding av heksan:isopropanol, 90:10, for å fjerne alle upolare lipider.

Galaktolipidmaterialet ble deretter eluert fra kolonnen med 20 L av en blanding av heksan:isopropanol, 60:40, hvilket ga en

galaktosyldiacylglycerolfraksjon. Inndampning av denne fraksjon førte til ca. 700 g DGDG, hovedlipid-klassen. Galaktolipidmaterialet ble deretter dispergert i vann og underkastet frysetørking, hvilket resulterte i et frittstrømmende pulver.

Anrikning av DGDG fra galaktolipider

50 g galaktolipider fra havre, oppnådd som ovenfor, med et DGDG-innhold på ca. 70%, ble løst i 250 ml_ heksan:isopropanol, 70:30, hvilket ga en totalmengde på 300 ml_. Den oppnådde løsning ble avsatt på en silikagelkolonne (110 g) og de mindre polare bestanddelene eluert med 1 L av blandingen av heksan:isopropanol, 70:30. Den anrikede DGDG-fraksjon ble eluert med 2 L aceton. Acetonfraksjonen ble inndampet og frysetørket. Totalutbyttet var 17 g av et nesten rent DGDG-produkt.

Hydrogenering av galaktolipider

200 g av en galaktolipidblanding oppnådd fra havre slik som angitt ovenfor, ble løst i 2 L varm isopropanol. 15 g palladium på kull katalysator (Pd 15%, vanninnhold 53%, Engelhard Rome s.r.i., Italia) ble plassert i bunnen av en

trykkreaktor (Modell nr. 4552M; Parr Instrument Co., USA) forsynt med to skovler på en røreraksling. Løsningen ble deretter overført til reaktoren under nitrogenforsegling for å redusere brannfaren. Reaktorbeholderen ble lukket og satt under trykk med nitrogen tre ganger for å fjerne luft og deretter tre ganger med hydrogen-gass (Plus 4.5, fra AGA Gas AB, Sverige). Hydrogentrykket ble deretter holdt ved 6 bar, rørerverket innstillet på 600 rpm. og blandingen oppvarmet til 70°C. Det tok 14 minutter for reaksjonsblandingen å nå den innstilte temperatur. Hydrogeneringsprosessen ble foretatt i 6 timer, hvoretter reaksjonsproduktet ble frafiltrert gjennom et 0,45 /ym filter for å fjerne karbonpartikler og palladium. Løsningsmidlet ble fordampet på en rotasjonsfordamper og det gjenværende faste materialet dispergert i 1600 mL deionisert vann og frysetørket.

Utbyttet av hydrogenerte galaktolipider etter filtrering og frysetørking var 155 g. Hydrogeneringseffekten ble bestemt ved gasskromatografi som viste at det bare kunne påvises mettede fettsyrer i det hydrogenerte produktet.

Galaktolipider fra hvetegluten

1 kg hvetegluten-pulver (AB Skånebrånnerier, Sverige) ble ekstrahert i et begerglass med 4 L 95% etanol ved 70°C i 3 timer. Oppslemmingen ble deretter filtrert under et trykk på 400-500 kPa og den oppnådde filterkake vasket med 1 L varm 95% etanol. De kombinerte etanolløsningene ble inndampet ved maksimalt 60°C og ga ca. 60 g gul olje.

Oljen ble overført til en kolonne av rustfritt stål inneholdende 45 g silikagel (Matrex Silica Si, partikkelstørrelse 20-45 /<y>m, porestørrelse 60 Å, fra Amicon Corp., USA). Kolonnen ble deretter vasket med 700 mL av en blanding av heksamisopropanoi, 90:10, for å fjerne nøytrale lipider.

For å fjerne MGDG og enkelte polare lipider, ble kolonnen deretter vasket med 1000 mL av en blanding av heksan:isopropanol, 70:30. Eluering av DGDG ble foretatt med 1000 mL ren aceton. Etter inndampning ble det oppnådd ca. 4 g av et nesten rent DGDG-produkt.

Galaktolipider fra rug

100 g rugflak (Kungsornen AB, Sverige) ble omrørt i 60 minutter i en blanding av teknisk heksan og isopropanol, 90:10. Oppslemmingen ble filtrert og

inndampet, hvilket førte til 0,5 g polare lipider. Residuet, løst i 10 mL av en blanding heksan og isopropanol, 70:30, ble avsatt på tre Sep-pak Silika plus kolonner (Millipore Corp., USA) forbundet i serie, vasket med 20 mL av den samme løsningsmiddelblandingen og eluert med 15 mL aceton. Eluatet ble inndampet og frysetørket og ga et utbytte på 47 mg galaktolipider.

Kjemisk og fysikalsk karakterisering av ulike galaktolipid-materialer Lipidklasse-analyse

Lipidklasse-analyse ble foretatt ved HPLC (high performance liquid chromatography) ved å benytte en kolonne pakket med diol-modifisert silika (LiChrosphere 100 DIOL, 5jt/m, 250 mm x 4 mm i.d.; E. Merck, Tyskland). Kolonnen var innesluttet i et vannbad som ble holdt ved 75°C. Det analytiske systemet besto av en HPLC-pumpe, CM 4000 (LDC/Milton Roy, USA) og en injektor, modell 7125, med en 20 jjL injeksjonssløyfe (Rheodyne Inc., USA). Detektoren av "evaporative light-scattering"-type var en Sedex45 (S.E.D.E.R.E., Frankrike) forsynt med et Sedex 55 tåkekammer med en drift-rørtemperatur og et luftinnløpstrykk på henholdsvis 97°C og 2,0 bar.

Strømningshastigheten av den mobile fase under analysen var 1 mL/min. En binær løsningsmiddelgradient, som var lineær i 25 minutter, ble benyttet ved å gå utfra 100% A og avslutte med 100% B, hvor A = heksan:isopropanol:-n-butanol:tetrahydrofuran:isooktan:vann, 64:20:6:4,5:4,5:1, og B = isopropanol:-n-butanol:tetrahydrofuran:isooktan:vann, 75:6:4,5:4,5:10. Alle løsningsmidlene inneholdt ammoniumacetat, 180 mg/L.

Datainnsamling og -behandling ble foretatt med GynkoSoft Data system versjon 4.22 (Softron GmbH, Tyskland). En typisk injisert mengde for analysen var 100 jjg. Identifikasjonen var basert på retensjonstidssammenligning med autentiske standarder (Karlshamns LipidTeknik AB, Sverige). Flyktige forbindelser ble ikke påvist i dette systemet. Kvantifiseringen var basert på toppareal-beregninger.

Zeta-potensialer ble bestemt på fortynnede vandige galaktolipiddispersjoner med etZetasizer4 instrument (Malvern Instruments, Ltd., Storbritannia).

I foreliggende Tabell 1 så vel som i Tabell 2 nedenfor, benyttes følgende forkortelser:

o-GL = galaktolipider fra havre

o-h-GL = hydrogenerte galaktolipider fra havre

o-DGDG = anrikede galaktolipider fra havre

w-GL = galaktolipider fra hvete

w-DGDG = anrikede galaktolipider fra hvete

r-GL = galaktolipider fra rug

Fettsyreanalyse

Analyse av fettsyreprofilen ble foretatt ved gasskromatografi etter omestring av lipidene til fettsyre-metylestere. Disse ble separert og kvantifisert ved gasskromatografi på kapillærkolonne på en Varian 3500 kapillær gasskromatograf forsynt med en kapillærkolonne 30 m x 0,25 mm i.d. (DB-WAX; J&W Scientific, USA), med en on-column injektor og en flamme-ionisasjonsdetektor. Helium ble benyttet som bærergass. Integreringen ble foretatt med Gynkosoft Data system versjon 4.22 (Softron GmbH, Tyskland). Omestringen ble utført ved å tilsette 1 mg av lipidprøven til 2 mL dimetylkarbonatisooktan, 1:1. 1 mL av en løsning inneholdende 2,3 g natrium løst i 200 mL metanol, ble tilsatt og reagensrøret ristet kraftig i 30 sekunder og satt tilside ved romtemperatur i 15 minutter for å sikre fullstendig omsetning. Det ble tilsatt 3 mL vann, og reagensrøret ble ristet og deretter sentrifugert ved 2 x g. 0,5 //L av det organiske lag ble injisert på kromatografen under følgende separasjonsbetingelser. Ovnen ble temperaturprogrammert med start ved 130°C (2 min.), økende til 150°C

(30°C/min.) og til 220°C (3,2°C/min.) med et 10 minutters opphold. Injektor-temperaturen var 130°C og detektortemperaturen 250°C. Initialt var gass-strømmen 2,7 mUmin. Resultatene er uttrykt som normaliserte vektprosenter ved å benytte ekstern standard. Det ble ikke foretatt korreksjoner for underordnede komponenter som det ikke fantes standarder med akseptabel renhet for.

NMR-spektroskopi av digalaktosyldiacylglyceroler

En-dimensjonale proton-dekoblede "natural abundance" <13>C-NMR-spektra ble tatt opp på et Bruker AM-400 spektrometer (Bruker Analytische Messtechnik GmbH, Tyskland) ved en <13>C-frekvens på 100,614 MHz. Pulsvinkelen var 36°, pulsrepetisjonstiden 1,0 s og oppløsningen 1,526 Hz per datapunkt. 3 Hz linjebredning ble benyttet under prosessering. Prøvene (10-40 mg) ble fortynnet i en blanding av 730 /vL DMSO-d6 (Aldrich Chemical Comp., Inc., USA) og 20 pl D2O (Aldrich Chemical Comp. Inc., USA) og overført til et NMR-rør (5 mm i.d.).

Eksempler

Eksempel 1. Dannelse av en vandig gel

Galaktolipidmaterialet fremstillet fra havre, ble blandet med ulike mengder vann for å teste svellingsevnen i vann. Lipid/vann-prøver ble fremstillet på vektbasis i glassrør. Prøvene ble vekselvis blandet med en stav og sentrifugert ved romtemperatur inntil det tydeligvis var dannet homogene systemer. Prøvene ble undersøkt med henblikk på fysisk utseende etter opbevaring i 6 måneder ved romtemperatur. Den lamellære flytende krystallinske fase ble påvist ved mikroskopi i polarisert lys. Resultatene er sammenfattet i den følgende tabell:

Dette betyr at det ble dannet en homogen enkelfase-gel ved et galaktolipidinnhold på ca. 25% og høyere.

Eksempel 2. Viskositetsegenskaper til en vandig gel

En galaktolipidgel inneholdende 55% vann, ble fremstillet ifølge Eksempel 1. Viskositetsmålinger ble foretatt med et Bohlin VOR reometer (Bohlin Reologi AB, Sverige) forsynt med en konsentrisk sylinder (C14; torsjonsmoment: 91 gem) under forskjellige skjærhastigheter og temperaturer. Viskositeten ble målt 24 timer etter fremstillingen. Steady-flow viskositetsverdier (i Pa*s) er sammenfattet nedenfor:

Det ble fastslått at prøven var pseudoplastisk ("shear-thinning"), dvs. viskositeten var avhengig av skjærhastigheten, en reologisk egenskap som er typisk for lamellære flytende krystallinske faser. En temperaturøkning resulterte dessuten bare i en svak senkning av viskositeten, hvilket tyder på at det i det undersøkte temperaturområdet ikke forekommer faseoverganger. Etter opppbevaring av gelen i 18 måneder ved romtemperatur, ble den inspisert visuelt. Det kunne ikke iakttas mikrobiell vekst. Det fysiske utseende hadde ikke endret seg under lagringen, og dette er bemerkelsesverdig siden det ikke ble tatt forholdsregler med hensyn til lagringstemperatur, antioksydanter, konserverings-midler, etc.

Dette gjenspeiler den fremragende stabilitet av galaktolipidmaterialet selv i et vandig miljø som kunne ha forårsaket f.eks. hydrolyse av acylkjedene eller mikrobiell nedbrytning.

Eksempel 3. Frigjøringstest

In vitro prøver på frigjøring av et vannløselig farvestoff, metylenblått (E. Merck, Tyskland) ble foretatt på galaktolipid- og fosfolipidgel som innledningsvis

inneholdt 60% lipid og 50 mM metylenblått. Galaktolipidmaterialet ble fremstillet fra havre. Fosfolipidet var kromatografisk renset fosfatidylcholin fra soyabønne (s-PC; Karlshamns LipidTeknik AB, Sverige). Diffusjonsmediet var membran-filtrert vann, likevektsinnstillet ved 37°C. Diffusjonscellen besto av en membranslange

fremstillet av regenerert cellulose (Spectra/Por; molekylvekt cut-off; 6.000-8.000; flat bredde: 1,0 cm) inneholdende ca. 2,5 g gel. Slangen ble senket ned i et termostatert begerglass (i.d. 10 cm) inneholdende 250 g medium, i en fiksert posisjon ca. 3 cm fra bunnen. Begeret ble anbrakt på en magnetrører med en rotasjonshastighet på 200 rpm. Alikvoter av mediet ble uttatt til bestemte tidspunkt og analysert spektrofotometrisk ved 665 nm. Som referanse ble også frigjøringen

av metylenblått fra en celluloseslange inneholdende 50 mM vandig metylenblått-løsning, målt.

Etter 2,5 timer kunne det ikke påvises noen synlig frigjøring av farvestoff fra galaktolipidgelen, mens 1,3% ble frigjort fra s-PC-gelen. Etter 5 timer hadde galaktolipidgelen frigitt kun 0,13% av dens farvestoffinnhold, hvilket var ca. 12 ganger mindre enn tilsvarende for s-PC-gelen.

Dette tyder på, at galaktolipidformuleringen ville resultere i en langsom frigjøring av et bioaktivt materiale når det ble administrert in vivo og at det således ville være egnet som en depot-formulering.

Eksempel 4. Frigjøringstest

En in vitro frigjøringstest av et vannløselig medikament, Remoxipride-hydroklorid-monohydrat (Astra AB, Sverige) ble foretatt på en galaktolipidgel som innledningsvis inneholdt 60% lipid, 15% Remoxipride-hydroklorid og 25% vann.

Diffusjonsmediet var en fosfatbuffer (pH 7,4; ionestyrke 0,05 M) likevektsinnstillet ved 37°C. Diffusjonscellen besto av et membranslange fremstillet av regenerert cellulose (Spectra/Por 3; molekylvekt cut-off; 3.500; flat bredde: 1,0 cm; lengde 4 cm) inneholdende ca. 1 mL gel. Slangen ble stengt i begge ender med tyngdeklammere og anbragt på bunnen av et termostatisert oppløsningsbad (SotaxAT6; i.d. 10 cm), inneholdende 600 mL fosfatbuffer. Bufferløsningen ble omrørt med en skovlerører med en hastighet på 50 rpm. En prøve på 1 mL ble tatt ut til bestemte tidsrom og analysert. Prøven ble erstattet med 1 mL buffer. Konsentrasjonen av Remoxipride ble bestemt ved omvendt fase væskekromatografi på en //-Bondapak C18-kolonne. Det anvendte elueringsmiddel varen blanding av fosfatbuffer, pH 1,8, og acetonitril, 4:1. En spektrofotometrisk detektor ble benyttet og bølgelengden var 254 nm.

Gelen bevirket en forbausende lav frigjøring av det inkorporerte medikament. Etter 2 timer var mindre enn 2% av det inkorporerte medikament frigjort fra galaktolipidgelen. Ca. 3% var frigjort etter 4 timer.

Dette tyder på at galaktolipidformuleringen er egnet som et parenteralt depot for forlenget frigjøring av et bioaktivt materiale, her eksemplifisert ved hjelp av Remoxipride-hydroklorid.

Eksempel 5. Dannelse av liposomer

Liposomer, hvilket vil si multilamellære vesikler, ble fremstillet og karakterisert på følgende måte. Vann ble tilsatt til galaktolipider fra havre for å gi sluttkonsentrasjoner på 1,0 og 10,0% lipid. Prøvene fikk likevektsinnstilles ved romtemperatur i 24 timer under forsiktig omrøring for å gi liposom-dispersjoner.

For å fremstille unilamellære vesikler ble en del av dispersjonen overført til et glassrør og opprevet ved hjelp av en ultralydsender (XL-2020; Heat Systems, Inc., USA) forsynt med en sonde med mikro-spiss, over nitrogen ved 0°C. Følgende innstillinger ble benyttet: output control 3,5, prosesseringstid 3x2 min., puls off 2 x 4 min.

Partikkelstørrelsesfordeling av de resulterende liposomdispersjoner ble bestemt ved dynamisk lysspredning (Zetasizer4, Malvern Instruments, Storbritannia) ved en vinkel på 90° og ved romtemperatur, ved å benytte en ZET5110 "sizing cell" og multimodal analyse. Følgende resultater, angitt som Z-gjennomsnitt, ble oppnådd:

De resulterende dispersjoner ble før og etter ultralydbehandling undersøkt med et optisk mikroskop (40-100x, Olympus CH-2, Japan). En liten prøve av liposom-dispersjonen ble anbragt på et objektglass. Prøvens utseende ble deretter betraktet mellom kryssede polarisatorer. Bare de ikke-ultralydbehandlede liposomene kunne observeres, og disse hadde den karakteristiske form av malteserkors. Galaktolipidenes evne til å danne vesikler ble også bekreftet gjennom "freezefracture" transmisjons-elektronmikroskopi.

Disse resultatene viser galaktolipidenes fremragende evne til å danne multilamellære vesikler ved å benytte den enkle direkte hydratiseringsmetode uten tilsetning av flyktige organiske løsningsmidler eller ko-surfaktanter. Små unilamellære vesikler dannes deretter lett ved ultralydbehandling, som ovenfor beskrevet, eller på en hvilken som helst konvensjonell måte, f.eks. ved ekstrudering gjennom en polykarbonatmembran.

Eksempel 6. Innkapslingseffektivitet

Innkapslingseffektiviteten av et inkorporert farvestoff i vesikler av galaktolipidmaterialet fremstillet fra havre, ble undersøkt. Galaktolipidmaterialet ble hydratisert direkte i en vandig 20 mM fluorescein-løsning i en konsentrasjon på 4,8%. Dispersjonen fikk lov til å svelle i 24 timer ved romtemperatur.

De farvestoff-ladede vesiklene ble fraskilt fra det ikke-inkorporerte farvestoff, ved gel-filtrering på en Sephadex G 50 kolonne (høyde 60 cm., i.d. 1,5 cm) ved romtemperatur. En EDTA-buffer (1 mM EDTA, 5 mM Tris, 150 mM NaCI), justert til pH 7,4, ble benyttet som eluent. En konsentrert farvestoff-ladet liposomdispersjon ble avsatt på kolonnen, etterfulgt av bufret EDTA-løsning. Kolonne-eluatet ble kontinuerlig målt ved 240 nm i et UV-spektrofotometer forsynt med en mikro-gjennomstrømningskuvette og en skriver, og oppsamlet med en automatisk fraksjonssamler. To fraksjoner, de farvestoffladede vesiklene og den ikke-oppfangede farvestoffløsning, ble oppsamlet hver for seg og justert til definerte volumer. Farvestoffkonsentrasjonene ble bestemt spektrofotometrisk ved 285,2 nm, og ut fra disse dataene ble det oppfangede volum og innkapslingseffektiviteten beregnet. Følgende resultater ble oppnådd: oppfanget volum 2,1 /A/mg lipid og innkapslingseffektivitet 11%. Vesikkelstørrelsen ble bestemt til 509 nm (Z-gjennomsnitt).

Direkte hydratisering av galaktolipidene resulterer som beskrevet i Eksempel 5, i dannelse av multilamellære vesikler. De ovenfor angitte data tyder på at disse vesiklene har et vesentlig høyere oppfanget volum og en bedre innkapslingseffektivitet enn konvensjonelle vesikler basert på fosfolipider, som angis å ha et oppfanget volum på ca. 0,5 //L/mg lipid.

Den direkte hydratiseringsmetode for fremstilling av multilamellære vesikler er en teknisk sett enkel og hurtig metode og således industrielt anvendelig. Ved å anvende denne fremgangsmåte på galaktolipidmaterialet, er det også mulig å oppnå et betydelig høyere oppfanget volum, det vil si en meget bedre innkapslingseffektivitet, som tidligere har utgjort den vesentlige ulempe ved anvendelse av fosfolipider for fremstilling av multilamellære vesikler.

Eksempel 7. Dannelse av vandige dispersjoner

Anriket galaktolipidmateriale, DGDG, fra havre, ble blandet med vann for å teste svellbarheten i vann. Lipid/vann-prøver ble fremstillet som beskrevet i Eksempel 1. Resultatene er sammenfattet i den etterfølgende tabell:

Som med det ikke-anrikede materiale, var det anrikede materialets svellbarhet i vann særdeles god, og det ble lett dannet homogene dispersjoner.

Eksempel 8. Dannelse av vandige dispersjoner

Hydrogenert galaktolipidmateriale fra havre ble blandet med vann for å teste svellbarheten i vann. Lipid-vann-prøvene ble fremstillet som beskrevet i Eksempel 1.

Som med det ikke-hydrogenerte materiale, var det hydrogenerte materialets svellbarhet i vann særdeles god. Dette materiale inneholder kun mettede fettsyrerester som betyr at det fører til en sterk ordnet, krystallinsk struktur, både i tørr tilstand og i nærvær av vann. Kjede-smeltepunktet for det hydrogenerte materiale som en dispersjon i vann, var ifølge differensiell skanderende kalorimetri ca. 55°C. Den tilsvarende verdi for et ikke-hydrogenert materiale var godt under 0°C.

Eksempel 9. Fremstilling av vannfrie viskøse dispersjoner

Viskøse dispersjoner ble fremstillet etter følgende resepter:

Galaktolipidene, fremstillet fra havre, og glycerol ble avvekslende blandet med en stav og sentrifugert ved romtemperatur inntil det dannet seg sterkt viskøse, homogene og tilsynelatende isotrope, væsker. Begge væskene besto i henhold til deres tekstur i det polariserende lysmikroskop, av en dispersjon av en lamellær fase i glycerol, dvs. multilamellære vesikler. Prøvene ble undersøkt med henblikk på fysisk utseende etter oppbevaring ved romtemperatur i 1 år. Det kunne ikke iakttas sedimentering, uansett galaktolipidkonsentrasjon, hvilket tyder på at glycerolet hadde en stabiliserende effekt på vesikkeldispersjonen.

Eksempel 10. Fremstilling av en vannfri formulering for bruk ved forbedring av slimhinne-tilstand

Sulfhydryl-inneholdende midler som DL-cystein og N-acetyl-L-cystein, kan stimulere tilhelingen og forhindre residiv av human duodenal ulcerasjon. Gastriske ulcerasjoner kan dannes ved ischemi eller skadelige substanser som etanol og acetylsalicylsyre, som ødelegger og fjerner den duodenale mukosa.

Det ble fremstillet en formulering ved å benytte følgende ingredienser:

N-acetyl-L-cystein ble løst i glycerol under forsiktig omrøring og oppvarming til ca. 60°C i et åpent begerglass. Galaktolipidmaterialet ble deretter tilsatt og den resulterende, tilsynelatende klare, væske overført til en glassbeholder med en plastkork. Preparatet som ifølge mikroskopering under polarisert lys, utgjorde en dispersjon, ble oppbevart i kjøleskap i mer enn 6 måneder.

Glycerol ble valgt som løsningsmiddel siden sulfhydryl-inneholdende substanser som N-acetyl-L-cystein er ustabile i vandig løsning og kan omdannes til substanser som ikke har noen farmakologisk effekt på slimhinnen.

Galaktolipidmaterialet er i seg selv fordelaktig, da in vivo undersøkelser på rotter har vist at det har en beskyttende effekt på maveslimhinnen.

Forskjellige lokalformuleringer med hydrokortison, et antiinflammatorisk medikament, ble fremstillet som beskrevet i Eksempel 11-14. Galaktolipidmaterialet ble fremstillet fra havre. Alle formuleringene var stabile i mer enn 2 måneder ved romtemperatur.

Eksempel 11

Hydrokortison og galaktolipidene ble grundig blandet på en virvelblander (vortex). Etter tilsetning av vann ble formuleringen avvekslende blandet, sentrifugert og forsiktig oppvarmet inntil det var oppnådd en fin melkeaktig dispersjon.

Eksempel 12

Hydrokortison ble løst i 1-propanol under forsiktig oppvarming og blanding. Etter tilsetning av vann og galaktolipidene, ble blandingen avvekslende blandet, sentrifugert og forsiktig opvarmet inntil det ble oppnådd en opak, sterkt viskøs gel.

Eksempel 13

Hydrokortison ble løst i 1,2-propandiol under forsiktig oppvarming og blanding. Etter tilsetning av vann og galaktolipidmaterialet, ble blandingen avvekslende omvirvlet, sentrifugert og forsiktig oppvarmet inntil det ble oppnådd en gulaktig, nesten gjennomsiktig gel.

Eksempel 14

. Hydrokortison ble løst i etanol under forsiktig oppvarming og blanding. Etter tilsetning av vann og galaktolipidene, ble blandingen avvekslende omvirvlet, sentrifugert og forsiktig oppvarmet inntil det ble oppnådd en lysebrun gjennomsiktig gel.

I Eksempel 15-17 er det beskrevet forskjellige vannfrie preparater for lokal anvendelse. Hydrokortison ble igjen valgt som modellmedikament. Galaktolipidene ble fremstillet fra havre. Alle preparatene var stabile i mer enn 2 måneder ved romtemperatur.

Eksempel 15

Galaktolipidene ble dispergert i glycerol. Etter at det var oppnådd en homogen gelfase ble hydrokortison tilsatt. Blandingen ble forsiktig oppvarmet og deretter blandet på en virvelblander. Den resulterende formulering som utgjorde en suspensjon, var en gulaktig, viskøs gel som inneholdt findispergerte faste hydrokortisonpartikler.

Eksempel 16

Formuleringen ble fremstillet som i Eksempel 15. Den resulterende formulering var en opak, sterkt viskøs gel med en lysegul farve.

Eksempel 17

Hydrokortison ble delvis oppløst i propanol under forsiktig oppvarming og blanding. Etter tilsetningen av galaktolipidene og kraftig omrøring, ble glycerol tilsatt. Formuleringen ble deretter omvirvlet, sentrifugert og oppvarmet inntil det dannet seg en gulaktig gel-lignende fase. Gelen inneholdt findispergerte hydrokortisonpartikler.

Eksempel 18. Sopphindrende formulering for vaginal administrering

Mikonazol-nitrat og galaktolipidene, fremstillet fra havre, ble godt blandet på en virvelblander. Etter tilsetning av vann ble formuleringen avvekslende omvirvlet og omrørt inntil det ble oppnådd en brunaktig, homogen og sterkt viskøs gel.

Eksempel 19. Antibakteriell formulering som sårdressing

Doxycyclin-hydroklorid ble løst i vann og ga en gul løsning. Etter tilsetning av galaktolipidene, fremstillet fra havre, ble blandingen avvekslende omvirvlet og omrørt inntil det ble oppnådd en lys brunaktig, sterkt viskøs gel.

Eksempel 20. Antibakteriell formulering for administrering i den ytre øregang

Doxycyclin-hydroklorid ble løst i vann og ga en gul løsning. Etter tilsetning av galaktolipidene, fremstillet fra havre, ble blandingen omvirvlet inntil det ble oppnådd en gul og melkeaktig doxycyclin-ladet vesikkeldispersjon.

Eksempel 21. Antidiabetisk formulering for nasal administrering

Galaktolipidene, fremstillet fra havre, ble hydratisert i den kommersielle insulinløsningen under forsiktig omrøring i 24 timer. Den resulterende dispersjon ble overført til en konvensjonell nesespray-flaske som kunne frembringe en fin aerosolspray.

Eksempel 22. En spermicid formulering

En blanding av de tre komponentene ble avvekslende omvirvlet, sentrifugert og forsiktig oppvarmet inntil det ble oppnådd en lys brunaktig, gjennomsiktig gel.

Eksempel 22. Analgetisk formulering for rektal administrering

Galaktolipider, fremstillet fra havre, og paracetamol ble blandet godt. Etter tilsetning av vann, ble formuleringen avvekslende blandet med en stav, forsiktig oppvarmet og deretter sentrifugert ved romtemperatur inntil det ble oppnådd en gulbrun, sterkt viskøs gel.

Viskositeten av galaktolipidformuleringene påvirkes ikke i vesentlig grad av moderate temperaturendringer. En formulering som oppbevares i kjøleskap, lar seg lett overføre til en sprøyte eller lignende innretning, og kan deretter administreres rektalt og derved oppvarmes til kroppstemperatur uten at dens viskositet eller konsistens går tapt.

Eksempel 24. Antiglaukom-formulering for okulær administrering

Galaktolipidene, fremstillet fra havre, ble dispergert i en del av vannet hvor det fikk svelle over natten under forsiktig omrøring ved romtemperatur. Timolol-maleat, løst i resten av vannet, ble deretter tilsatt og den resulterende liposomdispersjon overført til et glassrør og opprevet med et ultralydapparat (XL-2020; Heat Systems Inc., USA; output control 4) forsynt med en sonde med mikro-spiss, over nitrogen ved 0°C i 10 minutter.

Dette resulterte i en klar dispersjon inneholdende små mono-lamellære vesikler og et medikament i en farmakologisk effektiv mengde for anvendelse som øyedråpe-formulering. Galaktolipidene gir formuleringen både en øket viskositet og en forbedret bioadhesivitet som kan bevirke bedre biotilgjengelighet av medikamentet som følge av lengre oppholdstid på hornhinnen.

Eksempel 25. Inkorporering av litiumsaltet av gammalinolensyre i galaktolipidliposomer

En liposom-formulering av galaktolipid og litiumsaltet av gammalinolensyre, et anti-cancermedikament, ble fremstillet som følger.

Li-GLA, med et gammalinolensyre-innhold på 75%, ble anskaffet fra Callanish Ltd. Skottland. Det anrikede galaktolipidmaterialet, fremstillet fra havre, og Li-GLA ble blandet og deretter tilsatt glycerol-løsningen på 2,3%. Blandingen fikk stå for hydratisering (eller svelling) i 8 timer. Etter blanding under høy skjærspenning ved 12.000 rpm. i 30 sekunder, ble liposom-dispersjonen homogenisert ved 86 MPa i 3 minutter (EmulsiFlex-C30, Avestin Inc., Canada). En Li-GLA konsentrasjon på 1,5% tilsvarer 53 mM.

Den hemolytiske effekt av liposom-dispersjonen ble undersøkt in vitro som angitt nedenfor under Test 6.

Eksempel 26. Fremstilling av en dispersjon inneholdende 10% L-tyrosin

En dispersjon ble fremstillet på følgende måte:

Alle ingrediensene ble slått sammen og blandet under høy skjærspenning ved 15.000 rpm. i 4 minutter for å danne en homogen dispersjon. Dispersjonen var stabil i flere uker etter fremstillingen.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser et mikrofotografisk mønster i polarisert lys av liposomer fremstillet ifølge Eksempel 9 fra 10 vekt% galaktolipider i glycerol ved en forstørrelse på 100x. Den kuleformede fasong med malteserkorsene er karakteristiske trekk ved liposomer. Figur 2 viser den nerveblokkerende effekt av et lokalanestetisk medikament i en rotte med fast implantert intratekalkateter, slik som beskrevet nedenfor i Test 3.

Biologiske tester

Test 1. Hudirritasjon in vivo

For å vurdere hudtoksisiteten av galaktolipidene ifølge oppfinnelsen ble følgende test utført.

Galaktolipider fra havre ble blandet med vann for injeksjon til en 10% gel og påført i et doseringsnivå på 0,5 mL per dyr på den intakte huden til seks hannkaniner av rasene New Zealand White og holdt under semiokklusiv bandasjering i 4 timer. En hudundersøkelse med henblikk på erytrem og ødem, ble deretter foretatt 1, 24, 48 og 72 timer etter fjerning av bandasjen. Gjennomsnittsverdiene ble deretter beregnet ut fra vurderingen av hudlesjonene ved 24,48 og 72 timer. Resultatene er angitt i Tabell 5 nedenfor.

Ut fra dette kan det trekkes den konklusjon at påføring av en galaktolipidgel ikke forårsaker noe merkbart irritament.

Test 2. Vurdering av utskilling av galaktolipidliposomer in vivo

Fremstilling av <3>H-fettsyre-merket DGDG

En mengde på 500 mg av galaktolipider fra havre ble tritium-merket ved katalytisk redusjon av dobbeltbindingene i fettsyredelene med tritiumgass (Amersham Tritium Labeling Service, Storbritannia). Den spesifikke aktivitet utgjorde 36-60 Ci/mmol per redusert dobbeltbinding. <3>H-DGDG ble renset ved todimensjonal tynnskiktkromatografi på silikagel 60 plater. Mobilfasen i den første retningen var kloroform:metanol:vann, 65:25:4 (volumdeler) og i den andre retningen kloroform:metanol:eddiksyre:vann, 85:15:10:3,5 (volumdeler). DGDG-flekken ble eluert suksessivt med kloroform:metanol:vann, 65:25:4 (volumdeler) og 50:50:10 (volumdeler), ren metanol og metanol:vann, 1:1 (volumdeler). Andelen av <3>H i den lipofile del av galaktolipidmolekylet ble bestemt som følger: 18 nCi 3H-merket DGDG og 2 mg umerket materiale ble underkastet alkalisk hydrolyse i 1 mL 1 M KOH ved 60°C i 4 timer. Etter nøytralisering med 0,2 mL 5 M HCI, ble 5 mL kloroform, 1,5 mL etanol og 2,5 mL vann tilsatt. Fra denne tofase-fordeling ble 97% av radioaktiviteten gjenvunnet i den nedre (kloroform) fase.

Umerkede galaktolipider og <3>H-DGDG i en totalkonsentrasjon på 2,0 vekt% ble dispergert i 2,5 vekt% glycerol i vann. Liposom-dispersjonen ble likevektsinnstillet i 36 timer ved 4°C. Den ble deretter ultralydbehandlet med en sonde med mikro-spiss i 3 x 2 min., pulse off time 4 min., over nitrogen ved 0°C.

Test på rotter

Fastede Sprague Dawley hannrotter med en vekt på ca. 250 g, ble anestetisert med dietyleter. 0,5 mL av den ultralydbehandlede dispersjon med en radioaktivitet på 1,8-2,7 //Ci, ble injisert i vena jugularis externa. Dyrene ble avlivet ved aortapunksjon etter 2 min., 15 min., 60 min., 4 timer og 20 timer. Lipider i lever- og blodplasmaprøver ble ekstrahert med kloroform:metanol, 1:1 (volumdeler). Ekstraktene ble tørket under nitrogen, løst opp igjen i kloroform og underkastet tynnskiktkromatografi på silikagel 60 plater utviklet i kloroform:metanol:vann:eddiksyre, 65:25:4:4 (volumdeler). DGDG-flekken ble skrapet over i telleglass; 1 mL metanohvann, 1:1 (volumdeler) ble tilsatt og blandingen omvirvlet før tilsetning av 10 mL toluen:lnstagel (Packard Instruments B.V., Nederland), 1:1 (volumdeler). Radioaktiviteten ble bestemt i en Packard TriCarb væskescintillasjonsteller. Dataene er uttrykt som % injisert dose av 3H-DGDG i 10 mL blodplasma (4% av total kroppsvekt) og hel lever til forskjellige tidspunkter, og er sammenfattet i tabellen nedenfor.

Disse resultatene tyder på at vesikler som inneholder DGDG har en halveringstid på ca. 30 min., når de injiseres intravenøst i rotter. Dessuten er det tydelig at galaktolipidvesiklene utskilles fra blodstrømmen og brytes effektivt ned, hovedsakelig av leveren.

Test 3. Formuleringer med et lokalanestetisk medikament og in vivo undersøkelser av spinalanestesi i rotter

Forskjellige formuleringer av bupivacain-hydroklorid, et lokalanestetikum, ble fremstillet som følger.

Formuleringenes evne til å forlenge varigheten av virkningen av et lokalt anestetikum på ryggmarg og nerverøtter, ble undersøkt i et kontrollert forsøk på rotter med varig implanterte intratekal-katetere.

Fire grupper Sprague Dawley hannrotter (vekt: 235-300 g) ble undersøkt 1

uke etter implantering av intratekal-kateteret etter fremgangsmåten til T.L. Yaksh & T.A. Rudy (Physiol. Behav., 1976, Bd. 17, s. 1031-1036). To rottegrupper fikk ulike doser bupivacain administrert i en galaktolipidformulering (Sammensetning A), en tredje gruppe fikk bupivacain i en vandig løsning (Sammensetning B) og en fjerde gruppe fikk galaktolipidformuleringen uten noe lokalanestetikum (Sammensetning C) i henhold til tabellen nedenfor:

Rottene ble randomisert til en av de fire gruppene. Testforbindelsen ble administrert i det nedre lumbalområdet av durasekken via det implanterte kateteret. Effekten av testsubstansene på lokomosjonen ble fulgt til regulære tidsrom og gradert etter en skala på 0, 1, 2, 3 og 4, hvor 0 = ingen bevegelseshemming og 4 = paralyse av begge bakben og forben. Rottene ble observert i minst 90 min.

, Resultatene er sammenfattet i Figur 2. Alle dyr som fikk virksomme lokalanestetika oppviste en markert svekkelse av den motoriske funksjon kort tid etter dosering. Virkningen av denne effekten var imidlertid merkbart forskjellig for de tre gruppene, idet høydosegruppen oppviste lengst varighet og kontrollgruppen den korteste varighet av paralysen. Etter 90 minutter var alle dyrene fullstendig restituert. Forskjellene var statistisk signifikante for høydosegruppen og lavdose-gruppen vs. kontrollgruppen etter 20 minutter (Wilcoxon's "signed" rangeringstest). Høydosegruppen var også forskjellig fra kontrollgruppen etter 30 minutter.

Placebogruppen oppviste ingen effekt til noe tidspunkt. Det ble ikke iakttatt uventede eller toksiske effekter, og alle effekter var reversible.

Konklusjon: Galaktolipidformulering med bupivacain kunne signifikant forlenge varigheten av den nerveblokkerende effekt av bupivacain i en rottemodell med varig implantert intratekalkateter. Dette demonstrerer ytterligere at galaktolipidformuleringen er egnet til å forlenge interaksjonen av bioaktive komponenter.

Test 4. In vitro hemolysetest av liposomer inneholdende Li-GLA

Den hemolytiske virkning av den liposomale Li-GLA-formulering fremstillet i Eksempel 25, ble undersøkt og sammenlignet med fritt Li-GLA ved å benytte humant helblod i henhold til følgende fremgangsmåte.

Humanblod fra friske forsøkspersoner ble oppsamlet i 10 mL Vacutainer-rør (Becton Dickinson, Canada) inneholdende 143 USP-enheter natriumheparin. Blodprøver på 2 mL ble overført til 25 mL Erlenmeyerkolber, som ble blandet med 1,0 mL testformulering fortynnet med 0,9% saltvann, for å gi den ønskede testkonsentrasjon. Prøvene ble deretter inkubert ved 37°C i en oksygen:karbon-dioksyd, 95:5-anriket atmosfære, 3 L/min. i 1 time, under konstant forsiktig risting. Ved avslutningen av inkuberingen ble 10/A av blodblandingen overført til 500 jjL saltvann i et 1,5 mL Eppendorfrør. Standarder som ga 100% hemolyse ble fremstillet ved å tilsette 10 mL blod til 500 / jL rent vann i et 1,5 mL Eppendorfrør. Alle prøvene ble deretter sentrifugert i 2 minutter i en Eppendorf Microfuge (Brinkman Instruments Ltd. Canada) og tilslutt analysert på en sentrifugal analysator (Cobas Bioanalyser; Hoffmann-La Roche Ltd., Canada) med UV-skanning av 540 nm. Resultatene er vist nedenfor.

Li-GLA løst i 0,9% saltvann forårsaker 100% hemolyse ved en konsentrasjon på ca. 4-5 mM. Den hemolytiske aktivitet av Li-GLA er således sterkt avsvekket i den liposomale form. Den reduserte hemolytiske aktivitet av liposomalt Li-GLA er blitt bekreftet gjennom preliminære in vivo undersøkelser på rotter, hvor hemolyse reduseres med 50 til 80% når det benyttes liposomale formuleringer i stedet for fritt Li-GLA. Liposomformuleringen forårsaker ikke "rød urin" i rotter, hvilket fritt Li-GLA derimot gjør. Dessuten har det vært vist at virkningen mot kreftceller in vitro er omtrent den samme med fritt Li-GLA og liposomalt Li-GLA. Disse testene tyder på at den liposomale galaktolipidformulering reduserer hemolyse som er en alvorlig bivirkning av medikamentet, uten å påvirke dets farmakologiske effekt.

Konklusjon

Som konklusjon viser våre funn i relasjon til foreliggende oppfinnelse at lipid/polare løsningsmiddel-blandinger på basis av galaktolipidmaterialet ifølge oppfinnelsen er fosfolipidpreparater overlegne i alle henseender, så som preparatenes fysiske stabilitet, inkorporeringseffektiviteten av medikamenter og evnen til langsom frigjøring av inkorporerte medikamenter.

Claims (12)

1. Anvendelse av en tolags lipid/polar-løsningsmiddelblanding som består av 0,01-90 vekt%, fortrinnsvis 0,1-50 vekt%, av et tolags-dannende materiale i et polart løsningsmiddel, hvor det tolags-dannende materialet er et galaktolipidmateriale fra cerealier bestående av minst 50% digalaktosyldiacylglyceroler, hvor det gjenværende er andre polare lipider, som en bærer for en aktiv substans i et farmasøytisk eller kosmetisk produkt eller næringsmiddel.

2. Anvendelse av en blanding ifølge krav 1, hvor galaktolipidmaterialet består av ca. 70-80% digalaktosyldiacylglyceroler og 20-30% andre polare lipider.

3. Anvendelse av en blanding ifølge krav 1, hvor galaktolipidmaterialet består av opptil 100% digalaktosyldiacylglyceroler.

4. Anvendelse av en gelblanding ifølge krav 1-3, som omfatter 25-90 vekt% galaktolipidmateriale i et polart løsningsmiddel.

5. Anvendelse av en liposomblanding ifølge krav 1-3, som omfatter 0,01-25 vekt% galaktolipidmateriale i et polart løsningsmiddel.

6. Farmasøytisk blanding som omfatter en tolags lipid/polar-løsningsmiddelblanding som består av 0,01-90 vekt%, fortrinnsvis 0,1-50 vekt%, av et tolags-dannende materiale i et polart løsningsmiddel, hvor det tolags-dannende materialet er et galaktolipidmateriale fra cerealier bestående av minst 50% .digalaktosyldiacylglyceroler, hvor det gjenværende er andre polare lipider, i blanding med en terapeutisk aktiv substans.

7. Farmasøytisk blanding ifølge krav 6, hvor galaktolipidmaterialet består av ca. 70-80% digalaktosyldiacylglyceroler og 20-30% andre polare lipider.

8. Farmasøytisk blanding ifølge krav 6, hvor galaktolipidmaterialet består av opptil 100% digalaktosyldiacylglyceroler.

9. Farmasøytisk blanding ifølge krav 6-8, som omfatter en terapeutisk aktiv substans i en terapeutisk effektiv mengde; et galaktolipidmateriale, som utgjør 1-50 vekt% av hele blandingen; et polart løsningsmiddel; og et isotonitetsbevirkende middel i en isotonitetsbevirkende effektiv mengde.

10. Farmasøytisk blanding ifølge krav 6-9, for peroral, enteral, parenteral, rektal, vaginal, lokal, okulær, nasal eller aurikulær administrering.

11. Farmasøytisk blanding ifølge krav 6-9, hvor den terapeutisk aktive substans er et salt eller en ester av y-linolensyre, og mengden av galaktolipidmateriale utgjør mindre enn 25 vekt% av hele blandingen.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk liposomblanding ifølge krav 6-8, karakterisert ved at 0,01-25 vekt% av galaktolipidmaterialet blandes med den aktive substans og det polare løsningsmiddel i en mengde på opptil 100 vekt%.