CN110461353A - 可溶性cd24用于治疗系统性红斑狼疮的使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及CD24蛋白用于治疗系统性红斑狼疮(狼疮，SLE)的用途。

Description

可溶性CD24用于治疗系统性红斑狼疮的使用方法

技术领域

本发明涉及用于治疗系统性红斑狼疮(SLE)和相关表现的组合物和方法。

背景技术

系统性红斑狼疮(狼疮，SLE)是最常见的自身免疫疾病，并且具有朝向女性极强的性别偏差。SLE是慢性炎症性结缔组织疾病，其可以影响关节和许多器官，包括皮肤、心脏、肺、肾和神经系统。它是具有不同临床表现的复杂疾病；然而，并非患有系统性红斑狼疮的每个人都具有所有症状。通常，狼疮的特征是称为发作的疾病期、以及健康期或缓解。难以估计多少人患有这种疾病，因为它的症状广泛不同，并且其发病经常难以确定。虽然SLE通常首先影响15至45岁之间的人，但它也可以在生命的儿童期或以后发生。比男性多得多的女性患有狼疮。狼疮在非裔美国女性中比在高加索女性中更常见，并且在西班牙裔、亚裔和美洲原住民血统的女性中更常见。非裔美国人和西班牙裔女性也更容易具有活动性疾病和严重的器官系统牵涉。另外，狼疮可以在家族中运行，但患者的孩子或兄弟或姐妹也患有狼疮的风险仍然很低。与年龄匹配的群体相比，SLE患者展示4.6倍增加的死亡率，降低的劳动生产率，情绪障碍和器官功能恶化。然而，与其它自身免疫疾病和过敏性疾病相比，用于治疗SLE的药物的开发进展缓慢，并且存在鉴定新治疗靶的迫切且未满足的医学需求。

发明内容

本文提供的是通过向有此需要的受试者施用CD24蛋白，来治疗SLE及其相关症状、适应症、并发症和表现的方法。SLE频繁地与组织损伤相关联，并且由于组织损伤而恶化，所述组织损伤起因于疾病本身或者是由于用于控制在治疗期间的炎症效应的皮质类固醇。

本发明人已证实CD24负向调节宿主对由于组织或器官损伤而释放的细胞DAMP的应答，并且至少两种重叠机制可以解释这种活性。首先，CD24结合几种DAMP，包括HSP70、HSP90、HMGB1和核仁素，并且阻遏对这些DAMP的宿主应答。为此，推测CD24可以捕获炎性刺激物，以防止与其受体，TLR或RAGE的相互作用。其次，使用对乙酰氨基酚诱导的肝坏死并确保炎症的小鼠模型，本发明人证实，通过与其受体Siglec G的相互作用，CD24提供了对组织损伤的宿主应答的有力负调节。为了实现这种活性，CD24可以通过Siglec G结合并刺激信号传导，其中Siglec G相关的SHP1触发负调节。两种机制可以协同作用，因为具有任一基因的靶向突变的小鼠产生强得多的炎症应答。事实上，当用HMGB1、HSP70或HSP90刺激时，从来自CD24-/-或Siglec G-/-小鼠的骨髓培养的DC产生更高水平的炎性细胞因子。据我们所知，CD24是能够阻断由DAMP触发的炎症的唯一抑制性DAMP受体，并且目前没有可用于特异性靶向对组织损伤的宿主炎症应答的药物。

本发明人已证实使用RA、MS和GvHD的小鼠模型，外源可溶性CD24蛋白减轻DAMP介导的自身免疫疾病的能力。鉴于DAMP在SLE发病机理中的重要性，CD24蛋白可以用于治疗或预防(防止)SLE或其相关表现，例如狼疮性肾炎、神经精神性、血液学、肌肉骨骼和严重皮肤狼疮。本发明人还已发现CD24蛋白可以用于缓解SLE的症状，例如蛋白尿、脾肿大和淋巴结病。通常，狼疮遵循不可预测的复发缓解过程，其特征在于称为发作的疾病期、以及健康期或缓解。因此，本文所述的CD24蛋白可以在治疗上(即在发作过程中)或预防上(即在缓解期过程中)施用，以便控制或预防疾病发作的持续时间、严重性和/或频率。本文所述的CD24蛋白还可以与皮质类固醇组合使用，以便减少所施用的皮质类固醇的频率和剂量。

发明人还已证实CD24可以调节涉及脂肪和脂质代谢的分子。特别是，他们已证实CD24可以减少循环血清LDL-C的水平并增加循环瘦素。血脂异常在SLE患者中普遍存在(高达63％；Kakati等人2003)。另外，与年龄和性别匹配的对照受试者相比，动脉粥样硬化性心血管疾病(CVD)的发病率在SLE患者中增加高达50倍，并且这只能部分地通过CVD的传统危险因素来解释(27)。相应地，本文所述的CD24蛋白可以特别用于治疗患有脂血症和/或心血管疾病的SLE患者，或者用于预防SLE患者中的此类并发症。

人CD24是由CD24基因中的240个碱基对的开放读码框编码的小GPI锚定分子(28)。在80个氨基酸中，前26个构成信号肽，而后23个充当用于切割的信号，以允许GPI尾部的附着。因此，成熟的人CD24分子仅具有31个氨基酸。31个氨基酸之一在人群中是多态的。在开放读码框的核苷酸170处的C至T转变导致丙氨酸(a)被缬氨酸(v)取代。由于该残基位于切割位点的紧N末端，并且由于置换是非保守的，因此这两个等位基因可以在细胞表面上以不同的效率表达。实际上，用cDNA的转染研究证实CD24^V等位基因在细胞表面更有效地表达(28)。与此一致，CD24^v/vV PBL尤其是在T细胞上表达更高水平的CD24。

CD24蛋白可以包含成熟的人CD24或其变体。成熟的人CD24的序列可以包含SEQ IDNO：1或2的序列。CD24蛋白可以包含人CD24的任何或所有细胞外结构域。CD24蛋白的序列可以包含SEQ ID NO：4的信号序列，其可以促进从表达蛋白质的细胞的分泌。信号肽序列可以是在其它跨膜蛋白或分泌蛋白上发现的信号肽序列，或者是从本领域已知的现有信号肽修饰的信号肽序列。CD24蛋白可以是可溶的和/或可以是糖基化的。CD24蛋白可以使用真核蛋白表达系统产生，所述真核蛋白表达系统可以包含中国仓鼠卵巢细胞系中含有的载体或复制缺陷型逆转录病毒载体。复制缺陷型逆转录病毒载体可以稳定整合到真核细胞的基因组内。

CD24蛋白可以包含蛋白质标签，所述蛋白质标签可以在CD24蛋白的N末端或C末端处融合。蛋白质可以包含哺乳动物免疫球蛋白(Ig)的一部分，其可以是人Ig蛋白的Fc区。人Ig蛋白可以包含人Ig蛋白的铰链区以及CH2和CH3结构域，并且人Ig蛋白可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA。Fc区还可以包含铰链区以及IgM的CH2、CH3和CH4结构域。CD24蛋白的序列可以包含SEQ ID NO：5、6、8、9、11或12的序列。

附图说明

图1A显示了全长CD24融合蛋白CD24Fc(在本文中也称为CD24Ig)(SEQ ID NO：5)的氨基酸组成。加下划线的26个氨基酸是CD24的信号肽(SEQ ID NO：4)，其在从表达蛋白质的细胞分泌期间被切掉，并且因此从蛋白质的加工形式(SEQ ID NO：6)中缺失。序列的粗体部分是融合蛋白中使用的成熟CD24蛋白的细胞外结构域(SEQ ID NO：2)。通常存在于成熟CD24蛋白中的最后一个氨基酸(A或V)已从构建体中缺失，以避免免疫原性。未加下划线的非粗体字母是IgG1 Fc的序列，包括铰链区以及CH1和CH2结构域(SEQ ID NO：7)。图1B显示了CD24^VFc的序列(SEQ ID NO：8)，其中成熟的人CD24蛋白(粗体)是SEQ ID NO：1的缬氨酸多态性变体。图1C显示了CD24^AFc的序列(SEQ ID NO：9)，其中成熟的人CD24蛋白(粗体)是SEQ ID NO：1的丙氨酸多态性变体。图1B和1C中的融合蛋白的各个部分如图1A中标记，并且变体缬氨酸/丙氨酸氨基酸是加双下划线的。

图2显示了来自小鼠(SEQ ID NO：3)和人(SEQ ID NO：2)的成熟CD24蛋白之间的氨基酸序列变异。潜在的O-糖基化位点是粗体的，且N-糖基化位点是加下划线的。

图3.CD24IgG1(CD24Fc)的药效学的WinNonlin区室建模分析。空心圆圈代表3只小鼠的平均值，并且该线是预测的药代动力学曲线。图3A.1mg CD24IgG1的i.V.注射。图3B.1mg CD24IgG1(CD24Fc)的s.c.注射。图3C.如通过曲线下面积(AUC)、半衰期和最大血液浓度测量的，血液中的抗体总量的比较。应注意总的来说，s.c.注射的AUC和Cmax为i.V.注射的约80％，尽管差异并非统计学显著的。

图4.CD24-Siglec G(10)相互作用区分PAMP和DAMP。图4A.对PAMP的宿主应答不受CD24-Siglec G(10)相互作用的影响。图4B.CD24-Siglec G(10)相互作用可能通过SiglecG/10相关的SHP-1阻遏对DAMP的宿主应答。

图5.CD24Fc的单次注射减少CAIA的临床得分。图5A.实验图解。BALB/c小鼠(8周龄)在第1天时接受与媒介物或融合蛋白结合的mAb。小鼠在第3天时注射LPS，并且每天观察共3周。图5B.CD24Fc减少CAIA的临床得分。融合蛋白(1mg/小鼠)或媒介物在第1天时注射一次。双盲测定临床得分。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。CD24的效应在6个独立实验中再现，涉及PBS组中的总共52只小鼠和CD24Fc组中的总共54只小鼠。

图6.CD24Fc减少关节和CAIA中的炎性细胞因子的水平。CAIA如图5A中图解的起始且处理。通过来自BD Pharmingen的细胞因子珠阵列测量炎性细胞因子。图6A.代表性的FACS概况。图6B.在关节匀浆物中测量的减少细胞因子(平均值±SE)的概括。

图7.CD24Fc减少关节中的炎症和软骨破坏。在第7天时，前爪和后爪从CD24Fc处理的小鼠和对照小鼠两者中解剖，在4％多聚甲醛中固定24小时，随后为用5％甲酸的脱钙。然后将爪包埋在石蜡中，并且用H&E和番红O红(Sigma-Aldrich)染色纵剖面。

图8.在CAIA诱导的第5天时施用的CD24Fc的疗效。将CAIA诱导的小鼠随机分成两组，接受媒介物(PBS)或CD24 Fc。小鼠进行双盲评分。显示了三个独立实验的代表。

图9.低剂量的CD24Fc阻止CAIA的发展。图9A.实验图解。图9B.关节炎的临床得分，双盲评分的。

图10.Siglecg对于CD24Fc、WT(图10A)和Siglecg^-/-小鼠(图10B)的疗效是必需的，所述小鼠接受与抗胶原mAb的混合物结合的媒介物对照或CD24Fc。每日双盲记录临床得分。

图11.CD24^VFc和CD24Fc的构建。图11A.融合蛋白的图解。细胞外结构域中的多态性残基在CD24Fc中被缺失。图11B.关于两种融合蛋白的纯度的SDS-PAGE分析。显示的数目是加载的μg蛋白质。图11C.CD24^VFc和CD24Fc关于其与SigleclOFc的结合之间的比较。脱唾液酸化的CD24Fc用作阴性对照。图11D.CD24Fc和CD24^VFc关于CAIA模型中的疗效之间的比较。在第1天时，将CD24Fc或CD24^VFc(200μg/小鼠)与抗胶原抗体的混合物结合注射到小鼠内。在第3天时，通过用LPS处理引发关节炎。对疾病进行双盲评分。图11C和D中所示的数据是平均值和SEM。图11E和11F还比较了CD24Fc和CD24^VFc在与图11D中所示的那种类似执行的实验中的疗效，除了IgG1 Fc用作阴性对照之外。如图11E中所示，CD24Fc早在第4天时就减少了RA得分，并且在三周的观察至始至终显示统计学上显著的保护。另一方面，如图11F中所示，CD24^VFc在第8天时起始显示RA得分中的减少。尽管其后观察到减少的得分，但减少并未达到统计学显著性。

图12.CD24Fc赋予DBA/1小鼠中针对CIA的保护。图12A.CD24Fc压制CIA模型中关节炎的发展。当没有发展临床症状时，小鼠在第17天时接受单次治疗(1mg/小鼠)。显示的数据是已发展关节炎的小鼠中的疾病得分，其中疾病得分为3至8。CD24Fc和PBS组之间的差异是显著的(P＝0.02，费歇尔PLSD检验)。对于媒介物，N＝9，且对于CD24Fc组，N＝7。图12B.CD24Fc在DBA/1小鼠的CIA中的疗效。将具有3至8得分的临床症状的小鼠随机化，以接受通过i.p.注射的200μg CD24Fc或等体积的对照媒介物(PBS)，每隔一天，五次。每天检查小鼠以就临床症状评分共两周。当关节炎发展时，CD24Fc显著减轻关节炎的临床症状(P＝0.02，费歇尔PLSD检验)。对于PBS，N＝6，且对于CD24Fc组，N＝5。

图13.CD24Fc在具有正在进行的鸡CIA的小鼠中引起快速恢复。在第1天时，用100μL胶原-CFA乳液(通过将4mg/ml鸡II型胶原与等体积的含有5mg/ml结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的CFA混合制备)在尾的根部处皮内免疫8周龄C57BL/6小鼠。在第21天时，距离尾根部1.5em皮内施用由相同的胶原-CFA乳液的加强免疫。图13A.在第28天时，将临床得分＞3的小鼠随机化以接受媒介物或CD24Fc(1mg/小鼠)。终点是得分减少50％(上)或80％(下)。关于PBS的N＝12，且关于CD24Fc的N＝11。图13B.CD24Fc在鸡CIA模型中的剂量依赖性疗效。细节如图13A中，除了治疗在疾病高峰时(在第33天时，两组中5.5的平均得分)起始之外。将临床得分＞3的小鼠随机化以接受媒介物或CD24Fc的5次注射。终点是得分减少50％(上)或80％(下)。N＝11。100μg实验组和媒介物对照组之间的差异是统计学显著的。

图14.CD24抑制通过人巨噬细胞的炎性细胞因子产生。图14A.CD24的ShRNA沉默导致TNFα、IL-6和IL-1β的自发产生。用编码乱序或两个独立的CD24shRNA的慢病毒载体转导THP1细胞。通过用PMA(15ng/ml)培养4天，将转导的细胞分化成巨噬细胞。在洗去PMA和非粘附细胞后，将细胞再培养24小时，用于通过细胞因子珠阵列测量炎性细胞因子。图14B.如图14A中，除了在最后24小时内将给定浓度的CD24Fc或对照IgG Fc加入巨噬细胞中之外。图14C.CD24Fc在压制通过CD24沉默的巨噬细胞系THP1的炎性细胞因子自发产生方面比CD24vFc更有效。除了将CD24Fc和CD24^VFc并排比较之外，所示数据如图11中的图例详述。

图15.Siglec G对通过CD24Fc的保护的贡献。图15A.CD24Fc刺激Siglec G的酪氨酸磷酸化以及与Siglec G的SHP-1结合。来自CD24缺陷型小鼠的脾细胞用媒介物、Fc对照或CD24Fc(1μg/ml)刺激30分钟。在裂解后，用抗Siglec G抗血清沉淀Siglec G蛋白。通过蛋白质印迹检测Siglec G磷酸化及其与SHP-1的结合。图15B.Siglecg对于CD24Fc在具有低剂量的抗胶原抗体的小鼠中的疗效是必需的。WT(图15A)和Siglecg^-/-小鼠(图15B)接受与抗胶原mAb混合物(2mg/小鼠)结合的媒介物对照或CD24Fc。在第3天时注射LPS(100μg/小鼠)。每日双盲记录临床得分。数据代表两个实验。图15C.Siglecg的靶向突变减弱，但并未取消CD24Fc与双倍剂量的抗胶原抗体的疗效。在第1天时加入抗胶原抗体(4mg/小鼠)和CD24Fc(1mg/小鼠)，而在第3天时加入LPS(100μg/小鼠)。每天观察雄性WT(图15A)和Siglecg-/-小鼠(图15B)的临床得分。通过累积RA得分的％减少来计算％抑制。N＝5。雄性小鼠在8周龄时使用。

图16显示了通过治疗人受试者中的PK可评估群体的平均血浆CD24Fc浓度(±SD)的图。PK＝药代动力学；SD＝标准差。

图17显示了CD24Fc C_max相对于用于PK可评估群体的剂量的剂量比例图。

图18显示了CD24Fc AUC_0-42d相对于用于PK可评估群体的剂量的剂量比例图。

图19显示了CD24Fc AUC_0-inf相对于用于PK可评估群体的剂量的剂量比例图。

图20显示了表示为基线水平的百分比，在CD24Fc处理后降低的人血清LDL-C。使用接受10mg CD24Fc的群组1作为参考，确定CD24Fc是否以剂量和时间依赖性方式减少LDL-C水平。观察到LDL-C水平的显著剂量依赖性减少(p＜0.0001)。

图21显示了与第-1天预处理相比，在CD24Fc治疗后的第3天时健康人受试者的血清中瘦素的比率。药物在第0天时施用。数据由CD24Fc给药群组表示；0mg/kg组表示安慰剂对照组。

图22显示了CD24Fc治疗预防MRL.lpr狼疮模型中蛋白尿的进展。显示的数据是如通过Albustix(n＝10)测量的尿蛋白水平的平均值和SEM。

图23显示了CD24Fc的单次注射减少MRL.lpr小鼠中的蛋白尿。在11周时具有匹配水平的蛋白尿的雌性MRL.1pr小鼠在12周时腹膜内接受PBS(媒介物对照)或200μg/小鼠的CD24Fc的单次注射。在第16周时Siemens AU680化学分析仪测量尿白蛋白水平。P＝0.03，单尾非配对的t检验。N＝10。

图24显示了CD24Fc的单次注射减少MRL.lpr小鼠中的脾肿大。在11周时具有匹配水平的蛋白尿的雌性MRL.lpr小鼠在12周时腹膜内接受PBS(媒介物对照)或200μg/小鼠的CD24Fc的单次注射。在第16周时对小鼠实施安乐死，并且将其脾进行称重。P＝0.05，单尾非配对的t检验。N＝10。

图25显示了CD24Fc的单次注射减少MRL.lpr小鼠中的淋巴结病。在11周时具有匹配水平的蛋白尿的雌性MRL.lpr小鼠在12周时腹膜内接受PBS(媒介物对照)或200μg/小鼠的CD24Fc的单次注射。在第16周时对小鼠实施安乐死，并且将其淋巴结(腋窝、肱、腹股沟)组合并称重。P＝0.03，单尾非配对的t检验。N＝10。

具体实施方式

本发明人已惊讶地发现，可溶形式的CD24对于治疗SLE高度有效。该效应可以通过与损伤相关的分子模式来介导。模式识别涉及由分别称为PAMP和DAMP的病原体相关和组织损伤相关的分子模式两者触发的炎症应答。本发明人已认识到最近的研究已证实，加剧的对DAMP的宿主应答可能在自身免疫疾病的发病机理中起作用。首先，未能清除来自坏死细胞的碎片长期以来已提议作为人中的自身免疫疾病，特别是SLE的原因(1)。与缺陷清除一致，在SLE患者和SLE易感小鼠的血浆中已发现了更高水平的核小体(2)。通过其相关的HMGB1，这些核小体经由TLR2/4触发炎性细胞因子的释放(2)。其次，为了支持Hmgbl在SLE中的作用，Wen等人报道，针对含DNA的免疫复合物的自身抗体产生需要复合物中的HMGB1与TLR2相互作用(3)。发现DAMP促进炎性细胞因子和自身免疫疾病以及在动物模型中的产生，并且因而发现DAMP的抑制剂如HMGB1和HSP90改善类风湿性关节炎(RA)(4-6)。TLR、RAGE-R、DNGR(由Clec9A编码)和Mincle已显示是负责介导由各种DAMP引发的炎症的受体(2，7-14)。

本发明人最近的工作证实CD24-Siglec G相互作用区分对DAMP与PAMP的先天性免疫(15，16)。Siglec蛋白是膜相关的免疫球蛋白(Ig)超家族成员，其识别各种含唾液酸的结构。大多数Siglecs具有细胞内免疫酪氨酸抑制基序(ITIM)，其与SHP-1、-2和Cbl-b结合，以控制炎症应答的关键调节剂。本发明人将CD24鉴定为关于Siglec、小鼠中的Siglec G和人中的Siglec 10的第一天然配体(15)。Siglec G经由SHP-1/2信号传导机制(15)与唾液酸化的CD24相互作用，以压制TLR介导的对DAMP例如HMGB1的宿主应答，其对于SLE发病机理至关重要(2)。最近以来，通过本发明人的实验已证实Siglec G与Cb1结合以触发RIG-I的降解，导致人狼疮发病机理中的关键因素I型干扰素应答的压制(17)。

人中的各种自身免疫疾病，包括多发性硬化症(18-21)、SLE(20，22)、类风湿性关节炎(23)和巨细胞关节炎(24)的遗传分析，已显示CD24多态性与自身免疫疾病的风险之间的显著相关。特别地，涉及7507个患者和8803个对照的近期元分析确认CD24多态性与多重自身免疫疾病包括SLE的风险之间的关联(25)。具体地，在CD24mRNA的位置1527(P1527)处的二核苷酸缺失与MS的显著减少的风险(优势比OR＝0.53，伴随95％自举置信区间＝0.34-0.81)和延迟的进展(p＝0.016)相关。更重要的是，使用来自两个独立群组的150个家族，已发现P1227_del等位基因优先传递给未受影响的个体(p＝0.003)。在杂合个体中，关于二核苷酸缺失等位基因的mRNA水平比野生型等位基因的那种低2.5倍(p＝0.004)。由本发明人执行的转染研究揭示，二核苷酸缺失急剧减少CD24 mRNA的稳定性(p＜0.001)。结果证实，CD24 mRNA的3′UTR中的去稳定化二核苷酸缺失显著减少风险并延迟MS的进展。本发明人还已发现P1527_del等位基因也与SLE的风险减少密切相关。据他们所知，这是赋予针对器官特异性和系统性自身免疫疾病两者的保护的遗传多态性的第一个例子、以及赋予针对任何自身免疫疾病的保护的第一个3′UTR mRNA去稳定化SNP(20)。此外，Siglecs和SLE发病机理之间的因果关系得到近期报告支持，所述近期报告显示MRL/lpr小鼠中Siglecg的靶向突变适度加剧了自发性狼疮(26)。Siglecs在SLE中的作用得到人和小鼠中的遗传研究支持。

1.定义。

本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不预期是限制性的。如说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。

关于本文的数值范围的叙述，明确考虑了其间具有相同精度的每个中间数。例如，对于6-9的范围，除6和9之外，还考虑了数目7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确考虑了数目6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

“肽”或“多肽”是氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然和合成的修饰或组合。

“基本上相同的”可以意指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

当提及保护动物免于疾病时，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指预防、压制、阻遏或完全消除疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前，将本发明的组合物施用于动物。压制疾病涉及在疾病诱导之后但在其临床表现之前，将本发明的组合物施用于动物。阻遏疾病涉及在疾病临床表现之后，将本发明的组合物施用于动物。

“变体”可以意指通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列中不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性例子包括结合toll样受体并被特异性抗体结合的能力。变体还可以意指具有氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，荷电区域的亲水性、程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸在本领域中公认为通常涉及微小变化。如本领域理解的，可以通过考虑氨基酸的亲水指数来部分地鉴定这些微小变化。Kyte等人，J.Mol.Biol.157：105-132(1982)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍保留蛋白质功能。在一个方面，具有±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可以用于揭示导致蛋白质保留生物学功能的取代。在肽的背景下，氨基酸的亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，已报道与抗原性和免疫原性良好相关联的有用量度。美国专利号4,554,101，以引用的方式全文并入本文。如本领域理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以导致肽保留生物活性，例如免疫原性。可以用亲水性值在彼此±2内的氨基酸执行取代。氨基酸的疏水指数和亲水性值两者均受该氨基酸的特定侧链的影响。与该观察一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对相似性，且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它特性揭示的。

2.CD24

本文提供的是CD24蛋白，其可以包含成熟的人CD24的氨基酸序列或来自其它哺乳动物的氨基酸序列，其对应于CD24的细胞外结构域(ECD)或其变体。如上所述，成熟的人CD24蛋白的序列长31个氨基酸，具有可变丙氨酸(A)与在其C末端处的缬氨酸(V)残基：

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(V/A)(SEQ ID NO：1)

C末端缬氨酸或丙氨酸可以是免疫原性的，并且可以从CD24蛋白中省略以减少其免疫原性。因此，CD24蛋白可以包含缺少C末端氨基酸的氨基酸序列或成熟的人CD24：

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(SEQ ID NO：2)

尽管来自小鼠和人的成熟CD24蛋白的氨基酸序列中相当大的序列变异，但它们是功能上等价的，因为人CD24Fc已显示在小鼠中是活性的。人CD24 ECD的氨基酸序列显示与小鼠蛋白质的一些序列保守性(39％同一性；Genbank登录号NP_033976)。然而，由于取决于物种，CD24 ECD长度仅为27-31个氨基酸，并且与其一些受体(例如Siglec10/G)的结合由糖蛋白的唾液酸和/或半乳糖介导，因此同一性百分比不高并不令人惊讶。人Siglec-10(GenBank登录号AF310233)的细胞外结构域与其鼠同源物Siglec-G(GenBank登录号NP_766488)受体蛋白之间的氨基酸序列同一性为63％(图2)。由于小鼠和人CD24之间的序列保守主要在C末端和丰富的糖基化位点中，成熟CD24蛋白的显著变异可能在使用CD24蛋白时是可以耐受的，尤其是如果这些变异不影响C末端的保守残基、或者不影响来自小鼠或人CD24的糖基化位点。因此，CD24蛋白可以包含成熟鼠CD24的氨基酸序列：

NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG(SEQ ID NO：3)。

人CD24 ECD的氨基酸序列显示与食蟹猴蛋白(52％同一性；UniProt登录号UniProtKB-I7GKK1)比小鼠更多的序列保守性。再次，由于ECD在这些物种中长度仅为29-31个氨基酸，以及糖残基在与其受体结合中的作用，因此同一性百分比不高并不令人惊讶。食蟹猴Siglec-10受体的氨基酸序列尚未确定，但人和恒河猴Siglec-10(GenBank登录号XP_001116352)蛋白之间的氨基酸序列同一性为89％。因此，CD24蛋白还可以包含成熟食蟹猴(或恒河猴)CD24的氨基酸序列：

TVTTSAPLSSNSPQNTSTTPNPANTTTKA(SEQ ID NO：10)

CD24蛋白可以是可溶的。CD24蛋白还可以包含N末端信号肽，以允许从表达蛋白质的细胞中分泌。信号肽序列可以包含氨基酸序列MGRAMVARLGLGLLLLALLLPTQIYS(SEQ IDNO：4)。可替代地，信号序列可以是在其它跨膜蛋白或分泌蛋白上发现的任何信号序列，或由本领域已知的现有信号肽修饰的那些信号序列。

a.融合

CD24蛋白可以在其N末端或C末端处与蛋白质标签融合，所述蛋白质标签可以包含哺乳动物Ig蛋白的一部分，其可以是人或小鼠或另一个物种。该部分可以包含Ig蛋白的Fc区。Fc区可以包含Ig蛋白的铰链区、CH2，CH3和CH4结构域中的至少一个。Ig蛋白可以是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA，并且Fc区可以包含Ig蛋白的铰链区以及CH2和CH3结构域。Fc区可以包含人免疫球蛋白G1(IgG1)同种型，其可以包含SEQ ID NO：7的序列。Ig蛋白也可以是IgM，并且Fc区可以包含IgM的铰链区以及CH2、CH3和CH4结构域。蛋白质标签可以是有助于蛋白质纯化的亲和标签，和/或增强功能性蛋白质的溶解度和回收的溶解度增强标签。蛋白质标签还可以增加CD24蛋白的效价。蛋白质标签还可以包含GST、His、FLAG、Myc、MBP、NusA、硫氧还蛋白(TRX)、小遍在蛋白样修饰剂(SUMO)、遍在蛋白(Ub)、白蛋白或骆驼科动物Ig。用于制备融合蛋白和纯化融合蛋白的方法是本领域众所周知的。

基于临床前研究，对于实例中鉴定的融合蛋白CD24Fc的构建，已使用30个氨基酸的天然CD24分子的截短形式，其缺乏在GPI信号切割位点之前的最终多态性氨基酸(即，具有SEQ ID NO：2的成熟CD24蛋白)。将成熟人CD24序列与人IgG1 Fc结构域(SEQ ID NO：7)融合。全长CD24Fc融合蛋白在SEQ ID NO：5(图1)中提供，并且从细胞中分泌的CD24Fc融合蛋白的加工形式(即缺少被切掉的信号序列)在SEQ ID NO：6中提供。与IgG1 Fc融合的成熟CD24(即，具有SEQ ID NO：1的成熟CD24蛋白)的加工多态变体可以包含SEQ ID NO：11或12。

b.生产

CD24蛋白可以是高度糖基化的，并且可以涉及CD24的功能，例如免疫细胞的共刺激以及与损伤相关的分子模式分子(DAMP)的相互作用。可以使用真核表达系统制备CD24蛋白。表达系统可能需要从哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的载体表达。该系统也可以是病毒载体，例如可以用于感染真核细胞的复制缺陷型逆转录病毒载体。CD24蛋白也可以由稳定的细胞系产生，所述细胞系从已整合到细胞基因组内的载体或载体的一部分表达CD24蛋白。稳定细胞系可以从整合的复制缺陷型逆转录病毒载体表达CD24蛋白。表达系统可以是GPEx^TM。

c.药物组合物

CD24蛋白可以包含在药物组合物中，所述药物组合物可以包含药学上可接受量的CD24蛋白。药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药物组合物可以包含溶剂，其可以使CD24蛋白在延长的时期内保持稳定。溶剂可以是PBS，其可以使CD24蛋白在-20℃(-15～-25℃)下保持稳定至少66个月。溶剂可以能够与另一种药物组合容纳CD24蛋白。

药物组合物可以配制用于肠胃外施用，包括但不限于通过注射或连续输注。用于注射的制剂可以是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制试剂，包括但不限于悬浮剂、稳定剂和分散剂。该组合物还可以粉末形式提供，用于由合适的媒介物重建，所述媒介物包括但不限于无菌无热原水。

药物组合物还可以配制为长效制剂，其可以通过植入或通过肌内注射施用。该组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)、离子交换树脂配制或配制为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。用于皮下注射的制剂可能与适应症如狼疮及其相关表现和并发症特别相关。

d.剂量

可以通过临床试验最终确定CD24蛋白的剂量，以确定具有可接受的毒性和临床功效的剂量。可以通过啮齿类动物和非人灵长类动物中的药代动力学和毒性研究来估计初始临床剂量。CD24蛋白的剂量可以是0.01mg/kg至1000mg/kg，并且可以是1至500mg/kg，取决于所需量的疗效和施用途径。CD24蛋白可以通过静脉内输注或者皮下或壁内[即，在腔或器官的壁内]注射施用，并且剂量可以是10-1000mg、10-500mg、10-240mg、10-120mg，或10、30、60、120或240mg，其中受试者是人。

3.治疗方法

本文的CD24蛋白可以施用于患有系统性红斑狼疮(狼疮，SLE)的受试者，以治疗SLE或者其一种或多种症状、并发症或表现。SLE是慢性炎症性结缔组织疾病，其可以影响关节和许多器官，包括皮肤、心脏、肺、肾和神经系统。它是复杂的自身免疫疾病，并且可以引起许多不同的症状；然而，并非每个患有SLE的每个人都具有所有症状。肾脏受累在SLE中很常见，并且急性或慢性肾脏损害可能伴有狼疮性肾炎，导致急性或终末期肾功能衰竭。狼疮性肾炎是一类肾小球肾炎，其中肾小球变得发炎，并且是SLE患者中最常见和最严重的并发症之一。其它表现包括神经精神性、脑病、血液学、肌肉骨骼和严重皮肤狼疮。CD24蛋白还可以用于治疗与SLE相关的蛋白尿、脾肿大和淋巴结病中的至少一种。受试者可以是人、猫、犬、大型动物或禽类。

长期预后不良的主要决定因素之一是器官损伤，其预示更多的损伤和死亡。损伤依次又由不受控制的疾病活性，且尤其由长期的皮质类固醇使用触发，所述皮质类固醇通常在其疾病过程期间对SLE患者开出，以迅速压制炎症。因为它们是强效药物，医生寻求所需的最低剂量的皮质类固醇以达到所需益处。在使与皮质类固醇相关的副作用降到最低的努力中，研究人员正在努力开发限制或抵消皮质类固醇使用的方法。本发明人已使用RA、MS和GvHD的小鼠模型，证实外源可溶性CD24蛋白减轻起因于组织损伤的DAMP介导的自身免疫疾病的能力。鉴于DAMP在SLE发病机理中的重要性，CD24蛋白可以用于减少与SLE相关的器官损伤，以使疾病进展和发作降到最低。此外，CD24蛋白可以间歇地与皮质类固醇一起施用，以降低控制疾病所需的皮质类固醇剂量或提供皮质类固醇的治疗假期。

狼疮性肾炎的主要并发症是永久性肾损伤。这种损伤可能足够严重，使得它导致肾衰竭和对透析的依赖。与肾衰竭相关的所有并发症都适用于这些患者，例如高血压、体液超负荷、过早血管钙化、高脂血症和早发性冠状动脉疾病。与年龄和性别匹配的对照受试者相比，约63％的SLE患者患有脂血症，并且动脉粥样硬化性心血管疾病(CVD)的发病率在SLE患者中增加高达50倍，并且这只能部分地通过CVD的传统危险因素来解释。本发明人已证实CD24可以调节涉及脂肪和脂质代谢的分子。特别地，他们已证实CD24可以减少循环血清LDL-C的水平并增加循环瘦素。相应地，本文所述的CD24蛋白可以特别用于治疗患有脂血症和/或心血管疾病的SLE患者，或用于预防SLE患者，特别是患有狼疮性肾炎的患者中的此类并发症。患者可能患有溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏症、家族性高胆固醇血症或高脂血症。受试者还可能需要治疗或预防动脉粥样硬化，或降低心血管疾病事件的风险，所述心血管疾病事件可能是动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)事件。ASCVD事件可以是急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、稳定或不稳定型心绞痛、冠状动脉或其它动脉血运重建、中风、短暂性脑缺血发作、或假定为动脉粥样硬化起源的外周动脉疾病。此外，可以通过监测SLE患者中LDL-C和/或甘油三酯的血清水平来检测体内CD24蛋白的生物活性，因此提供了用于临床使用的方便的生物标记物。

通常，狼疮遵循不可预测的复发缓解过程，其特征在于称为发作的疾病期、以及健康期或缓解。预防损伤和追求稳定缓解是SLE治疗中的主要靶。因此，CD24蛋白可以在治疗上(即在发作期间)或预防上(即在缓解期过程中)施用，以便控制或预防疾病发作的持续时间、严重程度和/或频率。特别地，CD24蛋白可以施用于对其它治疗选项难治性的患者。

a.施用

药物组合物的施用途径可以是肠胃外的。肠胃外施用包括但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鞘内、关节内和直接注射。药物组合物可以施用于人受试者、猫、犬、大型动物或禽类。该组合物可以每天施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次。

b.组合治疗

CD24蛋白可以与用于治疗SLE的另一种治疗组合。由于疾病的复杂性，不存在关于所有SLE患者或所有类型的SLE的标准治疗方案，但免疫抑制和生物制剂是SLE中的炎性疾病控制的基础。在一个实施例中，CD24蛋白在标准护理治疗的背景下施用，以便进一步减轻疾病症状，诱导缓解，作为维持疗法或控制发作。目前用于SLE治疗的试剂包括抗疟药(如羟氯喹)、皮质类固醇(如泼尼松、氢化可的松、甲泼尼龙和地塞米松)、免疫抑制剂(如环磷酰胺和霉酚酸酯(MMF)以及硫唑嘌呤(AZA)，其通过阻断免疫细胞的产生来遏制过度活跃的免疫系统)、B细胞抑制剂(如BLyS特异性抑制剂如贝利木单抗、抗CD20抗体如利妥昔单抗和阿塞西普)、共刺激分子(如阿巴西普)、抗干扰素药物、抗细胞因子抗体、以及替代和补充疗法(如饮食、营养补充剂、鱼油、软膏和乳膏、脊椎按摩治疗和顺势疗法)。在一些情况下，例如狼疮性肾炎，最初给予高强度诱导疗法，以诱导缓解(例如，高剂量环磷酰胺或皮质类固醇与MMF)，其随后为低强度维持疗法，以维持稳定缓解(例如，MMF和AZA)，其中皮质类固醇用于控制发作。

特别地，CD24蛋白可以与皮质类固醇组合使用，以便减少施用的皮质类固醇的频率和剂量。皮质类固醇已经是并且仍然是SLE治疗的主要支柱，但它们与器官损伤有关，例如早产性骨质疏松症、糖尿病、心血管疾病和加速器官衰竭，其可能甚至进一步恶化疾病。这可以导致由需要更积极治疗的严重控制的疾病构成的循环，导致损害，其依次又导致更多的损害和死亡。相应地，更大的相关性应该给予新药的类固醇节约潜力，因为从长远来看，节约类固醇是优点。鉴于CD24蛋白减少DAMP介导的炎症的能力，它可以帮助减少由不受控制的疾病活性和长期的皮质类固醇使用触发的损伤，并且因此减少对进一步的类固醇使用的依赖。

CD24蛋白可以与其它治疗同时或有规律地(metronomically)施用。如本文使用的，术语“同时”或“同时地”意指CD24蛋白和其它治疗在彼此的48小时，优选24小时，更优选12小时，再更优选6小时，且最优选3小时或更短时间内施用。如本文使用的，术语“有规律地”意指在不同于其它治疗的时间和以相对于重复施用的某一频率的试剂施用。

CD24蛋白可以在另一种治疗之前的任何点施用，包括约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和1分钟。CD24蛋白可以在CD24蛋白的第二次治疗之前的任何点施用，包括约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和1分钟。

CD24蛋白可以在另一种治疗之后的任何点施用，包括约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时、50小时、52小时、54小时、56小时、58小时、60小时、62小时、64小时、66小时、68小时、70小时、72小时、74小时、76小时、78小时、80小时、82小时、84小时、86小时、88小时、90小时、92小时、94小时、96小时、98小时、100小时、102小时、104小时、106小时、108小时、110小时、112小时、114小时、116小时、118小时和120小时。CD24蛋白可以在先前的CD24治疗之后的任何点施用，包括约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和1分钟。

4.监测CD24蛋白活性的方法

通过察看与SLE相关的血清学标记物，例如抗dsDNA、抗核抗体(ANA)、蛋白尿、补体水平(C3和C4)、B细胞和T细胞亚群、尿肌酸、IFN标记和IL-6，可以进行在患者中检测本文所述的CD24蛋白的活性。

还可以通过检测受试者中LDL-C的浓度来监测施用于受试者的CD24蛋白的活性。受试者可以经历用CD24蛋白的治疗，例如用于SLE、免疫介导的组织损害等等的治疗。LDL-C的浓度可以指示受试者中CD24蛋白活性的水平，其中患者中LDL-C的降低指示更大的CD24蛋白活性。该方法可以包括从受试者获得样品，并检测样品中LDL-C的量。样品可以是血液样品，例如血清或血浆。测量LDL-C浓度的方法是本领域众所周知的，例如基于ELISA的测定或胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶处理后的比色/荧光测定。LDL-C的量可以通过Friedewald计算来测量，所述Friedewald计算可以包括基于样品中测量的总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的量，来计算LDL-C的量。HDL-C的量可以通过用硫酸葡聚糖-Mg²⁺的沉淀程序或通过直接HDL-C测定来测量。LDL-C的量也可以通过DIRECT LDL^TM测定、均相N-GENEOUS^TMLDL测定、或衍生自基于ApoB的方程计算的LDL-C值来测量：0.41TC-0.32TG+1.70ApoB-0.27，(Clin Chem 1997；43：808-815；其内容以引用的方式并入本文)。可以随着时间过去和在CD24蛋白质处理过程中监测LDL-C的水平，以便监测对治疗的应答。

可以基于使用LDL-C检测的CD24蛋白活性水平来调节施用于受试者的CD24蛋白的量，用于治疗本文所述或本领域已知的适应症。可以在一段时间内或在CD24蛋白质处理过程期间监测LDL-C的水平。如果受试者中的LDL-C浓度减少至正常范围内的水平，则施用于受试者的CD24蛋白的量可以减少，例如通过降低CD24蛋白的剂量或不太频繁地施用其。如果LDL-C浓度保持不变或保持在正常范围之上，则可以增加施用于受试者的CD24蛋白的量，例如通过增加CD24蛋白的剂量或更频繁地施用其。作为LDL-C的替代，还可以测量LDL颗粒(LDL-P)的浓度，以监测CD24蛋白活性。可以使用NMR直接检测LDL-P浓度。

还可以监测施用于受试者的CD24蛋白的水平，其可以通过包括从受试者中获得样品且检测样品中CD24蛋白的量的方法。样品可以是血液样品，例如血清或血浆。蛋白质检测方法是本领域众所周知的。样品中的CD24蛋白可以通过任何蛋白质检测方法检测，例如免疫测定，包括ELISA、Gyros、MSD、Biacore、AlphaLISA、Delfia、Singulex、Luminex、Immuno-PCR、基于细胞的测定、RIA、蛋白质印迹、亲和柱等等。ELISA方法可以是夹心ELISA或竞争ELISA。例如，ELISA可以包括使样品与抗CD24蛋白抗体接触，使CD24蛋白-CD24蛋白抗体复合物与结合抗CD24蛋白抗体的标记抗体接触，并且通过检测由标记产生的信号来测量标记抗体的量，其中所述信号的量与样品中CD24蛋白的量相关联。

可以基于CD24蛋白的药代动力学参数，调节(例如通过调节施用剂量和频率)对受试者施用的CD24蛋白的量。例如，可以调节施用于受试者的CD24蛋白的量，以获得大于1ng/ml的血浆CD24浓度。在另一个例子中，调节施用于受试者的CD24蛋白的量，以维持大于1ng/mL的稳态血浆浓度。在另一个例子中，可以调节施用于受试者的CD24蛋白的量，以获得至少约1ng/mL的CD24蛋白的C_max。在另外一个例子中，可以调节施用于受试者的CD24蛋白的量，以达到至少约400,000ng*hr/mL的CD40蛋白的药物暴露水平，如通过AUC_0-inf定义的。

本发明具有通过下述非限制性实例示出的多个方面。

实例1

在小鼠中的CD24药代动力学

将1mg CD24Fc(CD24Fc)注射到首次用于实验的C57BL/6小鼠内，并且在不同时间点(5分钟、1小时、4小时、24小时、48小时、7天、14天和21天)收集血液样品，其中每个时间点3只小鼠。将血清以1∶100稀释，并且使用夹心ELISA检测CD24Fc的水平，使用纯化的抗人CD24(3.3μg/ml)作为捕获抗体和过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG Fc(5μg/ml)作为检测抗体。如图3a中所示。CD24Fc的衰变曲线揭示蛋白质的典型双相衰变。第一个生物分布阶段具有12.4小时的半衰期。第二阶段遵循来自中央区室的一阶消除的模型。第二阶段的半衰期为9.54天，其与抗体在体内的半衰期相似。这些数据提示融合蛋白在血流中非常稳定。在其中融合蛋白皮下注射的另一项研究中，观察到几乎相同的9.52天的半衰期(图3b)。更重要的是，虽然CD24Fc在血液中达到峰值水平需要大约48小时，但如通过AUC测量的，血液中融合蛋白的总量通过任一种注射途径是基本上相同的。因此，从治疗的观点来看，不同的注射途径不应该影响药物的疗效。该观察极大地简化了关于灵长类动物毒性和临床试验的实验设计。

实例2

用于治疗RA的CD24

几十年来，已假定类风湿性关节炎(RA)主要是T细胞介导的自身免疫疾病。在过去的二十年中，存在关于抗体和B淋巴细胞在RA发病机理中的可能作用的重新认识。因此，除类风湿因子之外，在RA患者中已发现许多自身反应性抗体，尽管它尚未在人中得到明确解决。然而，几个证据已证实，在小鼠模型中，对于普遍存在的或组织特异性抗原特异的抗体足以引起RA症状。例如，发现来自K/BxN TCR转基因小鼠的抗体完全能够在新宿主中转移RA样疾病。同样地，关于4种抗胶原抗体的混合物现在广泛用于在小鼠中诱导RA。这种模型现在称为CAIA，用于胶原抗体诱导的关节炎。

CAIA模型的遗传分析指示关于补体的关键作用。尽管存在其它可能性，但这些要求建议抗体介导的组织损伤在RA的发病机理中的潜在牵涉。组织损伤和炎症之间的联系是免疫学中的长期观察。近二十年前，Matzinger提出了普遍称为危险理论的东西。本质上，她认为免疫系统在感知到宿主中的危险时打开。虽然当时没有明确定义危险的性质，但已确定坏死与细胞内组分如HMGB1和热休克蛋白(其被称为DAMP)的释放有关，用于危险相关的分子模式。发现DAMP促进炎性细胞因子和自身免疫疾病的产生。在动物模型中，发现HMGB1和HSP90的抑制剂改善RA。DAMP的牵涉提出了可以对于RA疗法探索对DAMP的宿主应答的负面调节的前景。

在对组织损伤的宿主应答中的CD24-Siglec 10相互作用

使用对乙酰氨基酚诱导的肝坏死并确保炎症，观察到通过Siglec G的相互作用，CD24提供了对组织损伤的宿主应答的强有力的负调节。CD24是GPI锚定分子，其在造血细胞和其它组织干细胞中广泛表达。人中的各种自身免疫疾病的遗传分析，包括多发性硬化、系统性红斑狼疮、RA和巨细胞关节炎，显示CD24多态性与自身免疫疾病的风险之间的显著相关。Siglec G是I-凝集素家族的成员，通过其识别含唾液酸结构的能力限定。Siglec G识别在CD24上的含有唾液酸的结构，并且通过树突状细胞负调节炎性细胞因子的产生。就其与CD24相互作用的能力而言，人Siglec 10和小鼠Siglec G是功能上等价的。然而，尚不清楚小鼠和人同源物之间是否存在一对一的关联性。尽管该机制尚未完全阐明，但SiglecG相关的SHP1可能涉及负调节似乎是合理的。最近在Science中报道的这些数据导致了新模型，其中CD24-Siglec G/10相互作用可能在区别病原体相关的分子模式(PAMP)与DAMP中起关键作用(图4)。

至少两个重叠机制可以解释CD24的功能。首先，通过与各种DAMP结合，CD24可以捕获炎性刺激物，以预防其与TLR或RAGE的相互作用。这一观点得到CD24与几种DAMP分子结合的观察的支持，所述DAMP分子包括HSP70、90、HMGB1和核仁素。其次，可能在与DAMP结合之后，CD24可以通过Siglec G刺激信号传导。两种机制均可以协同作用，因为具有任一基因的靶向突变的小鼠产生强得多的炎症应答。事实上，当用HMGB1、HSP70或HSP90刺激时，从来自CD24-/-或Siglec G-/-小鼠的骨髓培养的DC产生高得多的炎性细胞因子。相比之下，在其对PAMP例如LPS和PolyI：C的应答中未发现效应。这些数据不仅对于先天性免疫系统提供了区分病原体与组织损伤的机制，而且还提示CD24和Siglec G作为与组织损伤相关的疾病的潜在治疗靶。

CD24Fc对胶原抗体诱导的关节炎的疗效

鉴于先天性免疫在RA的发病机理中对组织损伤的可疑作用以及CD24-Siglec G/10途径在负调节此类应答中的作用，探索了刺激这种途径以治疗RA的可能性。基本上所有自身免疫疾病的发病机理都涉及对自身抗原的免疫应答的诱导和自身免疫性破坏。基于CD24-Siglec G相互作用的新型功能，集中于自身免疫破坏性阶段。因此，对于初步分析，采用胶原抗体诱导的关节炎模型来评估潜在的疗效。

如图5a中所示，通过在第1天时以2mg/小鼠i.V.注射4种抗胶原mAb(MDBiosciences，St.Paul，MN)的混合物，以及在第3天时i.p.注射100μg/小鼠的LPS(MDBioscience)，对8周龄BALB/c小鼠诱导CAIA。在第1天时用1mg CD24Fc或等体积的1xPBS媒介物作为阴性对照处理小鼠。如图5b中所示，与媒介物对照相比较，CD24Fc提供了高度显著的疗效。

为了理解通过其CD24Fc在该模型中减少关节炎的机制，从CD24Fc处理的小鼠或PBS对照组的匀浆化关节中测量细胞因子，并且通过细胞因子珠阵列测量200μg组织匀浆物的上清液。典型的例子显示于图7a中，而概括数据显示于图6b中。这些数据证实系统施用的CD24减少多重炎性细胞因子，包括TNF-α、IL-6、MCP-1(CCL2)和IL-1β的水平。

CD24Fc的效应通过CAIA小鼠的滑膜关节的组织学分析得到证明，如图7中呈现的。在关节炎诱导后第7天时，H&E染色证实PBS组中的关节滑膜被炎症细胞大量浸润，所述炎症细胞包括嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞(图7a)。这在CD24Fc处理的小鼠中大大减少(图7b)。另外，通过PBS处理的(图7c)小鼠而不是CD24Fc处理组(图7d)中的番红O红染色的损失，揭示严重的软骨损伤。

为了确定小鼠CD24Fc是否对正在进行的RA具有疗效，在RA诱导后的第5或7天时起始治疗。如图8中所示，早在CD24Fc处理后两天时，观察到RA得分的显著减少。即使没有另外的治疗，疗效也对于剩余的观察期持续。这些数据还加强了CD24Fc对正在进行的疾病的治疗潜力。

为了估计人中CD24Fc的治疗剂量，通过广泛范围的剂量滴定CD24Fc。如图9中所示，少至2微克/小鼠足以具有统计学显著的疗效。

CD24Fc的Siglecg依赖性疗效

为了确定CD24Fc是否通过与Siglec G相互作用来保护小鼠，确定疗效是否依赖于Siglecg基因。由于Siglecg缺陷小鼠由来自C57BL/6小鼠的ES细胞产生，因此WT C57BL/6小鼠用作对照。如图10a中所示，由于B6小鼠已知对CAIA较不敏感，因此总体疾病得分低于BALB/c小鼠中观察到的那种。然而，CD24Fc的单次注射基本上消除了WT小鼠中的临床体征。重要的是，即使疾病在Siglecg缺陷小鼠中不太严重，CD24Fc也没有疗效。因此，CD24Fc的疗效严格依赖于Siglecg基因。

总之，本文描述的数据证实CD24Fc对于CAIA的高疗功。鉴于我们关于安全性、稳定性和我们成功制造CD24Fc的广泛数据，所有这些都意味着融合蛋白作为用于RA的治疗剂的极大潜力。

实例3

变体CD24具有比野生型CD24改善的活性

该实例显示了含有缺失在位置57处的多态性氨基酸的人CD24的CD24多肽(SEQ IDNO：1)(CD24Fc)比含有野生型CD24的CD24多肽(SEQ ID NO：2)(CD24^VFc)对于治疗RA更有效。

方法

抗体、融合蛋白和其它材料

CD24Fc和CD24vFc由OncoImmune，Inc.制造；牛II型胶原，目录号20022，ChondrexInc.，Redmond，WA；用于BALB/c的4种抗胶原mAb的混合物目录号CIA-MAB-50和用于C57BL/6小鼠的CIA-MAB-2C，MD Bioproducts，St.Paul，MN；鸡II型胶原，目录号20011，ChondrexInc.，Redmond，WA；完全弗氏佐剂：目录号7008，Chondrex Inc.，Redmond，WA，具有以1mg/ml浓度的热灭活的结核分枝杆菌H37 Ra(非存活)；完全弗氏佐剂：目录号7023，ChondrexInc.，Redmond，WA，具有以5mg/ml浓度的热灭活的结核分枝杆菌H37 Ra(非存活)；不完全弗氏佐剂：目录号7002，Chondrex Inc.，Redmond，WA；脂多糖(LPS)，目录号9028，ChondrexInc.，Redmond，WA，来自大肠杆菌0111：B4；细胞计数珠阵列(CBA)Mouse InflammationKit，目录号552364，BD Biosciences，San Jose，CA；细胞计数珠阵列(CBA)HumanInflammatory Cytokines Kit，目录号551811，BD Biosciences，San Jose，CA。

实验动物

BALB/cAnNCr(01B05，NCI)和C57BL/6NCr(01C55，NCI)小鼠，雄性，7周龄，购自位于Frederick，MD的美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)。从JacksonLaboratories收到DBA/1J(000670，JAX)小鼠，雄性，7周龄。所有小鼠在免疫前隔离7天。在隔离期间，检查动物的一般健康和用于在本研究中使用的可接受性。通过耳标鉴定各个动物。通过研究编号、动物编号和组编号鉴定动物笼。为了使笼子变异降到最低，对相同笼子中的各个小鼠给予不同的处理，并且在双盲方案中进行评分。

CAIA模型

BALB/c小鼠(8周龄)在第1天时接受与媒介物或融合蛋白结合的mAb(2mg/小鼠)。小鼠在第3天时接受LPS(100μg/小鼠)，并且每天进行观察共3周。融合蛋白(0.2或1mg/小鼠)或媒介物在第1天时注射一次。在C57BL/6小鼠中，抗胶原抗体的剂量为2mg/小鼠或4mg/小鼠。

CIA模型

DBA/1小鼠中的CIA。在第1天时，在尾的根部处，用100μL胶原-CFA乳液(通过将2mg/ml牛II型胶原与等体积的含有1mg/ml结核分枝杆菌的CFA混合制备)皮下免疫8周龄DBA/1小鼠。在第10天时，距离尾根部1.5cm，用60μL胶原-IFA乳液(通过将2mg/ml胶原与等体积的IFA混合制备)皮下加强免疫小鼠。在关节炎症状发展之前或之后起始治疗。

C57BL/6小鼠中的CIA。在第1天时，在尾的根部处，用100μL胶原-CFA乳液(通过将4mg/ml鸡II型胶原与等体积的含有5mg/ml结核分枝杆菌的CFA混合制备)皮内免疫8周龄C57BL/6小鼠。在第21天时，距离尾根部1.5cm，皮内施用由相同的胶原-CFA乳液的加强免疫。在第28天时，将具有临床症状的小鼠随机化，以接受媒介物或CD24Fc。

RA模型中的治疗

关节炎的得分基于下述量表。

0，正常；1，轻度但踝关节或腕关节的明确发红和肿胀，或限于个别足趾的明显发红和肿胀，与受累足趾的数目无关；2，踝关节或腕关节的中度发红和肿胀；3，整个爪包括足趾的严重发红和肿胀；4，具有多关节牵涉的最大程度发炎的肢体。将小鼠的4个肢体的组合得分报告为小鼠的疾病得分。

CAIA中的预防性治疗与抗胶原抗体同时起始。

在DBA/1小鼠的CIA模型中的预防模型：在第17天时，将免疫的小鼠随机分成两组，并且用媒介物(PBS)或给定剂量的CD24Fc处理。双盲观察小鼠共三周。

使用具有3至8的临床得分的小鼠，在第一次免疫后25天时起始具有正在进行的疾病的DBA/1模型中的治疗性CIA。

C57BL/6小鼠中的治疗性CIA在第28天时起始或仅使用具有3至8的临床得分的那些小鼠。

统计方法

对于获得的所有数值数据计算组平均值和标准差值(当认为适当时)。用费歇尔PLSD测试或用于成对比较的t-检验，统计分析CD24Fc和对照小鼠之间的差异。

结果

非多态性CD24Fc对胶原抗体诱导的关节炎的疗效

人成熟CD24以两种等位基因形式存在，其中缬氨酸或丙氨酸存在于C末端(CD24氨基酸序列的位置57)处。包括任一等位基因形式的融合蛋白可能在一些RA患者中引发抗药物抗体。因此，为了避免免疫原性，测试多态性残基是否可以从CD24中去除，同时维持CD24的调节功能。如图11A中图解的，产生两种融合蛋白，一种具有CD24^V等位基因的整个细胞外结构域(CD24^VFc)(具有SEQ ID NO：2的成熟CD24序列)，而另一种具有在所得到的成熟CD24(CD24Fc)(具有SEQ ID NO：1的成熟CD24序列)的C末端处的一个氨基酸缺失。两种形式均以相似的程度表达且纯化(图11B)。

为了确定CD24上的缬氨酸是否是CD24-Siglec10相互作用所必需的，比较CD24Fc和CD24^VFc与Siglec 10Fc融合蛋白的结合。如图11C中所示，CD24Fc以剂量依赖性方式与Siglec 10Fc相互作用。由于CD24Fc用唾液酸酶的预处理阻止结合，因此相互作用取决于CD24Fc上的唾液酸。令人惊讶的是，虽然CD24^VFc也与Siglec 10Fc相互作用，但相互作用明显弱于CD24-Fc-Siglec 10Fc的那种。通过i.V.注射与CD24^VFc、CD24Fc、人IgG1Fc或等体积的作为阴性对照的1xPBS媒介物结合的4种抗胶原mAb的混合物，在8周龄BALB/c小鼠中诱导CAIA。如图11D中所示，与媒介物对照相比，CD24Fc提供了高度显著的疗效。令人惊讶的是，CD24^VFc效果差得多，其中活性与阴性对照没有显著不同。在类似于图11D中所示的实验中，图11E和11F也显示了CD24Fc比CD24^VFc更有效，尽管与图11D中的实验不同，CD24^VFc确实具有比阴性对照更多的活性。CD24Fc和CD24^VFC的疗效的比较指示，缺失多态性氨基酸残基不仅可能消除潜在的免疫原性问题，而且还显著增加CD24蛋白的抗炎活性。由于Fc部分在两种构建体中是相同的，因此疗效在很大程度上可归于CD24功能。由于Fc蛋白经常加剧关节炎(数据未显示)，因此媒介物对照用于体内研究以避免诱导混杂效应。

CD24Fc在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中的疗效

由于CAIA主要反映由抗体诱导的组织损伤起始的关节炎症，并且由于RA涉及可以在CIA环境中更好地反映的适应性和先天性免疫介导的破坏两者，因此两种CIA模型用于研究CD24Fc的潜在疗效。首先，在DBA/1小鼠中测试CD24Fc的预防效应。如图12A中所示，在临床症状发展之前用单一剂量的CD24Fc的治疗显著减少随后的疾病得分(P＝0.02)。为了确定CD24Fc是否对DBA/1小鼠中正在进行的CIA赋予疗效，当小鼠具有3至8的关节炎得分时起始治疗。每隔一天递送CD24Fc(200μg/小鼠)或媒介物，共5次。如图12B中所示，早在两次治疗后就观察到关节炎得分的明确减少。在CD24Fc组中观察到临床症状显著减少(P＝0.02)。

据报道，鸡胶原在C57BL/6背景中诱导严重的关节炎。因此，这种模型用于证明CD24Fc的疗效。由于在相同组内观察到疾病得分中的显著变化，因此50％和80％的疾病得分减少用作研究的终点。比较在三周时期内达到任一治疗终点的小鼠的百分比。如图13A中所示，CD24Fc在严重临床症状已发展后加速小鼠的恢复。为了测试在疾病的高峰期的疗效，允许小鼠经过另一周以达到峰值临床得分，此时小鼠用100或50μg/小鼠的重复注射(每隔一天一次，总共5次注射)进行处理。如图13B中所示，用50μg/小鼠/注射实现恢复的瞬时增加。然而，仅用100μg/小鼠/注射实现持续恢复。这些数据证实即使药物在疾病高峰期施用时的剂量依赖性疗效。

CD24Fc通过具有CD24的shRNA沉默的人巨噬细胞系抑制炎性细胞因子的产生

为了确定CD24是否调节人细胞系中炎性细胞因子的产生，CD24在人THP1细胞系中沉默，然后通过用PMA处理细胞诱导分化成巨噬细胞。如图14A中所示，CD24沉默显著增加TNFα、IL-1β和IL-6的产生。这些数据证实内源性人CD24在炎性细胞因子产生中的重要作用。重要的是，CD24Fc强烈抑制TNFα以及IL-1β和IL-6的产生(图14B)。与体内疗效一致，CD24^VFc在抑制巨噬细胞系中炎性细胞因子的产生方面效率低大约10倍(图14C)。

CD24Fc通过经由Siglec G的信号传导赋予保护

据报道，CD24Fc与小鼠中的Siglec G和人中的Siglec 10相互作用。为了确定CD24Fc是否通过Siglec G发信号，将来自CD24^-/-小鼠的脾细胞与媒介物、Fc或CD24Fc一起温育30分钟，并且测量酪氨酸磷酸化和SHP-1与Siglec G的结合。如图15A中所示，CD24Fc强烈刺激Siglec G的酪氨酸磷酸化。相应地，与Siglec G共沉淀的SHP1的量急剧增加。这些结果证实CD24Fc能够通过Siglec G发信号。

为了测试通过Siglec G的CD24Fc信号传导在RA治疗中的显著性，比较WT小鼠和Siglec G缺陷小鼠对CD24Fc的应答。如图15B中所示，当使用较低剂量的抗胶原抗体时，疾病不太严重，但保护完全依赖于Siglecg基因。然而，随着抗胶原抗体的剂量增加，保护效应仅部分依赖于Siglecg，因为保护仍然是明显的，尽管不太明显(KO中的52％相对于WT小鼠中的72％)(图15C)。这些数据证实虽然CD24Fc可以通过Siglec G发信号以赋予针对CAIA的保护，但存在另外的机制，其允许CD24Fc在不存在Siglec G的情况下预防RA。

讨论

总之，结果证实CD24Fc在三种小鼠RA模型，包括CAIA和两种CIA模型中具有有力的疗效。多重模型中的功效指示CD24Fc在具有不同潜在发病机理的人中的RA中具有疗效。几十年来，已假定RA主要是T细胞介导的自身免疫疾病。在过去的二十年中，已存在关于抗体和B淋巴细胞在RA发病机理中的可能作用的重新认识。因此，除类风湿因子之外，在RA患者中已发现许多自身抗体。几个证据已证实，在小鼠模型中，对于普遍存在的或组织特异性抗原特异的抗体足以引起RA症状。例如，发现来自K/BxN TCR转基因小鼠的抗体完全能够在新宿主中转移RA样疾病。同样地，4种抗胶原抗体的混合物现在广泛用于在小鼠中诱导RA。CAIA模型的遗传分析指示补体的关键作用。尽管存在其它可能性，但这些要求提示抗体介导的组织损伤分子在RA的发病机理中的潜在牵涉。CD24Fc在这种模型中的功效证实融合蛋白可以用于RA患者中抗体介导的破坏阶段。

CIA模型通常用于RA，因为它可以模拟适应性免疫和先天性免疫两者的诱导和效应子功能两者。两种CIA模型用于验证CD24Fc的疗效。DBA/1小鼠中的牛胶原诱导的RA是最常用的模型。上述数据显示CD24Fc在这种模型的疾病发作之前或之后减少疾病得分。牛CIA模型的一个缺点是只有相对少量的菌株易受影响。特别地，通常用于遗传研究的C57BL/6小鼠是抗性的。最近以来，已开发了使用鸡胶原在C57BL/6小鼠中诱导CIA的方案。如上所示，CD24Fc加速由鸡胶原诱导的关节炎的恢复。CD24Fc在多重模型中赋予保护的事实证实其疗效的稳固性。

与药物开发有关的重要问题是作用机制。由于已报道CD24Fc与Siglec G和人Siglec 10两者结合，因此评估了这种相互作用的重要性。在体外，如上所示，CD24Fc通过Siglec G发信号并触发酪氨酸磷酸化。在体内，如上所示，CD24Fc至少部分地通过Siglec G起作用。这些结果证实CD24Fc通过加强Siglec G介导的不受对DAMP的先天性免疫的保护来保护不受RA似乎是合理的。迄今为止，还没有通过强化超过对DAMP的先天性应答的负调节来开发RA药物。因此，CD24Fc和含有缺失多态性A/V氨基酸(SEQ ID NO：1)的变体CD24的其它融合蛋白代表了一类新的RA治疗剂。该方法可能优于靶向个别DAMP或炎性细胞因子的抗体。由于在自身免疫破坏期间释放多重DAMP，因此靶向个别DAMP可能不如靶向广谱调节剂如CD24-Siglec G途径有效。然而，应该指出，该实例中的数据证实保护并不完全依赖于通过Siglec G的信号传导。可以调用至少两种另外的机制。首先，通过与DAMP结合，CD24可以减少可用于其激动剂受体，例如RAGE，TLR的DAMP的量。其次，由于CD24是异质糖基化的，因此它可以与Siglecs的其它成员结合以赋予负调节。

结论

包含人CD24的非多态性细胞外结构域(包含SEQ ID NO：1)的融合蛋白保护小鼠不受由抗胶原抗体或胶原免疫引发的关节炎。该保护至少部分取决于其与Siglec G的相互作用。数据证实利用先天性免疫对组织损伤的负调节的潜力。出乎意料地，CD24的非多态性变体在压制炎性细胞因子产生和保护小鼠不受RA方面优于野生型CD24。

实例4

CD24在人中的药代动力学

该实例显示了CD24蛋白在人中的药代动力学分析。这衍生自I期、随机化、双盲、安慰剂对照、单次递增剂量研究，以评价CD24Fc在健康男性和女性成人受试者中的安全性、耐受性和PK。在该研究中召募了各8个受试者的5个群组中的总共40个受试者。每个群组中的8个受试者中的6个接受研究药物，并且2个受试者接受安慰剂(0.9％氯化钠，盐水)。第一群组用10mg进行给药。成功群组接受30mg、60mg、120mg和240mg CD24Fc或匹配的安慰剂，并且间隔至少3周给药，以允许审查每个先前群组的安全性和耐受性数据。只有在已证实足够的安全性和耐受性的情况下，才允许向新的受试者群体施用下一个更高剂量。

在每个群组中，最初的2名受试者在第1天时是1个研究药物接受者和1个安慰剂接受者。在第7天之后给药第3至5个和第6至8个受试者(在亚组之间间隔最少24小时)。每个受试者在相同亚组中间隔至少1小时进行给药。必要时，剩余受试者的给药延迟，等待审查在涉及该群组中的第一亚组或第二亚组的剂量后时期过程中可能已出现的任何重大安全性问题。随后的群组在先前群组后给药至少3周。

筛选期：

筛选就诊(就诊1)在活跃治疗期开始前至多21天发生。在提供知情同意书后，受试者经历关于合格性的筛选程序。

治疗期：

受试者在第-1天(就诊2)时加入临床药理学单位(Clinical Pharmacology Unit)(CPU)，并且随机化的治疗期在第1天时在最少10小时过夜禁食后开始。将受试者随机分配给用CD24Fc或安慰剂作为单一剂量的治疗。受试者保持限制直到第4天的早晨。

随访：

所有受试者都在第7天、第14天、第21天、第28天和第42天(±1天)返回CPU，用于随访(就诊3、就诊4、就诊5、就诊6和就诊7)。就诊7是所有受试者的最后一次就诊。

治疗的持续时间：每个受试者的总研究持续时间至多63天。单一剂量施用在第1天时发生。

受试者数目：

计划的：40个受试者

筛选的：224个受试者

随机化的：40个受试者

完成的：39个受试者

中断的：1个受试者

用于包含的诊断和主要标准：用于该研究的群体是18至55岁(包括端值在内)的健康男性和女性，具有18kg/m²至30kg/m²(包括端值在内)的体重指数。

研究产品和比较者信息：

CD24Fc：经由IV输注施用10mg、30mg、60mg、120mg或240mg的单一剂量；批号：09MM-036。CD24Fc是完全人源化的融合蛋白，其由人CD24的成熟序列和人免疫球蛋白G1的可结晶片段区(IgG1Fc)组成。CD24Fc以无菌，透明，无色，无防腐剂的水溶液形式供应，用于IV施用。将CD24Fc配制为单一剂量注射溶液，浓度为10mg/mL且pH为7.2。每个CD24Fc小瓶含有在16mL±0.2mL的CD24Fc中的160mg CD24Fc、5.3mg氯化钠、32.6mg磷酸氢二钠七水合物和140mg磷酸二氢钠一水合物。CD24Fc在透明硼硅酸盐玻璃小瓶中供应，所述玻璃小瓶具有氯化丁基橡胶塞和铝制翻转密封。

经由IV输注施用匹配的安慰剂(0.9％氯化钠，盐水)；批号：P296855、P311852、P300715、P315952。

意向治疗(ITT)群体由接受研究药物的至少1个剂量的所有受试者组成。ITT群体是用于受试者信息和安全性评估的主要分析群体。

通过治疗和就诊概括了临床实验室评估(化学、血液学和尿分析)。还概括了自基线的变化。通过治疗和时间点概括了生命体征(血压、心率、呼吸频率和温度)。还概括了自基线的变化。列出了所有体检数据。概括了心电图参数和自基线的变化。列出了总体解释。

血浆CD24Fc浓度

如图16中所示，CD24Fc的平均血浆浓度与施用的CD24Fc剂量成比例地增加。对于除了120mg之外的所有剂量组，在剂量后1小时达到CD24Fc的最大平均血浆浓度。在剂量后2小时达到关于120mg组的CD24Fc的最大平均血浆浓度。到第42天(984小时)时，关于所有组的CD24Fc的平均血浆浓度已降低至最大平均血浆浓度的2％至4％。

表1通过用于PK可评估群体的治疗概括了血浆CD24Fc PK参数。

表1通过治疗的血浆CD24Fc药代动力学参数的概括-PK可评估群体

血浆CD24Fc剂量比例分析

图17显示了CD24Fc C_max相对于用于PK可评估群体的剂量的剂量比例图。图18显示了CD24Fc AUC_0-42d相对于用于PK可评估群体的剂量的剂量比例图。图19显示了CD24FcAUC_0-inf相对于用于PK可评估群体的剂量的剂量比例图。表2显示了剂量比例性的效力分析。

C_max斜率估计值为1.172，其中90％CI为1.105至1.240。AUC_0-42d斜率估计值为1.088，其中90％CI为1.027至1.148。AUC_0-inf斜率估计为1.087，其中90％CI为1.026至1.1。

药代动力学结论

血浆CD24Fc的C_max和AUC与小鼠、猴和人中施用的剂量成比例地增加。血浆CD24Fc在1.01至1.34小时之间达到T_max。血浆CD24Fc的t_1/2范围在280.83至327.10小时之间。

实例5

CD24降低LDL-C水平

该实例证实CD24Fc降低LDL-C。在临床研究中分析了自基线的血浆中空腹LDL-C的变化，所述临床研究在上文中更详细地描述(参见实例4的方法部分)。对于群组1(CD24Fc10mg组)，在第-1天、第7天和第42天时获得的样品中测定空腹LDL-C水平。从群组2(CD24Fc30mg组)开始，将该脂质采样扩展至包括第14天。数据概括于表3中。由于群组1中的不完全数据集，群组2-5用于分析LDL-C水平的剂量依赖性减少。观察到统计学显著的剂量依赖性减少(表3)。

表3在第7天(U1)、第14天(U2)和第42天(U3)时，自基线(U0，定义为100％)的LDL-C水平的变化

*当与安慰剂组相比时，P＜0.05，斯氏t检验。

使用群组1作为参考，确定CD24Fc是否以剂量和时间依赖性方式减少LDL-C水平。如表4中所示，与接受10mg CD24Fc的群组1相比，观察到LDL-C水平的显著剂量依赖性降低(p＜0.0001)。

表4使用群组1(最低剂量作为参考)，通过GEE模型在群组中LDL-C减少的剂量和时间依赖性

这证实CD24Fc对于降低人患者中的LDL-C是有效的。该数据以图形方式展示在图20中。

实例6

CD24降低瘦素水平

该实例证实CD24Fc增加循环瘦素水平。在临床研究中分析了自基线的血浆中瘦素的变化，所述临床研究在上文中更详细地描述(参见实例4的方法部分)。

使用基于Luminex珠的免疫测定，在接受CD24Fc或安慰剂的40个健康受试者的第-1天治疗前和治疗后第3天时获得的80个样品中测定血浆瘦素水平。数据概括于表5中。

表5受试者血浆中的瘦素水平。

将分析灵敏度或检测限(LOD)确定为在位于高于平均背景(二十个零标准重复)2个标准差的点处从标准曲线计算的值。使用经过三个不同轮次一式三份测定的标准稀释剂中标准的2倍稀释系列，测定定量下限(LLOQ)，并且定义为在其下用于测量的变异系数(CV)为30％的点。计算CV并且针对浓度进行描绘，并且从图中插入LLOQ。测定性能特征如下表6中。

表6

分析物	瘦素
		单位	pg/ml
LOD	8.1
		LLOQ	18.2
标准曲线范围	7.7-600,000

图21展示了关于通过给药群组分组的患者，在第3天/第-1天时的瘦素比率。如图所示，在CD24Fc治疗后的循环瘦素的相对量中存在上升趋势，并且在0、60、120和240mg群组之间，这种增加是统计学显著的(P＝0.009397，剂量依赖性一般线性模型回归)，证实60mg以上的剂量依赖性增加。此外，与安慰剂(0mg)相比，在240mg群组中的CD24Fc施用后，存在瘦素水平中的统计学显著性增加(P＝0.05，如通过斯氏T检验确定的)，表明CD24Fc对于增加人患者中的瘦素是有效的。

实例7

CD24蛋白在SLE的小鼠模型中的功效评价

将8周龄的二十四(24)只MRL/MpJ-Faslpr/J(JAX原种#000485)(MRL.lpr)雌性小鼠转移到位于Bar Harbor，ME的体内研究动物饲养所。对小鼠进行耳朵切口用于鉴定，并且以每笼5只小鼠的密度饲养在个别且用HEPA过滤的空气积极通风的多磺酸盐笼中。动物室完全用人工荧光灯照明，具有控制的12小时光/黑周期(早上6点至半夜6点照明)。动物室中的正常温度和相对湿度范围分别为22±4℃和50±15％。动物室设定为具有每小时15次空气交换。无限制地提供酸化至pH 2.5至3.0的过滤的自来水，以及正常的啮齿类动物食物。

在11周龄时，使用Albustix测试蛋白尿。将产生得分1的小鼠随机分成10只的两组。组1接受200μl 1X PBS的单次IP注射。组2接受200μl 10mg/ml hCD24-Fc的单次IP注射。每周测量蛋白尿直至研究终点。在16周龄时，对小鼠实施安乐死。将它们的脾称重并且对于单核细胞进行加工。将淋巴结(腋窝、肱、腹股沟)组合，并且记录重量。

在11周龄时开始，使用Albustix每周测量尿中的蛋白质水平。蛋白质水平如下分配。1+，30mg/dL；2+，100mg/dL，3+，300mg/dL。如图22中所示，接受PBS的小鼠在接下来的4周内显示蛋白尿的逐渐增加，而接受CD24Fc的小鼠显示最低限度的增加。

为了更准确地测量蛋白尿，在16周龄时，使用Siemens AU680化学分析仪测试小鼠的尿白蛋白。如图23中所示，CD24Fc治疗显著减少蛋白尿。总之，这些数据证实CD24Fc阻止模型中蛋白尿的进展。

脾肿大和淋巴结病是MRL.1pr狼疮模型的主要特征。为了证明疗效，测试了CD24Fc减少脾和淋巴结重量的能力。如图24和25中所示，当在16周测量时，CD24Fc分别显著减少脾和淋巴结的重量。

总之，关于鼠狼疮模型的数据证实CD24Fc用于治疗SLE的功效。

实例8

用于狼疮性肾炎治疗的临床试验

下文描述了评价CD24Fc在狼疮性肾炎的治疗中的用途的I期临床试验的概述。

目标：

主要目标：

·评估多剂量CD24Fc加上SOC在患有狼疮性肾炎的患者中的安全性和耐受性，所述狼疮性肾炎对护理标准治疗免疫抑制药剂抗拒

·确定靶群体中推荐的CD24Fc的2期剂量(RP2D)和/或最大耐受剂量(MTD)。

次要目标：

·评价多剂量CD24Fc的药代动力学(PK)概况

·评价CD24Fc在加入用于狼疮性肾炎的护理标准治疗时的功效

·评估用于临床应答的探索性药效生物标记物

研究群体：

对用适度背景治疗/SOC(高剂量类固醇加上MMF或环磷酰胺)的护理标准免疫抑制药剂抗拒、患有活动性/增生性狼疮性肾炎的患者

入选标准：

·年龄≥18岁；

·根据修订的美国风湿病学会(American College of Rheumatology)标准的SLE诊断；

·在筛选时的活动性疾病(SELENA-SLEDAI得分≥6)

·增生性疾病(III/IV级)

·如通过2个阳性ANA或抗dsDNA测试结果(ANA滴定≥1∶80和/或抗dsDNA抗体≥30IU/mL)定义的血清阳性，其中在筛选期间必须获得≥1个测试结果。

·蛋白尿升高

排除标准：

具有＞50％肾小球硬化或间质性纤维化或估计的肾小球滤过率(eGFR)＜25ml/分钟/1.73m²的患者

研究设计：

多中心随机化双盲多剂量研究，并且将评价重复剂量的CD24Fc加上SOC相对于安慰剂加上SOC在患有增生性难治性狼疮肾炎的患者中的安全性、耐受性、PK和生物活性。患者将在第1、14、28和42天时接受CD24Fc。CD24Fc通过IV输注进行施用。

剂量-递增阶段包括10个患者的3个不同给药群组(8∶2治疗：安慰剂)，总共召募30个患者。关于剂量-递增阶段的剂量水平已基于非临床良好实验室规范(Good LaboratoryPractice)(GLP)重复剂量毒理学研究的结果、相关的非临床药效学读数，并且基于来自单一剂量FIH研究和GvHD预防中的II期研究的安全性、PK和PD结果进行确定。

群组1：240mg CD24Fc

群组2：480mg CD24Fc

群组3：960mg CD24Fc

关于剂量递增的主要安全性终点将是3级(严重)或4级(危及生命)不良事件(AE)的发生率。如果群组中的＜2个患者在最后一个给药日的2个半衰期内经历3级或4级AE，则允许剂量递增。

在研究自始至终评估基于CD24Fc MOA的临床活性，生物活性和一系列潜在的PD标记物。患者将随访78周。

临床样品：

在治疗前以及在治疗期间的多个治疗后时间点，需要来自所有受试者的抽血，用于安全性、PK和PD标记物的评价。

研究评价：

安全性：

·不良事件

·实验室异常

·感染

·死亡率

·恶性

临床活性：

·SLE响应者指数(SRI)-在第52周时系统性红斑狼疮响应者指数(SRI)中的改善(SELENA-SLEDAI得分≥4点的减少；没有新的不列颠群岛狼疮评估组(British IslesLupus Assessment Group)[BILAG]A器官结构域得分以及不超过1个新的B器官结构域得分；并且相对于基线，医师的全面评估(Physician′s Global Assessment)[PGA]得分中没有恶化[＜0·3增加]。)

·BICLA(基于BILAG的组合狼疮评价)

·肾脏参数-每日蛋白尿中的降低，eGFR

·6个月的缓解率

·类固醇节约(类固醇剂量中的减少)-平均泼尼松剂量从基线降低≥25％且在40至52周期间≤7.5mg/d的患者百分比

·严重发作中的降低(改良的SLE发作指数或BILAG A)

药代动力学：

通过在输注结束(EOI)后的不同时间点评价CD24Fc的血清水平来确定PK。

药效学：

·在研究自始至终收集血液样品，用于评估潜在的生物标记物，包括空腹低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平中的变化。

·标准化的脂质谱

·抗dsDNA

·ANA

·补体水平(C3和C4)

·B和T细胞亚群

·尿蛋白/肌酸

·IFN标记

·IL-6

统计分析：

安全性：

通过将不良事件制表和通过实验室数据的临床评价，来评估受试者中上升的静脉内多剂量CD24Fc的安全性和耐受性。

药代动力学：

PK参数包括AUC 0-t、AUC0-inf、Cmax、Tmax、t1/2、Kel、分布体积(Vd)、清除率(CL)。从0到t的血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC_0-t)、从0到无穷大的血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC_0-∞)和最大血浆浓度(C_max)对于所有统计分析进行对数转化，并且概括统计学进行反向转化且在原始量表上呈现。使用跨越剂量范围的AUC_0-∞和C_max分析剂量比例性。

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序列表

<110> 肿瘤免疫股份有限公司

<120> 可溶性CD24用于治疗系统性红斑狼疮的使用方法

<130> 060275.0401.01PC00

<150> 62/468,049

<151> 2017-03-07

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> X

<222> (31)..(31)

<223> 缬氨酸或丙氨酸

<400> 1

Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser

1 5 10 15

Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Xaa

20 25 30

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser

1 5 10 15

Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys

20 25 30

<210> 3

<211> 27

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 3

Asn Gln Thr Ser Val Ala Pro Phe Pro Gly Asn Gln Asn Ile Ser Ala

1 5 10 15

Ser Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Arg Gly

20 25

<210> 4

<211> 26

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser

20 25

<210> 5

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 5

Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly

20 25 30

Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro

35 40 45

Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

50 55 60

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

65 70 75 80

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

85 90 95

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

100 105 110

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

115 120 125

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

130 135 140

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

145 150 155 160

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

165 170 175

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

180 185 190

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

195 200 205

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

210 215 220

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

225 230 235 240

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

245 250 255

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

260 265 270

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280 285

<210> 6

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 6

Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser

1 5 10 15

Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Pro Lys

20 25 30

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

35 40 45

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

50 55 60

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

65 70 75 80

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

85 90 95

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

100 105 110

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

115 120 125

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

130 135 140

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

145 150 155 160

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

165 170 175

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

180 185 190

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

195 200 205

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

210 215 220

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

225 230 235 240

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

245 250 255

Leu Ser Pro Gly Lys

260

<210> 7

<211> 231

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

1 5 10 15

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 8

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 8

Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly

20 25 30

Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro

35 40 45

Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Val Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

50 55 60

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

65 70 75 80

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

85 90 95

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

100 105 110

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

115 120 125

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

130 135 140

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

145 150 155 160

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

180 185 190

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

210 215 220

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

225 230 235 240

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

245 250 255

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

260 265 270

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280 285

<210> 9

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 9

Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly

20 25 30

Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro

35 40 45

Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

50 55 60

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

65 70 75 80

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

85 90 95

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

100 105 110

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

115 120 125

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

130 135 140

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

145 150 155 160

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

180 185 190

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

210 215 220

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

225 230 235 240

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

245 250 255

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

260 265 270

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280 285

<210> 10

<211> 29

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 10

Thr Val Thr Thr Ser Ala Pro Leu Ser Ser Asn Ser Pro Gln Asn Thr

1 5 10 15

Ser Thr Thr Pro Asn Pro Ala Asn Thr Thr Thr Lys Ala

20 25

<210> 11

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 11

Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser

1 5 10 15

Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Val Pro

20 25 30

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

35 40 45

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

50 55 60

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

65 70 75 80

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

85 90 95

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

100 105 110

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

115 120 125

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

130 135 140

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

145 150 155 160

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

165 170 175

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

180 185 190

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

195 200 205

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

210 215 220

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

225 230 235 240

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

245 250 255

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260

<210> 12

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 12

Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser

1 5 10 15

Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Pro

20 25 30

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

35 40 45

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

85 90 95

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

100 105 110

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115 120 125

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

130 135 140

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145 150 155 160

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

165 170 175

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

180 185 190

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

195 200 205

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

210 215 220

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

225 230 235 240

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

245 250 255

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260

Claims (18)

1.一种治疗狼疮的方法，其包括将CD24蛋白施用于有此需要的受试者。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有狼疮性肾炎。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有脑病。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有心血管疾病。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者先前已用另一种药物治疗。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述CD24蛋白包含成熟的人CD24或其变体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述成熟的人CD24的序列包含SEQ ID NO:1或2中所示的序列。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述CD24蛋白还包含蛋白质标签，其中所述蛋白质标签在所述CD24蛋白的N末端或C末端处融合。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白质标签包含哺乳动物免疫球蛋白(Ig)的一部分。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述Ig部分是人Ig蛋白的Fc区。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述Fc区包含人Ig蛋白的铰链区以及CH2和CH3结构域，并且其中所述Ig蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述Fc区包含铰链区以及IgM的CH2、CH3和CH4结构域。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述CD24蛋白的序列包含SEQ ID NO:6、11或12中所示的序列。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用真核蛋白表达系统产生所述CD24蛋白。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达系统包含在中国仓鼠卵巢细胞系中含有的载体或复制缺陷型逆转录病毒载体。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述复制缺陷型逆转录病毒载体稳定整合到真核细胞的基因组内。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CD24蛋白是可溶的。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CD24蛋白是糖基化的。