JP2023530159A - 前頭側頭型認知症を処置するための組成物および方法 - Google Patents

前頭側頭型認知症を処置するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

血液脳関門（ＢＢＢ）を越える治療剤または診断剤の送達を容易にするための、そのバリアントおよび組合せを含む、ＢＢＢ輸送活性を有する活性剤にカップリングされたｐ９７断片を含む治療用ペイロードが開示される。治療用ペイロードは、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置に有効であり得る。前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を処置する方法および医薬組成物も開示される。本開示は、有意な神経学的態様を呈する疾患は、ＩＶまたは皮下投与などの通常の投与経路には応答しないと予想される課題を解決する手段を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１５日に出願した米国非仮特許出願第１７／３４８，１０６号および２０２０年６月１７日に出願した米国仮出願第６３／０４０，４２８号の優先権の利益を主張するものであり、それらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、書面の代わりにテキスト形式で提出され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、２７９４２－３１７－１０４４７２－１００－０６１１２０．ｔｘｔである。このテキストファイルは、約１２ＫＢであり、２０２１年５月１３日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて電子的に提出されている。
発明の技術分野
本発明は、血液脳関門を浸透する化合物を含む、疾患を処置するための化合物に関する。本発明は、本発明の化合物を含む医薬組成物および前記組成物を前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置に使用する方法も提供する。
発明の背景
前頭側頭型認知症は、神経細胞の喪失により脳の前頭葉および側頭葉に主に影響を及ぼすまれな脳障害を記載するために使用される一般的用語である。ＦＴＤ患者のおよそ３０％が強い家族歴を示し、これは、高度に遺伝性の神経変性障害のサブセットであると考えられている。ＦＴＤは、６５歳未満の人に影響を及ぼす認知症の２番目に多い形態であると考えられ、推定有病率は、３％～２６％の範囲である。ＦＴＤは、行動異常型ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）および原発性進行性失語（ＰＰＡ）からなる２つの中心的な臨床上のバリアントに分類され、ＦＴＤスペクトラム内の他の障害は関連するＦＴＤ症候群として分類される。Greaves CV, Rohrer JD. An update on genetic frontotemporal dementia. J Neurol. 2019; 266(8):2075-2086. doi:10.1007/s00415-019-09363-4; Hodges JR, Davies R, Xuereb J, Kril J, Halliday G. Survival in frontotemporal dementia. Neurology. 2003; 61(3):349-354. [PubMed: 12913196]; Olney, N.T. et al., Frontotemporal Dementia, Neurol. Clin. 2017 May; 35(s): 339-374;およびVieira RT, Caixeta L, Machado S, et al. Epidemiology of early-onset dementia: a review of the literature. Clin Pract Epidemiol Ment Health. 2013; 9:88-95. [PubMed: 23878613]を参照されたい。
現在、ＦＴＤの処置に対して利用可能なＦＤＡが承認した疾患修飾薬はなく、ロバストな血液および／または脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカーもまだ同定されていない。しかし、プログラニュリン、ニューロフィラメント軽鎖、およびポリ（ＧＰ）ジペプチドリピートタンパク質を含む３つの可能性があるマーカーが近年注目を集めている。
治療剤を脳の特異的な領域に送達することに関する課題を克服することは、前頭側頭型認知症などの脳のものを含め、多くの中枢神経系（ＣＮＳ）障害の処置または診断に対する主要な課題を表す。その神経保護的役割において、血液脳関門（ＢＢＢ）は、可能性として重要な多くの治療剤の脳への有益な送達を妨害するように機能する。そうでなければ診断および治療において有効であるかもしれない治療剤は、適切な量で血液脳関門を越えられない。すべての治療用分子のうちの９５％を上回るものが、血液脳関門を越えられないことが報告されている。したがって、疾患を処置するために血液脳関門を越えて治療剤を送達することが所望されている。
正常な脳の代謝および機能に関係する異なる生化学経路を標的とする技術の開発が必要である。これらの技術は、プログラニュリン、プログラニュリン調節因子（ソルチリン－１を含むソルチリン、プロサポシン、液胞ＡＴＰアーゼ阻害剤、および酸中和薬）などの薬剤の送達、ならびに遺伝子治療、例えばＣ９ｏｒｆ７２、ＧＲＮ、ＭＡＰＴ遺伝子を標的とするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の送達を含み得る。本発明は、前頭側頭型認知症を処置する、予防する、またはその進行を緩徐化するために、血液脳関門を越えて活性剤を送達するための新規組成物および方法を提供する。
タンパク質補充療法は、体内で欠損しているタンパク質を補充または交換することによる疾患および障害の治療的処置である。
ＲＮＡに基づく治療は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用を通してＲＮＡを変更すること、ならびに／またはタンパク質発現を低減する、回復する、および改変することを含む処置である。長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を哺乳動物細胞に導入することはインターフェロンの応答により難しいが、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用はより成功している。
しかし、中枢神経系（ＣＮＳ）の組織などの所望の組織への送達は、タンパク質およびＲＮＡ分子の治療的使用に対する難問である。問題の１つとして、血液脳関門（ＢＢＢ）が、多くの薬剤の体の血液から脳への自由な移動を遮断する。この理由から、有意な神経学的態様を呈する疾患は、ＩＶまたは皮下投与などの通常の投与経路には応答しないと予想される。そのような疾患および他の疾患に関しては、ＢＢＢを越える分子の送達を改善する方法が非常に望ましいであろう。
Greaves CV, Rohrer JD. An update on genetic frontotemporal dementia. J Neurol. 2019; 266(8):2075-2086. doi:10.1007/s00415-019-09363-4 Hodges JR, Davies R, Xuereb J, Kril J, Halliday G. Survival in frontotemporal dementia. Neurology. 2003; 61(3):349-354. [PubMed: 12913196] Olney, N.T. et al., Frontotemporal Dementia, Neurol. Clin. 2017 May; 35(s): 339-374 Vieira RT, Caixeta L, Machado S, et al. Epidemiology of early-onset dementia: a review of the literature. Clin Pract Epidemiol Ment Health. 2013; 9:88-95. [PubMed: 23878613]
発明の要旨
本発明に従って、活性剤がＢＢＢを通過することを可能にする、ｐ９７断片にカップリングされた前頭側頭型認知症の処置に好適な活性剤を含む治療用ペイロードを投与することによって、それを必要とする被験体における前頭側頭型認知症を処置する方法が提供される。本発明に従って、治療用ペイロードは、ｐ９７断片にカップリングされていない形態の活性剤と類似の薬物動態特徴を有する。
本発明により、被験体の血液脳関門を越える活性剤の輸送を促進することによって前頭側頭型認知症を処置することが可能になり得る。
他の態様では、本発明は以下を提供する：
請求項１． 前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を処置する、予防する、改善する、そのリスクを低減する、またはその発症もしくは進行を緩徐化する方法であって、ｐ９７ポリペプチドまたはその断片にカップリングされた前頭側頭型認知症の処置に好適な活性剤を含む治療用ペイロード（すなわち、組成物）を、それを必要とする被験体に投与することを含み、前記投与が、前記被験体の血液脳関門を越える前記治療用ペイロードの輸送を促進する、方法。
請求項２． 前記被験体が、哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
請求項３． 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２に記載の方法。
請求項４． 前記ｐ９７ポリペプチドが、長さが最大約３００個のアミノ酸を含み、前記ポリペプチドが、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）または配列番号２～１９のうちのいずれか１つもしくは複数と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
請求項５． 前記ｐ９７ポリペプチドが、配列番号１により定義されるような隣接するＣ末端および／またはＮ末端配列を必要に応じて含む、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）または配列番号２～１９のうちのいずれか１つもしくは複数を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
請求項６． 前記ｐ９７ポリペプチドが、配列番号１により定義されるような任意の介在配列を必要に応じて含む、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）または配列番号２～１９の２、３、４または５個のアミノ酸を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
請求項７． 前記ｐ９７ポリペプチドが、配列番号１３および／または１４の一方または両方を含み、必要に応じて、配列番号１によって定義される隣接するＣ末端および／またはＮ末端配列を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
請求項８． 前記ｐ９７ポリペプチドが、配列番号１３および／または１４の一方または両方を含み、必要に応じて配列番号１によって定義される介在配列を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
請求項９． 前記ｐ９７ポリペプチドが、長さが最大約２５０、２００、１５０、１００、５０、２０、１５または１０個のアミノ酸を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
請求項１０． 前記活性剤が、リンカーを用いて前記ｐ９７ポリペプチドまたはその断片にカップリングされている、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
請求項１１． 前記ポリペプチドまたはその断片が、配列番号１３［ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ］に対応するペプチド、あるいはそれに対して少なくとも約７０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約７５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９９％もしくはそれより高い相同性を有する配列を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
請求項１２． 前記活性剤が、リソソーム常在タンパク質である、請求項１に記載の方法。
請求項１３． 前記活性剤が、細胞成長、細胞生存、細胞修復、および／または炎症をモジュレートすることができる、請求項１に記載の方法。
請求項１４． 前記活性剤が、前記被験体の脳組織における細胞成長、細胞生存、細胞修復、および／または炎症をモジュレートすることができる、請求項１３に記載の方法。
請求項１５． 前記活性剤が、リソソーム機能障害をモジュレートする、予防する、最小限にする、または反転させることができる、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
請求項１６． 前記活性剤が、プログラニュリンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
請求項１７． 前記活性剤が、ヒトプログラニュリンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１６に記載の方法。
請求項１８． 前記活性剤が、組換えプログラニュリン（その活性形態）またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１６または１７に記載の方法。
請求項１９． 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系において産生される、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
請求項２０． 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生される、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
請求項２１． 前記活性剤がグラニュリンである、請求項１に記載の方法。
請求項２２． 前記活性剤が、プログラニュリンの調節因子またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１に記載の方法。
請求項２３． 前記活性剤がソーティングタンパク質である、請求項１に記載の方法。
請求項２４． 前記活性剤が、ソルチリン－１またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１に記載の方法。
請求項２５． 前記活性剤が、ヒトソルチリン－１またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項２４に記載の方法。
請求項２６． 前記活性剤が、組換えソルチリン－１（その活性形態）またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項２４または２５に記載の方法。
請求項２７． 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系において産生される、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
請求項２８． 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生される、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
請求項２９． 前記活性剤が、リソソーム輸送を容易にすることができる、または膜周囲から脂質基質を単離することができる、および／または脂質をリソソームの可溶性分解酵素により近づけることができる薬剤である、請求項１に記載の方法。
請求項３０． 前記活性剤が、プロサポシンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１に記載の方法。
請求項３１． 前記活性剤が、ヒトプロサポシンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項３０に記載の方法。
請求項３２． 前記活性剤が、組換えプロサポシン（その活性形態）またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項３０または３１に記載の方法。
請求項３３． 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系において産生される、請求項３０から３２のいずれかに記載の方法。
請求項３４． 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生される、請求項３０から３２のいずれかに記載の方法。
請求項３５． 前記活性剤が、小分子薬（すなわち、約１０００グラム／モル未満、または約７５０グラム／モル未満、または約５００グラム／モル未満の分子量を一般に有する分子薬）である、請求項１に記載の方法。
請求項３６． 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、行動異常型前頭側頭型認知症（ｂｖＦＴＤ）、原発性進行性失語（ＰＰＡ）［意味型原発性進行性失語（ｓｖＰＰＡ）、非流暢／非文法型原発性進行性失語（ｎｆｖＰＰＡ）を含む］、ならびに関連する前頭側頭型認知症障害［運動ニューロン病を伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤ－ＭＮＤ）、進行性核上性麻痺症候群（ＰＳＰ－Ｓ）、および大脳皮質基底核症候群（ＣＢＳ）を含む］からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
請求項３７． 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、ヒト遺伝子の常染色体変異に関連するまたはそれによって引き起こされる認知症から選択される、請求項１または３６に記載の方法。
請求項３８． 前記変異が、プログラニュリン遺伝子（ＧＲＮ）、微小管結合タンパク質タウ遺伝子（ＭＡＰＴ）、または９番染色体オープンリーディングフレーム７２遺伝子（Ｃ９ｏｒｆ７２）からなる群から選択されるヒト遺伝子の変異である、請求項３７に記載の方法。
請求項３９． 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、プログラニュリンの欠損または不在に関連している、請求項１に記載の方法。
請求項４０． 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、脳におけるプログラニュリンの欠損または不在に関連している、請求項３９に記載の方法。
請求項４１． 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、ＲＮＡ凝集体および／またはジペプチドリピートタンパク質の蓄積に関連している、請求項１に記載の方法。
請求項４２． 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、脳におけるＲＮＡ凝集体および／またはジペプチドリピートタンパク質の蓄積に関連している、請求項４１に記載の方法。
請求項４３． 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、タウの３リピート（３Ｒ－タウ）および／または４リピート（４Ｒ－タウ）アイソフォームを含むニューロンおよびグリア封入体の蓄積に関連している、請求項１に記載の方法。
請求項４４． 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、脳におけるタウの３リピート（３Ｒ－タウ）および／または４リピート（４Ｒ－タウ）アイソフォームを含むニューロンおよびグリア封入体の蓄積に関連している、請求項４３に記載の方法。
請求項４５． 脳におけるＲＮＡ凝集体および／またはジペプチドリピートタンパク質の蓄積を減少させるための、請求項１に記載の方法。
請求項４６． 脳における３Ｒ－タウおよび／または４Ｒ－タウを含むニューロンおよびグリア封入体の形成または蓄積を予防または緩徐化するための、請求項１に記載の方法。
請求項４７． 脳における異常なタンパク質の発現、形成、もしくは蓄積を分解する、減少させる、予防する、および／もしくは緩徐化するための、ならびに／または脳における異常な量の正常なタンパク質の発現、形成、もしくは蓄積を分解する、減少させる、予防する、もしくは緩徐化するための、請求項１に記載の方法。
請求項４８． 前記治療用ペイロード（すなわち、組成物）が、１日に少なくとも約１回、または少なくとも約１日おき、または１週間に少なくとも約２回、または１週間に少なくとも約１回、または２週間おきに少なくとも約１回、または１カ月に少なくとも約１回（または３０日おきに約１回）からなる群から選択されるレジメンに従って投与される、請求項１に記載の方法。
請求項４９． 前記被験体が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）についての少なくとも１つの臨床マーカー、評価または評定の改善を呈し、必要に応じて、前記改善が、前記方法の適用前のベースラインと比較して、少なくとも約５％である、または少なくとも約１０％である、または少なくとも約１５％である、または少なくとも約２０％である、または少なくとも約２５％である、請求項１から４８のいずれかに記載の方法。診断基準の例示的な表に関しては、Rascovsky, K., et al., Sensitivity of revised diagnostic criteria for the behavioural variant of frontotemporal dementia, Brain. 2011; 134(Pt 9):2456-2477. doi:awr179[pii] 10.1093/brain/awr179. [PubMed: 21810890]、およびGorno-Tempini, M.L. et al., Classification of primary progressive aphasia and its variants, Neurology. 2011; 76(11): 1006-1014. [PubMed: 21325651]を参照されたい。
請求項５０． ｐ９７ポリペプチドまたはその断片にカップリングされた前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置に好適な活性剤を含む治療用ペイロードを、それを必要とする被験体に投与することを含む、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を処置する、予防する、改善する、そのリスクを低減する、またはその発症もしくは進行を緩徐化するための医薬の製造における使用のための組成物であって、前記投与が、前記被験体の血液脳関門を越える前記治療用ペイロードの輸送を促進する、組成物。
請求項５１． コンジュゲートｐ９７－活性剤コンジュゲートを形成するように、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置に好適な活性剤にコンジュゲートされたｐ９７またはその断片を含むコンジュゲートであって、前記ｐ９７断片が、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）、あるいはそれに対して少なくとも約７０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約７５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９９％もしくはそれより高い相同性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、コンジュゲート。
請求項５２． 前記ｐ９７断片が、１つまたは複数の末端システインおよび／またはチロシンを有する、請求項５１に記載のコンジュゲート。
請求項５３． 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端チロシンを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
請求項５４． 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端システインを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
請求項５５． 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端チロシンを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
請求項５６． 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端システインを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
請求項５７． 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端チロシンシステインジペプチドを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
請求項５８． 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端チロシンシステインジペプチドを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
請求項５９． コンジュゲートｐ９７－活性剤コンジュゲートを形成するように、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置に好適な活性剤にコンジュゲートされたｐ９７またはその断片を含むコンジュゲートであって、前記ｐ９７断片が、ＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）、あるいはそれに対して少なくとも約７０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約７５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９９％もしくはそれより高い相同性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、コンジュゲート。
請求項６０． 前記ｐ９７断片が、１つまたは複数の末端システインおよび／またはチロシンを有する、請求項５９に記載のコンジュゲート。
請求項６１． 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端チロシンを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
請求項６２． 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端システインを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
請求項６３． 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端チロシンを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
請求項６４． 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端システインを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
請求項６５． 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端チロシンシステインジペプチドを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
請求項６６． 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端チロシンシステインジペプチドを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
請求項６７． 前記活性剤が、リソソーム常在タンパク質である、請求項５１から６６のいずれかに記載のコンジュゲート。
請求項６８． 前記活性剤が、細胞発達、細胞増殖、組織炎症、および／またはリソソーム機能に関与する、請求項６７に記載のコンジュゲート。
請求項６９． 前記活性剤が、前記被験体の脳組織における細胞発達、細胞増殖、組織炎症、および／またはリソソーム機能に関与する、請求項６８に記載のコンジュゲート。
請求項７０． 前記活性剤が、プログラニュリン、ソルチリン－１、プロサポシンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項５１から６９のいずれかに記載のコンジュゲート。
請求項７１． 前記活性剤が、ヒトプログラニュリン、ソルチリン－１、プロサポシンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項７０に記載のコンジュゲート。
請求項７２． 前記活性剤が、組換えプログラニュリン、ソルチリン－１、プロサポシンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項７０または７１に記載のコンジュゲート。
請求項７３． 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系において産生される、請求項７０から７２のいずれかに記載のコンジュゲート。
請求項７４． 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生される、請求項７０から７２のいずれかに記載のコンジュゲート。
請求項７５． 前記活性剤が、ＲＮＡ干渉剤である、請求項５１から６６のいずれかに記載のコンジュゲート。
請求項７６． 前記活性剤が、ＲＮＡ凝集体、ジペプチドリピートタンパク質、またはタウｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の形成を低減する、阻害する、または予防することができる、請求項７５に記載のコンジュゲート。
請求項７７． 前記活性剤が、被験体の脳組織におけるＲＮＡ凝集体、ジペプチドリピートタンパク質、またはタウｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の形成を低減する、阻害する、および／または予防することができる、請求項７６に記載のコンジュゲート。
請求項７８． 前記活性剤が、小分子薬（すなわち、約１０００グラム／モル未満、または約７５０グラム／モル未満、または約５００グラム／モル未満の分子量を一般に有する分子薬）である、請求項５１から７７のいずれかに記載のコンジュゲート。
本発明のこれらおよび他の態様は、本明細書における開示から明らかになる。
発明の詳細な説明
以下の詳細な説明は、当業者が本発明を実施するのを補助するために提供される。当業者であれば、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される実施形態に修正および変更を行うことができる。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。説明に使用されている用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、制限することを意図するものではない。
本出願に使用される場合、別途本明細書に明示的に提供される場合を除き、以下の用語のそれぞれは、以下に記載される意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願全体を通じて記載されている。用語が、本明細書に具体的に定義されていない場合、その用語には、その用語を本発明の説明においてその使用の文脈に適用する当業者により当該技術分野において認識されている意味が与えられる。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、文脈により別途明確に示されない限り、１つまたは１つより多くの（すなわち、少なくとも１つの）その冠詞の文法上の目的物を指す。例として、「１つの要素」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
「約」という用語は、当業者によって決定される、特定の値または組成に対する許容可能な誤差の範囲内である値または組成を意味し、これは、部分的に、その値または組成が、どのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に依存することになる。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従い、１または１より大きい標準偏差の範囲内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、最大１０％または２０％の範囲（すなわち、±１０％または±２０％）を意味し得る。例えば、約３ｍｇは、２．７ｍｇ～３．３ｍｇ（１０％の場合）または２．４ｍｇ～３．６ｍｇ（２０％の場合）の任意の数を含み得る。さらに、特に生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、最大１桁または最大５倍の値を意味し得る。特定の値または組成が、本出願および特許請求の範囲において提供される場合、別途示されない限り、「約」の意味は、その特定の値または組成の許容可能な誤差の範囲内であると想定するものとする。
「投与すること」は、当業者に公知の様々な方法および送達システムのいずれかを使用した、治療剤を含む組成物の被験体への物理的導入を指す。例えば、投与の経路としては、頬内、鼻内、眼、経口、浸透圧、非経口、直腸、舌下、局所、経皮、膣、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、または他の非経口投与経路、例えば、注射または注入によるものを挙げることができる。本明細書で使用される場合、「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の投与様式、通常、注射によるものを意味し、これには、限定することなく、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔が含まれる。投与することはまた、例えば、１回、複数回、および／または１回もしくは複数回の長期間にわたって、実施されてもよく、治療有効用量または治療量以下の用量であり得る。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の両方、ならびにアミノ酸アナログおよび模倣体を意味することが意図される。天然に存在するアミノ酸としては、タンパク質生合成中に用いられる２０個の（Ｌ）－アミノ酸、ならびに例えば４－ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリン、およびオルニチンなどのその他のものが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸としては、例えば、（Ｄ）－アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ－フルオロフェニルアラニン、エチオニンなどが挙げられ、これらは、当業者に公知である。アミノ酸アナログには、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸の改変形態が含まれる。そのような改変としては、例えば、アミノ酸上の化学基および部分の置換もしくは置換え、またはアミノ酸の誘導体化によるものを挙げることができる。アミノ酸模倣体は、例えば、参照アミノ酸に特徴的な電荷および電荷間隔など、機能的に類似する特性を呈する有機構造体を含む。例えば、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）を模倣する有機構造体は、天然に存在するＡｒｇアミノ酸に類似の分子空間に位置し、その側鎖のアミノ基と同じ程度の可撓性を有する、正電荷部分を有するであろう。模倣体には、アミノ酸またはアミノ酸官能基の最適な間隔および電荷の相互作用を維持するように拘束された構造体も含まれる。当業者であれば、どの構造体が、機能的に同等なアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を構成するのかを認識しているかまたは決定することができる。
本明細書全体を通じて、文脈によりそうでないことが求められない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、示されたステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の包含を意味するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。「からなる」とは、「からなる」という語句が続くものがすべて含まれ、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が、必要とされるかまたは必須であること、および存在し得る他の要素がないことを示す。「から本質的になる」とは、この語句の前に列挙されるすべての要素を含み、列挙された要素に対し、本開示で指定された活性または作用に干渉も妨害もしない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙された要素が、必要とされるかまたは必須であるが、他の要素は、必要に応じたものであり、それらが列挙された要素の活性または作用に物質的に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在し得る場合も存在し得ない場合もあることを示す。
「コンジュゲート」という用語は、薬剤または他の分子、例えば、生物学的に活性な分子の、ｐ９７ポリペプチドへの共有結合的または非共有結合的な結合または連結の結果として形成される実体を指すことが意図される。コンジュゲートポリペプチドの１つの例は、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」であり、これは、もともとは別個のポリペプチドをコードしていた２つまたはそれより多くのコード配列の接続によって作られるポリペプチドであり、結合されたコード配列の翻訳により、典型的に別個のポリペプチドのそれぞれに由来する機能的特性を有する単一の融合ポリペプチドが生じる。
本明細書で使用される場合、「機能」および「機能的」などの用語は、生物学的、酵素的、または治療的機能を指す。
「相同性」は、同一であるか、または保存的置換を構成する、アミノ酸のパーセンテージ数を指す。相同性は、配列比較プログラム、例えば、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １２， ３８７－３９５， １９８４）を使用して決定することができ、これは、参照により本明細書に組み込まれる。このようにして、本明細書に記載されるものに類似または実質的に異なる長さの配列を、アライメントへのギャップの挿入によって比較することができ、そのようなギャップは、例えば、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって決定される。
「単離された」とは、通常はその天然の状態で付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を意味する。例えば、「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、ペプチドまたはポリペプチド分子のその天然の細胞環境から、および細胞の他の成分との関係からのｉｎ ｖｉｔｒｏでの単離および／または精製を含み、すなわち、それは、ｉｎ ｖｉｖｏの物質とは有意に関係していない。
「連結」、「リンカー」、「リンカー部分」、または「Ｌ」という用語は、ｐ９７ポリペプチド断片を、目的の薬剤から分離するため、または例えば、ここで、２つもしくはそれより多くの薬剤が連結されてｐ９７コンジュゲートを形成している場合に、第１の薬剤を別の薬剤から分離するために使用することができる、リンカーを指す。リンカーは、生理学的に安定であり得るか、または放出可能なリンカー、例えば、酵素的に分解可能なリンカー（例えば、タンパク質分解により切断可能なリンカー）を含み得る。ある特定の態様では、リンカーは、ペプチドリンカーであり得、例えば、ｐ９７融合タンパク質の一部であり得る。一部の態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーまたは非タンパク質性リンカーであり得る。一部の態様では、リンカーは、粒子、例えば、ナノ粒子であり得る。
「モジュレートする」および「変更する」という用語は、典型的に、対照と比べて統計学的に有意または生理学的に有意な量または程度で、「増加させる」、「増強する」、または「刺激する」、ならびに「減少させる」または「低減させる」ことを含む。「増加した」、「刺激される」、または「増強される」量は、典型的に、「統計学的に有意な」量であり、これには、組成物なしで（例えば、本発明のコンジュゲートのポリペプチドの不在）または対照組成物、試料、もしくは試験被験体によって産生される量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれより大きい（例えば、５００倍、１０００倍）（それらの間にあるすべての整数および１を上回るすべての小数値、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）増加が含まれ得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的に、「統計学的に有意な」量であり、これには、組成物なしでまたは対照組成物によって産生される量の、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少が、それらの間のすべての整数を含めて、含まれ得る。１つの非限定的な例として、対照は、活性、例えば、薬剤単独と比べた、ｐ９７－薬剤コンジュゲートの血液脳関門を越える輸送／送達の量または速度、中枢神経系組織への分布の速度および／またはレベル、ならびに／あるいは血漿、中枢神経系組織、または任意の他の全身もしくは末梢非中枢神経系組織のＣｍａｘを比較することができる。比較および「統計学的に有意な」量の他の例は、本明細書に記載される。
ある特定の実施形態では、組成物中の任意の所与の薬剤（例えば、ｐ９７コンジュゲート、例えば、融合タンパク質）の「純度」は、具体的に定義され得る。例えば、ある特定の組成物は、例えば、決して限定することなく、化合物を分離、特定、および定量するために生物化学および分析化学において頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーの周知の形態である高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した場合に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（間にあるすべての小数値を含む）純粋である薬剤を含み得る。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマー、ならびにそのバリアントおよび合成アナログを指して互換可能に使用される。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、天然に存在しない合成のアミノ酸、例えば、天然に存在する対応するアミノ酸の化学的アナログである、アミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書に記載されるポリペプチドは、具体的な長さの産物に限定されず、したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に含まれ、そのような用語は、別途具体的に示されない限り、本明細書において互換可能に使用され得る。本明細書に記載されるポリペプチドはまた、発現後の改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該技術分野において公知の他の改変、天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方を、含み得る。ポリペプチドは、タンパク質全体、またはその部分配列、断片、バリアント、もしくは誘導体であり得る。
「生理学的に切断可能」または「加水分解可能」または「分解可能」な結合は、生理学的条件下において、水と反応する（すなわち、加水分解される）結合である。結合が水中で加水分解する傾向は、２つの中心原子を接続している連結の一般的な種類だけでなく、これらの中心原子に結合している置換基にも依存するであろう。適切な加水分解的に不安定または弱い連結としては、これらに限定されないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステル、カーボネート、およびヒドラゾン、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドが挙げられる。
「放出可能なリンカー」としては、これらに限定されないが、生理学的に切断可能なリンカーおよび酵素的に分解可能なリンカーが挙げられる。したがって、「放出可能なリンカー」は、生理学的条件下において、自発的加水分解または何らかの他の機序による切断（例えば、酵素に触媒される、酸に触媒される、塩基に触媒されるなど）のいずれかを受け得るリンカーである。例えば、「放出可能なリンカー」は、駆動力として、プロトン（例えば、イオン化可能な水素原子、Ｈａ）の塩基の引き抜き（ｂａｓｅ ａｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ）を有する脱離反応を含み得る。本明細書の目的で、「放出可能なリンカー」は、「分解可能なリンカー」と同義である。「酵素的に分解可能な連結」は、連結、例えば、１つまたは複数の酵素、例えば、ペプチダーゼまたはプロテアーゼによる分解の対象となるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、放出可能なリンカーは、ｐＨ７．４、２５℃、例えば、生理学的ｐＨ、ヒトの体温（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ）において、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、または約９６時間、またはそれよりも短い半減期を有する。
「参照配列」という用語は、一般に、核酸コード配列、またはアミノ酸配列を指し、それに対して、別の配列が比較される。本明細書に記載されるすべてのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、名称で記載されるものならびに表および配列表に記載されるものを含め、参照配列として含まれる。
「リソソーム常在タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、それがリソソーム内で産生されるか、リソソーム外で産生されて、リソソーム内に輸送または分泌されるかによらず、リソソーム内に局在するタンパク質を意味する。
「配列同一性」または例えば「５０％同一な配列」を含む用語は、本明細書で使用される場合、配列が、比較ウインドウにわたって、ヌクレオチドごとの基準またはアミノ酸ごとの基準で、同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアライメントされた配列を、比較ウインドウにわたって比較し、同一な核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一なアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列に生じる位置の数を決定して、一致する位置の数を得、一致する位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除し、この結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算することができる。本明細書に記載される参照配列（例えば、配列表を参照されたい）のうちのいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、典型的には、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する。
２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列関係を説明するために使用される用語としては、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、長さが、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含め、少なくとも１２個であるが、高頻度で１５～１８個であり、多くの場合に少なくとも２５個のモノマー単位である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれが、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似である配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含むため、２つ（またはそれより多くの）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に、２つのポリヌクレオチドの配列を、「比較ウインドウ」にわたって比較して、局所的な配列類似性領域を特定し、比較することによって行われる。「比較ウインドウ」は、少なくとも６つ、通例的には約５０～約１００個、より通例的には約１００～約１５０個の連続した位置の概念的セグメントを指し、このセグメントにおいて、ある配列が、同じ連続する位置数の参照配列に対して、２つの配列を最適にアライメントした後に比較される。比較ウインドウは、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウをアライメントするのに最適な配列アライメントは、コンピューターによるアルゴリズムの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージリリース７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または選択された様々な方法のいずれかによって生成される探索および最良のアライメント（すなわち、比較ウインドウにわたってもっとも高いパーセンテージの相同性をもたらすもの）によって行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９， １９９７によって開示されるように、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムへの参照もなされ得る。配列分析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，” Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ， １９９４－１９９８， Ｃｈａｐｔｅｒ １５のユニット１９．３に見出すことができる。
「統計学的に有意な」とは、結果が、偶然によって生じる可能性が低かったことを意味する。統計学的有意性は、当該技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。一般的に使用される有意性の尺度としては、ｐ値が挙げられ、これは、帰無仮説が正しい場合に観察された事象が生じる頻度または確率である。得られたｐ値が、有意性レベルよりも小さい場合、帰無仮説は拒絶される。単純な事例では、有意性レベルは、０．０５またはそれ未満のｐ値で定義される。
「溶解度」という用語は、ｐ９７ポリペプチド断片またはコンジュゲートが、液体溶媒中に溶解され、均質な溶液を形成する特性を指す。溶解度は、典型的に、濃度として、溶媒の単位体積当たりの溶質の質量（溶媒１ｋｇ当たりの溶質のｇ数、１ｄＬ（１００ｍｌ）当たりのｇ数、ｍｇ／ｍｌなど）、容積モル濃度、重量モル濃度、モル分率、または他の類似の濃度に関する記述のいずれかによって、表される。溶媒の量当たりの溶解し得る溶質の最大平衡量は、溶媒の温度、圧力、ｐＨ、および性質を含む、指定された条件下における、その溶媒中へのその溶質の溶解度である。ある特定の実施形態では、溶解度は、生理学的ｐＨにおいて、または他のｐＨ、例えば、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、もしくはｐＨ７．４において測定される。ある特定の実施形態では、溶解度は、水中または生理緩衝液、例えば、ＰＢＳまたはＮａＣｌ（ＮａＰありまたはなし）において測定される。具体的な実施形態では、溶解度は、比較的低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）および比較的高い塩（例えば、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＮａＰ）において測定される。ある特定の実施形態では、溶解度は、生物学的流体（溶媒）、例えば、血液または血清において測定される。ある特定の実施形態では、温度は、およそ室温（例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５℃）またはおよそ体温（約３７℃）であり得る。ある特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドまたはコンジュゲートは、室温または約３７℃において、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する。
「被験体」には、本明細書で使用される場合、本発明のｐ９７コンジュゲートで処置または診断することができる症状を呈するか、または症状を呈するリスクがある、動物が含まれる。好適な被験体（患者）には、研究室動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、もしくはモルモット）、家畜動物、および飼育動物または愛玩動物（例えば、ネコもしくはイヌ）が含まれる。非ヒト霊長類および、好ましくはヒト患者が、含まれる。
「実質的に」または「本質的に」とは、ほぼ全体的または完全にを意味し、例えば、なんらかの所与の数量の９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも上を意味する。
「実質的に含まない」とは、所与の数量のほぼ完全な不在または完全な不在を指し、例えば、なんらかの所与の数量の約１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、またはそれを下回ることを指す。例えば、ある特定の組成物は、細胞タンパク質、膜、核酸、内毒素、または他の夾雑物を「実質的に含まない」場合がある。
「処置」または「処置すること」は、本明細書で使用される場合、疾患または状態の症状または病理に対する任意の望ましい効果を含み、処置されている疾患または状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーにおける最小限の変化または改善すらも含み得る。「処置」または「処置すること」は、必ずしも、疾患もしくは状態またはその関連症状の完全な根絶または治癒を示すわけではない。この処置を受けている被験体は、それを必要とする任意の被験体である。臨床上の改善の例示的なマーカーは、当業者には明らかであろう。さらに、用語処置はまた、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を予防すること、改善すること、そのリスクを低減すること、またはその発症もしくは進行を緩徐化することを包含し得る。
「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、集団においてもっとも高頻度に観察されるものであり、したがって、遺伝子の「通常」または「野生型」形態と任意に設計される。
前頭側頭型認知症
上記のように、前頭側頭型認知症は、脳の前頭葉および側頭葉に主に影響を及ぼすまれな脳障害を記載するために使用される一般的用語である。
ＦＴＤは、２つの中心的な臨床上のバリアント、すなわち行動異常型ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）および原発性進行性失語（ＰＰＡ）に分類され、ＦＴＤスペクトラム内の他の障害は関連するＦＴＤ症候群として分類される。
ＢｖＦＴＤは、行動、人格、脱抑制、および実行制御の顕著な初期の変化を伴い、その多くは、多くの場合精神病と誤診されている。Woolley JD, Khan BK, Murthy NK, Miller BL, Rankin KP. The diagnostic challenge of psychiatric symptoms in neurodegenerative disease: rates of and risk factors for prior psychiatric diagnosis in patients with early neurodegenerative disease. J Clin Psychiatry. 2011; 72(2):126-133. DOI: 10.4088/JCP.10m06382oli [PubMed: 21382304]を参照されたい。行動学的症状は、脳の傍辺縁領域の機能障害と相関し、フォンエコノモニューロン（ＶＥＮ）は、ｂｖＦＴＤでは選択的に脆弱であることが見られるが、アルツハイマー病（ＡＤ）では脆弱ではない。Seeley WW, Crawford R, Rascovsky K, Kramer JH, Weiner M, Miller BL, Gorno-Tempini ML. Frontal paralimbic network atrophy in very mild behavioral variant frontotemporal dementia. Arch Neurol. 2008; 65(2):249-255. [PubMed: 18268196]、およびSeeley WW, Menon V, Schatzberg AF, Keller J, Glover GH, Kenna H, Greicius MD. Dissociable intrinsic connectivity networks for salience processing and executive control. J Neurosci. 2007; 27(9):2349-2356. [PubMed: 17329432]を参照されたい。
行動学的症状とは別に、構造的ニューロイメージング（ＭＲＩまたはＣＴ）またはＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴでの代謝低下もまた、ｂｖＦＴＤにおける側頭および／または前側頭葉萎縮に関する有用な診断ツールであった。ＰＰＡは、言語障害が疾患の初期相の主な症状である神経変性症候群を包含する。Rascovsky K, Hodges JR, Knopman D, Mendez MF, Kramer JH, Neuhaus J, Miller BL. Sensitivity of revised diagnostic criteria for the behavioural variant of frontotemporal dementia. Brain. 2011; 134(Pt 9):2456-2477. doi:awr179 [pii] 10.1093/brain/awr179. [PubMed: 21810890]を参照されたい。言語障害の主な基礎となる原因は、大部分がＦＴＤに関連しているが、ＡＤにも関連し得る。Bang J, Spina S, Miller BL. Frontotemporal dementia. Lancet. 2015;386(10004):1672-1682. doi:10.1016/S0140-6736(15)00461-4を参照されたい。
ＰＰＡは、意味型原発性進行性失語（ｓｖＰＰＡ）および非流暢／非文法型原発性進行性失語（ｎｆｖＰＰＡ）にさらに分類することができる。ｓｖＰＰＡは、意味性の知識および名前付けに関連する進行性障害であるが、ｎｆｖＰＰＡは、言葉の発出、文法、および会話の進行性の欠損に関連する。
ｓｖＰＰＡはそれぞれ、主に言語に基づくまたは行動に基づく症状をもたらす左側頭葉または右側頭葉に罹患し得る。しかし、時間が経つにつれて、疾患は両方の側頭葉へと広がることがあり、症状の重複が観察される。Seeley WW, Bauer AM, Miller BL, Gorno-Tempini ML, Kramer JH, Weiner M, Rosen HJ. The natural history of temporal variant frontotemporal dementia. Neurology. 2005; 64(8):1384-1390. DOI: 10.1212/01.WNL.0000158425.46019.5C [PubMed: 15851728]. Neuroimaging has been useful in diagnosing svPPA, as early symptoms originate from anterior and inferior temporal lobes, while later symptoms are associated with contralateral temporal lobes, ventromedial frontal cortex and insula.を参照されたい。Rohrer JD, Rosen HJ. Neuroimaging in frontotemporal dementia. Int Rev Psychiatry. 2013; 25(2):221-229. DOI: 10.3109/09540261.2013.778822 [PubMed: 23611351]、およびSeeley WW, Bauer AM, Miller BL, Gorno-Tempini ML, Kramer JH, Weiner M, Rosen HJ. The natural history of temporal variant frontotemporal dementia. Neurology. 2005; 64(8):1384-1390. DOI: 10.1212/01.WNL.0000158425.46019.5C [PubMed: 15851728]を参照されたい。
ｎｆｖＰＰＡの初期発生は、脳の左下前頭回におけるブローカ領域および前島を伴う。Gorno-Tempini ML, Dronkers NF, Rankin KP, Ogar JM, Phengrasamy L, Rosen HJ, Miller BL, Cognition and anatomy in three variants of primary progressive aphasia. Ann Neurol. 2004; 55(3):335-346. [PubMed: 14991811]、およびGorno-Tempini ML, Ogar JM, Brambati SM, Wang P, Jeong JH, Rankin KP, Miller BL. Anatomical correlates of early mutism in progressive nonfluent aphasia. Neurology. 2006; 67(10):1849-1851. DOI: 10.1212/01.wnl.0000237038.55627.5b [PubMed: 16931509]を参照されたい。言葉の発出の低減は、疾患の進行と共に増加し、最終的に言語能力が完全に失われ、これは病変が疾患の初期発生に関与する領域を超える領域に拡大することと相関する。左下前頭回およびブローカ領域におけるＭＲＩでの萎縮またはＰＥＴ／ＳＰＥＣＴでの代謝低下は、多くの場合ｎｆｖＰＰＡ診断のための有用なニューロイメージングの裏付けとなる。
関連するＦＴＤ症候群は、主にＦＴＤ－ＭＮＤ、ＰＳＰ－Ｓ、およびＣＢＳである。運動ニューロン疾患を伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤ－ＭＮＤ）は、ＦＴＤの認知症状と、ＭＮＤの運動機能障害との間に遺伝的、臨床的、および病理的な重複を表し、ＦＴＤ患者の最大１５％およびＭＮＤ患者の最大３０％が、重複する症候群を示す。Lomen-Hoerth C. Clinical phenomenology and neuroimaging correlates in ALS-FTD. J Mol Neurosci. 2011; 45(3):656-662. DOI: 10.1007/s12031-011-9636-x [PubMed: 21971978]を参照されたい。
タウ、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）およびｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ（ＦＵＳ）の発現の変動は、ＦＴＤ－ＭＮＤを引き起こすことが暗示されている。ＴＤＰ－４３コード遺伝子（ＴＡＲＤＢＰ）およびＦＵＳ遺伝子の変異は、ＦＴＤ－ＭＮＤの症例において共有される遺伝的重複として見られている。James R. Burrell, Matthew C. Kiernan, Steve Vucic, John R. Hodges, Motor Neuron dysfunction in frontotemporal dementia, Brain, Volume 134, Issue 9, September 2011, Pages 2582-2594, https://doi.org/10.1093/brain/awr195を参照されたい。
進行性核上性麻痺症候群（ＰＳＰ－Ｓ）は、無動および強直、ならびに垂直性核上性注視麻痺を特徴とする。症候群は、小脳、脳幹、大脳基底核における神経細胞の喪失、神経原線維変化、および皮質より脳幹により多くの４Ｒタウ封入体が存在することを含む。ニューロイメージングでの中脳の萎縮およびハミングバード徴候は、ＰＳＰとつながりがあるが、明確なバイオマーカーは同定されていない。Litvan I, Agid Y, Calne D, et al. Clinical research criteria for the diagnosis of progressive supranuclear palsy (Steele-Richardson-Olszewski syndrome): report of the NINDS-SPSP international workshop. Neurology 1996;47:1-9; Chambers CB, Lee JM, Troncoso JC, Reich S, Muma NA. Overexpression of four-repeat tau mRNA isoforms in progressive supranuclear palsy but not in Alzheimer's disease. Ann Neurol. 1999; 46(3):325-332. [PubMed: 10482263]; Lee VM, Goedert M, Trojanowski JQ. Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev Neurosci. 2001; 24:1121-1159. DOI: 10.1146/annurev.neuro.24.1.1121 [PubMed: 11520930];およびKim YE, Kang SY, Ma HI, Ju YS, Kim YJ. A Visual Rating Scale for the Hummingbird Sign with Adjustable Diagnostic Validity. J Parkinsons Dis. 2015; 5(3):605-612. DOI: 10.3233/JPD-150537 [PubMed: 26406141]を参照されたい。
大脳皮質基底核症候群（ＣＢＳ）は、運動制御にとって必須である脳の大脳皮質領域および大脳基底核における神経細胞が次第に失われることによって引き起こされる非対称性の無動および強直を特徴とする。臨床では、ＰＳＰ病態との有意な重複が暗示されており、ＣＢＳ診断の５０％より多くがＰＳＰ病態を有した。Wadia PM, Lang AE. The many faces of corticobasal degeneration, Parkinsonism Relat Disord. 2007; 13(Suppl 3):S336-340. DOI: 10.1016/S1353-8020(08)70027-0 [PubMed: 18267261]を参照されたい。現在、病態の予測に利用可能であるバイオマーカーはなく、ＣＢＳを、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの他の類似の神経変性疾患と区別するために信頼できるのはなおも、ニューロイメージングである。
ＦＴＤの遺伝性の大部分は、プログラニュリン遺伝子（ＧＲＮ）、微小管結合タンパク質タウ遺伝子（ＭＡＰＴ）、または９番染色体オープンリーディングフレーム７２遺伝子（Ｃ９ｏｒｆ７２）の常染色体優性変異による。各変異は、ＦＴＤ症例全体の５％～１０％を占める。Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子は、世界中で遺伝性ＦＴＤの最も一般的な原因であると暗示されており、この後にＧＲＮおよびＭＡＰＴが続く。Greaves CV, Rohrer JD. An update on genetic frontotemporal dementia. J Neurol. 2019;266(8):2075-2086. doi:10.1007/s00415-019-09363-4を参照されたい。
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子におけるヘキサヌクレオチドＧＧＧＧＣＣリピートの病的な伸長が、世界中でＦＴＤおよび筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の最も一般的な遺伝的原因であることが暗示されている。健康な個体はリピートの２～２０個のコピーを有するが、ＦＴＤおよびＡＬＳ患者は、リピートの１００～数千コピーを有することが見られた。ハプロ不全および／またはＲＮＡ媒介毒性が、疾患の全体的な発病に対するＣ９ｏｒｆ７２変異の関与因子であることが暗示されている。ハプロ不全は、患者におけるＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡの低減によって裏付けられるが、核におけるＲＮＡ凝集体（リピートを含む転写物によって形成される安定な構造）の蓄積および細胞質におけるジペプチドリピートタンパク質（ポリ（ＧＡ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＰＡ）、およびポリ（ＰＲ））の蓄積は、変異の結果としての毒性の獲得によるものであった。４３ｋＤａのｔｒａｎｓａｃｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ－４３；ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質によってコードされる）、Ｐ６２、およびユビキチンの細胞質での凝集もまた、毒性の獲得に関連する病態によるものであった。ＲＮＡｉ戦略を介したＲＮＡ凝集体およびジペプチドリピートタンパク質の低減は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子転写物のサイレンシングを標的とすることによって可能性を示している。
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プログラニュリンは、高度に保存された分泌タンパク質であり、体全体を通して多数の細胞型において発現され、顕著な発現が脳における成熟ニューロンおよびミクログリアに見られる。これは、細胞成長、修復、生存、および炎症の調節に関与し、主な役割はリソソームの機能およびＣＮＳにおけるミクログリア応答である。ＧＲＮ遺伝子変異により生じるプログラニュリンのハプロ不全は、ＦＴＤの最も一般的な原因の１つである。今日まで、７０を超える異なる病原性ＧＲＮ変異が報告されており、これらはハプロ不全または機能的ヌル対立遺伝子をもたらす。Townley RA, Boeve BF, Benarroch EE. Progranulin: Functions and neurologic correlations [published correction appears in Neurology. 2018 Jun 12;90(24):1127]. Neurology. 2018;90(3):118-125. doi:10.1212/WNL.0000000000004840; Huang, M. (2020), Network Analysis of the Brain Proteome of Grn Knockout Mice Reveals Pathogenic Mechanisms Shared in Human Frontotemporal dementia caused by GRN mutations. The FASEB Journal, 34: 1-1. doi:10.1096/fasebj.2020.34.s1.02374;およびPottier, C., Ravenscroft, T.A., Sanchez-Contreras, M. and Rademakers, R. (2016), Genetics of FTLD : overview and what else we can expect from genetic studies. J. Neurochem., 138: 32-53. doi:10.1111/jnc.13622を参照されたい。
ソルチリン、すなわちソルチリン－１およびプロサポシンは、内因性のプログラニュリンレベルおよびリソソーム輸送の重要な調節因子として暗示されているが、前臨床試験で外因性のプログラニュリンを補充すると、神経保護に成功したことが実証され、プログラニュリンを欠如するニューロンにおける神経突起の分岐および伸長を救出することができる。Laird A. S., Van Hoecke A., De Muynck L., Timmers M., Van den Bosch L., Van Damme P. and Robberecht W. (2010) Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy. PLoS ONE 5, e13368を参照されたい。ボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ；Ｍｅｒｃｋ）は、ＧＲＮ転写に正の影響を及ぼすことが示されているが、液胞ＡＴＰアーゼ阻害剤（バフィロマイシンＡ１、コンカナマイシンＡ、アルカゾリドＢ、およびアピクラレンＡ）および臨床で承認された酸中和剤（クロロキン、ベプリジル、およびアミオダロン）はそれぞれ、細胞内／分泌されたプログラニュリンを増加および刺激することが示されている。Cenik B., Sephton C. F., Dewey C. M. et al. (2011) Suberoylanilide hydroxamic acid (vorinostat) up-regulates progranulin transcription: rational therapeutic approach to frontotemporal dementia. J. Biol. Chem. 286, 16101- 16108. and Capell A, Liebscher S, Fellerer K, et al. Rescue of progranulin deficiency associated with frontotemporal lobar degeneration by alkalizing reagents and inhibition of vacuolar ATPase. J Neurosci. 2011;31(5):1885-1894. doi:10.1523/JNEUROSCI.5757-10.2011を参照されたい。
微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子変異は、今日まで同定された６０個を超えるＭＡＰＴ変異を包含し、主な臨床特性は、行動の変化および／またはパーキンソニズムである。Greaves, C.V., Rohrer, J.D. An update on genetic frontotemporal dementia. J Neurol 266, 2075-2086 (2019). https://doi.org/10.1007/s00415-019-09363-4を参照されたい。変異に応じて、一部の保因者はピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性、グリア細胞球状封入体タウオパチー、またはアルツハイマー病として診断され得る。Thal DR, von Arnim CA, Griffin WS, et al. Frontotemporal lobar degeneration FTLD-tau: preclinical lesions, vascular, and Alzheimer-related co-pathologies. J Neural Transm (Vienna). 2015;122(7):1007-1018. doi:10.1007/s00702-014-1360-6を参照されたい。病理学的には、タウの３リピートおよび／または４リピートアイソフォームを含むニューロンおよびグリア封入体が、死後の脳に見られており、エクソン１０のスプライシング調節および／またはタウタンパク質機能に影響を及ぼすＭＡＰＴ変異から生じることが提唱されている。Ghetti, B., Oblak, A.L., Boeve, B.F., Johnson, K.A., Dickerson, B.C. and Goedert, M. (2015), MAPT mutations and FTD. Neuropathol Appl Neurobiol, 41: 24-46. doi:10.1111/nan.12213を参照されたい。タウ凝集の阻害、微小管安定化を標的とする治療アプローチ、およびアンチセンス療法は、ＭＡＰＴ変異にとって有望であることを示している。Wischik CM, Harrington CR, Storey JM. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease. Biochem Pharmacol. 2014;88(4):529-539. doi:10.1016/j.bcp.2013.12.008、およびDeVos SL, Miller RL, Schoch KM, et al. Tau reduction prevents neuronal loss and reverses pathological tau deposition and seeding in mice with tauopathy. Sci Transl Med. 2017;9(374):eaag0481. doi:10.1126/scitranslmed.aag0481を参照されたい。
ｐ９７ポリペプチド配列およびそのコンジュゲート
本発明の組成物および方法は、ｐ９７またはその断片のコンジュゲートを含む。本明細書において有用なｐ９７タンパク質および断片は、２００３年７月３日に公開されたＳｔａｒｒらへのＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００３／０５７１７９号、２０１０年３月２３日に発行されたＳｔａｒｒらへの米国特許第８，５４６，３１９号、２０１４年１０月２日に公開されたＶｉｔａｌｉｓらへのＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１４／１６０４３８号、２０１６年６月１４日に発行されたＶｉｔａｌｉｓらへの米国特許第９，３６４，５６７号、２０１６年５月１２日に発行されたＶｉｔａｌｉｓらへの米国特許第９，９９３，５３０号、および２０１９年１２月５日に公開されたＴｉａｎらへのＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１９／２３１７２５号に記載されており、これらは、すべて、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態は、概して、ｐ９７のポリペプチド断片、特にヒトｐ９７（メラノトランスフェリン、ＭＴｆ、配列番号１）のポリペプチド断片、そのような断片を含む組成物、およびそのコンジュゲートに関する。ある特定の事例では、本明細書に記載されるｐ９７ポリペプチド断片は、輸送活性を有する、すなわち、それらは、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送することができる。特定の実施形態では、ｐ９７断片は、目的の薬剤、例えば、治療剤、診断剤、または検出可能な薬剤に共有結合的に、非共有結合的に、または作動可能にカップリングされて、ｐ９７－薬剤コンジュゲートを形成する。薬剤の具体的な例としては、本明細書に記載され当該技術分野において公知である他の薬剤の中でもとりわけ、小分子およびポリペプチド、例えば、抗体が挙げられる。例示的なｐ９７ポリペ
プチド配列および薬剤は、以下に記載されている。また、ｐ９７ポリペプチドを目的の薬剤にカップリングさせるための例示的な方法および成分、例えば、リンカー基も記載されている。
ｐ９７配列：一部の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドは、配列番号１３（ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ）において特定されるヒトｐ９７断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
以下により詳細に記載される他の具体的な実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、その長さにわたって、配列番号１３に記載されるヒトｐ９７配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性または相同性を有する配列を含む。
特定の実施形態では、ｐ９７断片またはそのバリアントは、ＢＢＢを越え、必要に応じて、ＢＢＢを越えて中枢神経系へ目的の薬剤を輸送する能力を有する。ある特定の実施形態では、ｐ９７断片またはそのバリアントは、ｐ９７受容体、ＬＲＰｌ受容体、および／またはＬＲＰｌＢ受容体に特異的に結合することができる。
一部の実施形態では、ｐ９７断片は、１つまたは複数の末端（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端）システインおよび／またはチロシンを有し、これらは、それぞれ、コンジュゲーションおよびヨウ素化のために付加され得る。一部の実施形態では、チロシンシステインジペプチドを使用することができる。
例えば本明細書に記載の態様の一部または全部を含めた本発明のある特定の態様では、ｐ９７断片ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）をｐ９７断片ＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）で置き換えることができる。
表１は、本発明において有用な全長ヒトｐ９７（配列番号１）およびその断片（配列番号２～１８）ならびに例示的なラット／マウス断片（配列番号１９）についての配列番号１～１９を提供する。
Figure 2023530159000001
Figure 2023530159000002
Figure 2023530159000003
Figure 2023530159000004
ｐ９７カップリング：上述のように、ある特定の実施形態は、融合またはコンジュゲーションによって、目的の薬剤、例えば、小分子、ポリペプチド（例えば、ペプチド、抗体）、ペプチド模倣体、ペプトイド、アプタマー、検出可能な実体、またはこれらの任意の組合せにカップリングされたｐ９７ポリペプチドを含む。また、１つより多くの目的の薬剤を含むコンジュゲート、例えば、抗体および小分子にコンジュゲートされたｐ９７断片も含まれる。
共有結合的連結が好ましいが、しかしながら、比較的強力な非共有結合的タンパク質－リガンド相互作用、例えば、ビオチンとアビジンとの間の相互作用を用いるものを含め、非共有結合的連結もまた、利用することができる。ｐ９７断片の薬剤との融合が、特に好ましい。必ずしもｐ９７断片と目的の薬剤との間の直接的な共有結合的または非共有結合的相互作用を必要としない、作動可能な連結も含まれ、そのような連結の例としては、ｐ９７ポリペプチドおよび目的の薬剤を含むリポソーム混合物が挙げられる。タンパク質コンジュゲートを生成する例示的な方法は、本明細書に記載されており、他の方法は、当該技術分野において周知である。
小分子：特定の実施形態では、ｐ９７断片は、小分子にコンジュゲートされる。「小分子」は、合成起源または生物学的起源（生体分子）であるが、典型的にはポリマーでない、有機化合物を指す。有機化合物は、分子が炭素を含む、大きなクラスの化学的化合物を指し、典型的に、カーボネートのみを含むもの、炭素の単純な酸化物、またはシアン化物は除外される。「生体分子」は、一般に、生きた生物によって産生される有機分子を指し、大きなポリマー分子（バイオポリマー）、例えば、ペプチド、多糖類、および核酸、ならびに小分子、例えば、一次二次代謝産物、脂質、リン脂質、糖脂質、ステロール、グリセロ脂質、ビタミン、およびホルモンが含まれる。「ポリマー」は、一般に、典型的には共有結合的化学結合によって接続される反復的構造単位から構成される大きな分子または巨大分子を指す。
ある特定の実施形態では、小分子は、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、５００、６５０、６００、７５０、７００、８５０、８００、９５０、１０００、または２０００ダルトンを含め、約１０００～２０００ダルトン未満の、典型的には、約３００～７００ダルトンの分子量を有する。
ある特定の小分子は、抗体に関して記載される（後述）「特異的結合」の特徴を有し得る。例えば、小分子は、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、または５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）で、本明細書に記載される標的に特異的に結合し得る。ある特定の実施形態では、小分子は、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質に特異的に結合する。
ポリペプチド剤：特定の実施形態では、目的の薬剤は、ペプチドもしくはポリペプチド、またはそれらの断片である。「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換可能に使用されるが、しかしながら、ある特定の事例では、「ペプチド」という用語は、より短いポリペプチド、例えば、間のすべての整数および範囲（例えば、５～１０個、８～１２個、１０～１５個）を含め、約２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個のアミノ酸からなるポリペプチドを指し得る。ポリペプチドおよびペプチドは、本明細書に記載されるように、天然に存在するアミノ酸および／または天然に存在しないアミノ酸から構成され得る。抗体もまた、ポリペプチドとして含まれる。これらのペプチド、ポリペプチドまたは抗原の断片または一部分は、本発明の範囲内として企図される。
例示的なポリペプチド剤としては、前頭側頭型認知症に関連するポリペプチドが挙げられる。そのようなポリペプチドの例としては、プログラニュリン、グラニュリン、グラニュリンペプチドＡ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ、ソルチリン、ソルチリン－１、プロサポシン、サポシン、サポシンＡ／Ｂ／Ｃ／Ｄ、ＧＭ２ガングリオシド活性化剤、スフィンゴ脂質活性化タンパク質３、ジペプチドリピートタンパク質、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、バフィロマイシン、バフィロマイシンＡ１、コンカナマイシン、コンカナマイシンＡ、アルカゾリド、アルカゾリドＢ、アピクラレン、アピクラレンＡ、クロロキン、ベプリジル、アミオダロン、１－［２－（２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－メチルフェノキシ）－エチル］－３－メチルピペリジン、ニューロテンシン（neuroteinsin）、ＰＧＲＮ５８８－５９３ペプチド、チアメト－Ｇ、ヒストンデアセチラーゼ（histone deacetylas）が挙げられる。
例示的なポリペプチド剤としては、リソソーム蓄積障害に関連するポリペプチドが挙げられる。そのようなポリペプチドの例としては、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイン輸送体、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、α－ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、α－Ｌ－フコシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２－ガングリオシドアクチベーター（ＧＭ２Ａ）、マンノシダーゼ、α－Ｄ－マンノシダーゼ、β－Ｄ－マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ ホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼγサブユニット、Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ヘパラン－Ｎ－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、ガラクトース６－スルファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、スルファターゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、カテプシンＡ、カテプシンＫ、α－ガラクトシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ／Ｂ、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、シアリン、およびシアル酸輸送体が、それらの断片、バリアントおよび誘導体を含めて、挙げられる。ある特定の実施形態は、ＧＢＡ１変異に起因するゴーシェ病の処置のために、多くの場合、使用されるポリペプチド、例えば、イミグルセラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼアルファ、エリグルスタット、ミグルスタットを含む。
ある特定の実施形態は、多発性硬化症（ＭＳ）の処置のために、多くの場合、使用されるポリペプチド、例えば、インターフェロン－βポリペプチド、例えば、インターフェロン－β１ａ（例えば、ＡＶＯＮＥＸ、ＲＥＢＩＦ）およびインターフェロン－β１ｂ（例えば、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）を含む。
ある特定の実施形態は、ＦＴＤ関連遺伝子、例えばＣ９ｏｒｆ７２、ＭＡＰＴ、ＧＲＮ、ＶＣＰ、ＣＨＡＭ２Ｂ、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＳＱＳＴＭ１、ＣＨＣＨＤ１０、ＴＢＫ１、ＯＰＴＮ、ＣＣＮＦ、ＴＩＡ１、およびＴＢＫ１の変異を標的とする二本鎖ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）（低分子干渉ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などのポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、上述のように、ポリペプチド剤は、抗体またはその抗原結合性断片である。本発明のコンジュゲートまたは組成物において使用される抗体または抗原結合性断片は、本質的に任意の種類のものであり得る。特定の例としては、治療用抗体および診断用抗体が挙げられる。当該技術分野において周知のように、抗体は、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を通じて特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’ｈ、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その合成バリアント、天然に存在するバリアント、必要とされる特異性の抗原結合性断片を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性の抗原結合性部位または断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリンの任意の他の改変された構成も包含する。
一部の実施形態では、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質のリガンドに特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体もしくは抗原結合性断片または他のポリペプチドは、細胞内タンパク質に特異的に結合する。
抗体またはポリペプチドは、当業者に公知の様々な技法のうちのいずれかによって調製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８を参照されたい。目的のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｅｕｒ．
Ｊ． ｌｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１－５１９， １９７６の技法、およびそれに対する改良形を使用して、調製することができる。トランスジェニック動物、例えば、マウスを用いて、ヒト抗体を発現させる方法もまた、含まれる。例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６， １９９６、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９－１０１， １９９４、およびＬｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：６５－９３， １９９５を参照されたい。
抗体またはポリペプチドはまた、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイライブラリーの使用によって生成または特定することもできる（例えば、米国特許第７，２４４，５９２号、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． １：７５５－７６８， ２００６を参照されたい）。利用可能なライブラリーの非限定的な例としては、クローニングまたは合成ライブラリー、例えば、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ）が挙げられ、ここでは、ヒト抗体レパートリーの構造的な多様性が、７つの重鎖可変領域遺伝子および７つの軽鎖可変領域遺伝子によって表される。これらの遺伝子の組合せにより、マスターライブラリーに４９個のフレームワークが生じる。高度に可変性の遺伝子カセット（ＣＤＲ＝相補性決定領域）を、これらのフレームワークに重ねることにより、巨大なヒト抗体レパートリーが再生され得る。軽鎖可変領域、重鎖ＣＤＲ－３、重鎖ＣＤＲ－１における多様性をコードする合成ＤＮＡ、および重鎖ＣＤＲ－２における多様性をコードする合成ＤＮＡをコードするヒトドナーを起源とする断片を用いて設計されたヒトライブラリーもまた、含まれる。
使用に好適な他のライブラリーは、当業者には明らかであろう。本明細書に記載され当該技術分野において公知であるｐ９７ポリペプチドは、精製プロセス、例えば、親和性クロマトグラフィーステップにおいて使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体またはポリペプチドは、ナノボディの形態をとり得る。ミニボディは、単一の遺伝子によってコードされ、ほぼすべての原核生物および真核生物宿主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（米国特許第６，７６５，０８７号を参照されたい）、カビ（例えば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＰｉｃｈｉａ（米国特許第６，８３８，２５４号を参照されたい）において効率的に産生される。産生プロセスは、拡張可能であり、複数キログラム量のナノボディが産生されている。ナノボディは、長期保管寿命を有するすぐに使用可能な溶液として製剤化することができる。ナノクローン方法（第ＷＯ０６／０７９３７２号を参照されたい）は、Ｂ細胞の自動化高スループット選択に基づく、所望される標的に対するナノボディを生成するための特許方法である。
ある特定の実施形態では、抗体もしくはその抗原結合性断片またはポリペプチドは、ヒト化されている。これらの実施形態は、一般に組換え技法を使用して調製される、非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来する抗原結合性部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく、キメラ分子を指す。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、キメラ抗体であり得る。この点に関して、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｅ部分に作動可能に連結されたかまたはそれ以外では融合された、抗体の抗原結合性断片から構成される。ある特定の実施形態では、異種Ｆｅドメインは、ヒト起源のものである。他の実施形態では、異種Ｆｅドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、ならびにＩｇＭを含む、親抗体とは異なるＩｇクラスに由来し得る。さらなる実施形態では、異種Ｆｅドメインは、異なるＩｇクラスの１つまたは複数に由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインから構成され得る。ヒト化抗体に関して上述のように、キメラ抗体の抗原結合性断片は、本明細書に記載される抗体のＣＤＲのうちの１つのみもしくは複数（例えば、本明細書に記載される抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＣＤＲ）を含み得るか、または可変ドメイン全体（ＶＬ、ＶＨ、もしくは両方）を含み得る。
他の活性剤
活性剤は、広く多様な化合物から選択することができる。一部の実施形態では、活性剤は、リソソーム常在タンパク質であり、これは、リソソーム内で産生されるか、または輸送、分泌によって、もしくはリソソームに取り込まれることによってリソソームに常在するタンパク質である。
活性剤は、特に被験体の脳組織において細胞成長、細胞生存、細胞修復、および／または炎症をモジュレートすることができる化合物であり得る。
活性剤は、リソソーム機能障害をモジュレートする、予防する、最小限にする、または反転させることができる化合物であり得る。
プログラニュリン
活性剤は、プログラニュリンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログであり得る。プログラニュリンは、５９３個のアミノ酸を有するタンパク質で、グラニュリンの前駆体タンパク質であり、ヒトにおいてＧＲＮ遺伝子によってコードされる。この遺伝子の変異は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の原因であることが暗示されている。プログラニュリンが切断されると、約６ｋダルトンの様々な活性なグラニュリンペプチドを生じる。プログラニュリンのグラニュリンへの切断は、リソソーム内またはリソソームの細胞外基質のいずれかで起こる。プログラニュリンおよびグラニュリンは、細胞において異なる生化学機能を有する。プログラニュリンは、抗炎症に関連するが、グラニュリンは炎症作用を有する。
プログラニュリンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログは、組換え（すなわち活性）形態であり得る。この活性形態は、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系またはあるいはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生され得る。
一部の実施形態では、活性剤は、プログラニュリンの活性なグラニュリン切断産物である。
プログラニュリンの調節因子またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログもまた、本明細書において活性剤ペイロードとして有用である。
ソーティングタンパク質およびソルチリン
活性剤は、ソーティングタンパク質であり得る。タンパク質ソーティング（タンパク質ターゲッテングとも呼ばれる）の機構は、それによってタンパク質が細胞内または細胞外の目的地に輸送される生物機構である。この機構が適切に作動している場合、タンパク質は、その適切な位置に輸送される。しかし、このソーティング機構が適切に作動していないか、または作動することができない場合、これは、細胞傷害、病状、および他の病態をもたらし得る。
一部の実施形態では、ペイロードの活性剤は、ソーティングタンパク質、またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログ、例えばソルチリン－１としても公知であるソルチリンである。
ソルチリン－１（ＳＯＲＴ１としても公知である）は、ヒトにおいてＳＯＲＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ソルチリン－１は、１型膜糖タンパク質であり、ソーティングタンパク質のｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒｔｉｎｇ １０（Ｖｐｓ１０ｐ）ファミリーメンバーである。ソルチリン－１は、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、および細胞膜の間でタンパク質を輸送するように作用し、代謝プロセス、神経発達、および細胞死に関与している。その結果、ソルチリン－１の不適切な機能または異常なレベルまたは不在は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の発生に関与し得る。ソルチリン－１の前駆体タンパク質は、４４個のアミノ酸のプロペプチドを含む。
ソルチリン－１は、プログラニュリンに結合し、エンドソームを介してこれをリソソームに送達し、そこでプログラニュリンは切断されてリソソームの中で分解される。
ソルチリン－１、またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログは、組換え（すなわち活性）形態であり得る。この活性形態は、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系またはあるいはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生され得る。
リソソーム輸送剤およびプロサポシン
活性剤は、リソソーム輸送を容易にすることができる、または脂質基質をその膜周囲から単離することができる、および／または脂質をリソソームの可溶性分解酵素により近づけることができる薬剤であり得る。そのような活性剤の例は、プロサポシン、またはその切断産物、誘導体、もしくはアナログである。
プロサポシンはまた、ＰＳＡＰとしても公知であり、ヒトにおいてＰＳＡＰ遺伝子によってコードされる。プロサポシンは、高度に保存された糖タンパク質であり、切断産物であるサポシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤの前駆体である。「サポシン」という用語は、スフィンゴ脂質活性化タンパク質の頭字語であることに注意すべきである。サポシンは、スフィンゴ糖脂質の分解を容易にする。プロサポシンは、神経栄養活性を有することが報告されている。
プロサポシンおよびプログラニュリンは、互いとヘテロ二量体を形成し、互いのリソソーム輸送を容易にすると考えられている。プロサポシンまたはその切断産物またはアナログは、組換え（すなわち、活性）形態であり得る。この活性形態は、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系またはあるいはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生され得る。
タウタンパク質およびタウタンパク質のモジュレーター
活性剤は、タウタンパク質またはタウタンパク質の活性もしくはレベルをモジュレートすることができる薬剤であり得る。Ｔタンパク質（またはτタンパク質）は、ヒトにおいてＭＡＰＴ（微小管結合タンパク質タウ）遺伝子からの選択的スプライシングによって産生される６つの高度に可溶性のタンパク質アイソフォームの群である。これらのタンパク質は、微小管アセンブリに関与し、神経細胞軸索における微小管安定性を維持すると考えられ、中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンに豊富に存在する。様々な病態および認知症が、タウタンパク質の異常、特に神経原線維変化と呼ばれる高度にリン酸化された不溶性の凝集体となる異常に関連しているように思われる。
ペプチド模倣体
ある特定の実施形態は、「ペプチド模倣体」を利用する。ペプチドアナログは、鋳型ペプチドのものに類似の特性を有する非ペプチド薬として、医薬品業界において広く使用されている。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と称される（Ｌｕｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １４：３８６－４０６， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９６、Ｊｏａｃｈｉｍ Ｇｒａｎｔｅ， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ３３：１６９９－１７２０， １９９４、Ｆａｕｃｈｅｒｅ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．， １５：２９， １９８６、Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ， ｐ．３９２ （１９８５）、およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３０：２２９， １９８７）。ペプチド模倣体は、ペプチドの生物活性を模倣するが、化学的な性質はもはやペプチド的ではない、分子である。ペプチド模倣体化合物は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第６，２４５，８８６号に記載されている。
ペプチド模倣体は、抗体に関して記載されている（上記）「特異的結合」の特徴を有し得る。例えば、ペプチド模倣体は、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、または５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）で、本明細書に記載される標的に特異的に結合し得る。一部の実施形態では、ペプチド模倣体は、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、ペプチド模倣体は、本明細書に記載される少なくとも１つのがん関連抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、ペプチド模倣体は、本明細書に記載される少なくとも１つの神経系関連抗原、疼痛関連抗原、および／または自己免疫関連抗原に特異的に結合する。
ペプトイド。
本発明のコンジュゲートには、「ペプトイド」も含まれる。ペプチドのペプトイド誘導体は、生物活性の重要な構造上の決定基を保持するが、ペプチド結合を排除し、それによって、タンパク質分解に対する耐性を付与する、改変されたペプチドの別の形態を表す（Ｓｉｍｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ． ８９：９３６７－９３７１， １９９２）。ペプトイドは、Ｎ－置換型グリシンのオリゴマーである。それぞれが天然のアミノ酸の側鎖に対応する、いくつかのＮ－アルキル基が、説明されている。本発明のペプチド模倣体は、少なくとも１つのアミノ酸、少数のアミノ酸、またはすべてのアミノ酸残基が、対応するＮ－置換型グリシンによって置換えられた化合物を含む。ペプトイドライブラリーは、例えば、米国特許第５，８１１，３８７号に記載されている。
ペプトイドは、抗体に関して記載されている（上記）「特異的結合」の特徴を有し得る。例えば、ペプトイドは、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、または５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）で、本明細書に記載される標的に特異的に結合し得る。ある特定の実施形態では、ペプトイドは、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、ペプトイドは、本明細書に記載される少なくとも１つのがん関連抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、ペプトイドは、本明細書に記載される少なくとも１つの神経系関連抗原、疼痛関連抗原、および／または自己免疫関連抗原に特異的に結合する。
アプタマー。
本発明のｐ９７コンジュゲートは、アプタマーも含む（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ． ３４６， ８１８－２２， １９９０およびＴｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２４９， ５０５－１０， １９９０を参照されたい）。アプタマーの例としては、核酸アプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー）、およびペプチドアプタマーが挙げられる。核酸アプタマーは、概して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択または同等の方法、例えば、ＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの体系的進化、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を複数回反復することによって、様々な分子標的、例えば、小分子、タンパク質、核酸、ならびにさらには細胞、組織、および生物に結合するように操作されている、核酸種を指す。例えば、米国特許第６，３７６，１９０号および同第６，３８７，６２０号を参照されたい。
典型的に、ペプチドアプタマーは、両方の末端で、典型的にペプチドアプタマーの結合親和性を抗体のものに匹敵するレベルまで（例えば、ナノモル範囲で）増加させる二重の構造上の制約であるタンパク質足場に結合された、可変ペプチドループを含む。ある特定の実施形態では、可変ループの長さは、約１０～２０個のアミノ酸（間のすべての整数を含む）から構成され得、足場は、良好な溶解度および小型化特性を有する任意のタンパク質を含み得る。ある特定の例示的な実施形態は、細菌タンパク質チオレドキシン－Ａを足場タンパク質として利用し得、可変ループが、還元性活性部位（野生型タンパク質における－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－ループ）内に挿入されており、２つのシステイン側鎖がジスルフィド架橋を形成することができる。ペプチドアプタマーを特定する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１０８５３２号に記載されている。
アプタマーは、抗体に関して記載されている（上記）「特異的結合」の特徴を有し得る。例えば、アプタマーは、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、または５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）で、本明細書に記載される標的に特異的に結合し得る。特定の実施形態では、アプタマーは、細胞表面受容体または他の細胞表面タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、アプタマーは、本明細書に記載される少なくとも１つのがん関連抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、アプタマーは、本明細書に記載される少なくとも１つの神経系関連抗原、疼痛関連抗原、および／または自己免疫関連抗原に特異的に結合する。
前頭側頭型認知症の処置に好適である特定の活性剤は、低分子、ポリペプチド剤、ペプチド模倣体、ペプトイド、アプタマー、ならびに酵素、例えばアルツハイマー病、神経セロイドリポフスチン症、筋萎縮性側索硬化症、またはパーキンソニズムの全体的または部分的症状を処置するために現在使用されている酵素を含む任意の薬剤であり得る。
検出可能な実体。一部の実施形態では、ｐ９７断片は、「検出可能な実体」にコンジュゲートされる。例示的な検出可能な実体としては、限定することなく、ヨウ素に基づく標識、放射性同位体、フルオロフォア／蛍光色素、およびナノ粒子が挙げられる。検出可能な実体は活性剤上に存在し得る。
例示的なヨウ素に基づく標識としては、ジアトリゾ酸（Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびそのアニオン形態、ジアトリゾエートが挙げられる。ジアトリゾ酸は、高度Ｘ線技法、例えば、ＣＴスキャンにおいて使用される放射線造影剤である。以下に記載されるヨウ素放射性同位体もまた、含まれる。
検出可能な実体として使用することができる例示的な放射性同位体としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１１１Ｎ、１６９Ｙｂ、９９ｍＴＣ、５５Ｆｅ、およびヨウ素の同位体、例えば、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが挙げられる。これらの放射性同位体は、異なる半減期、減衰の種類、およびエネルギーのレベルを有し、これらを、特定のプロトコールの必要性に一致するように適合することができる。これらの放射性同位体のうちのある特定のものは、ｐ９７ポリペプチドへのコンジュゲーションによって、ＣＮＳ組織に選択的にターゲッテングするかまたはより良好にターゲッテングして、例えば、ＣＮＳ組織の医療イメージングを改善することができる。
直接的に検出可能な実体として使用することができるフルオロフォアまたは蛍光色素の例としては、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、およびその他多数が挙げられる（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ － ９ｔｈ Ｅｄ．， ２００２， Ｍａｌｅｃ． Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ、Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－１０ｔｈ Ｅｄ．， ２００５， ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）。発光またはその他の方法で検出可能な色素もまた、含まれる。色素によって放出される光は、可視光または非可視光、例えば、紫外線光もしくは赤外線光であってもよい。例示的な実施形態では、色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）色素、キサンテン色素、例えば、フルオレセインおよびローダミン、アルファ位もしくはベータ位にアミノ基を有する色素（例えば、ナフチルアミン色素、１－ジメチルアミノナフチル－５－スルホネート、１－アニリノ－８－ナフタレンデスルホネート（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｄｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、および２－ｐ－トウイジニル（ｔｏｕｉｄｉｎｙｌ）－６－ナフタレンスルホネート）、３－フェニル－７－イソシアナトクマリンを有する色素、アクリジン、例えば、９－イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ、ピレン、ベンソキサジアゾール（ｂｅｎｓｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）、およびスチルベン、３－（ｓ－カルボキシペンチル）－３’－エチル－５，５’－ジメチルオキサカルボシアニン（ＣＹＡ）を有する色素、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５＆６－カルボキシローダミン－１１０（Ｒ１１０）、６－カルボキシローダミン－６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（商標）、Ｃｙ２、テキサスレッドおよびローダミンレッド、６－カルボキシ－２’，４，７，７’－テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６－カルボキシ－２’，４，４’，５’，７，７’－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５－カルボキシ－２’，４’，５’，７’－テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）、ＮＡＮ、ＮＥＤ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、およびＣｙ７．５、ＩＲ８００ＣＷ、ＩＣＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０であり得る。ある特定の実施形態は、検出可能な実体、例えば、フルオロフォア（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）で標識した化学療法剤（例えば、パクリタキセル、アドリアマイシン）へのコンジュゲーションを含む。
ナノ粒子は、通常、サイズが約１～１０００ｎｍの範囲に及び、多様な化学構造体、例えば、金および銀粒子、ならびに量子ドットを含む。角度のついた入射白色光で照射されると、約４０～１２０ｎｍの範囲の銀または金ナノ粒子は、高い強度で単色光を散乱する。散乱される光の波長は、粒子のサイズに依存する。近接している４～５つの異なる粒子は、それぞれ、単色光を散乱し、これが重なると、特異的な固有の色が得られる。誘導体化されたナノ粒子、例えば、銀または金粒子は、タンパク質、抗体、小分子、受容体リガンド、および核酸を含む、広範なアレイの分子に結合し得る。ナノ粒子の具体的な例としては、金属ナノ粒子および金属ナノシェル、例えば、金粒子、銀粒子、銅粒子、白金粒子、カドミウム粒子、複合粒子、金中空球、金コーティングシリカナノシェル、およびシリカコーティング金シェルが挙げられる。シリカ、ラテックス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ＰＶＤＦナノ粒子、およびこれらの材料のうちのいずれかの着色された粒子もまた、含まれる。
量子ドットは、広範な波長にわたる光により励起可能な直径が約１～５ｎｍの蛍光を発する結晶である。適切な波長を有する光によって励起されると、これらの結晶は、それらの化学組成およびサイズに応じた波長で、光、例えば、単色光を放出する。量子ドット、例えば、ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ｌｎＰ、またはｌｎＡｓは、固有の光学特性を有し、これらおよび類似の量子ドットは、いくつかの市販供給源から入手可能である（例えば、ＮＮ－Ｌａｂｓ、Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ、ＡＲ；Ｏｃｅａｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈ、Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ、ＡＲ；Ｎａｎｏｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
ポリペプチドバリアントおよび断片。
ある特定の実施形態は、名称で記載されるかまたは配列識別子を参照して記載されるかにかかわらず、ｐ９７ポリペプチドおよびポリペプチドに基づく薬剤、例えば、抗体を含む、本明細書に記載される参照ポリペプチドのバリアントおよび／または断片を含む。これらのポリペプチドの野生型またはもっとも一般的な配列は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されるバリアントおよび断片の比較物として使用することができる。
ポリペプチド「バリアント」は、この用語が本明細書に使用される場合、典型的に１つまたは複数の置換、欠失、付加、および／または挿入が、本明細書に具体的に開示されるポリペプチドとは異なる、ポリペプチドである。バリアントポリペプチドは、生物学的に活性である、すなわち、それらは、参照ポリペプチドの酵素活性または結合活性を有し続ける。そのようなバリアントは、例えば、遺伝子多型および／またはヒト操作により、生じ得る。
多数の事例では、生物学的に活性なバリアントは、１つまたは複数の保存的置換を含むことになる。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸と置換されるものであり、ペプチド化学の当業者であれば、実質的に変更されないであろうポリペプチドの二次構造および疎水性親水性質（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）を予測するであろう。上記のように、改変が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に行われてもよく、依然として、望ましい特徴を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を得ることができる。本発明のポリペプチドの同等のまたはさらには改善されたバリアントまたは部分を作るためにポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者であれば、典型的に、下の表Ａに従ってコードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つまたは複数を変更する。
ある特定の実施形態は、名称で記載されるかまたは配列識別子を参照して記載されるかにかかわらず、ｐ９７ポリペプチドおよびＦＴＤ関連タンパク質を含む、本明細書に記載される参照ポリペプチドのバリアントおよび／または断片を含む。これらのポリペプチドの野生型またはもっとも一般的な配列は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されるバリアントおよび断片の比較物として使用することができる。
ポリペプチド「バリアント」は、この用語が本明細書に使用される場合、典型的に１つまたは複数の置換、欠失、付加、および／または挿入が、本明細書に具体的に開示されるポリペプチドとは異なる、ポリペプチドである。バリアントポリペプチドは、生物学的に活性である、すなわち、それらは、参照ポリペプチドの酵素活性または結合活性を有し続ける。そのようなバリアントは、例えば、遺伝子多型および／またはヒト操作により、生じ得る。
多数の事例では、生物学的に活性なバリアントは、１つまたは複数の保存的置換を含むことになる。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸と置換されるものであり、ペプチド化学の当業者であれば、実質的に変更されないであろうポリペプチドの二次構造および疎水性親水性質（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）を予測するであろう。上述のように、改変が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に行われてもよく、依然として、望ましい特徴を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を得ることができる。本発明のポリペプチドの同等またはさらには改善されたバリアントまたは部分を作るようにポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者であれば、典型的に、以下の表Ａに従ってコードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つまたは複数を変更するであろう。
Figure 2023530159000005
例えば、ある特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合性領域または基質分子上の結合部位などの構造体と相互作用する結合能力の明らかな消失を伴わずに、タンパク質構造体における他のアミノ酸を置換し得る。タンパク質の生物学的な機能的活性を定義するのは、タンパク質の相互作用能力および性質であるため、ある特定のアミノ酸配列置換を、タンパク質配列、および当然ながらその根底にあるＤＮＡコード配列に行うことができ、いずれにせよ、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、様々な変更が、開示される組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に、それらの有用性の明らかな消失を伴わずに、行われ得ることが企図される。
そのような変更を行う場合、アミノ酸の疎水性親水性指数が、考慮され得る。タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与することにおける疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は、一般に、当該技術分野において理解されている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， １９８２、参照により本明細書に組み込まれる）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性特徴は、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとのタンパク質の相互作用を定義することが、許容されている。それぞれのアミノ酸には、その疎水性および荷電特徴に基づいて、疎水性親水性指数が割り当てられている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， １９８２）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（－０．４）、スレオニン（－０．７）、セリン（－０．８）、トリプトファン（－０．９）、チロシン（－１．３）、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）（－１．６）、ヒスチジン（－３．２）、グルタミン酸（－３．５）、グルタミン（－３．５）、アスパラギン酸（－３．５）、アスパラギン（－３．５）、リシン（－３．９）、およびアルギニン（－４．５）である。ある特定のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、依然として、類似の生物活性を有するタンパク質が得られること、すなわち、依然として生物学的機能が同等のタンパク質が得られることが、当該技術分野において公知である。そのような変更を行う場合、疎水性親水性指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが、特に好ましく、±０．５以内のものが、さらにより特に好ましい。
同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができることもまた、当該技術分野において理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる）は、タンパク質のもっとも高い局所平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって左右され、タンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（－０．４）、プロリン（－０．５±１）、アラニン（－０．５）、ヒスチジン（－０．５）、システイン（－１．０）、メチオニン（－１．３）、バリン（－１．５）、ロイシン（－１．８）、イソロイシン（－１．８）、チロシン（－２．３）、フェニルアラニン（－２．５）、トリプトファン（－３．４）。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のものの代わりに使用することができ、依然として、生物学的に同等な、特に、免疫学的に同等なタンパク質を得ることができることが、理解されている。そのような変更の場合、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが、特に好ましく、±０．５以内のものが、さらにより特に好ましい。
上記に概説されるように、アミノ酸置換は、したがって、概して、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。様々な前述の特徴を考慮した例示的な置換は、当業者に周知であり、これには、アルギニンおよびリシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびスレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが挙げられる。
アミノ酸置換は、さらに、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性質に基づいて行われてもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ、類似の親水性値を有する荷電していない極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、およびバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミン、ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。保存的変更を表し得る他のアミノ酸群としては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｉｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ、（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。
バリアントは、さらに、または代替として、非保存的変更を含有し得る。好ましい実施形態では、バリアントポリペプチドは、約１０個よりも少ない、９個よりも少ない、８個よりも少ない、７個よりも少ない、６個よりも少ない、５個よりも少ない、４個よりも少ない、３個よりも少ない、２個よりも少ないアミノ酸、またはさらには１個のアミノ酸の置換、欠失、または付加が、天然の配列とは異なる。バリアントは、さらに（または代替として）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、酵素活性、および／または疎水性親水性質に対して最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
ある特定の実施形態では、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）のバリアントは、２０１６年６月１４日に発行された米国特許第９３６４５６７号の表Ｂに示されるように、他の生物に由来するｐ９７配列の配列に基づき得、このような特許の全内容は、その全体が提示されるかのように参照により本明細書に組み込まれる。
一般に、バリアントは、参照ポリペプチド配列に対して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性または配列同一性もしくは配列相同性を呈する。さらに、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、またはそれより多くのアミノ酸の付加（例えば、（末端付加、Ｎ末端付加、それらの両方）、欠失、短縮、挿入、または置換が、天然または親配列とは異なるが、親または参照ポリペプチド配列の特性または活性を保持する、配列が、企図される。
一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも１個であるが、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１５個未満、１０個未満、８個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸残基が、参照配列とは異なる。他の実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも１％であるが、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満の残基が、参照配列とは異なる。（この比較が、アライメントを必要とする場合、配列は、最大の類似性に関してアライメントされるものとする。欠失もしくは挿入、またはミスマッチからの「ループ」アウト配列は、差異と考える。）
配列間の配列類似性または配列同一性（これらの用語は、本明細書において互換可能に使用される）の計算は、以下のように行われる。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を、最適な比較の目的でアライメントする（例えば、最適なアライメントのために、ギャップが、第１および第２のアミノ酸または核酸配列のうちの一方または両方に導入されてもよく、非相同配列は、比較目的で、無視してもよい）。ある特定の実施形態では、比較目的でアライメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次いで、比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されている場合、分子は、その位置において同一である。
２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共有している同一な位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮する。
２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに組み込まれている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４－４５３， １９７０）のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を使用して、決定される。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を使用して、決定される。特に好ましいパラメーターセット（および別途示されない限り使用すべきもの）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスで、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５である。
２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃａｂｉｏｓ． ４：１１－１７， １９８９）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して、決定することができる。
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を特定するために公開データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。本発明の核酸分子と相同であるヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的でギャップ付きアラインメント得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２， １９９７）に記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。
一実施形態では、上述のように、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、ＢＬＡＳＴアライメントツールを使用して、評価することができる。局所アライメントは、単純に、配列セグメントの対からなり、それぞれの配列から１つずつが比較される。Ｓｍｉｔｈ－ＷａｔｅｒｍａｎまたはＳｅｌｌｅｒｓのアルゴリズムの改変形は、スコアを伸長またはトリミングによって改善することができない、高スコアセグメント対（ＨＳＰ）と称されるすべてのセグメント対を見出すであろう。ＢＬＡＳＴアライメントの結果には、ＢＬＡＳＴスコアが偶然のみにより予測され得る尤度を示す、統計学的尺度が含まれる。
未加工スコアＳは、それぞれのアライメントした配列と関連するギャップおよび置換の数から計算され、ここで、類似性スコアが高いことは、より有意なアライメントを示す。置換スコアは、検索テーブルによって得られる（ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭを参照されたい）。
ギャップスコアは、典型的に、ギャップ開始ペナルティＧおよびギャップ伸長ペナルティＬの合計として計算される。長さｎのギャップについては、ギャップコストは、Ｇ＋Ｌｎとなるであろう。ギャップコストＧおよびＬの選択は、経験によるものであるが、Ｇには高い値（１０～１５）、例えば、１１、Ｌには低い値（１～２）、例えば、１を選択することが慣例的である。
ビットスコアＳ’は、使用されるスコア付けシステムの統計学的特性が考慮されている、未加工アライメントスコアＳから得られる。ビットスコアは、スコア付けシステムに対して正規化され、したがって、それらは、異なる検索から得られたアライメントスコアを比較するために使用することができる。「ビットスコア」および「類似性スコア」という用語は、互換可能に使用される。ビットスコアは、アライメントがどれほど良好であるかの指標を提供し、スコアが高いほど、アライメントが良好である。
Ｅ値または期待値は、類似のスコアを有する配列が、データベース内に偶然生じる尤度を示す。これは、データベース検索に偶然生じると予測される、Ｓと同等またはＳよりも良好なスコアを有する異なるアライメントの数の予測である。Ｅ値が小さいほど、アライメントの有意性が高い。例えば、ｅ－１１７のＥ値を有するアライメントは、類似のスコアを有する配列が、単純に偶然に生じる可能性が非常に低いことを意味する。加えて、ランダムなアミノ酸対のアライメントの予測スコアは、負となることが必要とされるが、そうでなければ、長いアライメントは、アライメントされるセグメントが関連していたかどうかとは独立して高いスコアを有する傾向となるであろう。加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、適切な置換マトリックス、ヌクレオチド、またはアミノ酸を使用し、ギャップ付きアライメントについては、ギャップ作りおよび伸長ペナルティを使用する。例えば、ポリペプチド配列のＢＬＡＳＴアライメントおよび比較は、典型的に、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して、行われる。
一実施形態では、配列類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して行われるＢＬＡＳＴ分析から報告される。
特定の実施形態では、本明細書に提供される配列同一性／類似性スコアは、ＧＡＰバージョン１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を以下のパラメーターで使用して得られた値を指す：ＧＡＰ加重５０および長さ加重３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア付けマトリックスを使用したヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；ＧＡＰ加重８および長さ加重２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ． ８９：１０９１５－１０９１９， １９９２）を使用したアミノ酸配列の同一性％および類似性％。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－ ４５３， １９７０）のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大にし、ギャップの数を最小限に抑える、２つの完全な配列のアライメントを見出す。
上述のように、参照ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、短縮、付加、および挿入を含む、様々な手段で変更され得る。そのような操作のための方法は、概して、当該技術分野において公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ （ＰＮＡＳ ＵＳＡ． ８２： ４８８－４９２， １９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３６７－３８２， １９８７）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， （”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，” Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， Ｃａｌｉｆ．，
１９８７）、ならびにそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， （１９７８） Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出すことができる。
そのような改変によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための方法は、当該技術分野において公知である。そのような方法は、参照ポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適応可能である。一例として、ライブラリー内の機能性変異体の頻度を増強する技法である再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）は、ポリペプチドバリアントを特定するためにスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：７８１１－７８１５， １９９２、Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． ６：３２７－３３１， １９９３）。
コンジュゲーションの例示的な方法。
目的の薬剤へのｐ９７ポリペプチド配列のコンジュゲーションまたはカップリングは、標準的な化学的技法、生物化学的技法、および／または分子技法を使用して、行うことができる。実際に、本開示を踏まえて、利用可能な当該技術分野において認識されている手法を使用して、ｐ９７コンジュゲートを作製する方法は、明らかであろう。当然ながら、一般に、本発明のｐ９７コンジュゲートの主要な成分をカップリングさせる場合に、用いられる技法および結果として生じる架橋化学は、コンジュゲートの個々の成分の所望される機能性または活性を実質的に妨害するものではないことが、好ましい。
用いられる特定のカップリング化学は、生物学的に活性な薬剤（例えば、小分子、ポリペプチド）の構造、生物学的に活性な薬剤内の複数の官能基の潜在的な存在、保護／脱保護ステップの必要性、薬剤の化学的安定性などに依存することになり、当業者によって容易に決定されるであろう。本発明のｐ９７コンジュゲートを調製するのに有用な例示的なカップリング化学は、例えば、Ｗｏｎｇ （１９９１）， ”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ”， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦｌａおよびＢｒｉｎｋｌｅｙ ”Ａ Ｂｒｉｅｆ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｄｙｅｓ， Ｈａｐｔｅｎｓ， ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，” ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．， ３：２０１３， １９９２において見出すことができる。好ましくは、コンジュゲートの結合能力および／または活性は、用いられるコンジュゲーション技法の結果として、例えば、コンジュゲートされていない薬剤またはコンジュゲートされていないｐ９７ポリペプチドと比べて、実質的に低減されるものではない。
ある特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、直接的または間接的のいずれかで、目的の薬剤にカップリングされ得る。ｐ９７ポリペプチド配列と目的の薬剤との間の直接的な反応は、それぞれが、互いに反応することができる置換基を有する場合に、可能である。例えば、一方における求核基、例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基は、他方におけるカルボニル含有基、例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することが可能であり得る。
あるいは、ｐ９７ポリペプチド配列および目的の薬剤を、非ペプチドリンカーおよびペプチドリンカーを含むリンカー基を介して間接的にカップリングさせることが、望ましい場合がある。リンカー基は、結合能力、ターゲッテング能力、または他の機能性の妨害を回避するために、目的の薬剤をｐ９７ポリペプチド配列から分離するためのスペーサーとしても機能し得る。リンカー基はまた、薬剤における置換基の化学的反応性を増加させ、したがって、カップリング効率を増加させるようにも機能し得る。化学的反応性の増加はまた、そうでなければ可能ではないであろう薬剤または薬剤における官能基の使用を促進することもできる。放出可能なリンカーまたは安定なリンカーの選択はまた、ｐ９７コンジュゲートおよび結合される目的の薬剤の薬物動態を変更するためにも用いることができる。例示的な連結基としては、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、およびエステラーゼ不安定性基が挙げられる。他の例示的な実施形態では、コンジュゲートは、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許第０ ４２５ ２３５号Ｂ１、およびＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ５２：１２７－１３１， １９９２に開示されるものなどの連結基を含む。さらなる例示的なリンカーは、以下に記載されている。
一部の実施形態では、１つより多くのｐ９７ポリペプチド配列を、薬剤にカップリングさせること、またはその逆が、望ましい場合がある。例えば、ある特定の実施形態では、複数のｐ９７ポリペプチド配列が、１つの薬剤にカップリングされるか、または代替として、１つもしくは複数のｐ９７ポリペプチドが、複数の薬剤にコンジュゲートされる。ｐ９７ポリペプチド配列は、同じであっても異なってもよい。特定の実施形態にかかわらず、複数のｐ９７ポリペプチド配列を含むコンジュゲートは、様々な手段で調製することができる。例えば、１つより多くのポリペプチドは、薬剤に直接的にカップリングされてもよく、または結合のための複数の部位を提供するリンカーを使用してもよい。様々な公知のヘテロ二官能性架橋戦略のうちのいずれかを、本発明のコンジュゲートを作製するために利用することができる。これらの実施形態の多くは、コンジュゲーション／架橋手順中に使用される材料の化学量論を制御することによって達成することができる。
ある特定の例示的な実施形態では、スクシンイミジルエステル官能基を含む薬剤とアミノ基を含むｐ９７ポリペプチドとの間の反応により、アミド結合が形成され、オキシカルボニルイミジザオール（ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｉｍｉｄｉｚａｏｌｅ）官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、カルバメート結合が形成され、ｐ－ニトロフェニルカーボネート官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、カルバメート結合が形成され、トリクロロフェニルカーボネート官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、カルバメート結合が形成され、チオエステル官能基を含む薬剤とｎ末端アミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、アミド結合が形成され、プロプリオンアルデヒド（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ）官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成される。
一部の例示的な実施形態では、ブチルアルデヒド官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、アセタール官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、ピペリドン官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、メチルケトン官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、マレイミド官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、アルデヒド官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成され、ヒドラジン官能基を含む薬剤とカルボン酸基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、第２級アミン結合が形成される。
特定の例示的な実施形態では、マレイミド官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、チオエーテル結合が形成され、ビニルスルホン官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、チオエーテル結合が形成され、チオール官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、ジスルフィド結合が形成され、オルトピリジルジスルフィド官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、ジスルフィド結合が形成され、ヨードアセトアミド官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により、チオエーテル結合が形成される。
具体的な実施形態では、アミンとスルフヒドリルとの架橋剤が、コンジュゲートを調製するのに使用される。
１つの好ましい実施形態では、例えば架橋剤は、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、これは、ＮＨＳ－エステルおよび中等度の長さのシクロヘキサン安定化スペーサーアーム（８．３オングストローム）の反対側の末端でマレイミド反応基を含むスルフヒドリル架橋剤である。ＳＭＣＣは、後続のｐ９７ポリペプチド配列との反応のためのスルフヒドリル反応性、マレイミドで活性化された薬剤（例えば、ポリペプチド、抗体）を作るために使用することができる、非切断型の膜透過性架橋剤である。ＮＨＳエステルは、ｐＨ７～９で第１級アミンと反応して、安定なアミド結合を形成する。マレイミドは、ｐＨ６．５～７．５でスルフヒドリル基と反応して、安定なチオエーテル結合を形成する。したがって、ＳＭＣＣのアミン反応性ＮＨＳエステルは、薬剤の第１級アミンと急速に架橋し、結果として得られるスルフヒドリル反応性マレイミド基は、ｐ９７のシステイン残基との反応に利用可能であり、目的の特異的なコンジュゲートが得られる。
ある特定の具体的な実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、架橋を促進するため、例えば、マレイミドで活性化された薬剤への架橋を促進するために、露出したスルフヒドリル基を含有するように改変される。より具体的な実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、保護チオールスルフヒドリル基を付加するように、第１級アミンを改変する試薬により、改変される。さらにより具体的な実施形態では、試薬Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、チオール化ｐ９７ポリペプチドを得る。
他の具体的な実施形態では、マレイミドで活性化された薬剤は、好適な条件下において、チオール化ｐ９７ポリペプチドと反応して、本発明のコンジュゲートを産生する。この反応におけるＳＭＣＣ、ＳＡＴＡ、薬剤、およびｐ９７ポリペプチドの比を操作することによって、異なる化学量論、分子量、および特性を有するコンジュゲートを産生することが可能であることが、理解される。
なおも他の例示的な実施形態では、コンジュゲートは、二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製される。特定のカップリング剤としては、ジスルフィド結合を提供するＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １７３：７２３－７３７ ［１９７８］）およびＮ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。
本明細書に考察される具体的な架橋戦略は、本発明のコンジュゲートを産生する場合に用いることができる好適なコンジュゲーション戦略の多くの例のうちの数例でしかない。ホモ官能性およびヘテロ官能性を含む、様々な他の二官能性または多官能性試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのカタログに記載のもの）を、リンカー基として用いることができることは、当業者には明らかであろう。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化炭水化物残基を通じて実行することができる。そのような手法について記載している多数の参考文献、例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号がある。
特定の実施形態は、ｐ９７ポリペプチドと薬剤との間のコンジュゲーションを促進するために、１つまたは複数のアルデヒドタグを利用し得る（参照により組み込まれる米国特許第８，０９７，７０１号および同第７，９８５，７８３号を参照されたい）。ここで、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用によるアルデヒドタグのスルファターゼモチーフにおける酵素改変により、ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基が生じる。ＦＧｌｙ残基のアルデヒド部分は、次いで、目的の部分のポリペプチドへの部位特異的結合のための化学的ハンドルとして利用することができる。一部の態様では、目的の部分は、小分子、ペプトイド、アプタマー、またはペプチド模倣体である。一部の態様では、目的の部分は、別のポリペプチド、例えば、抗体である。
上述のモチーフを有するポリペプチドは、ＦＧｌｙ残基を有するモチーフを生成するようにＦＧＥ酵素によって改変され得、この残基は、上述のように、薬剤、例えば、第２のポリペプチドの、例えば、リンカー部分を介した部位特異的結合に使用され得る。そのような改変は、例えば、ＦＧＥ酵素を発現する哺乳動物、酵母、もしくは細菌細胞において、スルファターゼモチーフを含有するポリペプチド（例えば、ｐ９７、抗体）を発現させること、または単離されたＦＧＥ酵素による単離されたポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ改変によって、行うことができる。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ． １０６：３０００－３００５， ２００９、Ｒｕｓｈ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ， Ｊ． Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． １３０：１２２４０－１， ２００８、およびＣａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８３：２０１１７－２５， ２００８を参照されたい）。
薬剤または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド（例えば、抗体、ｐ９７ポリペプチド）は、１つまたは複数のアルデヒド反応基、例えば、アミノオキシ、ヒドラジド、およびチオセミカルバジドで官能化され、次いで、少なくとも１つのＦＧｌｙ残基を介してアルデヒドタグ含有ポリペプチドに共有結合で連結されて、アルデヒド反応性結合が形成され得る。アミノオキシで官能化された薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）の結合により、ＦＧｌｙ残基と官能化された薬剤（例えば、非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）との間にオキシム結合が作られ、ヒドラジドで官能化された薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）の結合により、ＦＧｌｙ残基と官能化された薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）との間にヒドラジン結合が作られ、チオセミカルバジドで官能化された薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）の結合により、ＦＧｌｙ残基と官能化された薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）との間にヒドラジンカルボチアミド結合が作られる。したがって、これらおよび関連する実施形態では、Ｒ１は、シッフ塩基を含む結合、例えば、オキシム結合、ヒドラジン結合、またはヒドラジンカルボチアミド結合であり得る。
ある特定の実施形態は、（ｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有ｐ９７ポリペプチド、および（ｉｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有ポリペプチド剤（Ａ）のコンジュゲートを含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、それぞれのＦＧｌｙ残基を介して、必要に応じて二官能化リンカー部分または基を介して、共有結合的に連結される。
一部の実施形態では、アルデヒドタグ含有ｐ９７ポリペプチドおよびアルデヒドタグ含有薬剤は、多官能化リンカー（例えば、二官能化リンカー）を介して連結され（例えば、共有結合的に連結され）、後者は、同じかまたは異なるアルデヒド反応基で官能化されている。これらおよび関連する実施形態では、アルデヒド反応基は、リンカーが、ｐ９７ポリペプチドと薬剤との間でそれらのそれぞれのＦＧｌｙ残基を介して共有結合的架橋を形成することを可能にする。リンカー部分としては、１つまたは複数のアルデヒド反応性基で官能化することができ、好ましくは、二官能化または多官能化することができる、任意の部分または化学物質が挙げられる。特定の例としては、ペプチド、水溶性ポリマー、検出可能な実体、他の治療用化合物（例えば、細胞傷害性化合物）、ビオチン／ストレプトアビジン部分、およびグリカンが挙げられる（Ｈｕｄａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． １３３：１６１２７－３５， ２０１１を参照されたい）。
グリカン（またはグリコシド）の具体的な例としては、アミノオキシグリカン、例えば、グリコシルＮ－ペンテノイルヒドロキサメート中間体から構成される高次グリカンが挙げられる（上記）。例示的なリンカーは、本明細書に記載されており、当該技術分野において日常的な技法により、アルデヒド反応性基で官能化することができる（例えば、Ｃａｒｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ３：３２１－３２２， ２００７、ならびに米国特許第８，０９７，７０１号および同第７，９８５，７８３号を参照されたい）。
ｐ９７コンジュゲートはまた、様々な「クリック化学」技法によって調製することができ、これには、モジュール式であり、範囲が広く、非常に高い収率が得られ、非クロマトグラフィー方法によって除去することができる主として害にならない副産物を生成し、立体特異的であり得るが必ずしもエナンチオ選択的でない、反応が挙げられる（Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ． ４０：２００４－２０２１， ２００１を参照されたい）。特定の例としては、「アジド－アルキン付加環化」反応とも称されるアジドおよびアルキンのヒュスゲン１，３－双極性付加環化を用いるコンジュゲーション技法が挙げられる（Ｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ２５：２２１６－２２３０， ２００８を参照されたい）。アジド－アルキン付加環化反応の非限定的な例としては、銅触媒アジド－アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）反応およびルテニウム触媒アジド－アルキン付加環化（ＲｕＡＡＣ）反応が挙げられる。
ＣｕＡＡＣは、広い温度範囲にわたって機能し、水性条件および４～１２にわたるｐＨ範囲で非感受性であり、広範な官能基を許容する（Ｈｉｍｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． １２７：２１０－２１６， ２００５を参照されたい）。活性なＣｕ（Ｉ）触媒は、例えば、還元剤としてアスコルビン酸ナトリウムを使用して、Ｃｕ（Ｉ）塩またはＣｕ（ＩＩ）塩から生成することができる。この反応は、１，４置換産物を形成するため、領域特異的となっている（Ｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。
ＲｕＡＡＣは、アジドの末端アルキンへの付加環化を触媒することができるペンタメチルシクロペンタジエニルルテニウム塩化物［Ｃｐ＊ＲｕＣｌ］錯体を用い、位置選択的に、１，５－二置換１，２，３－トリアゾールをもたらす（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． ９：５３３７－５３３９， ２００７を参照されたい）。さらに、ＣｕＡＡＣとは対照的に、ＲｕＡＡＣはまた、内部アルキンとともに使用して、完全置換１，２，３－トリアゾールをもたらすこともできる。
ある特定の実施形態は、したがって、内部および末端の非天然のアミノ酸（例えば、Ｎ末端、（末端）を含め、アジド側鎖またはアルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。これらのｐ９７ポリペプチドのうちのある特定のものは、アジド側鎖またはアルキン側鎖を含有する非天然のアミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、無細胞系）での組込みによって形成することができる。例示的なｉｎ ｖｉｖｏ技法としては、細胞培養技法、例えば、改変されたＥ．ｃｏｌｉを使用するものが挙げられ（Ｔｒａｖｉｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２８５：１１０３９－４４， ２０１０およびＤｅｉｔｅｒｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ． １５：１５２１－１５２４， ２００５を参照されたい）、例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏ技法としては、無細胞系が挙げられる（Ｂｕｎｄｙ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ２１：２５５－６３， ２０１０を参照されたい）。
一部の実施形態では、アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドは、アジド－アルキン付加環化によって、少なくとも１つのアルキン基を含む薬剤（またはリンカー）、例えば、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むポリペプチド剤に、コンジュゲートされる。他の実施形態では、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドは、アジド－アルキン付加環化によって、少なくとも１つのアジド基を含む薬剤（またはリンカー）、例えば、アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むポリペプチド剤に、コンジュゲートされる。したがって、ある特定の実施形態は、１，２，３－トリアゾール結合を介して薬剤に共有結合的に連結されたｐ９７ポリペプチドを含むコンジュゲートを含む。
ある特定の実施形態では、アジド側鎖を有する非天然のアミノ酸および／またはアルキン側鎖を有する非天然のアミノ酸は、末端アミノ酸（Ｎ末端）である。ある特定の実施形態では、非天然のアミノ酸のうちの１つまたは複数は、内部である。
例えば、ある特定の実施形態は、アルキン基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。一部の実施形態は、アルキン基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。特定の実施形態は、アジド側鎖基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アジド側鎖基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。一部の実施形態は、アルキン基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有する少なくとも１つの内部の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アジド側鎖基を含む薬剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの内部の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
特定の実施形態は、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。他の実施形態は、アルキン側鎖を有する末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおも他の実施形態は、アルキン側鎖を有する末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド剤にコンジュゲートされた、アジド側鎖を有する末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
他の実施形態は、アジド側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むポリペプチド剤にコンジュゲートされたアルキン側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおさらなる実施形態は、アジド側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むポリペプチド剤にコンジュゲートされたアルキン側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アジド側鎖を有する（末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおもさらなる実施形態は、アジド側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド剤にコンジュゲートされた、アルキン側鎖を有するＮ末端の非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
ｐ９７コンジュゲートを産生する方法であって、（ａ）（ｉ）アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと少なくとも１つのアルキン基（例えば、アルキン側鎖を有する非天然のアミノ酸）を含む薬剤との間、または（ｉｉ）アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと少なくとも１つのアジド基（例えば、アジド側鎖を有する非天然のアミノ酸）を含む薬剤との間で、アジド－アルキン付加環化反応を行うステップと、（ｂ）反応物からｐ９７コンジュゲートを単離し、それによって、ｐ９７コンジュゲートを産生するステップとを含む、方法もまた、含まれる。
ｐ９７コンジュゲートが融合ポリペプチドである場合には、融合ポリペプチドは、概して、標準的な技法を使用して調製することができる。しかしながら、好ましくは、融合ポリペプチドは、本明細書に記載され当該技術分野において公知である発現系において、組換えポリペプチドとして発現される。本発明の融合ポリペプチドは、ｐ９７ポリペプチド配列の１つまたは複数のコピーを含有し得、所望される配置で存在する、目的のポリペプチドに基づく薬剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）の１つまたは複数のコピーを含有し得る。
融合タンパク質に関して、ｐ９７ポリペプチド、ポリペプチド剤（例えば、抗体）、および必要に応じてペプチドリンカー成分をコードするＤＮＡ配列は、別個にアセンブルされ、次いで、適切な発現ベクターにライゲーションされ得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、配列のリーディングフレームが同相となるように、ペプチドリンカーありまたはなしで、他のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端にライゲーションされる。ライゲーションされたＤＮＡ配列は、好適な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’にのみ位置する。同様に、翻訳を停止させるために必要とされる停止コドンおよび転写終結シグナルは、もっともＮ末端側のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’にのみ存在する。これにより、両方のポリペプチド成分の生物活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳が可能となる。
同様の技法、主として、調節エレメント、例えば、プロモーター、停止コドン、および転写終結シグナルの配置が、非融合コンジュゲートの産生のための非融合タンパク質、例えば、ｐ９７ポリペプチドおよびポリペプチド剤（例えば、抗体剤）の組換え産生に適用され得る。
本発明のポリヌクレオチドおよび融合ポリヌクレオチドは、ｐ９７ポリペプチド配列をコードする核酸の１つもしくは複数のコピーを含有し得、および／またはポリペプチド剤をコードする核酸の１つもしくは複数のコピーを含有し得る。
一部の実施形態では、対象となるｐ９７ポリペプチド、ポリペプチド剤、および／またはｐ９７－ポリペプチド融合体をコードする核酸が、宿主細胞に直接的に導入され、細胞が、コードされるポリペプチドの発現を誘導するのに十分な条件下においてインキュベートされる。本開示のポリペプチド配列は、本明細書に提供されるポリペプチドおよび核酸配列と組み合わせて、当業者に周知の標準的な技法を使用して調製され得る。
したがって、ある特定の関連する実施形態によると、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは融合ポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞が提供される。宿主細胞におけるｐ９７ポリペプチド、ポリペプチド剤、またはｐ９７－ポリペプチド剤融合体の発現は、便宜的に、適切な条件下において、ポリヌクレオチドを含有する組換え宿主細胞を培養することによって達成することができる。発現による産生に続いて、ポリペプチドは、任意の好適な技法を使用して単離および／または精製された後、所望されるように使用され得る。
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムが、周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母、およびバキュロウイルス系が挙げられる。
異種ポリペプチドの発現のための当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、およびその他多数が挙げられる。一般に好ましい細菌宿主は、ｆ．ｃｏｌｉである。原核細胞、例えば、ｆ．ｃｏｌｉにおけるポリペプチドの発現は、当該技術分野において十分に確立されている。考察については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ９：５４５－５５１ （１９９１）を参照されたい。培養物中での真核細胞における発現もまた、ポリペプチドの組換え産生のための選択肢として、当業者に利用可能である（Ｒｅｆ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ４：５７３－５７６， １９９３およびＴｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ６：５５３－５６０， １９９５を参照されたい。
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を適宜含む、適切な調節配列を含有する、好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、またはファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、シーケンシング、ＤＮＡの細胞への導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析のための核酸の操作のための多数の公知の技法およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２、またはそれに対する後続のアップデートに詳細に記載されている。
「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載されるポリペプチドのうちの１つまたは複数をコードする核酸配列が導入されているか、またはそれを導入することができ、さらに、選択された目的の遺伝子、例えば、本明細書に記載される任意のポリペプチドをコードする遺伝子を発現するか、またはそれを発現することができる、細胞を指して使用される。この用語は、親細胞の子孫を含み、選択された遺伝子が存在する限り、子孫がもともとの親と形態または遺伝子構成が同一であるかどうかは関係ない。宿主細胞は、ある特定の特徴、例えば、スルファターゼモチーフ内のシステインもしくはセリン残基をホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基に変換するためのホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の発現、またはコンジュゲーションを促進するためにアジド側鎖、アルキン側鎖、もしくは他の所望される側鎖を有する非天然のアミノ酸を含め、非天然のアミノ酸をポリペプチドに組み込むことができる、アミノアシルｔＲＮＡシンターゼの発現について、選択することができる。
したがって、そのような核酸を宿主細胞に導入するステップを含む方法もまた、企図される。核酸の導入は、任意の利用可能な技法を用い得る。真核細胞については、好適な技法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニア、もしくは昆虫細胞についてはバキュロウイルスを使用した形質導入を挙げることができる。細菌細胞については、好適な技法は、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを使用したトランスフェクションを挙げることができる。導入には、核酸からの発現を引き起こすかまたは可能にすること、例えば、遺伝子の発現のための条件下において宿主細胞を培養することが続き得る。一実施形態では、核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込まれる。組み込みは、標準的な技法に従って、ゲノムでの組換えを促進する配列の包含により促進され得る。
本発明はまた、ある特定の実施形態では、特定のポリペプチド、例えば、本明細書に記載されるｐ９７ポリペプチド、ポリペプチド剤、またはｐ９７－ポリペプチド剤融合タンパク質を発現させるために、本明細書に記載される核酸構築物を発現系において使用するステップを含む、方法も提供する。
上述のように、ある特定のｐ９７コンジュゲート、例えば、融合タンパク質は、非ペプチドリンカー（例えば、非タンパク質性リンカー）およびペプチドリンカーを含む、１つまたは複数のリンカー基を利用し得る。そのようなリンカーは、安定なリンカーまたは放出可能なリンカーであり得る。
例示的な非ペプチドの安定な連結としては、スクシンイミド、プロピオン酸、カルボキシメチレート結合、エーテル、カルバメート、アミド、アミン、カルバミド、イミド、脂肪族Ｃ－Ｃ結合、チオエーテル結合、チオカルバメート、チオカルバミドなどが挙げられる。一般に、加水分解的に安定な連結は、生理学的条件下において、１日当たり約１～２％未満から５％の加水分解速度を呈する。
例示的な非ペプチドの放出可能なリンカーとしては、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステル、カーボネート、およびヒドラジン結合が挙げられる。他の例示的な放出可能なリンカーの例は、ベンジル脱離に基づくリンカー、トリアルキルロックに基づくリンカー（またはトリアルキルロックラクトン化に基づく）、ビシンに基づくリンカー、および酸不安定性リンカーであり得る。酸不安定性リンカーの中でもとりわけ、ジスルフィド結合、ヒドラゾン含有リンカー、およびチオプロピオネート含有リンカーであり得る。細胞への内部移行中またはその後に放出可能または切断可能であるリンカーもまた、含まれる。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出の機序には、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、光不安定性結合の照射による切断（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体に媒介される加水分解による切断（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸に触媒される加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）が含まれる。一実施形態では、酸不安定性リンカーが、使用され得る（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７－１３１， １９９２および米国特許第５，２０８，０２０号）。さらなる詳細は、当業者に公知である。例えば、米国特許第９３６４５６７号を参照されたい。
ある特定の実施形態では、「水溶性ポリマー」が、ｐ９７ポリペプチド配列を目的の薬剤にカップリングするためのリンカーにおいて使用される。「水溶性ポリマー」とは、水に可溶性であり、通常、実質的に非免疫原性であり、通常、約１，０００ダルトンより大きい原子分子量（ａｔｏｍｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）を有する、ポリマーを指す。水溶性ポリマーを介した２つのポリペプチドの結合は、そのような改変が、血清半減期を増加させることによって、例えば、タンパク質分解安定性を増加させることおよび／または腎臓クリアランスを減少させることによって、治療指数を増加させ得るため、望ましい場合がある。加えて、１つまたは複数のポリマーを介した結合により、タンパク質医薬品の免疫原性が低減され得る。
水溶性ポリマーの特定の例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられる。
一部の実施形態では、水溶性ポリマーは、約１０，０００Ｄａより大きい、約２０，０００Ｄａより大きく、５００，０００Ｄａまで、約４０，０００Ｄａより大きく３００，０００Ｄａまで、約５０，０００Ｄａより大きく７０，０００Ｄａまで、通常は約６０，０００Ｄａより大きい、有効流体力学分子量を有する。「有効流体力学分子量」とは、水性ベースのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定される、ポリマー鎖の水に溶媒和される有効サイズを指す。水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド反復単位、例えば、酸化エチレン反復単位を有するポリマー鎖を含有する場合、それぞれの鎖は、約２００Ｄａ～約８０，０００Ｄａ、または約１，５００Ｄａ～約４２，０００Ｄａの原子分子量を有し得、２，０００～約２０，０００Ｄａが、特に目的とされる。直鎖状、分岐状、および末端荷電した水溶性ポリマーもまた、含まれる。
アルデヒドタグ付きポリペプチド間のリンカーとして有用なポリマーは、広範な分子量およびポリマーサブユニットを有し得る。これらのサブユニットは、生物学的ポリマー、合成ポリマー、またはこれらの組合せを含み得る。そのような水溶性ポリマーの例としては、硫酸デキストラン、Ｐ－アミノ架橋型デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンを含む、デキストランおよびデキストラン誘導体、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデキストリン、ならびにデンプンの誘導体およびヒドロイルアクト（ｈｙｄｒｏｙｌａｃｔｅ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールのプロピレングリコールとのコポリマーを含む、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体が挙げられ、ここで、前記ホモポリマーおよびコポリマーは、一方の末端において、アルキル基、ヘパリンおよびヘパリンの断片、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、アスパルトアミド、ならびにポリオキシエチル化ポリオール、デキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体で置換されているか、または非置換である。具体的に記載される水溶性ポリマーの様々な誘導体もまた含まれることが理解される。
水溶性ポリマー、特に、ポリアルキレンオキシドに基づくポリマー、例えば、ポリエチレングリコール「ＰＥＧ」が、当該技術分野において公知である（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｊ． Ｍ． Ｈａｒｒｉｓ， Ｅｄ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９９２）およびＰｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｊ． Ｍ． Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ． Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｅｄｓ．， ＡＣＳ （１９９７）、ならびに国際特許出願第ＷＯ９０／１３５４０号、同第ＷＯ９２／００７４８号、同第ＷＯ９２／１６５５５号、同第ＷＯ９４／０４１９３号、同第ＷＯ９４／１４７５８号、同第ＷＯ９４／１７０３９号、同第ＷＯ９４／１８２４７号、同第ＷＯ９４／２８９３７号、同第ＷＯ９５／１１９２４号、同第ＷＯ９６／０００８０号、同第ＷＯ９６／２３７９４号、同第ＷＯ９８／０７７１３号、同第ＷＯ９８／４１５６２号、同第ＷＯ９８／４８８３７号、同第ＷＯ９９／３０７２７号、同第ＷＯ９９／３２１３４号、同第ＷＯ９９／３３４８３号、同第ＷＯ９９／５３９５１号、同第ＷＯ０１／２６６９２号、同第ＷＯ９５／１３３１２号、同第ＷＯ９６／２１４６９号、同第ＷＯ９７／０３１０６号、同第ＷＯ９９／４５９６４号、および米国特許第４，１７９，３３７号、同第５，０７５，０４６号、同第５，０８９，２６１号、同第５，１００，９９２号、同第５，１３４，１９２号、同第５，１６６，３０９号、同第５，１７１，２６４号、同第５，２１３，８９１号、同第５，２１９，５６４号、同第５，２７５，８３８号、同第５，２８１，６９８号、同第５，２９８，６４３号、同第５，３１２，８０８号、同第５，３２１，０９５号、同第５，３２４，８４４号、同第５，３４９，００１号、同第５，３５２，７５６号、同第５，４０５，８７７号、同第５，４５５，０２７号、同第５，４４６，０９０号、同第５，４７０，８２９号、同第５，４７８，８０５号、同第５，５６７，４２２号、同第５，６０５，９７６号、同第５，６１２，４６０号、同第５，６１４，５４９号、同第５，６１８，５２８号、同第５，６７２，６６２号、同第５，６３７，７４９号、同第５，６４３，５７５号、同第５，６５０，３８８号、同第５，６８１，５６７号、同第５，６８６，１１０号、同第５，７３０，９９０号、同第５，７３９，２０８号、同第５，７５６，５９３号、同第５，８０８，０９６号、同第５，８２４，７７８号、同第５，８２４，７８４号、同第５，８４０，９００号、同第５，８７４，５００号、同第５，８８０，１３１号、同第５，９００，４６１号、同第５，９０２，５８８号、同第５，９１９，４４２号、同第５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号、同第５，９６５，１１９号、同第５，９６５，５６６号、同第５，９８５，２６３号、同第５，９９０，２３７号、同第６，０１１，０４２号、同第６，０１３，２８３号、同第６，０７７，９３９号、同第６，１１３，９０６号、同第６，１２７，３５５号、同第６，１７７，０８７号、同第６，１８０，０９５号、同第６，１９４，５８０号、同第６，２１４，９６６号を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
例示的な目的のポリマーとしては、エチレンオキシド反復単位を含むポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドを含む、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはこれらの誘導体を含むものが挙げられる。さらなる例示的な目的のポリマーとしては、約１，０００ダルトンより大きい分子量を有するポリアミドが挙げられる。さらなる例示的な水溶性反復単位は、エチレンオキシドを含む。そのような水溶性反復単位の数は、有意に変動してもよく、そのような単位の通例的な数は、２～５００、２～４００、２～３００、２～２００、２～１００、およびもっとも通例的には２～５０である。
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカー配列は、ｐ９７コンジュゲートの成分を分離するかまたはカップリングさせるために用いることができる。例えば、ポリペプチド－ポリペプチドコンジュゲートに関して、ペプチドリンカーは、それぞれのポリペプチドが、その二次構造および三次構造に折りたたまれるのを確実にするのに十分な距離で、成分を分離することができる。そのようなペプチドリンカー配列は、本明細書に記載され当該技術分野において周知である標準的な技法を使用して、コンジュゲート（例えば、融合タンパク質）に組み込まれ得る。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）可撓性の伸長したコンフォメーションを採用することができること、（２）第１および第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用することができないこと、ならびに（３）ポリペプチドの機能性エピトープと反応し得る疎水性残基も荷電残基もないこと。リンカーとして有益に用いることができるアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６， １９８５、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：８２５８－８２６２， １９８６、米国特許第４，９３５，２３３号、および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものが挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、ペプチドリンカーは、約１～５個のアミノ酸、５～１０個のアミノ酸、５～２５個のアミノ酸、５～５０個のアミノ酸、１０～２５個のアミノ酸、１０～５０個のアミノ酸、１０～１００個のアミノ酸、または任意の介在範囲のアミノ酸である。他の例示的な実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが約１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはそれより多くのアミノ酸を含む。特定のリンカーは、約１～２００個のアミノ酸、１～１５０個のアミノ酸、１～１００個のアミノ酸、１～９０個のアミノ酸、１～８０個のアミノ酸、１～７０個のアミノ酸、１～６０個のアミノ酸、１～５０個のアミノ酸、１～４０個のアミノ酸、１～３０個のアミノ酸、１～２０個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸、１～５個のアミノ酸、１～４個のアミノ酸、１～３個のアミノ酸、または約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、またはそれより多くのアミノ酸の全アミノ酸長を有し得る。
ペプチドリンカーは、本明細書の他の箇所に記載され当該技術分野において公知である、任意の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸アナログ、および／またはアミノ酸模倣体を利用し得る。リンカーとして有益に用いることができるある特定のアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６， １９８５、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ． ８３：８２５８－８２６２， １９８６、米国特許第４，９３５，２３３号、および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものが挙げられる。特定のペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｓｎ残基を含有する。他のほぼ中性のアミノ酸、例えば、ＴｈｒおよびＡｌａもまた、所望される場合、ペプチドリンカー配列において用いることができる。これらおよび関連するアミノ酸の他の組合せは、当業者には明らかであろう。
具体的な実施形態では、リンカー配列は、３つのグリシン残基を含む、Ｇｌｙ３リンカー配列を含む。特定の実施形態では、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合性部位およびペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータープログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ， ＰＮＡＳ． ９０：２２５６－２２６０， １９９３およびＰＮＡＳ． ９１：１１０９９－１１１０３， １９９４）、またはファージディスプレイ法によって、合理的に設計することができる。
ペプチドリンカーは、生理学的に安定であり得るか、または放出可能なリンカー、例えば、生理学的に分解可能もしくは酵素的に分解可能なリンカー（例えば、タンパク質分解により切断可能なリンカー）を含み得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の放出可能なリンカーは、コンジュゲートのより短い半減期およびより急速なクリアランスをもたらし得る。これらおよび関連する実施形態を使用して、例えば、血流中におけるｐ９７コンジュゲートの溶解度および血液循環期間を強化し、同時に、血流中に（またはＢＢＢを越えて）薬剤を送達することができるが、リンカーの分解の後に、ｐ９７配列が実質的に含まれないようにすることができる。これらの態様は、ポリペプチドまたは他の薬剤が、ｐ９７配列に恒久的にコンジュゲートされた場合に、低減された活性を呈する事例において、特に有用である。本明細書に提供されるリンカーを使用することにより、そのような抗体は、コンジュゲートされた形態にある場合に、治療活性を維持することができる。これらおよび他の手段において、ｐ９７コンジュゲートの特性は、抗体の経時的な生体活性および循環半減期のバランスを取るように、より効果的に適合させることができる。
本発明の特定の実施形態での使用に好適な酵素的に分解可能な連結としては、これらに限定されないが、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、またはサブチリジン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）など、セリンプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列が挙げられる。
本発明の特定の実施形態での使用に好適な酵素的に分解可能な連結としてはまた、コラゲナーゼ、ストロメリシン、およびゼラチナーゼなど、マトリックスメタロプロテイナーゼによって切断することができるアミノ酸配列が挙げられる。
本発明の特定の実施形態での使用に好適な酵素的に分解可能な連結はまた、アンジオテンシン変換酵素によって切断することができるアミノ酸配列が挙げられる。
本発明の特定の実施形態での使用に好適な酵素的に分解可能な連結はまた、カテプシンＢによって分解することができるアミノ酸配列が挙げられる。
ある特定の実施形態では、しかしながら、非ペプチドまたはペプチドリンカーのうちのいずれか１つまたは複数は、必要に応じたものである。例えば、リンカー配列は、第１および第２のポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、立体障害を防止するために使用することができる非必須Ｎ末端および／または（末端のアミノ酸領域を有する場合、融合タンパク質において必要とされない場合がある。
本明細書に記載されるｐ９７ポリペプチドおよびｐ９７ポリペプチドコンジュゲートの機能的特性は、例えば、親和性／結合アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、競合的阻害アッセイ）、細胞傷害性アッセイ、細胞生存性アッセイ、細胞増殖もしくは分化アッセイ、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏモデルを使用したがん細胞および／もしくは腫瘍成長阻害を含む、当業者に公知の様々な方法を使用して、評価することができる。例えば、本明細書に記載されるコンジュゲートは、血液脳関門を越えた輸送速度を含め、受容体内部移行、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの有効性などに対する効果に関して試験され得る。そのようなアッセイは、当業者に公知の十分に確立されたプロトコール（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． Ｉｎｃ． ＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， ＮＹ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ： Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａｄａ Ｍ． Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄａｖｉｄ Ｈ． Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｅｔｈａｎ Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， ＮＹを参照されたい）、または市販入手可能なキットを使用して、行うことができる。
使用方法および医薬組成物
本発明のある特定の実施形態は、本明細書に記載のｐ９７ポリペプチドおよびｐ９７コンジュゲートの組成物を使用する方法に関する。そのような方法の例は、例えば、前頭側頭型認知症の処置のためのｐ９７コンジュゲートの使用を含む処置方法および診断方法を含む。本発明のｐ９７コンジュゲートの投与を、前頭側頭型認知症を処置するための他の治療と共に含む併用療法を使用してもよい。
したがって、ある特定の実施形態は、本明細書に記載のｐ９７コンジュゲートを含む組成物を投与するステップを含む、それを必要とする被験体を処置する方法を含む。本明細書に記載のｐ９７コンジュゲートを含む組成物を投与するステップを含む、被験体の神経系（例えば、中枢神経系組織）に薬剤を送達する方法も含まれる。これらのおよび関連実施形態のいくつかでは、方法は、中枢神経系組織に薬剤を送達する速度を、例えば、単独で薬剤を含む組成物による送達と比べて、上昇させる。
一部の事例では、被験体は、ＣＮＳの疾患、障害または状態に罹患しており、末梢組織と比べてＣＮＳ組織への、治療剤の脳血液関門を越える送達の増加は、例えば、末梢組織への薬剤の曝露に関連する副作用を低減させることにより、処置を向上させることができる。ＣＮＳの例示的な疾患、障害および状態には、リソソーム蓄積症、例えばゴーシェ病が含まれる。
一部の事例では、被験体は、１つまたは複数のリソソーム蓄積症を有するか、または有するリスクがある。したがって、ある特定の方法は、それを必要とする被験体におけるリソソーム蓄積症、必要に応じて中枢神経系に関連するそれらのリソソーム蓄積症の処置に関する。例示的なリソソーム蓄積症としては、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪性肉芽腫症、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシスＩ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ゴーシェ病、グロボイド細胞型白質ジストロフィー、クラッベ病、グリコーゲン蓄積症ＩＩ、ポンペ病、ＧＭ１－ガングリオシドーシス、ＧＭ１－ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩ型、テイサックス病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホフ病、ＧＭ２－ガングリオシドーシス、アルファ－マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、ベータ－マンノシドーシス、－マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシスＩ／ＩＩ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩＩ型細胞疾患、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽性ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型、サンフィリッポ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖症ＩＶＡ型モルキオ症候群、ムコ多糖症ＩＶＢ型モルキオ症候群、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖症ＩＸ型、マルチプルスルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ１バッテン病、ニーマンピック病Ａ／Ｂ型、ニーマンピック病、ニーマンピック病Ｃ１型、ニーマンピック病Ｃ２型、濃化異骨症、シンドラー病Ｉ／ＩＩ型、シンドラー病、およびシアル酸蓄積症が挙げられる。これらおよび関連する実施形態では、ｐ９７ポリペプチドを、本明細書に記載されるようにリソソーム蓄積症に関連する１つまたは複数のポリペプチドにコンジュゲートさせることができる。
一部の事例では、被験体は、ＣＮＳの疾患、障害または状態を有し、末梢組織と比べてＣＮＳ組織への治療剤の脳血液関門を越える送達の増加は、例えば、プログラニュリンレベルを増加もしくは回復させることによって、またはＲＮＡ凝集体、ジペプチドリピートタンパク質、もしくはタウタンパク質／沈着物／封入体の蓄積を減少させることによって処置を改善することができる。ＣＮＳの例示的な疾患、障害および状態としては、前頭側頭型認知症、神経セロイドリポフスチン症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソニズム、およびアルツハイマー病が挙げられる。
一部の事例では、被験体は、遺伝子、例えばＧＲＮ、ＭＡＰＴ、およびＣ９ｏｒｆ７２の変異に関連する１つまたは複数の疾患を有するか、または有するリスクがある。したがって、ある特定の方法は、それを必要とする被験体におけるＧＲＮ、ＭＡＰＴ、またはＣ９ｏｒｆ７２遺伝子変異関連疾患の処置に関し、必要に応じて、それらのＧＲＮ、ＭＡＰＴ、またはＣ９ｏｒｆ７２遺伝子変異関連疾患は、中枢神経系に影響を及ぼす。例示的なＧＲＮ、ＭＡＰＴ、またはＣ９ｏｒｆ７２遺伝子変異関連疾患としては、前頭側頭型認知症、神経セロイドリポフスチン症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソニズム、およびアルツハイマー病が挙げられる。
本明細書に記載の疾患または状態のうちの１つまたは複数に罹患している被験体を同定するための方法は、当技術分野で公知である。
被験体の臓器または組織成分をイメージングするための方法であって、（ａ）ｐ９７ポリペプチドが検出可能な実体にコンジュゲートされている、ヒトｐ９７（メラノトランスフェリン）ポリペプチドまたはそのバリアントを含む組成物を、被験体に投与するステップと、（ｂ）被験体、臓器または組織中の検出可能な実体を可視化するステップとを含む方法も含まれる。
特定の実施形態では、臓器または組織コンパートメントは、中枢神経系（例えば、脳、脳幹、脊髄）を含む。特定の実施形態では、臓器または組織コンパートメントは、脳またはその一部分、例えば、脳の実質を含む。
様々な方法を利用して、被験体、臓器または組織中の検出可能な実体を可視化することができる。例示的な非侵襲的方法としては、Ｘ線撮影、例えば、透視および投影放射線写真；Ｘ線ＣＴスキャンを利用するのか、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を利用するのか、または単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を利用するのかを問わず、ＣＴスキャンまたはＣＡＴスキャン（コンピューター断層撮影（ＣＴ）またはコンピューター体軸断層撮影（ＣＡＴ））；ならびにある特定のタイプの磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、特に、造影剤を利用するものが、これらの組合せを含めて、挙げられる。単に例として、ＰＥＴは、陽電子放出造影剤または放射性同位体、例えば１８Ｆを用いて行うことができ、ＳＰＥＣＴは、ガンマ線放射造影剤または放射性同位体を用いて行うことができ、ＭＲＩは、造影剤または放射性同位体を用いて行うことができる。これらの例示的な造影剤または放射性同位体のいずれか１つまたは複数を、ｐ９７ポリペプチドにコンジュゲートし、または別様に組み込み、イメージングのために被験体に投与することができる。
例えば、ｐ９７ポリペプチドを、これらの放射性同位体のうちの１つまたは複数で直接標識することができ、あるいはこれらの放射性同位体造影剤のうちの１つもしくは複数を含む分子（例えば、小分子）、または本明細書に記載の任意の他のものに、コンジュゲートすることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ使用のために、例えば、ヒト疾患の処置、医用イメージング、または試験のために、本明細書に記載のコンジュゲートは、一般に、投与前に医薬組成物に組み込まれる。医薬組成物は、本明細書に記載のｐ９７ポリペプチドまたはコンジュゲートのうちの１つまたは複数を、生理的に許容される担体または賦形剤と組み合わせて含む。
医薬組成物を調製するために、ｐ９７ポリペプチドまたはコンジュゲートのうちの１つまたは複数の有効量または所望される量が、特定の投与方法に好適になるように当業者に公知の任意の医薬担体または賦形剤と混合される。医薬担体は、液体、半液体または固体であることがある。非経口、皮内、皮下または局所的適用に使用される溶液または懸濁物は、例えば、滅菌希釈剤（例えば、水）、食塩溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水；ＰＢＳ）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗微生物剤（例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウム）およびキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸およびリン酸）を含み得る。静脈内投与される場合、好適な担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）；ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびこれらの混合物などの増粘および可溶化剤を含有する溶液が挙げられる。
純粋な形態でのまたは適切な医薬組成物での、本明細書に記載のポリペプチドおよびコンジュゲートの投与は、同様の有用性に役立つ薬剤についての受け入れられている投与方法のいずれかによって行うことができる。医薬組成物を、ポリペプチドまたはコンジュゲートまたはコンジュゲート含有組成物を適切な生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と合わせることにより調製することができ、固体、半固体、液体または気体形態の調製物、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射剤、吸入剤、ゲル、マイクロスフェアおよびエアロゾルに製剤化することができる。加えて、他の薬学的に活性な成分（本明細書の他の箇所に記載の他の抗がん剤を含む）ならびに／または適切な賦形剤、例えば、塩、緩衝液および安定剤が、組成物中に存在することもあるが、存在しなくてもよい。
投与は、経口、非経口、経鼻、静脈内、皮内、皮下または局所的経路を含む、様々な異なる経路により果たすことができる。好ましい投与方法は、処置または予防される状態の性質に依存する。
担体は、例えば、利用される投薬量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物にとって非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含み得る。多くの場合、生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理的に許容される担体の例としては、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポロクサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））などが挙げられる。
ある特定の態様では、ｐ９７ポリペプチド配列および薬剤は、各々、個別にまたは既存コンジュゲートとして、粒子、例えば、ナノ粒子、ビーズ、脂質製剤、脂質粒子、もしくはリポソーム、例えばイムノリポソームに結合されるか、またはこれらの中に封入される。例えば、特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、粒子の表面に結合され、目的の薬剤は、粒子の表面に結合される、および／または粒子内に封入される。これらのおよび関連実施形態のうちの一部では、ｐ９７ポリペプチドおよび薬剤は、専ら粒子（例えば、ナノ粒子、リポソーム）自体を介して互いに共有結合で連結または動作可能に連結され、いずれの他の方法でも互いに共有結合で連結されない；すなわち、それらは、同じ粒子に個別に結合される。他の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドおよび薬剤は、先ず、本明細書に記載されるように（例えば、リンカー分子を介して）互いに共有結合でまたは非共有結合でコンジュゲートされ、次いで、粒子（例えば、イムノリポソーム、ナノ粒子）に結合される、またはそのような粒子内に封入される。特定の実施形態では、粒子は、リポソームであり、組成物は、１つまたは複数のｐ９７ポリペプチドと、目的の１つまたは複数の薬剤と、リポソームを形成するための脂質の混合物（例えば、リン脂質、界面活性剤特性を有する混合脂質鎖）とを含む。一部の態様では、ｐ９７ポリペプチドおよび薬剤は、脂質／リポソーム混合物と個別に混合され、したがって、リポソーム構造の形成により、共有結合性コンジュゲーションを必要とせずにｐ９７ポリペプチドおよび薬剤が動作可能に連結される。他の態様では、ｐ９７ポリペプチドおよび薬剤は、先ず、本明細書に記載されるように互いに共有結合でまたは非共有結合でコンジュゲートされ、次いで、リポソームを形成するための脂質と混合される。ｐ９７ポリペプチド、薬剤、またはｐ９７－薬剤コンジュゲートを、例えば、コアセルベーション技術によりもしくは界面重合により、調製されたマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン－マイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、それぞれ）内に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内に、またはマクロエマルジョン内に捕捉することができる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｌｏ， Ａ．， Ｅｄ．， （１９８０）において開示されている。粒子またはリポソームは、他の治療または診断剤、例えば細胞傷害剤をさらに含み得る。
正確な投薬量および処置期間は、処置される疾患の関数であり、正確な投薬量および処置期間を、公知の試験プロトコールを使用して実験により決定することができ、または当技術分野で公知のモデル系で組成物を試験し、そこから外挿することにより決定することができる。対照臨床試験を行うこともできる。投薬量は、緩和される状態の重症度によっても変わり得る。医薬組成物は、一般に、望ましくない副作用を最小限に抑えて治療有用効果を発揮するように、製剤化され、投与される。組成物は、１回で投与されることもあり、または多数のより小さい用量に分割されて時間の間隔を空けて投与されることもある。いずれの特定の被験体についても、具体的な投薬量レジメンは、個々の必要に応じて経時的に調整され得る。
したがって、これらのおよび関連医薬組成物を投与する典型的な経路は、限定ではないが、経口、局所的、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸、膣および鼻内経路を含む。本明細書で使用される場合の非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術を含む。本発明のある特定の実施形態による医薬組成物は、それらの中に含有される活性成分が患者への組成物の投与時に体内に吸収されて利用され得ることを可能にするように製剤化される。被験体または患者に投与されることになる組成物は、１つまたは複数の投薬単位の形態をとることができ、例えば、錠剤が単一投薬単位であることもあり、エアロゾル形態での本明細書に記載のコンジュゲートの容器が複数の投薬単位を保持することもある。そのような剤形の実際の調製方法は、当業者には公知である、または分かるであろう；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０００）を参照されたい。いずれにせよ、投与される組成物は、目的の疾患または状態の処置のための、本明細書に記載のｐ９７ポリペプチド、薬剤またはコンジュゲートの治療有効量を含有することになる。
医薬組成物は、固体の形態であることもあり、または液体の形態であることもある。一実施形態では、組成物が例えば錠剤または粉末形態であるために、担体は粒状である。組成物が、例えば、経口油、注射可能な液体、または例えば吸入投与に有用であるエアロゾルであると、担体は液体であり得る。経口投与が意図される場合、医薬組成物は、好ましくは、固体形態または液体形態のどちらかであり、半固体、半液体、懸濁物およびゲル形態は、本明細書で固体または液体のどちらかと見なされる形態の中に含まれる。
経口投与用の固体組成物として、医薬組成物を、粉末、顆粒、圧縮錠剤、丸剤、カプセル、チューインガム、オブラートなどに製剤化することができる。そのような固体組成物は、１つまたは複数の不活性希釈剤または可食担体を通常は含有することになる。加えて、次のうちの１つまたは複数が、存在することもある：結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプン、ラクトースまたはデキストリン；崩壊剤、例えば、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、トウモロコシデンプンなど；滑沢剤、例えば、ステアリン鎖マグネシウムまたはステロテックス；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリン；矯味矯臭剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料；および着色剤。医薬組成物が、カプセル、例えばゼラチンカプセルの形態である場合、その医薬組成物は、上記のタイプの材料に加えて、液体担体、例えば、ポリエチレングリコールまたは油を含有し得る。
医薬組成物は、液体形態、例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョンまたは懸濁物であり得る。液体は、２つの例として、経口投与用または注射による送達用であり得る。経口投与が意図される場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味剤、保存薬、色素／着色剤および風味増強剤のうちの１つまたは複数を含有する。注射により投与することが意図される組成物の場合、界面活性剤、保存薬、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝液、安定剤および等張剤のうちの１つまたは複数を含み得る。
液体医薬組成物は、それらが溶液であるか、懸濁物であるか、他の同様の形態であるかを問わず、次のアジュバントのうちの１つまたは複数を含み得る：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、固定油、例えば、溶媒または懸濁媒体として役立ち得る合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸；および張度を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数用量バイアルに封入することができる。生理食塩水は、好ましいアジュバントである。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
非経口投与または経口投与のどちらかが意図される液体医薬組成物は、好適な投薬量が得られることになるように、本明細書で開示されるようなｐ９７ポリペプチドまたはコンジュゲートの量を含有するべきである。通常は、この量は、組成物中に少なくとも０．０１％の目的の薬剤である。経口投与が意図される場合、この量を、組成物の重量の０．１％～約７０％の間になるように変動させることができる。ある特定の経口医薬組成物は、約４％～約７５％の間の目的の薬剤を含有する。ある特定の実施形態では、本発明による医薬組成物および調製物は、非経口投薬単位が希釈前に０．０１～１０重量％の間の目的の薬剤を含有するように調製される。
医薬組成物は、局所的投与が意図されることもあり、その場合、担体は、溶液、エマルジョン、軟膏またはゲル基剤を適切に含み得る。基剤は、例えば、次のうちの１つまたは複数を含み得る：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤、例えば水およびアルコール、ならびに乳化剤および安定剤。増粘剤が、局所的投与用の医薬組成物中に存在することもある。経皮投与が意図される場合、組成物は、経皮パッチまたはイオン導入デバイスを含み得る。
医薬組成物は、直腸内で融解されて薬物を放出することになる形態、例えば座薬の形態での、直腸投与が意図されることもある。直腸投与用の組成物は、好適な無刺激賦形剤として油性基剤を含有し得る。そのような基剤としては、限定ではないが、ラノリン、カカオ脂、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
医薬組成物は、固体または液体投薬単位の物理的形態を改良するための様々な材料を含み得る。例えば、組成物は、活性成分の周囲にコーティングシェルを形成する材料を含み得る。コーティングシェルを形成する材料は、通常は不活性であり、例えば、糖、セラック、および他の腸溶コーティング剤から選択され得る。あるいは、活性成分は、ゼラチンカプセルに封入されることもある。固体または液体形態の医薬組成物は、コンジュゲートまたは薬剤に結合し、それによって化合物の送達を補助する薬剤を含み得る。この能力で作用し得る好適な薬剤は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、１つもしくは複数のタンパク質、またはリポソームを含む。
医薬組成物は、エアロゾルとして投与することができる投薬単位から本質的になることもある。エアロゾルという用語は、コロイド的性質のものから、加圧パッケージからなる系までの幅がある、様々な系を示すために使用される。送達は、液化もしくは圧縮ガスによることもあり、または活性成分を分配する好適なポンプシステムによることもある。エアロゾルは、活性成分を送達するために単相、二相または三相系で送達されることがある。
エアロゾルの送達は、必要な容器、活性化剤、弁、サブコンテナなどを含むことがあり、これらが一緒にキットを形成し得る。当業者は、過度の実験をしなくても、好ましいエアロゾルを決定することができる。
本明細書に記載されるようなコンジュゲートを含む組成物を、時限放出製剤またはコーティングなどの、コンジュゲートを身体から急速に排出されないように保護する担体を用いて調製することができる。そのような担体は、放出制御製剤、例えば、これらに限定されないが、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系、ならびに生体内分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、および当業者に公知の他のものを含む。
医薬組成物を、製薬技術分野で周知の方法論により調製することができる。例えば、注射により投与されることが意図される医薬組成物は、本明細書に記載されるようなコンジュゲートと必要に応じて塩、緩衝液および／または安定剤のうちの１つまたは複数とを含む組成物を、溶液を形成するための滅菌蒸留水と合わせることにより、調製することができる。界面活性剤が、均一な溶液または懸濁物の形成を助長するために添加されることもある。界面活性剤は、コンジュゲートと非共有結合的に相互作用して水性送達系へのコンジュゲートの溶解または均一な懸濁を助長する化合物である。
組成物を治療有効量で投与することができ、この治療有効量は、利用される具体的な化合物（例えば、コンジュゲート）の活性；化合物の代謝安定性および作用の長さ；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別および食事；投与の方法および時間；排泄率；薬物の組合せ；特定の障害または状態の重症度；ならびに治療を受けている被験体を含む、様々な因子に依存して変わることになる。
一般に、治療有効一日用量は、（７０ｋｇの哺乳動物について）約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約０．０７ｍｇ）～約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約７．０ｇ）であり；好ましくは、治療有効用量は、（７０ｋｇの哺乳動物について）約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約０．７ｍｇ）～約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約３．５ｇ）であり；より好ましくは、治療有効用量は、（７０ｋｇの哺乳動物について）約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約７０ｍｇ）～約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約１．７５ｇ）である。
例証するために以下の実施例を提供するが、以下の実施例は、後続の特許請求の範囲に記載の範囲を限定することを意図したものではない。
（実施例１－融合）
ｐ９７断片、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）を、所望の成熟酵素のＮ末端の最初のアミノ酸と、リンカー配列、例えば（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２または（ＥＡ３Ｋ）３を通じて遺伝子融合する。次いで、ｐ９７断片－酵素配列を含有するＤＮＡプラスミドを哺乳動物発現ベクターにクローニングし、次いでそれをタンパク質産生のために細胞にトランスフェクトする。次いで、トランスフェクション産生から条件培地を回収し、親和性クロマトグラフィーによって精製する。
（実施例２－コンジュゲーション）
ｐ９７断片、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号２）と所望の活性剤またはタンパク質を、コンジュゲーション技法、例えば、ＳｏｌｕＬｉｎｋ（商標）バイオコンジュゲーション法またはマレイミド－チオール相互作用法を利用してコンジュゲートする（Ｓｏｌｕｌｉｎｋバイオコンジュゲーション製品の情報および利用可能性に関しては例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｒｉｌｉｎｋｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｓｏｌｕｌｉｎｋ／を参照されたい）。ＳｏｌｕＬｉｎｋバイオコンジュゲーションを、４ＦＢ架橋剤を用いたｐ９７断片の改変およびＨｙＮｉｃ架橋剤を用いた酵素の改変によって実施する。２つの改変された生体分子を混合することにより、ＨｙＮｉｃ改変酵素と４ＦＢ改変ｐ９７断片の反応によって形成される、安定な、ＵＶにより追跡可能な結合の形成がもたらされる。マレイミド－チオールコンジュゲーションを、Ｎ－（β－マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）を用いて酵素を改変し、それによりマレイミド含有酵素を生じさせること、ならびにｐ９７断片のＣ末端にシステインを付加し、その後、ｐ９７断片をチオール改変することによって実施する。次いで、マレイミド含有酵素とチオール含有ｐ９７断片を反応させ、反応をシステインによってクエンチする。
参照による組込み
本明細書で言及する、特許文書（訂正証明書を含む）、特許出願文書、科学論文、政府報告書、ウェブサイトおよび他の参考文献の各々の全開示は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。専門用語に齟齬がある場合、本明細書が優先する。本明細書における参考文献の引用を、そのような参考文献が本発明の先行技術であるということの承認と見なすべきではない。
等価物
本発明の趣旨またはその本質的特徴から逸脱することなく他の特定の形態で本発明を具現化することができる。上記の実施形態は、あらゆる点で、本明細書に記載の本発明を制限するものではなく説明するものと見なされたい。本発明の方法および組成物の様々な実施形態では、含むという用語が、方法の列挙されているステップまたは組成物の成分に関して使用されている場合、方法および組成物が、列挙されているステップもしくは成分から本質的になるか、またはそれからなることも企図される。さらに、ステップの順序、またはある特定の動作を行うための順序は、本発明が作動可能であり続ける限り重要ではないことを理解されたい。さらに、２つまたはそれより多くのステップまたは動作を同時に行うことができる。
本明細書では、単数形は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形も含む。別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。齟齬がある場合、本明細書が優先する。
さらに、ある特定の事例では、混合によって、ある特定の成分がさらに反応することまたはさらなる材料に変換されることがあるため、組成物が、混合する前の成分で構成されていると記載されることがあることを認識されたい。
当業者は、通例と同程度の実験を使用して、本明細書に記載の特定の手順の非常に多くの均等物を認識することまたは突き止めることができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であると見なされ、以下の特許請求の範囲に包含される。
本明細書で使用されるすべてのパーセンテージおよび比率は、別段の指示がない限り、重量によるものである。物体の質量は、多くの場合、日常的な用法でおよび最も一般的な科学的目的のためにその重量として言及されるが、質量は、技術的には、物体の物質量を指し、これに対して重量は、重力に起因して物体が受ける力を指すことが認識される。また、一般的な用法では、物体の「重量」（質量）は、物体をはかり（scale）または天秤
（balance）で「重量測定」（質量測定）して決定するものである。

Claims (78)

  1. 前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を処置する、予防する、改善する、そのリスクを低減する、またはその発症もしくは進行を緩徐化する方法であって、ｐ９７ポリペプチドまたはその断片にカップリングされた前頭側頭型認知症の処置に好適な活性剤を含む治療用ペイロード（すなわち、組成物）を、それを必要とする被験体に投与することを含み、前記投与が、前記被験体の血液脳関門を越える前記治療用ペイロードの輸送を促進する、方法。
  2. 前記被験体が、哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ｐ９７ポリペプチドが、長さが最大約３００個のアミノ酸を含み、前記ポリペプチドが、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）または配列番号２～１９のうちのいずれか１つもしくは複数と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記ｐ９７ポリペプチドが、配列番号１により定義されるような隣接するＣ末端および／またはＮ末端配列を必要に応じて含む、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）または配列番号２～１９のうちのいずれか１つもしくは複数を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  6. 前記ｐ９７ポリペプチドが、配列番号１により定義されるような任意の介在配列を必要に応じて含む、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）または配列番号２～１９の２、３、４または５個のアミノ酸を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  7. 前記ｐ９７ポリペプチドが、配列番号１３および／または１４の一方または両方を含み、必要に応じて、配列番号１によって定義される隣接するＣ末端および／またはＮ末端配列を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  8. 前記ｐ９７ポリペプチドが、配列番号１３および／または１４の一方または両方を含み、必要に応じて配列番号１によって定義される介在配列を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  9. 前記ｐ９７ポリペプチドが、長さが最大約２５０、２００、１５０、１００、５０、２０、１５または１０個のアミノ酸を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記活性剤が、リンカーを用いて前記ｐ９７ポリペプチドまたはその断片にカップリングされている、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記ポリペプチドまたはその断片が、配列番号１３［ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ］に対応するペプチド、あるいはそれに対して少なくとも約７０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約７５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９９％もしくはそれより高い相同性を有する配列を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記活性剤が、リソソーム常在タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記活性剤が、細胞成長、細胞生存、細胞修復、および／または炎症をモジュレートすることができる、請求項１に記載の方法。
  14. 前記活性剤が、前記被験体の脳組織における細胞成長、細胞生存、細胞修復、および／または炎症をモジュレートすることができる、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記活性剤が、リソソーム機能障害をモジュレートする、予防する、最小限にする、または反転させることができる、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記活性剤が、プログラニュリンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記活性剤が、ヒトプログラニュリンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記活性剤が、組換えプログラニュリン（その活性形態）またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系において産生される、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生される、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
  21. 前記活性剤がグラニュリンである、請求項１に記載の方法。
  22. 前記活性剤が、プログラニュリンの調節因子またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１に記載の方法。
  23. 前記活性剤がソーティングタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  24. 前記活性剤が、ソルチリン－１またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１に記載の方法。
  25. 前記活性剤が、ヒトソルチリン－１またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記活性剤が、組換えソルチリン－１（その活性形態）またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系において産生される、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
  28. 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生される、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
  29. 前記活性剤が、リソソーム輸送を容易にすることができる、または膜周囲から脂質基質を単離することができる、および／または脂質をリソソームの可溶性分解酵素により近づけることができる薬剤である、請求項１に記載の方法。
  30. 前記活性剤が、プロサポシンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項１に記載の方法。
  31. 前記活性剤が、ヒトプロサポシンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記活性剤が、組換えプロサポシン（その活性形態）またはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系において産生される、請求項３０から３２のいずれかに記載の方法。
  34. 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生される、請求項３０から３２のいずれかに記載の方法。
  35. 前記活性剤が、小分子薬（すなわち、約１０００グラム／モル未満、または約７５０グラム／モル未満、または約５００グラム／モル未満の分子量を一般に有する分子薬）である、請求項１に記載の方法。
  36. 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、行動異常型前頭側頭型認知症（ｂｖＦＴＤ）、原発性進行性失語（ＰＰＡ）［意味型原発性進行性失語（ｓｖＰＰＡ）、非流暢／非文法型原発性進行性失語（ｎｆｖＰＰＡ）を含む］、ならびに関連する前頭側頭型認知症障害［運動ニューロン病を伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤ－ＭＮＤ）、進行性核上性麻痺症候群（ｓｖＰＰＡ）、および大脳皮質基底核症候群（ＣＢＳ）を含む］からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  37. 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、ヒト遺伝子の常染色体変異に関連するまたはそれによって引き起こされる認知症から選択される、請求項１または３６に記載の方法。
  38. 前記変異が、プログラニュリン遺伝子（ＧＲＮ）、微小管結合タンパク質タウ遺伝子（ＭＡＰＴ）、または９番染色体オープンリーディングフレーム７２遺伝子（Ｃ９ｏｒｆ７２）からなる群から選択されるヒト遺伝子の変異である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、プログラニュリンの欠損または不在に関連している、請求項１に記載の方法。
  40. 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、脳におけるプログラニュリンの欠損または不在に関連している、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、ＲＮＡ凝集体および／またはジペプチドリピートタンパク質の蓄積に関連している、請求項１に記載の方法。
  42. 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、脳におけるＲＮＡ凝集体および／またはジペプチドリピートタンパク質の蓄積に関連している、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、タウの３リピート（３Ｒ－タウ）および／または４リピート（４Ｒ－タウ）アイソフォームを含むニューロンおよびグリア封入体の蓄積に関連している、請求項１に記載の方法。
  44. 前記前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が、脳におけるタウの３リピート（３Ｒ－タウ）および／または４リピート（４Ｒ－タウ）アイソフォームを含むニューロンおよびグリア封入体の蓄積に関連している、請求項４３に記載の方法。
  45. 脳におけるＲＮＡ凝集体および／またはジペプチドリピートタンパク質の蓄積を減少させるための、請求項１に記載の方法。
  46. 脳における３Ｒ－タウおよび／または４Ｒ－タウを含むニューロンおよびグリア封入体の形成または蓄積を予防または緩徐化するための、請求項１に記載の方法。
  47. 脳における異常なタンパク質の発現、形成、もしくは蓄積を分解する、減少させる、予防する、および／もしくは緩徐化するための、ならびに／または脳における異常な量の正常なタンパク質の発現、形成、もしくは蓄積を分解する、減少させる、予防する、もしくは緩徐化するための、請求項１に記載の方法。
  48. 前記治療用ペイロード（すなわち、組成物）が、１日に少なくとも約１回、または少なくとも約１日おき、または１週間に少なくとも約２回、または１週間に少なくとも約１回、または２週間おきに少なくとも約１回、または１カ月に少なくとも約１回（または３０日おきに約１回）からなる群から選択されるレジメンに従って投与される、請求項１に記載の方法。
  49. 前記被験体が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）についての少なくとも１つの臨床マーカー、評価または評定の改善を呈し、必要に応じて、前記改善が、前記方法の適用前のベースラインと比較して、少なくとも約５％である、または少なくとも約１０％である、または少なくとも約１５％である、または少なくとも約２０％である、または少なくとも約２５％である、請求項１から４８のいずれかに記載の方法。
  50. ｐ９７ポリペプチドまたはその断片にカップリングされた前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置に好適な活性剤を含む治療用ペイロードを、それを必要とする被験体に投与することを含む、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を処置する、予防する、改善する、そのリスクを低減する、またはその発症もしくは進行を緩徐化するための医薬の製造における使用のための組成物であって、前記投与が、前記被験体の血液脳関門を越える前記治療用ペイロードの輸送を促進する、組成物。
  51. コンジュゲートｐ９７－活性剤コンジュゲートを形成するように、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置に好適な活性剤にコンジュゲートされたｐ９７またはその断片を含むコンジュゲートであって、前記ｐ９７断片が、ＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）、あるいはそれに対して少なくとも約７０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約７５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９９％もしくはそれより高い相同性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、コンジュゲート。
  52. 前記ｐ９７断片が、１つまたは複数の末端システインおよび／またはチロシンを有する、請求項５１に記載のコンジュゲート。
  53. 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端チロシンを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
  54. 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端システインを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
  55. 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端チロシンを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
  56. 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端システインを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
  57. 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端チロシンシステインジペプチドを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
  58. 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端チロシンシステインジペプチドを有するＤＳＳＨＡＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
  59. コンジュゲートｐ９７－活性剤コンジュゲートを形成するように、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置に好適な活性剤にコンジュゲートされたｐ９７またはその断片を含むコンジュゲートであって、前記ｐ９７断片が、ＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）、あるいはそれに対して少なくとも約７０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約７５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約８５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９０％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９５％もしくはそれより高い相同性を有する、またはそれに対して少なくとも約９９％もしくはそれより高い相同性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、コンジュゲート。
  60. 前記ｐ９７断片が、１つまたは複数の末端システインおよび／またはチロシンを有する、請求項５９に記載のコンジュゲート。
  61. 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端チロシンを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
  62. 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端システインを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
  63. 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端チロシンを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
  64. 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端システインを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
  65. 前記ｐ９７断片が、Ｃ末端チロシンシステインジペプチドを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
  66. 前記ｐ９７断片が、Ｎ末端チロシンシステインジペプチドを有するＤＳＳＹＳＦＴＬＤＥＬＲ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記ｐ９７断片および前記活性剤が、長さが約１～２０個のアミノ酸であるペプチドリンカーによって分離されている、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
  67. 前記活性剤が、リソソーム常在タンパク質である、請求項５１から６６のいずれかに記載のコンジュゲート。
  68. 前記活性剤が、細胞発達、細胞増殖、組織炎症、および／またはリソソーム機能に関与する、請求項６７に記載のコンジュゲート。
  69. 前記活性剤が、前記被験体の脳組織における細胞発達、細胞増殖、組織炎症、および／またはリソソーム機能に関与する、請求項６８に記載のコンジュゲート。
  70. 前記活性剤が、プログラニュリン、ソルチリン－１、プロサポシンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項５１から６９のいずれかに記載のコンジュゲート。
  71. 前記活性剤が、ヒトプログラニュリン、ソルチリン－１、プロサポシンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項７０に記載のコンジュゲート。
  72. 前記活性剤が、組換えプログラニュリン、ソルチリン－１、プロサポシンまたはその誘導体、切断産物、もしくはアナログである、請求項７０または７１に記載のコンジュゲート。
  73. 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってヒト線維芽細胞系において産生される、請求項７０から７２のいずれかに記載のコンジュゲート。
  74. 前記活性剤が、遺伝子活性化技術によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において産生される、請求項７０から７２のいずれかに記載のコンジュゲート。
  75. 前記活性剤が、ＲＮＡ干渉剤である、請求項５１から６６のいずれかに記載のコンジュゲート。
  76. 前記活性剤が、ＲＮＡ凝集体、ジペプチドリピートタンパク質、またはタウｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の形成を低減する、阻害する、または予防することができる、請求項７５に記載のコンジュゲート。
  77. 前記活性剤が、被験体の脳組織におけるＲＮＡ凝集体、ジペプチドリピートタンパク質、またはタウｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の形成を低減する、阻害する、および／または予防することができる、請求項７６に記載のコンジュゲート。
  78. 前記活性剤が、小分子薬（すなわち、約１０００グラム／モル未満、または約７５０グラム／モル未満、または約５００グラム／モル未満の分子量を一般に有する分子薬）である、請求項５１から７７のいずれかに記載のコンジュゲート。
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