CN112512558A - 戈谢病的治疗 - Google Patents

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Abstract

公开了治疗有效载荷，所述治疗有效载荷包含与具有血脑屏障(BBB)转运活性的活性试剂偶联的p97片段，包括其变体和组合，以促进治疗或诊断试剂穿越BBB递送。治疗有效载荷可以在治疗戈谢病上是有效的。还公开了治疗戈谢病的方法和药物组合物。

Description

戈谢病的治疗
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且据此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称为20053PCT_ST25.txt。该文本文件约为7KB，于2019年5月18日创建，并将通过EFS-Web电子提交。
技术领域
本发明涉及治疗疾病的化合物，包括穿透血脑屏障的化合物。本发明还提供包含本发明化合物的药物组合物以及使用所述组合物治疗戈谢病的方法。
背景技术
克服将治疗剂运送至大脑特定区域的困难，代表治疗或诊断许多中枢神经系统(CNS)病症(包括大脑的那些)的主要挑战。在其神经保护作用中，血-脑屏障(BBB)的作用是阻止许多潜在的重要治疗剂向大脑运送。
原本可能对诊断和治疗有效的治疗剂不能以足够的量穿越BBB。据报道，所有治疗分子中超过95％不会穿越血脑屏障。因此，期望递送治疗剂以穿越(acouss)BBB治疗疾病。
戈谢病是一种常染色体隐性遗传的溶酶体贮积病，其特征在于溶酶体酶葡萄糖脑苷脂酶(GCase)的缺乏。白细胞和红细胞膜中的鞘糖脂降解后形成糖脂葡萄糖脑苷脂，GCase水解所述糖脂葡萄糖脑苷脂。这种酶的缺乏会导致葡萄糖脑苷脂大量积聚在位于戈谢患者肝脏、脾脏和骨髓中的吞噬细胞的溶酶体中。这些分子的积累会引起一系列临床表现，包括脾肿大、肝肿大、骨骼疾病、血小板减少和贫血。(Beutler等人，Gaucher disease；In:The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease(McGraw-Hill,Inc,纽约,1995)2625-2639页)。
当前针对戈谢病的可用治疗包括酶替代疗法和底物减少疗法。
酶替代疗法(ERT)平衡了戈谢病患者的低水平GCase，因此他们的身体可以分解GCase。ERT通常包括使患者大约每2周(在输注中心或家里)接受静脉(IV)输注。
美国食品和药物管理局(FDA)批准了针对戈谢病的ERT治疗，包括以下酶替代治疗药物：CerezymeTM(伊米苷酶(imiglucerase))，可从马萨诸塞州剑桥的GenzymeCorporation获得；可以从Shire Human Genetic Therapies,Inc.,Lexington,马萨诸塞州获得的VPRIVTM(维拉西酶α(velaglucerase alfa))；以及,以及从纽约州纽约PfizerLaboratories获得的ElelysoTM(塔利苷酶α(taliglucerase alfa))。
底物减少疗法(SRT)利用口服药物来减少人体产生的GCase量，从而减少过多的积聚。SRT会部分阻止人体产生GCase，GCase是在戈谢病患者体内堆积的脂肪化学物质。
目前有两种FDA批准的针对患有戈谢病的患者口服SRT药物：
CerdelgaTM(依利格鲁司他(eliglustat))，可从马萨诸塞州剑桥的GenzymeCorporation获得；和ZavescaTM(美格鲁特(miglustat))，可从加利福尼亚州，南旧金山的Actelion Pharmaceuticals US Inc.获得。
发明内容
根据本发明，提供在受试者中治疗戈谢病的方法，所述方法包括施用含有适合用于治疗戈谢病的活性试剂的治疗有效载荷，所述活性试剂偶联至某种p97片段使得活性试剂能够穿越BBB。根据本发明，所述治疗有效载荷与未偶联p97片段形式的活性试剂具有相似的药代动力学性质。
借助于本发明，现在有可能通过促进活性试剂穿越受试者血脑屏障的转运来治疗戈谢病。
在本发明的一个方面，提供一种治疗戈谢病的方法，其包括向受试者施用含有适合用于治疗戈谢病的活性试剂的治疗有效载荷，所述活性试剂偶联至基本上由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO:2)组成的p97片段，其中所述施用促进治疗有效载荷穿越受试者血脑屏障的转运。
在本发明的一个方面，所述活性试剂是人酶β-葡萄糖脑苷脂酶的类似物。
在本发明的一个方面，所述活性试剂通过基因活化技术在人成纤维细胞系中产生。
在本发明的一个方面，所述活性试剂是溶酶体酶、β-葡萄糖脑苷脂酶的重组活性形式。
在本发明的一个方面，所述活性试剂是葡萄糖基神经酰胺合酶抑制剂。
在本发明的一个方面，所述活性试剂选自伊米苷酶、维拉西酶α和塔利苷酶α。
在本发明的一个方面，所述活性试剂选自美格鲁特和依利格鲁司他及其药学上可接受的盐。
在本发明的一个方面，提供一种缀合物，其包含与适于治疗戈谢病的活性试剂缀合的p97片段，以形成p97-抗体缀合物，其中所述p97片段基本上由DSSHAFTLDELR(SEQ IDNO：2)组成。
在本发明的一个方面，所述p97片段具有一个或多个末端半胱氨酸和/或酪氨酸。
在本发明的一个方面，所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与C-末端酪氨酸组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
在本发明的一个方面，所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与C-末端半胱氨酸组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
在本发明的一个方面，所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与N-末端酪氨酸组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
在本发明的一个方面，所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与N-末端半胱氨酸组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
在本发明的一个方面，所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与C-末端酪氨酸半胱氨酸二肽组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
在本发明的一个方面，所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与N-末端酪氨酸半胱氨酸二肽组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
在本发明的某些方面，包括例如上述的一些或全部方面，p97片段DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)可以被p97片段DSSYSFTLDELR(SEQ ID NO：3)所取代。
具体实施方式
提供以下详细描述以帮助本领域技术人员实施本发明。在不脱离本公开的精神或范围的情况下，本领域普通技术人员可以对本文所述的实施方案进行修改和变化。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方案，而无意于进行限制。
如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下每个术语应具有以下含义。在整个申请中阐述了附加的定义。在本文中没有具体定义术语的情况下，则该术语被赋予本领域普通技术人员公认的含义，该含义为在描述其本发明中的用途的上下文中所使用的含义。
除非上下文明确指出，冠词“一(a)”和“一个(an)”是指该冠词的语法受试者中的一个或一个以上(即，至少一个)。举例来说，“一个元件”是指一个元件或一个以上元件。
术语“约”指值或组成在本领域普通技术人员所确定的特定值或组成的可接受的误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值或组成，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或多于1个标准偏差之内。可选择地，“约”可以表示多至10％或20％的范围(即，±10％或±20％)。例如，约3mg可包括在2.7mg至3.3mg(对于10％)或在2.4mg至3.6mg(对于20％)之间的任何数字。此外，特别是关于生物系统或过程，这些术语可以表示多至一个数量级或多至一个值的5倍。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”的含义应被认为在该特定值或组成的可接受的误差范围内。
术语“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统将包含治疗剂的组合物物理引入至受试者。例如，施用途径可包括经颊、鼻内、眼内、口服、渗透、肠胃外、直肠、舌下、局部、透皮、阴道静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”是指通常通过注射而不是肠内和局部施用的施用方式，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病变内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、气管内、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。例如，也可以进行一次、多次、和/或在一个或多个延长的时期内进行施用，以及可以是治疗有效剂量或亚治疗剂量。
如本文所用，术语“氨基酸”指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及氨基酸类似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括在蛋白生物合成中使用的20种(L)-氨基酸和其它氨基酸，例如，如4-羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、锁链素(desmosine)、异锁链素、同型半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包括，例如本领域技术人员已知的(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、p-氟苯丙氨酸、乙硫氨基酪酸等。氨基酸类似物包括天然存在的和非天然存在的氨基酸的修饰形式。此种修饰可包括，例如将氨基酸的化学基团和化学部分进行取代或替换，或者通过氨基酸衍生。氨基酸模拟物包括，例如显示与参考氨基酸具有功能相似性特征(如电荷和电荷间距特征)的有机结构。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构与天然存在的Arg氨基酸侧链的e-氨基基团具有位于相似分子间隔中的正电荷部分以及具有相同程度的迁移率。模拟物也包括约束结构以维持氨基酸或氨基酸功能基团的最适间距和电荷相互作用。那些本领域技术人员已知或可确定何种结构构成了功能等价的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
在整个本说明书中，除非上下文需要，否则术语“包括(comprise)”、“包含(comprises)”和“含有(comprising)”将被理解为意指包含所陈述的步骤或元件、或者步骤或元件的组，而不排除任何其它的步骤或元件或者步骤或元件的组。通过“由…组成”，意为包括并限于短语“由…组成”后跟的无论什么。因此，短语“由…组成”表明列出的元件是必须的或强制的，而且不可能出现其它元件。通过“基本上由…组成”，意为包括短语后列出的任何元件，并且限于不干扰或有助于列出的元件在公开内容中指定的活性或作用的其他元件。因此，短语“基本上由…组成”表明列出的元件是必须的或强制的，而其它的元件是可选的，并且根据它们是否极大地影响列出的元件的活性或作用而可能或不可能出现。
术语“缀合物”意指作为试剂或其它分子(如生物活性分子)与p97多肽共价或非共价结合或连接的结果而形成的实体。缀合多肽的一个示例是“融合蛋白”或“融合多肽”，即，通过将两个或更多的编码序列连接而产生的多肽，其中所述编码序列最初编码单独的多肽；将连接的编码序列进行翻译产生单个的融合多肽，其通常具有来源于每个单独多肽的功能特性。
本文使用的术语“功能(function)”和“功能的(functional)”等，指生物功能、酶功能、或治疗功能。
“同源性(homology)”指相同的或组成保守型取代的氨基酸的数量百分比。可使用序列比较程序如GAP(Deveraux等人,Nucleic Acids Research.12,387-395,1984)来确定同源性，将其通过引用的方式并入本文。这样可通过向比对中插入空位，将本文引用的那些序列与相似或长度显著不同的序列进行比较，可通过，例如GAP使用的比较算法来确定此种空位。
通过“分离的”，意指物质基本上或实质上不含其天然状态中通常伴随其的组分。例如，本文使用的“分离的肽”或“分离的多肽”等，包括将肽或多肽分子从其天然的细胞环境中、以及与该细胞的其它组分的连接中进行体外的分离和/或纯化，即所述肽或多肽分子不与体内物质显著相连。
本文使用的术语“连接(linkage)”、“接头(linker)”、“接头部分(linkermoiety)”或“L”指可用于将p97多肽片段与目的试剂分隔的接头，或可用于将第一试剂与另外的试剂分隔的接头，例如将其中两个或多个试剂连接以形成p97缀合物。所述接头可以是生理稳定的，或可包含可释放的接头，例如酶可降解接头(如，蛋白水解可切割的接头)。在某些方面，所述接头可以是肽接头，例如，作为p97融合蛋白的部分。在一些方面，所述接头可以是非肽接头或非蛋白接头。在一些方面，所述接头可以是颗粒，如纳米颗粒。
术语“调整”和“改变”包括“增加”、“增强”或“刺激”以及“降低”或“减少”，通常是相对于对照的统计上显著的或生理上显著的量或水平。“增加的”、“刺激的”或“增强的”量通常为“统计上显著”的量，并且可包括无组合物(如不含本发明缀合物的多肽)、或对照组合物、样本或测试受试者所产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(如500、1000倍)(包括在1之间的和大于1的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。“降低的”或“减少的”量通常为“统计上显著的”量，并且可包括无组合物或对照组合物所产生的量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包括其间的所有整数)的减少。作为非限制性示例，对照可以比较相对于单独的试剂，p97-试剂缀合物的活性，例如穿越血脑屏障转运/递送的量或比率，在中枢神经系统组织分布的比率和水平，和/或血浆、中枢神经系统组织、或任何其它的全身或外周非中枢神经系统组织的Cmax。本文描述了比较和“统计上显著的”量的其它示例。
在某些实施方案中，可具体限定组合物中任何给定试剂(例如，p97缀合物如融合蛋白)的“纯度”。例如，某些组合物可包含试剂，其是至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％纯度，包括其间的所有小数，例如但不局限于，如通过高压液相色谱法(HPLC)所测量的，HPLC是生物化学和分析化学中经常使用的柱色谱法的众所周知的形式，其可将化合物分离、鉴定和定量。
本文使用的术语“多肽”和“蛋白”是可互换的，其指的是氨基酸残基的聚合物及其变体和合成的类似物。因此，这些术语适于其中一个或多个氨基酸残基为合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物，如相应的天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合物的化学类似物。本文所述的多肽不限于特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白都包含于多肽的定义中，并且除非特别指出，这些术语可在本文中互换使用。本文所述的多肽也可包括表达后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。多肽可以是整个蛋白，或者是其子序列、片段、变体、或衍生物。
“生理上可切割的”或“可水解的”或“可降解的”键为在生理条件下与水反应的键(即是水解的)。键在水中水解的趋势不仅取决于将两个中心原子相连的通常的连接类型，还取决于这些中心原子上连接的取代基。合适的水解不稳定的或弱的连接包括，但不限于：羧酸酯、磷酸酯、酸酐、乙缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、含硫酯、硫酯、碳酸酯和腙、肽和寡核苷酸。
“可释放的接头”包括但不限于，生理上可切割的接头和酶可降解的接头。因此，“可释放的接头”为在生理条件下，可经历自发水解或被一些其它机制切割(如，酶-催化、酸-催化、碱-催化等等)的接头。例如，“可释放的接头”可涉及作为驱动力的质子的碱脱除(base abstraction)(如，可电离的氢原子，Ha)的消去反应。为了本文的目的，“可释放的接头”是“可降解的接头”的同义词。“酶可降解的连接”包括，例如通过一种或多种酶(如肽酶或蛋白酶)降解的连接(如氨基酸序列)。在具体实施方案中，可释放的接头在pH7.4、25℃时，例如在生理pH、人体温度(如体内)时具有的半衰期为，约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时或约96小时或更短。
术语“参考序列”通常指与另一序列相比核酸编码序列、或氨基酸序列。参考序列包括本文所述的所有多肽和多核苷酸序列，包括那些用名称描述的和那些在表格和序列表中描述的。
本文使用的术语“序列同一性”或、例如，包含“与…具有50％序列同一性”指在比对窗口中，基于核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的序列相同的程度。因此，可通过下述方法来计算“序列同一性百分比”：在比较窗口中将两条最优比对的序列进行比较；确定在两条序列中都出现的具有相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Iie、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gin、Cys和Met)的位点数量以得到匹配位点的数量；将匹配位点的数量除以比较窗口中所有位点的数量(即，窗口大小)，并且将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。
包含与本文所述的任何参考序列(参见，如序列表)具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，其中多肽变体通常保有参考多肽的至少一种生物活性。
用于描述两个或更多个多核苷酸之间或多肽之间的序列关系的术语包括：“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”的长度为至少12个，但通常为15至18个，且经常为至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。
由于两条多核苷酸每条可包括(1)两条多核苷酸之间的相似序列(即，只有完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)两条多核苷酸之间的差异序列，通常通过在“比较窗口”将两条多核苷酸的序列进行比较来实施两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较，从而鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。“比较窗口”指至少为6个连续位点，通常为约50至约100个，更通常为约100至约150个连续位点的概念上片段，其中在将两条序列最优比对后，将序列与具有相同数量连续位点的参考序列进行比较。为了将两条序列最优比对，与参考序列(其不包括插入或缺失)相比，比较窗口可包括约20％或更少的插入或缺失(即空位)。可通过算法(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)的计算机化实施或通过检查和任何选择的不同方法产生的最佳比对(即，在比较窗口产生最高百分比同源性)来进行用于比对比较窗口的序列的最优比对。也可参考例如Altschul等人,Nucl.AcidsRes.25:3389,1997公开的程序中的BLAST家族。可在Ausubel等人,“Current Protocols inMolecular Biology,”John Wiley&Sons Inc,1994-1998,第15章第19.3单元中发现序列分析的详细讨论。
“统计上显著的”指结果不太可能偶然发生。可通过任何本领域已知的任何方法来确定统计学显著性。通常使用的显著性方法包括p-值，如果零假设是正确的，p-值为观察的事件会发生的频率或可能性。如果得到的p-值小于显著水平，则拒绝零假设。在简单情况下，将显著水平限定为p-值为0.05或更低。
术语“溶解度”指p97多肽片段或缀合物溶解于液体溶剂并形成均匀溶液的性质。溶解度通常表示为浓度，或通过每单位体积溶剂中溶质的质量(每kg溶剂的溶质g、g/dL(100mL)、mg/ml等)、摩尔浓度、质量摩尔浓度(molality)、摩尔分数或其它类似的浓度的描述来表示。在特定条件下(包括温度、压力、pH、和溶剂的性质)，每份溶剂量能够溶解的溶质的最大平衡量称为溶质在该种溶剂中的溶解度。在某些实施方案中，在生理pH或其它pH，如在pH5.0、pH6.0、pH7.0、或pH7.4时，测量溶解度。在某些实施方案中，在水中或生理缓冲液中，如PBS或NaCl(含有或不含NaP)中测量溶解度。在特定实施方案中，在相对更低的pH(例如，pH 6.0)和相对更高的盐(例如500mM NaCl和10mM NaP)下测量溶解度。在某些实施方案中，在生物液体(溶剂)，如血液或血清中测量溶解度。在某些实施方案中，温度可以是约室温(例如，约20、21、22、23、24、25℃)或约体温(-37℃)。在某些实施方案中，在室温或在约37℃，p97多肽或缀合物的溶解度为至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、或30mg/ml。
本文使用的“受试者”包括表现出可用本发明的p97缀合物治疗或诊断的症状或有表现出此种症状的风险的任何动物。合适的受试者(患者)包括实验动物(如小鼠、大鼠、兔子、或豚鼠)、农场动物(farm animals)和家畜或宠物(如猫或狗)。包括非人灵长类动物，以及优选为人类患者。
“基本上(substantially)”或“本质上(essentially)”指几乎全部或完全，例如某给定量的95％、96％、97％、98％、99％、或更多。
“基本上不含(substantially free)”指几乎完全或完全不含给定的量，例如，少于某给定量的约10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或更少。例如，某些组合物可“基本上不含”细胞蛋白、细胞膜、核酸、内毒素或其它污染物。
本文使用的“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”包括对疾病或病况的症状或病理的任何可期望的效果，并且也可包括待治疗的疾病或病况的一种或多种可测量的标记物的甚至是最小的变化或改善。“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”不一定表示疾病或病况或其相关症状完全根除或治愈。接受该治疗的受试者为需要其的任何受试者。临床改善的示例性标记物对本领域技术人员将是显而易见的。
术语“野生型(wild-type)”指基因或基因产物，其具有此种基因或基因产物从天然存在的来源中分离时的特性。野生型基因或基因产物(如多肽)指在种群中观察到的最高频率的基因或基因产物，因而被任意地设定为基因的“正常”或“野生型”形式。
P97多肽序列和其缀合物
本发明的实施方案通常涉及人p97多肽片段(黑素转铁蛋白；MTf，SEQ ID NO:1)、包含此片段的组合物、和其缀合物。在某些示例中，本文所述的p97多肽片段具有转运活性，即它们能够穿越血脑屏障(BBB)转运。在具体实施方案中，p97片段共价、非共价或可操作地(operatively)偶联至目的试剂(如治疗剂、诊断剂、或可检测的试剂)，从而形成p97-试剂缀合物。除本文所述的和本领域已知的其它试剂外，试剂的具体示例包括小分子和多肽，如抗体。示例性p97多肽序列和试剂在下文描述。也描述示例性的方法和组分，如将p97多肽与目的试剂偶联的接头组。
p97序列。在一些实施方案中，p97多肽包括确定为SEQ ID NO:2(DSSHAFTLDELR)的人p97片段，或基本上由其组成，或由其组成。
在其它特定实施方案中，下面更详细地描述了p97多肽序列，其包括沿着其长度与SEQ ID NO:2所示的人p97序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性或同源性的序列。
在具体实施方案中，p97片段或其变体具有穿越BBB的能力，以及任选地转运目的试剂穿越BBB并进入中枢神经系统。在某些实施方案中，p97片段或其变体能够特异性结合至p97受体、LRPl受体、和/或LRPIB受体。
在一些实施方案中，p97片段具有一个或多个末端(例如，N-末端、C-末端)半胱氨酸和/或酪氨酸，其可以分别加入用于缀合和碘化反应。在一些实施方案中，可以使用酪氨酸半胱氨酸二肽。
在某些实施方案中，包括例如本文所述的方面的一些或全部，可以使用p97片段DSSYSFTLDELR(SEQ ID NO:3)取代p97片段DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO:2)。
p97偶联。如上文所指出的，某些实施方案包括与目的试剂偶联的p97多肽，所述目的试剂，例如，小分子、多肽(例如，肽、抗体)、肽模拟物、类肽、适体、可检测的实体、或其任意组合。也包括包含多于一种目的试剂的缀合物，例如，与抗体和小分子缀合的p97片段。
优选共价连接，但是也可应用非共价连接，包括那些利用相对强的非共价的蛋白-配体相互作用的非共价连接，如生物素与抗生物素蛋白之间的相互作用。特别优选的是p97片段与试剂的融合。也包括可操作连接，其不一定需要在p97片段和目的试剂之间直接共价或非共价相互作用；这种连接的示例包括包含p97多肽和目的试剂的脂质体混合物。本文描述了产生蛋白缀合物的示例性方法，其它方法在本领域是已知的。
小分子。在具体实施方案中，p97片段与小分子缀合。“小分子”指合成的或生物来源(生物分子)的有机化合物，但通常不是聚合物。有机化合物指分子中包含碳的一大类化学化合物，通常排除那些仅含有碳酸盐、简单的碳氧化物或氰化物的化合物。“生物分子”通常指由活的有机体产生的有机分子，包括大的聚合物分子(生物聚合物)如肽、多糖、和核酸，和小分子如初级、次级代谢产物、脂质、磷脂、糖脂、固醇、甘油糖脂、维生素、和激素。“聚合物”通常指由重复的结构单元组成的大分子或大分子，其通常由共价化学键连接。
在某些实施方案中，小分子的分子量为小于约1000-2000道尔顿，通常为在约300和700道尔顿之间，以及包括约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、500、650、600、750、700、850、800、950、1000或2000道尔顿。
某些小分子可具有用于描述抗体(下文)的“特异性结合”特性。例如，小分子可与本文所述的靶标特异性结合，其结合亲和力(Kd)为至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50nM。在某些实施方案中，小分子可与细胞表面受体或其它细胞表面蛋白特异地结合。
多肽试剂。在具体实施方案中，目的试剂为肽或多肽。本文使用的术语“肽”和“多肽”是可互换的，然而在某些示例中，术语“肽”可指较短的多肽，例如由约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸组成的多肽，包括其间的所有整数和范围(如5-10、8-12、10-15)。如本文所述，多肽和肽可由天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸组成。多肽也包括抗体。
在一些实施方案中，如上文所指出的，多肽试剂为抗体或其抗原结合片段。本发明的缀合物或组合物中使用的抗体或抗原结合片段基本上可以是任何类型。具体示例包括治疗性抗体和诊断性抗体。本领域公知，抗体是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个表位识别位点，与靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)特异性结合的免疫球蛋白分子。
本文使用的术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，也包含其片段(如dAb、Fab、Fab’、F(ab’h、Fv)、单链(ScFv)、其合成的变体、天然存在的变体、含有具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、以及含有具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。
本文使用的术语“抗原结合片段”指含有与目的抗原结合的免疫球蛋白重链和/或轻链中至少一个CDR的多肽片段。在此方面，本文所述的抗体的抗原结合片段可包括来自抗体的VH和VL序列中的1、2、3、4、5或全部6个CDR，所述抗体与治疗靶标或诊断靶标相结合。
术语“抗原”指可与选择性结合试剂(如抗体)结合的分子或分子的部分，另外所述抗原能够用于动物以产生能够与该抗原表位结合的抗体。抗原可具有一个或多个表位。
术语“表位”包括任何决定簇，优选为能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的多肽决定簇。表位是与抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中可具有特殊的三维结构特性、和/或特殊的电荷特性。在抗原的初级结构上，表位可为连续的或不连续的。
如果分子(如抗体)与特定的细胞或物质的反应或结合比其与其它细胞或物质的反应或结合更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更强，则可说该分子表现出“特异性结合”或“优选结合”结合”。如果抗体与靶标的结合比抗体与其它物质的结合的亲和力更强、亲和性(avidity)更强、更容易和/或持续时间更长，则抗体“特异性结合”或“优选结合”至该靶标。例如，特异性或优选结合至特异性表位的抗体是这样的抗体，其与特定表位结合比抗体与其它表位的结合的亲和力更强、亲和性更强、更容易和/或持续时间更长。通过阅读该定义也可理解，例如，与第一靶标特异性或优选结合的抗体(或部分或表位)，可能或不可能与第二靶标特异性或优选结合。如此，“特异性结合”或“优选结合”不一定需要(尽管可包括)专一性结合。通常但不一定，提到结合意思是指优选结合。
免疫结合通常指免疫球蛋白分子与其特异性抗原之间发生的类型中的非共价相互作用，例如通过举例说明而非限制，由静电的、离子的、亲水的和/或疏水的吸引或排斥、空间力、氢键、范德华力以及其它相互作用产生。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(Kd)表示，其中Kd越小表示亲和力越强。
可用本领域已知的方法来量化所选的多肽的免疫结合特性。此类方法中的一种需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物部分的浓度、相互作用的亲和力、以及平等地影响两个方向速率的几何参数。因此，可通过计算结合和解离的浓度和实际速率来确定“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。Koff/Kon的比值能够消除所有与亲和力无关的参数，并因此等于解离常数Kd。
可使用本领域已知的方法来量化所选抗体和多肽的免疫结合特性(参见Davies等人,Annual Rev.Biochem.59:439-473,1990)。在一些实施方案中，当平衡解离常数为约≤10-7或10-8M时，认为抗体或其它多肽与抗原或其表位特异性结合。在一些实施方案中，抗体的平衡解离常数可以是约≤10-9M或≤10-10M。在某些示例性实施方案中，抗体或其它多肽与本文所述的抗原或靶标(其与之特异性结合)的亲和力(Kd)为至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50nM。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段或其它多肽与细胞表面受体或其它的细胞表面蛋白特异性结合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段或其它多肽与细胞表面受体或其它细胞表面蛋白的配体特异性结合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段或其它多肽与细胞内蛋白特异性结合。
可通过那些本领域技术人员已知的多种技术中的任何技术制备抗体。参见，如Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。例如，可使用Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976中的技术以及对其的改善来制备对目的多肽具有特异性的单克隆抗体。还包括使用转基因动物(如小鼠)来表达人抗体的方法。参见，如Neuberger等人,Nature Biotechnology 14:826,1996；Lonberg等人，Hand book of Experimental Pharmacology 113:49-101,1994以及Lonberg等人，Internal Review of Immunology 13:65-93,1995。
也可通过噬菌体展示文库或酵母展示文库来产生或鉴定抗体(参见，如美国专利第7,244,592号；Chao等人，Nature Protocols.1:755-768,2006)。可利用的文库的非限制性示例包括克隆的或合成的文库，如人源组合抗体文库(HuCAL)，其中通过7个重链和7个轻链可变区基因来代表人源抗体谱(repertoire)的结构多样性。这些基因的组合在主文库中产生了49个框架(framework)。通过在这些框架中，将高度可变的基因盒(CDR＝互补决定区)叠加，可重产生大的人抗体谱。还包括用以下设计的人文库：编码轻链可变区、重链CDR-3的人供体-来源片段、编码重链CDR-1中多样性的合成DNA、以及编码重链CDR-2中多样性的合成DNA。
可使用的其它合适的文库对本领域技术人员将是显而易见的。可将本文所述的和本领域已知的p97多肽用于纯化过程，例如亲和层析步骤。
在某些实施方案中，如本文所述抗体和其抗原结合片段包括在重链和轻链框架区(FR)组之间分别插入的重链和轻链CDR组，框架区组为CDR提供支撑，并且限定CDR相对彼此之间的空间关系。本文使用的术语“CDR组”指重链或轻链V区的三个高度可变区。从重链或轻链的N-末端出发，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包含6个CDR，其包括来自各重链和轻链V区的CDR组。包含单个CDR(如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文指“分子识别单元”。对许多抗原-抗体复合物的晶体学分析表明，CDR的氨基酸残基与结合的抗原产生广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3的接触。因此，所述分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
本文使用的术语“FR组”指四个侧翼氨基酸序列，其形成重链或轻链V区的CDR组的CDR的框架。一些FR残基可与结合的抗原接触；然而FR主要负责将V区折叠成为抗原结合位点，特别地，所述FR残基与CDR直接相邻。在FR内，某些氨基酸残基和某些结构特征是十分高度保守的。就这点而言，所有V区序列都包含约90个氨基酸残基的内部二硫键环。当V区折叠成为结合位点时，CDR展示突出的环基序(motif)，其形成抗原结合表面。通常认为，存在影响CDR环成为某种“标准”结构的折叠形状的FR保守结构区，而与精确的CDR氨基酸序列无关。进一步，已知某些FR残基可参与非共价的结构域间接触，其可稳定抗体重链和轻链的相互作用。
可通过参考Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.第4版.US Department of Health and Human Services.1987及其更新来确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位点。
“单克隆抗体”指均质性抗体群，其中所述单克隆抗体包含涉及表位选择性结合的氨基酸(天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸)。单克隆抗体是针对单一表位高度特异性的。术语“单克隆抗体”不仅包含完整的单克隆抗体和全长的单克隆抗体，也包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’h、Fv)、单链(ScFv)、其变体、包含抗原结合部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、以及含有具有所需特异性和与表位结合能力的抗原结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。并不意图限制抗体的来源或其制备方法(如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物)。该术语包括上文描述的在“抗体”定义之下的全部的免疫球蛋白以及片段等。
蛋白水解酶的木瓜蛋白酶优选切割IgG分子以得到若干片段，其中两种(F(ab)片段)每种都包括含有完整的抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以产生若干片段，包括含有两个抗原结合位点的F(ab’h片段。可通过将IgM进行优选蛋白水解切割，且少数情况将IgG或IgA免疫球蛋白分子切割，而产生根据本发明的某些实施方案应用的Fv片段。然而，更通常使用本领域已知的重组技术获得Fv片段。所述Fv片段包括含有抗原结合位点的非共价VH::VL异二聚体，所述抗原结合位点保留了天然抗体分子的许多抗原识别和结合能力。参见Inbar等人,PNAS USA.69:2659-2662,1972；Hochman等人，Biochem.15:2706-2710,1976以及Ehrlich等人,Biochem.19:4091-4096,1980。
在某些实施方案中，包括单链Fv或scFV抗体。例如，可根据本申请关于选择具所想要的特异性的抗体的教导，利用标准的分子生物学技术来制备κ抗体(Ill等人,Prat.Eng.10:949-57,1997)；微抗体(Martin等人，EMBO J 13:5305-9,1994)、双抗体(Holliger等人，PNAS 90:6444-8,1993)；或Janusins(Traunecker等人，EMBO J 10:3655-59,1991；和Traunecker等人，Int.J.Cancer Suppl.7:51-52,1992)。
单链Fv(sFv)多肽是共价相连的VH::VL异二聚体，其由包含由肽编码接头相连的Vw-和VL-编码基因的融合基因来表达。Huston等人(PNAS USA.85(16):5879-5883,1988)。描述了许多识别化学结构的方法，以将来自抗体V区的天然聚合且化学分离的轻多肽链和重多肽链转变为sFv分子，所述sFv分子将折叠成为与抗原结合位点的结构基本相似的三维结构。参见，如Huston等人的美国专利第5,091,513和5,132,405号，以及Ladner等人的美国专利第4,946,778号。
在某些实施方案中，如本文所述的抗体是“双抗体”的形式。
双抗体是多肽的多聚体，每个多肽包括含有免疫球蛋白轻链的结合区的第一结构域和含有免疫球蛋白重链结合区的第二结构域，这两个结构域是相连的(例如，通过肽接头)，但却不能相互联接以形成抗原结合位点：抗原结合位点通过将多聚体中一个多肽的第一结构域与多聚体中另一多肽的第二结构域相连而形成(WO94/13804)。抗体的dAb片段由VH结构域组成(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)。可通过，例如基因融合构建双抗体和其它多价或多特异性的片段(参见WO94/13804；和Holliger等人，PNAS USA.90:6444-6448,1993)。
还包括包含与CH3结构域相连的scFv的微抗体(参见Hu等人，Cancer Res.56:3055-3061,1996)。也参见Ward等人，Nature.341:544-546,1989；Bird等人,Science.242:423-426,1988；Huston等人，PNAS USA.85:5879-5883,1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；以及Reiter等人，Nature Biotech.14:1239-1245,1996。
在使用双特异性的抗体时，这些可以是可通过多种方法制备的常规的双特异性抗体(Holliger和Winter,Current Opinion Biotechnol.4:446-449,1993)，例如化学制备的或来自杂交瘤的，或者可能是上文提及的任何双特异性抗体片段。可仅利用可变结构域，构建不含Fe区域的双抗体和scFv，潜在地降低抗独特型反应的效果。
与双特异性完全抗体相反，由于双特异性双抗体可在inf.coli中容易地构建和表达，其可能特别有用。使用来自文库的噬菌体展示(WO94/13804)可容易地选择具有合适结合特异性的双抗体(和许多其它的多肽，如抗体片段)。如果双抗体的一个臂要保持恒定，例如具有针对抗原X的特异性，则可构建另一个臂是可变的文库，并且选择具有合适特异性的抗体。可通过“杵臼”(knobs-into-holes)工程技术(Ridgeway等人,Protein Eng.,9:616-621,1996)制备双特异性完全抗体。
在某些实施方案中，可以以
Figure BDA0002916649070000141
的形式提供本文所述的抗体。
Figure BDA0002916649070000142
是铰链区被移除的IgG4抗体(参见GenMab Utrecht,The Netherlands；也参见，如US20090226421)。这一抗体技术产生了比现有的小抗体形式具有预期的更长治疗窗口的稳定、更小的抗体形式。IgG4抗体被认为是惰性的，因此其不与免疫系统相互作用。可通过去除抗体的铰链区来修饰完整的人IgG4抗体，从而获得相对于相应的完整IgG4(GenMab,Utrecht)，具有明显稳定性能的半分子片段。将IgG4分子二等分，仅在可与同源抗原(如，疾病靶标)结合的
Figure BDA0002916649070000143
上保留一个区域，因此
Figure BDA0002916649070000144
只能与靶标细胞上的一个位点单价结合。对于某些癌症细胞表面抗原，该单价结合可能不会如使用具有相同抗原特异性的二价抗体可见的那样刺激癌症细胞生长，因而
Figure BDA0002916649070000145
技术可为用常规抗体难以治疗的一些类型的癌症提供治疗选择。当治疗一些形式的癌症时，
Figure BDA0002916649070000146
的小尺寸可具有极大的优势，其允许分子在更大的实体瘤中更好地分布并可能增强疗效。
在某些实施方案中，本文提供的抗体可以是纳米抗体的形式。微抗体是由单基因编码的，且在几乎所有的原核和真核宿主中高效地产生，所述宿主，例如，大肠杆菌(参见美国专利第6,765,087号)、霉菌(如曲霉菌(Aspergillus)或木霉菌(Trichoderma))和酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyvermyces)、汉逊酵母(Hansenula)或毕赤酵母(Pichia)(参见美国专利第6,838,254号)。生产方法是可放大规模的，并且已经生产了数千克量的纳米抗体。可将纳米抗体配制为具有长保存期限的即用型溶液。纳米克隆方法(参见WO06/079372)是产生针对期望的靶标的纳米抗体的专利方法，其基于B细胞的自动高通量筛选。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的。这些实施方案涉及通常用重组技术制备的嵌合分子，其具有来自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和该分子的基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的其余免疫球蛋白结构。所述抗原结合位点可以包括融合至恒定结构域的完整可变结构域，或者仅包括在可变结构域中接枝至合适的框架区域的CDR。表位结合位点可以是野生型的或可通过一个或多个氨基酸的取代将其进行修饰。这消除了在人类个体中作为免疫原的恒定区，但仍保留了对外来可变区产生免疫反应的可能性(LoBuglio等人，PNAS USA 86:4220-4224,1989；Queen等人，PNAS USA.86:10029-10033,1988；Riechmann等人，Nature.332:323-327,1988)。
抗体人源化的示例性方法包括在美国专利第7,462,697号中描述的方法。
另一种方法不仅关注提供人来源的恒定区，也将可变区进行修饰，从而将它们按尽可能接近人源形式进行改造。已知重链和轻链的可变区都包含三个互补决定区(CDR)，其根据所针对的表位而变化并决定结合能力，其是在四个框架区(FR)侧翼包围的区域，所述框架区在给定物种中相对保守，并推定其为CDR提供了支架。当制备涉及具体表位的非人源抗体时，可通过将来自非人源抗体的CDR接枝至待修饰的人源抗体中存在的FR来对可变区进行“改造”或“人源化”。该方法在不同抗体中的应用，报道见于在Sato等人，CancerRes.53:851-856,1993；Riechmann等人，Nature 332:323-327,1988；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536,1988；Kettleborough等人，Protein Engineering.4:773-3783,1991；Maeda等人,Human Antibodies Hybridoma 2:124-134,1991；Gorman等人，PNASUSA.88:4181-4185,1991；Tempest等人，Bio/Technology 9:266-271,1991；Co等人，PNASUSA.88:2869-2873,1991；Carter等人，PNAS USA.89:4285-4289,1992以及Co等人，JImmunol.148:1149-1154,1992。在一些实施方案中，人源化抗体保留了所有的CDR序列(例如，包含来自小鼠抗体的所有6个CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施方案中，人源化抗体含有根据原抗体改造的一个或多个CDR(1、2、3、4、5、6个)，其也被称为“来源于”原抗体中一个或多个CDR的一个或多个CDR。
在某些实施方案中，本发明的抗体可以为嵌合抗体。在此方面，嵌合抗体包含与不同抗体的异源Fe部分可操作地连接或者融合的抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，所述异源Fe结构域是人源的。在其它实施方案中，所述异源Fe结构域可来自亲本抗体中不同的Ig类型，包括IgA(包括亚型IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。在进一步的实施方案中，所述异源Fe结构域可包括来自不同Ig类型中一种或多种的CH2和CH3结构域。如上文所指出的，关于人源化抗体，嵌合抗体的抗原结合片段可仅包括本文所述的抗体的一个或多个CDR(如本文所述的抗体的1、2、3、4、5或6个CDR)、或者可以包括整个可变结构域(VL、VH或两者)。
肽模拟物。某些实施方案使用“肽模拟物”。肽类似物通常在制药工业中用作具有与那些模板肽类似的特性的非肽类药物。这种类型的非肽类化合物被称为“肽模拟物(peptide memitics)”或“模拟肽(peptidomimetics)”(Luthman等人，A Text book ofDrug Design and Development,14:386-406,第二版,Harwood Academic Publishers,1996；Joachim Grante,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:1699-1720,1994；Fauchere，Adv.Drug Res.,15:29,1986；Veber和Freidinger TINS,392页(1985)以及Evans等人，J.Med.Chem.30:229,1987)。模拟肽是模拟了肽的生物活性，但化学性质不再是肽的分子。模拟肽化合物在本领域是已知的，且描述于，例如美国专利第6,245,886号。
肽模拟物可具有针对抗体所述的“特异性结合”的特性(同上文)。例如，肽模拟物可与本文所述的靶标特异性结合，其结合亲和力(Kd)为至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50nM。在一些实施方案中，肽模拟物与细胞表面受体或其它的细胞表面蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述肽模拟物与本文所述的至少一种癌症相关抗原特异性结合。在具体实施方案中，所述肽模拟物与本文所述的至少一种神经系统相关抗原、疼痛相关抗原和/或自身免疫相关抗原特异性结合。
类肽。本发明的缀合物也包括“类肽”。肽的类肽衍生物代表了另一种形式的修饰的肽，其保留了针对生物活性的重要结构决定簇，但是消除了肽键，因而对蛋白质水解具有抗性(Simon,等人,PNAS USA.89:9367-9371,1992)。类肽是N取代的甘氨酸的寡聚物。描述了许多N-烷基基团，每种对应于天然氨基酸的侧链。本发明的模拟肽包括其中至少一个氨基酸残基、几个氨基酸残基或全部氨基酸残基被相应N取代的甘氨酸取代的化合物。类肽文库描述于，例如美国专利第5,811,387号。
类肽可具有针对抗体所述“特异性结合”的特性(同上文)。例如，类肽可与本文所述的靶标特异性结合，其结合亲和力(Kd)为至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50nM。在某些实施方案中，类肽与细胞表面受体或其它的细胞表面蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述类肽与本文所述的至少一种癌症相关抗原特异性结合。在具体实施方案中，所述类肽与本文所述的至少一种神经系统相关抗原、疼痛相关抗原和/或自身免疫相关抗原特异性结合。
适体。本发明的p97缀合物也包括适体(参见，例如Ellington等人，Nature.346,818-22,1990以及Tuerk等人,Science.249,505-10,1990)。适体的示例包括核酸适体(如DNA适体、RNA适体)和肽适体。核酸适体通常涉及通过重复轮的体外选择或等同的方法如SELEX(通过指数富集的配体的系统进化)进行工程化的核酸种类，以结合不同的分子靶标，如小分子、蛋白、核酸以及甚至是细胞、组织和器官结合。参见，例如美国专利第6,376,190号和6,387,620号。
肽适体通常包括两端都与蛋白支架相连的可变肽环，双结构约束通常将肽适体的结合亲和力增加至可与抗体的结合亲和力相比的水平(如在纳摩尔的范围内)。在某些实施方案中，可变环的长度可包括约10-20个氨基酸(包括其间的所有整数)，并且所述支架可包括具有好的溶解度和紧凑特性的任何蛋白。某些示例性实施方案可利用细菌蛋白硫氧还蛋白-A作为支架蛋白，可变环插入还原性活性位点内(在野生蛋白中为-Cys-Gly-Pro-Cys-环)，两个半胱氨酸侧链能够形成二硫键桥。鉴定肽适体的方法描述于，例如美国专利申请第2003/0108532号。
适体可具有针对抗体所述的“特异性结合”特性(同上文)。例如，适体可与本文所述的靶标特异性结合，其结合亲和力(Kd)为至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50nM。在具体实施方案中，适体与细胞表面受体或其它的细胞表面蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述适体与本文所述的至少一种癌症相关抗原特异性结合。在具体实施方案中，所述适体与本文所述的至少一种神经系统相关抗原、疼痛相关抗原和/或自身免疫相关抗原特异性结合。
适用于治疗戈谢病的具体活性剂可以是任何试剂，包括那些小分子、多肽剂、肽模拟物、类肽、适体以及酶，例如目前用于治疗戈谢病的酶。下面列出了目前可用于治疗戈谢病的活性剂的一些示例，尽管本文未明确鉴定的其他活性剂也意欲包括在本发明的范围内。
思而赞(Cerezyme)(伊米苷酶)是由重组DNA技术生产的人酶β-葡萄糖脑苷脂酶的类似物。β-葡萄糖脑苷脂酶(β-D-葡萄糖基-N-酰基鞘氨醇葡萄糖水解酶，E.C.3.2.1.45)是一种溶酶体糖蛋白酶，其催化h生成葡萄糖和神经酰胺。思而赞是使用哺乳动物细胞培养物(中国仓鼠卵巢)通过重组DNA技术生产的。纯化的伊米苷酶是一种497个氨基酸的单体糖蛋白，含有4N-连接的糖基化位点(Mr＝60,430)。伊米苷酶与胎盘葡萄糖脑苷脂酶的不同之处在于位点495处的一个氨基酸，其中组氨酸取代精氨酸。糖基化位点的寡糖链已被修饰以终止在甘露糖。伊米苷酶上修饰的碳水化合物结构与胎盘葡萄糖脑苷脂酶上的那些有一些不同。伊米苷酶的这些甘露糖末端的寡糖链被巨噬细胞(在戈谢病中积累脂质的细胞)上的内吞碳水化合物的受体所特异性识别。
VPRIV(维拉西酶α)，VPRIV是用于1型戈谢病患者的长期酶替代疗法(ERT)。VPRIV的活性成分是维拉西酶α，它是通过基因激活技术在人成纤维细胞系中产生的。维拉西酶α是一种497个氨基酸的糖蛋白；分子量约为63kDa。维拉西酶α与天然存在的人类的酶(葡萄糖脑苷脂酶)具有相同的氨基酸序列。维拉西酶α含有5个潜在的N-连接糖基化位点；这些位点中的四个被聚糖链占据。维拉西酶α主要包含高甘露糖型N-连接的聚糖链。高甘露糖型N-连接的聚糖链通过巨噬细胞表面上存在的甘露糖受体被特异性识别和内在化，所述细胞在戈谢病中积累葡萄糖脑苷脂。维拉西酶α在溶酶体中催化糖脂葡萄糖脑苷脂水解为葡萄糖和神经酰胺。
ELELYSO(塔利苷酶α)是一种水解的溶酶体葡萄糖脑苷脂特异性酶，适用于治疗已确诊患有1型戈谢病的患者。塔利苷酶α是一种用于静脉输注的水解溶酶体葡萄糖脑苷脂特异性酶，是溶酶体酶(β-葡萄糖脑苷脂酶)的重组活性形式，其通常在一次性生物反应器系统
Figure BDA0002916649070000181
中培养的遗传修饰的胡萝卜植物根细胞中表达。β-葡萄糖脑苷脂酶(β-D-葡萄糖基-N-酰基鞘氨醇葡萄糖水解酶，E.C.3.2.1.45)是溶酶体糖蛋白酶，其催化糖脂葡萄糖脑苷脂水解为葡萄糖和神经酰胺。ELELYSO是使用植物细胞培养物(胡萝卜)通过重组DNA技术生产的。纯化的塔利苷酶α是一种单体糖蛋白，含有4个N-连接的糖基化位点(Mr＝60,800)。塔利苷酶α与天然人葡萄糖脑苷脂酶的区别在于N末端的两个氨基酸和C末端的多达7个氨基酸。塔利苷酶α是具有寡糖链的糖基化蛋白，在糖基化位点具有末端甘露糖。塔利苷酶α的这些甘露糖末端的寡糖链被巨噬细胞上的内吞碳水化合物受体特异性识别，所述巨噬细胞是在戈谢病中积累脂质的细胞。
CERDELGATM(依利格鲁司他(eliglustat)是一种葡萄糖基神经酰胺合酶抑制剂，表明其用于长期治疗患有1型戈谢病的成年患者(其经FDA清楚的测试检测为CYP2D6中度代谢者(IM)、或弱代谢者(PM))。CERDELGA(依利格鲁司他)胶囊含依利格鲁司他酒石酸盐，其是葡萄糖基神经酰胺合酶的小分子抑制剂，类似于该酶的神经酰胺底物，化学名称为N-(1R，2R)-1-(2,3-二氢苯并[b]][1,4]二恶英-6-基)-1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-2-基)辛酰胺(2R，3R)-2,3-二羟琥珀酸盐。
ZAVESCA(美格鲁特(miglustat)是一种葡萄糖基神经酰胺合酶抑制剂，表明其用作治疗轻度/中度1型戈谢病(对于该疾病患者酶替代疗法不是治疗选择)的单一疗法。美格鲁特是酶葡萄糖基神经酰胺合酶的抑制剂，该酶是负责大多数鞘糖脂合成第一步的葡萄糖基转移酶。Zavesca是一种N-烷基化的亚氨基糖，是D-葡萄糖的合成类似物。美格鲁特的化学名字是1,5-(丁基亚氨基)-1,5-二脱氧-D-葡萄糖醇。
可检测实体。在一些实施方案中，p97片段缀合至“可检测实体”。可检测实体的示例包括而不限于，基于碘的标记、放射性同位素、荧光团/荧光染料、和纳米颗粒。可检测的实体可以存在于活性剂上。
示例性基于碘的标记包括泛影酸(
Figure BDA0002916649070000182
GE Healthcare)和它的阴离子形式，泛影酸盐。泛影酸是用于先进的X射线技术(如CT扫描)的放射性造影剂。也包括下文描述的碘放射性同位素。
用作可检测实体的示例性放射性同位素包括32P、33P、35S、3H、18F、11C、13N、15O、111In、169Yb、99mTC、55Fe，以及碘的同位素如123I、124I、125I和131I。这些放射性同位素具有不同的半衰期、衰减类型和能量级，可将其进行调整以匹配具体方案的需要。例如通过与p97多肽缀合，这些放射性同位素中的某些能够选择性地靶向或更好地靶向CNS组织，从而改善这些组织的医学成像。
可用作直接可检测实体的荧光团或荧光染料的示例包括荧光素、四甲基罗丹明、德克萨斯红(Texas Red)、Oregon
Figure BDA0002916649070000191
和一些其它的染料(如Haugland,Hand book ofFluorescent Probes第9版,2002,Molec.Probes,Inc.,Eugene OR；Haugland,TheHandbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies第10版.,2005,Invitrogen,Carlsbad,CA)。还包括发光的或其它可检测染料。染料发出的光可以是可见光或不可见光，如紫外光或红外光。在示例性实施方案中，所述染料可以是荧光共振能量转移(FRET)染料；呫吨染料，如荧光素和罗丹明；在α或β位置有氨基的染料(如萘胺染料、1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺-8-萘磺酸盐和2-p-甲苯胺基(touidinyl)-6-萘磺酸盐)；含3-苯基-7-异氰酸基香豆素的染料；吖啶，如9-异硫氰基吖啶和吖啶橙；嵌二萘、苯并噁二唑和均二苯代乙烯(stilbene)；含3-(s-羧基戊烷基)-3′-乙基-5,5’-二甲基氧杂羰花青(CYA)的染料；6-羧基荧光素(FAM)；5&6-羧基罗丹明-110(R110)；6-羧基罗丹明-6G(R6G)；N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；6-羧基-X-罗丹明(ROX)；6-羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素(JOE)；ALEXA FLUORTM；Cy2；德克萨斯红和罗丹明红；6-羧基-2’,4,7,7’-四氯荧光素(TET)；6-羧基-2’,4,4’,5’,7,7’-六氯荧光素(HEX)；5-羧基-2’,4’,5’,7’-四氯荧光素(ZOE)；NAN；NED；Cy3；Cy3.5；Cy5；Cy5.5；Cy7和Cy7.5；IR800CW、ICG、AlexaFluor 350；Alexa Fluor 488；Alexa Fluor 532；Alexa Fluor 546；Alexa Fluor 568；Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 750。某些实施方案包括与用可检测实体(如荧光团(例如Oregon
Figure BDA0002916649070000192
Alexa Fluor 488)标记的化学治疗剂(例如，紫杉醇、阿霉素)缀合。
纳米颗粒的尺寸范围通常为约1-1000nm，且包括不同的化学结构，如金、银颗粒和量子点。当用成角度的入射白光照射时，范围为约40-120nm的银或金的纳米颗粒将高强度地散射单色光。散射光的波长取决于颗粒的尺寸。很接近的4-5种不同颗粒中的每种将散射单色光，当将其叠加时会产生特定的、独特的颜色。衍化的纳米颗粒如银或金颗粒能够与大范围的分子连接，包括蛋白、抗体、小分子、受体配体、和核酸。纳米颗粒的具体示例包括金属纳米颗粒和金属纳米壳，如金颗粒、银颗粒、铜颗粒、铂颗粒、镉颗粒、复合颗粒、金空心球体、金包被的二氧化硅纳米壳和二氧化硅包被的金壳。还包括二氧化硅、乳胶、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、PVDF纳米颗粒、以及任何这些材料的有色颗粒。
量子点是直径为约1-5nm的荧光晶体，其可被大范围的波长的光激发。当被具有合适波长的光激发时，这些晶体可发射光，如单色光，其波长取决于晶体的化学组成和尺寸。量子点如CdSe、ZnSe、InP或InA具有独特的光学特性；这些以及类似的量子点可从多种商业来源得到(例如：NN-Labs,Fayetteville,AR；Ocean Nanotech,Fayetteville,AR；NanocoTechnologies,Manchester,英国；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。
多肽变体和片段。某些实施方案包括本文所述的参考多肽(不管是通过名称或是通过参考鉴定的序列所描述)的变体和/或片段，包括p97多肽和基于多肽的试剂(如抗体)。这些多肽的野生型或最普遍的序列在本领域是已知的，并且其可用作本文所述的变体和片段的比较。
本文使用的术语多肽“变体”，指通常相比本文具体公开的多肽存在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的差异的多肽。多肽变体具有生物活性，即，它们继续具备参考多肽的酶活性或结合活性。此种变体可能通过，例如，遗传多态性和/或人工操作得到。
在许多示例中，具有生物活性的变体将包含一个或多个保守取代。“保守取代”指其中一个氨基酸被具有相似特性的另一个氨基酸取代，从而肽化学领域的技术人员可以预测到多肽的二级结构和亲水性质基本不发生改变。如上所述，可以在本发明的多核苷酸和多肽结构中进行修饰，并仍可获得编码具有所期望特征的多肽变体或衍生物的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以生成本发明多肽的等同物、或者甚至是改善的变体或部分时，本领域技术人员通常将根据下表A，改变编码DNA序列中的一个或多个密码子。
Figure BDA0002916649070000211
例如，可将蛋白结构中的某些氨基酸取代为其它的氨基酸，而不明显失去与结构的相互结合的能力，例如，如抗体的抗原结合区或对底物分子的结合位点。因为蛋白的相互作用能力和性质限定了蛋白的生物功能活性，因此可在蛋白序列(以及，当然的，其潜在的DNA编码序列中)将某些氨基酸序列进行取代，并且仍可获得具有相似特性的蛋白。因此，可以考虑将公开的组合物的肽序列、或编码所述肽的相应DNA序列进行不同的改变，而不明显丧失其功能。
在进行这些改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物功能方面的重要性通常为本领域所公知(Kyte&Doolittle,1982，通过引用并入本文)。公认氨基酸的相对亲水特性影响所生成蛋白的二级结构，其反过来限定了蛋白与其它分子(如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)之间的相互作用。基于氨基酸的疏水性和电荷特性，赋予每个氨基酸一个亲水指数(Kyte&Doolittle,1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(–0.4)；苏氨酸(–0.7)；丝氨酸(–0.8)；色氨酸(–0.9)；酪氨酸(–1.3)；脯氨酸(–1.6)；组氨酸(–3.2)；谷氨酸(–3.5)；谷氨酰胺(–3.5)；天冬氨酸(–3.5)；天冬酰胺(–3.5)；赖氨酸(–3.9)；和精氨酸(–4.5)。本领域已知，某些氨基酸可被其它具有相似亲水指数或评分的氨基酸取代，且仍可产生具有相似生物活性的蛋白，即，仍可获得在生物功能上等价的蛋白。在作出这些改变时，优选取代那些亲水指数在±2内的氨基酸，特别优选那些在±1内的氨基酸，甚至更特别优选那些在±0.5内的氨基酸。
本领域已知，基于亲水性，可以有效地将相似的氨基酸进行取代。美国专利第4,554,101号(具体地通过引用整体将其并入本文)指出，受相邻氨基酸亲水性支配的蛋白的最大局部平均亲水性与该蛋白的生物性质相关。如在美国专利第4,554,101号中所详述的，赋予氨基酸残基下列的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(–0.4)；脯氨酸(–0.5±1)；丙氨酸(–0.5)；组氨酸(–0.5)；半胱氨酸(–1.0)；甲硫氨酸(–1.3)；缬氨酸(–1.5)；亮氨酸(–1.8)；异亮氨酸(–1.8)；酪氨酸(–2.3)；苯丙氨酸(–2.5)；色氨酸(–3.4)。应理解，一个氨基酸可被另一个具有相似亲水性值的氨基酸取代，且仍获得生物等价(具体而言免疫等价)的蛋白。在这些改变中，优选对那些亲水性值在±2内的氨基酸进行取代，特别优选那些亲水性值在±1内的氨基酸，并且更特别优选那些亲水性值在±0.5内的氨基酸。
如上文所述的，因此氨基酸的取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。考虑各种前述特征的示例性取代对于本领域技术人员是已知的，其包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
还可基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性对氨基酸进行进一步的取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守改变的其它氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gin、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。
变体也可，或可选地包含非保守改变。在一个优选实施方案中，变体多肽通过取代、缺失或添加少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2个氨基酸，甚至1个氨基酸不同于天然序列。也可(或可选地)通过，例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构、酶活性和/或亲水性质影响最小的氨基酸，对变体进行修饰。
在某些实施方案中，DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO:2)的变体可以基于来自其它有机体的p97序列的序列，如2016年6月14日提交的美国专利9364567的表B所示，如全文所示，该专利的全部内容通过引用并入本文。
总之，变体显示出与参考多肽序列至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性或序列同一性或序列同源性。此外，也考虑通过添加(例如，通过C-末端添加、N-末端添加、或两者)、缺失、截短、插入、或取代约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸，使序列不同于天然序列或亲本序列，但仍保有亲本或参考多肽序列的特性或活性的序列。
在一些实施方案中，变体多肽与参考序列的不同在于至少一个，但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基。在其它实施方案中，变体多肽与参考序列有至少1％，但少于20％、15％、10％或5％的残基不同。(如果该比较需要比对，则序列应按最大相似性来比对。由缺失或插入或错配导致的“环出”(looped out)序列视为不同)。
如下进行计算序列之间的序列相似性或序列同一性(这些术语在本文中可互换使用)。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，将所述序列比对以进行最优比较目的(例如，为了最优比对，可向第一和第二氨基酸序列或核酸序列中的一个或两个引入空位，并且为了比较目的可忽略非同源序列)。在某些实施方案中，用于比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％、60％，甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后将相应的氨基酸位点或核苷酸位点的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列某位点被与第二序列相应位点处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在该位点处具有同一性。
在两个序列之间的百分比同一性是序列中相同位置的数目的函数，考虑到空位的数目、以及每个空位的长度，需要引入该空位以用于两个序列的最佳比对。
可用数学算法来完成两序列之间的序列比较和百分比同一性的测定。在优选实施方案中，利用已并入GCG软件包的GAP程序的Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48:444-453,1970)，其利用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。在另一优选实施方案中，利用GCG软件包中的GAP程序，采用NWSgapdna.CMP矩阵，以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，测定两条核苷酸序列之间的百分比同一性。具体优选的参数组(除非另有说明是应该使用的)为Blossum62评分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，且移码空位罚分为5。
可利用已并入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller算法(Cabios.4:11-17,1989)，采用PAM120权重残基表，以及12的空位长度罚分和4的空位罚分，来测定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的百分比同一性。
可将本文所述的核酸序列和蛋白质序列用作“查询序列(query sequence)”来对公共数据库进行检索，例如鉴定其它的家族成员或相关序列。该检索可利用Altschul,等人,(1990,J.Mol.Biol,215:403-10)中的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行。可用NBLAST程序来进行BLAST核苷酸检索，评分＝100，字长＝12，从而获得与本发明的核酸分子具有同源性的核苷酸序列。可用XBLAST程序来进行BLAST蛋白质检索，评分＝50，字长＝3，从而获得与本发明的蛋白分子具有同源性的氨基酸序列。为了获得有空位的比对以进行比较，可利用Altschul等人,(Nucleic Acids Res.25:3389–3402,1997)中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序中的默认参数(如，XBLAST和NBLAST)。
在一个实施方案中，如上文所指出的，可利用BLAST比对工具对多核苷酸和/或多肽进行评估。局部比对简单地由一对序列片段组成，每个序列片段来自待比较的每条序列。Smith-Waterman或Sellers算法的修正将找到不能通过延伸或削减来提高评分的所有片段对，其被称为高分片段对(HSP)。BLAST比对的结果包括统计测量，以说明可仅从偶然发生以预期BLAST评分的可能性。
根据与每一比对序列有关的空位数目和取代来计算初始评分S，其中相似性评分越高表明比对越显著。通过查表给出取代评分(参见PAM,BLOSUM)。
通常将空位评分计算为空位开放罚分G、和空位延伸罚分L的总和。对于空位长度n，空位代价将为G+Ln。按经验选择空位代价G和L，但是通常为G选择高数值(10-15)(例如11)，并且为L选择低数值(1-2)(例如1)。
比特评分S’来源于初始比对评分S，其中将使用的评分系统的统计特征考虑在内。针对评分系统将比特评分标准化，从而可将其用于比较来自不同检索的比对评分。术语“比特评分”和“相似性评分”可互换使用。比特评分指示比对的好坏：评分越高，比对越好。
E-值、或预期值描述了具有相似评分的序列在数据库中偶然发生的可能性。它是在数据库检索中偶然发生、且具有与S相等或更高评分的不同比对数目的预示。E-值越小，比对越显著。例如，E值为e-117的比对表示，具有相似评分的序列不太可能简单地偶然发生。
此外，用于比对氨基酸随机对的预期评分要求是负值，否则长比对将趋向于具有高的评分，无论比对的片段是否相关。而且，BLAST算法使用了合适的取代矩阵、核苷酸或氨基酸，并且将空位产生和延伸罚分用于有空位的比对。例如，通常使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分为11以及空位延伸罚分为1来进行BLAST比对和多肽序列比较。
在一个实施方案中，自使用BLOSUM62矩阵进行的BLAST分析、其空位存在罚分为11、空位延伸罚分为1来报道序列相似性评分。
在具体实施方案中，本文提供的序列同一性/相似性评分指的是使用GAP版本10(GCG,Accelrys,San Diego,Calif.)，采用下述参数获得的值：使用空位权重为50、长度权重为3、以及nwsgapdna.cmp评分矩阵得到的核苷酸序列的％同一性和％相似性；使用空位权重为8、长度权重为2、以及BLOSUM62评分矩阵(Henikoff and Henikoff,PNAS USA.89:10915-10919,1992)得到的氨基酸序列的％同一性和％相似性。GAP使用Needleman和Wunsch算法(J Mol Biol.48:443-453,1970)来寻找两个完全序列的比对，其使得匹配数目最大化且空位数目最小化。
如上文所指出的，可用多种方法改变参考多肽，包括氨基酸取代、缺失、截短、添加、和插入。此种操作的方法在本领域通常是已知的。例如，可通过在DNA上进行突变来制备参考多肽的氨基酸序列变体。诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域是已知的。参见，例如Kunkel(PNAS USA.82:488-492,1985)；Kunkel等人,(Methods in Enzymol.154:367-382,1987)；美国专利第4,873,192号；Watson,J.D.等人,(“Molecular Biology of the Gene,”第4版,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)，以及其中引用的参考文献。可在Dayhoff等人,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到不影响目的蛋白的生物活性的合适的氨基酸取代的指导。
用于筛选通过这些修饰产生的组合文库的基因产物的方法、以及筛选具有选定特征的基因产物的cDNA文库的方法在本领域是已知的。这些方法可适用于参考多肽的组合诱变产生的基因文库的快速筛选。作为一个实例，可将递归整体诱变(该技术提高文库中功能性突变体的频率)与筛选分析组合使用以鉴定多肽变体(Arkin和Yourvan,PNAS USA 89:7811-7815,1992；Delgrave等人,Protein Engineering.6:327-331,1993)。
缀合的示例性方法。可利用标准的化学、生物化学和/或分子技术将p97多肽序列缀合或偶联至目的试剂。确实，如何根据现有公开内容，利用可获得的本领域认可的方法来制备p97缀合物是显而易见的。当然，当将本发明的p97缀合物的初始组分进行结合时，通常优选的是，所使用的技术和产生的连接化学物基本不破坏缀合物中各个组分的所想要的功能或活性。
采用的具体偶联化学将取决于生物活性试剂(如小分子、多肽)的结构、生物活性试剂中多种官能团的潜在存在、保护/脱保护步骤的需要、该试剂的化学稳定性等，并且其可被本领域技术人员容易地确定。可用于制备本发明的p97缀合物的示例性偶联化学可参见，例如Wong(1991),“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”,CRCPress,Boca Raton,Fla.；和Brinkley“A Brief Survey of Methods for PreparingProtein Conjugation with Dyes,Haptens,and Crosslinking Reagents,”inBioconjug.Chem.,3:2013,1992。优选地，作为采用的缀合技术的结果，缀合物的结合能力和/或活性，相对于例如未缀合的试剂或未缀合的p97多肽基本不会降低。
在某些实施方案中，可将p97多肽序列直接或间接缀合至目的试剂。当p97多肽序列和目的试剂都包含能够与另一个发生反应的取代基时，这两者之间可能发生直接反应。例如，在一个上的亲核基团(如氨基或巯基)，可能与在另一个上的含羰基基团(如，酸酐或酸性卤化物，或与含有好的离去基团(如卤化物)的烷基)发生反应。
可选地，将p97多肽序列与目的试剂通过接头基团(包括非肽接头和肽接头)间接偶联是可取的。接头基团也可作为间隔物发挥功能以使目的试剂远离p97多肽序列，从而避免干扰结合能力、靶向能力或其它的功能。接头基团还可用于增强试剂上的取代基的化学反应性，并因此增加偶联效率。化学反应性的增强可能也会促进试剂或其上的官能团的利用，否则这将是不可能的。可释放的或稳定的接头的选择也可用于改变p97缀合物和所连接的目的试剂的药代动力学。示例性连接基团包括，例如二硫基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。在其它示例性实施方案中，所述缀合物包括连接基团，如美国专利第5,208,020号或EP专利0425235B1以及Chari等人,CancerResearch.52:127-131,1992中公布的那些。其它的示例性接头在下文中描述。
在一些实施方案中，将多于一个的p97多肽序列与试剂偶联，或与之相反是可取的。例如，在某些实施方案中，多个p97多肽序列与一个试剂偶联，或者可选地，一个或多个p97多肽与多个试剂缀合。所述p97多肽序列可以相同也可以不同。不管具体的实施方案是什么，可用多种方法制备含有多个p97多肽序列的缀合物。例如，可将多于一个的多肽直接偶联至试剂，或者可使用能够为连接提供多个位点的接头。可应用多种已知的异双功能交联策略中的任何策略来制备本发明的缀合物。应理解，这些实施方案中的许多可通过控制在缀合/交联步骤中所用材料的化学计量来实现。
在某些示例性实施方案中，包含琥珀酸亚胺酯官能团的试剂与包含氨基的p97多肽之间的反应，形成酰胺连接；包含氧羰基咪唑(oxycarbonylimidizaole)官能团的试剂与包含氨基的p97多肽之间的反应，形成氨基甲酸酯连接；包含p-硝基苯基碳酸酯官能团的试剂与包含氨基的p97多肽之间的反应，形成氨基甲酸酯连接；包含三氯苯基碳酸酯官能团的试剂与包含氨基的p97多肽反应，形成氨基甲酸酯连接；包含硫酯官能团的试剂与包含n-末端氨基的p97多肽之间的反应，形成酰胺连接；包含丙醛官能团的试剂与包含氨基的p97多肽之间的反应，形成仲胺连接。
在一些示例性实施方案中，含有丁醛官能团的试剂与含有氨基的p97多肽之间的反应，形成仲胺连接；含有乙缩醛官能团的试剂与含有氨基的p97多肽之间的反应，形成仲胺连接；含有哌啶酮官能团的试剂与含有氨基的p97多肽之间的反应，形成仲胺连接；含有甲基酮官能团的试剂与含有氨基的p97多肽之间的反应，形成仲胺连接；含有三氟乙基磺酸酯(Tresylate)官能团的试剂与含有氨基的p97多肽之间反应，形成仲胺连接；含有马来酰亚胺官能团的试剂与含有氨基的p97多肽之间的反应，形成仲胺连接；含有乙醛官能团的试剂与含有氨基的p97多肽之间的反应，形成仲胺连接；以及含有肼官能团的试剂与含有羧酸基团的p97多肽之间的反应，形成仲胺连接。
在特定示例性实施方案中，含有马来酰亚胺官能团的试剂与含有硫醇基的p97多肽之间的反应，形成硫醚连接；含有乙烯砜官能团的试剂与含有硫醇基的p97多肽之间的反应，形成硫醚连接；含有硫醇官能团的试剂与含有硫醇基的p97多肽之间的反应，形成二硫键连接；含有邻吡啶二硫化物官能团的试剂与含有硫醇基的p97多肽之间的反应，形成二硫键连接；并且含有碘乙酰胺官能团的试剂与含有硫醇基的p97多肽之间的反应，形成硫醚连接。
在特定实施方案中，使用胺-至-巯基交联剂制备缀合物。
例如，在一个优选实施方案中，所述交联剂为琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)(Thermo Scientific)，其为在中等长度的环己烷稳定的间隔物臂(8.3埃)的对应两端含有NHS-酯和马来酰亚胺反应基团的巯基交联剂。SMCC是不可切割的、膜可渗透的交联剂，其可用于产生巯基反应性的、马来酰亚胺激活的试剂(如多肽、抗体)，可用于后续与p97多肽序列的反应。在pH7-9时，NHS酯与伯胺反应形成稳定的酰胺键。在pH6.5-7.5时，马来酰亚胺与巯基基团反应，形成稳定的硫醚键。因此，SMCC的胺反应性NHS酯与试剂的伯胺键迅速交联，然后所产生的巯基反应性的马来酰亚胺基团可与p97的半胱氨酸残基反应，从而得到特定的目的缀合物。
在某些特定实施方案中，将p97多肽序列修饰以使其含有暴露的巯基基团，从而促进交联，例如促进与马来酰亚胺激活的试剂的交联。在更具体实施方案中，用修饰伯胺以添加保护性的巯基基团的试剂来修饰p97多肽序列。在甚至更具体的实施方案中，使用试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)(Thermo Scientific)以产生硫醇化的p97多肽。
在其它特定实施方案中，在合适的条件下，将马来酰亚胺激活的试剂与硫醇化的p97多肽反应以产生本发明的缀合物。应理解，通过操纵在这些反应中的SMCC、SATA、试剂和p97多肽的比例，可能产生具有不同的化学计量、分子量和特性的缀合物。
在其它示例性实施方案中，使用双功能性蛋白偶联剂来制备缀合物，所述偶联剂例如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚胺酸酯的双官能性衍生物(如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(p-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(p-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。具体的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人,Biochem.J.173:723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫键连接。
除了许多合适的缀合策略示例中的若干之外，可将本文讨论的具体的交联策略用于制备本发明的缀合物。对本领域技术人员来说显而易见的是，许多其它的双功能或多功能试剂，包括同和异功能性的(如在Pierce Chemical Co.,Rockford,IL目录中描述的那些)可用作接头基团。偶联可能受，例如通过氨基、羧基、巯基或氧化的碳水化合物残基的影响。有许多描述此类方法学的参考文献，例如Rodwell等人的美国专利第4,671,958号。
具体的实施方案可应用一种或多种醛标签来促进p97多肽和试剂之间的缀合(参见美国专利第8,097,701号和第7,985,783号，以引用的方式并入本文)。在此，通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的作用对醛标签的硫酸酯酶基序进行酶修饰，产生了甲酰甘氨酸(FGly)残基。然后可将FGly残基的醛部分用作将目的部分在特异位点连接至多肽的化学柄(chemical handle)。在一些方面，所述目的部分为小分子、类肽、适体、或肽模拟物。在一些方面，所述目的部分为另一多肽，如抗体。
可用FGE酶修饰具有上述基序的多肽，以产生具有FGly残基的基序，如上文所指出的，可将产生的基序用于与试剂(如第二多肽)(例如通过接头部分)位点特异性连接。可通过，例如在表达FGE酶的哺乳动物、酵母或细菌细胞中表达含硫酸酯酶基序的多肽(如p97、抗体)，或通过用分离的FGE酶将分离的多肽进行体外修饰来进行此种修饰(参见Wu等人,PNAS.106:3000-3005,2009；Rush和Bertozzi,J.Am Chem Soc.130:12240-1,2008；和Carlson等人,J Biol Chem.283:20117-25,2008)。
可用一种或多种醛反应性基团(如氨氧基、酰肼和氨基硫脲)将试剂或含有非醛标签的多肽(例如抗体、p97多肽)官能化，然后通过至少一个FGly残基将其共价连接至含有醛标签的多肽，从而形成醛反应性连接。氨氧基-官能化的试剂(或含有非醛标签的多肽)的连接，在FGly残基和官能化的试剂(或含有非醛标签的多肽)之间产生了肟连接；酰肼-官能化的试剂(或含有非醛标签的多肽)的连接，在FGly残基和官能化的试剂(或含有非醛标签的多肽)之间产生了肼连接；并且氨基硫脲-官能化的试剂(或含有非醛标签的多肽)的连接，在FGly残基和官能化的试剂(或含有非醛标签的多肽)之间产生了肼碳酰胺(hydrazinecarbothiamide)连接。因此，在这些及相关实施方案中，R1可以是含有席夫碱的连接，如肟连接、肼连接、或肼碳酰胺连接。
某些实施方案包括以下缀合物：(i)含有硫酸酯酶基序(或醛标签)的p97多肽，和(ii)含有硫酸酯酶基序(或醛标签)的多肽试剂(A)，其中(i)和(ii)通过它们各自的FGly残基共价连接，任选地，通过双官能化的接头部分或基团连接。
在一些实施方案中，含有醛标签的p97多肽与含有醛标签的试剂通过多官能化的接头(例如双官能化的接头)连接(例如，共价连接)，后者被相同或不同的醛反应性基团官能化。在这些和相关实施方案中，所述醛反应性基团允许接头在p97多肽和试剂之间通过它们各自的FGly残基形成共价桥。接头部分包括可被官能化的任何部分或化学品，并且优选被一个或多个醛反应性基团双官能化或多官能化。具体示例包括肽、水溶性聚合物、可检测实体、其它的治疗性化合物(例如，细胞毒性化合物)、生物素/链霉亲和素部分、和聚糖(参见Hudak等人,J Am Chem Soc.133:16127-35,2011)。
聚糖(或糖苷)的具体示例包括氨氧基聚糖，如由糖基N-戊烯酸异羟肟酸酯(pentenoyl hydroxamate)中间体组成的更高阶的聚糖(同上文)。本文描述了示例性的接头，并且其可根据本领域的常规技术用醛反应性基团进行官能化(参见，例如，Carrico等人,Nat Chem Biol.3:321-322,2007；和美国专利第8,097,701号和7,985,783号)。
也可通过各种“点击化学”技术制备p97缀合物，包括以下的反应：模块化、范围广泛、收率很高、主要产生可通过非色谱法移除的无害副产物，并且其可以是立体定向的而不必具有对映选择性(参见Kolb等人,Angew Chem Int Ed Engl.40:2004-2021,2001)。具体示例包括采用叠氮化物和炔烃的Huisgen1,3-偶极环加成反应的缀合技术，也被称为“叠氮化物-炔烃环加成”反应(参见Hein等人,Pharm Res.25:2216-2230,2008)。叠氮化物-炔烃环加成反应的非限制性示例包括铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)反应和钌催化的叠氮化物-炔烃环加成(RuAAC)反应。
CuAAC可在广泛的温度范围内进行，其对水条件和4-12的pH范围不敏感，并且可耐受众多的官能团(参见Himo等人,J Am Chem Soc.127:210-216,2005)。可通过，例如利用抗坏血酸钠作为还原剂，从Cu(I)盐或Cu(II)盐中产生有活性的Cu(I)催化剂。该反应形成1,4-取代的产物，使之具有区域特异性(参见Hein等人,同上文)。
RuAAC利用能够催化叠氮化物至末端炔烃的环加成反应的五甲基环戊二烯基(pentamethylcyclopentadienyl)氯化钌[Cp*RuCl]复合物，区域选择性地产生1,5-双取代1,2,3-三唑(参见Rasmussen等人,Org.Lett.9:5337-5339,2007)。进一步，与CuAAC对比，RuAAC还可与内部炔烃使用以提供全部取代的1,2,3-三唑。
某些实施方案因此包含含有至少一个具有叠氮化物侧链或炔烃侧链的非天然氨基酸的p97多肽，包含内部和末端非天然氨基酸(如N-末端，C-末端)。这些p97多肽中的某些可通过体内或体外(例如无细胞系统)并入非天然氨基酸而形成，所述非天然氨基酸含有叠氮化物侧链或炔烃侧链。示例性的体内技术包括细胞培养技术，例如使用修饰的大肠杆菌(参见Travis和Schultz,The Journal of Biological Chemistry.285:11039-44,2010；以及Deiters和Schultz,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters.15:1521-1524,2005)；示例性的体外技术包括无细胞系统(参见Bundy,Bioconjug Chem.21:255-63,2010)。
在一些实施方案中，包含至少一个具有叠氮化物侧链的非天然氨基酸的p97多肽，通过叠氮化物-炔烃环加成反应缀合至含有至少一个炔烃基团的试剂(或接头)，如包含至少一个具有炔烃侧链的非天然氨基酸的多肽试剂。在其它实施方案中，包含至少一个具有炔烃侧链的非天然氨基酸的p97多肽，通过叠氮化物-炔烃环加成反应缀合至含有至少一个叠氮化物基团的试剂(或接头)，如包含至少一个具有叠氮侧链的非天然氨基酸的多肽试剂。因此，某些实施方案包括含有p97多肽的缀合物，所述p97多肽通过1,2,3-三唑连接与试剂共价连接。
在某些实施方案中，具有叠氮化物侧链的非天然氨基酸和/或具有炔烃侧链的非天然氨基酸是末端氨基酸(N-末端，C-末端)。在某些实施方案中，一种或多种非天然氨基酸是内部的。
例如，某些实施方案包括p97多肽，其包含具有叠氮化物侧链的N-末端非天然氨基酸，所述叠氮化物侧链缀合至含有炔烃基团的试剂。一些实施方案包括p97多肽，其包含具有叠氮化物侧链的C-末端非天然氨基酸，所述叠氮化物侧链缀合至含有炔烃基团的试剂。具体实施方案包括p97多肽，其包含具有炔烃侧链的N-末端非天然氨基酸，所述炔烃侧链缀合至含有叠氮化物侧基的试剂。进一步的实施方案包括p97多肽，其包含具有炔烃侧链的C-末端非天然氨基酸，所述炔烃侧链缀合至含有叠氮化物侧基的试剂。一些实施方案包括p97多肽，其包含具有叠氮化物侧链的至少一个内部非天然氨基酸，所述叠氮化物侧链缀合至含有炔烃基团的试剂。另一个实施方案包括p97多肽，其包含具有炔烃侧链的至少一个内部非天然氨基酸，所述炔烃侧链缀合至含有叠氮化物侧基的试剂。
具体实施方案包括p97多肽，所述p97多肽含有具有叠氮化物侧链的N-末端非天然氨基酸，其与含有具有炔烃侧链的N-末端非天然氨基酸的多肽试剂缀合。其它实施方案包括p97多肽，所述p97多肽含有具有叠氮化物侧链的C-末端非天然氨基酸，其与含有具有炔烃侧链的C-末端非天然氨基酸的多肽试剂缀合。又一实施方案包括p97多肽，所述p97多肽含有具有叠氮化物侧链的N-末端非天然氨基酸，其与含有具有炔烃侧链的C-末端非天然氨基酸的多肽试剂缀合。进一步的实施方案包括p97多肽，所述p97多肽含有具有叠氮化物侧链的C-末端非天然氨基酸，其与含有具有炔烃侧链的N-末端非天然氨基酸的多肽试剂缀合。
其他实施方案包括p97多肽，所述p97多肽含有具有炔烃侧链的N-末端非天然氨基酸，其与含有具有叠氮化物侧链的N-末端非天然氨基酸的多肽试剂缀合。又进一步的实施方案包括p97多肽，所述p97多肽含有具有炔烃侧链的C-末端非天然氨基酸，其与含有具有叠氮化物侧链的C-末端非天然氨基酸的多肽试剂缀合。另外的实施方案包括p97多肽，所述p97多肽含有具有炔烃侧链的N-末端非天然氨基酸，其与含有具有叠氮化物侧链的C-末端非天然氨基酸的多肽试剂缀合。进一步的实施方案包括p97多肽，所述p97多肽含有具有炔烃侧链的C-末端非天然氨基酸，其与含有具有叠氮化物侧链的N-末端非天然氨基酸的多肽试剂缀合。
也包含制备p97缀合物的方法，所述方法包括：(a)在(i)含有至少一个具有叠氮化物侧链的非天然氨基酸的p97多肽与含有至少一个炔烃基团的试剂(例如，具有炔烃侧链的非天然氨基酸)之间进行叠氮化物-炔烃环加成反应；或者在(ii)含有至少一个具有炔烃侧链的非天然氨基酸的p97多肽与含有至少一个叠氮化物基团的试剂(例如，具有叠氮化物侧链的非天然氨基酸)之间进行叠氮化物-炔烃环加成反应；和(b)将p97缀合物从反应中分离，因而产生p97缀合物。
当p97缀合物是融合多肽时，通常可使用标准技术来制备融合多肽。然而优选地，在表达系统中将融合多肽表达为重组多肽，这是本文所述的也是本领域已知的。本发明的融合多肽可以包含p97多肽序列的一个或多个拷贝，并且可包含基于多肽的目的试剂(如抗体或其抗原结合片段)的一个或多个拷贝，其以任何期望的排列存在。
对于融合蛋白，可将编码p97多肽、多肽试剂(如抗体)和任选的肽接头组分的DNA序列分别组装，然后将其连接入合适的表达载体。将编码一种多肽组分的DNA序列的3’端(用或不用肽接头)连接至编码另一种或多种多肽组分的DNA序列的5’端，以使所述序列的阅读框同相(in phase)。将连接的DNA序列可操作地与合适的转录或翻译调控元件相连。所述负责DNA表达的调控元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5’。类似地，中止翻译所需的中止密码子和转录中止信号也仅存在于编码最C-末端多肽的DNA序列的3’。这样就允许翻译为单个的融合多肽，其保有两个多肽组分的生物活性。
可将相似的技术(主要是调控元件如启动子、终止密码子和转录终止信号的排列)用于重组生产非融合蛋白，例如，用于生产非融合缀合物的p97多肽和多肽试剂(如，抗体试剂)。
本发明的多核苷酸和融合多核苷酸可包含编码p97多肽序列的核酸的一个或多个拷贝，和/或可包含编码多肽试剂的核酸的一个或多个拷贝。
在一些实施方案中，将编码受试者p97多肽、多肽试剂和/或p97-多肽融合蛋白的核酸直接引入宿主细胞，并且将细胞在足以诱导编码多肽表达的条件下培养。可通过本领域技术人员已知的标准技术，结合本文提供的多肽和核酸序列，来制备本公开的多肽序列。
因此，根据某些相关实施方案，提供重组的宿主细胞，其包含编码本文所述的多肽的多核苷酸或融合多核苷酸。可通过在合适的条件下培养含有所述多核苷酸的重组宿主细胞，来方便地实现在宿主细胞中表达p97多肽、多肽试剂、或p97-多肽试剂融合蛋白。在通过表达生产之后，可利用任何合适的技术将多肽分离和/或纯化，然后根据需要使用。
在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是已知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。
本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞、仓鼠崽肾细胞、HEK-293细胞、NSO小鼠黑色素瘤细胞以及许多其它细胞。常用的、优选的细菌宿主是f.coli。在本领域已经完善建立在原核细胞如f.coli中表达多肽。综述，参见例如Pluckthun,A.Bio/Technology.9:545-551(1991)。作为重组生产多肽的选择，本领域技术人员也可将其在培养的真核细胞中表达(参见,Curr.Opinion Biotech.4:573-576,1993；和Trill等人,Curr.Opinion Biotech.6:553-560,1995)。
可以选择或构建合适的载体，其包含合适的调控序列，视情况包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记物基因和其它序列。视情况，载体可以是质粒、病毒(如噬菌体或噬菌粒)。更进一步的细节参见，例如Molecular Cloning:aLaboratory Manual第二版，Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor LaboratoryPress。在Current Protocols in Molecular Biology,第二版,Ausubel等人编JohnWiley&Sons,1992，或另外的其后续更新中，详细描述了许多已知的核酸操作的技术和方案，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白分析。
使用的术语“宿主细胞”指，已经引入或能够已经引入编码本文所述的一种或多种多肽的核酸序列的细胞，其进一步表达或能够表达所选择的目标基因，如编码任何本文所述多肽的基因。该术语包括亲本细胞的子代，不管子代与其来源的亲本细胞的形态或基因组成是否相同，只要其存在所选择的基因。可选择具有某些特征的宿主细胞，例如表达甲酰甘氨酸生成酶(FGE)以将硫酸酯酶基序中的半胱氨酸或丝氨酸残基转变为甲酰甘氨酸(FGly)残基，或者表达氨酰基tRNA合成酶，其可将非天然氨基酸并入多肽，包括具有叠氮化物侧链、炔烃侧链或其它期望的侧链的非天然氨基酸，从而促进缀合。
因此，也考虑了包括向宿主细胞引入此类核酸的方法。核酸的引入可使用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和利用逆转录病毒或其它病毒的转导(如牛痘)，或对于昆虫细胞，杆状病毒。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和利用噬菌体的转染。可在引入之后，例如通过在使基因表达的条件下培养宿主细胞，引起或允许核酸表达。在一个实施方案中，将核酸整合进宿主细胞的基因组(如染色体)。根据标准技术，可通过包含能够促进与基因组重组的序列来促进整合。
在某些实施方案中，本发明也提供一种方法，其包括在表达系统中使用本文所述的核酸构建体来表达特定多肽，如本文所述的p97多肽、多肽试剂、或p97-多肽试剂融合蛋白。
如上文所指出的，某些p97缀合物(如融合蛋白)可使用一个或多个接头基团，包括非肽接头(如非蛋白质接头)和肽接头。此类接头可以是稳定的接头，也可以是可释放的接头。
示例性非肽稳定的连接包括：琥珀酰亚胺、丙酸、羧甲基连接、醚、氨基甲酸酯、酰胺、胺、碳酰二胺、酰亚胺、脂肪族C-C键、硫醚连接、硫代氨基甲酸酯、硫脲等。通常，水解稳定的连接是在生理条件下，表现出少于约1-2％至5％/天的水解速率的稳定连接。
示例性非肽可释放的连接包括：羧酸酯、磷酸酯、酸酐、乙缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、含硫酯、硫醇酯、碳酸酯和腙连接。可释放的接头的其它示例性示例可以是基于苯甲基消除的接头、基于三烷基锁的接头(或基于三烷基锁内酯化)、基于N-二甘氨酸(bicine)的接头、和酸不稳定的接头。酸不稳定的接头可以是二硫键、含腙的接头和含硫代丙酸酯的接头。也包括在内化进细胞期间或进入时可释放或可切割的接头。将试剂从这些接头基团在细胞内释放的机制包括：通过将二硫键还原而切割(如Spitler的美国专利第4,489,710号)，通过对光不稳定的键的辐照(如Senter等人的美国专利第4,625,014号)，通过将衍化的氨基酸侧链水解(如Kohn等人的美国专利第4,638,045号)，通过血清补体介导的水解(如Rodwell等人的美国专利第4,671,958号)，以及酸催化的水解(如Blattler等人的美国专利第4,569,789号)。在一个实施方案中，可使用酸不稳定的接头(CancerResearch 52:127-131,1992；和美国专利第5,208,020号)。本领域技术人员已知进一步详情。参见，例如美国专利第9364567号。
在某些实施方案中，在接头中使用“水溶性聚合物”将p97多肽序列与目的试剂偶联。“水溶性聚合物”指在水中可溶的聚合物，且其通常基本上是非免疫原性的，并且原子分子量通常大于1,000道尔顿。将两个多肽通过水溶性聚合物连接是可取的，因为此种修饰能够通过增加血清的半衰期来增加治疗指数，例如通过增加蛋白水解稳定性和/或减少肾脏的清除。此外，通过一个或多个聚合物的连接能够降低蛋白质药物的免疫原性。
水溶性聚合物的具体示例包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯烃或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物等。
在一些实施方案中，水溶性聚合物具有高于约10,000Da，高于约20,000-500,000Da，高于约40,000-300,000Da，高于约50,000-70,000Da，通常高于约60,000Da的有效的水动力分子量。“有效的水动力分子量”指通过基于水的尺寸排阻色谱法(SEC)测定的聚合物链的有效的水溶剂化尺寸。当水溶性聚合物包含含有聚亚烷基氧化物重复单元(如环氧乙烷重复单元)的聚合物链时，每条链可具有在约200Da和约80,000Da之间，或在约1,500Da和约42,000Da之间的原子分子量，其中2,000至约20,000Da是特别期望的。也可包括线性、支链和末端带电的水溶性聚合物。
用作醛标记的多肽之间的接头的聚合物可具有广范围的分子量和聚合物亚基。这些亚基可包括生物聚合物、合成聚合物或其组合。此种水溶性聚合物的示例包括：葡聚糖和葡聚糖衍生物，包括硫酸葡聚糖、P-氨基交联的葡聚糖和羧甲基葡聚糖)；纤维素和纤维素衍生物，包括甲基纤维素和羧甲基纤维素；淀粉和糊精)，以及淀粉的衍生物和水解产物(hydroylactes)；聚亚烷基二醇及其衍生物，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇、聚乙二醇均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物，其中所述均聚物和共聚物为未被取代的，或在一端被烷基取代；肝素和肝素片段；聚乙烯醇和聚乙烯乙醚；聚乙烯吡咯烷酮；天冬酰胺和聚乙氧基化的多元醇；以及葡聚糖和葡聚糖衍生物；糊精和糊精衍生物。应当理解，也包括具体描述的水溶性聚合物的不同衍生物。
水溶性聚合物为本领域已知，特别是基于聚亚烷基氧化物的聚合物，如聚乙二醇“PEG”(参见Poly(ethylene glycol)Chemistry:Biotechnical and BiomedicalApplications,J.M.Harris,编，Plenum Press,New York,N.Y.(1992)；以及Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications,J.M.Harris and S.Zalipsky，编,ACS(1997)；和国际专利申请：WO90/13540、WO92/00748、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28937、WO95/11924、WO96/00080、WO96/23794、WO98/07713、WO98/41562、WO98/48837、WO99/30727、WO99/32134、WO99/33483、WO99/53951、WO01/26692、WO95/13312、WO96/21469、WO97/03106、WO99/45964和美国专利第4,179,337号；第5,075,046号；第5,089,261号；第5,100,992号；第5,134,192号；第5,166,309号；第5,171,264号；第5,213,891号；第5,219,564号；第5,275,838号；第5,281,698号；第5,298,643号；第5,312,808号；第5,321,095号；第5,324,844号；第5,349,001号；第5,352,756号；第5,405,877号；第5,455,027号；第5,446,090号；第5,470,829号；第5,478,805号；第5,567,422号；第5,605,976号；第5,612,460号；第5,614,549号；第5,618,528号；第5,672,662号；第5,637,749号；第5,643,575号；第5,650,388号；第5,681,567号；第5,686,110号；第5,730,990号；第5,739,208号；第5,756,593号；第5,808,096号；第5,824,778号；第5,824,784号；第5,840,900号；第5,874,500号；第5,880,131号；第5,900,461号；第5,902,588号；第5,919,442号；第5,919,455号；第5,932,462号；第5,965,119号；第5,965,566号；第5,985,263号；第5,990,237号；第6,011,042号；第6,013,283号；第6,077,939号；第6,113,906号；第6,127,355号；第6,177,087号；第6,180,095号；第6,194,580号；第6,214,966号，其通过引用并入)。
示例性目的聚合物包括那些含有聚亚烷基氧化物、聚酰胺亚烷基氧化物或其衍生物的聚合物，包括含环氧乙烷重复单元的聚亚烷基氧化物和聚酰胺亚烷基氧化物。其它示例性目的聚合物包括含有分子量大于约1,000道尔顿的聚酰胺。其它示例性水溶性重复单元包括环氧乙烷。此种水溶性重复单元的数量可明显不同，这种单元的通常数量为2至500、2至400、2至300、2至200、2至100，且最通常为2至50。
在某些实施方案中，可使用肽接头序列将p97缀合物的组分分离或偶联。例如，对于多肽-多肽缀合物，肽接头可通过足以确保每条多肽可折叠为其二级结构和三级结构的距离将组分间隔。可使用本文所述的和本领域已知的标准技术将此种肽接头序列并入缀合物(如融合蛋白)。可基于下述因素选择合适的肽接头序列：(1)其能够采用灵活的延伸构象；(2)其不能采用可与第一和第二多肽的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺少可与多肽的功能性表位反应的疏水的或带电荷的残基。可用作接头的氨基酸序列包括在Maratea等人,Gene 40:39-46,1985；Murphy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262,1986；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号中公开的那些。
在某些示例性实施方案中，肽接头为约1至5个氨基酸之间，在5至10个氨基酸之间、在5至25个氨基酸之间、在5至50个氨基酸之间、在10至25个氨基酸之间、在10至50个氨基酸之间、在10至100个氨基酸之间，或任何其间范围的氨基酸。在其它示例性实施方案中，肽接头的长度包括约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸。具体的接头的总氨基酸长度可以是约1-200个氨基酸、1-150个氨基酸、1-100个氨基酸、1-90个氨基酸、1-80个氨基酸、1-70个氨基酸、1-60个氨基酸、1-50个氨基酸、1-40个氨基酸、1-30个氨基酸、1-20个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。
如在本文其它地方描述的且在本领域已知，肽接头可使用任何一种或多种天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸、氨基酸类似物和/或氨基酸模拟物。可用作接头的某些氨基酸序列包括在Maratea等人,Gene 40:39-46,1985；Murphy等人,PNAS USA.83:8258-8262,1986；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号中公开的那些。具体的肽接头序列包含Gly、Ser和/或Asn残基。如果需要，也可将其它的接近中性的氨基酸如Thr和Ala用于肽接头序列。这些和相关氨基酸的其他组合对于本领域技术人员是显而易见的。
在具体实施方案中，所述接头序列包含含有三个甘氨酸残基的Gly3接头序列。在具体实施方案中，可通过能建模DNA结合位点和肽自身的计算机程序(Desjarlais&Berg,PNAS.90:2256-2260,1993；和PNAS.91:11099-11103,1994)，或通过噬菌体展示方法来合理的设计柔性(flexible)接头。
肽接头可以是生理上稳定的，也可以包括可释放的接头，如生理可降解的或酶可降解的接头(如,可通过蛋白水解切割的接头)。在某些实施方案中，一种或多种可释放的接头可使缀合物的半衰期更短，且清除更快速。这些或相关的实施方案可用于，例如，增加p97缀合物在血流中的溶解度和血液循环寿命，同时这也将试剂递送进了血流(或穿越BBB)，在接头被降解后基本上不含有p97序列。在那些当将多肽或其他试剂与p97序列永久缀合时显示活性降低的情况下，这些方面是特别有用的。通过使用本文提供的接头，当这些抗体为缀合形式时，其仍可维持它们的治疗活性。用这种和其它方法，可更有效地调整p97缀合物的特性，以随时间平衡抗体的生物活性和循环半衰期。
可适用于本发明具体实施方案的酶可降解接头包括但不限于：被丝氨酸蛋白酶如凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶、或枯草杆菌蛋白酶切割的氨基酸序列。
可适用于本发明具体实施方案的酶可降解接头还包括被基质金属蛋白酶，例如胶原酶、溶基质素(stromelysin)和明胶酶切割的氨基酸序列。
适用于本发明的具体实施方案的酶可降解接头还包括可以被血管紧张素转化酶切割的氨基酸序列。
适用于本发明的具体实施方案的酶可降解接头还包括可以被组织蛋白酶B降解的氨基酸序列。
然而，在某些实施方案中，非肽接头或肽接头的任何一种或多种是任选的。例如，当第一和第二多肽具有可用于将功能性结构域隔开并防止位阻干扰的非必需的N-末端和/或C-末端的氨基酸区域时，该融合蛋白中可能不需要接头序列。
可使用技术人员已知的多种方法来评估本文所述的p97多肽和p97多肽缀合物的功能特性，包括，例如，亲和力/结合分析(例如，表面等离子体共振、竞争性抑制分析)；使用体外或体内模型进行的细胞毒性分析、细胞活力分析、细胞增殖或分化分析、癌细胞和/或肿瘤生长抑制。例如，可测试本文所述的缀合物对受体内化的影响、体外和体内效果等，包括穿越血脑屏障的运送率。此类分析可通过技术人员已知的公认操作方案(参见，例如Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY)；Current Protocols in Immunology(编辑:John E.Coligan,AdaM.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober 2001 John Wiley&Sons,NY,NY)、或商业上可获得的试剂盒来进行。
使用方法和药物组合物
本发明的某些实施方案涉及本文所述的p97多肽和p97缀合物的组合物的使用方法。此类方法的示例包括治疗方法和诊断方法，包括例如，p97缀合物在治疗戈谢病中的用途。可以采用包括施用本发明的p97缀合物与其他治疗剂的组合疗法用于治疗戈谢病。
因此，某些实施方案包括对有需要的受试者进行治疗的方法，包括施用含有本文所述的p97缀合物的组合物。也包括将试剂递送至受试者的神经系统(如中枢神经系统组织)的方法，包括施用含有本文所述的p97缀合物的组合物。在这些和相关实施方案的某些中，所述方法相对于例如通过仅含有试剂的组合物的递送而言，提高了将试剂向中枢神经系统组织的递送率。
在一些示例中，受试者患有CNS疾病、病症或病况，在此种情况下，相对于周围组织，增加治疗试剂穿越血脑屏障至CNS组织的递送可以改善治疗，例如，通过降低与将试剂暴露于周围组织有关的副作用。示例性的CNS疾病、病症和病况包括溶酶体贮积症，例如戈谢病。
在一些情况下，受试者患有一种或多种溶酶体贮积病或处于患这种病的风险中。因此，某些方法涉及在需要其的受试者中治疗溶酶体贮积病，任选地与中枢神经系统有关的那些溶酶体贮积病。示例性的溶酶体贮积病包括：天冬氨酰葡萄糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、沃尔曼(Wolman)病、胱氨酸病、达农(Danon)病、法布里病、法伯脂质肉芽肿病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、1/11型半乳糖唾液酸贮积症、1/11/111型戈谢病、戈谢病、球形细胞脑白质营养不良、克拉伯(Krabbe)病、糖原贮积病II、庞贝氏病、1/11/111型GM1-神经节苷脂贮积症、I型GM2-神经节苷脂贮积症、泰萨克斯(Tay Sachs)病、II型GM2-神经节苷脂贮积症、山霍夫氏(Sandhoff)病、GM2-神经节苷脂贮积症、1/11型α-甘露糖苷贮积症、-甘露糖苷贮积症、异染性脑白质营养不良、I型粘脂质贮积症、1/11型唾液酸贮积症、粘脂质贮积症11/1111型-细胞病、粘脂质贮积症IIIC型假Hurler多营养障碍、I型粘多糖贮积症、II型粘多糖贮积症、亨特氏(Hunter)综合征、IIIA型粘多糖贮积症、圣菲利波氏(Sanfilippo)症、IIIB粘多糖贮积症、IIIC型粘多糖贮积症、111D型粘多糖贮积症、IVA型粘多糖贮积症、莫基奥(Morquio)综合征、粘多糖贮积症IVB型莫基奥综合征、VI型粘多糖贮积症、VII型粘多糖贮积症、斯赖(Sly)综合征、IX型粘多糖贮积症、多种硫酯酶缺乏症、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLNI贝敦氏(Batten)病、NB型尼曼-匹克(Niemann-Pick)病、尼曼-匹克病、CI型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、致密性成骨不全症、1/11型辛德勒病、辛德勒病以及唾液酸贮积症。在这些和相关实施方案中，如本文所述，可将p97多肽与一种或多种与溶酶体贮积症有关的多肽缀合。
戈谢病是最常见的溶酶体贮积病。它是由酶葡萄糖脑苷脂酶(也称为酸性β-葡糖苷酶)的遗传缺陷引起的。该酶作用于脂肪物质葡萄糖脑苷脂(也称为葡萄糖基神经酰胺)。当酶有缺陷时，该物质会积累，特别是在单核细胞谱系的细胞中积累。脂肪物质可以聚集在脾脏、肝脏、肾、肺、大脑和骨髓中。症状可能包括脾脏和肝脏肿大、肝功能不全、骨骼疾病和可能疼痛的骨骼病变、严重的神经系统并发症、淋巴结和(偶尔)相邻关节肿大、腹部膨大、皮肤呈褐色、贫血、低血小板和眼白(巩膜)上黄色脂肪沉积。受影响最严重的人也可能更容易受到感染。该病是由1号染色体上的隐性基因引起的，并且影响男性和女性。
戈谢病具有三种常见的临床亚型：
I型(或非神经性类型)是该疾病的最常见形式，大约每50,000例活产儿中就有1例发生。它最常发生在阿什肯纳兹犹太人的后代(heritage)中。症状可能始于生命的早期、或始于成年，包括肝脏肿大和脾脏严重肿大(一起称为肝脾肿大)；脾脏可能破裂并引起其他并发症。骨骼无力和骨骼疾病可能是广泛的。脾脏肿大和骨髓置换引起贫血、血小板减少和白细胞减少。大脑不受影响，但可能有肺部疾病，罕见有肾脏损害。该组患者通常容易瘀伤(由于血小板水平低)，并且由于红细胞数量少而感到疲劳。根据疾病的发作和严重程度，1型患者可能活到成年。许多患者患有轻度疾病或可能没有任何症状。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物用于治疗I型戈谢病。
II型(或急性婴儿神经性戈谢病)通常在出生后6个月内开始，发病率约为100,000活产儿中的1个。症状包括肝脏和脾脏肿大、脑部广泛和进行性损伤、眼运动障碍、痉挛、癫痫发作、肢体僵硬、以及吞咽能力差。患病儿童通常会在2岁时死亡。
III型(慢性神经病形式)可以在儿童期甚至成年后的任何时间开始，大约每100，000活产儿中就有1个发生。与急性或2型相比，它的特点是缓慢进行但较轻的神经系统症状。主要症状包括脾脏和/或肝脏肿大、癫痫发作、协调性差、骨骼异常、眼运动障碍、血液病症(包括贫血)和呼吸系统问题。患者常常活到十几岁和成年。
本文描述的识别患有一种或多种疾病或病状的受试者的方法是本领域已知的。
还包括对受试者的器官或组织部分成像的方法，包括(a)向受试者施用包含人p97(黑素转铁蛋白)多肽、或其变体的组合物，其中p97多肽与可检测实体缀合，以及(b)将在受试者、器官、或组织中的可检测实体可视化。
在具体的实施方案中，器官或组织隔室包括中枢神经系统(例如，脑、脑干、脊髓)。在特定实施方案中，器官或组织隔室包括大脑或其一部分，例如大脑的实质。
可采用各种方法来可视化在受试者、器官、或组织中的可检测实体。示例性的非侵入性方法包括放射线照射术(如，荧光镜检查和投影放射线照射术)、CT-扫描或CAT-扫描(计算机断层扫描(CT)或计算机轴向断层扫描(CAT))，是否使用X-射线CT-扫描、正电子发射断层扫描(PET)、或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、以及某些类型的磁共振成像(MRI)(特别是那些使用造影剂的)，包括其组合。仅以示例的方式，可用正电子发射造影剂、或放射性同位素(如18F)来实施PET，可用发射γ的造影剂或放射性同位素来实施SPECT，并且可用造影剂或放射性同位素来实施MRI。可将这些示例性造影剂或放射性同位素中任何一种或多种与p97多肽缀合或并入p97多肽，并且为了成像目的向受试者施用。
例如，可直接用这些放射性同位素中的一种或多种来标记p97多肽，或者可将p97多肽与包含这些放射性同位素造影剂中的一种或多种的分子(如小分子)、或与本文描述的其它任何缀合。
对于体内用途，例如，对于人类疾病的治疗、医学成像、或测试而言，在施用前通常将本文描述的缀合物掺入药物组合物。药物组合物包括本文描述的p97多肽或缀合物中的一种或多种，并组合有生理可接受的载体或赋形剂。
为了制备药物组合物，将有效量或期望量的一种或多种p97多肽或缀合物与本领域技术人员已知的任何药物载体或赋形剂混合，使之适合于施用的具体方式。药物载体可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外施用、皮内施用、皮下施用或局部施用的溶液或悬液可包括，例如，无菌稀释剂(如水)、盐溶液(如磷酸盐缓冲液；PBS)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗微生物剂(如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)以及螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲液(如醋酸、柠檬酸和磷酸)。如果通过静脉内施用，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇和其混合物。
可通过任何可接受的试剂施用方式施用纯化形式或合适的药物组合物的形式的本文描述的多肽和缀合物，以提供类似的功用。可将多肽、或缀合物、或含有缀合物的组合物与合适的生理可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来制备药物组合物，并且可制造为固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、散剂、颗粒、药膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球体和气雾剂。此外，其它的药学活性成分(包括如本文其它地方所述的其它的抗癌剂)和/或合适的赋形剂如盐、缓冲液和稳定剂，可能但不必需存在于组合物中。
施用可通过多种不同的途径来实现，包括口服、肠胃外、鼻、静脉内、皮内、皮下或局部。优选的施用方式取决于治疗或预防的病况的性质。
载体可以包括，例如，药学可接受的载体、赋形剂、或稳定剂，其在使用的剂量和浓度下，对与其暴露的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理可接受的载体是水性pH缓冲溶液。生理可接受的载体的实例包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括坏血酸；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双塘、以及其它的碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如聚山梨酸酯20(TWEENTM)、聚乙二醇(PEG)和泊洛沙姆(PLURONICSTM)等。
在某些方面，p97多肽序列和试剂分别单独、或作为已存在的缀合物与颗粒结合或被包封于颗粒内，如纳米颗粒、珠子、脂质制剂、脂质颗粒、或脂质体(如免疫脂质体)。例如，在具体实施方案中，将所述p97多肽序列结合于颗粒的表面，并且将目的试剂结合于颗粒的表面和/或包封于颗粒内。在这些和相关实施方案的一些中，将p97多肽与试剂仅通过颗粒本身(如纳米颗粒、脂质体)彼此共价连接或可操作地连接至彼此，并且不以任何其它方式彼此共价连接；即它们单独与同一颗粒结合。在其它实施方案中，p97多肽和试剂首先如本文所述彼此共价缀合或非共价缀合(如通过接头分子)，然后与颗粒结合或包封于颗粒内(如免疫脂质体、纳米颗粒)。在特定实施方案中，所述颗粒为脂质体，且所述组合物包含一种或多种p97多肽、一种或多种目的试剂、以及脂质的混合物以形成脂质体(如具有表面活性剂性质的磷脂、混合脂质链)。在一些方面，所述p97多肽和试剂单独与脂质/脂质体混合物混合，以使得形成的脂质体结构将p97多肽和试剂可操作地连接而不需要共价缀合。在其它方面，如本文所述，首先将p97多肽和试剂彼此共价或非共价缀合，然后将其与脂质混合以形成脂质体。可将p97多肽、试剂或p97-试剂缀合物包封进微胶囊中，所述微胶囊通过例如凝聚技术或界面聚合(如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备，包封进胶体药物递送系统(如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中。此类技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Oslo,A.编(1980)。所述颗粒或脂质体可进一步包括其它的治疗剂或诊断剂，如细胞毒性剂。
治疗的精确剂量和持续时间是被治疗疾病的函数，并且可使用已知的检验方案或通过在本领域已知的模型系统中将组合物进行检验并由此推断来根据经验确定。也可进行受控的临床试验。也可根据缓解的病况严重性来改变剂量。通常制造和施用药物组合物，从而在发挥治疗有效性作用的同时将不想要的副作用最小化。组合物可以施用一次，也可将其分成若干更小剂量在时间间隔内施用。对于任何具体受试者而言，可根据个体需要随时间调节具体的剂量方案。
因此，这些和相关药物组合物的典型施用途径包括但不限于：口服、局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、颊、直肠、阴道和鼻内施用。本文使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉注射、肌内注射、胸骨内注射或输注技术。制造根据本发明的某些实施方案的药物组合物，使得在向患者施用所述组合物时其含有的活性成分是生物可利用的。向受试者或患者施用的组合物可以是一个或多个剂量单位的形式，例如片剂可以是单个剂量单位，而本文描述的气雾剂形式缀合物的容器内可含有多个剂量单位。制备此种剂型的实际方法是已知的，或者对本领域那些技术人员将是显而易见的；例如，参见Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第二十版(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。不管怎样，用于治疗目的疾病或病况而施用的组合物应含有治疗有效量的本文描述的p97多肽、试剂或缀合物。
药物组合物可以是固体或液体形式。在一个实施方案中，所述载体是微粒，以使所述组合物是，例如呈片剂或散剂形式。所述载体可以是液体，而所述组合物是例如，口服油剂、可注射液体或气雾剂，其可用于如吸入施用。当意图口服施用时，所述药物组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬液和凝胶形式也作为固体或液体形式包含于本文所考虑的形式之内。
作为用于口服施用的固体组合物，可将所述药物组合物制备为粉剂、颗粒、压缩片、丸剂、胶囊、口香糖、薄片(wafer)等。此类固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。此外也可存在下述的一种或多种：粘合剂如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂如淀粉、乳糖或葡聚糖；崩解剂如海藻酸、海藻酸钠、初生凝胶(Primogel)、玉米淀粉等；润滑剂如硬脂酸镁或氢化植物油(Sterotex)；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；调味剂如薄荷、水杨酸甲脂或橙香精；和着色剂。当所述药物组合物是胶囊形式如明胶胶囊时，除上述类型的材料外，其还可以包含液体载体如聚乙二醇和油。
所述药物组合物可以是液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳剂或悬液。作为两个示例，所述液体可用于口服施用或通过注射递送。当意图口服施用时，优选除存在的化合物外，组合物还包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂或增味剂中的一种或多种。在意图通过注射施用的组合物中，可包含下述的一种或多种：表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等张剂。
所述液体药物组合物，不管它们是溶液、悬液或是其它相似的形式，可以包含下述佐剂中的一种或多种：用于注射的无菌稀释剂如水、盐溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等张氯化钠；固定油如合成的单甘酯或双甘酯，其可作为溶剂或悬浮介质、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它的溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、以及用于调节张力(tonicity)的试剂，如氯化钠或右旋糖。可将肠胃外制剂封闭于玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选的佐剂。可注射的药物组合物优选是无菌的。
意欲用于肠胃外施用或口服施用的液体药物组合物应含有如本文所述的量的p97多肽或缀合物，以获得合适的剂量。通常，该量是在组合物中有至少0.01％的目的试剂。当意欲口服施用时，该量可在组合物重量的0.1-约70％之间变化。某些口服的药物组合物含有在约4％和约75％之间的目的试剂。在某些实施方案中，制备根据本发明的药物组合物和制剂，以使在被稀释前肠胃外剂量单位含有0.01至10％之间重量的目的试剂。
可意欲将所述药物组合物进行局部施用，在这种情况下，所述载体可以适合地包括溶液、乳剂、油膏或凝胶基质。所述基质，例如，可包括下述的一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和醇，以及乳化剂和稳定剂。在局部施用的药物组合物中可以存在增稠剂。如果意图经皮施用，则所述组合物可以包括透皮贴剂或离子电渗疗法装置。
可意欲将所述药物组合物进行直肠施用，例如以栓剂的形式，其将在直肠中融化并释放药物。所述用于直肠施用的组合物可以包含油性基质作为合适的非刺激性赋形剂。此种基质包括但不限于：羊毛脂、可可油和聚乙二醇。
所述药物组合物可以包含不同的材料，这些材料可对固体或液体剂量单位的物理形式进行修饰。例如，所述组合物可以包含在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可选自，例如糖、虫胶和其它肠溶性的包衣剂。可选地，可将所述活性成分包裹在明胶胶囊中。固体或液体形式的药物组合物可以包含与所述缀合物或试剂结合的试剂，并因此有助于化合物的递送。可发挥这一作用的合适试剂包括单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白或脂质体。
所述药物组合物可基本上由可作为气雾剂施用的剂量单位构成。使用术语气雾剂以表示从胶体性质的系统到由加压包组成的系统范围内的多种系统。可以通过液化的气体或加压的气体，或者通过将活性成分分散的合适的泵系统来进行递送。可以在单相、双相或三相系统中递送气雾剂以递送活性成分。
气雾剂的递送包括必需的容器、活化剂、阀门、副容器等，可将其共同组成试剂盒。本领域普通技术人员不需过度实验即可确定优选的气雾剂。
可将包含如本文所述缀合物的组合物与载体一起制备，所述载体可保护缀合物免于被身体快速消除，其可为例如随时间释放的制剂或包衣。此类载体包括控释释放制剂，例如，但不限于：植入剂、微型胶囊递送系统、和生物可降解、生物相容性聚合物、例如，乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸以及本领域普通技术人员已知的其它聚合物。
可通过药物领域已知的方法学来制备所述药物组合物。例如，可通过将含有如本文所述缀合物的组合物和任选地盐、缓冲液和/或稳定剂中的一种或多种与无菌蒸馏水组合以形成溶液，从而制备意欲通过注射施用的药物组合物。可加入表面活性剂以促进形成均匀的溶液或悬液。表面活性剂是与缀合物非共价相互作用的化合物，以促进缀合物在水性递送系统中的溶解或均匀悬浮。
可施用治疗有效量的组合物，而治疗有效量可根据多种因素变化，这些因素包括：采用的特定化合物(如缀合物)的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间长度；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用模式和施用时间；排泄速率；药物组合；具体疾病或病况的严重性；以及正在接受治疗的受试者。
通常，治疗上有效的日剂量为(对于70kg哺乳动物而言)约0.001mg/kg(即～0.07mg)至约100mg/kg(即，～7.0g)；优选地，治疗有效剂量为(对于70kg的哺乳动物)从约0.01mg/kg(即～0.7mg)至约50mg/kg(即～3.5g)；更优选地，治疗有效剂量为(对于70kg的哺乳动物而言)从约1mg/kg(即～70mg)至约25mg/kg(即～1.75g)。
实施例
提供下列实施例用于说明目的，而不意欲限制以下权利要求的范围。
实施例1-融合：
p97片段DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)通过接头序列，例如(G4S)3、(G4S)2、或(EA3K)3与所想要的成熟酶的N-末端的第一个氨基酸遗传融合。然后将含有p97片段-酶序列的DNA质粒克隆到哺乳动物表达载体中，然后将其转染到细胞中以生产蛋白质。然后收获转染产物中的条件介质，并通过亲和色谱纯化。
实施例2-缀合
利用缀合技术，例如SoluLinkTM生物缀合方法或马来酰亚胺-硫醇相互作用方法(参见，例如https://www.trilinkbiotech.com/solulink/，可获得Solulink生物缀合产品的信息和可用性)，将p97片段DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)缀合至所想要的酶。通过使用4FB交联剂修饰p97片段和使用HyNic交联接头修饰酶来进行SoluLink生物缀合。两种修饰的生物分子的混合将产生通过HyNic修饰的酶与4FB修饰的p97片段的反应形成的稳定的、UV-可追踪的键。马来酰亚胺-硫醇缀合通过以下进行：用N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)修饰酶得到含有马来酰亚胺的酶，并在p97片段的c-末端添加半胱氨酸并随后进行p97片段的硫醇修饰。然后使含马来酰亚胺的酶与含硫醇的p97片段反应，并用半胱氨酸淬灭反应。
在整个申请中，通过作者姓名和日期，或者通过专利号或专利公开号来引用各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用其整体并入本文，以便更全面地描述截至本文所述和要求保护的发明日期的本领域技术人员已知的现有技术水平。然而，本文引用的参考文献不应被理解为承认这种参考文献是本发明的现有技术。
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的特定方法的许多等同形式。这样的等同形式被认为是在本发明的范围之内，并由以下权利要求书覆盖。
序列表
<110> 比奥阿赛斯技术有限公司
<120> 戈谢病的治疗
<130> 20053-PCT
<150> 62/677013
<151> 2018-05-27
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 738
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Arg Gly Pro Ser Gly Ala Leu Trp Leu Leu Leu Ala Leu Arg Thr
1 5 10 15
Val Leu Gly Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu
20 25 30
Gln His Lys Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile
35 40 45
Gln Pro Ser Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val
50 55 60
Gln Leu Ile Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Ile Tyr Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly
85 90 95
Glu Val Tyr Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val
100 105 110
Val Arg Arg Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys
115 120 125
Ser Cys His Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val
130 135 140
Gly Tyr Leu Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val
145 150 155 160
Leu Lys Ala Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala
165 170 175
Gly Glu Thr Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp
180 185 190
Ser Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr
195 200 205
Asp Tyr Ser Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val
210 215 220
Ala Phe Val Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr
225 230 235 240
Leu Pro Ser Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu
245 250 255
Cys Arg Asp Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His
260 265 270
Leu Ala Arg Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp
275 280 285
Gly Gly Leu Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser
290 295 300
His Glu Gly Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln
305 310 315 320
Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala
325 330 335
Thr Gln Thr Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met
340 345 350
Lys Gly Leu Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp
355 360 365
Cys Val Leu Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val
370 375 380
Ala Phe Arg Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala
385 390 395 400
Lys Ser Pro Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp
405 410 415
Ala Val Thr Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr
420 425 430
Gly Leu Val Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser
435 440 445
Asn Ser Tyr Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala
450 455 460
Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe
465 470 475 480
Gly Ser Pro Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg
485 490 495
Gly Phe Ile Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu
500 505 510
Phe Phe Asn Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro
515 520 525
Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys
530 535 540
Cys Val Gly Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe
545 550 555 560
Arg Cys Leu Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr
565 570 575
Thr Val Phe Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala
580 585 590
Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg
595 600 605
Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro
610 615 620
His Ala Val Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly
625 630 635 640
Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn
645 650 655
Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu
660 665 670
Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr
675 680 685
Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met
690 695 700
Ser Ser Gln Gln Cys Ser Gly Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ala Pro
705 710 715 720
Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ala Leu Ala Ala Arg Leu Leu Pro Pro
725 730 735
Ala Leu
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 3
Asp Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10

Claims (15)

1.一种治疗戈谢病的方法，其包括向受试者施用含有适合用于治疗戈谢病的活性试剂的治疗有效载荷，所述活性试剂偶联至基本上由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)组成的p97片段，其中所述施用促进治疗有效载荷穿过受试者的血脑屏障转运。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性试剂是人酶β-葡萄糖脑苷脂酶的类似物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性试剂通过基因活化技术在人成纤维细胞系中产生。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性试剂是溶酶体酶、β-葡萄糖脑苷脂酶的重组活性形式。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性试剂是葡萄糖基神经酰胺合酶抑制剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性试剂选自伊米苷酶、维拉西酶α和塔利苷酶α。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性试剂选自美格鲁特和依利格鲁司他及其药学上可接受的盐。
8.一种缀合物，其包含与适于治疗戈谢病的活性试剂缀合的p97片段，以形成p97-抗体缀合物，其中所述p97片段基本上由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)组成。
9.根据权利要求8所述的缀合物，其中所述p97片段具有一个或多个末端半胱氨酸和/或酪氨酸。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与C-末端酪氨酸组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
11.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与C-末端半胱氨酸组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
12.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与N-末端酪氨酸组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
13.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与N-末端半胱氨酸组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
14.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与C-末端酪氨酸半胱氨酸二肽组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
15.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述p97片段由DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO：2)与N-末端酪氨酸半胱氨酸二肽组成，并且其中所述p97片段和所述活性试剂由约1-20个氨基酸长的肽接头分开。
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