JP2012523836A - Ｔｎｆファミリー受容体を標的とし、ｔｎｆ作用を拮抗するペプチド、その組成物、方法および使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＴＮＦのモジュレーター、特にペプチドおよびその誘導体、とりわけＴＮＦおよびＴＮＦにより介在される反応、活性またはシグナル伝達を拮抗するＧＥＰペプチドを提供する。本発明は、ＴＮＦを拮抗する方法、および炎症性疾患および状態などのＴＮＦにより介在される疾患または反応を調節する方法を提供する。他の炎症性メディエーターなどを組み合わせたＧＥＰペプチドの組成物を提供する。関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病（Ｃｈｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、炎症性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患などＴＮＦにより介在される疾患および炎症状態を処置、緩和、または予防する方法を提供する。

Description

政府の支援
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、国立関節炎、骨格筋、皮膚疾患研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ Ｓｋｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）が交付するＮＩＨ／ＮＩＡＭＳ １ Ｋ０１ ＡＲ０５３２１０およびＮＩＨ／ＮＩＡ １ Ｒ０３ ＡＧ０２９３８８による政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

本発明は全般的にＴＮＦ／ＴＮＦＲのモジュレーターに関し、特にＴＮＦおよびＴＮＦ／ＴＮＦＲにより介在される反応、活性またはシグナル伝達を拮抗するペプチドおよびその誘導体に関する。本発明はさらに、ＴＮＦを拮抗する方法、ならびに炎症性疾患および状態などＴＮＦにより介在される疾患または反応の調節に関する。

関節炎の進行において、滑膜、軟骨および骨はどれも、発生病理に関与すると考えられる増殖因子、サイトカインおよび炎症性メディエーターの産生が増加する部位である［１、２］。骨と滑膜はどちらも関節炎の発生病理に重要な役割を果たしているけれども［１、３］、疾患修飾性治療薬の開発努力はほとんどが軟骨内の分子現象に重点を置いてきた。関節炎における軟骨細胞は、増殖、退行性の変化、さらに最終的には死など一連の複雑な変化を起こす。様々な病期におけるこうした表現型の変化の調節については集中的な研究が行われており、これらの個々の軟骨細胞応答をそれぞれ調節する生体力学的および生化学的シグナルに焦点が当てられている［２、４］。この調節カスケードにおいて、軟骨細胞はそれ自体が主要な役割を演じており、外部からの生体力学的および生化学的刺激の標的であるだけでなく、軟骨細胞自体が、関節軟骨の悪化を助長するサイトカイン、プロテアーゼおよび炎症性メディエーターの供給源でもある［１、２］。関節炎における軟骨細胞により産生される病因分子には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−Ｉ）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭＴＳ、一酸化窒素、プロスタグランジンおよびロイコトリエン類がある［２、４］。関節炎における軟骨細胞は、増殖因子の放出の増加、ならびにＩＩ型コラーゲン、プロテオグリカンおよび他の細胞外マトリックスタンパク質の合成のほか、軟骨前駆細胞の肥大表現型と関連する遺伝子の発現など、タンパク同化作用（ａｎａｂｏｌｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の増強を示すという証拠もある［５〜７］。

過去２０年におけるリウマチ学の研究の非常に多くは、治療的価値がある特異的アンタゴニストの開発を目指して、関節リウマチ（ＲＡ）の炎症および変性過程に関わるサイトカインおよびメディエーターを同定することに着目してきた。ＴＮＦ−αは、プロ炎症性サイトカインカスケードの最上流に位置し、ＲＡの発生病理を支配しているため、すべての因子の中で最も大きな注目を集めている。この説を、以下を含む多くの証拠が裏付けている：（１）ＲＡ患者の炎症を起こした滑膜および軟骨では、ＴＮＦ−αが高レベルで発現する；（２）抗ＴＮＦ−αは、ＩＬ−Ｉなど他のプロ炎症性サイトカインの産生を阻害する；さらに（３）ＴＮＦ−αは、関節の炎症を誘発し、メタロプロテイナーゼを誘導して軟骨破壊の引き金となり、破骨細胞形成および骨吸収を刺激する。最も重要なのは、ＲＡの抗ＴＮＦ治療が、炎症を低下させ、患者の機能および活力を改善し、さらに軟骨および骨の糜爛を抑制することにより、顕著な結果を示していることである。現在、ＴＮＦリガンドを標的とすることによる抗ＴＮＦ処置剤には、エタネルセプト（エンブレル、可溶
性ＴＮＦＲ２−ＩｇＧ１融合タンパク質）、インフリキシマブ（レミケード、ＴＮＦ−αに対するキメラモノクローナル抗体）、およびアダリムマブ（ＴＮＦ−αに対するヒト型モノクローナル抗体）の３種類があり、関節リウマチなど様々な種類の炎症性疾患の処置に臨床的に使用されている。ここに来て、操作されたタンパク質／ペプチドが、治療製品の新しい傾向になっている。実際、設計されたタンパク質／ペプチド治療薬は現在、ＦＤＡにより毎年承認される新規な低分子薬剤の数を上回り、これを凌いでいる。サイトカインを直接標的としてこれを全身性に除去（リガンド除去）する抗体およびイムノアドヘシンは、効果的な治療戦略（たとえばエタネルセプト、アダリムマブおよびインフリキシマブ）になっており、一部の適応症では、サイトカイン受容体の選択的標的化（たとえばアナキンラ）により、非常に効果的な臨床結果が実現できる。

グラニュリン／エピテリン前駆体（ＧＥＰ）は、ＰＣ細胞由来増殖因子（ＰＣＤＧＦ）、アクログラニン、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）、プロエピセリン（ＰＥＰＩ）、またはＧＰ８０とも呼ばれ、組織培養のコンディション培地から増殖因子として最初に精製された［８、９、６５、６６、６７］。ＧＥＰは、見掛けの分子量が８０ｋＤａの５９３アミノ酸の分泌糖タンパク質で［１０、１４］、自己分泌増殖因子として働く。ＧＥＰは、Ｐ−Ｇ−Ｆ−Ｂ−Ａ−Ｃ−Ｄ−Ｅ（Ａ〜Ｇが完全なリピートで、Ｐが半分のモチーフである）の順で７つのリピートと半分のリピートとのシステインリッチのｍｏｔｉｆ（ＣＸ₅
〜₆ＣＸ₅ＣＣＸ₈ＣＣＸ₆ＣＣＸＤＸ₂ＨＣＣＰＸ₄ＣＸ₅〜₆Ｃ）（配列番号９）を含む（図１）。コンセンサス配列のＣ末端領域は、保存された配列ＣＣＸＤＸ₂ＨＣＣＰ（配列番
号１０）を含んでおり、金属結合部位を持ち、かつ調節機能に関与していることが示唆される［１５］。目を引くのは、ＧＥＰが、生物活性を保持するグラニュリン（またはエピテリン）として知られる６ｋＤａの小さな反復単位を遊離するタンパク質プロセシングを受け［１６］、ペプチドが、細胞増殖アッセイにおいて活性であり［１３］、炎症に関係している可能性があることである［１７］。

ＧＥＰは、周期が速い上皮細胞、免疫系の細胞、およびニューロンで豊富に発現する［１０〜１２、１７］。いくつかのヒト癌では、高レベルのＧＥＰ発現が認められており、乳癌、腎明細胞癌、浸潤性卵巣癌、膠芽細胞腫、脂肪細胞の奇形腫、および多発性骨髄腫など多様な癌における腫瘍形成に関与している［１６、１８〜２４］。ＧＥＰは主に分泌増殖因子として機能するけれども、細胞内に局在し、細胞内活性を直接調節することも明らかになった［１２、２５〜２７］。細胞増殖の調節におけるＧＥＰの役割については、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）遺伝子を標的として欠失させたマウス由来のマウス胚線維芽細胞（Ｒ細胞）を用いて特性が解明されている。これらの細胞は、ＩＧＦ−Ｉ、および細胞周期の進行に必要な他の増殖因子（ＥＧＦおよびＰＤＧＦ）に応答して増殖することができない［２８］。これに対し、ＧＥＰは、ＩＧＦ−ＩＲの条件を無視でき、したがってＲ細胞の増殖を促進する、唯一知られている増殖因子である［１３、２９］。さらにＧＥＰが分化、発生および病理学的過程の調節に関係していることを示す証拠も増加している。ＧＥＰは、中皮の分化［３０］、脳の性分化［３１］、マクロファージの発生［３２］、および関節リウマチおよび変形性関節症の滑膜［３３］由来の発現量に差のある遺伝子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅ）として単離されてきた。さらにＧＥＰは、傷害反応および組織修復の極めて重要なメディエーターであることも示された［２１、３４］。ＧＥＰの突然変異は、１７番染色体に連鎖するタウ陰性前頭側頭型認知症を引き起こすことが報告された［３５〜３８］。ＧＥＰの作用機序は、大部分が依然として不明である。ＧＥＰ関連タンパク質の中には、様々な過程においてＧＥＰ作用に影響を与えるものがあることが報告されている。一例として、分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）がある。エラスターゼは、グラニュリン間のリンカーにおいてもっぱらＧＥＰを消化し、その結果グラニュリンペプチドが産生されたことから、このプロテアーゼが、重要なＧＥＰコンバターゼであることが示唆される。ＳＬＰＩは、エラスターゼに直接結合するか、あるいはグラニュリンペプチドをこの
酵素から隔離することにより、このタンパク質分解を遮断する［３４］。ＧＥＰは、ヒトサイクリンＴ１［２６］およびＴａｔ−Ｐ−ＴＥＦｂ［２５］と相互作用することにより転写活性を調節することができる。ＧＥＰはさらに、ヘパラン硫酸プロテオグリカンのパールカンと相互作用することも明らかになった。パールカン−ヌルマウスは、重度の骨格異常を呈する［１９、３９〜４１］。

サイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーは、炎症、器官形成、宿主防御、自己免疫およびアポトーシスなど複数の生物学的機能において決定的な役割を果たす。これらの強力な生物学的メディエーターの作用は、受容体−リガンド相互作用を通じて、細胞内シグナル伝達を行い、細胞表現型の変化をさせることにより達成される。このリガンドは、三量体を形成し、それに対応する受容体に結合することによりその機能を発揮する。その後、受容体のオリゴマー化により、受容体の細胞内ドメインの立体構造が変化し、次いでアダプタータンパク質のＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）ファミリーのメンバーが結合し、シグナル伝達カスケードを惹起することが可能になる。ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲ１、ＴｒｋＡ、ＮＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＯＸ−４０、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ４およびＲＡＮＫは、様々なＴＲＡＦ分子（１〜６など）と相互作用するＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーのいくつかを含む（Ｌｅｗｉｔ−Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９：３８９−３９２（１９８８）、Ｂａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ．７３：４３１−４４５（１９９３），Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．３：１０３１−１０３９（１９９５），Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．４：５６３−５７１（１９９９），Ｍｏｎｇｋｉｌｓａｐａｙａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．６：− １０４８− １０５３（１９９９），Ｃｈａ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１ １７１−３１ １７７（２０００））．

２つのＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２）は、細胞に広範に発現し、それらの同族のリガンド、すなわち中心的なプロ炎症性サイトカインＴＮＦαと相互作用する［４２〜４４］。ＴＮＦαが病態生理学において、非常に重要な機能を促進し、細胞増殖、分化および死を強く妨害する因子であることは、広く認められている。ＴＮＦは、感染および免疫学的傷害に対する急性反応を調整するだけでなく、生理的ホメオスタシスおよび調節の回復に必要なバランス因子（ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）としても働くようである［４５］。ＴＮＦαは、骨格の発達に影響を与え、小児の長軸成長に影響することが知られている炎症性疾患の大部分でそのレベルが高いことが明らかになっている［４６、４７］。ＴＮＦアンタゴニストエタネルセプト（エンブレル）で処置した難治性若年性特発性関節炎の小児は、追いつき成長（ｃａｔｃｈ−ｕｐ ｇｒｏｗｔｈ）を示した［４６、４７］。ＴＮＦαは、中足骨器官培養において成長板軟骨細胞を制御し、長軸成長を抑制する［４８］。

関節炎は、主に高齢者集団に起こる変性関節疾患であり、米国では現在、４６，０００，０００を超える人が罹患している。典型的な臨床症状は、疼痛およびこわばりであり、特に長時間の活動後に顕著である。工業化社会では、関節炎は、身体障害の主要な原因であり、保健医療の利用を増大させ、生活の質を悪化させた。今後数十年で人口が増加すると共に高齢化するため、関節炎の状態の影響は、増大することが予想される。関節炎疾患の有病率にもかかわらず、その正確な病因、発生病理および進行については、分からないままである。関節炎の病理学的過程における炎症性サイトカインおよび増殖因子の重要性を証明する証拠が蓄積されている。関節炎の関節における関節軟骨および骨の細胞外マトリックスの破壊には、過剰なサイトカイン活性、および炎症性サイトカインとその生理的アンタゴニストとの間の不均衡が介在する。このため、軟骨細胞および関節炎を制御する増殖因子と、サイトカインの作用を拮抗する阻害剤との単離は、病態生理学的観点および治療的観点の両方から見て非常に重要である。我々は以前に、軟骨の形成に決定的な役割
を果たす新規な軟骨形成増殖因子としてグラニュリン／エピテリン前駆体（ＧＥＰ）を同定した（Ｘｕ，Ｋ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（１５）：１ １３４７−１ １３５５；国際公開第２００８／０９４６８７Ａ２号パンフレット）。

当該技術分野においては、炎症性疾患および状態の過程に関する理解を深め、より完全なものとし、それにより、特にＴＮＦファミリーメンバーにより介在される過程および状態に対する介入に関する理解を深め、より完全なものとすることが依然として求められている。このため、本発明の目的は、炎症性関節炎など様々な種類のＴＮＦ関連疾患に対する新しい抗ＴＮＦ／ＴＮＦＲ治療介入を開発するため、増殖因子およびサイトカインが軟骨発生および関節炎を制御する分子機構に関する我々の理解をメディエーターにまで広げことにある。

本明細書の参考文献の引用については、そうした文献が本発明の先行技術であることを承認するものと解釈してはならない。

ＧＥＰの生物学的特性を踏まえ、ＧＥＰは、他の既知の増殖因子と同様に「古典的」膜受容体を介して作用し得るとの仮説を立てられている。これまでのところ、機能的受容体は同定されていない。本明細書に記載の我々の機能遺伝子のスクリーニングが、新規なＧＥＰ結合受容体としてのＴＮＦ受容体の単離につながった。我々の研究により、ＧＥＰ（グラニュリン／エピテリン前駆体）が、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を直接標的とする最初の増殖因子であることが明らかにされる。このため、ＧＥＰおよびその誘導ペプチドは、サイトカイン受容体に作用する新規な抗ＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達遮断薬となる。

本明細書に記載の研究により、ＧＥＰがＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達の新規なアンタゴニストであることが明らかにされる。本知見からは、１）ＧＥＰがＴＮＦ受容体に用量依存的に直接結合する；２）中和抗体または組換え細胞外ドメインによりＴＮＦ受容体を遮断すると、細胞増殖の刺激におけるＧＥＰ機能が停止する；３）ＧＥＰは、Ｅｒｋ１／２シグナル伝達を強力に、Ａｋｔ経路を中程度に活性化する；４）ＧＥＰは、ＴＧＦβサブファミリー下流の分子であることが知られているＢＭＰ２などの遺伝子を活性化する；さらに、ＧＥＰにより介在されるこれらの遺伝子発現の誘導は、ＴＮＦ受容体に依存する；５）ＧＥＰは、関節炎応答遺伝子であり、そのレベルは関節炎の患者で著しく高かった；６）ＧＥＰは、ＴＮＦαのアンタゴニストとして、ＴＮＦαにより誘導される炎症反応およびアポトーシスを劇的に低下させる；さらに７）重要な点として、ＧＥＰは、関節リウマチなど様々な種類の炎症性疾患および状態の処置に臨床的に使用されているエンブレルおよびレミケードより、ＴＮＦ刺激性の炎症に対して優れた（少なくとも同等の）阻害作用を示すことが明らかにされる。これらの知見により、ＧＥＰが、ＴＮＦ受容体を直接標的とすることによるＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達の新規な天然のアンタゴニストであることが明らかにされる。

本発明は、ＧＥＰおよびＧＥＰペプチド、特にａｔｓｔｔｒｉｎと呼ばれるペプチドを、特にＴＮＦにより介在されるシグナル伝達または応答を阻害または遮断するＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性およびシグナル伝達のモジュレーターとして、とりわけＴＮＦ／ＴＮＦＲのアンタゴニストとして提供する。

本発明は、ＴＮＦファミリーメンバー受容体、特にＴＮＦＲを拮抗し、ＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達などのＴＮＦファミリーメンバーのシグナル伝達を遮断したり、阻害したり、低下させたり、あるいは予防したりするペプチドを提供する。本発明は、ＴＮＦファ
ミリーメンバー受容体、特にＲＡＮＫを拮抗し、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬシグナル伝達などのＴＮＦファミリーメンバーのシグナル伝達を遮断したり、阻害したり、低下させたり、あるいは予防したりするペプチドを提供する。

特定の実施形態では、本発明は、ＴＮＦファミリー／受容体のシグナル伝達および応答、特にＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達および応答を調節できる、とりわけ拮抗できるＧＥＰペプチドおよびａｔｓｔｔｒｉｎのうち本明細書に開示したファミリーのすべてのメンバーに関する。このペプチドのファミリーは、特に１つまたは複数のグラニュリンユニット、およびＧＥＰの１つまたは複数のリンカーユニットを含む、ＧＥＰ配列とハーフユニットとを混合した部分などのフラグメントまたは一部を含む。一態様では、このペプチドは、グラニュリンユニットの２つ以上のハーフユニット、およびＧＥＰの１つまたは複数のリンカーユニットを含む。

本発明の特定の態様では、ＧＥＰペプチドは、グラニュリンユニットＡ、ＣおよびＦのハーフユニットとリンカーユニットＰ３、Ｐ４およびＰ５とを組み合わせた組み合わせを含む。特定の態様では、このＧＥＰペプチドは、少なくとも１つのハーフユニットが１／２Ｆであるグラニュリンユニットのハーフユニットと、リンカーユニット、特に少なくとも２つのリンカーユニットとの組み合わせを含む。さらに特定の態様では、ａｔｓｔｔｒｉｎは、図２４に示すアミノ酸配列を持ち、配列番号２に示すものなどグラニュリンユニットおよびリンカーユニットの１／２Ｆ−Ｐ３−Ｐ４−１／２Ａ−Ｐ５−１／２Ｃを含む。

本発明は、当然ながら、本明細書に説明するもの、および／または公知の組換え技法を用いたものなど、本発明のＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎを調製するための複数の手段を意図している。したがって、本発明は、その範囲内にそうした合成調製物を包含することを意図している。本明細書に開示されるアンタゴニストのアミノ酸配列の決定により、様々な合成方法または任意の公知の組換え技法のいずれかによるペプチドの再生が促進される。したがって、本発明は、組換えＤＮＡ技法による宿主系での発現に適した、本発明のペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター、および結果得られる形質転換された宿主に及ぶものである。

本発明はさらに、組換えＤＮＡ分子、組換え核酸、もしくはクローン化遺伝子、またはその縮重変異体に関する、好ましくは、核酸分子、特に図２４に示す１つまたは複数のＧＥＰペプチドのアミノ酸またはその変異体をコードする組換えＤＮＡ分子またはクローン化遺伝子に関する。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子、組換え核酸、またはその縮重変異体、好ましくは核酸分子は、１つまたは複数のグラニュリンユニット、および図１に示したような、および図２３のＧＥＰの配列に示したようなＧＥＰの１つまたは複数のリンカーユニットを含み、ＴＮＦ／ＴＮＦＲを拮抗できるＧＥＰペプチドをコードする。さらに特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子、組換え核酸、またはその縮重変異体、好ましくは核酸分子は、ＴＮＦ／ＴＮＦＲを拮抗でき、グラニュリンユニットおよびリンカーユニット１／２Ｆ−Ｐ３−Ｐ４−１／２Ａ−Ｐ５−１／２Ｃ（配列番号２）を含む、図２４に示すようなＧＥＰペプチドａｔｓｔｔｒｉｎをコードする。

本発明は、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎを含むか、あるいはそれに基づく、治療方法に使用される医薬組成物を提供することを目的とする。この医薬組成物は、ＴＮＦアンタゴニスト活性を持つ１つまたは複数のＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎの組み合わせを含む。医薬組成物は、ＴＮＦアンタゴニスト活性を持つ１つまたは複数のＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎと、１つまたは複数の炎症性メディエーターとの組み合わせを含む。炎症性メディエーターは、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド、コルチコステロイド、他のＴＮＦアンタゴニスト（
たとえばエタネルセプト、アダリムマブおよびインフリキシマブ）、およびサイトカイン受容体アンタゴニスト（たとえばアナキンラ）を含み、これらから選択してもよい。医薬組成物は、ＴＮＦアンタゴニスト活性を持つ１つまたは複数のＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎと、１つまたは複数の炎症性メディエーター、免疫調節薬（ｉｍｍｕｎｏｄｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）または抗癌剤との組み合わせを含む。

さらなる実施形態では、本発明は、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／もしくはａｔｓｔｔｒｉｎ、またはそれらの活性フラグメントのＴＮＦ／ＴＮＦＲアンタゴニスト活性に基づくか、あるいは同じ活性を有することが確認された作用物質または他の薬剤に基づくと考えられる、ある種の治療方法に関する。このため、本発明は、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性により介在される疾患、および／または、ＴＮＦファミリーリガンド／受容体活性により促進または誘導される疾患、および／または、炎症を特徴とする疾患を予防および／または処置する方法を提供する。本発明は、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病（Ｃｈｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、炎症性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患などのＴＮＦにより介在される疾患および炎症状態、または免疫学的な状態を処置、緩和または予防する方法を提供する。

一態様では、本発明は、ＧＥＰ、ＴＮＦ、ＧＥＰ／ＴＮＦＲおよび／またはＴＮＦ／ＴＮＦＲにより介在される腫瘍または癌を処置、緩和または予防する方法を提供する。このため、腫瘍細胞または癌性細胞／前癌細胞の成長および／または増殖がＧＥＰ、ＴＮＦ、ＧＥＰ／ＴＮＦＲおよび／またはＴＮＦ／ＴＮＦＲの活性またはシグナル伝達に依存するか、またはそれらにより促進される腫瘍状態、癌性状態または前癌状態が、本発明のＴＮＦ／ＧＥＰアンタゴニストペプチドに感受性があり得ると考えている。本発明はさらに、ＧＥＰペプチド、特にＧＥＰにより介在される癌または細胞増殖を阻害または遮断するａｔｓｔｔｒｉｎの使用および応用を意図している。

さらに詳しくは、本治療方法は、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性により介在される疾患、および／または、ＴＮＦファミリーリガンド／受容体の活性により促進または誘導される疾患、および／または、炎症を特徴とする疾患を、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／もしくはａｔｓｔｔｒｉｎ、またはそのサブユニットに基づくＴＮＦの効果的なアンタゴニストを含む医薬組成物を投与することにより、あるいは、たとえば、薬剤スクリーニングアッセイにより開発される他の同等に効果的な薬剤、本発明の別の態様に従い調製および使用される他の同等に効果的な薬剤を投与することにより、処置、予防または緩和する方法を提供する。特定の態様では、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、および／またはａｔｓｔｔｒｉｎは、ＴＮＦ／ＴＮＦＲにより介在される疾患もしくは状態、または炎症性疾患もしくは状態を処置、緩和または予防するために投与してもよい。

さらなる態様では、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎまたはそのサブユニットは、アレルギー、自己免疫疾患、および特にＴＮＦ／ＴＮＦＲが関与または関係している他のこうした免疫状態などの免疫学的傷害を調節する方法、予防する方法、処置する方法、または緩和する方法に利用してもよい。このため、自己免疫性状態、アレルギー状態または他のこうした免疫学的状態における免疫および／または炎症応答は、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎまたはそのサブユニットにより調節してもよい。そうした一態様では、ループスおよび多発性硬化症などの自己免疫疾患を、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎまたはそのサブユニットにより調節しても、緩和しても、あるいは処置してもよい。

特に、本明細書に記載するもの、および本明細書の図２３および２４に示すものなど、本発明のＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎペプチド、それらの抗体、アゴニスト、模倣体またはそれらの活性フラグメントは、ＴＮＦ／ＴＮＦＲにより介在される状態
または炎症を処置または緩和するためなど、抗ＴＮＦまたはＴＮＦ／ＴＮＦＲファミリーアンタゴニストの活性および／または治療が適切である場合に投与する医薬製剤として調製してもよい。ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよびａｔｓｔｔｒｉｎペプチドは、配列番号１および８に記載されるような例示的なＧＥＰ、ならびに配列番号２および３〜７に記載するようなＧＥＰペプチドまたはａｔｓｔｔｒｉｎペプチド、およびそれらの変異体またはサブユニットを含む。本明細書のＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎの特異性により、現在の抗ＴＮＦおよび／または抗炎症性治療剤の後遺症を管理しやすくすることができ、それにより一般的な抗ＴＮＦおよび／または抗ＴＮＦファミリー剤として広く適用することが可能になると考えられる。

本発明は、ＧＥＰペプチドの活性と類似することにより標的哺乳動物細胞のＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性の調節に効果的である可能性がある薬剤または化合物をスクリーニングするためのアッセイ系を含む。この態様は、ＧＥＰおよびａｔｓｔｔｒｉｎペプチドと同様に、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性の調節に効果的な別の活性ＧＥＰフラグメント、グラニュリン／リンカーユニットの組み合わせ、誘導体、変異体およびアミノ酸改変体をスクリーニングするためのアッセイを含む。一例では、被験薬または化合物を、ＴＮＦαを含む細胞サンプルに投与してＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性を活性化し、被験薬または化合物のＴＮＦα活性に対する作用を、対照と比較することにより判定する。この場合、対照はＧＥＰ、活性ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎである。

アッセイでは、対照量（ｃｏｎｔｒｏｌ ｑｕａｎｔｉｔｙ）のＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎ、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、またはこれらに対する抗体、もしくは同種のものを調製し、酵素、特異的結合パートナーおよび／または放射性元素で標識してもよく、次いで細胞サンプルに導入してもよい。標識した材料またはその結合パートナーがサンプル内の部位と反応する機会を得た後、結合した標識の性質によって異なることがある、得られた塊を公知の技法により調べればよい。同位元素³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³⁶Ｃ
ｌ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁹⁰Ｙ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉおよび¹⁸⁶Ｒｅなどの放射性
標識を使用する場合、現在利用できる公知の計数手順を利用してもよい。標識が酵素である場合、検出は、当該技術分野において公知の現在利用されている比色アッセイ法、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定法またはガス定量法のいずれかにより達成してもよい。

他の目的および利点は、以下の説明図を参照しながら展開される下記の説明の概説から当業者に明らかになるであろう。

ＧＥＰ増殖因子の構造を示す。このユニットのコンセンサス配列Ｃはシステインを、Ｄはアスパラギン酸を、Ｐはプロリンを、Ｔはトレオニンを、Ｇはグリシンを、Ｈはヒスチジンを表し、点は任意のアミノ酸を表す。 （Ａ）は、酵母におけるＴＮＦＲに対するＧＥＰの結合を示す。各プラスミド対は、図示したように、酵母菌株ＭＡＶ２０３に同時形質転換した。酵母形質転換体は、ＳＤ−ｌｅｕ−／ｔｒｐ−／ｈｉｓ−／ｕｒａ−／３ＡＴ⁺プレートで選択し、β−ガラクトシダーゼ活性について試験した。ｃ−Ｊｕｎとｃ−Ｆｏｓとの間の公知の相互作用を陽性対照として使用し、Ｒｂおよびラミンとの間の相互作用がないものを陰性対照として使用した。（Ｂ）は、ＧＥＰが軟骨細胞内でＴＮＦＲ２に結合することを示す。ヒト軟骨細胞から調製した細胞抽出物を、対照ＩｇＧ、抗ＴＮＦＲ２抗体、続いてプロテインＡ−アガロースとインキュベートした。免疫沈降させたタンパク質複合体および細胞抽出物（レーン１、陽性対照）を、抗ＧＥＰ抗体を用いた免疫ブロットで調べた。 マイクロタイタープレートにコートした組換えＧＥＰに対するＴＮＦＲ１細胞外ドメイン（ＴＮＦＲ１ＥＣＤ）、およびＴＮＦＲ２細胞外ドメイン（ＴＮＦＲ２ＥＣＤ）の固相結合を示す。 （Ａ）は、ＧＥＰに結合するＴＮＦＲ２のフラグメントのマッピングに使用したＴＮＦＲ２コンストラクトの模式図を示す。（Ｂ）は、β−ガラクトシダーゼアッセイを示す。 ＭＴＴアッセイを示す。ヒト軟骨細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＧＥＰ（ＧＥＰ）、またはＧＥＰと１ｕｇ／ｍｌの抗ＴＮＦＲ１（ＧＥＰ＋ＴＮＦＲ１ ａｂ）、抗ＴＮＦＲ２（ＧＥＰ＋ＴＮＦＲ２ ａｂ）、もしくは１ｕｇ／ｍｌの抗ＩＧＦＩＲ（ＧＥＰ＋ＴＧＦ１Ｒ ａｂ、対照として使用）と、のいずれかの非存在下（ＣＴＲ）または存在下で培養し、ＭＴＴアッセイを用いて細胞増殖を解析した。 ＧＥＰがヒトＣ２８Ｉ２軟骨細胞内でＡｋｔおよびＥｒｋ１／２経路を活性化することを示す。フィルムの長時間（５分）曝露およびフィルムの短時間（３０秒）曝露の両方を示している点に注意されたい。 ５０ｎｇ／ｍｌのＧＥＰの存在下で培養した初代野生型（Ｂ６）、ＴＮＦＲ１−／−、およびＴＮＦＲ２−／−ＭＬＥ細胞を用いたリアルタイムＰＣＲによる、遺伝子Ｇａｄｄ４５ｂ、ＪｕｎＢ、ＫＬＦ２、Ｓｍａｄ７、Ｓｏｘ４およびＴｃｆ８の様々な時点での発現プロファイリングを示す。 シグナル伝達および標的遺伝子発現などの細胞内現象を図示するモデルを示す。 左は、ＴＮＦＲに結合するＧＥＰのフラグメントのマッピングに使用したＧＥＰコンストラクトの模式図である。右は、β−ガラクトシダーゼアッセイを示す。 左は、ＧＥＰコンストラクトの模式図を示す。右は、β−ガラクトシダーゼアッセイを示す。 左は、ＧＥＰコンストラクトの模式図を示す。右は、β−ガラクトシダーゼアッセイを示す。 左は、ＴＮＦＲに結合するＧＥＰのフラグメントのマッピングに使用したＧＥＰコンストラクトの模式図を示す。右は、β−ガラクトシダーゼアッセイを示す。 左は、ＴＮＦＲに結合するＧＥＰのフラグメントのマッピングに使用したＧＥＰコンストラクトの模式図を示す。右は、β−ガラクトシダーゼアッセイを示す。 左は、ＴＮＦＲに結合するＧＥＰのフラグメントのマッピングに使用したＧＥＰコンストラクトの模式図を示す。右は、β−ガラクトシダーゼアッセイを示す。 左は、ＴＮＦＲに結合するＧＥＰのフラグメントのマッピングに使用したＧＥＰコンストラクトの模式図を示す。右は、β−ガラクトシダーゼアッセイを示す。 （Ａ）は、Ａｔｓｔｔｒｉｎが、ＴＮＦが引き金となる呼吸性バーストを用量依存的（ｄｏｅｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）に阻害することを示す。（Ｂ）は、ＴＮＦが引き金となる呼吸性バーストに対するＡｔｓｔｔｒｉｎ、レミケードおよびエンブレルの作用を示す。結果は、３回の培養により１．５×１０４細胞／ウェルで産生されたｎｍｏｌのＨ２Ｏ２の平均値である。 ＴＵＮＥＬ染色アッセイを示す。ラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞およびヒトＣ２８Ｉ２軟骨細胞を２４時間血清飢餓状態にし、外因性の増殖因子およびサイトカインの作用を除去した。その後、細胞を、０．０２％ＢＳＡ（ＣＴＲ）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＥＰ（ＧＥＰ）、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、またはＧＥＰ＋ＴＮＦ−αで３６時間刺激した。アポトーシスは、ＴＵＮＥＬアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。 ＧＥＰが、ＴＮＦα誘導性のメタロプロテイナーゼを阻害することを示す。ヒト軟骨の外植片を、図示したような様々な量のＧＥＰを補充した５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαの非存在下あるいは存在下、無血清培地で１日間培養し、リアルタイムＰＣＲを行った。単位は任意単離であり、各群の一番左のバーは、相対レベル１を示す。 Ａｔｓｔｔｒｉｎ、エンブレルおよびレミケードの抗炎症機序を説明すると考えられるモデルを示す。Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＴＮＦ受容体に直接結合することによりＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達を遮断するのに対し、エンブレルおよびレミケードは、ＴＮＦリガンドを標的とすることによりシグナル伝達を妨げる。 Ａｔｓｔｔｒｉｎが、癌細胞のＧＥＰ刺激性の細胞増殖を中和することを示す（ＭＴＴアッセイ）。ＲＣＳ軟骨肉腫（左パネル）およびＳａｏｓ−２骨肉腫（右パネル）を、図示したように様々な量のＡｔｓｔｔｒｉｎを使用してあるいは使用せずにＧＥＰ（２００ｎｇ／ｌ）の非存在下（ＣＴＲ）または存在下で培養し、ＭＴＴアッセイを用いて細胞増殖を解析した。 空気嚢型急性炎症モデルのマウス無細胞滲出液中のＩＬ−６およびＩＬ−１３のレベルを示す。対照（ＣＴＲ）、およびレミケード（１０μｇ／ｇ）、ＧＥＰ（１０μｇ／ｇ）、およびＡｔｓｔｔｒｉｎ（１０μｇ／ｇ）を投与した動物におけるＩＬ−６およびＩＬ−１３のレベルを図示する。 ＴＲＡＰ染色で判定した、ＲＡＮＫＬ誘導性の破骨細胞形成を示す。マクロファージＲａｗ２６４．７を、ＲＡＮＫＬ単独の存在下で、あるいは様々な量のＧＥＰまたはａｔｓｔｔｒｉｎと一緒に４日間インキュベートした。 ５９３アミノ酸であるヒトＧＥＰのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。 ａｔｓｔｔｒｉｎペプチドの配列（配列番号２）、および様々な他の被験ペプチドの配列（それぞれ配列番号３〜７）を示す。 （Ａ）および（Ｂ）は、（Ａ）マウスＧＥＰの構造、および（Ｂ）マウスＧＥＰのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。（Ｂ）のグラニュリンユニットＧｒｎＡ、ＧｒｎＣ、ＧｒｎＤおよびＧｒｎＥを下線で示し、各ユニットで表示する。 ＧＥＰが、ＴＮＦＲだけでなく、ＲＡＮＫおよびＦＡＳに結合するのに対して、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＴＮＦＲに特異的に結合することを示す（酵母ツーハイブリッドアッセイ）。プラスミド対をそれぞれ、図示したように、酵母菌株ＭＡＶ２０３に同時形質転換した。酵母形質転換体は、ＳＤ−ｌｅｕ−／ｔｒｐ−／ｈｉｓ−／ｕｒａ−／３ＡＴ⁺プレートで選択し、β−ガラクトシダーゼ活性について試験した。Ｒｂとラミンとの間の相互作用がないものを陰性対照（Ｎｅｇ．ＣＴＲ）として使用した。 ＴＮＦＲ１（Ｒ１）およびＴＮＦＲ２（Ｒ２）に対するＧＥＰ（ＰＧＲＮ）およびＴＮＦαの結合に関するＦａｓｔＳｔｅｐ（商標）カイネティックアッセイを示す。 （Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）は、（Ａ）組換えＡｔｓｔｔｒｉｎの特徴付けを示す。グルタチオンアガロース樹脂にコンジュゲートしたＧＳＴ−Ａｔｓｔｔｒｉｎ、および活性化血液凝固第Ｘ因子（ｆａｃｔｏｒ Ｘａ）により遊離されたＡｔｓｔｔｒｉｎを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、このタンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色した。（Ｂ）および（Ｃ）は、ＴＮＦＲ１（Ｒ１）およびＴＮＦＲ２（Ｒ２）に対するＡｔｓｔｔｒｉｎおよびＴＮＦαの結合に関するＦａｓｔＳｔｅｐ（商標）カイネティックアッセイを示す。 ＧＥＰ、ＡｔｓｔｔｒｉｎおよびＧＥＰ＋Ａｔｓｔｔｒｉｎを用いて行ったｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＥＲＫおよびチューブリン対照に対するＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）マルチプレックスウエスタンブロットの結果を示す。ＧＥＰは、Ａｋｔ経路およびＥｒｋ１／２経路をどちらも活性化するが、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、活性化しない。組み合わせた研究では、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、発癌性のｐ−ＡＫＴ経路およびｐ−ＥＲＫ経路の、ＧＥＰにより介在される活性化を遮断した。 （Ａ）および（Ｂ）は、ＰＢＳで処置したＣＩＡマウス（ｎ＝１０）、Ａｔｓｔｔｒｉｎで処置したＣＩＡマウス（ｎ＝１０）、またはエンブレルで処置したＣＩＡマウス（ｎ＝１０）の重症度（Ａ）（臨床スコアによる）、および関節炎の発生率（Ｂ）を示す。 正常マウス、およびＰＢＳ、Ａｔｓｔｔｒｉｎ、またはエンブレルで処置したＣＩＡマウスの前足（上）および後足（下）の写真を示す。 （Ａ）および（Ｂ）は、図示したようにＨ＆Ｅまたはサフラニン０で染色した、ＰＢＳ処置動物およびＡｔｓｔｔｒｉｎ処置動物の各足首の（Ａ）断面を示す。Ｈ＆Ｅのパネルの矢印はそれぞれ組織破壊および細胞浸潤を示す。サフラニン（Ｓａｒｆａｎｉｎ）０のパネルの矢印は、マトリックス染色の消失を示す。（Ｂ）は、ＰＢＳ処置動物およびＡｔｓｔｔｒｉｎ処置動物の足首のＭｉｃｒｏＣＴ画像を示す。 ＰＢＳ処置動物およびＡｔｓｔｔｒｉｎ処置動物のＴＲＡＰ染色の画像を示す。ＰＢＳ処置動物のＴＲＡＰ＋破骨細胞は赤色染色で示されるが、Ａｔｓｔｔｒｉｎ処置動物ではほとんど検出できない。視覚的に強調するため、異なる倍率像を示す。 プロ炎症性サイトカインＩＬ−１βおよびＩＬ−６、ならびに抗炎症性サイトカインＩＬ−１０およびＩＬ−１３に対するＡｔｓｔｔｒｉｎの作用を、対照のＰＢＳ（陰性対照）およびエンブレル（陽性対照）と比較して示す。＊、＊＊および＊＊＊はそれぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１を示す。 関節炎を誘導するためのコラーゲン免疫から２５日以降の、ＰＢＳ、エンブレル、またはＡｔｓｔｔｒｉｎのいずれかで処置したＣＩＡ動物の臨床スコアのデータを示す。 ＴＮＦ誘導性のニトリット生成に対するＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎの作用を示す。図示したように、ＴＮＦαを、０．３ｎＭ、１．５ｎＭまたは７．５ｎＭのＧＥＰ、Ａｔｓｔｔｒｉｎまたはエンブレルと共に、ＲＡＷ２６４．７細胞に加え、μＭのニトリットを測定した。 ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−αおよびＧＥＰ、またはＴＮＦ−αおよびＡｔｓｔｔｒｉｎの存在下で、ＲＡＷ２６４．７細胞の免疫蛍光法により、ＮＦ−κＢのＴＮＦ誘導性の核内蓄積を評価する。細胞をＮＦ−κＢ ｐ６５に対して染色する一方、核をＤＡＰＩ染色し、さらに２つの染色に対して組み合わせた。ＧＥＰまたはＡｔｓｔｔｒｉｎの存在下では、ＮＦ−κＢ染色は細胞質内にとどまる。 ＴＮＦ−α単独の存在下での、あるいは濃度を上げながらＧＥＰまたはＡｔｓｔｔｒｉｎのどちらかと組み合わせたときの、ＴＮＦ活性化ＮＦκＢレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｄ）遺伝子の誘導倍率を示す。ＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎは、ＴＮＦ−αにより介在されるＮＦκＢレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｄ）遺伝子の活性化を阻害する。

本発明によれば、当該技術分野の技術の範囲内にある従来の分子生物学技法、微生物学技法および組換えＤＮＡ技法を使用してもよい。こうした技法については、文献に十分に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４））］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（ＭＪ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」 ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」 ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照されたい。

したがって、以下の用語が出現する場合、その用語には、以下に記載の定義を与えるものとする。

「Ａｔｓｔｔｒｉｎ」、「ＴＮＦ受容体を標的としたＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達のアンタゴニスト」、「ａｔｓｔｔｒｉｎペプチド」、「ＴＮＦアンタゴニストペプチド」という用語、および特に記載していない任意の変異体は、本明細書において同義に使用されることがあり、本出願および特許請求の範囲において使用される場合、１つまたは複数のタンパク質を含むペプチド、特にＧＥＰまたはＧＥＰのフラグメントに由来するペプチドをいい、本明細書に記載し、図２４に示し、さらに図１５に図示するアミノ酸配列データを持ち、かつ本明細書に説明および記載し、特許請求の範囲に規定される活性および能力特性を有するタンパク質まで及ぶ。本明細書には、ＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達のアンタゴニストとしての活性を持ち、ＴＮＦαなど１つまたは複数のＴＮＦ受容体に結合できる活性ＧＥＰペプチドが含まれ、提供される。ヒトＧＥＰの全長配列を図２３に示す。マウスＧＥＰの全長配列を図２５に示す。以上のように、ＧＥＰ配列に由来する、あるいはＧＥＰ配列を含み、かつＴＮＦおよび／またはＴＮＦファミリーアンタゴニスト活性を持つＴＮＦアンタゴニストペプチドは、本明細書に包含される。これらのａｔｓｔｔｒｉｎペプチドは、ペプチドのフラグメント、変異体、および誘導体を含み、包含する。したがって、実質的に同等の活性を示すタンパク質、およびその改変体であるタンパク質も、同様に意図している。これらの改変体は、たとえば、部位特異的変異誘発により得られた改変体など人為的なものであっても、あるいは複合体またはその命名されたサブユニットの産生体である、宿主中で突然変異により得られた改変体など偶発的なものであってもよい。さらに、ヒトａｔｓｔｔｒｉｎに対応するマウスもしくは他の種またはオーソログのＧＥＰ配列および活性ＧＥＰペプチド配列も意図している。さらに、「Ａｔｓｔｔｒｉｎ」、「ＴＮＦ受容体を標的としたＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達のアンタゴニスト」、「ａｔｓｔｔｒｉｎペプチド」、「ＴＮＦアンタゴニストペプチド」という用語は、その範囲内に、本明細書に具体的に記載したタンパク質だけでなく、実質的に同種の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）アナログおよび対立遺伝子変異をすべてを含むことも意図している。

本明細書に記載のアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体であると好ましい。しかしながら、そのポリペプチドが免疫グロブリン結合について所望の機能（ｆｕｃｔｉｏｎａｌ）特性を保持している限り、任意のＬ−アミノ酸残基の代わりに「Ｄ」異性体の残基を使用してもよい。ＮＨ₂とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨ
とは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。標準的なポリペプチド命名法であるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に従い、アミノ酸残基の略語を以下の対応表に示す：
対応表
記号 アミノ酸
１文字 ３文字
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｔ Ｔｈｒ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｋ Ｌｙｓ リジン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｃ Ｃｙｓ システイン

本明細書では、アミノ酸残基の配列はすべて、左および右の方向性について、従来のアミノ末端からカルボキシ末端方向とする方式により表される点に留意されたい。さらに、アミノ酸残基配列の始めまたは終わりのダッシュは、ペプチドが１つまたは複数のアミノ酸残基の他の配列に結合していることを示す点にも留意されたい。上記の表は、３文字記号と１文字記号とが対応するように表示されており、これらの記号は交互に出現する場合がある。

「レプリコン」とは、インビボでのＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製することができる任意の遺伝子エレメント（たとえば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。

「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントを結合させて、結合したセグメントの複製を起こすことができるプラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。

「ＤＮＡ分子」とは、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）の一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのどちらかの重合体をいう。この用語は、分子の一次および二次構造のみをいい、ＤＮＡ分子を任意の特定の三次形態に限定するものではない。このため、この用語には、特に、直鎖状ＤＮＡ分子（たとえば、制限酵素断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について検討する場合、本明細書では、非転写ＤＮＡ鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同である配列を持つ鎖）に沿って５’〜３’方向の配列のみを記載する通常の慣習に従い、配列を記載することがある。

「複製起点」とは、ＤＮＡ合成に関わるＤＮＡ配列をいう。

ＤＮＡ「コード配列」とは、適切な制御配列の制御下に置かれたときに、インビボで転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３¹（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによ
り決定される。コード配列は、以下に限定されるものではないが、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（たとえば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、コード配列の３’側に位置する。

転写および翻訳制御配列とは、宿主細胞においてコード配列の発現を規定するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターおよび同種のものなど、ＤＮＡ制御配列である。

「プロモーター配列」とは、結合細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。本発明の定義では、プロモーター配列は、その３¹末端に転写開始部位が結合し、バックグラウンドを超
える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５¹方向）に伸びている。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレ
アーゼＳ１によるマッピングで決定すると都合がよい）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合に関わるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。真核生物プロモー
ターは、必ずではないが多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは、−１０コンセンサス配列および−３５コンセンサス配列に加えてシャインダルガノ配列を含む。

「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでｍＲＮＡが、コード配列がコードするタンパク質に翻訳されるとき、細胞内の転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。

「シグナル配列」は、コード配列の前にあってもよい。この配列は、宿主細胞と情報交換してポリペプチドを細胞表面に導く、あるいはポリペプチドを培地に分泌する、ポリペプチドのＮ末端にあるシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞から遊離する前に宿主細胞により切除される。シグナル配列は、原核生物および真核生物に由来する様々なタンパク質で見出すことができる。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明のプローブに言及して本明細書で使用する場合、２つ以上のリボヌクレオチド、好ましくは４つ以上のリボヌクレオチドからなる分子と定義される。その正確な大きさは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途により左右される多くの要因によって異なる。

「プライマー」という用語は、本明細書で使用する場合、精製された制限酵素消化断片のように天然に存在するか、あるいは人工的に作製するかに関係なく、核酸鎖と相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下で好適な温度およびｐＨに置かれたとき、合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、一本鎖でも、あるいは二本鎖でもよいが、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成を開始するのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源および方法の用途など多く要因によって異なる。たとえば、診断に使用する場合、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは通常、１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むけれども、より少ないヌクレオチドを含んでもよい。

本明細書において、プライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の様々な鎖と「実質的に」相補的であるように選択する。これは、プライマーが、そのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。たとえば、非相補的ヌクレオチドフラグメントが、プライマーの５’末端に結合し、残りのプライマー配列がこの鎖と相補的であってもよい。あるいは、非相補的塩基またはより長い配列をプライマーに組み込んでもよく、ただし、プライマー配列は、プライマー配列とハイブリダイズし、それにより伸長産物の合成のための鋳型となる鎖の配列と十分な相補性を有するものとする。

本明細書で使用する場合、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、それぞれ二本鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列またはその近傍で切断する細菌酵素をいう。

外来または異種ＤＮＡを細胞内に導入してあるとき、その細胞は、そうしたＤＮＡにより「形質転換され」ている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合して）いても、あるいはいなくてもよい。原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、たとえば、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメント（ｅｐｉｓｏｍａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）で維持してもよい。真核細胞に関しては、安定な形質転換細胞とは、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれているため、形質転換ＤＮＡ
は染色体の複製により娘細胞に遺伝する細胞である。この安定性は、真核細胞が、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを樹立する能力により明らかにされる。「クローン」は、単細胞または有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞集団である。「細胞株」は、多くの世代にわたってインビトロで安定な増殖が可能な初代細胞のクローンである。

ＤＮＡコンストラクトの「異種」領域とは、より大きなＤＮＡ分子内で同定可能なＤＮＡのセグメントで、本来それより大きな分子と一緒に見出されないものである。したがって、異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、その遺伝子は通常、由来生物のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接することになる。異種コード配列の別の例として、コード配列自体が自然界に見出されないコンストラクト（たとえば、ゲノムコード配列がイントロン、またはネイティブな遺伝子と異なるコドンを持つ合成配列を含むｃＤＮＡ）がある。対立遺伝子変異または自然発生する変異現象により、本明細書に定義するようなＤＮＡの異種領域は生じない。

２つのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の規定の長さにわたりヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）が一致する場合、「実質的に相同」である。実質的に相同である配列は、配列データバンクで提供される標準的なソフトウェアを使用して、あるいは、たとえば、その特定の系に定義されるストリンジェントな条件下、サザンハイブリダイゼーション実験により、配列を比較することにより特定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の決定は、当該技術分野の技術の範囲内である。たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，上掲；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ＆ＩＩ，上掲；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，上掲を参照されたい。配列番号と同じアミノ酸配列を持つａをコードするが、配列番号に縮重するをコードするＤＮＡ配列も、本発明の範囲内であることを理解されたい。「に縮重する」とは、異なる３文字コドンを使用して個々のアミノ酸を特定することを意味する。それぞれの特定のアミノ酸をコードするためにいくつかのコドンが交換して使用できることは当該技術分野において周知である。たとえば、以下に限定されるものではないが、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）は、ＵＵＡまたはＵＵＧまたはＣＵＵまたはＣＵＣまたはＣＵＡまたはＣＵＧのいずれかによりコードされる場合があり、セリン（ＳｅｒまたはＳ）は、ＵＣＵまたはＵＣＣまたはＵＣＡまたはＵＣＧまたはＡＧＵまたはＡＧＣのいずれかによりコードされる場合がある。これらの例示的に記載したコドンは、ＲＮＡ配列のコドンであることを理解すべきである。ＤＮＡに対応するコドンは、ＵをＴに置き換えたものである。

発現制御配列がＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するとき、そのＤＮＡ配列は、発現制御配列に「作動的に連結されて」いる。「作動的に連結される」という用語は、適切な開始シグナル（たとえば、ＡＴＧ）が、発現されるＤＮＡ配列の前にあることと、発現制御配列の制御下でＤＮＡ配列の発現、およびＤＮＡ配列がコードする所望の産物の産生ができるように正しいリーディングフレームを維持することとを含む。組換えＤＮＡ分子に挿入したい遺伝子が、適切な開始シグナルを含まない場合、そうした開始シグナルは遺伝子の前に挿入すればよい。

「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の塩および温度条件が５×ＳＳＣおよび６５℃と実質的に同等である条件をいう。しかしながら、当業者であれば、こうした「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、緩衝液中のナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さおよび濃度、ミスマッチの比率、ホルムアミドの比率、および同種のものなど個々の条件によって異なることを理解するであろう。さらに、「標準的なハイブリダイゼーション条件」の決定には、ハイブリダイズする２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−Ｄ
ＮＡであるかどうかも重要である。こうした標準的なハイブリダイゼーション条件は、当業者により公知の式に従い容易に決定され、ハイブリダイゼーションは典型的には予想されるまたは測定されたＴ_mより１０〜２０℃低く、洗浄は、必要に応じて、よりストリン
ジェントにする。

本明細書で使用する場合、「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」または「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｕｌ」または「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」はリットルを意味する。

ＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、および／またはａｔｓｔｔｒｉｎには、アミノ酸が置換または修飾されるように、あるいは、特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変化するように、突然変異を作製してもよい。こうした突然変異は一般に、ヌクレオチドの変化をできる限り少なくして作製する。この種の置換突然変異は、結果得られるタンパク質のアミノ酸を非保存的に変化させて（すなわち、コドンを、特定の大きさまたは特徴を持つアミノ酸群に属するアミノ酸から、別の群に属するアミノ酸に変化させて）作製しても、あるいは保存的に変化させて（すなわち、コドンを、特定の大きさまたは特徴を持つアミノ酸群から、同じ群に属するアミノ酸に変化させて）作製してもよい。こうした保存的変化は一般に、結果得られるタンパク質の構造および機能における変化が小さくなる。非保存的変化は、結果得られるタンパク質の構造、活性または機能が変化する可能性が高くなる。本発明は、結果得られるタンパク質またはペプチドの活性または結合特性を著しく変化させない保存的変化を含む配列を含むと見なすべきである。本発明は、結果得られるタンパク質またはペプチドの活性または結合特性を著しく変化させない保存的および／または非保存的変化を含む配列を含むと見なすべきである。

以下は、様々なアミノ酸群の一例である：
無極性Ｒ基を持つアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
非電荷極性Ｒ基を持つアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
電荷極性Ｒ基を持つアミノ酸（ｐＨ６．０で負電荷を持つ）：アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正電荷を持つ）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）
別の群には、フェニル基を持つアミノ酸があり得る：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン。

別の群は、分子量（すなわち、Ｒ基の大きさ）によるものである：
グリシン ７５
アラニン ８９
セリン １０５
プロリン １１５
バリン １１７
トレオニン １１９
システイン １２１
ロイシン １３１
イソロイシン １３１
アスパラギン １３２
アスパラギン酸 １３３
グルタミン １４６
リジン １４６
グルタミン酸 １４７
メチオニン １４９
ヒスチジン（ｐＨ６．０） １５５
フェニルアラニン １６５
アルギニン １７４
チロシン １８１
トリプトファン ２０４

特に好ましい置換は、下記である：
−正電荷を維持できるようなＡｒｇからＬｙｓへの置換およびその逆；
−負電荷を維持できるようなＡｓｐからＧｌｕへの置換およびその逆；
−遊離−ＯＨを維持できるようなＴｈｒからＳｅｒへの置換；および
−遊離ＮＨ₂を維持できるようなＡｓｎからＧｌｎへの置換。

アミノ酸置換はまた、特に好ましい特性を持つアミノ酸を置換するために導入してもよい。たとえば、もう１つのＣｙｓとジスルフィド架橋の可能がある部位にＣｙｓを導入してもよい。特に「触媒作用のある」部位としてＨｉｓを導入してもよい（すなわち、Ｈｉｓは、酸または塩基として働くことができ、生化学的触媒作用において最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、特にその平面構造のため、導入してタンパク質の構造に−ターンを誘導してもよい。

２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）が同一であるか、または保存的置換に相当する場合、「実質的に相同」である。

「抗体」は、特定のエピトープに結合する抗体およびそのフラグメントなど任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナルおよびキメラ抗体を包含し、最後に記載した用語については、米国特許第４，８１６，３９７号明細書および同第４，８１６，５６７号明細書に詳述されている。

「抗体結合部位」とは、抗原に特異的に結合する、重鎖および軽鎖の可変および超可変領域からなるその抗体分子の構造部分である。

文法上様々な形をとる「抗体分子」という語句は、本明細書で使用する場合、インタクトな免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分をどちらも含むことを意図している。

例示的な抗体分子には、インタクトな免疫グロブリン分子と、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子と、当該技術分野においてＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦ
（ｖ）として公知の部分を含むパラトープを含む、それらの免疫グロブリン分子の各部分（これらの部分は、本明細書に記載の治療方法に使用するのに好ましい）とがある。

抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂部分はそれぞれ、よく知られた方法による、実
質的にインタクトな抗体分子に対するパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応により調製する。たとえば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓらへの米国特許第４，３４２，５６６号明細書を参照されたい。また、Ｆａｂ’の抗体分子部分もよく知られており、Ｆ（ａｂ’）₂部分を作製し、続いてメルカプトエタノールなどで２つの重鎖部分を結合する
ジスルフィド結合を還元し、続いて結果得られるタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドなどの試薬でアルキル化する。本明細書では、インタクトな抗体分子を含む抗体が
好ましい。

文法上様々な形をとる「モノクローナル抗体」という語句は、特定の抗原と免疫反応することができる抗体結合部位を１種しか持たない抗体をいう。このため、モノクローナル抗体は通常、免疫反応する任意の抗原に対する結合親和性が均一である。したがって、モノクローナル抗体は、各々が異なる抗原免疫特異的である複数の抗体結合部位を持つ抗体分子、たとえば、二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含んでもよい。

「薬学的に許容される」という語句は、生理学的に許容され、かつヒトに投与したときに、通常アレルギー、または急性胃蠕動（ｇａｓｔｒｉｃ ｕｐｓｅｔ）、眩暈および同種のものなど類似の有害反応を起こさない分子的実体および組成物をいう。

「治療有効量」という用語は、医師（ｍｅｄｉｃａｌ ｄｏｃｔｏｒ）または他の臨床医が求めている、被検体の生物学的または医学的反応を引き起こす薬剤、化合物、ペプチドまたは医薬剤の量を意味する。本明細書では、「治療有効量」という語句を、標的細胞または細胞塊のＳ期の活性、または、たとえば、その存在と活性により起こり得る血圧上昇、発熱もしくは白血球数など他の病理学的変化の特徴における臨床的に重要な変化を予防し、好ましくは少なくとも約３０パーセント、一層好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント低下させるのに十分な量を含むものとして使用する。

「予防する」または「予防」という用語は、疾患の発症の前に病原体にさらされるか、または疾患に感染しやすい可能性がある被検体の疾患または障害に罹患する、あるいはそれらを発生するリスクを低下させる（すなわち、疾患の臨床症状の少なくとも１つが発生しなくなる）ことをいう。

「予防法」という用語は、「予防」という用語に関連し、かつ「予防」という用語を包含し、その目的が疾患の処置または治癒というよりも予防である措置または手順をいう。予防措置の非限定的な例として、ワクチンの投与；たとえば、不動状態により血栓症のリスクがある病院患者への低分子量ヘパリンの投与；およびマラリアが風土病となっている、またはマラリアに接触するリスクが高い地域を訪れる前に、クロロキンなどの抗マラリア薬を投与することがある。

「溶媒和物」という用語は、本発明に有用な化合物と１つまたは複数の溶媒分子との物理的結合を意味する。この物理的結合は、水素結合を含む。場合によっては、溶媒和物は、たとえば、１つまたは複数の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に取り込まれたとき、単離することができる。「溶媒和物」は、溶液相および単離可能な溶媒和物をどちらも包含する。代表的な溶媒和物として、水和物、エタノレートおよびメタノラートが挙げられる。

「被検体」という用語は、ヒトおよび他の哺乳動物を含む。

任意の疾患または障害を「処置すること」または「処置」という用語は、一実施形態では、疾患または障害を寛解させる（すなわち、疾患を阻止するか、またはその臨床症状の少なくとも１つの症候、程度または重症度を軽減することをいう）− 別の実施形態では、「処置すること」または「処置」とは、被検体により認識できない少なくとも１つの身体的パラメーターを改善することをいう。なお別の実施形態では、「処置すること」または「処置」とは、身体的に、（たとえば、認識できる症状の安定化）、生理学的に、（たとえば、身体的パラメーターの安定化）、またはその両方で疾患または障害を調節することをいう。さらなる実施形態では、「処置すること」または「処置」は、疾患の進行を遅
延させることに関する。

「炎症を特徴とする疾患」、「炎症性疾患」という用語は、炎症に関連する、少なくとも一部が炎症に起因する、あるいは炎症を含む疾患をいう。この用語は、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病（Ｃｈｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、炎症性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患から選択される例示的な疾患を含むが、これに限定されるものではない。

「炎症性メディエーター」という用語は、炎症反応または炎症応答を増強、惹起、または促進するメディエーターをいい、以下から選択することができる：サイトカイン（たとえばＴＮＦα、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１３、ＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（たとえばＭＤＣ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＭＩＰ−Ｉα）、プロスタグランジン（たとえばＰＧＤ２）、ロイコトリエン類（たとえばＬＴＢ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４）、メタロプロテアーゼ、キマーゼ、トリプターゼ、増殖因子（たとえばＶＥＧＦ）。

関節炎疾患の有病率にもかかわらず、その正確な病因、発生病理および進行については、分からないままである。関節炎の病理学的過程における炎症性サイトカインおよび増殖因子の重要性を証明する証拠が蓄積されている。このため、軟骨細胞および関節炎を制御する増殖因子と、サイトカインの作用を拮抗する阻害剤との単離は、病態生理学的観点および治療的観点の両方から見て非常に重要である。グラニュリン／エピテリン前駆体（ＧＥＰ）は、たとえば国際公開第２００８／０９４６８７Ａ２号パンフレットに、およびＬｉｕら（Ｘｕ，Ｋ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（１５）：１１３４７−１１３５５）により記載されているように、軟骨の形成に決定的な役割を果たす新規な軟骨形成増殖因子として以前に認められている。

本発明は、増殖因子ＧＥＰが、ＴＮＦ受容体と直接結合し、関節炎の中心的な炎症性サイトカイン、ＴＮＦαの天然のアンタゴニストとして働くことを証明する。したがって、本発明の目的は、増殖因子およびサイトカインが軟骨発生および関節炎を制御する分子機構についての理解を広げることと、ＧＥＰ、特にそれから誘導される活性ペプチド、とりわけ新規な抗ＴＮＦ／ＴＮＦＲモジュレーターとしてのａｔｓｔｔｒｉｎ、および／またはその誘導体または変異体を提供することとにある。本明細書において、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＴＮＦに結合し、それを拮抗し、ＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達を変化させることが証明される。本明細書において、ＧＥＰは、ＴＮＦファミリーメンバーであるＲＡＮＫに結合することが証明される。このため、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、および／またはａｔｓｔｔｒｉｎは、関節炎などの炎症状態、変形性関節症、骨粗鬆症および骨肉腫などの骨疾患、ならびに癌状態など様々な種類のＴＮＦ関連疾患の治療介入に適用可能であり、かつ有用である。

当業者は、インビボでのＴＮＦ／ＴＮＦＲの調節を詳細に判定するなど、本発明のＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎ、または本発明で同定された、または本発明による作用物質または化合物の詳細または追加の評価、判定、スクリーニングおよび／または確認を行うため、ＴＮＦ／ＴＮＦＲファミリーにより介在される疾患または状態のインビボの動物モデルを利用してもよい。ＴＮＦ／ＴＮＦＲにより介在される疾患もしくは状態、炎症状態、免疫疾患もしくは状態（アレルギー、自己免疫疾患など）、骨疾患もしくは状態、または他の標的可能な状態の発症および進行を仲介する、緩和する、あるいは制御するにあたって、組換えＧＥＰおよびＧＥＰ誘導ペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎの適用性を証明するための動物モデルは、容易に入手できる。動物モデルまたは研究は、本明細書およびその例に記載および詳述されたものを含む。ＴＮＦαトランスジェニックマウスは、関節炎を発症し、関節リウマチの新規な治療戦略の有効性を評価する有用な手段となる。動物モデルとして、潰瘍性大腸炎モデル、多発性硬化症モデル（ＥＡＥ、リ
ゾレシチン誘導性など）、関節炎モデル、アレルギー性喘息モデル、気道炎症モデル、乾癬モデルおよび急性炎症モデルがあるが、これに限定されるものではない。多発性硬化症のＥＡＥ動物モデルは、急性もしくは慢性で再発を繰り返す、後天性の炎症性および脱髄性自己免疫疾患を提供する。アレルギーモデルは、免疫学的傷害および状態のモデルとして利用してもよい。変形性関節症モデルとしては、たとえばウサギの膝前十字靭帯を切除して誘導した実験的変形性関節症、およびラットの内側側副靭帯を断裂して誘導した実験的変形性関節症がある。適切な骨疾患、骨損傷、および／または骨粗鬆症モデルも当業者に知られており、入手可能である。

本発明は、関節リウマチおよび変形性関節症の予防、処置または緩和のためのＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎ、および／またはこれらの誘導体の使用および用途を含む。本発明は、炎症状態、自己免疫疾患を含む免疫状態、骨疾患および癌などのＴＮＦ関連疾患の予防、処置または緩和のためのＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎ、および／またはこれらの誘導体の使用および用途を含む。ＴＮＦ関連疾患として、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病（Ｃｈｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、炎症性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、骨粗鬆症、骨肉腫が挙げられる。本発明は、炎症性障害の予防、処置または緩和のための、および／または必要とされる抗ＴＮＦ／ＴＮＦＲ作用を正確に送達することによる炎症性障害の特定の治療介入のための、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎ、および／またはこれらの誘導体の使用および用途を含む。本発明は、組織修復を促進または媒介するためのＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎ、および／またはこれらの誘導体の使用および用途を含む。本発明は、アレルギー、ならびにループスおよび多発性硬化症といった自己免疫疾患などの免疫学的傷害および状態の予防、処置または緩和のためのＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎ、および／またはこれらの誘導体の使用および用途を含む。本発明は、ＧＥＰおよび／またはＴＮＦ／ＴＮＦＲにより介在される癌もしくは他のそうした過剰増殖性障害などの癌、および腫瘍または癌細胞の増殖の予防、処置または緩和のためのＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎ、および／またはこれらの誘導体の使用および用途を含む。

本明細書に記載するようなＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎなどのＴＮＦアンタゴニストペプチドの存在により生じる診断上と治療上の可能性はどちらも、このペプチドが、直接の原因となりＴＮＦとのタンパク質間相互作用に関わり、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性および／またはシグナル伝達を遮断する、阻害する、拮抗する、妨害する働きをするという事実に由来するものである。したがって、本発明は、ＴＮＦ／ＴＮＦＲおよび／またはＴＮＦファミリー／ＴＮＦファミリーＲにより惹起されたり、促進されたり、あるいは媒介されたりする活性、シグナル、および／または状態、以下に限定されるものではないが、炎症性疾患および状態を調節するため、ＴＮＦ／ＴＮＦＲおよび／またはＴＮＦファミリー／ＴＮＦファミリーＲが関係する反応のカスケードにおける薬剤介入（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）を意図している。

本明細書に記載するようなＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎ、あるいはこれらとの類似性もしくは同族のＴＮＦ拮抗作用を示す他のリガンド、または作用物質については、炎症状態または疾患などＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達に関連する有害な医学的状態のある患者に様々な手段により投与するため、効果的な強度で好適なキャリアと共に医薬組成物として調製してもよい。様々な投与法、中でも皮下、静脈内および腹腔内注射、カテーテル法および同種のものなど非経口法を利用してもよい。本明細書に記載するようなＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／もしくはａｔｓｔｔｒｉｎ、またはこれらのサブユニットの平均的な量は、異なってもよく、特に資格を持つ医師または獣医師の推奨および処方箋に基づくべきものである。

さらに、本明細書に記載するようなＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／もしくはａｔｓｔｔｒｉｎならびに／またはこれらのサブユニットの産生または活性を調節する、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む抗体、ならびに薬剤は、ある種の診断用途を有することがあり、たとえば、ＴＮＦにより介在される疾患、炎症状態、感染症、癌、または同種のものなどの状態の検出および／または測定を行う目的で利用してもよい。たとえば、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎは、たとえば、マウス脾臓リンパ球と骨髄腫細胞とを融合したものを利用したハイブリドーマ法などの公知の技法により、様々な細胞培地を用いて、これらに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を作製するために使用してもよい。同様に、本明細書に記載するような本発明のＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎの活性と類似する、あるいはその活性を拮抗する小分子を、発見したり、または合成したりしてもよく、それを診断および／または治療プロトコルに使用しても構わない。

ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製する一般的な方法は、よく知られている。不死の抗体産生細胞株については、発癌性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタインバーウイルスのトランスフェクションなど融合以外の技法により作製してもよい。たとえば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， 「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， 「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（１９８０）を参照されたい。さらに米国特許第４，３４１，７６１号明細書；同第４，３９９，１２１号明細書；同第４，４２７，７８３号明細書；同第４，４４４，８８７号明細書；同第４，４５１，５７０号明細書；同第４，４６６，９１７号明細書；同第４，４７２，５００号明細書；同第４，４９１，６３２号明細書；同第４，４９３，８９０号明細書も参照されたい。

好ましくは、本発明の診断方法に使用される抗ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎ抗体は、親和性精製されたポリクローナル抗体である。一層好ましくは、この抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。さらに、本明細書に使用される抗ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎ抗体分子は、全抗体分子のＦａｂ、Ｆａｂ¹、Ｆ（ａｂ’）₂またはＦ（ｖ）部分であることが好ましい。

本発明はさらに、本発明の治療方法を実施するのに有用な治療用組成物も意図している。治療用組成物は、生物学的適合性のある組成物を含む。本治療用組成物は、本明細書に記載するような薬学的に許容される賦形剤（キャリア）、ならびに活性成分のＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／もしくはａｔｓｔｔｒｉｎポリペプチド、これらのアナログまたはこれらのフラグメントの１種または複数種を混合物として含む。好ましい実施形態では、本組成物は、本ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎを含み、図２３および２４など本明細書の図に記載するもの、および配列番号１〜８に提示するものなど１つもしくは複数のＧＥＰグラニュリン、および１つもしくは複数のリンカーユニット、あるいはＧＥＰペプチドもしくはａｔｓｔｔｒｉｎの任意の１つまたは複数を含む組成物を含んでもよい。

本発明のペプチドおよび組成物は、図２３および３４に記載されているようなヒトＧＥＰ配列に基づくａｔｓｔｔｒｉｎなどのＧＥＰペプチドだけでなく、１つもしくは複数、または少数もしくは多くの置換を有するその変異体を含み、変異体の結合および活性プロファイルは、ａｔｓｔｔｒｉｎのＧＥＰペプチドと比較して保持されている。様々な動物由来、またはヒトを含む哺乳動物由来のＧＥＰペプチドが知られているため、これらの配列は、ａｔｓｔｔｒｉｎのヒトペプチドアミノ酸の一部の置換などにより、本発明の組成物および方法に使用し得る代替のアミノ酸配列および変異体となる。本明細書の図２５に
マウスＧＥＰ配列を示す。様々な動物のＧＥＰ配列は、公知であり、開示されており、本発明の方法および組成物と、それらに対応し、関連する、本明細書のＧＥＰペプチドの変異体として評価および使用するのに好適なアミノ酸との評価および判定に使用することができるであろう。ＧＥＰ配列は、入手可能であり、以下のとおり参照によって本明細書に援用する：ラット（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ１６９０３．１、ＣＡＡ４４１９８．１）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２８７９８．２、ＢＡＥ３５３８９．１、ＮＰ＿０３２２０１．２）、スマトラオランウータン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１
１２６６８９．１）、カニクイザル（ｃｒａｂ−ｅａｔｉｎｇ ｍａｃａｇｕｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＥ０１７９６．１）、ウマ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１４８９７９１．１）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０７０４８２．１）、ウサギ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００２７１９２２８．１）、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０３８０４３．１）、チンパンジー（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５１１５４９．２）およびオポッサム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００ １３７４８７０．１）。

ペプチド、アナログまたは活性フラグメントは、中和させた薬学的に許容される塩形態として治療用組成物に製剤化してもよい。薬学的に許容される塩として、酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基とで形成される）、および、たとえば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸および同種のもののような有機酸とで形成される酸付加塩が挙げられる。有機カルボキシル基から形成される塩も、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインおよび同種のもののような有機塩基から誘導することができる。

治療用のペプチド含有、アナログ含有または活性フラグメント含有組成物は、たとえば単位用量の注射などにより従来どおり静脈内に投与する。「単位用量」という用語は、本発明の治療用組成物に関連して使用する場合、ヒトの単位投与量として好適な物理的に分離した単位をいい、各単位は、必要とされる希釈液、すなわちキャリアまたはビヒクルと一緒になって、所望の治療効果を発揮するように計算された所定量の活性材料を含む。

この組成物は、治療有効量で投与製剤に適合した形で投与する。投与量は、処置される被検体、活性成分を利用する被検体の免疫系の能力、およびＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性の阻害または中和の所望の程度によって異なる。投与すべき活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、個体ごとに異なる。しかしながら、好適な投与量は、１日に個体体重１キログラム当たり活性成分約０．１〜２０ミリグラム、好ましくは約０．５〜約１０ミリグラム、一層好ましくは１〜数ミリグラムの範囲であり、投与経路によって異なってもよい。初回投与およびブースター注射に好適な方法も様々であるけれども、代表的には、初回投与し、続いてその後の注射または他の投与により１時間またはそれを上回る時間の間隔で反復投与する。あるいは、多くの場合、血中濃度をナノモルから１０マイクロモルに維持するのに十分な持続点滴静注を意図している。

特定の生物学的適合性のある組成物は、たとえば、トリス、ホスファート、または塩イオンを含むＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて緩衝処理され得る水溶液である。通常、塩イオンの濃度は、生理的レベルと同等である。生物学的適合性のある溶液は、安定化剤および防腐剤を含んでもよい。より好ましい実施形態では、この生体適合性組成物は、薬学的に許容される組成物である。こうした組成物は、局所経路、経口経路、非経口経路、鼻腔内経路、皮下経路および眼内経路による投与用に製剤化してもよい。非経口投与とは、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射または注入法を含むことを意図するものである。本組成物は、よく知られた標準的な無毒で生理学的に許容されるキャリア、アジュバントおよびビヒ
クルを望ましいように含む投薬単位製剤で非経口的に投与してもよい。

本組成物の発明の特定の実施形態は、薬学的に許容されるキャリアとの混合物として、本明細書に上述するような治療有効量のＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎを含む医薬組成物である。別の特定の実施形態は、感染症、同種移植反応、炎症、アレルギーおよび自己免疫疾患ならびに癌などＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性を特徴とする疾患、または前記疾患に対する感受性を処置または予防する組成物であって、薬学的に許容されるキャリアとの混合物として、有効量のＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／もしくはａｔｓｔｔｒｉｎ、その薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、またはこれらのプロドラッグを含む、医薬組成物である。さらに特定の実施形態は、炎症に関わる疾患、またはその状態に対する感受性を処置または予防する医薬組成物であって、薬学的に許容されるキャリアとの混合物として、有効量のＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／もしくはａｔｓｔｔｒｉｎ、その薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、またはこれらのプロドラッグを含む、医薬組成物である。

本発明の組成物は、炎症、免疫学的な状態、過剰増殖状態、および／もしくは癌の緩和、予防または処置に好適な１種または複数種の作用物質と組み合わせてＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎ、および／またはこれらの誘導体を含んでもよい。本発明の組成物は、抗炎症薬、抗癌剤または免疫調節薬（ｉｍｍｕｎｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）の１種または複数種と組み合わせたＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、ａｔｓｔｔｒｉｎ、および／またはこれらの誘導体を含んでもよい。より一般的には、これらの抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤もしくはリン酸化カスケード阻害剤でも、翻訳後モジュレーターでも、細胞増殖もしくは分裂阻害剤（たとえば有糸分裂阻害剤）でも、阻害剤でも、またはシグナル伝達阻害剤でもよい。他の処置または療法は、好適な用量の非ステロイド系抗炎症剤（たとえばアスピリン、パラセタモール、イブプロフェンまたはケトプロフェン）などの疼痛緩和剤、またはモルヒネなどのアヘン剤、または制吐薬を投与することを含んでもよい。さらに、この組成物は、インターロイキンなどの免疫モジュレーター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）もしくは他の増殖因子、コロニー刺激因子、サイトカイン、またはホルモンを含んでもよいし、これらと一緒に投与してもよい。

経口投与の医薬組成物は、経口投与に好適な投与量で、当該技術分野において周知の薬学的に許容されるキャリアを用いて製剤化してもよい。こうしたキャリアを用いれば、患者の摂取に適した錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液および同種のものとして医薬組成物を製剤化することができる。経口使用の医薬組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせて、任意選択的に、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて好適な助剤を加えた後、顆粒の混合物を処理して錠剤または糖衣錠素錠（ｄｒａｇｅｅ ｃｏｒｅ）を得ることにより調製してもよい。好適な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガントなどのガム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物またはタンパク質の充填剤がある。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩など、崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。糖衣錠素錠は、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物をさらに含む、濃縮糖溶液などの好適なコーティングと組み合わせて使用してもよい。製品識別のため、または活性化合物の量、すなわち、投与量を特徴付けるため、錠剤または糖衣錠コーティングに色材または色素を加えてもよい。

経口的に使用される医薬品には、ゼラチン製のプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、およびゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとで作らされた、シールした軟カプセル剤がある。プッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤は、ラクトースもしくはデンプンなどの充填剤またはバインダー、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意選択的に安定剤と混合した活性成分を含んでもよい。軟カプセル剤の場合、活性化合物は、安定剤を使用してあるいは使用せずに脂肪油、液体または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体に溶解または懸濁させてもよい。

好ましい注射用無菌調製物は、無毒の非経口的に許容可能な溶媒または希釈液に溶かした溶液でも、または懸濁液でもよい。薬学的に許容されるキャリアの例として、食塩水、緩衝食塩水、等張食塩水（たとえばリン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、ナトリウム、カリウム；塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムまたはこうした塩の混合物）、リンゲル液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。１，３−ブタンジオールおよび無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として利用すると都合がよい。合成のモノまたはジグリセリドなど刺激のない任意の不揮発性油を使用してもよい。注射剤の調製には、オレイン酸などの脂肪酸も使用される。

本発明の作用物質または組成物は、投与のため、高分子キャリア、生分解性もしくはバイオミメティックマトリックスまたは足場と組み合わせても、あるいはそれらに埋め込んでもよい。キャリア、マトリックスまたは足場は、組成物が組み込まれ、発現することができ、かつ細胞の添加と、または細胞の存在下で適合性があるのであれば、どのような材料であってもよい。特に、キャリア、マトリックスまたは足場は大部分が、非免疫原性であり、かつ生分解性である。生分解性材料の例として、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ヒアルロン酸、腸線縫合糸、ゼラチン、セルロース、ニトロセルロース、コラーゲン、アルブミン、フィブリン、アルギナート、綿または他の天然の生分解性材料があるが、これに限定されるものではない。マトリックスまたは足場材料は、投与または埋植の前に、たとえば、エチレンオキシドで処理して、またはγ線照射もしくは電子ビームによる照射により滅菌すると好ましいことがある。さらに、足場またはフレームワーク構造を形成するため、以下に限定されるものではないが、ナイロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリラート、ポリビニル化合物（たとえば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオレチレン（ＰＴＦＥ、テフロン（登録商標））、サーマノックス（ＴＰＸ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）などのヒドロキシ酸のポリマー、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、および様々なポリヒドロキシアルカノエート、ならびにこれらの組み合わせなど、多くの他の材料を使用してもよい。好適なマトリックスとして、高分子メッシュまたはスポンジ、および高分子ヒドロゲルが挙げられる。特定の実施形態では、マトリックスは、１年未満、より具体的には６カ月未満、最も具体的には２〜１０週間の期間にわたって生分解性である。このポリマー組成物、および製造方法は、分解速度を判定するために使用してもよい。たとえば、ポリ乳酸を増量しながらポリグリコール酸と混合すると、分解時間が短縮される。使用してもよいポリグリコール酸のメッシュは、たとえば、手術用備品会社（たとえば、Ｅｔｈｉｃｏｎ，ＮＪ）から市販品として入手することができる。一般に、これらのポリマーは、少なくとも一部が、水、緩衝塩溶液、または荷電側基またはその一価イオン性塩を持つ水性アルコール溶液などの水溶液に可溶である。

この組成物媒体はまた、任意の生体適合性、または無細胞毒性ホモポリマーもしくはヘテロポリマー、たとえば薬剤吸収スポンジとして働くことができる親水性のポリアクリル酸ポリマーから調製されるヒドロゲルであってもよい。特にエチレンおよび／またはプロ
ピレンオキシドから得られるものなど、それらの一部は、市販されている。ヒドロゲルは、たとえば外科的介入中に、処置される組織の表面に直接付着させてもよい。

この活性発現阻害剤はまた、たとえば、界面重合により調製したマイクロカプセル、たとえば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタシラート）マイクロカプセル、コロイド状薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに封入してもよい。こうした技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．に開示されている。

徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例として、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスがあり、このマトリックスは、形状製品、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルの形態をとる。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタマートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセタートからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーを用いると、１００日間を超えて分子の放出が可能になり、ある種のヒドロゲルは、タンパク質を放出する期間がより短い。封入された抗体が体内に長時間とどまる場合、抗体は３７℃で水分に曝露されるため、変性したり、あるいは凝集したりすることがあり、その結果生物活性が消失し、免疫原性がある変化する可能性がある。関係する機構に応じて、安定化のための合理的戦略を工夫してもよい。たとえば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互交換による分子間のＳ−Ｓ結合の形成であることを発見した場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、適切な添加剤を用いた含水量の制御、および特異的なポリマーマトリックス組成物の開発により達成することができる。

上述のように、治療有効用量とは、症状または状態を寛解させるタンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはその抗体、アゴニストもしくはアンタゴニストの量をいう。こうした化合物の薬効および毒性については、細胞培養または実験動物を用いた標準的な薬学的手順、たとえば、ＥＤ₅₀（集団の５０％治療有効用量）およびＬＤ₅₀（集団の５０％致死用量）により判定してもよい。有毒作用と治療効果との用量比が治療係数であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀の比として表すことができる。大きな治療係数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒト使用のための投与量範囲を処方する際に使用される。こうした化合物の投与量は、好ましくはほとんど毒性がないか、まったく毒性がないＥＤ₅₀を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用する剤形、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変化する。

どのような化合物の場合も、細胞培養アッセイ、あるいは動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタを用いて、最初に治療有効用量を推定することができる。動物モデルはさらに、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するために使用してもよい。その後こうした情報を使用して、ヒトへの投与に有用な用量および経路を判定すればよい。正確な投与量は、処置される患者を考慮して個々の医師により選択される。投与量および投与は、十分なレベルの活性部分を与えるか、または所望の効果を維持するように調整する。考慮に入れてもよい他の因子として、病状の重症度、患者の年齢、体重および性別；食事、所望の処置期間、投与方法、投与の時間および頻度、薬剤の組み合わせ、治療に対する反応感受性および忍容性／応答がある。長時間作用性の医薬組成物は、個々の製剤の半減
期およびクリアランス速度に応じて３〜４日ごとに投与しても、毎週投与しても、または２週に１回投与してもよい。

本発明による医薬組成物は、様々な方法により被検体に投与してもよい。医薬組成物は、標的組織に直接供給しても、カチオン性脂質と複合体を形成しても、リポソーム内に内包させても、あるいは当該技術分野において公知の他の方法により標的細胞に送達してもよい。所望の組織への局部投与は、直接注射、経皮吸収、カテーテル、インフュージョンポンプ、またはステントにより行ってもよい。ＤＮＡ、ＤＮＡ／ビヒクル複合体または組換えウイルス粒子は、処置部位に局所投与する。送達の代替経路として、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠剤またはピル形態）、局所送達、全身送達、点眼送達、腹腔内および／または髄膜内送達があるが、これに限定されるものではない。

あるいは、または加えて、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎをコードするポリヌクレオチドを特にベクターに組み込んでもよい。ポリ核酸は、核酸配列の発現を可能にするシグナルに作動可能に連結し、好ましくは、ベクターを細胞に導入したならば、アンチセンス核酸を発現する組換えベクターコンストラクトを利用して細胞に導入する。アデノウイルスベクター系、レトロウイルスベクター系、アデノ随伴ウイルスベクター系、レンチウイルスベクター系、単純ヘルペスウイルスベクター系またはセンダイウイルスベクター系など、様々なウイルスを用いた系が入手可能であり、すべて、発現阻害剤、または標的細胞内の標的ポリペプチドを発現しているポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列の導入および発現に使用してもよい。

特に、本発明の方法に使用するウイルスベクターは、複製欠損である。こうした複製欠損ベクターは通常、感染細胞内のウイルスの複製に必要な少なくとも１つの領域を欠損（ｐａｃｋ）している。これらの領域は、当業者に知られる任意の手法により除去されていても（全部または一部）、あるいは機能しないようにされていても、どちらもでもよい。これらの技法として、必須（複製のための）領域に対する１つまたは複数の塩基の全体の除去、置換、部分的削除、または付加が挙げられる。こうした技法は、遺伝子操作の技法を用いて、あるいは変異誘発物質を用いた処置によりインビトロ（単離されたＤＮＡ上）で行っても、またはインサイツで行ってもよい。好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子のカプシドを形成するのに必要なそのゲノムの配列を保持している。

好ましい実施形態では、ウイルスエレメントは、アデノウイルス由来である。好ましくは、ビヒクルは、アデノウイルスのカプシド、またはその機能的部分、誘導体、および／またはアナログに包まれたアデノウイルスベクターを含む。アデノウイルスの生物学は、分子レベルでも比較的よく知られている。アデノウイルスベクターの多くの手段が開発されてきており、さらに開発が続いている。したがって、アデノウイルスのカプシドは、本発明のライブラリーに加えるのに好ましいビヒクルとなっている。アデノウイルスは、多様な細胞に感染することができる。しかしながら、それぞれのアデノウイルスの血清型は、細胞に対する選択性が異なる。本発明のアデノウイルスのカプシドが進入できる標的細胞集団を組み合わせて拡大するには、好ましい実施形態では、ビヒクルに、少なくとも２種のアデノウイルス由来のアデノウイルス線維タンパク質を含ませる。好ましいアデノウイルス線維タンパク質配列は、血清型１７、４５および５１である。これらのキメラベクターの技法または構築および発現については、参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００３／０１８０２５８号明細書、および米国特許出願公開第２００４／００７１６６０号明細書に開示されている。

好ましい実施形態では、アデノウイルスに由来する核酸は、アデノウイルスの後期タンパク質、またはその機能的部分、誘導体、および／またはアナログをコードする核酸を含
む。アデノウイルスの後期タンパク質、たとえばアデノウイルス線維タンパク質は、好ましくは、ある種の細胞をビヒクルが標的とするために、または細胞へのビヒクルの送達を増強するために使用する。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸は、本質的にすべてのアデノウイルスの後期タンパク質をコードし、アデノウイルスのカプシド全体、またはその機能的部分、アナログ、および／または誘導体の形成を可能にする。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸は、アデノウイルスＥ２Ａ、またはその機能的部分、誘導体、および／またはアナログをコードする核酸含む。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸は、少なくとも部分的に、細胞内のアデノウイルス由来の核酸の複製を促進する少なくとも１つのＥ４領域タンパク質、またはその機能的部分、誘導体、および／またはアナログをコードする核酸を含む。本出願の例に使用するアデノウイルスベクターは、処置発明の本方法に有用なベクターの例示である。

本発明のある種の実施形態は、レトロウイルスベクター系を使用する。レトロウイルスは、分裂している細胞に感染し、染色体に組み込まれるウイルスであり、その構造は、当該技術分野において公知である。レトロウイルスベクターは、ＭｏＭｕＬＶ（「モロニーマウス白血病ウイルス」），ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」），ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）およびフレンドウイルスなど様々な種類のレトロウイルスから構築することができる。本発明の実施にはさらに、レンチウイルスベクター系を使用してもよい。

本発明の他の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）を利用する。ＡＡＶウイルスは、安定、かつ部位特異的に感染細胞のゲノムに組み込まれる、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。ＡＡＶウイルスは、細胞の増殖、形態または分化に何ら影響を及ぼさずに広範囲の細胞に感染することができ、ヒトの病態に関わらないようである。

ベクター構築の際は、本発明のポリヌクレオチド作用物質を、１つまたは複数の制御領域に連結してもよい。適切な制御領域を選択することは、当該技術分野における通常の技術水準内で日常的に行われている。制御領域はプロモーターを含み、さらにエンハンサー、サプレッサー等を含んでもよい。

本発明の発現ベクターに使用してもよいプロモーターは、構成的プロモーターおよび制御（誘導性）プロモーターをどちらも含む。プロモーターは、宿主に応じて原核生物のプロモーターでも、または真核生物のプロモーターでもよい。本発明の実施に有用な原核生物（バクテリオファージなど）のプロモーターは、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、λＰ_r、Ｐ_lプロモーター、およびｔｒｐプロモーターである。本発明の実施に有用な真核生物（ウイルスの）プロモーターの中には、ユビキタスプロモーター（たとえばＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、治療遺伝子プロモーター（たとえばＭＤＲ型、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子）、組織特異的プロモーターがあり、さらに組織特異性を示し、トランスジェニック動物に利用されている動物の転写制御領域、たとえばリンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）、ならびに精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）がある。

本発明の実施に使用してもよい他のプロモーターとして、分裂細胞において優先的に活性化されるプロモーター、刺激に応答するプロモーター（たとえばステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン制御転写モジュレーター、サイトメガロ
ウイルス前初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＳＶ−４０プロモーター、Ｅ１ａプロモーター、およびＭＬＰプロモーターが挙げられる。本発明の実施に使用してもよい別のプロモーターとして、樹状細胞において活性であり、および／または発現するプロモーターが挙げられる。

他のベクター系として、ポリヌクレオチド作用物質の患者への導入を促進する非ウイルス系がある。たとえば、所望の配列をコードするＤＮＡベクターを、リポフェクションによりインビボで導入してもよい。リポソームにより介在されるトランスフェクションに伴う問題点を是正するように設計された合成カチオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のインビボでのトランスフェクションに適したリポソームを調製してもよい（Ｆｅｉｇｎｅｒ，ｅｔ．ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７）；Ｍａｃｋｅｙ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８０２７−３１；Ｕｌｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−８を参照されたい）。カチオン性脂質を使用すると、負に帯電した核酸の封入を促進することができ、さらに、負に帯電した細胞膜との融合も促進する（Ｆｅｉｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｎｇｏｌｄ，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８）。核酸の移行に特に有用な脂質化合物および組成物については、国際公開第９５／１８８６３号パンフレットおよび国際公開第９６／１７８２３号パンフレット、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号明細書に記載されている。外来遺伝子を指定の器官にインビボで導入するためにリポフェクションを使用すると、実用面でいくつかの利点があり、細胞が多様である組織、たとえば、膵臓、肝臓、腎臓および脳においては、特定の細胞型にトランスフェクションを行うことは、特に有利であると考えられる。脂質は、標的化のため他の分子に化学的に結合してもよい。標的化ペプチド、たとえば、ホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質、たとえば、抗体、または非ペプチド分子は、リポソームに化学的に結合することができる。インビボでの核酸のトランスフェクションを促進するには、他の分子、たとえば、カチオン性のオリゴペプチド（たとえば、国際公開第９５／２１９３１号パンフレット）、ＤＮＡ結合タンパク質に由来するペプチド（たとえば、国際公開第９６／２５５０８号パンフレット）、またはカチオン性ポリマー（たとえば、国際公開第９５／２１９３１号パンフレット）も有用である。

さらに、インビボでＤＮＡベクターを裸のＤＮＡプラスミドとして導入することもできる（米国特許第第５，６９３，６２２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書および同第５，５８０，８５９号明細書を参照されたい）。治療目的の裸のＤＮＡベクターは、当該技術分野において公知の方法、たとえば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用により所望の宿主細胞に導入することができる（たとえば、Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−７；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−４；Ｈａｒｔｍｕｔ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎａｄｉａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２，０１２，３１１，ｆｉｌｅｄ Ｍａｒ．１５，１９９０；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ（１９９１）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−３０を参照されたい）。さらに、受容体を介したＤＮＡ送達のアプローチを使用してもよい（Ｃｕｒｉｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−５４；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−３２）。

さらに、本発明は、別のまたは異なる構造または配列特性を持つＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎペプチドを調製すること、ならびにペプチド模造物およびエステル結合などのペプチド模倣結合（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｂｏｎｄ）を使用してＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎの特性を持つ、すなわちＴＮＦおよび
ＴＮＦ／ＴＮＦＲを阻害または拮抗することができる別のペプチドまたは作用物質を調製することも想定している。別の実施形態では、還元型ペプチド結合、すなわち、Ｒ₁−Ｃ
Ｈ₂−ＮＨ−Ｒ₂（式中、Ｒ₁およびＲ₂はアミノ酸残基または配列である）を組み込んだペプチドを作製してもよい。還元型ペプチド結合は、ジペプチドサブユニットとして導入してもよい。こうした分子は、ペプチド結合の加水分解、たとえば、プロテアーゼ活性に耐性があると考えられる。こうしたペプチドは、代謝分解またはプロテアーゼ活性に対する耐性によるインビボでの半減期の延長など、独特の機能および活性を持つアンタゴニストになると考えられる。さらに、ある種の系では、規制されたペプチドが高い機能活性を示すこともよく知られている（Ｈｒｕｂｙ，１９８２，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３１：１８９−１９９；Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２６８：２４９−２６２。

処理後にペプチドを規制、環化、または剛化するため架橋して、架橋結合を形成することができる化学官能基を、ペプチドの配列内の少なくとも２つの位置に与えるアミノ酸またはアミノ酸アナログを挿入するのであれば、規制されたペプチド、環状ペプチドまたは高剛性ペプチドを、人工的に合成してもよい。環化は、ターン誘導アミノ酸を組み込むときに好ましい。ペプチドに架橋できるアミノ酸の例として、ジスルフィドを形成するシステイン、ラクトンまたはラクターゼを形成するアスパラギン酸、および遷移金属をキレートして架橋結合を形成するγ−カルボキシル−グルタミン酸（Ｇｌａ）（Ｂａｃｈｅｍ）などのキレート剤が挙げられる。Ｚｅｅ−ＣｈｅｎｇおよびＯｌｓｏｎ（１９８０，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９４：１１２８−１１３２）により記載された合成法を改変して、保護γ−カルボキシルグルタミン酸を調製してもよい。ペプチド配列に、架橋できる少なくとも２つのアミノ酸を含むペプチドについては、たとえば、ペプチドに架橋して、規制されたペプチド、環状ペプチドまたは高剛性ペプチドを形成するように、システイン残基を酸化してジスルフィドを形成するか、または金属イオンを付加してキレートを形成することにより処理してもよい。

本発明は、架橋結合を系統的に調製する戦略を意図している。たとえば、ペプチド配列内に４つのシステイン残基を組み込み場合、様々な保護基を使用してもよい（Ｈｉｓｋｅｙ，１９８１，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１３７−１６７；Ｐｏｎｓａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４６：８２５５−８２６６）。第１のシステインペアは、脱保護して酸化することができ、その後第２の組も、脱保護して酸化すればよい。こうして規定のジスルフィド架橋結合の組を形成してもよい。あるいは、１ペアのシステインおよび１ペアのコレ−ティング（ｃｏｌｌａｔｉｎｇ）アミノ酸アナログを組み込んで、架橋結合の化学的性質が異なるようにしてもよい。

特定の立体構造モチーフを導入するには、以下の非古典的アミノ酸をペプチドに組み込んでもよい：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシラート（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：２２７５−２２８３）；（２Ｓ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ ａｎｄ Ｈｒｕｂｙ，１９９１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）；２−アミノテトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（Ｌａｎｄｉｓ，１９８９，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ）；ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシラート（Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．ＴａｋｅｄａＲｅｓ．Ｌａｂｓ．４３：５３−７６）；β−カルボリン（ＤおよびＬ）（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ，１９８８，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎ
ａ）；ＨＩＣ（ヒスチジンイソキノリンカルボン酸）（Ｚｅｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４３）；ならびにＨＩＣ（ヒスチジン環状尿素）（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａ）。

特定の二次構造を誘導する、または特定の二次構造に有利に働くようにするには、以下のアミノ酸アナログおよびペプチド模造物をペプチドに導入してもよい：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−カルボン酸）、βターン誘導ジペプチドアナログ（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：５８３４−５８３８）；βシート誘導アナログ（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：５０８１−５０８２）；βターン誘導アナログ（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：５０５７−５０６０）；α−ヘリックス誘導アナログ（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：４９３５−４９３８）；γターン誘導アナログ（Ｋｅｍｐ
ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：１０９：１１５）；および以下の参考文献により提供されるアナログ：Ｎａｇａｉ ａｎｄ Ｓａｔｏ，１９８５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６：６４７ ６５０；ＤｉＭａｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ，ｐ．１６８７；さらにＧｌｙ−Ａｌａターンアナログ（Ｋａｈｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３０：２３１７）；アミド結合イソスター（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：３８５３−３８５６）；トレトラゾール（Ｚａｂｒｏｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：５８７５−５８８０）；ＤＴＣ（Ｓａｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐ．Ｒｅｓ．３５：５０１：５０９）；ならびにＯｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１２：３２３−３３３およびＧａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６：４３６に教示されたアナログ。βターンおよびβバルジのコンフォメーション（Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｉｙ）を固定した模倣体、ならびにそれらを含むペプチドについては、１９９５年８月８日にＫａｈｎに発行された米国特許第５，４４０，０１３号明細書に記載されている。

本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたはペプチドの修飾または誘導体化も提供する。これらの修飾は、本発明のポリペプチドまたはペプチドの安定性、活性、半減期を変化させたり、あるいは向上させたりする働きをすることがある。ペプチドの修飾は、当業者によく知られており、リン酸化、カルボキシメチル化およびアシル化が挙げられる。修飾は、化学的手段によって行っても、または酵素的手段によって行ってもよい。別の態様では、グリコシル化または脂肪酸アシル化ペプチド誘導体を調製してもよい。グリコシル化または脂肪酸アシル化ペプチドの調製については、当該技術分野において周知である。さらに、脂肪酸アシルペプチド誘導体を調製してもよい。たとえば、以下に限定されるものではないが、遊離アミノ基（Ｎ末端またはリジル）をアシル化、たとえば、ミリストイル化してもよい。別の実施形態では、−（ＣＨ₂）_nＣＨ₃構造の脂肪族側鎖を含むアミノ
酸をペプチドに組み込んでもよい。このペプチド−脂肪酸コンジュゲート、および本発明に使用するのに好適な他のペプチド−脂肪酸コンジュゲートについては、英国特許第８８０９１６２．４号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＡＵ８９／００１６６号パンフレットおよび上掲の参考文献５に開示されている。タンパク質の安定性およびインビボでの活性など生物学的および物理的性質の向上などのため、炭水化物部分の付加、ならびに本発明のペプチドのグリコシル化アナログの調製および使用も、意図している。

誘導体化の化学部分。さらに、本発明のペプチドの誘導体（変異体、アナログおよびそれらの活性フラグメントなど）も提供する。こうした誘導体は、活性、溶解性、有効治療濃度、および血液脳関門の通過を改善する誘導体を包含し、含む。さらに包含される誘導
体は、ＴＮＦ／ＴＮＦＲと相互作用する、ＴＮＦ／ＴＮＦＲまたは発現細胞を標的とする、あるいは抗炎症活性を持つことが分かっている部分または分子の結合を含む。化学部分は、本発明のペプチドのＮ末端に結合しても、またはＣ末端に結合してもよい。誘導体化に好適な化学部分は、たとえば、水溶性ポリマーの中から選択してもよい。選択されたポリマーは、ポリマーが結合する成分が生理的環境などの水性環境で沈殿しないような水溶性であってもよい。好ましくは、最終産物の調製物を治療に使用するため、ポリマーは、薬学的に許容されるものである。ポリマーは、分枝でも、または非分枝でもよい。当業者は、ポリマー／成分コンジュゲートを治療に使用するどうか、使用する場合には、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性といった考慮すべき事項、および他の考慮すべき事項に基づき、所望のポリマーを選択することができる。本成分の場合、これらの考慮すべき事項は、本明細書に記載するアッセイを用いて確認することができる。

水溶性ポリマーは、たとえば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー、あるいはランダムコポリマー）、およびデキストラン、またはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群から選択してもよい。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性のため、製造の際に有利である場合がある。

ポリマーは、任意の好適な分子量としてもよく、分枝でも、または非分枝でもよい。ポリエチレングリコールの場合、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造が容易であるように約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製の際、明示された分子量より大きい分子もあれば、小さい分子もあることを示す）である。所望の治療プロファイル（たとえば、所望の徐放期間、作用がある場合、生物活性に対する作用、取り扱いやすさ、抗原性の程度または欠如、および治療用タンパク質またはアナログへのポリエチレングリコールの他の既知の作用）に応じて、他の大きさを使用してもよい。

こうして結合されるポリマー分子の数は、異なってもよく、当業者は、機能に対する作用を確認することができる。モノ誘導体化を行って（ｍｏｎｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）もよいし、あるいは、同一または異なる化学部分（たとえば、様々な重量のポリエチレングリコールなどのポリマー）を用いてジ誘導体化、トリ誘導体化、テトラ誘導体化、または何らかの誘導体化の組み合わせを行ってもよい。ポリマー分子と成分分子との比率は、反応混合物中のこれらの濃度が異なるにつれ、異なる。一般に、最適な比率（過剰な未反応成分およびポリマーが存在しないという反応の効率性の面から）は、所望の誘導体化の程度（たとえば、モノ、ジ、トリ、等）、選択したポリマーの分子量、ポリマーが分枝であるか、あるいは非分枝であるか、および反応条件などの要因によって決定される。

ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、タンパク質の機能ドメインまたは抗原性ドメインに対する作用を考慮して、成分に結合すべきである。当業者に入手可能ないくつかの結合方法、たとえば、参照によって本明細書に援用する欧州特許第０４０１３８４号明細書（ＰＥＧとＧ−ＣＳＦとのカップリング）があり、さらに、Ｍａｌｉｋ
ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（トレシルクロリドを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告）も参照されたい。たとえば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノ基またはカルボキシル基などの反応基を介してアミノ酸残基に共有結合させてもよい。反応基とは、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合できる基である。遊離アミノ基を持つアミノ酸残基には、リジン残基および末端のア
ミノ酸残基があり、遊離カルボキシル基を持つアミノ酸残基には、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端のアミノ酸残基がある。ポリエチレングリコール分子を結合する反応基としては、スルフヒドリル基を使用してもよい。治療目的に好ましいのは、Ｎ末端またはリジン基での結合などアミノ基での結合である。

より詳細には、本発明は、本発明のペプチドまたはそのフラグメントを含む融合タンパク質である誘導体を提供する。したがって、本発明のペプチドおよびそのフラグメントは、「修飾」してもよい、すなわち、キメラペプチドまたはタンパク質の融合体に加えてもよいし、あるいは、たとえば、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを持つように標識してもよい。特定の実施形態では、１９９７年４月２９日に出願された米国特許第５，６２５，０４８号明細書、および１９９９年７月２４日に公開された国際公開第９７／２６３３３号パンフレット（それぞれ参照によってその全体を本明細書に援用する）に記載されているような緑色蛍光タンパク質などのマーカータンパク質との連結または結合により、ペプチドを修飾してもよい。こうした一実施形態では、真核細胞に発現させるため、キメラペプチド、たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、マルトース結合（ＭＰＢ）タンパク質融合タンパク質、またはポリ−ヒスチジンタグ付き融合タンパク質を調製してもよい。本発明のペプチドを融合タンパク質として発現させると、安定発現を促進したり、あるいは融合パートナーの特性に基づく精製を可能にしたりすることができる。たとえば、ＧＳＴは、固体支持マトリックスにコンジュゲートさせたグルタチオンに結合し、ＭＢＰは、マルトースマトリックスに結合し、ポリ−ヒスチジンは、Ｎｉ−キレート化支持マトリックスにキレートする。融合タンパク質は、適切な緩衝液を用いるか、あるいは、通常ペプチドと融合パートナー（たとえば、ＧＳＴ、ＭＢＰまたはポリ−Ｈｉｓ）との間に設計される切断部位に特異的なプロテアーゼで処理することにより、特定のマトリックスから溶出することができる。あるいは、キメラペプチドは、緑色蛍光タンパク質を含んでいてもよく、このキメラペプチドを用いて細胞内のペプチドの細胞内局在を判定する。

本発明はさらに、多量体ペプチド構造を構築するため、結合させた化学部分の少なくとも１つが、複数のペプチド結合部位を持ち、前記ペプチドの少なくとも２つに同時に結合できる分子である、誘導体も含む。この誘導体は、本発明の糖鎖エピトープ模倣ペプチドの利用可能な局所濃度を高める作用がある。あるいは、またはさらに、こうした部分は、ペプチドの活性を適切に保持する安定な足場を与える働きをし、それにより拡散または分解を軽減または予防することもできる。より詳細には、こうした分子は、ＢＳＡ、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン（ａｌｌｂｕｍｉｎ）、ポリアクリルアミド、ビーズおよび合成繊維（生分解性および非生分解性）の群から選択される。

本発明の糖鎖エピトープ模倣ペプチドは、単量体、二量体、多量体、ヘテロ二量体、ヘテロ多量体等として調製し、利用してもよい。多量体形態でペプチドを提示または投与すると、ＴＮＦアンタゴニスト活性などペプチドの活性が増強されるか、もしくは他の方法でペプチドにより介在される活性の調節が促進され得る、および／または、ＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達および活性が阻害され得る。ペプチドモノマーは、様々なやり方で作製することができる。本発明のペプチドは、タンパク質合成機を使用し、当該技術分野において周知の、および本明細書に上述するような方法を利用し、本明細書に上述したようなアミノ酸改変体、アナログ等を組み込んで合成してもよい。さらに、ペプチドのＤＮＡ配列は、細菌または哺乳動物細胞の発現系での産生に適したｐＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの発現ベクターに挿入してもよい。昆虫または酵母発現系を使用してもよい。ペプチドの精製は、ニッケル−ＮＴＡ樹脂に結合する６−ヒスチジンタグなどのタグ配列の付加により促進してもよい。これらのタグ配列は、タグの後にプロテアーゼ特異的配列を付加することにより容易に除去されることが多い。ペプチドの二量体および多量体については、当該技術分野における様々な方法を用
いて作製することができる。二量体または多量体のＤＮＡ配列はさらに、細菌または哺乳動物細胞の系など発現系に挿入してもよい。これにより、（Ｍｅｔ−ＦＬＨＴＲＬＦＶ）_x（式中、ｘ＝２、３、４、．．．等）などの分子が産生される。その有効性を高めるた
めペプチドまたはペプチド模倣物の間に短くてフレキシブルなスペーサー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）₃を含ませることが必要な場合がある。二量体および多量
体はさらに、ジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）またはジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）などの架橋試薬を用いて作製してもよい。これらの試薬は、アミノ基と反応し、アルギニン残基の遊離アミン基、およびＮ末端の遊離アミン基を介してペプチドに架橋することができる。二量体および多量体はさらに、ビオチンとアビジンとの間、ＪｕｎとＦｏｓとの間、およびＦｃ領域の抗体間の親和性相互作用を用いて形成してもよい。精製されたペプチドは、ビオチン化し、強いタンパク質間相互作用を形成することが知られている因子と混合すればよい。ペプチドまたはペプチド模倣物は、上述したような架橋剤を用いて、あるいは、ペプチド−Ｊｕｎ／Ｆｏｓ分子を形成する分子技法を用いて、二量体の形成に関わるＪｕｎおよびＦｏｓの領域に結合してもよい。ＪｕｎとＦｏｓとのペプチドのハイブリッドを混合すると、二量体の形成が起こるであろう。さらに、ペプチド−Ｆｃハイブリッドの産生物を産生してもよい。哺乳動物細胞に発現させる場合、Ｆｃ領域のシステインを介して共有結合性のジスルフィド結合が形成され、二量体の形成が起こるであろう。ペプチドのヘテロ二量体およびヘテロ多量体を形成してもよい。これにより、全分子の各部分が、抗ＴＮＦ作用および／または抗炎症（ａｎｉｔ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）作用および／または細胞増殖調節作用など多くの作用の発現を担う多機能であり得る分子が作製されるであろう。これらの多機能分子を作製するには、上述と同じ科学技術を使用してもよい。ＤＮＡレベルで糖鎖エピトープ模倣ペプチドをタンパク質に挿入する分子技法を使用してもよい。この挿入は、タンパク質分子のＮ末端もしくはＣ末端で行っても、または中程で行ってもよい。ヘテロ二量体は、ペプチド／Ｆｃまたはペプチド／ＪｕｎもしくはＦｏｓのハイブリッド分子を用いて形成してもよい。他のＦｃまたはＪｕｎ／Ｆｏｓを含むハイブリッドと混合すると、二量体の形成が起こり、ヘテロ二量体が産生されるであろう。ペプチドをヘテロ二量体に結合するにはさらに、架橋試薬を使用してもよい。最後に、他の分子のビオチン化と共にペプチドのビオチン化を用いて、多量体を作製してもよい。これらの成分をアビジンと混合すると、アビジン分子の４つのビオチン結合部位それぞれに異なるビオチン化分子が結合する大きな多機能複合体を作製することができる。

一態様では、本発明は、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性および／またはシグナル伝達を特徴とする、それにより媒介される、またはそれにより促進される疾患、および／または炎症、免疫傷害および癌を特徴とする疾患を予防および／または処置する方法であって、本明細書に開示されているような治療有効量のＴＮＦアンタゴニストペプチドを被検体に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、ペプチドは、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチドおよび／またはａｔｓｔｔｒｉｎから選択される。特定の実施形態では、疾患は、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病（Ｃｈｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、炎症性肺疾患および慢性閉塞性肺疾患から選択される。実施形態の１つでは、疾患は、ループスおよび多発性硬化症などアレルギーおよび自己免疫疾患を含む免疫学的な障害または状態であってもよい。一態様では、疾患は、ＧＥＰにより介在される癌またはＴＮＦ／ＴＮＦＲにより介在される癌などの癌であってもよい。

本発明はさらに、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性および／またはシグナル伝達を特徴とする、それにより媒介される、またはそれにより促進される疾患、および／または炎症および癌を特徴とする疾患を処置または予防する薬物を調製するための、上記および本明細書に記載されるようなペプチドの使用に関する。特定の実施形態では、疾患は、炎症を特徴とする。本発明の特定の実施形態では、疾患は、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、
乾癬、炎症性腸疾患、クローン病（Ｃｈｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、炎症性肺疾患および慢性閉塞性肺疾患から選択される。

本発明は、本発明の例示として提供する以下の非限定的な実施例を参照すれば、理解を深めることができる。以下の例は、本発明の好ましい実施形態をより詳細に説明するために提示するものである。しかしながら、決して本発明の広範な範囲を限定するものと解釈してはならない。

実施例１
ＧＥＰは、ＴＮＦα受容体（ＴＮＦＲ）に結合し、拮抗する。
タンパク質間相互作用の網羅的解析、その後の生物的評価の現在の方法は、特定の疾患または臓器系の発生病理とこれまで無関係であった新規なタンパク質を同定する強力な手段となった。機能遺伝子のスクリーニングにより、我々は今回、ＧＥＰ、すなわちＴＮＦＲに関連する軟骨形成および関節炎の新規なメディエーターを発見した。このことは、軟骨の生物学における増殖因子およびサイトカインの作用と、それらの軟骨障害および関節炎の状態の処置への応用とに関する我々の理解を広げるものである。特に、我々の研究は、中心的なプロ炎症性サイトカインＴＮＦαの天然のアンタゴニストを明らかにし、関節炎の障害の患者に起こる分解現象に関連する洞察を提供するものである。間葉系幹細胞の軟骨形成能を制御し、中心的なプロ炎症性サイトカインの阻害剤として働く増殖因子を同定および操作すれば、それを使用して、軟骨障害および結合組織障害の治療への応用を最適化することができる。この研究の重要な長期的目標は、（１）骨格の生物学および関連する疾患の制御におけるＧＥＰ、ＴＮＦαの役割、ならびにそれらの相互作用および機能連関を明らかにすること；および（２）ＧＥＰ、特にＧＥＰ誘導ペプチドを集めて（ｒｅｃｒｕｉｔ）、関節炎など様々な種類のＴＮＦ関連疾患に対して新規な抗ＴＮＦ／ＴＮＦＲによる治療介入法を開発することである。

我々の網羅的スクリーニングにより、いくつかの新規なＧＥＰ結合パートナーが単離され、その中で我々が大きな関心を持ったのはＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）である。その後の研究により、ＧＥＰがＴＮＦＲの細胞外ドメインに直接結合し、軟骨細胞のＧＥＰ刺激性のシグナル伝達および標的遺伝子発現が、ＴＮＦＲに厳密に依存することが示された。ＧＥＰおよびＴＮＦαがどちらもＴＮＦＲに結合することから、ＴＮＦＲに対するＧＥＰの結合が、ＴＮＦαとその受容体との結合を遮断することができる、すなわち、ＧＥＰがＴＮＦαの天然のアンタゴニストとして働くことができるという可能性が高まった。実際、ＧＥＰは、ＴＮＦα誘導性の炎症反応および軟骨細胞のアポトーシスを劇的に阻害する。

ＧＥＰ関連受容体として同定されたＴＮＦＲ２：
ＧＥＰの生物学的特性を考慮に入れて、ＧＥＰは、他の既知の増殖因子と同様に「古典的」膜受容体を介して作用し得るとの仮説が立てられている。これまでのところ、機能的受容体は同定されていない。ＧＥＰ関連タンパク質を調査する中で、我々は、ＧＥＰ欠損シグナルペプチドをコードするコンストラクトｐＤＢｌｅｕ−ＧＥＰ（ａ．ａ．２ １−５８８）をベイトとして用いて酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）用ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、２４個の陽性クローンを単離した。これらのクローンのシーケンシングデータにより、そのうちの２個が細胞表面ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ ＩＢ／ＣＤ１２０ｂ；受託番号ＮＭ＿１３０４２６）であることが示された。

酵母内および軟骨細胞内でＧＥＰはＴＮＦＲ２に結合する：
酵母内のＧＥＰとＴＮＦＲ２と間の相互作用を確認するため、ＧａＷＤＢＤに結合したＧＥＰをコードするプラスミド、およびＶＰ １６ＡＤと融合した、ＴＮＦＲ２のＮ末端切断型ミュータント（ａ．ａ．２６−５６７）をコードするプラスミドを、酵母細胞に同
時形質転換した。相互作用することが知られており、陽性対照として使用されるｃ−Ｊｕｎ／ｃ−Ｆｏｓ対と同様に、我々のアッセイにより、β−ガラクトシダーゼの活性に基づきＣＯＭＰが酵母内でＧＥＰと相互作用することが示された（図２（Ａ））。これらの２つのタンパク質が初代ヒト軟骨細胞内で相互作用するかどうかを判定するため、免疫共沈降（Ｃｏ−ＩＰ）アッセイを行った（図２（Ｂ））。簡単に説明すると、単離されたヒト軟骨細胞から調製した細胞抽出物を、抗ＴＮＦＲ２抗体または対照ＩｇＧのどちらかとインキュベートし、免疫沈降した複合体を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＧＥＰ抗体を用いて検出した。抗ＴＮＦＲ２で沈降させた免疫沈降複合体には、特異的なＧＥＰバンドが存在した（レーン３）。しかしながら、対照ＩｇＧ（レーン２）抗体で沈降させた免疫沈降複合体には、特異的なＧＥＰバンドが存在しなかったことから、初代ヒト軟骨細胞においてＧＥＰはＴＮＦＲ２に特異的に結合することが明らかになった。

ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の細胞外ドメインに対するＧＥＰの直接的な結合：
ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン間に著しいアミノ酸類似性があるため、我々は次に、組換えＧＥＰと、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）とを用いた固相結合アッセイにより、ＧＥＰがＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２に直接結合するかどうかを判定した（図３）。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを、５００ｎｇの精製されたＧＥＰを含むＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）１００μｌでコートとした。ブロッキング後、各ウェル、様々な量（５〜５００ｎｇ）のＴＮＦＲ１の細胞外ドメイン（ＴＮＦＲ１ＥＣＤ、左パネル）またはＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン（ＴＮＦＲ２ＥＣＤ、右パネル）を加え、液相から結合したタンパク質を、ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２に対する抗体、続いて西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートされた二次抗体で検出した。図３に示すように、ＧＥＰは、液相ＴＮＦＲ１ＥＣＤおよびＴＮＦＲ２ＥＣＤに対して用量依存的結合および飽和を示した。

ＴＮＦＲ２のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）は、ＧＥＰに結合するのに十分である：
ＴＮＦＲ２の様々な欠失ミュータントを作製し、ＧＥＰと相互作用する能力について酵母ツーハイブリッドアッセイで試験した。これらすべてのミュータントに関するフィルターベースのβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果（図４）を図４（Ａ）にまとめてある。この一連の実験からの我々の結論は、ＴＮＦＲ２のＣＲＤ（すなわちＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３またはＣＲＤ４）はそれぞれ、ＧＥＰとの相互作用を行うのに十分である。

抗ＴＮＦＲ特異的遮断抗体またはＴＮＦＲの組換え細胞外ドメインは、ＧＥＰ刺激性の軟骨細胞の増殖を止める：ＧＥＰがＴＮＦＲに結合するという知見、さらに、ＧＥＰがヒト軟骨細胞に対して強力な分裂促進作用を持つという我々の最近の報告［４９］を考え合わせ、ＧＥＰ刺激性の軟骨細胞増殖は、ＴＮＦＲに依存するかどうかを判定した。ヒト軟骨細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＧＥＰ（ＧＥＰ）、またはＧＥＰと１ｕｇ／ｍｌの抗ＴＮＦＲ１（ＧＥＰ＋ＴＮＦＲ１ ａｂ；ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインに対する抗体ＳＣ−７８９５）、抗ＴＮＦＲ２（ＧＥＰ＋ＴＮＦＲ２ ａｂ；ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインに対する抗体ＳＣ−１２７５１）、もしくは１ｕｇ／ｍｌの抗ＩＧＦ１Ｒ（ＧＥＰ＋ＴＧＦ ＩＲ ａｂ、対照として使用）と、のいずれかの非存在下（ＣＴＲ）または存在下で培養し、ＭＴＴアッセイを用いて細胞増殖を解析した（図５左パネル）。予想どおり、ＧＥＰは軟骨細胞の増殖を強力に刺激し、このＧＥＰ刺激性の細胞増殖の大部分が、抗ＴＮＦＲ１または抗ＴＮＦＲ２抗体のどちらかより遮断されたのに対し、抗ＩＧＦＩＲは、ＧＥＰ作用に対する遮断作用を何ら示さなかった。

ＧＥＰがＴＮＦＲの細胞外ドメインと直接結合するため、我々は次に、ＧＥＰとの相互作用について内因性ＴＮＦＲと競合させて、ＴＮＦＲの組換え細胞外ドメインが軟骨細胞
増殖におけるＧＥＰ作用に影響を与えるかどうかを調べた。図５の右パネルに示すように、５０ｎｇ／ｍｌのＧＥＰにより誘導された軟骨細胞の増殖は、ＴＮＦＲ１（Ｒ１ＥＣＤ、２５ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦＲ２（Ｒ２ＥＣＤ、２５ｎｇ／ｍｌ）の組換え細胞外ドメインのいずれによっても完全に止められた。以上のように、これらの結果から、ＧＥＰにより介在される軟骨細胞の増殖は、ＴＮＦＲ活性厳密に依存することが示される。

ＧＥＰは、軟骨細胞のＡｋｔ経路およびＥｒｋ１／２経路を活性化する：
我々は次に、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｉ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて、軟骨細胞のＧＥＰ活性化シグナル伝達を解析しようとした。ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｉ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）により、単一膜上でホスホ−ｐ９０ＲＳＫ、ホスホ−Ａｋｔ、ホスホｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）およびホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質のレベルを同時に検出することができる。ヒトＣ２８Ｉ２軟骨細胞（Ｄｒ．Ｍａｒｙ Ｂ．Ｇｏｌｄｒｉｎｇから提供）を２４時間飢餓状態にし、様々な時点で５０ｎｇ／ｍｌのＧＥＰで処理し、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｉを用いて、細胞ライセートを解析した。図６に示すように、ＧＥＰは、軟骨細胞のＡｋｔおよびｐ４４／ｐ４２（Ｅｒｋ１／２）経路を特異的に活性化する。

ＧＥＰにより介在される標的遺伝子の活性化は、ＴＮＦＲに依存する：
ＧＥＰ下流の分子を同定するため、我々は、ゲノム全体のＤＮＡチップ解析を行った。全ＲＮＡを、ヒトＣ２８Ｉ２軟骨細胞から単離し、５０ｎｇ／ｍｌのＧＥＰにより処理し、マイクロアレイ解析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により様々な時点で解析した。階層的クラスタリングで測定したところ、ＧＥＰ処理後に約４０個の遺伝子が上方制御される（２倍超）と判定された［５３］。興味深いことに、Ｇａｄｄ４５β、ＪｕｎＢ、ＫＬＦ２、Ｓｍａｄ７、Ｓｏｘ４およびＴｃｆ８などのＧＥＰ誘導性の遺伝子は、ＴＧＦβサブファミリーによっても活性化されることが知られている［５４〜５６］。我々は次に、ＧＥＰによるこれらの遺伝子の活性化が、ＴＮＦＲに依存するかどうかを判定し、５０ｎｇ／ｍｌのＧＥＰの存在下で培養した初代野生型（Ｂ６）、ＴＮＦＲ１−／−、およびＴＮＦＲ２−／−ＭＬＥ細胞を用いたリアルタイムＰＣＲにより、これらの遺伝子の発現プロファイリングを様々な時点で調べた（図７）。ＧＥＰは野生型ＭＬＥ細胞においては、明らかにこれらの遺伝子を活性化した。しかしながら、ＧＥＰはＴＮＦＲ１−／−細胞またはＴＮＦＲ２−／−細胞においては、それらの誘導の大部分を喪失したことから、ＧＥＰの標的遺伝子の誘導は、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２に依存することが示される。興味深いことに、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２はどちらも、ＧＥＰ刺激性の遺伝子発現にとって重要であるようである。

ＴＮＦαおよびＧＥＰ誘導性の細胞内現象を明らかにするために提案されたモデル：
ＧＥＰは、ＴＮＦαと同様にＴＮＦＲのＣＲＤに結合する（図４）［５７］。このため、ＴＮＦＲに対するＧＥＰとＴＮＦαとの間の結合に、相反する阻害作用（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）が存在する。興味ある問題は、同じ受容体ＴＮＦＲを使用するＧＥＰおよびＴＮＦαが、なぜ正反対の反応を誘導するかである。図８に示すように、ＴＮＦα三量体（ｔｒｉｍｍｅｒ）はＴＮＦ受容体の細胞外ドメインに結合し、１）ストレス関連ＪＮＫの強い活性化を誘導し、ｐ３８の反応を抑制し、２）ＮＦ−ｋＢ経路の活性化を誘導する［５８］のに対し、ＧＥＰは、Ｅｒｋ１／２を強力に活性化し、中程度にＡｋｔシグナル伝達を活性化する（図６および図８）。Ｓｏｘ４、Ｓｍａｄ７、ＪｕｎＢ、Ｇａｄｄ４５β、Ｔｃｆ８など多くのＧＥＰ活性化遺伝子は、ＴＧＦβサブファミリーによっても活性化され、ＧＥＰにより介在される遺伝子の活性化は、ＴＮＦＲに依存する（図７）。

実施例２
Ａｔｓｔｔｒｉｎ（ＴＮＦ受容体を標的としたＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達のアンタゴニスト）の発見
ＴＮＦ受容体への結合に必要とされるＧＥＰのペプチドを同定するため、酵母発現プラスミドを用いて、一連のＧＥＰミュータント（すなわちＣ末端欠失、Ｎ末端欠失、個々のグラニュリンユニット、個々のリンカー、および様々な組み合わせ）を発現させた。簡単に説明すると、一連のＧＥＰミュータントをコードするｃＤＮＡセグメントをＰＣＲにより増幅し、ｐＤＢｌｅｕ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）酵母発現ベクターのＳａｌｌ／Ｎｏｔｌ部位にインフレームでクローニングした。作製したプラスミド、およびＴＮＦＲ１／Ｒ２の細胞外ドメインをコードするｐＰＣ８６−ＴＮＦＲを、３つのレポーター遺伝子、Ｈｉｓ＋、Ｕｒａ＋およびＬａｃＺ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む酵母ＭａＶ２０３株に同時形質転換し、形質転換体をβ−ガラクトシダーゼについて調べた。これらすべてのミュータントフィルターベースのβ−ガラクトシダーゼアッセイ（図９から図１５の図の右パネル）の結果を、これらの図の左パネルにまとめてある。図９から明らかなように、一連のＣ末端欠失の結果から、ＧＥＰのＣ末端の欠失は、ＴＮＦＲに対する結合親和性を低下させ、最終的に結合活性を完全に喪失することが示された。これは、一連のＮ末端欠失ミュータントにも当てはまる（図１０）。

単一のグラニュリンユニット（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ；図１１）と単一のリンカーユニット（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６またはＰ７；図１２）は、いずれもＴＮＦＲに結合できなかったことから、ＧＥＰの結合領域は、１つまたは複数のグラニュリンユニットおよびリンカーにまたがっている可能性がある。この仮説を調べるため、我々は最初に、各グラニュリンユニットとその３’−リンカーとを結合したところ、グラニュリンユニットＦとリンカーＰ３とを結合したものが、ＴＮＦＲに対して弱い結合を示すことが明らかになった（図１３）。次に、我々は、各グラニュリンユニットとその５’−リンカーとを結合したところ、Ｐ４とグラニュリンユニットＡとを結合したものが、ＴＮＦＲに対して弱い結合を示し、さらに、Ｐ５とユニットＣとを結合したものも、ＴＮＦＲに対して弱い結合を示すことが明らかになった（図１４）。これらの知見により、我々は、Ａ、ＣおよびＦのハーフユニットと、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５との様々な組み合わせのＴＮＦＲへの結合を試験した。図１５に明らかなように、１／２Ａ＋Ｐ３＋Ｐ４＋１／２Ｃ＋Ｐ５＋１／２Ｆは、ＴＮＦＲに対して強い結合を示した。このＧＥＰ由来のペプチドはここで、Ａｔｓｔｔｒｉｎと呼ぶ。

実施例３
ＧＥＰはＴＮＦαの作用を拮抗する
Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＴＮＦα誘導性の炎症反応を拮抗する：我々は次に、Ａｔｓｔｔｒｉｎが、ＴＮＦにより介在される炎症を阻害するかどうかを判定した。好中球は、ＴＮＦαのような炎症性刺激が引き金となり、好中球活性化および炎症プロセスの発生に関わる大量の反応性酸素種を発生する［５９］。このため、我々は、ＴＮＦα誘導性の好中球活性化に対するＡｔｓｔｔｒｉｎの作用を試験した。図１６（Ａ）に示すように、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＴＮＦαが引き金となる好中球活性化を用量依存的に阻害する。重要かつ際立っているのは、Ａｔｓｔｔｒｉｎが、様々な種類の炎症性疾患、特に関節リウマチなどの処置に臨床的に使用されているエンブレルおよびレミケード［６０］に匹敵する（少なくとも同等の）阻害作用を示すことである（図１６（Ｂ））。

ＧＥＰは、ＴＮＦα誘導性の細胞死を阻害する：ＴＮＦ−αは、軟骨細胞培養でアポトーシスを誘導することが明らかになっている［６１〜６３］。我々は次に、ＧＥＰが軟骨細胞におけるＴＮＦ−α誘導性のアポトーシスに影響を与えるかどうかを判定した。簡単に説明すると、ラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞およびヒトＣ２８Ｉ２軟骨細胞を２４時間血清飢餓状態にし、外因性の増殖因子およびサイトカインの作用を除去した。その後、細
胞を、０．０２％ＢＳＡ（ＣＴＲ、対照）、１００ｎｇ／ｍｌのＧＥＰ（ＧＥＰ）、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、またはＧＥＰ＋ＴＮＦ−αで３６時間刺激した。アポトーシスは、ＴＵＮＥＬアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。図１７に示すように、ＴＮＦ−αは、ＲＣＳおよびＣ２８Ｉ２の軟骨細胞の両方で顕著に細胞死を誘導したのに対し、ＧＥＰは、ＴＮＦ−αによる軟骨細胞のアポトーシスの誘導を劇的に阻害した。

ＧＥＰは、ＴＮＦα誘導性のメタロプロテイナーゼを阻害する：我々は最近、ＴＮＦαが、ＡＤＡＭＴＳファミリーの２つのメタロプロテイナーゼＡＤＡＭＴＳ−７およびＡＤＡＭＴＳ−１２の発現を誘導することを報告した［６４］。我々は次に、ＧＥＰがＴＮＦαによるＡＤＡＭＴＳの誘導を阻害するかどうかを判定した。簡単に説明すると、ヒトＣ２８Ｉ２軟骨細胞または軟骨の外植片を、様々な量のＧＥＰの非存在下または存在下、ＴＮＦαで４８時間処理し、ＡＤＡＭＴＳ−７およびＡＤＡＭＴＳ−１２の発現を、その特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲにより判定した。我々の以前の報告結果によれば［６４］、ＴＮＦαは、ＡＤＡＭＴＳ−７およびＡＤＡＭＴＳ−１２の発現を明らかに誘導した（図１８）。ＧＥＰは、軟骨細胞または軟骨の外植片においてＴＮＦαにより介在されるメタロプロテイナーゼの誘導を用量依存的に阻害することが示された（図１８）。

ＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎの主な特徴の概要：ＧＥＰおよびそれに由来するＡｔｓｔｔｒｉｎは、エタネルセプト（エンブレル、可溶性ＴＮＦＲ２−ＩｇＧ１融合タンパク質）、インフリキシマブ（レミケード、ＴＮＦ−αに対するキメラモノクローナル抗体）、およびアダリムマブ（ＴＮＦ−αに対するヒト型モノクローナル抗体）など現在入手可能な操作された抗炎症抗体または組換えタンパク質遮断薬と比較して、下記のような特徴を有する：

ｉ）独特の抗ＴＮＦ／ＴＮＦＲ特性：サイトカインを直接標的としてこれを全身性に除去（リガンド除去）する抗体およびイムノアドヘシンは、効果的な治療戦略になっており（たとえばエタネルセプト、アダリムマブおよびインフリキシマブ）、一部の適応症では、サイトカイン受容体の選択的標的化（たとえばアナキンラ）により、より効果的な臨床結果が実現できる。我々の研究により、ＧＥＰは、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を直接標的とする、最初に知られた増殖因子であり、したがってＧＥＰおよびその誘導ペプチドは、ＩＬ−Ｉ受容体を標的にするアナキンラの作用に似て、サイトカイン受容体への作用を介する、最初の抗ＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達遮断薬であることが明らかにされている。（ＧＥＰ／Ａｔｓｔｔｒｉｎとエンブレル／レミケードと間の特徴的な抗炎症機序を比較した図１９を参照されたい）。その独特の抗ＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達活性により、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、レミケードなどの現在のＴＮＦα遮断薬に反応しない患者集団にも十分に効果がある可能性がある。

ｉｉ）低毒性：Ａｔｓｔｔｒｉｎは、既に体液に存在する天然のＧＥＰ因子に由来するため、ＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎは、免疫学的問題または反応を引き起こさず、他の操作された組換えタンパク質と比較して毒性がないか、あるいは低いことが予想される。

ｉｉｉ）多機能：ＧＥＰは、その抗炎症活性に加えて、強力な組織修復機能も持っているため、ＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎは、炎症反応を遮断する一方で、炎症反応により傷害された組織を修復することも予想される。これに対し、エンブレルおよびレミケードなど現在の抗ＴＮＦ遮断薬はどれも、組織修復活性を持っていない。さらに、我々のパイロット研究からは、Ａｔｓｔｔｒｉｎに、Ａｔｓｔｔｒｉｎのもう１つの用途である腫瘍抑制活性があることも明らかになった。

実施例４
Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＧＥＰ刺激性の癌細胞増殖を阻害する
いくつかのヒト癌では、高レベルのＧＥＰ発現が認められており、これが乳癌、腎明細胞癌、浸潤性卵巣癌、膠芽細胞腫、脂肪細胞の奇形腫、および多発性骨髄腫など多様な癌における腫瘍形成に関与している［１６、１８−２４］。Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＴＮＦＲへのＴＮＦの結合を遮断することでＴＮＦにより介在される炎症を阻害しており、さらに、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＴＮＦＲへのＧＥＰの結合を遮断することで腫瘍細胞の増殖も阻害すると予想される。この仮説を試験するため、我々は、癌細胞のＧＥＰ刺激性の細胞増殖に対するＡｔｓｔｔｒｉｎの作用を調べた。図２０に明らかなように、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、試験対象の癌細胞のＧＥＰ刺激性の細胞増殖を用量依存的に阻害した。
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２９．Ｘｕ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｇｒａｎｕｌｉｎ／ｅｐｉｔｈｅｌｉｎ
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３０．Ｓｕｎ，Ｘ．，Ｍ．Ｇｕｌｙａｓ，ａｎｄ Ａ．Ｈｊｅｒｐｅ，Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｓ ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００４．３０（４）：ｐ．５１０−８．
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３２．Ｂａｒｒｅｄａ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘ
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３６．Ｃｒｕｔｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ ｃａｕｓｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７ｑ２１．Ｎａｔｕｒｅ，２００６．４４２（７１０５）：ｐ．９２０−４。
３７．Ｇａｓｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ ａｒｅ ａ ｍａｊｏｒ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｈｕｍ
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３８．Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｌ．Ｐ．，Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ，ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７，ａｎｄ ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，２００６．６０（３）：ｐ．２７５−７。
３９．Ａｒｉｋａｗａ−Ｈｉｒａｓａｗａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｒｌｅｃａｎ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｎｄ ｃｅｐｈａｌｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９９９．２３（３）：ｐ．３５４−８。４０．Ｋｖｉｓｔ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ
ｐｅｒｌｅｃａｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｉｂｒｉｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｅｒｌｅｃａｎ ｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００６．２８１（４４）：ｐ．３３１２７−３９。
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４２．Ｗａｌｌａｃｈ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ｆａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．１７：ｐ．３３１−６７。
４３．Ｇｕｉｃｃｉａｒｄｉ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ Ｇ．Ｊ．Ｇｏｒｅｓ，ＡＩＰｌ：ａ ｎｅｗ ｐｌａｙｅｒ ｉｎ ＴＮＦ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ ＣＨｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００３．１１１（１２）：ｐ．１８１３−５。
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４７．ＭａｃＲａｅ，Ｖ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ
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４８．Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ，Ｋ．，Ｄ．Ｃｈｒｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｌ．Ｓａｖｅｎｄａｈｌ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−ｌｂｅｔａ ａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ａｃｔ ｉｎ ｓｙｎｅｒｇｙ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ
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４９．Ｘｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｇｒａｎｕｌｉｎ−ｅｐｉｔｈｅｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ＧＥＰ）ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ＧＥＰ
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５４．Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ
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ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ
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６０．Ｒｏｔｈｅ，Ａ．，Ｂ．Ｅ．Ｐｏｗｅｒ，ａｎｄ Ｐ．Ｊ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２００８．４（１１）：ｐ．６０５−１４。
６１．Ａｉｚａｗａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ．Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，２００１．１９（５）：ｐ．７８５−９６．
６２．Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＭＰ−４ ｍＲＮＡ ｂｕｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｃｌｏｎａｌ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ＥＣ ｃｅｌｌｓ，ＡＴＤＣ５．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０００．１２（５）：ｐ．５２６−５３０。
６３．ＭａｃＲａｅ，Ｖ．Ｅ．，Ｃ．Ｆａｒｑｕｈａｒｓｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｆ．Ａｈｍｅｄ，Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ ｉｎ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ），２００６．４５（１）：ｐ．１１−９。
６４．Ｌｕａｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＡＭＴＳ−７
ａｎｄ ＡＤＡＭＴＳ−１２ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ａｌｐｈａ−２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２００８．１６（１１）：ｐ．１４１３−２０。
６５．Ｈｅ，Ｚ．ａｎｄ Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．，Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９．５９，ｐ．３２２２。
６６．Ｈｅ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ ｉｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ
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６７．Ｚｈｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｎ ｔｏ ｅｐｉｔｈｅｌｉｎｓ：ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＳＬＰＩ ａｎｄ ｅｌａｓｔａｓｅ ｉｎ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ．Ｃｅｌｌ，２００２．１１１，ｐ．８６７。

実施例５
急性炎症空気嚢モデルの研究
空気嚢型急性炎症動物モデルを用いて、ＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎの抗炎症活性を試験した。空気嚢を誘導するため、１０〜１５週齢の雄マウスの背部皮下に、３ｍｌの空気を注射した。２日後、嚢を１．５ｍｌの空気で再膨張させた。６日目に、カラゲナンの懸濁液１ｍｌ（カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸塩緩衝生理食塩水溶液［ＰＢＳ］中に２％重量／容量）を空気嚢に注射して、炎症を誘導した。空気嚢に炎症を誘導する１時間前に、レミケード（１０ｕｇ／ｇ）、ＧＥＰ（１０ｕｇ／ｇ）およびＡｔｓｔｔｒｉｎ（１０ｕｇ／ｇ）を投与した。４時間後、ＣＯ₂ナルコーシスによりマウスを
屠殺し、嚢を２ｍｌのＰＢＳでフラッシュし、滲出液を採取した。遠心分離（１，０００ｇ、１０分間）後、無細胞の滲出液を集めた。製造者の指示に従い酵素免疫測定法（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＭ）を用いて、滲出液中のＩＬ−６およびＩＬ−１３の濃度を２回ずつ定量した。図２１に示す（ｓｈｏｗｅｄ）ように、ＧＥＰおよびその誘導Ａｔｓｔｔｒｉｎはどちらも、２つの主要な炎症性メディエーターＩＬ−６およびＩＬ−１３のレベルを強力に低下させた。このモデルでは、ＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎがどちらも、レミケードより効果的な抗炎症作用（ＩＬ−１３濃度が約８０％低下）を示す点に留意されたい。

実施例６
慢性炎症動物モデルの研究
関節リウマチ動物モデルを用いて、ＧＥＰ活性を判定する。この研究では、ＢＡＬＢ／ｃＪ雌マウスを使用する。この動物を１ケージ当たり３〜４匹の密度で収容し、１週間馴化させる。コラーゲンＩＩの十分に解明されたエピトープに対する４種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ：Ｃ１１ｂ、Ｊ１、Ｄ３およびＵ１）の組み合わせをＩＶ投与する（０日目）。３日後（３日目）、マウスに、ＩＰ投与でリポ多糖をチャレンジする（ＬＰＳ、２５μｇ／マウス）。３日目のＬＰＳのチャレンジから１時間後に試験デザインに従い、被検化合物およびビヒクルを投与する。１日目、４日目、７日目、１０日目および１１日目に足の浮腫を判定する。１日目、３日目、５日目、７日目および１０日目に関節の炎症の徴候について、マウスの関節炎スコアを視覚的に検討する。関節炎スコアを測定したすべての日に体重を測定する。剖検時に血液を採取し、血清または血漿へ処理する。１１日目にカリパスで最終的な測定を行った後、マウスを安楽死させる。後肢を採取し、病理組織解析のために固定する。

実施例７
ＴＮＦαトランスジェニックマウスにおける関節炎の進行に対するＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎの作用
Ｄｒ．Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｏｌｌｉａｓ¹研究室が最初に作製したヒトＴＮＦα遺伝子導
入トランスジェニックマウスは、関節リウマチ患者に観察される多くの特徴を持つ慢性炎症性および破壊性多発性関節炎を発症する［５５］。このマウスモデルの表現型により、ＴＮＦαが関節リウマチのプロ炎症カスケードの最上流にあるという理論が検証され、さらに、この疾患の効果的な管理を変貌させてきた抗ＴＮＦα治療の顕著な成功が示唆された。このため、ＴＮＦαトランスジェニックマウスは、関節リウマチの発生過程の分子機構を分析し、新規な治療戦略の有効性を評価するための非常に有用な手段である［１１５、１３８、１３９］。このモデルを用いて、ＧＥＰ、特にその誘導ペプチドａｔｓｔｔｒｉｎ、関節リウマチを処置するための直接投与を詳細に評価する。簡単に説明すると、ＴＮＦαトランスジェニックマウス（ｎ＝６０、Ｔａｃｏｎｉｃから購入）をマウス１０匹ずつの６群に分け、文献に効果的であると記載されている用量でＧＥＰ、ＧＥＰ誘導ペプチド、および抗ＴＮＦα抗体（対照とする）を投与する［１４０、１４１］。処置剤はすべて腹腔内注射により投与する。群１は、リン酸塩緩衝生理食塩水で処置し、陰性対照とする。群２および３（低用量のＧＥＰおよびＧＥＰ誘導ペプチド）には、４週目〜１０週
目にかけて毎週３回１ｍｇ／ｇのＧＥＰまたはペプチドを投与する。群４および５（高用量）には、４週目〜１０週目にかけて毎週３回ｌＯｍｇ／ｇのＧＥＰまたはペプチドを投与する。群６には、４週目〜１０週目にかけて毎週３回１０ｍｇ／ｇの抗ＴＮＦαを投与する。１０週目に、動物をすべて頸椎脱臼で屠殺し、心臓穿刺により血液を採取し、より詳しい解析のため足および脛骨を脱臼させる。臨床評価は生後４週目から週１回行う。各群の動物の関節炎を評価する。

実施例８
ＲＡＮＫＬ誘導性の破骨細胞形成に対するＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎの作用
破骨細胞は骨吸収細胞であり、その過剰な活性は、骨粗鬆症を引き起こす。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞形成における重要な受容体であり、ＲＡＮＫに結合する。ＲＡＮＫおよびＴＮＦＲは、同じＴＮＦＲファミリーに属し、配列、特に構造が非常に類似している。（１）破骨細胞形における重要な受容体ＲＡＮＫが、ＴＮＦＲサブファミリーに属すること、および（２）ＧＥＰおよびその誘導ペプチドＡｔｓｔｔｒｉｎがＴＮＦＲに結合し、ＴＮＦα作用を遮断することを踏まえて、我々はさらに、ＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎが破骨細胞形成に影響を与えるかどうかを調べた。ＧＥＰまたはペプチドａｔｓｔｔｒｉｎの存在下および非存在下で、ＲＡＮＫＬ誘導性の破骨細胞形成を判定した。簡単に説明すると、我々は、ＲＡＮＫＬの存在下でマクロファージＲａｗ ２６４．７を４日間培養し、ＴＲＡＰ染色を行った。予想どおり、ＲＡＮＫＬは、確実に破骨細胞形成を誘導し、多核性のＴＲＡＰ陽性細胞が観察された（図２２、矢印で示す）。ＧＥＰおよびａｔｓｔｔｒｉｎは、用量依存的（ｄｏｅｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）に骨芽細胞の分化を阻害することが示された（図２２）。興味深いことに（Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ）、破骨細胞形成の遮断において、ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＧＥＰより強力であるように思われる。ａｔｓｔｔｒｉｎが破骨細胞形成を阻害するという知見により、このペプチドが、関節リウマチなどの様々な種類の炎症性疾患だけでなく、骨粗鬆症も処置する作用があることが示される。

実施例９
ＴＮＦファミリーメンバーＲＡＮＫＬおよびＦＡＳに対するＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎの結合
ＧＥＰ／Ａｔｓｔｔｒｉｎと、ＲＡＮＫおよびＦＡＳなどＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）サブファミリーの他のメンバーとの間の相互作用を調べた。結合を判定するため、様々なプラスミド対を、酵母菌株ＭＡＶ２０３に同時形質転換し、酵母ツーハイブリッドアッセイを行った（図２６）。ＧＥＰプラスミドは、ＴＮＦＲ１プラスミド、ＴＮＦＲ２プラスミド、ＲＡＮＫプラスミド、およびＦＡＳプラスミドとそれぞれ同時形質転換した。Ａｔｓｔｔｒｉｎプラスミドは、ＴＮＦＲ１プラスミド、ＴＮＦＲ２プラスミド、ＲＡＮＫプラスミド、およびＦＡＳプラスミドとそれぞれ同時形質転換した。酵母形質転換体は、ＳＤ−ｌｅｕ−／ｔｒｐ−／ｈｉｓ−／ｕｒａ−／３ＡＴ⁺プレートで選択し、β−ガラクト
シダーゼ活性について試験した。Ｒｂとラミンとの間の相互作用がないものを陰性対照として使用した。このツーハイブリッドアッセイによれば、ＧＥＰは、ＴＮＦＲだけでなく、ＲＡＮＫおよびＦＡＳとも結合するのに対し、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＴＮＦＲに特異的に結合する。

これらの研究により、ＧＥＰはＲＡＮＫおよびＦａｓにも結合するものの、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の場合より、相互作用が弱くなる可能性があることが明らかにされる。これに対し（ｈｉ ｃｏｎｔｒａｓｔ）、ＴＮＦ（ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２）受容体に対してＧＥＰより高い結合親和性を示すＡｔｓｔｔｒｉｎは、ツーハイブリッド結合アッセイにより判定したところ、ＲＡＮＫおよびＦＡＳと直接的に相互作用しない。したがって、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、そのＴＮＦＲに対する特異性により、ＧＥＰと比較して副作用および毒性が少ないか、あるいは副作用および毒性が異なる可能性がある。ＧＥＰの方は、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーＲＡＮＫと結合し、したがって複数の病態生理学
的プロセスに影響を与え得るためである。

我々は以前に、Ａｔｓｔｔｒｉｎが、ＲＡＮＫＬ誘導性の破骨細胞形成を強力に阻害することを示した（実施例８）。今回、本例の結果により、ＡｔｓｔｔｒｉｎがＲＡＮＫに結合しないことが明らかにされる。全体として、これらのデータからは、Ａｔｓｔｔｒｉｎにより介在される破骨細胞形成（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｇｅｎｅｓｉｓ）の阻害は、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ経路の遮断によるものでなければならないことが示唆される。実際、ＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達が、破骨細胞形成にとっても極めて重要であることを示す証拠が増加している。

実施例１０
ＧＥＰは、ＴＮＦＲに対してＴＮＦαより高い結合親和性を示す
ＳｅｎｓｉＱ Ｐｉｏｎｅｅｒ（ＩＣｘ Ｎｏｍａｄｉｃｓ，Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ，ＯＫ ７３１０４）を用いた分析的表面プラズモン共鳴により、ＴＮＦＲに対するＧＥＰおよびＴＮＦαの速度論的（ｋｉｎｅｔｉｃ）結合研究の観察および解析を行った。図２７に速度論的（ｋｉｎｅｔｉｃ）結合を示し、表１に速度定数をまとめてある。ＧＥＰは、ＴＮＦαと比較してＴＮＦ受容体、特にＴＮＦＲ２に対して著しく高い親和性を示す（ＧＥＰとＴＮＦαとのＫ_D：１．２８×１０^-9Ｍと７．６４×１０^-7Ｍ）。ＴＮＦ
Ｒ２（Ｋ_D７．６４×１０^-7Ｍ）よりもＴＮＦＲ１（ＫＤ８．８×１０^-9Ｍ）に対してよ
り高い親和性を示すＴＮＦαと異なり、ＧＥＰは、ＴＮＦＲ１（ＫＤ）１．５８×１０^-9Ｍ）よりもＴＮＦＲ２（ＫＤ１．２８×１０^-9Ｍ）に対して若干高い親和性を示す。

実施例１１
ＡｔｓｔｔｒｉｎおよびＴＮＦＲの結合研究
ＡｔｓｔｔｒｉｎをＧＳＴ融合タンパク質として細菌に発現させ、グルタチオンアガロース樹脂で精製し、活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ ｆａｃｔｏｒ）を用いて溶出した（活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ ｆａｃｔｏｒ）の切断部位はＧＳＴとＡｔｓｔｔｒｉｎとの間にある）（図２８（Ａ））。次いで活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｘａ ｆａｃｔｏｒ）を、Ｘａ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｒｅｓｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶出液から除去した。精製されたＡｔｓｔｔｒｉｎを、Ｌｉｍｕｌｕｓ血球抽出物を用いたアッセイによりエンドトキシンについて解析したところ、エンドトキシンレベルは対照培地と同等であり、製造者規格の＜１単位／μｇを何倍も下回ることが示された。分析的表面プラズモン共鳴アッセイ（図２８（Ｂ）および（Ｃ））を用いて、我々は、ＡｔｓｔｔｒｉｎはＴＮＦαと比較して、ＴＮＦＲ２に対し約９倍高い結合親和性（Ａｔｓｔｔｒｉｎ／ＴＮＦＲ２とＴＮＦα／ＴＮＦＲ２とのＫＤ：８．５９×１０^-8Ｍと７．６４×１０^-7Ｍ）を示したけれども、ＴＮＦＲ１に対しては約１８倍低い親和性（Ａｔｓｔｔｒｉｎ／ＴＮＦＲ１とＴＮＦα／ＴＮＦＲ１とＫＤ：１．６０×１０^-7Ｍと８．８０×１０^-9Ｍ）を示したことから、ＡｔｓｔｔｒｉｎはＴＮＦα／ＴＮＦＲ２経路を効果的に遮断できるものの、ＴＮＦ
α／ＴＮＦＲ１シグナル伝達に大きな影響を与え得ないことを見出して気持ちが高ぶった。

実施例１２
Ａｔｓｔｔｒｉｎは、Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔシグナル伝達を活性化できずに、癌細胞増殖を阻害する
単一膜上でホスホ−ｐ９０ＲＳＫ、ホスホ−Ａｋｔ、ホスホ−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）、およびホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質のレベルを同時に検出することができるＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｉ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて、我々は次に、軟骨細胞におけるＧＥＰ活性化シグナル伝達とＡｔｓｔｔｒｉｎ活性化シグナル伝達とを比較しようとした。ヒトＣ２８Ｉ２軟骨細胞（Ｄｒ．Ｍａｒｙ Ｂ．Ｇｏｌｄｒｉｎｇから提供）を２４時間飢餓状態にし、５０ｎｇ／ｍｌのＧＥＰまたはＡｔｓｔｔｒｉｎを用いて処理し、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｉを用いて細胞ライセートを様々な時点で解析した。図２９に示すように、ＧＥＰは、Ｅｒｋ１／２を強く活性化し、Ａｋｔ経路を中程度に活性化した（Ｆｅｎｇ，Ｊ．，Ｇｕｏ，Ｆ．，Ｊｉａｎｇ，Ｂ．，Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｃ．Ｊ．，ＧＥＰ：Ａ ＢＭＰ２−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｅｒｋ１／２ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ＪｕｎＢ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２０１０ Ｆｅｂ．２［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ
ｐｒｉｎｔ］）。しかしながら、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＧＥＰのＴＮＦＲ結合活性を保持しつつ（図２８）、ＧＥＰの発癌性シグナル伝達を破壊する。ＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎを組み合わせて試験すると、Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＧＥＰにより介在されるｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫの活性化を遮断または抑制する（図２９）。

実施例１３
コラーゲン誘導性の関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいてＡｔｓｔｔｒｉｎは、関節炎の発症を予防する
我々は次に、ＲＡの多くの臨床的および病理学的特徴を示す、コラーゲン誘導性の関節炎（ＣＬＡ）マウスモデルを用いてＡｔｓｔｔｒｉｎを調べた。簡単に説明すると、０日目にＤＢＡ／１マウスに、改変した完全フロイントアジュバントに乳化したニワトリのコラーゲンＩＩを、ｓ．ｃ．投与で尾基底部にチャレンジした（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）。１９日目、マウスを３群（各々ｎ＝１０）に分け、３５日目まで１日おきに以下のとおり処置した：群１には、Ａｔｓｔｔｒｉｎを１０μｇ／ｇ体重の用量でｉ．ｐ．投与し、群２には、エンブレル（ＴＮＦＲ２の可溶性細胞外ドメイン）を１０μｇ／ｇ体重の用量でｉ．ｐ．投与し（陽性対照とした）、群３には、等量のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、陰性対照とした）を投与した。関節炎の発生、関節炎の重症度スコア、および定圧カリパスで測定する足の厚さについて、マウスを毎日モニターした。図３０（Ａ）および３０（Ｂ）に示すように、Ａｔｓｔｔｒｉｎおよびエンブレルはどちらも、関節炎の発症を効果的に予防した。Ａｔｓｔｔｒｉｎは関節炎の発症を完全に予防したため、このモデルではＡｔｓｔｔｒｉｎの方が、エンブレルより強力であった。図３１の代表的なパネルに見られるように、ＰＢＳで処置したマウスでは、ＣＩＡの症状（腫脹、紅斑、変形）がはっきりと確認された。これに対し、Ａｔｓｔｔｒｉｎおよびエンブレルで処置したマウスでは、病理学的変化が著しく低下し、Ａｔｓｔｔｒｉｎ処置マウスは、正常マウスと同等であった。ＰＢＳで処置したＣＩＡマウスの足首は、白血球の強い浸潤および組織の破壊（Ｈ＆Ｅ染色）、ならびにマトリックス染色（サフラニン（Ｓａｒｆｒａｎｉｎ）０染色）の消失を示した（図３２（Ａ））。Ａｔｓｔｔｒｉｎ処置マウスでは、関節炎の症状がなかった。ＭｉｃｒｏＣＴ画像（図３２（Ｂ））からは、ＰＢＳで処置したＣＩＡマウスで明瞭な骨糜爛が明らかになった。しかし、Ａｔｓ
ｔｔｒｉｎでは、明らかにならなかった。さらに、ＰＢＳで処置したＣＩＡマウスの糜爛領域周囲には、ＴＲＡＰ＋の骨吸収破骨細胞が明瞭に認められた。これに対し、Ａｔｓｔｔｒｉｎ処置ＣＩＡマウスでは、ＴＲＡＰ＋破骨細胞がほとんど検出できなかった（図３３）。

我々は、ＣＩＡマウスの血清中のプロ炎症性および抗炎症性サイトカインのレベルに対するＡｔｓｔｔｒｉｎの作用を評価した。この研究では、ＡｔｓｔｔｒｉｎをＰＢＳおよびエンブレルと比較した。プロ炎症性サイトカインＩＬ−１βおよびＩＬ−６を評価し、さらに、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０およびＩＬ−１３を判定した。図３４に示すように、Ａｔｓｔｔｒｉｎおよびエンブレルは、プロ炎症性サイトカインＩＬ−６のレベルを著しく低下させた。エンブレルおよびＡｔｓｔｔｒｉｎはＩＬ−１βを著しく低下させるとは言い難いけれども、Ａｔｓｔｔｒｉｎの方が、エンブレルよりもＩＬ−Ｉβを低下させた。抗炎症性サイトカインについては、エンブレルおよびＡｔｓｔｔｒｉｎはどちらも、ＩＬ−Ｉ０を増加させた。Ａｔｓｔｔｒｉｎの方が、ＩＬ−１０レベルに対してより著しい作用を示した。エンブレルおよびＡｔｓｔｔｒｉｎはどちらも、抗炎症性サイトカインＩＬ−１３の量を増加させた。

実施例１４
細胞内のＴＮＦ誘導性の活性に対するＡｔｓｔｔｒｉｎの作用
ＲＡＷ２６４．７細胞を用いたインビトロでの細胞ベースの研究を利用して、細胞内のＴＮＦの反応に対するＡｔｓｔｔｒｉｎの作用を詳細に判定し、評価した。ＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎについて、ＴＮＦ誘導性のニトリット生成に対するその作用を評価した。添加したＴＮＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＧＥＰ、Ａｔｓｔｔｒｉｎまたはエンブレルのいずれかの量を増量しながら（０．３、１．５および７．５ｎＭ）、細胞内のニトリット生成を測定した。ＧＥＰは、ニトリット生成をやや低下させたのに対し、ＡｔｓｔｔｒｉｎおよびエンブレルはそれぞれＴＮＦ誘導性のニトリット生成をより著しく低下させた（図３６）。次に、細胞内のＴＮＦ誘導性のＮＦκＢの核内蓄積を評価した。ＧＥＰおよびＡｔｓｔｔｒｉｎは、ＮＦκＢ ｐ６５染色で判定したところ、どちらもＴＮＦ誘導性のＮＦκＢの核内蓄積を遮断した（図３７）。ＴＮＦαの存在下で、ＧＥＰまたはＡｔｓｔｔｒｉｎのどちらかの濃度を上げながら、ＴＮＦ活性化ＮＦκＢレポーター遺伝子（ＮＦκＢ結合部位を持つＰＡＫ−Ｉ）の誘導を測定した（図３８）。Ａｔｓｔｔｒｉｎは、ＧＥＰより（ｔｈａｔ）低濃度でレポーター遺伝子の誘導をより著しく阻害した。

本発明は、その精神または本質的な特徴を逸脱することなく、他の形態で実施したり、あるいは他のやり方で行ったりすることができる。したがって、本開示は、すべての態様において、例示であり（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ）、限定的なものと見なしてはならない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等範囲に属する変更はすべて、そこに包含されることを意図している。

本明細書では、様々な参考文献を引用しており、各々についてその全体を参照によって本明細書に援用する。

Claims (21)

1. １つまたは複数のグラニュリンユニットと、グラニュリン／エピテリン前駆体（ＧＥＰ）の１つまたは複数のリンカーユニットとを含み、かつＴＮＦファミリーメンバーのシグナル伝達を拮抗できる、単離されたペプチド（その変異体を含む）。
2. １つまたは複数のグラニュリンユニットと、図２３のヒトＧＥＰの１つまたは複数のリンカーユニットとを含み、かつＴＮＦおよびＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達を拮抗できる、請求項１に記載の単離されたペプチド。
3. 図２３および／または図２４に示すＧＥＰの少なくとも１／２Ｆ、１／２Ａおよび１／２Ｃグラニュリンユニットと、ＧＥＰのリンカーユニットＰ３、Ｐ４およびＰ５とを含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
4. 図２４（配列番号２）に示す１／２Ｆ−Ｐ３−Ｐ４−１／２Ａ−Ｐ５−１／２Ｃを含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
5. 前記ペプチドまたは変異体は、ＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２に結合できる、請求項１に記載の単離されたペプチド。
6. 請求項１に記載の１つまたは複数のペプチドと、抗炎症薬または化合物、抗癌剤または化合物、および免疫調節薬の１つまたは複数とを含む、組成物。
7. 任意選択的に薬学的に許容されるキャリア、ビヒクルまたは希釈液をさらに含む治療用または医薬組成物である、請求項６に記載の組成物。
8. 請求項１に記載のペプチド、および薬学的に許容されるキャリア、ビヒクルまたは希釈液を含む、医薬組成物。
9. 請求項１〜５のいずれかのペプチドをコードすることができる、単離された核酸。
10. 請求項９に記載の核酸、および前記核酸を発現するための手段を含む、ベクター。
11. 前記核酸は細胞内で前記核酸の発現を可能にするシグナルに作動可能に連結される、請求項１０に記載のベクター。
12. 哺乳動物細胞または被検体においてＴＮＦもしくはＴＮＦ／ＴＮＦＲの活性またはシグナル伝達を調節、遮断、または阻害する方法であって、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、またはａｔｓｔｔｒｉｎを含む組成物を前記細胞または被検体に投与することを含む、方法。
13. 哺乳動物細胞または被検体においてＴＮＦの活性またはシグナル伝達を調節、遮断、または阻害する方法であって、請求項８の組成物を前記細胞または被検体に投与することを含む、方法。
14. 被検体においてＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達により介在される疾患または状態を予防、緩和、および／または処置する方法であって、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、またはａｔｓｔｔｒｉｎを含む組成物を前記被検体に投与することを含む、方法。
15. 被検体においてＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達により介在される疾患または状態を予防、緩和、および／または処置する方法であって、請求項８に記載の組成物を前記被検体に
    投与することを含む、方法。
16. 前記疾患または状態は炎症性疾患もしくは状態、免疫学的な疾患もしくは状態、または癌である、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 前記炎症性疾患または状態は関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、炎症性肺疾患および慢性閉塞性肺疾患から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記免疫学的な疾患または状態はアレルギーおよび自己免疫疾患から選択される、請求項１６に記載の方法。
19. ＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性を拮抗または阻害するのに効果的である可能性がある薬剤または化合物をスクリーニングするためのアッセイ系であって、可能性がある薬剤または化合物を、ＴＮＦを含む細胞サンプルに投与してＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性を活性化すること、および対照との比較によりＴＮＦ活性時の前記可能性がある薬剤または化合物の前記効果を判定することを含み、前記対照はＴＮＦのアンタゴニストである、アッセイ系。
20. 前記ＴＮＦはＴＮＦαであり、前記対照は請求項１に記載のペプチドである、請求項１８に記載のアッセイ系。
21. 前記ＴＮＦはＴＮＦαであり、前記対照はａｔｓｔｔｒｉｎである、請求項１８に記載のアッセイ系。

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