JPWO2021014428A5 - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2021014428A5 JPWO2021014428A5 JP2022504139A JP2022504139A JPWO2021014428A5 JP WO2021014428 A5 JPWO2021014428 A5 JP WO2021014428A5 JP 2022504139 A JP2022504139 A JP 2022504139A JP 2022504139 A JP2022504139 A JP 2022504139A JP WO2021014428 A5 JPWO2021014428 A5 JP WO2021014428A5
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- seq
- acid molecule
- exon
- optionally
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Description
実施例８．ＬＭＩ０７０は用量依存的にインビボで導入遺伝子発現をオンにする
ＳＮＸ７スイッチ（バージョン１）を有するシナプシンプロモーターの制御下にあるｈＰＧＲＮをコードするｓｓＡＡＶ９ウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞で産生し、イオジキサノールで精製した。２ｕＬのＡＡＶベクターの２ｅ１０ｖｇは、ＦＶＢ新生仔マウスにおいてＰ０でＩＣＶを注射された。４週齢で、３、１０又は３０ｍｇ／ｋｇのＬＭＩ０７０又は溶媒対照を胃管で経口投与した。１グループあたり６～７匹のマウスを特定の時点で屠殺した（図８Ａ）。ＰＢＳで経心腔的灌流した後、左半球の後半分をＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブでホモジナイズした。ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイは、ＡＡＶベクターから発現したヒトＰＧＲＮの測定に使用された。ヒト皮質のサンプルは、生理学的ＰＧＲＮレベル（約２００ｐｇ／ｍｇ）の対照として使用された。結果は、脳内のトランスジェニックｈＰＧＲＮの急速な（ＬＭＩ０７０投与の１２時間後）蓄積を示し、これは２４時間の時点で減少し始める。導入遺伝子の発現は、ＬＭＩ０７０投与に対する用量反応を示した。
以下の態様を包含し得る。
［１］ 目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に連結されたミニ遺伝子を含む核酸分子であって、前記ミニ遺伝子は、
ａ．第１のエクソン；
ｂ．第１のイントロン；
ｃ．第２のエクソン；
ｄ．第２のイントロン；及び
ｅ．第３のエクソン
を含み、前記第２のエクソンは、スプライス調節剤結合配列を含み、スプライス調節剤の存在下では、前記第２のエクソンは、前記核酸のｍＲＮＡ産物に含まれ、及び前記スプライス調節剤の非存在下では、前記第２のエクソンは、前記核酸のｍＲＮＡ産物に含まれない、核酸分子。
［２］ 前記第３のエクソンは、前記スプライス調節剤の不在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームであり、且つ前記スプライス調節剤の存在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームではない終止コドンを含む、上記［１］に記載の核酸分子。
［３］ 前記第２のエクソンは、前記スプライス調節剤の存在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームである終止コドンを含む、上記［１］に記載の核酸分子。
［４］ 前記第１のエクソン及び前記第３のエクソンは、開始コドンを含まず、前記第２のエクソンは、開始コドンを含む、上記［１］に記載の核酸分子。
［５］ 前記ミニ遺伝子と前記導入遺伝子との間に配置されたプロテアーゼ切断部位をコードする配列を含む、上記［１］～［４］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［６］ 前記プロテアーゼ切断部位は、哺乳動物プロテアーゼによって切断される、上記［５］に記載の核酸分子。
［７］ 前記哺乳動物プロテアーゼは、フューリン、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、カテプシンＢ、グランザイムＢ、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ジェネナーゼ、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ又はエラスターゼ１である、上記［６］に記載の核酸分子。
［８］ 前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＸＸＸ［ＫＲ］Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＲＸコンセンサスモチーフ、ＲＮＲＲ（配列番号３９）、Ｉ－Ｅ－Ｐ－Ｄ－Ｘコンセンサスモチーフ（配列番号３５）、Ｇｌｕ／Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ、Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ－Ｎ－Ｌ－Ｙ－Ｆ－Ｑ－Ｇ（配列番号４１）及び［ＡＧＳＶ］－ｘ（配列番号４２）からなる群から選択される切断モチーフを有するポリペプチドを含む、上記［４］～［７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［９］ 前記切断部位は、フューリンによって切断される、上記［４］～［８］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［１０］ フューリンによって切断される前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）；ＲＴＫＲ（配列番号４３）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号４５）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号４７）；ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号４９）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号５１）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号５３）；ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号５５）；又はＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号５７）である、上記［９］に記載の核酸分子。
［１１］ フューリンによって切断される前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）を含む、上記［１０］に記載の核酸分子。
［１２］ 前記プロテアーゼ切断部位をコードする前記配列は、ＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣ（配列番号１９）を含む、例えばそれからなる、上記［１１］に記載の核酸分子。
［１３］ 前記ミニ遺伝子と前記導入遺伝子との間に配置された自己切断ペプチドをコードする配列を含み、任意選択により、前記自己切断ペプチドは、前記目的のタンパク質のＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸以内で切断する、上記［１］～［１２］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［１４］ 前記自己切断ペプチドは、任意選択により、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド及びＦ２Ａペプチドから選択される２Ａペプチドである、上記［１３］に記載の核酸分子。
［１５］ 前記自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドを含む、上記［１３］又は［１４］に記載の核酸分子。
［１６］ 前記自己切断ペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号６１）を含み、任意選択により、前記自己切断ペプチドは、（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５９）を含む、上記［１３］～［１５］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［１７］ 前記スプライス調節剤結合配列は、前記第２のエクソンの３’末端に位置する、上記［１］～［１６］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［１８］ 前記スプライス調節剤結合配列は、ＡＧＡを含み、例えばそれからなり、及び前記スプライス調節剤は、５－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－２－（６－（（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－４－イル）オキシ）ピリダジン－３－イル）フェノール（ＬＭＩ０７０）である、上記［１］～［１７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［１９］ 前記第２のエクソンは、
ａ．ＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号１）；
ｂ．ＧＴＡＡＴＴＡＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＡＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＡ（配列番号２）；
ｃ．ＧＧＡＴＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＡＡＣＡＧＡ（配列番号３）；
ｄ．ＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号４）；
ｅ．ＡＴＣＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡ（配列番号５）；
ｆ．ＡＡＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＡＧＡＡＡＣＣＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡ（配列番号６）；
ｇ．ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧＡ（配列番号７）；
ｈ．ＴＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＴＣＣＧＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＴＡＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号８）；
ｉ．ＧＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡ（配列番号９）；
ｊ．ＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡ（配列番号１０）；
ｋ．
、及び
ｌ．（ａ）～（ｋ）のいずれかのフラグメント又は変異体であって、それに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するフラグメント又は変異体
から選択される配列を含む、例えばそれからなる、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２０］ 前記第２のエクソンは、ＳＮＸ７のエクソンに由来する配列を含み、任意選択により、前記配列は、ＳＮＸ７の潜在的エクソンに由来する、上記［１］～［１９］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２１］ 前記第２のエクソンは、
ａ．
；
ｂ．配列番号１６のフラグメント；又は
ｃ．配列番号１６の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
を含む、例えばそれからなる、上記［１］～［２０］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２２］ 前記第２のエクソンは、
ａ．
；
ｂ．配列番号９８のフラグメント；又は
ｃ．配列番号９８の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
を含む、例えばそれからなる、上記［１］～［２０］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２３］ 前記第２のエクソンは、３ｎ－１ヌクレオチドからなり、ｎは、整数である、上記［１］若しくは［２］又は［４］～［２２］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２４］ 前記第１のエクソンは、
ａ．１つ以上、例えば３つのＧＡＡリピート（配列番号６９）（例えば、ＧＡＡＧＡＡＧＡＡ（配列番号６９）を含む）；
ｂ．コザック配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号７０）を含むコザック配列）；又は
ｃ．（ａ）及び（ｂ）の両方
を含む、上記［１］～［２１］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２５］ 前記ミニ遺伝子は、
ａ．単一の開始コドン、例えばＡＴＧ開始コドンを除く全てを除去するか又は変異させること；
ｂ．前記第１のエクソン、前記第２のエクソン及び前記第３のエクソンの末端におけるもの以外の全ての潜在的スプライスドナー及びスプライスアクセプター配列を除去するか又は変異させること
を行うように改変されている、上記［１］～［２３］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２６］ 前記単一の開始コドンは、前記第１のエクソン内に配置される、上記［２５］に記載の核酸分子。
［２７］ 前記単一の開始コドンは、前記第２のエクソン内に配置される、上記［２５］に記載の核酸分子。
［２８］ 前記ミニ遺伝子は、２０００未満、１９００未満、１８００未満、１７００未満、１６００未満、１５００未満、１４００未満、１３００未満、１２００未満、１１００未満、１０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満又は５００未満のヌクレオチドを含む、上記［１］～［２７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２９］ 前記ミニ遺伝子は、約２５００～約５００ヌクレオチド、例えば約２０００～約５００ヌクレオチド、例えば約１５００～約６００ヌクレオチド、例えば約１２００～約７００ヌクレオチド、例えば約１１００～約８００ヌクレオチド、例えば約８００～約５００ヌクレオチド、例えば８００～約６００ヌクレオチド、例えば約８００～約７００ヌクレオチドを含む、上記［１］～［２７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［３０］ 前記ミニ遺伝子は、配列番号７１又は配列番号９４或いはそれに対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する配列又はその機能的フラグメントを含む、例えばそれからなる、上記［１］若しくは［２］又は［４］～［２９］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［３１］ （ａ）目的のタンパク質をコードする導入遺伝子と、（ｂ）配列番号７１又は配列番号９４或いはそれに対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する配列又はその機能的フラグメントを含む、例えばそれからなるミニ遺伝子とを含む核酸分子。
［３２］ フューリン切断部位をコードする配列であって、配列番号１９を含む配列と、自己切断ペプチドをコードする配列であって、配列番号２０を含む配列とをさらに含み、任意選択により、前記ミニ遺伝子は、前記フューリン切断部位をコードする前記配列の５’側（例えば、前記フューリン切断部位をコードする前記配列のすぐ５’側）に配置され、前記フューリン切断部位をコードする前記配列は、前記自己切断ペプチドをコードする前記配列の５’側（例えば、前記自己切断ペプチドをコードする前記配列のすぐ５’側）に配置され、及び前記自己切断ペプチドをコードする前記配列は、前記導入遺伝子の５’側（例えば、前記導入遺伝子のすぐ５’側）に配置される、上記［３１］に記載の核酸分子。
［３３］ 前記ミニ遺伝子及び導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、任意選択により、前記プロモーターは、前記ミニ遺伝子の５’側に配置される、上記［１］～［３２］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［３４］ 前記プロモーターは、ＪｅＴプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＰＧＫプロモーター若しくはシナプシンプロモーター又はイントロンを含まない任意のプロモーターである、上記［３３］に記載の核酸分子。
［３５］ 転写後調節エレメントをさらに含む、上記［１］～［３４］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［３６］ 前記転写後調節エレメント（ＰＲＥ）は、Ｂ型肝炎（ＨＰＲＥ）、コウモリ（ＢＰＲＥ）、ジリス（ＧＳＰＲＥ）、ホッキョクジリス（ＡＳＰＲＥ）、アヒル（ＤＰＲＥ）、チンパンジー（ＣＰＲＥ）及びウーリーモンキー（ＷＭＰＲＥ）又はウッドチャック（ＷＰＲＥ）由来のＰＲＥを含み、任意選択により、前記転写後調節エレメントは、前記導入遺伝子の３’側に配置される、上記［３５］に記載の核酸分子。
［３７］ 前記転写後調節エレメントは、配列番号７２、配列番号７３又は配列番号８８を含む、上記［３５］に記載の核酸分子。
［３８］ 前記構築物は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）をさらに含み、任意選択により、前記ポリＡは、前記導入遺伝子の３’側に配置される、上記［１］～［３７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［３９］ 前記ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡ、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリＡ又はウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ、ベータグロビンポリＡ、アルファグロビンポリＡ、オボアルブミンポリＡ、カッパ軽鎖ポリＡ及び合成ポリＡである、上記［３８］に記載の核酸分子。
［４０］ 前記ポリＡは、配列番号２２を含む、例えばそれからなる、上記［３８］又は［３９］に記載の核酸分子。
［４１］ 上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
［４２］ ＤＮＡベクター、任意選択により環状ベクター、任意選択によりプラスミドである、上記［４１］に記載のベクター。
［４３］ 二本鎖又は一本鎖である、上記［４１］又は［４２］に記載のベクター。
［４４］ 二本鎖である、上記［４１］～［４３］のいずれか一項に記載のベクター。
［４５］ ウイルスベクターである、上記［４１］～［４４］のいずれか一項に記載のベクター。
［４６］ 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である、上記［４５］に記載のベクター。
［４７］ 前記ウイルスベクターは、組換えＡＡＶベクター、任意選択により自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、上記［４６］に記載のベクター。
［４８］ 前記組換えＡＡＶベクターは、１つ以上の末端逆位反復（ＩＴＲ）を含み、任意選択により、前記ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、任意選択により、前記ＡＡＶベクターは、２つのＩＴＲを含み、任意選択により、前記２つのＩＴＲは、配列番号１２及び配列番号２３を含む、上記［４７］に記載のベクター。
［４９］ 例えば、５’から３’まで、
ａ．任意選択により配列番号１２を含む末端分解部位の欠失を含むように任意選択により改変されているＩＴＲ、任意選択によりＡＡＶ２ ＩＴＲ；
ｂ．プロモーター、任意選択により配列番号１３を含むか又はそれからなるＪｅＴプロモーター；
ｃ．上記［１］～［３２］のいずれか一項に記載の核酸分子；
ｄ．任意選択により配列番号２２を含むか又はそれからなるポリＡシグナル；及び
ｅ．任意選択により配列番号２３を含むか又はそれからなるＩＴＲ、任意選択によりＡＡＶ２ ＩＴＲ
を含む、上記［４１］～［４８］のいずれか一項に記載のベクター。
［５０］ 上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸又は上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクターを含む組換えウイルス。
［５１］ アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、キメラＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ＤＮＡウイルス、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である、上記［５０］に記載の組換えウイルス。
［５２］ ＡＡＶである、上記［５１］に記載の組換えウイルス。
［５３］ 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３６、ＡＡＶｒｈ３７、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ及びＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓキャプシド血清型又はその変異体、例えば複数のＡＡＶ血清型からのキャプシドの組み合わせの１つ以上を含む、上記［５２］に記載の組換えウイルス。
［５４］ 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシド血清型又はその任意の変異体若しくは誘導体を含む、上記［５２］に記載の組換えウイルス。
［５５］ 例えば、それぞれ配列番号７４、配列番号７５及び配列番号７６によってコードされるか、又はそれぞれ配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む、上記［５４］に記載の組換えウイルス。
［５６］ 前記ＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクター又は一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターを含む、上記［５０］～［５５］のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
［５７］ 上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター又は上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む細胞。
［５８］ ヒト細胞である、上記［５７］に記載の細胞。
［５９］ ニューロン又は星状細胞である、上記［５７］又は［５８］に記載の細胞。
［６０］ 前記細胞がスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を含む場合、前記目的のタンパク質の発現レベルは、前記細胞が前記スプライス調節剤を含まない場合の前記目的のタンパク質の発現レベルよりも例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく、任意選択により、前記細胞が前記スプライス調節剤を含まない場合の前記発現レベルは、検出できない、上記［５７］～［５９］のいずれか一項に記載の細胞。
［６１］ 前記細胞がスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を含まない場合、前記目的のタンパク質の発現レベルは、前記細胞が前記スプライス調節剤を含む場合の前記目的のタンパク質の発現レベルよりも例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく、任意選択により、前記細胞が前記スプライス調節剤を含む場合の前記発現レベルは、検出できない、上記［５７］～［５９］のいずれか一項に記載の細胞。
［６２］ 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、上記［１］若しくは２］又は４］～４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター或いは上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
ａ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
ｂ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法。
［６３］ 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、上記［１］若しくは［３］～［３６］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター又は上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
ａ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
ｂ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法。
［６４］ 上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス又は上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物。
［６５］ 遺伝子治療を必要とする対象を処置する方法であって、上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞又は上記［６４］に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
［６６］ スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して、前記目的のタンパク質の発現において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍の増加又は減少を引き起こすのに有効な量の前記スプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を前記対象に投与することをさらに含む、上記［６５］に記載の方法。
［６７］ 上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞又は上記［６４］に記載の医薬組成物と、スプライス調節剤とを含むキット。
［６８］ 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、上記［１］若しくは２］又は４］～４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター或いは上記［５０］～［６２］のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
ａ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
ｂ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法における使用のための、上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞又は上記［６０］に記載の医薬組成物。
［６９］ 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、上記［１］若しくは３］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター又は上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
ａ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
ｂ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法における使用のための、上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞又は上記［６４］に記載の医薬組成物。
［７０］ 遺伝子治療を必要とする対象を処置する方法における使用のための、上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞又は上記［６４］に記載の医薬組成物。
［７１］ 前記導入遺伝子は、ゲノム編集系のタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ）、ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）、抗体若しくは抗体フラグメント又は治療用タンパク質（例えば、プログラニュリン、ＳＭＮ、ＭｅＣＰ２、ＣＬＮ２、ＣＬＮ３、ＣＬＮ４、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７、ＣＬＮ８から選択されるタンパク質）をコードする、上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞、上記［６２］若しくは６３］又は［６５］若しくは［６６］のいずれか一項に記載の方法、上記［６４］に記載の医薬組成物或いは上記［６４］～［６６］のいずれか一項に記載の使用のための核酸、ベクター、組換えウイルス、細胞又は医薬組成物。
ＳＮＸ７スイッチ（バージョン１）を有するシナプシンプロモーターの制御下にあるｈＰＧＲＮをコードするｓｓＡＡＶ９ウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞で産生し、イオジキサノールで精製した。２ｕＬのＡＡＶベクターの２ｅ１０ｖｇは、ＦＶＢ新生仔マウスにおいてＰ０でＩＣＶを注射された。４週齢で、３、１０又は３０ｍｇ／ｋｇのＬＭＩ０７０又は溶媒対照を胃管で経口投与した。１グループあたり６～７匹のマウスを特定の時点で屠殺した（図８Ａ）。ＰＢＳで経心腔的灌流した後、左半球の後半分をＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブでホモジナイズした。ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイは、ＡＡＶベクターから発現したヒトＰＧＲＮの測定に使用された。ヒト皮質のサンプルは、生理学的ＰＧＲＮレベル（約２００ｐｇ／ｍｇ）の対照として使用された。結果は、脳内のトランスジェニックｈＰＧＲＮの急速な（ＬＭＩ０７０投与の１２時間後）蓄積を示し、これは２４時間の時点で減少し始める。導入遺伝子の発現は、ＬＭＩ０７０投与に対する用量反応を示した。
以下の態様を包含し得る。
［１］ 目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に連結されたミニ遺伝子を含む核酸分子であって、前記ミニ遺伝子は、
ａ．第１のエクソン；
ｂ．第１のイントロン；
ｃ．第２のエクソン；
ｄ．第２のイントロン；及び
ｅ．第３のエクソン
を含み、前記第２のエクソンは、スプライス調節剤結合配列を含み、スプライス調節剤の存在下では、前記第２のエクソンは、前記核酸のｍＲＮＡ産物に含まれ、及び前記スプライス調節剤の非存在下では、前記第２のエクソンは、前記核酸のｍＲＮＡ産物に含まれない、核酸分子。
［２］ 前記第３のエクソンは、前記スプライス調節剤の不在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームであり、且つ前記スプライス調節剤の存在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームではない終止コドンを含む、上記［１］に記載の核酸分子。
［３］ 前記第２のエクソンは、前記スプライス調節剤の存在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームである終止コドンを含む、上記［１］に記載の核酸分子。
［４］ 前記第１のエクソン及び前記第３のエクソンは、開始コドンを含まず、前記第２のエクソンは、開始コドンを含む、上記［１］に記載の核酸分子。
［５］ 前記ミニ遺伝子と前記導入遺伝子との間に配置されたプロテアーゼ切断部位をコードする配列を含む、上記［１］～［４］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［６］ 前記プロテアーゼ切断部位は、哺乳動物プロテアーゼによって切断される、上記［５］に記載の核酸分子。
［７］ 前記哺乳動物プロテアーゼは、フューリン、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、カテプシンＢ、グランザイムＢ、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ジェネナーゼ、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ又はエラスターゼ１である、上記［６］に記載の核酸分子。
［８］ 前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＸＸＸ［ＫＲ］Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＲＸコンセンサスモチーフ、ＲＮＲＲ（配列番号３９）、Ｉ－Ｅ－Ｐ－Ｄ－Ｘコンセンサスモチーフ（配列番号３５）、Ｇｌｕ／Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ、Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ－Ｎ－Ｌ－Ｙ－Ｆ－Ｑ－Ｇ（配列番号４１）及び［ＡＧＳＶ］－ｘ（配列番号４２）からなる群から選択される切断モチーフを有するポリペプチドを含む、上記［４］～［７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［９］ 前記切断部位は、フューリンによって切断される、上記［４］～［８］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［１０］ フューリンによって切断される前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）；ＲＴＫＲ（配列番号４３）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号４５）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号４７）；ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号４９）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号５１）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号５３）；ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号５５）；又はＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号５７）である、上記［９］に記載の核酸分子。
［１１］ フューリンによって切断される前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）を含む、上記［１０］に記載の核酸分子。
［１２］ 前記プロテアーゼ切断部位をコードする前記配列は、ＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣ（配列番号１９）を含む、例えばそれからなる、上記［１１］に記載の核酸分子。
［１３］ 前記ミニ遺伝子と前記導入遺伝子との間に配置された自己切断ペプチドをコードする配列を含み、任意選択により、前記自己切断ペプチドは、前記目的のタンパク質のＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸以内で切断する、上記［１］～［１２］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［１４］ 前記自己切断ペプチドは、任意選択により、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド及びＦ２Ａペプチドから選択される２Ａペプチドである、上記［１３］に記載の核酸分子。
［１５］ 前記自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドを含む、上記［１３］又は［１４］に記載の核酸分子。
［１６］ 前記自己切断ペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号６１）を含み、任意選択により、前記自己切断ペプチドは、（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５９）を含む、上記［１３］～［１５］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［１７］ 前記スプライス調節剤結合配列は、前記第２のエクソンの３’末端に位置する、上記［１］～［１６］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［１８］ 前記スプライス調節剤結合配列は、ＡＧＡを含み、例えばそれからなり、及び前記スプライス調節剤は、５－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－２－（６－（（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－４－イル）オキシ）ピリダジン－３－イル）フェノール（ＬＭＩ０７０）である、上記［１］～［１７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［１９］ 前記第２のエクソンは、
ａ．ＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号１）；
ｂ．ＧＴＡＡＴＴＡＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＡＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＡ（配列番号２）；
ｃ．ＧＧＡＴＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＡＡＣＡＧＡ（配列番号３）；
ｄ．ＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号４）；
ｅ．ＡＴＣＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡ（配列番号５）；
ｆ．ＡＡＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＡＧＡＡＡＣＣＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡ（配列番号６）；
ｇ．ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧＡ（配列番号７）；
ｈ．ＴＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＴＣＣＧＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＴＡＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号８）；
ｉ．ＧＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡ（配列番号９）；
ｊ．ＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡ（配列番号１０）；
ｋ．
ｌ．（ａ）～（ｋ）のいずれかのフラグメント又は変異体であって、それに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するフラグメント又は変異体
から選択される配列を含む、例えばそれからなる、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２０］ 前記第２のエクソンは、ＳＮＸ７のエクソンに由来する配列を含み、任意選択により、前記配列は、ＳＮＸ７の潜在的エクソンに由来する、上記［１］～［１９］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２１］ 前記第２のエクソンは、
ａ．
ｂ．配列番号１６のフラグメント；又は
ｃ．配列番号１６の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
を含む、例えばそれからなる、上記［１］～［２０］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２２］ 前記第２のエクソンは、
ａ．
ｂ．配列番号９８のフラグメント；又は
ｃ．配列番号９８の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
を含む、例えばそれからなる、上記［１］～［２０］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２３］ 前記第２のエクソンは、３ｎ－１ヌクレオチドからなり、ｎは、整数である、上記［１］若しくは［２］又は［４］～［２２］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２４］ 前記第１のエクソンは、
ａ．１つ以上、例えば３つのＧＡＡリピート（配列番号６９）（例えば、ＧＡＡＧＡＡＧＡＡ（配列番号６９）を含む）；
ｂ．コザック配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号７０）を含むコザック配列）；又は
ｃ．（ａ）及び（ｂ）の両方
を含む、上記［１］～［２１］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２５］ 前記ミニ遺伝子は、
ａ．単一の開始コドン、例えばＡＴＧ開始コドンを除く全てを除去するか又は変異させること；
ｂ．前記第１のエクソン、前記第２のエクソン及び前記第３のエクソンの末端におけるもの以外の全ての潜在的スプライスドナー及びスプライスアクセプター配列を除去するか又は変異させること
を行うように改変されている、上記［１］～［２３］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２６］ 前記単一の開始コドンは、前記第１のエクソン内に配置される、上記［２５］に記載の核酸分子。
［２７］ 前記単一の開始コドンは、前記第２のエクソン内に配置される、上記［２５］に記載の核酸分子。
［２８］ 前記ミニ遺伝子は、２０００未満、１９００未満、１８００未満、１７００未満、１６００未満、１５００未満、１４００未満、１３００未満、１２００未満、１１００未満、１０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満又は５００未満のヌクレオチドを含む、上記［１］～［２７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［２９］ 前記ミニ遺伝子は、約２５００～約５００ヌクレオチド、例えば約２０００～約５００ヌクレオチド、例えば約１５００～約６００ヌクレオチド、例えば約１２００～約７００ヌクレオチド、例えば約１１００～約８００ヌクレオチド、例えば約８００～約５００ヌクレオチド、例えば８００～約６００ヌクレオチド、例えば約８００～約７００ヌクレオチドを含む、上記［１］～［２７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［３０］ 前記ミニ遺伝子は、配列番号７１又は配列番号９４或いはそれに対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する配列又はその機能的フラグメントを含む、例えばそれからなる、上記［１］若しくは［２］又は［４］～［２９］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［３１］ （ａ）目的のタンパク質をコードする導入遺伝子と、（ｂ）配列番号７１又は配列番号９４或いはそれに対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する配列又はその機能的フラグメントを含む、例えばそれからなるミニ遺伝子とを含む核酸分子。
［３２］ フューリン切断部位をコードする配列であって、配列番号１９を含む配列と、自己切断ペプチドをコードする配列であって、配列番号２０を含む配列とをさらに含み、任意選択により、前記ミニ遺伝子は、前記フューリン切断部位をコードする前記配列の５’側（例えば、前記フューリン切断部位をコードする前記配列のすぐ５’側）に配置され、前記フューリン切断部位をコードする前記配列は、前記自己切断ペプチドをコードする前記配列の５’側（例えば、前記自己切断ペプチドをコードする前記配列のすぐ５’側）に配置され、及び前記自己切断ペプチドをコードする前記配列は、前記導入遺伝子の５’側（例えば、前記導入遺伝子のすぐ５’側）に配置される、上記［３１］に記載の核酸分子。
［３３］ 前記ミニ遺伝子及び導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、任意選択により、前記プロモーターは、前記ミニ遺伝子の５’側に配置される、上記［１］～［３２］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［３４］ 前記プロモーターは、ＪｅＴプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＰＧＫプロモーター若しくはシナプシンプロモーター又はイントロンを含まない任意のプロモーターである、上記［３３］に記載の核酸分子。
［３５］ 転写後調節エレメントをさらに含む、上記［１］～［３４］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［３６］ 前記転写後調節エレメント（ＰＲＥ）は、Ｂ型肝炎（ＨＰＲＥ）、コウモリ（ＢＰＲＥ）、ジリス（ＧＳＰＲＥ）、ホッキョクジリス（ＡＳＰＲＥ）、アヒル（ＤＰＲＥ）、チンパンジー（ＣＰＲＥ）及びウーリーモンキー（ＷＭＰＲＥ）又はウッドチャック（ＷＰＲＥ）由来のＰＲＥを含み、任意選択により、前記転写後調節エレメントは、前記導入遺伝子の３’側に配置される、上記［３５］に記載の核酸分子。
［３７］ 前記転写後調節エレメントは、配列番号７２、配列番号７３又は配列番号８８を含む、上記［３５］に記載の核酸分子。
［３８］ 前記構築物は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）をさらに含み、任意選択により、前記ポリＡは、前記導入遺伝子の３’側に配置される、上記［１］～［３７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［３９］ 前記ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡ、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリＡ又はウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ、ベータグロビンポリＡ、アルファグロビンポリＡ、オボアルブミンポリＡ、カッパ軽鎖ポリＡ及び合成ポリＡである、上記［３８］に記載の核酸分子。
［４０］ 前記ポリＡは、配列番号２２を含む、例えばそれからなる、上記［３８］又は［３９］に記載の核酸分子。
［４１］ 上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
［４２］ ＤＮＡベクター、任意選択により環状ベクター、任意選択によりプラスミドである、上記［４１］に記載のベクター。
［４３］ 二本鎖又は一本鎖である、上記［４１］又は［４２］に記載のベクター。
［４４］ 二本鎖である、上記［４１］～［４３］のいずれか一項に記載のベクター。
［４５］ ウイルスベクターである、上記［４１］～［４４］のいずれか一項に記載のベクター。
［４６］ 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である、上記［４５］に記載のベクター。
［４７］ 前記ウイルスベクターは、組換えＡＡＶベクター、任意選択により自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、上記［４６］に記載のベクター。
［４８］ 前記組換えＡＡＶベクターは、１つ以上の末端逆位反復（ＩＴＲ）を含み、任意選択により、前記ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、任意選択により、前記ＡＡＶベクターは、２つのＩＴＲを含み、任意選択により、前記２つのＩＴＲは、配列番号１２及び配列番号２３を含む、上記［４７］に記載のベクター。
［４９］ 例えば、５’から３’まで、
ａ．任意選択により配列番号１２を含む末端分解部位の欠失を含むように任意選択により改変されているＩＴＲ、任意選択によりＡＡＶ２ ＩＴＲ；
ｂ．プロモーター、任意選択により配列番号１３を含むか又はそれからなるＪｅＴプロモーター；
ｃ．上記［１］～［３２］のいずれか一項に記載の核酸分子；
ｄ．任意選択により配列番号２２を含むか又はそれからなるポリＡシグナル；及び
ｅ．任意選択により配列番号２３を含むか又はそれからなるＩＴＲ、任意選択によりＡＡＶ２ ＩＴＲ
を含む、上記［４１］～［４８］のいずれか一項に記載のベクター。
［５０］ 上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸又は上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクターを含む組換えウイルス。
［５１］ アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、キメラＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ＤＮＡウイルス、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である、上記［５０］に記載の組換えウイルス。
［５２］ ＡＡＶである、上記［５１］に記載の組換えウイルス。
［５３］ 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３６、ＡＡＶｒｈ３７、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ及びＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓキャプシド血清型又はその変異体、例えば複数のＡＡＶ血清型からのキャプシドの組み合わせの１つ以上を含む、上記［５２］に記載の組換えウイルス。
［５４］ 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシド血清型又はその任意の変異体若しくは誘導体を含む、上記［５２］に記載の組換えウイルス。
［５５］ 例えば、それぞれ配列番号７４、配列番号７５及び配列番号７６によってコードされるか、又はそれぞれ配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む、上記［５４］に記載の組換えウイルス。
［５６］ 前記ＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクター又は一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターを含む、上記［５０］～［５５］のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
［５７］ 上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター又は上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む細胞。
［５８］ ヒト細胞である、上記［５７］に記載の細胞。
［５９］ ニューロン又は星状細胞である、上記［５７］又は［５８］に記載の細胞。
［６０］ 前記細胞がスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を含む場合、前記目的のタンパク質の発現レベルは、前記細胞が前記スプライス調節剤を含まない場合の前記目的のタンパク質の発現レベルよりも例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく、任意選択により、前記細胞が前記スプライス調節剤を含まない場合の前記発現レベルは、検出できない、上記［５７］～［５９］のいずれか一項に記載の細胞。
［６１］ 前記細胞がスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を含まない場合、前記目的のタンパク質の発現レベルは、前記細胞が前記スプライス調節剤を含む場合の前記目的のタンパク質の発現レベルよりも例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく、任意選択により、前記細胞が前記スプライス調節剤を含む場合の前記発現レベルは、検出できない、上記［５７］～［５９］のいずれか一項に記載の細胞。
［６２］ 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、上記［１］若しくは２］又は４］～４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター或いは上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
ａ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
ｂ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法。
［６３］ 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、上記［１］若しくは［３］～［３６］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター又は上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
ａ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
ｂ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法。
［６４］ 上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス又は上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物。
［６５］ 遺伝子治療を必要とする対象を処置する方法であって、上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞又は上記［６４］に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
［６６］ スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して、前記目的のタンパク質の発現において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍の増加又は減少を引き起こすのに有効な量の前記スプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を前記対象に投与することをさらに含む、上記［６５］に記載の方法。
［６７］ 上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞又は上記［６４］に記載の医薬組成物と、スプライス調節剤とを含むキット。
［６８］ 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、上記［１］若しくは２］又は４］～４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター或いは上記［５０］～［６２］のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
ａ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
ｂ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法における使用のための、上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞又は上記［６０］に記載の医薬組成物。
［６９］ 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、上記［１］若しくは３］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター又は上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
ａ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
ｂ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法における使用のための、上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞又は上記［６４］に記載の医薬組成物。
［７０］ 遺伝子治療を必要とする対象を処置する方法における使用のための、上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞又は上記［６４］に記載の医薬組成物。
［７１］ 前記導入遺伝子は、ゲノム編集系のタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ）、ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）、抗体若しくは抗体フラグメント又は治療用タンパク質（例えば、プログラニュリン、ＳＭＮ、ＭｅＣＰ２、ＣＬＮ２、ＣＬＮ３、ＣＬＮ４、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７、ＣＬＮ８から選択されるタンパク質）をコードする、上記［１］～［４０］のいずれか一項に記載の核酸分子、上記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載のベクター、上記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組換えウイルス、上記［５７］～［６１］のいずれか一項に記載の細胞、上記［６２］若しくは６３］又は［６５］若しくは［６６］のいずれか一項に記載の方法、上記［６４］に記載の医薬組成物或いは上記［６４］～［６６］のいずれか一項に記載の使用のための核酸、ベクター、組換えウイルス、細胞又は医薬組成物。
Claims (20)
- 目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に連結されたミニ遺伝子を含む核酸分子であって、前記ミニ遺伝子は、
ａ．第１のエクソン；
ｂ．第１のイントロン；
ｃ．第２のエクソン；
ｄ．第２のイントロン；及び
ｅ．第３のエクソン
を含み、前記第２のエクソンは、スプライス調節剤結合配列を含み、スプライス調節剤の存在下では、前記第２のエクソンは、前記核酸のｍＲＮＡ産物に含まれ、及び前記スプライス調節剤の非存在下では、前記第２のエクソンは、前記核酸のｍＲＮＡ産物に含まれない、核酸分子。 - 前記第３のエクソンは、前記スプライス調節剤の不在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームであり、且つ前記スプライス調節剤の存在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームではない終止コドンを含む、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記第２のエクソンは、前記スプライス調節剤の存在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームである終止コドンを含む、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記第１のエクソン及び前記第３のエクソンは、開始コドンを含まず、前記第２のエクソンは、開始コドンを含む、請求項１に記載の核酸分子。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
前記ミニ遺伝子と前記導入遺伝子との間に配置されたプロテアーゼ切断部位をコードする配列を含む、
任意選択で、
ａ）前記プロテアーゼ切断部位は、フューリン、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、カテプシンＢ、グランザイムＢ、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ジェネナーゼ、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ又はエラスターゼ１からなる群から選択される哺乳動物プロテアーゼによって切断される、
ｂ）前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＸＸＸ［ＫＲ］Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＲＸコンセンサスモチーフ、ＲＮＲＲ（配列番号３９）、Ｉ－Ｅ－Ｐ－Ｄ－Ｘコンセンサスモチーフ（配列番号３５）、Ｇｌｕ／Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ、Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ－Ｎ－Ｌ－Ｙ－Ｆ－Ｑ－Ｇ（配列番号４１）及び［ＡＧＳＶ］－ｘ（配列番号４２）からなる群から選択される切断モチーフを有するポリペプチドを含む、核酸分子。 - 請求項４～５のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
前記切断部位は、フューリンによって切断される、
任意選択で、
フューリンによって切断される前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）を含む、
前記プロテアーゼ切断部位をコードする前記配列は、ＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣ（配列番号１９）を含む、例えばそれからなる、核酸分子。 - 請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
前記ミニ遺伝子と前記導入遺伝子との間に配置された自己切断ペプチドをコードする配列を含み、任意選択により、前記自己切断ペプチドは、前記目的のタンパク質のＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸以内で切断する、
任意選択で、前記自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドを含む、
任意選択で、前記自己切断ペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号６１）を含み、又は、前記自己切断ペプチドは、（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５９）を含む、核酸分子。 - 前記スプライス調節剤結合配列は、前記第２のエクソンの３’末端に位置する、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記スプライス調節剤結合配列は、ＡＧＡを含み、例えばそれからなり、及び前記スプライス調節剤は、５－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－２－（６－（（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－４－イル）オキシ）ピリダジン－３－イル）フェノール（ＬＭＩ０７０）である、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記第２のエクソンは、
ａ．ＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号１）；
ｂ．ＧＴＡＡＴＴＡＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＡＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＡ（配列番号２）；
ｃ．ＧＧＡＴＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＡＡＣＡＧＡ（配列番号３）；
ｄ．ＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号４）；
ｅ．ＡＴＣＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡ（配列番号５）；
ｆ．ＡＡＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＡＧＡＡＡＣＣＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡ（配列番号６）；
ｇ．ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧＡ（配列番号７）；
ｈ．ＴＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＴＣＣＧＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＴＡＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号８）；
ｉ．ＧＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡ（配列番号９）；
ｊ．ＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡ（配列番号１０）；
ｋ．
ｌ．（ａ）～（ｋ）のいずれかのフラグメント又は変異体であって、それに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するフラグメント又は変異体
から選択される配列を含む、例えばそれからなる、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
前記第２のエクソンは、ＳＮＸ７のエクソンに由来する配列を含み、任意選択により、前記配列は、ＳＮＸ７の潜在的エクソンに由来する、
任意選択により、
ａ）前記第２のエクソンは、
ｉ．
ｉｉ．配列番号１６のフラグメント；又は
ｉｉｉ．配列番号１６の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
を含む、例えばそれからなる；又は
ｂ）前記第２のエクソンは、
ｉ．
ｉｉ．配列番号９８のフラグメント；又は
ｉｉｉ．配列番号９８の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
を含む、例えばそれからなる、核酸分子。 - 前記第１のエクソンは、
ｉ．１つ以上、例えば３つのＧＡＡリピート（配列番号６９）（例えば、ＧＡＡＧＡＡＧＡＡ（配列番号６９）を含む）；
ｉｉ．コザック配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号７０）を含むコザック配列）；又は
ｉｉｉ．（ａ）及び（ｂ）の両方
を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 前記ミニ遺伝子は、
ｉ．単一の開始コドン、例えばＡＴＧ開始コドンを除く全てを除去するか又は変異させること；
ｉｉ．前記第１のエクソン、前記第２のエクソン及び前記第３のエクソンの末端におけるもの以外の全ての潜在的スプライスドナー及びスプライスアクセプター配列を除去するか又は変異させること
を行うように改変されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸分子。 - 請求項１若しくは２及び４～１３のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
前記ミニ遺伝子は、配列番号７１又は配列番号９４或いはそれに対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する配列又はその機能的フラグメントを含む、例えばそれからなる、
任意選択で、
ａ）前記核酸分子が、フューリン切断部位をコードする配列であって、配列番号１９を含む配列と、自己切断ペプチドをコードする配列であって、配列番号２０を含む配列とをさらに含み、任意選択により、前記ミニ遺伝子は、前記フューリン切断部位をコードする前記配列の５’側（例えば、前記フューリン切断部位をコードする前記配列のすぐ５’側）に配置され、前記フューリン切断部位をコードする前記配列は、前記自己切断ペプチドをコードする前記配列の５’側（例えば、前記自己切断ペプチドをコードする前記配列のすぐ５’側）に配置され、及び前記自己切断ペプチドをコードする前記配列は、前記導入遺伝子の５’側（例えば、前記導入遺伝子のすぐ５’側）に配置される、；
ｂ）前記核酸分子が、前記ミニ遺伝子及び導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、任意選択により、前記プロモーターは、前記ミニ遺伝子の５’側に配置される、；
任意選択で、前記プロモーターは、ＪｅＴプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＰＧＫプロモーター若しくはシナプシンプロモーター又はイントロンを含まない任意のプロモーターである、；
ｃ）前記核酸分子が、Ｂ型肝炎（ＨＰＲＥ）、コウモリ（ＢＰＲＥ）、ジリス（ＧＳＰＲＥ）、ホッキョクジリス（ＡＳＰＲＥ）、アヒル（ＤＰＲＥ）、チンパンジー（ＣＰＲＥ）及びウーリーモンキー（ＷＭＰＲＥ）又はウッドチャック（ＷＰＲＥ）由来のＰＲＥを含む前記転写後調節エレメント（ＰＲＥ）をさらに含み、任意選択により、前記転写後調節エレメントは、前記導入遺伝子の３’側に配置される；
ｄ）前記核酸分子が、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）をさらに含み、任意選択により、前記ポリＡは、前記導入遺伝子の３’側に配置される；
任意選択で、前記ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡ、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリＡ又はウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ、ベータグロビンポリＡ、アルファグロビンポリＡ、オボアルブミンポリＡ、カッパ軽鎖ポリＡ及び合成ポリＡである、核酸分子。 - ベクターであって、
請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸を含む、
任意選択で、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である、ベクター。 - 請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸又は請求項１５に記載のベクターを含む組換えウイルスであって、
任意選択で、前記組換えウイルスが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、キメラＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ＤＮＡウイルス、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である、組換えウイルス。 - 請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター又は請求項１６に記載の組換えウイルスを含む細胞であって、
任意選択で、前記細胞が、ニューロン又は星状細胞である、細胞。 - 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、請求項１若しくは３～１４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター又は請求項１６に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば請求項１７に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
ｉ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
ｉｉ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法。 - 請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の組換えウイルス又は請求項１７に記載の細胞を含む医薬組成物であって、
スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して、前記目的のタンパク質の発現において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍の増加又は減少を引き起こすのに有効な前記スプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を含む、医薬組成物。 - 遺伝子治療に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の組換えウイルス、請求項１７に記載の細胞又は請求項１９に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962878514P | 2019-07-25 | 2019-07-25 | |
| US62/878,514 | 2019-07-25 | ||
| US202063013283P | 2020-04-21 | 2020-04-21 | |
| US63/013,283 | 2020-04-21 | ||
| PCT/IB2020/057038 WO2021014428A1 (en) | 2019-07-25 | 2020-07-24 | Regulatable expression systems |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022541070A JP2022541070A (ja) | 2022-09-21 |
| JPWO2021014428A5 true JPWO2021014428A5 (ja) | 2023-08-01 |
Family
ID=71944162
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022504139A Pending JP2022541070A (ja) | 2019-07-25 | 2020-07-24 | 調節可能な発現系 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220307053A1 (ja) |
| EP (1) | EP4004213A1 (ja) |
| JP (1) | JP2022541070A (ja) |
| KR (1) | KR20220035937A (ja) |
| CN (1) | CN114174514A (ja) |
| AU (1) | AU2020319168B2 (ja) |
| CA (1) | CA3147574A1 (ja) |
| IL (1) | IL289711A (ja) |
| WO (1) | WO2021014428A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022226183A2 (en) * | 2021-04-21 | 2022-10-27 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Optimized ap4m1 polynucleotides and expression cassettes and their use |
| GB2617565A (en) * | 2022-04-11 | 2023-10-18 | Ucl Business Ltd | A construct, vector and system and uses thereof |
| WO2023219533A1 (ru) * | 2022-05-11 | 2023-11-16 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Аденоассоциированный вирусный вектор на основе серотипа aav.php.b и его применение |
| WO2024060205A1 (zh) * | 2022-09-23 | 2024-03-28 | 北京基驭医疗科技有限公司 | 包含基于小分子药物的可变剪接调节元件的核酸分子 |
| GB202215198D0 (en) * | 2022-10-14 | 2022-11-30 | Univ Sheffield | Gene therapy treatment |
Family Cites Families (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
| US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| AU678867B2 (en) | 1993-11-09 | 1997-06-12 | Medical College Of Ohio, The | Stable cell lines capable of expressing the adeno-associated virus replication gene |
| ES2216005T3 (es) | 1993-11-09 | 2004-10-16 | Targeted Genetics Corporation | Produccion de titulos elevados de vectores de aav recombinantes. |
| US5658785A (en) | 1994-06-06 | 1997-08-19 | Children's Hospital, Inc. | Adeno-associated virus materials and methods |
| US5856152A (en) | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
| AU707866B2 (en) | 1994-12-06 | 1999-07-22 | Targeted Genetics Corporation | Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant AAV vectors |
| US6001650A (en) | 1995-08-03 | 1999-12-14 | Avigen, Inc. | High-efficiency wild-type-free AAV helper functions |
| FR2737730B1 (fr) | 1995-08-10 | 1997-09-05 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de purification de virus par chromatographie |
| US6143548A (en) | 1995-08-30 | 2000-11-07 | Genzyme Corporation | Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV) |
| EP1983057A3 (en) | 1995-09-08 | 2009-01-07 | Genzyme Corporation | Improved AAV vectors for gene therapy |
| US5910434A (en) | 1995-12-15 | 1999-06-08 | Systemix, Inc. | Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant |
| CA2302992C (en) | 1997-09-05 | 2011-11-01 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors |
| US6410300B1 (en) | 1998-01-12 | 2002-06-25 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and formulations for mediating adeno-associated virus (AAV) attachment and infection and methods for purifying AAV |
| US6258595B1 (en) | 1999-03-18 | 2001-07-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses |
| WO2001083692A2 (en) | 2000-04-28 | 2001-11-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids |
| US9441244B2 (en) | 2003-06-30 | 2016-09-13 | The Regents Of The University Of California | Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof |
| US9233131B2 (en) | 2003-06-30 | 2016-01-12 | The Regents Of The University Of California | Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof |
| DK1751275T3 (da) | 2004-06-01 | 2017-11-27 | Avigen Inc | Sammensætninger og fremgangsmåder til forebyggelse af aggregering af aav-vektorer |
| US8110681B2 (en) | 2006-03-17 | 2012-02-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compounds for the treatment of spinal muscular atrophy and other uses |
| CA2653974A1 (en) | 2006-05-30 | 2008-02-14 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detecting and treating dementia |
| WO2009151546A2 (en) * | 2008-05-27 | 2009-12-17 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods for treating spinal muscular atrophy |
| CA2787827C (en) | 2010-01-28 | 2020-11-10 | The Children's Hospital Of Philadelphia | A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy |
| DE102012007232B4 (de) | 2012-04-07 | 2014-03-13 | Susanne Weller | Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen |
| MY174339A (en) | 2012-08-13 | 2020-04-09 | Novartis Ag | 1,4-disubstituted pyridazine analogs and methods for treating smn-deficiency-related conditions |
| US9040712B2 (en) | 2013-01-23 | 2015-05-26 | Novartis Ag | Thiadiazole analogs thereof and methods for treating SMN-deficiency-related-conditions |
| PL3027600T3 (pl) | 2013-07-31 | 2022-08-08 | Novartis Ag | 1,4-dwupodstawione pochodne pirydazyny i ich zastosowanie do leczenia stanów związanych z niedoborem smn |
| JP2015092462A (ja) | 2013-09-30 | 2015-05-14 | Tdk株式会社 | 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池 |
| SI3062824T1 (sl) * | 2013-10-28 | 2020-04-30 | Invectys | Cepivo telomeraza kodirajoče DNA |
| JP6202701B2 (ja) | 2014-03-21 | 2017-09-27 | 株式会社日立国際電気 | 基板処理装置、半導体装置の製造方法及びプログラム |
| EP3189142B1 (en) * | 2014-09-05 | 2020-07-15 | Stichting Katholieke Universiteit | Antisense oligonucleotides for the treatment of leber congenital amaurosis |
| JP6197169B2 (ja) | 2014-09-29 | 2017-09-20 | 東芝メモリ株式会社 | 半導体装置の製造方法 |
| ES2879995T3 (es) | 2015-12-10 | 2021-11-23 | Ptc Therapeutics Inc | Métodos para el tratamiento de la enfermedad de Huntington |
| WO2018009547A1 (en) * | 2016-07-05 | 2018-01-11 | The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Diagnosing col6-related disorders and methods for treating same |
| WO2018098446A1 (en) | 2016-11-28 | 2018-05-31 | Ptc Therapeutics, Inc | Methods for modulating rna splicing |
| AU2018282154B2 (en) | 2017-06-05 | 2022-04-07 | Ptc Therapeutics, Inc. | Compounds for treating huntington's disease |
| BR112019027719A2 (pt) | 2017-06-28 | 2020-07-28 | Ptc Therapeutics, Inc. | métodos para tratar a doença de huntington |
| WO2019005980A1 (en) | 2017-06-28 | 2019-01-03 | Ptc Therapeutics, Inc. | METHODS OF TREATING HUNTINGTON'S DISEASE |
| GB2587457B (en) | 2017-08-04 | 2022-06-01 | Skyhawk Therapeutics Inc | Methods and compositions for modulating splicing |
| US20210317474A1 (en) | 2017-11-08 | 2021-10-14 | Novartis Ag | Means and method for producing and purifying viral vectors |
-
2020
- 2020-07-24 AU AU2020319168A patent/AU2020319168B2/en active Active
- 2020-07-24 US US17/629,286 patent/US20220307053A1/en active Pending
- 2020-07-24 EP EP20750750.0A patent/EP4004213A1/en active Pending
- 2020-07-24 KR KR1020227005340A patent/KR20220035937A/ko unknown
- 2020-07-24 WO PCT/IB2020/057038 patent/WO2021014428A1/en unknown
- 2020-07-24 JP JP2022504139A patent/JP2022541070A/ja active Pending
- 2020-07-24 CN CN202080054347.8A patent/CN114174514A/zh active Pending
- 2020-07-24 CA CA3147574A patent/CA3147574A1/en active Pending
-
2022
- 2022-01-09 IL IL289711A patent/IL289711A/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Saraiva et al. | Gene therapy for the CNS using AAVs: the impact of systemic delivery by AAV9 | |
| US11344608B2 (en) | Factor IX gene therapy | |
| RU2021102893A (ru) | Модифицированные гены атаксии фридрейха и векторы для генной терапии | |
| US20200370069A1 (en) | Treatment of spinal muscular atrophy | |
| KR20210096168A (ko) | 신경퇴행성 질환을 위한 유전자 요법 | |
| US11891616B2 (en) | Transgene cassettes designed to express a human MECP2 gene | |
| JP2022541070A (ja) | 調節可能な発現系 | |
| WO2020208032A1 (en) | Hybrid promoters for muscle expression | |
| JPWO2020106916A5 (ja) | ||
| JPWO2021014428A5 (ja) | ||
| US20220042045A1 (en) | Expression cassettes for gene therapy vectors | |
| JP2023065516A5 (ja) | ||
| JPWO2019153009A5 (ja) | ||
| JPWO2020033473A5 (ja) | ||
| JPWO2020232297A5 (ja) | ||
| JPWO2021076911A5 (ja) | ||
| EP4198046A1 (en) | Alpha-sarcoglycan gene transfer increase using modified itr sequences | |
| EP4198134A1 (en) | Gamma-sarcoglycan gene transfer increase using modified itr sequences | |
| JPWO2021108809A5 (ja) | ||
| JPWO2020186150A5 (ja) | ||
| JP2024517957A (ja) | ベクター系 | |
| Nick et al. | Driving AAV Drug Design to the Right Place, Right Amount, and Right Time | |
| WO2024079249A1 (en) | Hybrid aav vector enhancing transgene expression in the liver | |
| JP2024521537A (ja) | 血友病ｂを処置するための組成物および方法 | |
| WO2023111107A1 (en) | Calpain-3 gene transfer increase using modified itr sequences |