CN115779097A - 基于工程化线粒体的肿瘤抗原递送系统及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及基于工程化线粒体的肿瘤抗原递送系统及应用。尽管线粒体中的DNA和磷脂成分作为TLR的激动剂已有报道，但是目前尚无文献报道以线粒体作为肿瘤抗原递送系统，构建基于转基因线粒体的预防性/治疗性肿瘤疫苗。本发明以鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)作为前导序列的质粒，结合慢病毒转染系统，建立了靶向线粒体的抗原表达平台。以卵清蛋白(OVA)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)为模型抗原，构建在线粒体上过表达OVA或TRP2的稳定细胞株，并提取其中的转基因线粒体(OVA‑MITO和TRP2‑MITO)用于评价它们作为肿瘤疫苗的效力。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及基于工程化线粒体的肿瘤抗原递送系统及应用。
背景技术
肿瘤疫苗的开发旨在通过激发针对肿瘤的适应性免疫反应来预防和治疗肿瘤。目前，已出现多种类型的肿瘤疫苗，它们包括肽段疫苗、全细胞疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗等。然而，这些肿瘤疫苗大多未能在临床上取得实际性的进展。例如，已有研究表明，肽段肿瘤疫苗缺乏临床疗效的可能原因是：抗原被递送到非专业的抗原呈递细胞(APC)或未发炎的淋巴器官。而一些评估自体细胞疫苗抗肿瘤效力的临床试验，由于缺乏适宜的佐剂来逆转肿瘤的免疫抑制作用，也未能到达主要终点。另外，PROSTVAC和PANVAC等病毒载体疫苗作为单药也未能充分地诱发免疫应答，目前进行中的临床试验正在评估它们与免疫检查点抑制剂联合使用的抗肿瘤效力。这些临床结果说明，提高抗原递送的准确性以及佐剂的辅助作用是提高肿瘤疫苗效力的关键。
最近的研究表明，模式识别受体(PPR)的激活对于为肿瘤疫苗产生有效和持久的抗肿瘤免疫至关重要。例如，当使用损伤相关分子模式(DAMPs)作为一种Toll样受体(TLR)激动剂作为疫苗佐剂时，可以向免疫系统表明疫苗抗原是外来的和危险的，这一点对肽段或蛋白类疫苗尤其重要。现有研究揭示了氧化的线粒体DNA作为一种DAMP，可在STING通路的介导下，增强细胞疫苗的抗肿瘤作用。此外，还有一些临床前研究表明，使用TLR7/8和TLR9激动剂作为佐剂，能促进原位肿瘤疫苗的治疗效果。
线粒体是具有原核生物特性的特殊细胞器，可有效激活免疫应答。许多线粒体来源的成分被认为是刺激PRR的DAMP，例如线粒体中的心磷脂可激活TLR2，线粒体DNA可激活TLR9/STING通路等。根据发明人前期研究，癌细胞中分离出的线粒体很容易被树突状细胞吞噬。
尽管线粒体中的DNA和磷脂成分作为TLR的激动剂已有报道，但是目前尚无文献报道以线粒体作为肿瘤抗原递送系统，构建基于转基因线粒体的预防性/治疗性肿瘤疫苗。
发明内容
本发明的目的在于从解决现有技术的不足出发，提出一个新的肿瘤抗原递送系统，即基于转基因线粒体的肿瘤抗原递送系统。通过构建了在靶向于线粒体上过表达肿瘤抗原的稳转细胞株，提取富集肿瘤抗原的线粒体，从而制备肿瘤疫苗。
具体地，构建了在靶向于线粒体上过表达肿瘤抗原的稳转细胞株，提取了富集肿瘤抗原的线粒体，以卵清蛋白(OVA)或酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)作为模型抗原，制备了肿瘤疫苗。在小鼠中对线粒体疫苗的预防和治疗作用进行了评估，显示出极强的抗肿瘤作用和免疫激活作用。
更具体地，是以鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)作为前导肽序列的质粒、结合慢病毒转染系统，建立了靶向线粒体的抗原表达平台。借助该技术，本发明成功分离出了富集肿瘤抗原的转基因线粒体作为肿瘤疫苗，并在动物模型中系统地评价了转基因线粒体疫苗对肿瘤的预防和治疗效果。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
第一，本发明首先提供一种肿瘤抗原递送系统，其包括转基因线粒体。
其中，所述肿瘤抗原包括但不限于：已知被证明可作为肿瘤抗原的分子；筛选出的个体化肿瘤相关新抗原。
优选地，所述肿瘤抗原选自OVA、TRP2、ROR-1、X PROTEIN、MUC 1、LMP1、LMP2、HPVE6/E7、EGFR、WT1、MAGE-A3、NY-ESO-1、HER2、gp100、PAP等中至少一种。更优选地，所述肿瘤抗原为OVA、TRP2中至少一种。
其中，所述转基因线粒体是以OTC序列和慢病毒转染系统，构建提取的线粒体。
进一步地，所述肿瘤抗原递送系统是以OTC作为前导序列的质粒和慢病毒转染系统，构建表达肿瘤抗原的线粒体稳转细胞株，提取其中的线粒体作为肿瘤抗原的递送系统。
优选地，所述肿瘤抗原包括OTC前导序列和模板抗原，所述模板抗原包括卵清蛋白(OVA)或酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)。
更优选地，所述OTC前导序列如SEQ ID NO.1所示。
最优选地，所述肿瘤抗原的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
第二，本发明还提供构建肿瘤抗原递送系统的方法，包括以下步骤：
构建含有肿瘤抗原的质粒，以慢病毒系统感染细胞，筛得在线粒体稳定表达肿瘤抗原的稳转株，再提取稳转株的线粒体，即可得到转基因线粒体。
进一步地，所述肿瘤抗原为含有OTC序列和肿瘤抗原序列。
其中，所述肿瘤抗原序列选自OVA、TRP2、ROR-1、X PROTEIN、MUC 1、LMP1、LMP2、HPVE6/E7、EGFR、WT1、MAGE-A3、NY-ESO-1、HER2、gp100、PAP中至少一种。更优选地，所述肿瘤抗原序列为OVA、TRP2序列中至少一种。
其中，所述质粒选自昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种。
优选地，所述质粒选自pCDH-CMV、pCDH-EF1、pCDH-MSCV、pCDH-RFP、pLV105载体中的任意一种。
第三，本发明还提供一种肿瘤疫苗，其含有上述肿瘤抗原递送系统。
其中，所述肿瘤抗原递送系统包括转基因线粒体。
优选地，所述转基因线粒体包括表达肿瘤抗原的线粒体。更优选地，所述转基因线粒体为表达OVA的线粒体或表达TRP2的线粒体。
第四，本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述的肿瘤抗原递送系统或肿瘤疫苗，还包括药剂学上允许的辅料或辅助性成分。
其中，上述药物组合物中所述的辅料或辅助性成分为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、保护剂、吸附载体或润滑剂中至少一种。
第五，本发明还提供上述的肿瘤抗原递送系统、肿瘤疫苗，或者上述的药物组合物，与至少一种其它预防性疾病治疗药物的组合物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。
其中，所述其它预防性疾病治疗药物为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂、DC肿瘤疫苗或心磷脂。
第六，本发明还提供了上述肿瘤抗原递送系统在制备肿瘤疫苗佐剂中的用途。
第七，本发明也提供了上述的肿瘤疫苗、或者上述的药物组合物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。
其中，上述的肿瘤选自宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、肉瘤、淋巴瘤或粒细胞白血病等肿瘤。
本发明的有益效果：
本发明首次以线粒体作为肿瘤抗原递送系统，构建基于转基因线粒体的预防性/治疗性肿瘤疫苗。本发明以鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)作为前导序列的质粒和慢病毒转染系统，建立了靶向线粒体的抗原表达平台。以卵清蛋白(OVA)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)为模型抗原，构建在线粒体上过表达OVA或TRP2的稳定细胞株，并提取其中的转基因线粒体(OVA-MITO和TRP2-MITO)用于评价它们作为肿瘤疫苗的效力。
通过实验发现，两种转基因线粒体疫苗对于小鼠皮下肿瘤兼有预防和治疗效果。申请人还发现OVA-MITO与TRP2-MITO都能有效募集并激活树突状细胞(DC)，进而诱导针对肿瘤的细胞免疫。通过更加深入的研究，进一步发现线粒体疫苗激活DC细胞的潜在机制与TLR2信号通路，以及线粒体内膜中的心磷脂有关。本研究证明，转基因线粒体作为一种富含免疫刺激物的抗原载体，能够高效地将肿瘤抗原递呈至局部范围内的DC细胞，并通过TLR2信号通路引发针对肿瘤的细胞免疫。
附图说明
图1为本发明试验例1构建在线粒体上稳定表达肿瘤抗原的细胞系。
图2为本发明试验例2转基因线粒体疫苗抑制小鼠肿瘤生长。
图3为本发明试验例3转基因线粒体疫苗增强了CD8+T细胞之间的交叉激活作用。
图4为本发明试验例4OVA-MITO疫苗可激活肿瘤微环境中的T细胞免疫。
图5为本发明试验例5线粒体疫苗通过调节TLR2介导的信号通路促进树突状细胞的成熟。
图6为本发明试验例6线粒体中的心磷脂通过TLR2信号通路诱导树突状细胞的成熟。
图7为本发明试验例3TRP2-MITO能够被用于制备DC疫苗并能发挥有效的抗肿瘤作用
图8为本发明试验例4TRP2-MITO疫苗在肿瘤微环境中诱导T细胞介导的免疫应答。
图9为本发明试验例5线粒体疫苗不能在TLR2-/-小鼠中激发CD8+T细胞的交叉激活作用
图10为本发明试验例7转基因线粒体疫苗的安全性分析。
具体实施方式
对于肿瘤疫苗来说，有效递呈优选的抗原并配合适宜的佐剂可提高疫苗的抗肿瘤效率。线粒体作为一种细胞器，不仅具有原核生物的特性，而且还是多种损伤相关分子模式(DAMP)的来源。此外，线粒体易被吞噬细胞吞噬，然后激活先天免疫。
本发明首次提出转基因线粒体，并公开了转基因线粒体的制备方法，该制备方法可依赖于OTC序列，同时保护转基因线粒体作为肿瘤疫苗的作用，或作为抗原递逞系统，对于其他预防性疾病中的作用。
本发明利用以鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)作为前导序列的质粒和慢病毒转染系统，建立了靶向线粒体的抗原表达平台。申请人以卵清蛋白(OVA)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)为模型抗原，构建在线粒体上过表达OVA或TRP2的稳定细胞株，并提取其中的转基因线粒体(OVA-MITO和TRP2-MITO)用于评价它们作为肿瘤疫苗的效力。发现两种转基因线粒体疫苗对于小鼠皮下肿瘤兼有预防和治疗效果。
更进一步地，所述OTC前导序列如SEQ ID NO.1所示。
OTC序列，SEQ ID NO.1：
ATGCTGTTTAATCTGAGGATCCTGTTAAACAATGCAGCTTTTAGAAATGGTCACAACTTCATGGTTCGAAATTTTCGGTGTGGACAACCACTACAATTGGGATCT。
其中，所述肿瘤抗原的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.2：OTC+OVA全长序列：
ATGCTGTTTAATCTGAGGATCCTGTTAAACAATGCAGCTTTTAGAAATGGTCACAACTTCATGGTTCGAAATTTTCGGTGTGGACAACCACTACAATTGGGATCTAGCACCAGGACACAGATAAATAAGGTTGTTCGCTTTGATAAACTTCCAGGATTCGGAGACAGTATTGAAGCTCAGTGTGGCACATCTGTAAACGTTCACTCTTCACTTAGAGACATCCTCAACCAAATCACCAAACCAAATGATGTTTATTCGTTCAGCCTTGCCAGTAGACTTTATGCTGAAGAGAGATACCCAATCCTGCCAGAATACTTGCAGTGTGTGAAGGAACTGTATAGAGGAGGCTTGGAACCTATCAACTTTCAAACAGCTGCAGATCAAGCCAGAGAGCTCATCAATTCCTGGGTAGAAAGTCAGACAAATGGAATTATCAGAAATGTCCTTCAGCCAAGCTCCGTGGATTCTCAAACTGCAATGGTTCTGGTTAATGCCATTGTCTTCAAAGGACTGTGGGAGAAAGCATTTAAGGATGAAGACACACAAGCAATGCCTTTCAGAGTGACTGAGCAAGAAAGCAAACCTGTGCAGATGATGTACCAGATTGGTTTATTTAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAGAAAATGAAGATCCTGGAGCTTCCATTTGCCAGTGGGACAATGAGCATGTTGGTGCTGTTGCCTGATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAAGAGAGGAAGATCAAAGTGTACTTACCTCGCATGAAGATGGAGGAAAAATACAACCTCACATCTGTCTTAATGGCTATGGGCATTACTGACGTGTTTAGCTCTTCAGCCAATCTGTCTGGCATCTCCTCAGCAGAGAGCCTGAAGATATCTCAAGCTGTCCATGCAGCACATGCAGAAATCAATGAAGCAGGCAGAGAGGTGGTAGGGTCAGCAGAGGCTGGAGTGGATGCTGCAAGCGTCTCTGAAGAATTTAGGGCTGACCATCCATTCCTCTTCTGTATCAAGCACATCGCAACCAACGCCGTTCTCTTCTTTGGCAGATGTGTTTCCCCTTAA
SEQ ID NO.3：OTC+TRP2(1-472)
ATGCTGTTTAATCTGAGGATCCTGTTAAACAATGCAGCTTTTAGAAATGGTCACAACTTCATGGTTCGAAATTTTCGGTGTGGACAACCACTACAATTGGGATCTGGCCTTGTGGGATGGGGGCTTCTGCTGGGTTGTCTGGGCTGCGGAATTCTGCTCAGAGCTCGGGCTCAGTTTCCCCGAGTCTGCATGACCTTGGATGGCGTGCTGAACAAGGAATGCTGCCCGCCTCTGGGTCCCGAGGCAACCAACATCTGTGGATTTCTAGAGGGCAGGGGGCAGTGCGCAGAGGTGCAAACAGACACCAGACCCTGGAGTGGCCCTTATATCCTTCGAAACCAGGATGACCGTGAGCAATGGCCGAGAAAATTCTTCAACCGGACATGCAAATGCACAGGAAACTTTGCTGGTTATAATTGTGGAGGCTGCAAGTTCGGCTGGACCGGCCCCGACTGTAATCGGAAGAAGCCGGCCATCCTAAGACGGAATATCCATTCCCTGACTGCCCAGGAGAGGGAGCAGTTCTTGGGCGCCTTAGACCTGGCCAAGAAGAGTATCCATCCAGACTACGTGATCACCACGCAACACTGGCTGGGGCTGCTCGGACCCAACGGGACCCAGCCCCAGATCGCCAACTGCAGCGTGTATGACTTTTTTGTGTGGCTCCATTATTATTCTGTTCGAGACACATTATTAGGTCCAGGACGCCCCTATAAGGCCATTGATTTCTCTCACCAAGGGCCTGCCTTTGTCACGTGGCACAGGTACCATCTGTTGTGGCTGGAAAGAGAACTCCAGAGACTCACTGGCAATGAGTCCTTTGCGTTGCCCTACTGGAACTTTGCAACCGGGAAGAACGAGTGTGACGTGTGCACAGACGAGCTGCTTGGAGCAGCAAGACAAGATGACCCAACGCTGATTAGTCGGAACTCGAGATTCTCTACCTGGGAGATTGTGTGCGACAGCTTGGATGACTACAACCGCCGGGTCACACTGTGTAATGGAACCTATGAAGGTTTGCTGAGAAGAAACAAAGTAGGCAGAAATAATGAGAAACTGCCAACCTTAAAAAATGTGCAAGATTGCCTGTCTCTCCAGAAGTTTGACAGCCCTCCCTTCTTCCAGAACTCTACCTTCAGCTTCAGGAATGCACTGGAAGGGTTTGATAAAGCAGACGGAACACTGGACTCTCAAGTCATGAACCTTCATAACTTGGCTCACTCCTTCCTGAATGGGACCAATGCCTTGCCACACTCAGCAGCCAACGACCCTGTGTTTGTGGTCCTCCACTCTTTTACAGACGCCATCTTTGATGAGTGGCTGAAGAGAAACAACCCTTCCACAGATGCCTGGCCTCAGGAACTGGCACCCATTGGTCACAACCGAATGTATAACATGGTCCCCTTCTTCCCACCGGTGACTAATGAGGAGCTCTTCCTAACCGCAGAGCAACTTGGCTACAATTACGCCGTTGATCTGTCAGAGGAAGAAGCTCCAGTTTGGTCCACAACTCTCTCATAG。
申请人还发现OVA-MITO与TRP2-MITO都能有效募集并激活树突状细胞(DC)，进而诱导针对肿瘤的细胞免疫。通过更加深入的研究，进一步发现线粒体疫苗激活DC细胞的潜在机制与TLR2信号通路，以及线粒体内膜中的心磷脂有关。本发明证明，转基因线粒体作为一种富含免疫刺激物的抗原载体，能够高效地将肿瘤抗原递呈至局部范围内的DC细胞，并通过TLR2信号通路引发针对肿瘤的细胞免疫。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一、实验试剂及相关动物
1、细胞培养
B16-F10(ATCC CRL-6475)和B16-OVA细胞(OVA转染的B16-F10细胞)在补充有10％胎牛血清(Gibco)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100mg/ml)的DMEM(FBS，Gibco)中培养。
E.G7-OVA细胞(ATCC CRL-2113)(OVA转染的EL4小鼠T淋巴瘤细胞)在补充有10％的FBS(Gibco)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)和G418(0.4mg/ml)(Invivogen,ant-gn-1)的RPMI 1640(Gibco)中培养。
人胚肾293T(HEK293T)(ATCC CRL-11268)细胞在DMEM(Gibco)完全培养基中培养。
小鼠原代脾脏淋巴细胞在补充有10％FBS(Gibco)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)和1mM丙酮酸钠(Gibco)，55μM2-巯基乙醇(Gibco)，2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640(Gibco)中培养。
所有这些细胞系都在37℃和5％的CO2湿度中培养。Mycoalert支原体检测试剂盒(Lonza)用于支原体污染的常规监测。
2、小鼠
所有小鼠置于生物疗法国家重点实验室(四川大学)的无特定病原体条件下(温度:21-25℃；湿度:30-70％；暗/光循环:12h/12h)。当肿瘤体积达到1600mm3时，或当小鼠状况不佳且预计很快死亡时，处死小鼠。所有动物实验均已获得四川大学动物保护与使用专业委员会(成都，四川，中国)的批准。采用C57BL/6(北京Vital River实验动物科技有限公司)、TLR2-/-、TLR4-/-、TLR9-/-、STING-/-、ASC-/-、NLRP3-/-和OT-1小鼠(Jackson实验室)(雌性，6-8周龄，体重约20g)。
3、统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism软件v8.02进行(ns，无显著性；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；和****P<0.0001)。数据以平均值±标准误差(SEM)表示。数据分析采用非配对t检验或单因素方差分析。Log rank(Mantel-Cox)检验用于评价生存分析的统计学差异。
二、实验方法
实施例1、OVA-MITO和TRP2-MITO表达细胞系的构建
我们合成了一个cDNA片段，包含编码小鼠OTC的前32个氨基酸序列和编码OVA的全长序列(或TRP2氨基酸1-472或mCherry)。将cDNA片段插入到pCDH-CMV Lentivector(Addgene)质粒中，构建pCDH-OVA或pCDH-mCherry。然后，我们用同样的方法设计了一个pLV105-TRP2。将构建的质粒与包装载体psPAX2和VSV-G编码质粒pMD2.G(Addgene)一起瞬时转染到HEK293T细胞。为了获得稳定表达OTC-OVA(OTC-TRP2和OTC-mCherry)的B16-F10细胞系，将慢病毒颗粒转染到B16-F10细胞中，并用盐酸嘌呤霉素(2ng/ml)筛选克隆。
实施例2、线粒体裂解产物制备
收集细胞并在PBS中重悬，用PBS洗涤两次。根据制造商的说明，使用线粒体分离试剂盒(Sigma-Aldrich，D6950-02)分离线粒体。简而言之，将细胞重悬于线粒体分离缓冲液中，并用Dounce匀浆器匀浆。通过600×g离心10分钟，除去细胞核和细胞碎片，收集含有线粒体的上清液。然后，通过3500×g离心10分钟，浓缩线粒体。用PBS洗涤一次后，11000×g离心10分钟以浓缩线粒体。使用Percoll密度梯度离心法分离纯化的线粒体。接着，将纯化的线粒体重悬于无内毒素的PBS(Solarbio)中。使用BCA蛋白检测试剂盒(ThermoScientific)来确定线粒体的浓度。本研究中的所有实验都是用新鲜分离的线粒体进行的。
实施例3、RNA分离和实时定量PCR
细胞总RNA分离试剂盒(FOREGENE，No.RE-03113)根据制造商的说明，用于提取RNA。使用iScript逆转录酶(Bio-Rad)合成下游应用的cDNA。然后将cDNA与基因特异性引物SYBR Master Mix PCR Power SYBR Green(Bio-Rad,1725124)结合。实时定量PCR(RT-qPCR)采用CFX Connect实时PCR系统(Bio-Rad)进行。PCR产物在1.5％琼脂糖上进行电泳，并使用溴化乙锭荧光进行可视化。
实施例4、蛋白印迹
蛋白印迹分析按照标准方案进行。去除上清液后，在有蛋白酶抑制剂cocktail(Med Chem Express，HY-K0010)和磷酸酶抑制剂cocktail II(Med Chem Express，HY-K0022)的情况下，用RIPA缓冲液(Beyotime Biotechnology，P0045)裂解细胞，煮沸10分钟。然后，蛋白质被加载(10微升/道)，通过12.5％的SDS-PAGE解析，并电印迹到PVDF膜(Millipore)上。在室温下用5％(重量/体积)的脱脂牛奶在Tris-缓冲盐水-0.1％吐温-20(TBST)中阻断1小时后，PVDF膜与一抗在4℃下孵育过夜。然后，用TBST清洗PVDF膜三次，随后与TBST-BSA中的二抗在RT下孵育1小时。化学发光底物(Thermo Fisher Scientific)被用来检测PVDF膜上的HRP。
实施例5、免疫荧光染色
细胞在放置有玻璃盖板的24孔板中培养过夜(5×103个细胞/孔)。接下来，吸出培养液的上清液，用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，然后用0.4％Triton X-100进行透化。用5％的胎牛血清阻断细胞，用PBS洗三次。然后，将细胞与指定的一抗包括HSP60(Abcam，ab46798)、OVA(Abcam，ab181688)、TRP2(Biorbyt，orb227952)、CD11c(Biolegend，)和LMP2(杭州华安生物技术有限公司，ET7107-24)，以及Alexa Flour二抗包括山羊抗小鼠AlexaFluor 488(Invitrogen,A28175)和山羊抗兔Alexa Fluor 488(Invitrogen,A27034)孵育。最后，使用蔡司LSM 710共聚焦显微镜分析细胞的荧光信号。
实施例6、体内Mito疫苗治疗
为了评估Mito疫苗的预防效果，6周大的C57BL/6或TLR2-/-小鼠在第0、14和28天皮下注射100μlPBS，其中含有5μg可溶性OVA(Sigma-Aldrich,vac-pova-100)、50μg Mito加5μg可溶性OVA、50μg Mito或50μgOVA-MITO。最后一次免疫后一周，小鼠被皮下接种1×106E.G7-OVA或2×105B16-OVA肿瘤细胞。对于B16-F10模型，在第0、14和28天给C57BL/6小鼠注射100μl含有5μg可溶性TRP2、50μg Mito或50μg TRP2-MITO的PBS。最后一次注射后一周，小鼠被接种或2×105个B16-F10肿瘤细胞。
为了评估Mito疫苗的治疗效果，在第0天用1×106个E.G7-OVA或2×105个B16-OVA肿瘤细胞皮下注射小鼠，然后在第3、10和17天用5μg可溶性OVA、50μg Mito加5μg可溶性OVA或50μgOVA-MITO接种三次。对于B16-F10模型，在第0天给小鼠皮下接种2×105个B16-F10肿瘤细胞，然后在第3、10和17天三次接种100μl PBS、50μg Mito或50μgTRP2-MITO。接种肿瘤细胞一周后，每两天用电子卡尺测量一次肿瘤体积，并根据公式(长×宽2×0.52)垂直计算。
为了进一步研究Mito疫苗与PD-1抗体联合使用的治疗效果，在第0天给6周大的C57BL/6小鼠皮下接种2×105个B16-F10肿瘤细胞。然后，在第3天、第10天和第17天给小鼠皮下注射50μg TRP2-MITO疫苗。肿瘤接种3天后，小鼠腹腔注射10mg/kg的抗PD-1抗体或同种型匹配的对照抗体，每5天一次。肿瘤接种后一周，每两天测量一次肿瘤体积。
实施例7、肿瘤微环境
为了分析浸润在肿瘤微环境中的免疫细胞，在用B16-OVA培养后的第14天处死C57BL/6小鼠，分离出肿瘤组织，用IV型胶原酶(Gibco,USA)在37℃下消化30分钟。细胞用PBS洗涤三次，用以下抗体在4℃下孵育30分钟：PerCP-Cyanine5.5偶联的抗小鼠CD3(Biolegend，103132)，BV-421偶联的抗小鼠Gr1(Biolegend，117343)，FITC偶联的抗小鼠CD4(Biolegend，107641)，PE偶联的抗小鼠CD107a(Biolegend)，PE偶联的抗小鼠F4/80(Biolegend)，APC偶联的抗小鼠CD8a(Biolegend，121414)，APC偶联的抗小鼠CD206(Biolegend，121414)，FITC偶联的抗小鼠CD45(Biolegend，101206)，PE-Cy7偶联的抗小鼠CD11c(Biolegend，103222)，和FITC偶联的抗小鼠CD11b(Biolegend，120120)。使用NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)采集样品，并使用NovoExpress软件收集和分析数据。
实施例8、体内记忆T细胞反应
经免疫的C57BL/6小鼠(6-8周)在最后一次注射后第7天被处死。收集脾脏淋巴细胞，用APC-Cy7偶联的抗小鼠抗-Live/Died(Invitrogen,2277713)染色，然后用以下抗体孵育：FITC偶联的抗小鼠CD62L(Biolegend，101206)，PerCP-Cyanine5.5偶联的抗小鼠CD69(Biolegend，101206)，APC偶联的抗小鼠CD8(Biolegend，101206)，BV421偶联的抗小鼠CD4(Biolegend，101206)，和BV510偶联的抗小鼠CD44(Biolegend，101206)。样品由NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)和NovoExpress软件进行采集和分析。
实施例9、体内DC动员和活化分析
为了分析体内DC的动员和活化情况，12只C57BL/6小鼠(每组n＝4)皮下皮内注射PBS、Mito(50μg)或OVA-MITO(50μg)。18小时后，处死小鼠，从皮肤和右侧引流淋巴结(腘窝淋巴结和腹股沟淋巴结)制备单细胞悬液。然后将细胞在4℃下与下列表面标志物的荧光偶联抗体孵育30分钟：PerCP-Cyanine5.5偶联的抗小鼠CD45(Biolegend，103132)，BV421偶联的抗小鼠CD11c(Biolegend，117343)，BV650偶联的抗小鼠MHCII(Biolegend，107641)，PE偶联的抗小鼠CD8a(Biolegend)，APC偶联的抗小鼠CD103(Biolegend，121414)，FITC偶联的抗小鼠CD11b(Biolegend，101206)，PE-Cy7偶联的抗小鼠B220(Biolegend，103222)，和BV421偶联的抗小鼠CD197(Biolegend，120120)。使用NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)收集样品。
实施例10、DC体外成熟
从野生型或TLR2-/-小鼠TLR4-/-、TLR9-/-、STING-/-、ASC-/-、NLRP3-/-小鼠中制备骨髓衍生DCs(BMDCs)，并在补充有10％FBS(Gibco)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)和IL-4(10ng/ml)(PeproTech，AF-214-14)和GM-CSF(20ng/ml)(PeproTech，AF-315-03)的RPMI 1640(Gibco)中培养。用OVA-MITO或线粒体裂解液培养24小时后，检测BMDCs的活化和成熟情况。简单地说，收集培养上清液，用ELISA试剂盒(Invitrogen，88-7064-88，88-7324-88，88-7121-88)测量DC条件培养基中IL-6、TNF-α和IL-12p70的水平。收集细胞并使用FITC偶联的抗小鼠CD40(Biolegend,553790)、PE偶联的抗小鼠CD86(Biolegend,105008)、APC偶联的抗小鼠CD11c(Biolegend)、BV421偶联的抗小鼠CD80(Biolegend)、PE-Cy7偶联的抗小鼠MHCII(Biolegend)的抗体染色。使用NovoCyte流式细胞仪(ACEABiosciences)收集样品。
实施例11、线粒体染色和DC摄取
为了标记线粒体，将MitoTracker Red CMXRos染料(Thermofisher，I34154)原液用补充有10％血清的培养基稀释到工作浓度为50nM。然后将B16-F10细胞在MitoTrackerRed CMXRos中37℃下孵育20分钟。然后，去除标记液，用培养液清洗细胞两次。接下来，如上所述，黑暗条件下在冰上进行线粒体分离程序。
将BMDCs与预标记的线粒体进行孵化。孵化3-6小时后，清洗DC，用4％多聚甲醛固定，然后用仓鼠一级抗CD11c抗体(Biolegend)染色30分钟。然后加入FITC偶联的兔抗仓鼠IgG二抗，在37℃下孵育1小时(Invitrogen)。根据制造商的指示，用DAPI(Beyotime)对细胞核进行标记。然后在LMS 710(Carl Zeiss)共聚焦显微镜下对DC进行安装和分析，或用NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)进行分析。
实施例12、TLR2抑制剂对BMDCs的抑制和激活作用
用特异性的TLR2抑制剂C29(100μM)(Med Chem Express，363600-92-4)预处理野生型小鼠的BMDCs 2小时，然后加入或不加入线粒体(10μg/ml)处理24小时，收集培养上清液以测量IL-6、TNF-α和IL-12p70的水平。将细胞与下列抗体进行孵化：FITC偶联的抗小鼠CD40(Biolegend，553790)，PE偶联的抗小鼠CD86(Biolegend，105008)，APC偶联的抗小鼠CD11c(Biolegend)，BV421偶联的抗小鼠CD80(Biolegend)，PE-Cy7偶联的抗小鼠MHCII(Biolegend)。
实施例13、基于DC的体内免疫治疗
为了评估线粒体脉冲DC免疫疗法在体内的治疗效果，将表达OVA-MITO的B16-F10细胞或表达Vehicle-MITO的B16-F10细胞的线粒体(10μg/ml)与1×106个C57BL/6小鼠源性DCs在每10厘米细胞培养皿中共培养，然后用LPS(10μg/ml)刺激BMDCs过夜。接下来，6周大的C57BL/6小鼠被皮下接种1×106E.G7-OVA或2×105B16-OVA肿瘤细胞。三天后，将1×106的线粒体脉冲DCs经皮下注射，每周一次，持续3周。
对于B16-F10模型，将表达TRP2-MITO的B16-F10细胞或表达Vehicle-MITO的B16-F10细胞的线粒体(10μg/ml)与BMDCs共培养，然后用LPS进行刺激。C57BL/6小鼠被皮下接种2×105个B16-F10肿瘤细胞，并以相同的注射计划用线粒体脉冲DCs处理。肿瘤接种后一周，每两天用电子卡尺测量肿瘤体积，并按公式(长×宽2×0.52)垂直计算。
实施例14、体内T细胞反应
C57BL/6小鼠每周皮下注射100μl含有5μg可溶性OVA、50μgmito加5μg可溶性OVA(OVA/mito)或50μg OVA-MITO的PBS，持续3周。对于B16-F10模型，C57BL/6小鼠(6-8周)每周皮下注射100μl含有50μgMito或50μgTRP2-MITO的PBS，持续3周。最后一次注射后一周，所有的小鼠被处死，收获脾脏淋巴细胞并使用小鼠淋巴细胞分离培养基(Dakewe)纯化。然后用OVA257-264(SIINFEKL)肽(Invivogen，vac-sin)、OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)肽(10μg/ml)(Invivogen，vac-isq)或TRP2180-188(SVYDFFVWL)(上海托希森生物技术有限公司)重新刺激淋巴细胞72小时。在收获细胞前4小时，将Brefeldin A(Biolegend,420601)加入细胞培养物中。收集细胞并使用LIVE/DEADTM可固定紫罗兰死细胞染色试剂盒(Invitrogen)对活细胞进行染色。然后，用FITC抗小鼠CD8抗体(Biolegend，100218)、针对SIINFEKL表位的H-2Kb OVA四聚体(MBL，TS-5001-1C)和针对SVYDFFVWL表位的H-2Kb TRP2四聚体(Biolegend，CPM-1-0448)对细胞染色。随后，用固定/渗透溶液试剂盒(BD Bio-sciences，554714)对细胞进行固定和透化，并与PE偶联的抗小鼠IFN-γ(Biolegend，505808)或APC偶联的抗小鼠颗粒酶B(Biolegend，515406)抗体在4℃下培养过夜。使用NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)获取样品。此外，收集T细胞条件培养基，使用IFN gamma'Femto-HS'高灵敏度小鼠ELISA试剂盒(Invitrogen)测量IFN-γ的水平。
实施例15、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定
为了获得效应T细胞，分离免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，并在白细胞介素-2(20ng/ml)(Sigma-Aldrich)存在下用SIINFEKL肽(10μg/ml)刺激72小时。以B16-OVA细胞为靶细胞，接种于96孔板(5×103细胞/孔)，并以不同的效应T细胞与靶细胞(E:T)比与不同组的效应T细胞共培养。在37℃下培养6小时后，收集细胞培养上清液，根据制造商的说明，使用CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega，G1781，G1782)测量乳酸脱氢酶活性。
实施例16、体内过继转移和免疫
C57BL/6小鼠按照间隔7天的三剂免疫方案，经皮下注射5μg可溶性OVA、50μgmito加5μg可溶性OVA或50μg OVA-MITO。免疫小鼠在第一次接种后的第21天被处死，并收集脾脏淋巴细胞，在100μl PBS中共有1×107个淋巴细胞被静脉注射到C57BL/6小鼠体内。在接受淋巴细胞后，2×105个B16-OVA细胞注射给受体小鼠。肿瘤大小的测量和计算如前所述。
实施例17、OT-I型CD8+T淋巴细胞增殖试验
将来自野生型或TLR2-/-小鼠的BMDCs培养6天，然后用OVA(1μg/ml)或OVA-MITO(10μg/ml)刺激细胞18小时，然后收集细胞，用RPMI 1640重悬以进一步研究。
使用小鼠CD8+T细胞分离试剂盒(Stem Cell)，通过CD8磁珠阴性选择制备OT-1小鼠脾脏的CD8+T淋巴细胞。接着，将CD8+T淋巴细胞重悬于2.5μM的CFSE标记溶液中，然后在37℃下孵育15分钟。随后，加入含血清的培养基并孵化5分钟。用PBS洗三次后，将OT-1CD8+T淋巴细胞与OVA或OVA-MITO处理的BMDCs按5:1的比例共培养48或72小时，培养48小时后在白光显微镜下统计CD8+T淋巴细胞的数量。共培养72小时后，收获非贴壁细胞，用流式细胞仪分析T细胞的CFSE荧光值。
实施例18、脂质体的制备与表征
为了制备脂质体，采用溶剂注射法合成心磷脂。简而言之，心磷脂(Sigma-Aldrich，C0563-100MG)和胆固醇在65℃下溶于无水乙醇(质量比＝2：1)。通过1毫升的注射器将此混合溶液在65℃下滴加到搅拌的水相中。在65℃下，通过加热磁力搅拌器将该混合溶液的体积减少到其2/3，以去除无水乙醇。使用TEM(H-600，日立，日本)和DLS(MalvernZetasizer Nano ZS)来确定心磷脂脂质体的尺寸分布和形态。
实施例19、TPR2-MITO联合心磷脂的疗效
为了评估TPR2-MITO联合心磷脂的治疗效果，在第0天给C57BL/6小鼠皮下接种2×105个B16-F10肿瘤细胞。然后，在第3天、第10天和第17天给小鼠皮下注射50μg TRP2-MITO。此外，在肿瘤接种后三天，小鼠腹腔注射5mg/kg心磷脂，每三天一次。肿瘤体积在接种后第7天开始测量，计算方法如上所述。
实施例20、Crls1 siRNA转染和敲除
使用以下RNAi序列:siCrls1#1(rat,SEQ ID NO.4：5’-CGAACACTAGCTAAGTACT-3’)；siCrls1#2(rat,SEQ ID NO.5：5’-CAGCTCCAGTTTTCAATTA-3’)；siCrls1#3(rat,SEQ IDNO.6：5'-CCATGGACAATCCCAAATT-3’)；siCrls1#4(rat,SEQ ID NO.7：5’-AACCAACATTCATCAGCAAGGTAA-3’)；siCrls1#5(rat,SEQ ID NO.8：5’-AACATTCATCAGCAAGGTAAATACA-3’)。将TRP2稳定转染的细胞接种在六孔板上(2×103个细胞/孔)，用Lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen,Cat#L3000-015)转染心磷脂特异性siRNA寡核苷酸或阴性对照siRNA。第二天，用新鲜的完全培养基补充细胞，48小时后收集细胞以测量细胞中的心磷脂RNA和心磷脂含量。根据制造商的说明，用心磷脂测定试剂盒(Abcam，ab241036)分析心磷脂含量。
实施例21、Crls1 siRNAMito疫苗的体内治疗
按如上所述方法，用Lipofectamine 3000转染试剂处理对照组和Crls1 siRNA转染的细胞，并在转染48小时后收集。接下来，从siRNA转染的细胞中提取线粒体。此外，使用Crls1 siRNA线粒体疫苗(siCrls1)和对照组线粒体疫苗mito疫苗(siScramble)进行体内实验。简而言之，6周大的C57BL/6小鼠在第0天被接种2×105个B16-F10肿瘤细胞。然后，在第3、10和17天给小鼠注射100μl含有50μg siCrls1或50μgsiScramble的PBS。肿瘤细胞接种后一周，按上述方法测量并计算肿瘤体积。
实施例22、Mito疫苗在健康小鼠体内的安全性评价
为了评估不同Mito疫苗在体内的安全性，每天对接种后小鼠的外观和体重进行监测。采集接种小鼠的血清样本进行生化指标的分析。具体来说，血清生化参数的指标，包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)和酶类碱性磷酸酶(ALP)，都由COBAS(罗氏诊断)检测。
三、试验结果和分析
试验例1、线粒体稳定表达肿瘤抗原细胞系的构建
首先，利用鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)前导序列的质粒和慢病毒转染系统建立线粒体靶向抗原表达细胞系。为了将卵清蛋白(OVA)或酪氨酸相关蛋白2(TRP2)作为模型抗原，导入线粒体，我们构建了同时包含OTC前导序列和所选抗原序列长度的线粒体靶向模型抗原表达质粒OTC-OVA和OTC-TRP2(图1A)。随后，通过慢病毒载体转染和嘌呤霉素筛选获得稳定表达模型抗原(OVA或TRP2)的B16-F10细胞株。为了确定模型抗原(OVA或TRP2)是否通过OTC前导序列在细胞中的线粒体上稳定表达，我们首先通过RT-PCR检验了线粒体中OVA/TRP2的mRNA水平(图1B)。我们还通过WesternBlot检测了线粒体中OVA或TRP2的蛋白水平，所得的结果与mRNA转录水平一致(图1C)。
为了进一步证实外源蛋白在线粒体上的表达，我们构建了表达mCherry荧光蛋白的B16-F10稳定细胞株以精确观察外源蛋白在细胞内的定位。我们发现红色荧光(mCherry)可以与HSP60抗体染色的线粒体绿色荧光信号很好地重合。该结果表明该方法有效实了现外源蛋白在线粒体上的靶向表达(图1D)。
接着，为了研究模型抗原(OVA或TRP2)在线粒体中的靶向表达，我们进行了免疫荧光染色。在构建好的线粒体靶向表达OVA蛋白的稳定细胞系中，检测到OVA蛋白(绿色)和Mitotracker(红色)的共定位如图1E所示。对于TRP2，虽然正常状态下的B16-F10细胞在整个细胞中表达TRP2(图1F)，但是在经过转染后的B16细胞系中，TRP2和Mitotracker的共定位显著增加(图1F)。综上所述，这些数据表明我们已经成功构建了在线粒体中靶向表达OVA或TRP2的稳定细胞系。所构建的B16细胞中表达OVA的线粒体和表达TRP2的线粒体被提取制成肿瘤疫苗并用于后续实验。
图1为构建在线粒体上稳定表达肿瘤抗原的细胞系，(A)使线粒体靶向表达模型抗原的质粒示意图，包含鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)前导序列和抗原(OVA或TRP2)序列。
(B)琼脂糖凝胶电泳显示B16-F10细胞表达OVA或TRP2的情况。a.未处理的B16-F10细胞；b.转染空载质粒的B16-F10细胞；c.在线粒体上稳定表达肿瘤抗原(OVA或TRP2)的B16-F10细胞。
(C)对于线粒体上表达或不表达模型抗原(OVA或TRP2)的B16-F10细胞的免疫印迹分析。
(D)使用mCherry荧光蛋白质粒转染B16-F10细胞后，对细胞内mCherry荧光信号与HSP60荧光信号的共定位分析。右图为mCherry和HSP60对应的荧光强度。
(E)转染OTC-OVA质粒的B16-F10细胞中外源性OVA蛋白与染色体示踪剂共定位的免疫荧光分析。右侧为OVA和染色体示踪剂对应的荧光强度。
(F)在线粒体表达或不表达TRP2的B16-F10细胞中，外源性TRP2与染色体示踪剂共定位的免疫荧光分析。右侧显示TRP2和染色体示踪剂对应的荧光强度。图(D)-(F)中的比例尺为10μm。
试验例2、转基因线粒体疫苗可抑制小鼠肿瘤生长
我们从靶向表达抗原的细胞株中提取到了表达抗原的线粒体。同时，正常B16-F10细胞的线粒体也被提取作为对照。为了评估表达OVA的线粒体(命名为OVA-MITO)和表达TRP2的线粒体(命名为TRP2-MITO)作为肿瘤疫苗，对肿瘤的预防效力，我们以图2A所示的方案，使用OVA-MITO或TRP2-MITO对小鼠进行了免疫。在B16-OVA和E.G7-OVA小鼠皮下肿瘤模型中，与其他组相比，OVA-MITO作为预防性肿瘤疫苗显著抑制了肿瘤生长，延长了小鼠生存期(图2B,C)。单独使用线粒体或线粒体和OVA(MITO/OVA)的混合物进行免疫均未能延长小鼠生存期(图2B,C，右)。该结果表明OVA-MITO疫苗具有可观的免疫刺激作用。此外，在B16-F10肿瘤模型中，与其他组相比，TRP2-MITO作为肿瘤疫苗，显著延长了小鼠的生存期，展现出明显的肿瘤预防作用(图2D)。
同时，本研究还探索了OVA-MITO和TRP2-MITO的对于肿瘤的治疗效果，具体实验方案如图2E所示。在接种肿瘤后，后续三次肿瘤疫苗的注射在三种不同的肿瘤模型中都显示出明显的治疗效果，并且也显著延长了小鼠的生存期(图2F-H)。此外，已有证据表明，肿瘤疫苗可以与免疫检查点阻断治疗(如抗PD-1抗体)联合使用，从而达到更好的疗效。在本研究中，我们检验了TRP2-MITO疫苗联合抗PD-1治疗对小鼠B16-F10肿瘤模型的治疗效果(图2I)。结果表明，TRP2-MITO和抗PD-1抗体的联合治疗完全抑制了肿瘤生长，并显著延长了治疗组所有小鼠的生存期(图2J)。综上所述，作为癌症治疗的预防性和治疗性疫苗，OVA-MITO和TRP2-MITO展现出了可观的抗肿瘤功效。
图2转基因线粒体疫苗抑制小鼠肿瘤生长，其中，
(A)用于小鼠免疫治疗的预防性肿瘤疫苗(OVA-MITO或TRP2-MITO)的示意图。
(B-C)B16-OVA(B)和E.G7-OVA(C)荷瘤小鼠在第0、14和28天接种了OVA-MITO作为预防性疫苗(5μg可溶性OVA,50μg MITO,50μg MITO+5μg可溶性OVA，或50μgOVA-MITO)。肿瘤体积和小鼠存活率在图中标注的时间点测量。(B中n＝12,C中n＝8)
(D)B16-F10荷瘤小鼠接种了TRP2-MITO作为预防性疫苗(在第0,14和28天注射5μg可溶性TRP2,50μgMITO或50μgTRP2-MITO)。肿瘤体积和小鼠存活率在图中标注的时间点测量。(n＝10)
(E)用于小鼠免疫治疗的治疗性肿瘤疫苗(OVA-MITO或TRP2-MITO)的示意图
(F-G)B16-OVA(F)和E.G7-OVA(G)荷瘤小鼠接种了OVA-MITO作为治疗性疫苗(在第3、10和17天，注射5μg可溶性OVA,50μgMITO+5μg可溶性OVA或50μgOVA-MITO)。肿瘤体积和小鼠存活率在图中标注的时间点测量。(F中n＝8,中n＝7)
(H)B16-F10荷瘤小鼠在第3、10和17天接种50μgMITO或50μgTRP2-MITO。瘤体积和小鼠存活率在图中标注的时间点测量。(n＝12)
(I)TRP2-MITO疫苗联合抗PD-1治疗小鼠B16-F10肿瘤模型的示意图。
(J)B16-F10荷瘤小鼠在第3、10和17天接种50μg的TRP2-MITO，且每5天注射一次10mg/kg的PD-1抗体或同型抗体作为对照。瘤体积和小鼠存活率在图中标注的时间点测量。(n＝8)
数据以平均值±SEM表示。肿瘤体积分析采用单因素方差分析，生存分析采用对数秩(logrank)检验(Mantel-Cox检验)；*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.0001。
试验例3、线粒体疫苗增强了CD8+T细胞之间的交叉激活作用
下一步，本研究通过检测线粒体对抗原提呈细胞(APCs)的刺激作用，探讨了线粒体作为疫苗佐剂的作用机制。树突状细胞(DC)是主要的抗原提呈细胞，负责抗原摄取与提呈，并在激发适应性抗肿瘤免疫中发挥关键作用。
为了探讨线粒体疫苗能否募集树突细胞(DC)，我们将OVA-MITO或对照线粒体(从正常B16-F10细胞提取的线粒体)注射到小鼠皮下。通过流式细胞术对注射部位的组织进行分析，发现OVA-MITO招募DC细胞的能力较之于对照组更强(图3A)。此外，使用OVA-MITO免疫显著增加了MHCII+DC细胞(图3B)，以及CD11b+D103+DC细胞(图3C)在引流淋巴结中所占的比例。由于DC细胞能够摄取抗原，转运到淋巴结，并通过MHCI类或MHCII类分子呈递抗原，而CD197是反映DC细胞趋化特性和淋巴结归巢能力的代表性标志物，所以我们还监测了经OVA-MITO免疫后的小鼠的引流淋巴结中DC细胞的CD197表达水平的上调情况(图3D)。为了进一步证实DC细胞是否能够有效摄取表达肿瘤抗原的线粒体，我们将mCherry-MITO与骨髓来源的树突状细胞(BMDC)共同培养后，通过anti-CD11c抗体对DC细胞进行免疫荧光染色，我们成功观察到了BMDCs对mCherry-MITO的摄取(图3E)。此外，我们还发现，BMDC吞噬mCherry-MITO呈现出剂量和时间依赖性(图3F)。另外，在被BMDC摄取后，mCherry-MITO呈现出与LMP2染色的DC蛋白酶体的共定位(图3G)，这表明MHCI类分子在此递呈中起到了重要的参与作用。树突状细胞的成熟对引发有效的T细胞反应至关重要。我们发现，与对照组相比，使用OVA-MITO在体外对BMDC进行刺激后，BMDC的共刺激标志物CD80,CD86,CD40以及MHCII的表达水平均显著上调(图3H)。此外，体内实验也检测到了OVA-MITO的刺激导致BMDC的共刺激标记物和MHCII表达水平的上调。使用OVA-MITO免疫后，通过流式细胞术检测引流淋巴结中的细胞，发现DC成熟度明显提高(图3I)。
图3转基因线粒体疫苗增强了CD8+T细胞之间的交叉激活作用
(A)流式细胞术分析小鼠经指定的处理方法(50μgMITO、50μgOVA-MITO或PBS处理18h)后，CD11c+MHCII+DC细胞在注射部位的聚集情况(n＝4)。
(B-C)流式细胞术分析小鼠经指定的处理方法(50μgMITO，50μgOVA-MITO，或PBS处理18h)后迁移至小鼠引流淋巴结的CD11c+MHCII+DC细胞数量(B)以及CD11b+CD103+DC细胞数量(n＝4)。
(D)流式细胞术分析小鼠经指定的处理方法(50μgMITO，50μgOVA-MITO，或PBS处理18h)后，引流淋巴结中MHCII+DC的CCR7(CD195)表达水平(n＝4)。
(E)对经过mCherry-MITO(1μg/mL)处理6h后的CD11c+BMDC进行免疫荧光分析。
(F)流式细胞术分析经指定的处理方法(PBS、10μg/m、50μg/mL或100μg/mL由MitoTrackerTM Redcmxros染色过的线粒体刺激3h或6h)处理过的CD11c+BMDC细胞。
(G)免疫荧光分析经过mCherry-MITO(10μg/mL)处理3h后的BMDCs中外源性mCherry-MITO与LMP2的共定位情况。LMP2与mCherry对应的荧光强度显示在右侧图中。
(H)流式细胞术分析经MITO或OVA-MITO(10μg/ml)在体外刺激24h后的BMDCs中CD86、CD80、CD40和MHCⅡ的表达水平。
(I)流式细胞术分析小鼠在经过指定处理方法(后足垫注射50μgMITO或50μgOVA-MITO)的18h后小鼠引流淋巴结中DC细胞CD86、CD80、CD40和MHCⅡ的表达水平(n＝3)。
(J-K)B16-OVA(J)和E.G7-OVA(K)荷瘤小鼠接受了指定的治疗(在第3天，第10天和第17天，接种1x106个用PBS,OVA,OVA/MITO或OVA-MITO刺激过夜后的DC细胞)。肿瘤体积和小鼠存活率在图中标注的时间点测量。(n＝7)
图(D)-(F)中的比例尺为10μm。数据以平均值±SEM表示。(A)～(D)采用单因素方差分析，(F)、(H)、(I)采用t检验分析，生存分析采用对数秩(logrank)检验(Mantel-Cox检验)；*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.0001。
基于OVA-MITO对DC成熟的激活作用，我们进一步制备了OVA-MITO负载的DC疫苗，以验证转基因线粒体疫苗能否与DC肿瘤疫苗联合应用。在本实验中，使用B16-OVA与E.G7-OVA皮下肿瘤模来研究OVA-MITO负载的DC疫苗的治疗效果。结果表明，与治疗组相比，OVA-MITO负载的DC疫苗对肿瘤生长具有显著的抑制作用，并延长了小鼠生存期(图3J,K)。值得注意的是，OVA/线粒体混合物负载的DC疫苗对E.G7-OVA起到了少许抑制作用，但与对照组相比未能延长小鼠的生存期。此外，TRP2-MITO负载的DC疫苗对B16-F10肿瘤模型也具有较强的抗肿瘤能力(图7)。综上，这些结果表明，转基因线粒体疫苗可以有效地招募DC到注射部位，诱导DC成熟并迁移到引流淋巴结。同时，OVA-MITO或TRP2-MITO也可作为一种基于细胞的肿瘤疫苗从而发挥肿瘤治疗的效果。
图7为TRP2-MITO能够被用于制备DC疫苗并能发挥有效的抗肿瘤作用；其中，(A)B16-F10荷瘤小鼠接受了指定的治疗(在第3、10、17天，接种1×106个分别负载PBS,TRP2,TRP2/MITO或TRP2-MITO的DC细胞。肿瘤体积和小鼠存活率在图中标注的时间点测量。(n＝12)。数据以平均值±SEM表示。肿瘤体积分析采单因素方差分析，生存分析采用对数秩(logrank)检验(Mantel-Cox检验)；***表示P<0.001,****表示P<0.0001。
试验例4、线粒体疫苗可激活肿瘤微环境中的T细胞免疫
为了进一步评估OVA-MITO如何激发适应性抗肿瘤免疫应答，我们对肿瘤微环境，尤其是T细胞群进行了表征。抗肿瘤疫苗的效果取决于以细胞毒性T细胞为代表的，T细胞介导的免疫反应的激活水平。为了确定线粒体疫苗对细胞免疫的激活效果，我们用OVA-MITO免疫小鼠3次，然后接种B16-OVA肿瘤细胞，并在接种后的第14天处死小鼠，然后用流式细胞术分析肿瘤内免疫细胞群，尤其是细胞毒性T细胞。我们观察到OVA-MITO疫苗的接种显著增加了肿瘤浸润的CD8+T细胞(图4A)。同时，肿瘤浸润CD8+T细胞的百分比较之于CD107a+T细胞和CD8+CD11c+T细胞在OVA-MITO的免疫后均显著升高(图4B、C)，以上提到的这些标志物与CD8+T细胞的杀瘤特性密切相关。M2巨噬细胞和抑制性髓源性抑制细胞(MDSCs)浸润的减少也促进了局部免疫微环境的激活(图4D,E)。此外，我们还发现在接受治疗的小鼠中，CD4+效应记忆T细胞在脾脏中的比例相比对照组明显增加，而CD8+中央T细胞和CD8+效应记忆T细胞的百分比略有增加(图4F、G)。
为了进一步探索OVA-MITO/TRP2-MITO疫苗能否诱导特异性的细胞介导的抗肿瘤适应性免疫，我们首先分离了OVA-MITO免疫后小鼠的脾脏淋巴细胞，随后用结合MHC-I的OVA257-264肽段(SIINFEKL)刺激脾脏淋巴细胞。结果显示，经过OVA-MITO免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞受到刺激后，对OVA有特异性的CD8+T细胞的百分比明显增加。同时，经过OVA/MITO混合物免疫后小鼠的脾脏淋巴细胞受到刺激后，对OVA有特异性的CD8+T细胞的百分比也有少许增加(图4H)。颗粒酶B对CD8+T细胞的靶细胞杀伤能力十分重要(33)，结果显示，经过OVA-MITO免疫后，分泌颗粒酶B的CD8+T细胞也有所增加(图4)。此外，免疫之后，小鼠脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ的CD8+T细胞数量，以及细胞培养上清中IFN-γ的分泌量，在受到SIINFEKL刺激后均显著增加。另外，细胞毒性分析表明，与其他组相比，经过OVA-MITO免疫小鼠的脾脏T细胞在受到刺激后，对B16-OVA靶细胞的细胞毒性显著提升(图4L)。为了进一步证实其抗肿瘤免疫效果，我们在C57BL/6小鼠中进行了T细胞过继转移实验。首先，C57BL/6小鼠在接受3次OVA-MITO注射后，脾脏淋巴细胞被分离并转移到另一组荷瘤的C57BL/6小鼠体内，以评估T细胞介导的抗肿瘤免疫效果。结果表明，与其他组细胞相比，OVA-MITO免疫小鼠的淋巴细胞显著抑制了肿瘤生长(图4M)。另外，使用TRP2-MITO对小鼠进行免疫后，也得到了类似的结果，包括对TRP2特异性CD8+T细胞的产生、颗粒酶B分泌和IFN-γ产生(图8A-C)。
另外，可以观察到CD4+辅助性T细胞可能促进了细胞毒性T细胞(CTL)的产生，因为OVA-MITO的注射可以显著增加分泌IFN-γ的CD4+Th1细胞占比(图4N左)，以及CD4+分泌IFN-γ的水平(图4N右)。然而，与OVA-MITO疫苗相比，OVA/MITO混合物的注射可诱导分离的淋巴细胞在体外产生更多的IL-4(图8D)，这表明转基因线粒体疫苗的全身抗肿瘤效应可能在很大程度上依赖于通过Th1细胞介导的免疫应答。
图4为OVA-MITO疫苗可激活肿瘤微环境中的T细胞免疫
(A-C)流式细胞术分析在第0、14和28天分别用5μg可溶性OVA、50μgMITO+5μg可溶性OVA或50μg OVA-MITO免疫后小鼠肿瘤浸润的CD3+CD8+T细胞(A),CD3+CD8+CD107a+T细胞(B)和CD3+CD8+CD11c+T细胞(C)。(n＝5)
(D-E)流式细胞术分析在第0、14和28天分别用5μg可溶性OVA、50μgMITO+5μg可溶性OVA或50μgOVA-MITO免疫后小鼠肿瘤浸润的CD11b+F4/80+CD206+M2型巨噬细胞(D)和CD11b+Gr1+髓系抑制性细胞(E)。(n＝5)
(F)流式细胞术分析在第0、14和28天分别用5μg可溶性OVA、50μgMITO+5μg可溶性OVA或50μg OVA-MITO免疫后小鼠脾脏中CD4+TCM,CD4+TEM(TCM,中央记忆T细胞；TEM,效应记忆T细胞；n＝3)
(G)流式细胞术分析在第0、14和28天分别用5μg可溶性OVA、50μgMITO+5μg可溶性OVA或50μgOVA-MITO免疫后小鼠脾脏中CD8+TCM,CD8+TEM(TCM,中央记忆T细胞；TEM,效应记忆T细胞；n＝3)
(H-J)用结合MHC-I的OVA257-264肽段(SIINFEKL)刺激在第0、14和28天分别用5μg可溶性OVA、50μgMITO+5μg可溶性OVA或50μgOVA-MITO免疫的小鼠脾脏淋巴细胞72h后，用流式细胞术分析其中CD8+T细胞表达OVA四聚体(H)，颗粒酶(I)，干扰素-γ(J)的水平。(n＝3)
(K)ELISA检测在收到(H—J)所述相同方法处理的后的CD4+T细胞上清液中干扰素-γ的分泌水平。(n＝4)
(L)将在第0、14和28天分别用5μg可溶性OVA、50μgMITO+5μg可溶性OVA或50μgOVA-MITO免疫后小鼠脾脏淋巴细胞与B16-OVA细胞以不同比例(25:1、50:1)培养6h后，检测肿瘤细胞的溶胞水平。
(M)将1×107受到指定处理方法(在第0、14和28天分别用5μg可溶性OVA、50μgMITO+5μg可溶性OVA或50μgOVA-MITO免疫)的小鼠脾淋巴细胞，在另一批小鼠接种B16-OVA细胞前1天通过尾静脉注射到小鼠体内。肿瘤体积在图中标注的时间点测量。(n＝7)
(N)用结合MHC-I的OVA257-264肽段(SIINFEKL)刺激在第0、14和28天分别用5μg可溶性OVA、50μgMITO+5μg可溶性OVA或50μgOVA-MITO免疫后小鼠脾脏淋巴细胞72h后，用流式细胞术分析其中的IFN-γ+CD4+Th1细胞(左图)。并用ELISA法检测CD4+Th1细胞培养上清液中干扰素-γ的分泌水平(右图)。(n＝3)
数据以平均值±SEM表示。(A)～(N)采用单因素方差分析；*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.0001。
图8为TRP2-MITO疫苗在肿瘤微环境中诱导T细胞介导的免疫应答；其中，(A)使用TRP2180-188(SVYDFFVWL)刺激72h接受了指定的处理方法(在第0、14和28天注射50μg MITO或50μg TRP2-MITO)的小鼠的脾脏淋巴细胞后，使用流式细胞术分析TRP2四聚体+CD8+T细胞。(n＝3)
(B-C)脾脏淋巴细胞在受到(A)中相同处理后，使用流式细胞术分析颗粒酶+CD8+T细胞(B)以及干扰素-γ+CD8+T细胞。(n＝5)
(D)从接受指定处理方法(在第0、14和28天注射5μg可溶性OVA,50μgMITO+5μg可溶性OVA或50μgOVA-MITO)的小鼠中分离脾脏淋巴细胞，随后用OVA323-339在体外刺激72h，最用ELISA分析CD4+Th2细胞培养上清液中白介素-4的分泌水平。(n＝3)
数据以平均值±SEM表示。(A)～(D)采用单因素方差分析；*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.0001。
试验例5、线粒体疫苗通过调节TLR2介导的信号通路促进树突状细胞的成熟
线粒体是损伤相关分子模式(DAMPs)的重要来源，而DAMPs是模式识别受体(PRRs)，如toll样受体(TLRs)的激动剂为了进一步研究转基因线粒体疫苗如何激活适应性免疫反应，我们使用了一系列基因敲除小鼠来研究潜在的机制。我们将来自不同基因敲除小鼠的DC与线粒体孵育24小时后使用ELISA试剂盒分析树突状细胞上清液中IL-6、TNF-α和IL12p70的含量(图5A-C)。结果表明，TLR2敲除的DC分泌的IL-6,TNF-α和IL12p70都显著减少。为了进一步阐明TLR2在DC活化中的作用，我们分析了在有或没有线粒体刺激(10μg/ml)的条件下，野生型和TLR2敲除的DC细胞的共刺激分子和MHCII的表达情况。结果显示，野生型的DC细胞经线粒体刺激后，CD80、CD86、CD40和MHC-II的表达水平都有所升高，而TLR2敲除的DC细胞经线粒体刺激后，CD80、CD86、CD40和MHC-II的表达水平无明显提升。此外，与对照组相比，在使用TLR2特异性抑制剂C29预处理后，DC细胞成熟标志物的表达水平，以及在培养上清液中IL-6、TNF-α和IL-12的分泌水平都显著下调(图5F、G)。这些结果表明线粒体通过TLR2介导的信号通路刺激DC细胞分泌促炎细胞因子并上调共刺激分子的表达，进而获得有效地激活T细胞的能力。
为了研究TLR2在线粒体疫苗抗原提呈中的作用，我们将OVA或OVA-MITO与野生型或TLR2敲除的BMDC在体外共同培养。随后，再将这些BMDC与CFSE标记的，OT-I小鼠来源的CD8+T细胞共培养。结果表明，受到OVA-MITO刺激后的野生型BMDCs可显著促进OT-ICD8+T细胞的增殖并形成明显的细胞团。相反，受到OVA-MITO刺激的TLR2敲除DC细胞对于CD8+T细胞的增殖的促进作用明显减弱(图5h)。为了在体内更进一步证实TLR2在免疫激活中的作用，我们接下来研究了转基因线粒体疫苗能否刺激TLR2敲除小鼠的细胞免疫。结果表明，OVA-MITO疫苗能在野生型小鼠中有效诱导出OVA特异性的CD8+T细胞。然而，在TLR2敲除鼠中未检测到这种变化。另外，接种了OVA-MITO或OVA-TRP2疫苗的TLR2敲除小鼠的脾脏淋巴细胞在受到OVA-MITO或OVA-TRP2的刺激后，也并没有增加IFN-γ的表达和分泌水平(图9B,C)。
图9为线粒体疫苗不能在TLR2-/-小鼠中激发CD8+T细胞的交叉激活作用；其中，
(A)在第0天，第14天和第28天，野生型和TLR2-/-小鼠注射了指定的疫苗(5μg可溶性OVA或50μgOVA-mito)，随后，脾脏淋巴细胞被分离并被OVA257-264(10μg/mL)刺激72h。刺激完成后，使用流式细胞术分析OVA四聚体+CD8+T细胞。(n＝3)
(B)在第0天，第14天和第28天，野生型和TLR2-/-小鼠注射了指定的疫苗(5μg可溶性OVA或50μg OVA-MITO)，随后，脾脏淋巴细胞被分离并被OVA257-264或OVA323-339(10μg/mL)刺激72h。刺激完成后，使用流式细胞术分析IFN-γ+CD8+T细胞和IFN-γ+CD4+T细胞。(n＝3)
(C)在第0天，第14天和第28天，野生型和TLR2-/-小鼠注射了指定的疫苗(50μgMITO或50μgTRP2-MITO)，随后，脾脏淋巴细胞被分离并被TRP2180-188(10μg/mL)刺激72h。刺激完成后，使用流式细胞术分析IFN-γ+CD8+T细胞和IFN-γ+CD4+T细胞。(n＝3)
数据以平均值±SEM表示。(A)～(C)采用单因素方差分析；*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.0001。
为了研究TLR2在转基因线粒体疫苗所发挥的抗肿瘤效应中所起到的作用，我们在野生型和TLR2敲除鼠中比较了线粒体疫苗对于肿瘤的的预防和治疗效果。利用B16-F10肿瘤模型，我们发现TRP2-MITO在TLR2敲除鼠中没有发挥出预防肿瘤的作用(图5)。OVA-MITO疫苗也在对TLR2敲除鼠肿瘤的预防中收效甚微。这些结果表明TLR2的敲除降低了线粒体疫苗作为预防性肿瘤疫苗的肿瘤抑制作用(图5J)。此外，我们还发现TRP2-MITO作为治疗性疫苗的效力也在TLR2敲除小鼠中受到了显著的削弱(图5K)。这些结果体现了TLR2在转基因线粒体疫苗诱导DC活化和细胞免疫应答中不可或缺的作用。
图5线粒体疫苗通过调节TLR2介导的信号通路促进树突状细胞的成熟，其中，(A-C)ELISA分析敲除不同基因的CD11c+BMDC经过10μg/mL的线粒体刺激24h后细胞上清液中白介素-6(A)、肿瘤坏死因子-α(B)和白介素-12p70(C)的分泌水平。
(D-E)流式细胞术分析野生型BMDC(D)以及TLR2-/-BMDC(E)受到或不受到线粒体(10μg/mL)刺激24h后细胞表达CD86、CD80、CD40和MHCⅡ的水平。(n＝3)。(F)流式细胞术分析野生型BMDC受到指定处理方法(100μM的TLR2特异性抑制剂C29预处理2h，然后加入或不加入10μg/mL线粒体处理24h)后，细胞表达CD86、CD80、CD40和MHCⅡ的水平。(n＝3)。
(G)ELISA法检测BMDCs上清液中白介素-6，肿瘤坏死因子-α和白介素-12p70的水平(n＝3)，方法与(F)相同。(H)将OVA(1μg/mL)或OVA-MITO(10μg/mL)与野生型或TLR2敲除的BMDC(2×105)在体外共同培养。随后，再将这些BMDC与CFSE标记的，OT-I小鼠来源的CD8+T细胞(1×106)共培养48h后，分析CD8+T细胞的相位对比影像。(图中比例尺为100μm)。
(I)B16-F10荷瘤的野生型和TLR2-/-小鼠在第0、14和28天接受指定的预防性疫苗(50μg MITO或50μg TRP2-MITO)。肿瘤体积在图中标注的时间点测量。(n＝8)。(J)B16-OVA荷瘤的野生型和TLR2-/-小鼠在第0、14和28天接受指定的预防性疫苗(5μg可溶性OVA或50μgOVA-MITO)。肿瘤体积在图中标注的时间点测量。(n＝8)。
(K)B16-F10荷瘤的野生型和TLR2-/-小鼠在第0、14和28天接受指定的治疗性疫苗(50μgMITO或50μgTRP2-MITO)。肿瘤体积在图中标注的时间点测量。(野生型MITO组n＝12；其他组n＝11)。数据以平均值±SEM表示(A)～(C)、(I)～(K)采用单因素方差分析，(D)～(H)采用t检验分析；*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.0001。
试验例6、线粒体中的心磷脂通过TLR2信号通路诱导树突状细胞的成熟
接下来，我们在线粒体衍生的DAMP中寻找潜在的TLR2激动剂。心磷脂(CL)是一种位于线粒体内膜的独特脂质成分，据报道它可以激活包括TLR2在内的几种模式识别受体。在下一步的实验中，我们研究CL是否在线粒体疫苗的免疫刺激效应中发挥促进作用。实验结果表明，将CL与BMDC共培养能够显著促进DC细胞的成熟和共刺激因子表达的上调，且该变化呈现CL剂量依赖性(图6A)。此外，为了阐明CL对DC细胞的激活是否依赖于TLR2通路，我们使用CL刺激野生型与TLR敲除的小鼠BMDC，然后检测BMDC受到刺激后的成熟水平。结果表明，TLR敲除的小鼠BMDC在受到刺激后，CD80、CD86、CD40和MHCII相比对照组并没有明显的上调，而野生型BMDCs却能够被CL有效激活(图6B,C)。
为了进一步探索CL是否与线粒体疫苗的抗肿瘤效应有关，我们使用小干扰RNA(siCRLS1)抑制CL合成酶1(CRLS1)的表达来降低B16-F10细胞中CL的含量，并使用无序siRNA作为对照。结果显示，加入siCRLS1后，CL的转录水平显著降低(图6D)。利用siCRLS1#5，我们观察到转染后48小时达到最大抑制率，与亲本细胞相比，CL转录平降低了88％(图6D)。使用同样的方法也可以检测到B16-F10细胞的线粒体中CL含量的显著降低(图6E)。因此，我们使用siCRLS1处理48小时后细胞中的线粒体用于后续的实验。
在下一步实验中，我们用CL下调的TRP2-MITO处理B16-F10荷瘤小鼠。结果显示，由于TRP2-MITO中的CL水平下降，其抗肿瘤作用显著减弱，有力地证明了CL在线粒体疫苗抗肿瘤效力中的重要作用(图F)。此外，根据我们的假设，与对照组相比，将外源CL与TRP2-MITO联合可进一步增强TRP2-MITO的治疗效果，且延长了小鼠的生存期(图6G)。综上所述，以上结果表明，线粒体中的CL对TLR2信号通路介导的DC细胞成熟有十分重要的作用，与抗肿瘤免疫应答的激发以及转基因粒体疫苗的抗肿瘤效果密切相关。
图6线粒体中的心磷脂通过TLR2信号通路诱导树突状细胞的成熟
(A)用指定处理方法(PBS或10μg/mL,20μg/mL或50μg/mL心磷脂)刺激BMDC24h后，用流式细胞术检测CD11c+BMDC表达CD86、CD80、CD40和MHCⅡ的水平。(n＝3)
(B-C)流式细胞术分析野生型(B)和TLR2-/-(C)CD11c+BMDC受到或不受到50μg/mL心磷脂刺激24h后，CD86、CD80、CD40和MHCⅡ的表达水平(n＝3)。
(D)使用qRT-PCR检测B16-F10细胞在转染siCrls1或siScramble48h后,Crls1的转录水平。
(E)使用不同siCRLS1或siScramble转染B16-F10细胞48h后，分析线粒体心磷脂蛋白的水平。
(F-G)B16-F10荷瘤小鼠接受指定的治疗(在第3、10和17天给予50μgTRP2-MITO,50μgsiCrls1或50μgsiScramble)。肿瘤体积和小鼠存活率在图中标注的时间点测量。(n＝12)
(H-I)B16-F10荷瘤小鼠接受指定的治疗(每3天腹腔注射5mg/kg心磷脂同时，同时在第3天与第10天注射50μg TRP2-MITO)。肿瘤体积和小鼠存活率在图中标注的时间点测量。(n＝12)
数据以平均值±SEM表示。(A)-(C)采用t检验分析；(D)～(H)采用单因素方差分析，生存分析采用对数秩(logrank)检验(Mantel-Cox检验)；*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.0001。
试验例7、转基因线粒体疫苗的安全性分析
为了研究转基因线粒体疫苗的安全性，小鼠在接种3剂OVA-MITO/TRP2-MITO后被处死，并收集血液样本。处死前，小鼠未出现行为学改变、皱褶皮毛、食欲下降等不良反应。接种后体重亦无显著变化(图10A-C)。此外，经过OVA-MITO/TRP2-MITO疫苗处理后，对照组和实验组小鼠血清生化参数(ALT、AST、ALP、CREA、BUN和UA)均无明显差异(图10B-D)。这些结果表明本研究开发的转基因线粒体疫苗具有良好的安全性。
图10为转基因线粒体疫苗的安全性分析，其中，(A)C57BL/6小鼠在第0、14和28天分别接受5μgOVA或指定浓度(10、50或250μg)的OVA-MITO。小鼠体重在图中标注的时间点测量。(n＝6)
(B)C57BL/6小鼠接受与(A)相同的处理。图中显示第24天小鼠血清生化分析结果。(n＝4)
(C)C57BL/6小鼠在第0、14和28天分别接受5μg TRP2、50μgMITO或50μgTRP2-MITO治疗。小鼠体重在图中标注的时间点测量。(n＝12)
(D)C57BL/6小鼠接受与(C)相同的处理。图中显示第24天小鼠血清生化分析结果。(n＝5)数据以平均值±SEM表示。
Claims (17)
1.肿瘤抗原递送系统，其特征在于：其包括转基因线粒体。
2.如权利要求1所述的肿瘤抗原递送系统，其特征在于：所述转基因线粒体是基于肿瘤抗原和慢病毒转染系统，构建提取的线粒体；优选地，所述肿瘤抗原选自OVA、TRP2、ROR-1、XPROTEIN、MUC 1、LMP1、LMP2、HPV E6/E7、EGFR、WT1、MAGE-A3、NY-ESO-1、HER2、CEA、gp100、PAP中至少一种；更优选地，所述肿瘤抗原为OVA、TRP2中至少一种。
3.如权利要求2所述的肿瘤抗原递送系统，其特征在于：所述转基因线粒体是以OTC序列和慢病毒转染系统，构建提取的线粒体。
4.如权利要求1所述的肿瘤抗原递送系统，其特征在于：所述肿瘤抗原递送系统是以OTC作为前导序列的质粒和慢病毒转染系统，构建表达肿瘤抗原的线粒体稳转细胞株，提取其中的线粒体作为肿瘤抗原的递送系统。
5.如权利要求4所述的肿瘤抗原递送系统，其特征在于：所述肿瘤抗原包括OTC前导序列和模板抗原，所述模板抗原包括OVA或TRP2；优选地，所述OTC前导序列如SEQ IDNO.1所示；更优选地，所述肿瘤抗原的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
6.构建肿瘤抗原递送系统的方法，其特征在于：包括以下步骤：构建含有肿瘤抗原序列的质粒，以慢病毒系统感染细胞，筛得在线粒体稳定表达肿瘤抗原的稳转株，再提取稳转株的线粒体，即可得到转基因线粒体。
7.如权利要求6所述的构建肿瘤抗原递送系统的方法，其特征在于：所述肿瘤抗原含有OTC序列和肿瘤抗原序列。
8.如权利要求7所述的构建肿瘤抗原递送系统的方法，其特征在于：肿瘤抗原序列选自OVA、TRP2、ROR-1、X PROTEIN、MUC 1、LMP1、LMP2、HPV E6/E7、EGFR、WT1、MAGE-A3、NY-ESO-1、HER2、gp100、PAP中至少一种；优选地，所述肿瘤抗原序列为OVA、TRP2序列中至少一种；进一步地，所述质粒选自昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种；优选地，所述质粒选自pCDH-CMV、pCDH-EF1、pCDH-MSCV、pCDH-RFP、pLV105载体中的任意一种。
9.肿瘤疫苗，其特征在于：含有权利要求1-5任一项所述的肿瘤抗原递送系统。
10.如权利要求9所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述肿瘤抗原递送系统包括转基因线粒体；优选地，所述转基因线粒体包括表达肿瘤抗原的线粒体；更优选地，是表达OVA的线粒体或表达TRP2的线粒体。
11.药物组合物，其特征在于：包含权利要求1-5任一项的肿瘤抗原递送系统、权利要求9-10任一项的肿瘤疫苗和药剂学上允许的辅料或辅助性成分。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于：所述的辅料或辅助性成分为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、保护剂、吸附载体或润滑剂中至少一种。
13.权利要求1-5任一项肿瘤抗原递送系统、权利要求9-10任一项的肿瘤疫苗，或者权利要求11-12任一项所述的药物组合物，与至少一种其它预防性疾病治疗药物的组合物在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于：所述其它预防性疾病治疗药物为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂、DC肿瘤疫苗或心磷脂中至少一种。
15.权利要求1-5任一项肿瘤抗原递送系统在制备肿瘤疫苗佐剂中的用途。
16.权利要求1-5任一项肿瘤抗原递送系统、权利要求9-10任一项的肿瘤疫苗，或者权利要求11-12任一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤选自宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、肉瘤、淋巴瘤和粒细胞白血病等肿瘤。
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