CN109125740A - 一种新型的肿瘤疫苗及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种新型的肿瘤疫苗。为解决本领域目前没有能产生持久高效的抗肿瘤免疫反应的技术方案的问题，本发明提供了一种由核酸，尤其是不表达外源基因的可复制的核酸，与阳离子生物材料形成的复合物为主要活性成分的肿瘤疫苗，本发明肿瘤疫苗中的核酸与阳离子生物材料在直接杀伤肿瘤细胞、诱导机体天然免疫应答和适应性免疫应答抗肿瘤等方面具有协同增效的作用。此外，本发明所制备的肿瘤疫苗药物组分简单，易于生产制备和质量控制，具有很好的应用前景。

Description

一种新型的肿瘤疫苗及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种新型的肿瘤疫苗及其制备方法以及该疫苗在治 疗和/或预防肿瘤方面的用途。
背景技术
肿瘤生物治疗以现代分子生物学、免疫学和细胞生物学等前沿科学为基础，应用现代生 物技术及其产品进行肿瘤防治的手段，通过增加免疫细胞数量，促进人体免疫细胞重建以直 接恢复和提高人体免疫功能，并增强机体对癌细胞的免疫力，通过干扰肿瘤细胞的发生、生 长、分化、侵袭、转移和复发等一系列过程，以达到治疗肿瘤的目的。肿瘤生物治疗已成为 继手术、放疗和化疗之后第四大肿瘤治疗技术，主要包括肿瘤免疫治疗(包括抗体治疗、肿 瘤疫苗治疗、过继细胞免疫治疗、细胞因子治疗)、肿瘤基因治疗、抗血管生成治疗和分子靶 向治疗等。
肿瘤疫苗治疗一直以来是肿瘤生物治疗研究的热点领域，其原理是通过调动患者自身的 免疫系统，利用肿瘤抗原诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫反应，来抑制癌细胞的生 长、转移和复发，从而控制或杀灭肿瘤。肿瘤疫苗治疗包括：肿瘤细胞疫苗、肿瘤多肽疫苗、 肿瘤基因工程疫苗、肿瘤核酸疫苗和抗独特型抗体疫苗等。由于DNA作为核苷酸进入机体， 其本身没有致病性，免疫原性低，一般不会诱导机体产生免疫反应，因此，本领域目前所称 的“肿瘤DNA疫苗”一般是指是将肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原以及免疫刺激因子的表达 基因共同构建到质粒载体中，将质粒载体注入到机体内后，在宿主细胞中表达相应的肿瘤抗 原，从而刺激机体产生特异性免疫反应和非特异性免疫反应。肿瘤DNA疫苗具有安全有效， 易大量制备和纯化，以及不易整合入宿主细胞基因组等特点，在肿瘤免疫治疗方面引起了广 泛关注。
随着时间的推移，虽然临床研究表明上述的肿瘤DNA疫苗在临床试验中可以激活肿瘤病 人产生抗原特异性抗肿瘤免疫应答，但目前肿瘤DNA疫苗极少能诱导肿瘤患者产生持久高效 的抗肿瘤免疫反应，难以获得持久的预防或治疗肿瘤的效果。所以，如何提高肿瘤DNA疫苗 的免疫原性以及诱导肿瘤患者机体产生持久高效的抗肿瘤免疫反应，获得更满意的预防或治 疗肿瘤的效果，是目前亟需解决的技术问题。
由于裸DNA不易直接进入细胞，且易被细胞中的核酸酶降解，因此，DNA疫苗在治疗肿 瘤时，不仅转染效率比较低，而且免疫原性很弱，不易激活机体抗肿瘤免疫应答。阳离子生 物材料作为药物载药系统，与病毒载体相比，阳离子脂质具有合成简便快速，可以大量生产 等优点，由于其带有正电荷，易与带负电荷的DNA静电结合形成复合物，可保护DNA在体内 的降解作用，所形成的复合物通过细胞内吞或吞噬作用而被细胞摄入。但是研究发现在基因 转染的过程，有时会导致细胞的死亡。
阳离子生物材料也可以作为佐剂运用到肿瘤DNA疫苗中，DNA与阳离子生物材料形成的 复合物有利于被抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞、树突状细胞(DC)细胞吞噬，增强DNA 疫苗的免疫原性。同时由于复合物表面带正电荷，因此可延长DNA疫苗在注射部位停留时间， 以及增加抗原提呈和延长刺激体内细胞免疫的时间。然而，阳离子生物材料作为载药系统运 用于制备肿瘤DNA疫苗治疗肿瘤时，在系统给药后常引起组织细胞发生急性细胞坏死，并启 动损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMP)，从而诱发机体发生 一系列的炎症反应，并且易引起组织毒性损伤，如肝毒性、肺毒性等，这些因素限制了阳离 子生物材料作为药物载体系统在目前的肿瘤DNA疫苗治疗的临床应用。因此，如何有效利用 阳离子生物材料的优势开发为药物载体系统，提高药物在体内的生物利用度和靶向性，减少 其毒副反应，是目前开发阳离子纳米药物载体系统亟需解决的难题。
根据发明人前期研究(Cell Research(2015)25:237-253.)，阳离子生物材料可通过与 肿瘤细胞膜上的Na+/K+-ATP酶上的OBS位点结合，从而引起肿瘤细胞内的Na+浓度升高，直接 导致肿瘤细胞坏死，并释放胞内的线粒体等相关抗原和活性氧成分(reactiveoxygen species, ROS)。而线粒体DNA具有丰富的CpG结构，经ROS氧化后可激活TLR9信号通路，即TLR9-MyD88 通路，从而诱导天然免疫反应，造成炎性细胞的激活和聚集，刺激中性粒细胞释放更多的炎 性因子，增强免疫反应。因此，阳离子纳米载体可直接诱导肿瘤细胞的坏死，而该坏死机制 不同于以往研究的RIP1或MLKL调控的细胞坏死通路，是一种全新的细胞坏死机制，即通过 Na+/K+-ATP酶损伤途径；此外，局部注射阳离子纳米载体还能引起肿瘤细胞自身抗原的释放， 激活免疫细胞抗肿瘤的免疫反应。
此外，Terman等所提出的溶酶体线粒体轴理论(Lysosomal–mitochondrial axistheory)作 为溶酶体启动细胞死亡的新理论表明：在氧化应激、电离辐射、溶酶体靶向药物等刺激下， 溶酶体膜通透性增加，溶酶体内的水解酶释放到细胞质中，通过释放的磷脂酶类水解酶直接 引起线粒体损伤，或通过其他的水解酶激活促凋亡蛋白(Bid等)间接引起线粒体损伤，最终 导致线粒体中细胞色素c的释放、Casepse的激活，从而启动细胞凋亡。另外，多个研究表 明肿瘤细胞对于溶酶体膜的稳定性较正常细胞更敏感。
尽管DNA疫苗、阳离子生物材料、以及溶酶体启动细胞死亡的机理已有相关研究，但是 目前尚无文献报道不具有表达外源基因能力的可复制的DNA片段(pMVA质粒和pMVA-1质粒) 与阳离子生物材料形成复合物，作为肿瘤疫苗，具有协同增强抗肿瘤的作用；也无文献报道 经氧化后的这些DNA片段与阳离子生物材料形成复合物，作为肿瘤疫苗，具有更强的抗肿瘤 作用。
发明内容
本发明的目的在于从解决现有技术的不足出发，发明了不表达外源基因的可复制的DNA 片段与阳离子生物材料所形成的DNA/阳离子生物材料复合物，具有抗肿瘤的协同增效作用， 表现为不仅可以直接杀伤肿瘤，而且可以激活机体的天然免疫反应和适应性反应的抗肿瘤作 用，并且可以产生长期记忆免疫力，因此，可作为肿瘤疫苗单独使用或联合其他肿瘤治疗方 式应用于不同类型的肿瘤治疗中。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供了一种肿瘤疫苗。该肿瘤疫苗的成分包含DNA和阳离子生物材料的复合物。
进一步的，上述肿瘤疫苗中所述的DNA的长度为50～10000bp。
优选的，上述肿瘤疫苗中所述的DNA的长度为100～6000bp。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的DNA为线状DNA或环状DNA。
进一步的，上述肿瘤疫苗中所述的线状DNA为线粒体DNA，或线粒体DNA片段。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的环状DNA为质粒。
进一步的，上述肿瘤疫苗中所述的质粒选自pMVA、pMVA-1、pVAX1、pcDNA3.1、pBR322 或pUC18中的至少一种。
其中，上述肿瘤疫苗中所述质粒为包含复制子、抗性基因和质粒骨架序列的可复制但不 具有表达外源基因能力的质粒。
其中，上述包含复制子、抗性基因和质粒骨架序列的可复制但不具有表达外源基因能力 的质粒为pMVA质粒，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，或者其核苷酸序列与SEQID NO.1 所示序列具有90％以上的同源性。
其中，上述包含复制子、抗性基因和质粒骨架序列的可复制但不具有表达外源基因能力 的质粒为pMVA-1质粒，所述pMVA-1质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；或者其核苷 酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有90％以上的同源性。
所述的pMVA质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述的pMVA质粒是经重构后所 形成的具有最基本结构单元的可复制的质粒，包含卡那霉素抗性基因、pUC origin序列和质 粒骨架序列(如图1所示)，所述的pMVA质粒不具有表达外源基因的能力，不仅可以在大 肠杆菌中进行复制和抗性基因的筛选，更重要的是，在肿瘤细胞内有利于被氧化，形成氧化 DNA，具有更强的抗肿瘤活性，并且可进行规模化生产。
所述的pMVA-1质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述的pMVA-1质粒是在pMVA 质粒特定的核苷酸位点进行碱基突变或缺失而得到的。所述的pMVA-1质粒载体具有上述 pMVA质粒所具有的功效，同时，pMVA-1质粒的产量较pMVA质粒的产量更高，更利于进行规模化生产，可有效降低生产成本。
进一步的，上述肿瘤疫苗中所述的质粒上负载有其他DNA。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的其他DNA的长度为50～3000bp。
优选的，上述肿瘤疫苗中所述的其他DNA的长度为100～2500bp。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的其他DNA为线粒体DNA或线粒体DNA片段。
进一步的，上述肿瘤疫苗中所述的线粒体DNA(mtDNA)选自核苷酸序列为SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的DNA片段、或者核苷酸序列与SEQ ID NO.3、 SEQID NO.4或SEQ ID NO.5有90％以上的同源性的DNA片段中的至少一种。所述mtDNA 或mtDNA片段富含CpG基序，可作为TLR9通路或STING通路的激动剂，以激活抗肿瘤天 然免疫反应。
更进一步的，上述肿瘤疫苗中所述的质粒，优选负载mtDNA的pMVA质粒，或负载mtDNA的pMVA-1质粒：如SEQ ID NO.6所示的质粒pMVA-2，SEQ ID NO.7所示的质粒 pMVA-3，SEQ ID NO.8所示的质粒pMVA-4，SEQ ID NO.9所示的质粒pMVA-5，SEQ ID NO.10 所示的质粒pMVA-6，和SEQ ID NO.11所示的质粒pMVA-7，或者核苷酸序列与SEQ ID NO.6、 SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、或SEQ ID NO.11所示序列有 90％以上的同源性的质粒中的至少一种。
上述肿瘤疫苗中所述的DNA，可进一步选自体外氧化所形成的氧化DNA。优选的，所述的氧化DNA为氧化的质粒。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的体外氧化，包括但不限于使用射线照射、或各种氧化剂， 所述的射线照射包括紫外线、X射线、γ射线等；所述的氧化剂包括氧气、臭氧、F2、Cl2、Br2、硝酸盐、氯酸盐、高氯酸盐、HNO3、KMnO4、NaClO、CrO3、H2O2、PbO2、NaBiO3、 XeF2、Ce4+、PdCl2等。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的阳离子生物材料选自阳离子脂质类材料或阳离子聚合物中 的至少一种。
进一步的，上述肿瘤疫苗中所述的阳离子脂质类材料为阳离子脂质，或阳离子脂质与辅 助脂质的复合物。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的阳离子脂质选自(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺(DOTMA)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、 溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)或溴化二甲基双十八烷基 铵(DDAB)中的至少一种。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的辅助脂质选自磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆 固醇(Chol)或二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的至少一种。
进一步的，上述肿瘤疫苗中所述的阳离子脂质与辅助脂质的复合物中阳离子脂质与辅助 脂质的质量比为1:0.1～1:10。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、多糖、聚酰胺-胺PAMAM 或含有咪唑基团的聚合物中的至少一种。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的聚乙烯亚胺分子量为2～30kD。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的聚乙烯亚胺为PEI 2kD、PEI 5kD、PEI 25kD。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的多糖选自壳聚糖、羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖或壳聚糖 季铵盐中的至少一种。
其中，上述肿瘤疫苗中所述的多糖的分子量为30～50kD。
所述的壳聚糖是天然富产的氨基多糖，是甲壳素的衍生物，具有优异的生物相容性、生 物可降解性以及无毒等性能。
由于阳离子聚合物含有在中性条件下非质子化的-NH2，在溶酶体酸性条件下具有海绵质 子效应，使溶酶体膜破裂，诱发肿瘤细胞死亡，促使癌细胞释放免疫原性分子，以增强机体 抗肿瘤的特异性免疫反应。
综上所述，本发明所述的阳离子生物材料适应于体内递送DNA，尤其适用于压缩和稳定 DNA的转染运输进细胞，因为带负电荷的DNA可与阳离子生物材料通过静电作用结合，DNA 磷酸基团所带的负电荷大部分或全部被中和后，可与阳离子生物材料融合，结构重排，从而 导致DNA压缩。所述的阳离子生物材料另一方面可改善DNA体内转运，尤其适用于皮下或 腹腔途径注射，具有血清稳定性、摄入效率、以及DNA的释放等。更重要的是，本发明所述的阳离子生物材料可以直接诱导肿瘤细胞坏死，使其释放胞内的线粒体、肿瘤相关抗原和 ROS。此外，肿瘤坏死可增强肿瘤细胞的免疫原性，从而激活免疫细胞抗肿瘤的特异性免疫 反应。且所述的阳离子生物材料还可通过初次或再次加强的天然免疫应答来支持适应性免疫 应答的诱导和维持。此外，所述的阳离子生物材料还具有改善的储存稳定性。
上述肿瘤疫苗中所述的DNA和阳离子生物材料的复合物中的DNA与阳离子生物材料的 质量比为1:1～1:100。
优选的，上述的DNA和阳离子生物材料的复合物中的DNA与阳离子生物材料的质量比 为1:1～1:50。
上述的DNA/阳离子生物材料复合物的粒径为1～2000nm。
优选的，上述的DNA/阳离子生物材料复合物的粒径为50～1000nm。
上述肿瘤疫苗中所述的DNA/阳离子生物材料复合物的电位为1～150mv。
优选的，上述肿瘤疫苗中所述的DNA/阳离子生物材料复合物的电位为5～100mV。
其中，所述的DNA/阳离子生物材料复合物在诱导机体免疫应答抗肿瘤方面具有协同增 效作用，表现为：所述的阳离子生物材料，一方面可以促进质粒DNA的细胞转染率；另一方 面，所述的阳离子生物材料具有免疫佐剂效应，对癌细胞具有直接杀伤作用，可通过与肿瘤 细胞膜上的Na+/K+-ATP酶上的OBS位点结合，引起肿瘤细胞内的Na+浓度升高，导致肿瘤细胞 坏死，并释放胞内的线粒体等相关抗原和活性氧成分(ROS)。肿瘤细胞中的mtDNA具有丰富 的非甲基化CpG基序，经ROS氧化后可激活STING或TLR9信号通路，从而诱发天然免疫反应， 造成炎性细胞的激活和聚集，刺激中性粒细胞释放更多的炎性因子，如IL-6、、IL-12、IFN-γ、 TNF-α等。第三方面，所述的阳离子生物材料诱导肿瘤细胞坏死后，使其释放肿瘤抗原。释 放的肿瘤抗原在DC细胞中经过加工呈递到DC细胞表面，进一步激活并聚集CD8+T细胞和CD4+T 细胞的特异性杀瘤活性。
所述的DNA/阳离子生物材料复合物通过内吞作用进入肿瘤细胞后，可引起肿瘤细胞内的 ROS显著升高，DNA/阳离子生物材料复合物经ROS氧化后，所述的DNA/阳离子生物材料复合 物中的DNA，包括上述的mtDNA或质粒，可形成氧化DNA。所述的氧化DNA被溶酶体吞噬，使 得溶酶体的酸性梯度发生明显改变，即溶酶体膜通透性改变，引起溶酶体破裂，释放出大量 的溶酶体蛋白水解酶(如cathepsin)，水解酶释放到细胞质中，引起肿瘤细胞线粒体膜电位下 降，导致线粒体损伤，并进一步激活Caspase酶，从而诱导肿瘤细胞死亡，包括肿瘤细胞凋 亡和肿瘤细胞坏死。
由此可见，DNA/阳离子生物材料复合物协同诱导的肿瘤细胞死亡作用显著，而单独使用 的阳离子生物材料或DNA则无此明显作用。
所述的DNA/阳离子生物材料复合物还可协同促进DC细胞成熟，上述的氧化DNA与DC细胞细胞质中的cGAS结合后，形成cGMP(cyclic GMP-AMP，环化鸟苷酸-腺苷酸)，cGMP 可有效活化STING(stimulator of interferon genes,干扰素刺激基因)蛋白，诱导DC细胞释放 IFN-β和其他炎症因子(如：IL-1β、IL-6)，从而启动STING信号通路 (cGAS-2’3’cGAMP-STING-TBK-IRF3)抗肿瘤的天然免疫反应。所述的DNA/阳离子生物材 料复合物在协同促进DC细胞成熟的同时，还可改变肿瘤微环境并诱导CD8+T细胞特异性杀 伤肿瘤活性。
此外，所述DNA还可以选自体外氧化所形成的氧化DNA，比如氧化的质粒。氧化DNA可与阳离子生物材料形成复合物，作为肿瘤疫苗，在抗肿瘤方面，具有比上述DNA/阳离子生物材料复合物更强的协同增效作用。
而所述的体外氧化，可以使用射线照射或者氧化剂处理的方式进行。所述的射线照射， 可使用包括紫外线、X射线、γ射线在内的可以使DNA发生氧化的射线进行照射。而处理 DNA的氧化剂有很多种类可以选择，比如氧气、臭氧、F2、Cl2、Br2、硝酸盐、氯酸盐、高 氯酸盐、HNO3、KMnO4、NaClO、CrO3、H2O2、PbO2、NaBiO3、XeF2、Ce4+、PdCl2等都可 以在体外先对DNA进行氧化处理。
本发明还提供了一种药物组合物。该药物组合物包含上述的肿瘤疫苗和药剂学上允许的 辅料或辅助性成分。
其中，上述药物组合物中所述的辅料或辅助性成分为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、 湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、保护剂、吸附载体或润滑剂中至少一种。
本发明还提供了制备上述肿瘤疫苗的方法。该方法包括以下步骤：(1)制备DNA和阳 离子生物材料；(2)将步骤(1)中的DNA和阳离子生物材料混合、静置，即可制备得到DNA/阳离子生物材料复合物。
所述的肿瘤疫苗中的DNA的制备，包含质粒载体的构建方法、负载其他DNA质粒的构 建方法。
其中，所述的肿瘤疫苗中质粒载体构建方法，包括pMVA、pMVA-1质粒载体的构建方法。
pMVA质粒载体构建的方法包含以下步骤：
通过全基因合成的方式，合成一段1978bp的序列，包括pUC origin、kanamycin基因和 两段质粒骨架序列，再通过连接，环化而成pMVA质粒载体。所述的pMVA质粒载体的核苷 酸序列如SEQ ID NO.1所示。
pMVA-1质粒载体构建的方法包含以下步骤：
在上述pMVA质粒载体构建方法的基础上，将pMVA质粒载体的多个核苷酸位点进行定 点突变或缺失，得到突变优化后的pMVA-1质粒。所述的pMVA-1质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，所述的肿瘤疫苗中负载其他DNA质粒的构建方法，包括将mtDNA片段负载到pMVA质粒载体上，制备为pMVA-2，pMVA-3，和pMVA-4。
其中，所述的pMVA-2质粒的构建方法，包含以下步骤：
将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，与上述pMVA环化之前的线性序列一起全基因合成， 再通过连接，环化而成pMVA-2质粒。所述的pMVA-2质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所 示，其中第33～152位的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
所述的pMVA-3质粒的构建方法，包含以下步骤：
将SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，与上述pMVA环化之前的线性序列一起全基因合成， 再通过连接，环化而成pMVA-3质粒。所述的pMVA-3质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所 示，其中第33～632位的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
所述的pMVA-4质粒的构建方法，包含以下步骤：
将SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，与上述pMVA环化之前的线性序列一起全基因合成， 再通过连接，环化而成pMVA-4质粒。所述的pMVA-4质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所 示，其中第33～2032位的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
其中，所述的肿瘤疫苗中负载其他DNA质粒的构建方法，包括将mtDNA负载到pMVA-1 质粒载体上，制备为pMVA-5，pMVA-6，和pMVA-7。
其中，所述的pMVA-5质粒的构建方法，包含以下步骤：
将SEQ ID NO.3所示的mtDNA片段的核苷酸序列1，与上述pMVA-1环化之前的线性序 列一起全基因合成，再通过连接，环化而成pMVA-5质粒。所述的pMVA-5质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中第33～152位的核苷酸序列为插入的SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
所述的pMVA-6质粒的构建方法，包含以下步骤：
将SEQ ID NO.4所示的mtDNA片段的核苷酸序列2，与上述pMVA-1环化之前的线性序 列一起全基因合成，再通过连接，环化而成pMVA-6质粒。所述的pMVA-6质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中第33～632位的核苷酸序列为插入的SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
所述的pMVA-7质粒的构建方法，包含以下步骤
将SEQ ID NO.5所示的mtDNA片段的核苷酸序列3，与上述pMVA-1环化之前的线性序 列一起全基因合成，再通过连接，环化而成pMVA-7质粒。所述的pMVA-7质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其中第33～2032位的核苷酸序列为插入的SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
所述的肿瘤疫苗中的阳离子生物材料的制备，包含阳离子脂质的制备方法，或阳离子脂 质与辅助脂质制备为复合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将无热原的阳离子脂质或与无热原的辅助脂质混合，加入无水乙醇，加热，并搅拌 充分溶解；
(2)旋蒸步骤(1)中的混合溶液至溶液体积的1/3，用水定容；
(34)将步骤(2)所得到的溶液经高压匀浆机和挤出仪后，即可获得阳离子脂质，或阳 离子脂质与辅助脂质的复合物。
所述步骤(1)中，阳离子脂质与辅助脂质的质量比为1:0.1～1:10；所述的阳离子脂质优 选DOTAP，所述的辅助脂质优选胆固醇；所述的加热温度为50℃。
所述步骤(2)中旋蒸温度为30～60℃，优选40℃。真空压力度0.08-0.1MPa,优选0.09MPa；
所述步骤(4)中，高压匀浆机压力为700-800bar，次数为3-10次；所述挤出仪温度为 50℃，挤出膜为100nm，次数为1-2次；所述的获得的阳离子脂质或阳离子脂质与辅助脂质 的复合物粒径为80～150nm，PDI＜0.3。
所述的肿瘤疫苗中的阳离子生物材料的制备，包含PEI的制备方法：用水溶解PEI25kD。
所述的肿瘤疫苗或药物组合物中的阳离子生物材料的制备，包含壳聚糖的制备方法：中 分子量壳聚糖(30～50kD)溶解于水、或稀酸。
本发明还提供上述DNA/阳离子生物材料复合物制备方法，并进一步提供将所述的DNA/ 阳离子生物材料复合物制备为一种可用于治疗肿瘤的疫苗的方法，所述方法包含以下步骤：
将上述所制备的阳离子生物材料与DNA在无菌条件下混合，并静置0.5～1h，以形成DNA/ 阳离子生物材料复合物；
上述制备的DNA/阳离子生物材料复合物平均粒径在500nm以内、电位在100mV以内有 利于复合物转染进入肿瘤细胞，且DNA/阳离子生物材料复合物可协同诱导肿瘤细胞产生氧 化应激反应，通过溶酶体途径发挥直接抗肿瘤作用，并协同增强机体免疫应答的抗肿瘤活性。
本发明还提供了制备上述药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：(1)制备DNA和 阳离子生物材料；(2)将步骤(1)中的DNA和阳离子生物材料混合；在DNA和阳离子生 物材料混合前和/或混合过程中和/或混合后，添加药剂学上允许的辅料或辅助性成分，制备成 药物组合物。
其中，上述方法中所述的辅料或辅助性成分为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润 剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、保护剂、吸附载体或润滑剂中至少一种。
本发明还提供了一种治疗药盒。该治疗药盒包含上述的肿瘤疫苗，或上述的所述的药物 组合物，此外还包含至少一种其它肿瘤治疗药物。
其中，上述的治疗药盒中所述的其它肿瘤治疗药物选自化疗药物或免疫反应调节剂中的 至少一种。
其中，上述的治疗药盒中所述的免疫反应调节剂为细胞因子、II类HLA蛋白结合辅助 分子、CD40激动剂、检查点受体拮抗剂、B7共刺激分子、FLt3激动剂或CD40L激动剂中 的至少一种。
本发明在上述方案的基础上，还提供了一种抗肿瘤药物。该抗肿瘤药物含有上述的肿瘤 疫苗，或上述的药物组合物，和肿瘤抗原。
其中，上述的抗肿瘤药物中所述的肿瘤抗原选自肿瘤相关抗原、凋亡的肿瘤细胞或坏死 的肿瘤细胞中的至少一种。
同时，本发明也提供了上述的肿瘤疫苗、或者上述的药物组合物在制备治疗和/或预防肿 瘤的药物中的用途。
其中，上述的肿瘤选自宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、肉瘤或淋巴瘤。
同时，本发明也提供上述的肿瘤疫苗，或者上述的药物组合物，与至少一种其它肿瘤治 疗药物的组合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
其中，上述用途中所述的其它肿瘤治疗药物选自化疗药物或免疫反应调节剂中的至少一 种。
其中，上述用途中所述的免疫反应调节剂为细胞因子、II类HLA蛋白结合辅助分子、 CD40激动剂、检查点受体拮抗剂、B7共刺激分子、FLt3激动剂或CD40L激动剂中的至少一种。
此外，本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法。该方法包括给患肿瘤的哺乳动物施用治疗 有效量的上述的肿瘤疫苗、上述的药物组合物、上述的治疗药盒或上述的抗肿瘤药物中的至 少一种。
其中，上述方法中所述的哺乳动物为鼠、犬、猴或人。
其中，上述方法中所述的肿瘤选自宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、肉瘤或淋巴瘤。
其中，上述方法中施用肿瘤疫苗、药物组合物、治疗药盒或抗肿瘤药物的方式为注射治 疗。
其中，上述方法中所述的注射治疗为皮下单点注射、皮下多点注射、静脉注射、瘤周注 射、瘤内注射、胸腔注射、腹腔注射、蛛网膜下腔注射、淋巴结内或周围注射或肌肉注射中 的至少一种。上述注射治疗可视具体情况单独运用，必要时可联合运用。
其中，将上述的肿瘤疫苗、或上述的药物组合物用于治疗患肿瘤的哺乳动物，包含激活 荷瘤动物体内抗肿瘤免疫反应，包括天然免疫反应和适应性免疫反应，达到抑制肿瘤生长的 目的；此外，前述经所述的肿瘤疫苗或所述的药物组合物治疗后的荷瘤动物，当再次遇到肿 瘤细胞攻击时，其体内的记忆性免疫细胞可有效抑制肿瘤细胞生长、转移和复发，打破机体 免疫耐受，达到长期抗肿瘤免疫治疗的效果。所述的肿瘤疫苗、或药物组合物治疗肿瘤的方 法中施用的DNA有效剂量为1～50μg/kg，DNA与阳离子生物材料的质量比为1:1～1:100，优 选1:1～1:50。
其中，上述方法中在治疗肿瘤的过程还使用至少一种其它肿瘤治疗药物配合施用。
其中，上述方法中所述的其它肿瘤治疗药物为肿瘤抗原。
其中，上述方法中所述的肿瘤抗原选自肿瘤相关抗原、凋亡的肿瘤细胞或坏死的肿瘤细 胞中的至少一种。
所述的肿瘤细胞，包括宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、肉瘤细胞、 鼻咽癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、食道癌细胞、肝癌细胞、前列腺细胞、肾癌细胞、膀胱癌细胞或皮肤癌细胞等。
其中，上述方法中在治疗肿瘤的过程中还可以使用放疗配合治疗。
本发明的有益效果在于：
1、本发明重构了不具有表达外源基因的能力，但能够在大肠杆菌中进行复制和抗性基因 筛选的质粒，比如pMVA质粒载体以及负载mtDNA片段的质粒(pMVA-2、pMVA-3和pMVA-4)，和pMVA-1质粒载体以及负载mtDNA片段的质粒(pMVA-5、pMVA-6和pMVA-7)， 更重要的是，这些质粒在肿瘤细胞内更有利于被氧化，形成氧化DNA，具有更强的抗肿瘤活 性，且更便于规模化生产。
2、本发明以pMVA等DNA/阳离子生物材料复合物为主要活性成分的肿瘤疫苗能通过溶酶 体破裂途径直接发挥抗肿瘤的协同作用：
本发明创造性地发现，pMVA等DNA/阳离子生物材料复合物被肿瘤细胞内吞进入细胞质 后，肿瘤细胞产生大量的ROS，复合物经ROS氧化后，所形成的氧化DNA可促使溶酶体膜发 生通透(Lysosoma membrane permeabilization，LMP)，由此组织蛋白酶从溶酶体腔释放到 胞质，进而引发一系列级联反应造成溶酶体不稳定，且LMP可进一步导致肿瘤细胞线粒体外 膜发生通透(MOMP),细胞色素c释放入肿瘤细胞细胞质中，从而激活经典的caspase细胞凋 亡通路，最终导致肿瘤细胞死亡。
3、本发明以pMVA等DNA/阳离子生物材料复合物为主要活性成分的肿瘤疫苗还具有激活 抗肿瘤免疫反应的协同作用：
本发明还创造性地发现，经体外细胞活性实验和体内药效实验证明：较单独使用阳离子 生物材料、质粒DNA，阳离子生物材料与pMVA等DNA混合形成的pMVA等DNA/阳离子生物材 料复合物具有抗肿瘤的免疫反应的协同增效作用：
a.体外实验表明：pMVA等DNA/阳离子生物材料复合物转染进入肿瘤细胞后，引起肿瘤细 胞内的ROS显著升高，DNA/阳离子生物材料复合物经ROS氧化后，所形成的氧化DNA激活STING 通路，刺激DC细胞成熟，并分泌IFN-β和IL-1β，从而启动抗肿瘤的天然免疫反应。
b.体内实验表明：注射pMVA等DNA/阳离子生物材料复合物后，肿瘤细胞坏死，DNA发 生氧化，肿瘤细胞中溶酶体裂解，以及肿瘤部位天然免疫细胞——中性粒细胞增加，免疫抑 制因子与促血管生成的因子表达减少。同时，检测到肿瘤组织周围有DC细胞吞噬肿瘤抗原和 氧化的质粒DNA，以及大量的CD4+淋巴细胞和CD8+淋巴细胞浸润，表明该复合物激活了机体 的适应性免疫反应。
c.pMVA等DNA/阳离子生物材料复合物作为主要活性成分制备为肿瘤疫苗治疗肿瘤模型 小鼠后，给予肿瘤消散的小鼠进行再次肿瘤细胞攻击时，该复合物具有发挥长期抗肿瘤的免 疫作用。
因此，本发明的DNA/阳离子生物材料复合物对直接诱导肿瘤细胞的坏死具有协同作用， 还能协同引起肿瘤细胞自身抗原和氧化DNA的释放，启动STING通路和激活炎性细胞所引发 的天然免疫反应，且促使DC细胞成熟，诱导机体产生抗肿瘤的适应性免疫反应。
4、本发明以pMVA等DNA/阳离子生物材料复合物为主要活性成分的肿瘤疫苗具有组成成 分简单，易于质量控制的优点：
本技术方案所涉及的肿瘤疫苗由阳离子生物材料和DNA组成，成分简单，易于质量控制， 且适合规模化生产，显著的降低了生产成本。
5、本发明以pMVA等DNA/阳离子生物材料复合物为主要活性成分的肿瘤疫苗可作为肿 瘤细胞抗原的佐剂，进一步增强肿瘤细胞抗原的免疫反应，并能适用于不同类型的肿瘤治疗。
6、实验表明，本发明以pMVA等DNA/阳离子生物材料复合物为主要活性成分的肿瘤疫 苗可应用于多种肿瘤的治疗及联合治疗，应用前景广阔。
本技术方案的疫苗可用于治疗多种肿瘤，包括宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、 结肠癌、淋巴瘤、肉瘤等，也可与放疗和/或化疗，或与免疫抑制剂联合治疗肿瘤。适应症广 泛，治疗方式灵活多样，应用前景广阔。
附图说明
图1、质粒载体构建图谱：
A：pMVA质粒构建图谱，包含卡那霉素抗性基因(第205-999bp)、pUC origin序列(第 1309-1972bp)、和质粒骨架序列(第1-204bp，第1000-1308bp，第1973-1978bp)，共计1978 bp(如SEQ ID NO.1所示)。
B：pMVA-1质粒构建图谱，包含卡那霉素抗性基因(第205-999bp)、pUC origin序列(第1308-1971bp)、和质粒骨架序列(第1-204bp，第1000-1307bp，第1972-1977bp)，共 计1977bp(如SEQ ID NO.2所示)。
图2、琼脂糖凝胶电泳验证NcoEⅠ酶和Eco72Ⅰ酶将pMVA质粒进行酶切的结果，其中闭环plasmid(即p MVA-1质粒)的分子量大小与NcoEⅠ酶和Eco72Ⅰ酶酶切后的质粒片段 大小一致，约2000bp。
图3、不同质量比的DNA/DOTAP复合物的琼脂糖凝胶电泳检测图；
图4、不同质量比的pMVA-1/DOTAP复合物体外抑制A549细胞活性的检测图：其中，●表示DOTAP:pMVA-1质量比为1:1的pMVA-1/DOTAP复合物，■表示DOTAP:pMVA-1质 量比为6:1的pMVA-1/DOTAP复合物,▲表示DOTAP:pMVA-1质量比为10:1的 pMVA-1/DOTAP复合物，▼表示DOTAP:pMVA-1质量比为15:1的pMVA-1/DOTAP复合物， ◆表示DOTAP:pMVA-1质量比为20:1的pMVA-1/DOTAP复合物。
图5、不同质量比的pMVA1/PEI25D复合物体外抑制A549细胞活性的检测图：其中●表示PEI25KD:pMVA-1质量比为1:1的pMVA-1/PEI25KD复合物，▼表示DOTAP:pMVA-1 质量比为10:1的pMVA-1/PEI25KD复合物，◆表示DOTAP:pMVA-1质量比为20:1的 pMVA-1/PEI25KD复合物。
图6、不同质量比的pMVA1/壳聚糖复合物体外抑制A549细胞活性的检测图：其中●表 示壳聚糖:pMVA-1质量比为1:1的pMVA-1/壳聚糖复合物，▼表示壳聚糖:pMVA-1质量比为 10:1的pMVA-1/壳聚糖复合物，◆表示壳聚糖:pMVA-1质量比为20:1的pMVA-1/壳聚糖复合 物。
图7、PI-AnnexinV法检测pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞死亡的荧光显微镜 观测图。其中，A：pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导A549细胞死亡的荧光显微镜检测图，B：pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导CT26细胞死亡的荧光显微镜检测图。A549细胞和CT26细 胞分别经PMVA-1/DOTAP复合物处理24h后，均出现大量PI阳性和AnnexinV阳性结果， 而对照组则无明显的PI阳性和AnnexinV阳性细胞。
图8、流式细胞术检测肿瘤细胞经不同样品处理后的细胞死亡数。A：流式细胞术测定 各组A549细胞死亡统计图。B.流式细胞术测定各组CT26细胞死亡统计图。所有结果均采用平均相对表达量±SD表示，*p﹤0.05。其中，空白对照组(Control)、对照组pMVA质粒组(PMVA)和DOTAP阳离子脂质体组(DOTAP)，以及实验组pMVA-1/DOTAP复合物组 (PMVA-DOTAP)
图9、流式细胞术检测A549细胞内ROS水平的统计图。其中，空白对照组Cont：在A549细胞中只加入培养基；对照组PMVA：在A549细胞中加入pMVA-1质粒；对照组DOTAP： 在A549细胞中加入DOTAP；实验组PMVA-DOTAP：在A549细胞中加入pMVA-1/DOTAP 复合物；阴性对照组NAC：在pMVA-1/DOTAP复合物作用前使用5mM NAC进行预处理； 阳性对照组H2O2：在A549细胞中加入200μM H2O2。所有结果均采用平均相对表达量±SD 表示，*P﹤0.05。
图10、氧化的pMVA-1质粒与DOTAP阳离子脂质所形成ox-pMVA-1/DOTAP复合物对A549细胞死亡的影响。所有结果均采用平均相对表达量±SD表示，*P﹤0.05。
图11、pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞死亡与肿瘤细胞发生氧化应激有关。 流式细胞术检测在加入pMVA-1/DOTP复合物前，经NAC预处理的A549细胞发生死亡的比例。所有结果均采用平均相对表达量±SD表示，*P﹤0.05。
图12、pMVA-1/DOTAP复合物作用A549细胞0.5h和3h后，pMVA-1/DOTAP复合物 进入细胞且协同诱导溶酶体酸度梯度丧失的荧光显微镜图。
图13、流式细胞术定量检测分别经不同样品作用1h、3h、6h和9h的A549细胞溶酶体中Lysotracker红色荧光强度的变化。统计分析各组Lysotracker Red荧光强度下降的A549细 胞所占的百分比。其中，空白对照组Control：在A549细胞中只加入培养基；对照组PMVA：在A549细胞中加入pMVA-1质粒；对照组DOTAP：在A549细胞中加入DOTAP；实验组PMVA-DOTAP：在A549细胞中加入pMVA-1/DOTAP复合物。所有结果均采用平均相对表达 量±SD表示，*P﹤0.05。
图14、pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导A549细胞溶酶体膜通透性增加的荧光图。A：FITC-Dextran细胞内定位法检测A549细胞溶酶体膜发生通透性增加；B：Cathepsin B细胞内 定位法检测A549细胞溶酶体内水解酶释放入细胞质中。其中，空白对照组Control：在A549 细胞中只加入培养基；对照组PMVA：在A549细胞中加入pMVA-1质粒；对照组DOTAP： 在A549细胞中加入DOTAP；实验组PMVA-DOTAP：在A549细胞中加入pMVA-1/DOTAP 复合物。
图15、TMRM荧光标记法检测肿瘤细胞线粒体膜电位变化。A：流式细胞术检测发生线 粒体膜电位去极化的A549细胞的百分比；B：流式细胞术检测发生线粒体膜电位去极化的 CT26细胞的百分比。其中，空白对照组Control：在A549细胞中只加入培养基；对照组PMVA： 在A549细胞中加入pMVA-1质粒；对照组DOTAP：在A549细胞中加入DOTAP；实验组PMVA-DOTAP：在A549细胞中加入pMVA-1/DOTAP复合物。所有结果均采用平均相对表达 量±SD表示，*P﹤0.05。
图16、pMVA-1/DOTAP复合物诱导A549细胞Caspase蛋白酶的激活。所有结果均采用平均相对表达量±SD表示，*P﹤0.05。
图17、pMVA-1/DOTAP复合物以及肿瘤细胞刺激对DC细胞的抗原摄取具有抑制作用。 FITC-Dextran作为DC细胞摄取的模式抗原，通过检测CD11c阳性DC细胞的FITC平均荧光强度值来判断DC细胞的吞噬能力，由此分析DC是否被诱导成熟。*P<0.05。其中，对照 组(Control)：BMDC细胞中只加入培养基，PMVA组：BMDC细胞中只加入pMVA-1质粒， DOTAP组：BMDC细胞中只加入DOTAP阳离子脂质，PMVA-DOTAP组：BMDC细胞中只 加入pMVA-1/DOTAP复合物；Tumor组：在BMDC细胞中加入CT26细胞，Tumor+PMVA 组：在BMDC细胞中加入经pMVA-1质粒载体处理过的CT26细胞，Tumor+DOTAP组：在 BMDC细胞中加入经DOTAP阳离子脂质处理过的CT26细胞，Tumor+PMVA-DOTAP组：在 BMDC细胞中加入经pMVA-1/DOTAP复合物处理过的CT26细胞。
图18、统计分析流式细胞术检测经CT26细胞刺激后分泌细胞因子的BMDC细胞百分比。A：分泌IFN-β的BMDC百分比；B：分泌IL-1β的BMDC百分比。所有结果均采用平 均百分比±SD表示，*P﹤0.05。其中，control组：BMDC细胞中只加入培养基，Tumor组： 在BMDC细胞中加入CT26细胞，Tumor+PMVA组：在BMDC细胞中加入经pMVA-1质粒 载体处理过的CT26细胞，Tumor+DOTAP组：在BMDC细胞中加入经DOTAP阳离子脂质 处理过的CT26细胞，Tumor+PMVA-DOTAP组：在BMDC细胞中加入经pMVA-1/DOTAP 复合物处理过的CT26细胞。
图19、pMVA-1/DOTAP复合物显著抑制宫颈癌腹腔转移模型裸鼠的肿瘤生长。A：pMVA-1/DOTAP复合物组裸鼠体重显著低于其他实验组；B：pMVA-1/DOTAP复合物组裸鼠 腹水量明显少于其他各组；C：pMVA-1/DOTAP复合物组裸鼠的节结数明显少于其他各组； D：pMVA-1/DOTAP复合物组裸鼠的瘤重显著低于其他各组。**p<0.01。
图20、流式细胞术检测宫颈癌腹腔转移模型裸鼠腹水凋亡细胞比例的统计分析图。
图21、DNA/DOTAP复合物抑制卵巢癌腹腔转移模型小鼠的肿瘤生长。A：DNA/DOTAP复合物组小鼠腹水量明显少于其他各组；B：DNA/DOTAP复合物组小鼠的瘤重明显低于其他各组；C：DNA/DOTAP复合物组小鼠的腹水癌细胞数显著低于其他各组。**p<0.01。
图22、质粒DNA/DOTAP复合物可抑制CT26腹腔转移模型小鼠的肿瘤生长。A：治疗组质粒DNA/DOTAP复合物自然死亡的小鼠数量显著低于其他对照组(P＜0.01或P＜0.05)；B：治疗组pMVA-3/DOTAP小鼠的瘤重显著低于其他各组；C：治疗组pMVA-3/DOTAP小鼠 的腹水量明显少于其他各组；D：治疗组pMVA-3/DOTAP小鼠的腹水癌细胞数显著低于其他 各组；E：治疗组pMVA-3/DOTAP小鼠的肿瘤结节数显著低于其他各组。**P＜0.01，*P＜0.05。
图23、pMVA-1/DOTAP复合物可显著抑制小鼠肉瘤的生长。治疗组pMVA-1/DOTAP组小鼠的无瘤率为90％，显著高于NS组的1％，DOTAP组20％和pMVA-1组20％。**P＜0.01。
图24、pMVA-1/DOTAP复合物可显著抑制人鼻咽癌细胞皮下模型小鼠的肿瘤生长。**P ＜0.01。
图25.pVMA-1/DOTAP复合物抑制CT26腹腔转移模型小鼠的肿瘤生长。A： pMVA-1/DOTAP组小鼠与正常组小鼠体重没有明显差异；B：pMVA-1/DOTAP组小鼠腹水量 明显少于阴性对照组、pMVA-1组和DOTAP组。C.：pMVA-1/DOTAP组小鼠生存期明显长 于阴性对照组、pMVA-1组和DOTAP组。D：pMVA-1/DOTAP组小鼠瘤重显著低于阴性对照 组、pMVA-1组和DOTAP组。*p<0.05。
图26、pMVA-1/DOTAP复合物治疗CT26腹腔转移模型小鼠后，可引起治疗小鼠产生全身性抗肿瘤记忆性免疫应答，当遇到肿瘤细胞，包括同种类型和不同类型的肿瘤细胞，再次刺激后，可通过记忆性T细胞及其分泌的大量免疫细胞因子，抑制肿瘤细胞的生长，以打破肿瘤的免疫耐受作用。A：在第一次腹腔接种CT26细胞并经pMVA-1/DOTAP复合物治疗 的小鼠再次受到CT26攻击后(DOTAP+2皮下CT26组)，与没有接受腹腔CT26细胞接种也 没有接受治疗的小鼠遇到CT26细胞攻击(对照组皮下CT26)相比，肿瘤体积显著减小。B： 在第一次腹腔接种CT26细胞并经pMVA-1/DOTAP复合物治疗的小鼠遇到4T1细胞攻击后 (DOTAP+2皮下4T1组)，与没有接受腹腔CT26细胞接种也没有接受治疗的小鼠遇到4T1 细胞攻击(对照组皮下4T1)相比，肿瘤体积显著减小。
图27、pMVA-1/DOTAP复合物与Cisplatin(顺铂)联合治疗可显著抑制小鼠U14皮下模型的肿瘤细胞生长。*P＜0.05。其中，NS组：只注射10％蔗糖，DOTAP组：只注射DOTAP，pMVA1组：只注射pMVA-1质粒，Cisplatin：只注射顺铂，LP组：pMVA-1/DOTAP复合物， LP+Cisplatin组：pMVA-1/DOTAP复合物与顺铂联合治疗
图28、pMVA-1/DOTAP复合物与放疗联合治疗可显著抑制小鼠U14皮下模型的肿瘤细 胞生长。*P＜0.05
图29、pVAX1/DOTAP复合物作为佐剂，与凋亡或坏死CT26细胞混合制备为肿瘤细胞疫苗，可显著延长荷瘤小鼠的生存期，具有良好的抗肿瘤作用。其中，NS：生理盐水组；NECRO：pVAX1/DOTAP复合物与坏死CT26细胞混合制备为坏死肿瘤细胞疫苗组；APOP：pVAX1/DOTAP复合物与凋亡CT26细胞混合制备为凋亡细胞疫苗组。
名词解释
1、线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)：为闭环双链DNA分子,单个细胞中约有数 千个拷贝。mtDNA含有37个基因,编码13个呼吸链多肽及22个tRNA和2个rRNA,还有一含基因复制和转录调控序列的非编码区“D-loop”。
2、溶酶体膜发生通透(Lysosoma membrane permeabilization，LMP)：
尽管溶酶体膜通透性是如何发生的目前还存在争议，但是LMP诱导物包括：ROS、脂类、 纳米颗粒等。
(1)ROS：
在发生高水平氧化应激的情况下，由于溶酶体没有过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶， 所以溶酶体不能降解过氧化氢，大量过氧化氢分散在溶酶体膜上，从而促使溶酶体中含量丰 富的二价铁离子催化过氧化氢成为羟自由基，进而引发LMP。
(2)脂类
由于一些脂质和脂类代谢物具有亲溶酶体性，所以可促使LMP发生。
(3)纳米颗粒：可聚集在溶酶体中，破坏溶酶体膜，通过LMP途径诱导细胞死亡。
3、细胞死亡：
正常的组织中，经常发生“正常”的细胞死亡，是维持组织机能和形态所必需的。细胞 死亡的方式通常包括细胞坏死(necrosis)、细胞凋亡(apoptosis)和细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)。
细胞凋亡是最常见、了解最多的PCD形式，一般由活化的caspases执行，这是一种细胞 内半胱氨酸(cysteine)蛋白酶。因此，从启动机制上讲凋亡分为caspases依赖性的和caspases非依赖性的。凋亡细胞典型的形态学改变为：细胞核染色质凝聚(chromatincondensation)，核碎裂(nuclear fragmentation)，梯形DNA形成(DNA laddering)；细胞膜出芽(blebbing)；细胞质碎片形成(凋亡小体形成)。凋亡过程中没有细胞膜的破坏,降解的细 胞成分被包裹形成凋亡小体，最后被吞噬细胞或临近细胞的溶酶体通过异吞噬作用清除。因 此，凋亡过程中在死亡的细胞周围无炎症反应出现。
细胞坏死是细胞受到化学因素(如强酸、强碱、有毒物质)、物理因素(如热、辐射)和 生物因素(如病原体)等因素的影响，引起细胞死亡的现象。坏死细胞的形态改变主要是由 酶性消化和蛋白变性两种病理过程引起。细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解， 结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。随着胞质内蛋白变性、凝固 或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性。随后，坏死细胞发生溶解，导致 细胞结构完全消失，最后细胞膜和细胞器破裂，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织 炎症反应，坏死细胞残余碎片可被巨噬细胞吞噬，或诱导DC细胞活化和成熟。
4、STING信号通路：
STING(Stimulator of IFN genes),又称ERIS/MYPS/MITA,是一个由TMEM173基因编码 的多功能接头蛋白。STING信号通路(cGAS-2’3’cGAMP-STING-TBK1-IRF3),是免疫系统识别 异常来源的细胞质双链DNA,发挥天然免疫的关键通路。STING信号通路在机体自发的抗肿瘤 免疫反应，以及在放疗诱导的抗肿瘤免疫反应中,均发挥了关键作用。肿瘤来源的双链DNA, 也能被肿瘤微环境中的DC摄取,激活cGAS,进一步cGAS催化ATP、GTP合成2’3’cGAMP,2’ 3cGAMP与STING结合,改变STING蛋白的构象,活化的STING招募TBK1和IKK,T3K1和IKK与 STING相互作用后被磷酸化。被磷酸化后的TBK1招募IRF3,被磷酸化后的IKK招募NF-κβ, 随后IRF3及NF-κβ磷酸化后进入细胞核,作为重要的转录因子,调控下游基因的表达,促进I 型干犹素及Thl型细胞因子(如INF-γ)的分泌。与此同时,STING信号通路的激活,可促进 APC(如CD8α+/CD103+DC)的成熟和活化,促进APC提呈肿瘤相关抗原,启动CD8+T细胞特异性 抗肿瘤免疫反应。
5、天然免疫应答(innate immunity)：又称非特异性免疫(nonspecificimmunity)， 是指机体在种系发生和进化过程中逐渐形成的一种天然免疫防御功能，构成机体抵御病原生 物入侵的第一道防线。天然免疫可稳定遗传，免疫作用广泛，无特异性。初次与抗原接触即 能发挥免疫效应，但无免疫记忆性。
例如，天然免疫系统受微生物及其产物的刺激而活化，免疫细胞如巨噬细胞、DC细胞内、 中性粒细胞内的Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)可识别微生物所特有的病原相关 分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),启动激动天然免疫应答，分 泌炎症细胞因子(如IL-12)，介导炎性反应。
天然免疫细胞表达的模式识别受体(pattern-recognition receptor,PRR),通过识别不 同PAMA而被激活，其表达不同的细胞因子，从而诱导初始T细胞分化为不同的T细胞，并决 定适应性免疫应答的类型。因此，天然免疫应答可调控或影响适应性免疫应答的类型和强度， 适应性免疫应答的维持及其效应的发挥也须有天然免疫的协助和参与。
6、CpG基序(motif)：又称为免疫刺激序列(immunostimulatory sequences，ISS)，是指一类以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为核心的序列。CpG基序是TLR9的天然配体，是一种强有力的非特异性免疫刺激DNA序列,能够激活多种免疫细胞。含有CpG基序的DNA可被天然免疫细胞内吞，被胞内TLR9识别，激活MyD88、TRAF6及下游的NF-kB及MAPK 两大通路，导致多种转录因子，诱导Th1型细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-12和IFN-γ的表 达，进而促使初始T细胞向Thl细胞分化，Th1细胞进一步分泌的IFN-γ又诱导NK细胞和巨 噬细胞的活化，促进B淋巴细胞的分裂、增殖和抗体的产生，从而全面增强宿主的细胞免疫 和体液免疫。
真核细胞之中的mtDNA来源于细菌的环状基因组，也含大量未甲基化的CpG基序，可作 为PAMP作用于PRRs。当线粒体发生功能障碍时，如氧化应激，产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，mtDNA从线粒体中释放到胞浆中作为刺激物激活TLR9信号通路，诱 导中性粒细胞P38MAPK通路产生炎性细胞因子(如IL-12)、趋化因子等，从而促发适应性 免疫反应，诱导初始T细胞向Th1细胞分化，并释放大量的IFN-γ。
7、适应性免疫反应：又称特异性免疫应答，是指体内特异性T、B细胞接受抗原刺激后， 自身活化、增殖、分化为效应细胞，产生一系列生物学效应的过程。适应性免疫反应具有特 异性、记忆性和耐受性的特点。
适应性免疫应答的第一阶段是抗原识别，抗原经抗原呈递细胞摄取、加工、处理后，与 抗原呈递细胞上的MHC分子形成MHC复合物，并通过初始T细胞或初始B细胞表面受体(TCR 或BCR)特异性识别。抗原呈递细胞包括：DC细胞、巨噬细胞、中性粒细胞。
第二个阶段是初始T细胞或初始B细胞增殖和分化阶段，T/B细胞特异性识别抗原，产 生其激活的第一信号；T/B细胞与抗原呈递细胞表面多种粘附分子相互作用，提供T细胞或B 细胞激活的第二信号(即共刺激信号)。激活的抗原呈递细胞和T细胞所产生的多种淋巴因子 作为第三信号，通过自分泌和旁分泌作用，参与淋巴细胞增殖和分化，最终形成效应T细胞 或浆细胞。其中，效应T细胞最重要的功能是通过CD8+细胞毒性T细胞(CTL)杀死感染的细 胞以及通过Th1细胞激活巨噬细胞，二者共同组成细胞免疫；此外，通过Th2细胞激活B细 胞，产生不同种类的抗体，由此激活体液免疫应答。
第三个阶段是效应阶段，免疫效应细胞和效应分子(细胞因子和抗体)共同发挥作用， 清除非己抗原，维持机体正常生理状态。
8、记忆性免疫反应：免疫记忆是适应性免疫的重要特征,即机体再次遇到初次致敏的抗 原时,会呈现应答速度和强度增强的二次应答反应。免疫记忆的关键是记忆性淋巴细胞的形成 和维持。诱导保护性免疫记忆反应既有记忆性B淋巴细胞介导的体液免疫反应，又有记忆性 T淋巴细胞介导的细胞免疫反应。
抗原刺激决定了初次应答产生的抗原特异性CD8+T细胞数量，约有5％抗原特异性CD8+T 细胞转变为记忆性CD8+T细胞。记忆性T细胞(Tm)接受抗原再次刺激后可迅速成熟为效应 性记忆性T细胞(TEM)，并在早期产生大量IFN-γ、IL-4和IL-5。
与遭遇抗原初次刺激的初始T细胞相比，记忆性T细胞具有以下优势：(1)记忆性T细 胞再次暴露于相同抗原时，可表现出更强的增殖能力、细胞因子分泌能力和CTL活性；(2) 相同抗原再次激活记忆性T细胞所需条件与初次应答相比阈值较低。(3)一般认为记忆性 CD8+T细胞的维持不需要抗原的持续刺激，并具备自我更新能力。(4)记忆性T细胞再次激 活后可释放大量细胞因子，如IFN-γ、IL-4和IL-5，从而促进T细胞发挥杀伤肿瘤作用。(5) 记忆性T细胞不必归巢于次级淋巴器官即可产生具有快速强烈免疫反应的效应细胞。
9、DNA/阳离子脂质类材料：
本发明所涉及的阳离子脂质表面带有正电荷，易于带负电荷的DNA通过静电作用形成 DNA/阳离子脂质类材料。通常情况下，所形成的DNA/阳离子脂质类材料表面带有正电荷，通 过静电作用吸附到带负电荷的细胞表面，通过与细胞膜融合或细胞内吞作用将DNA传递进入 细胞，形成包涵体或进入溶酶体。在阳离子脂质作用下，细胞膜上的阴离子脂质因膜的去稳 定而失去原有的平衡而扩散进入复合物，与阳离子脂质中的阳离子形成中性离子对，使原来 与脂质体结合的DNA游离出来，进入细胞质。
10、质粒:
本领域质粒一般是指附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的 环状DNA分子。
需要说明的是本发明重新构建了一类不具有表达外源基因能力的可复制的环状DNA分 子，属于一类新型的质粒。本发明构建的质粒与阳离子生物材料形成复合物后，能进入肿瘤 细胞，引起肿瘤细胞内的ROS明显升高，从而使质粒/阳离子生物材料复合物中的质粒经ROS 氧化，形成氧化DNA，可促使肿瘤细胞中的溶酶体破裂，一方面，可以直接介导肿瘤细胞坏 死；另一方面，可以激活机体抗肿瘤的免疫反应。此外，本发明所构建的质粒/阳离子生物材 料复合物中的质粒也可在体外用各种已报道的手段，使DNA先行氧化，然后再进入体内增强 上述抗肿瘤的作用。
11、DNA氧化及氧化损伤
DNA常受到来自体内外各种因素的刺激，如各种射线、强氧化剂、强酸和强碱等物理化 学因素和内源性ROS等，都会导致DNA受到自由基的攻击而产生氧化。氧化往往会对DNA造 成氧化损伤，如DNA双链结构断裂(DSBs)、DNA单链断裂、碱基或碱基对被切除或替换等。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明。需要说明的是，本发明 中涉及的一些常见的分子生物学操作以及常见的制备药物制剂的操作，本领域技术人员都能 在阅读本发明说明书的基础上结合本领域已有的教科书、手册以及相关设备和试剂的使用说 明进行完成。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1、pMVA和pMVA-1质粒构建和表达
(1)pMVA质粒的构建和表达
通过全基因合成的方式，合成一段1978bp核苷酸序列，包括pUC origin序列、卡那霉 素(kanamycin)基因和两段质粒骨架序列，再通过连接，环化而成pMVA质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。pMVA质粒的结构如图1A所示。
采用琼脂糖凝胶电泳进行酶切验证，实验结果如图2所示。
将构建得到的pMVA质粒在大肠杆菌DH5a中进行表达。
(2)pMVA-1质粒的构建和表达
将上述构建制备得到的pMVA质粒，进行碱基定点突变或缺失，得到pMVA-1质粒，共1977bp。突变位点，包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第2，3，4，41和1950位碱基； 缺失位点是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第1075位碱基。pMVA-1质粒载体的核苷酸序 列如SEQ ID NO.2所示。pMVA-1质粒的结构如图1B所示。
将上述构建的pMVA-1质粒在大肠杆菌DH5a中进行表达，其产量明显优于pMVA质粒的产量。
实施例2、线粒体DNA(mtDNA)靶序列的筛选
选择50～3000bp mtDNA，包括：如SEQ ID NO.3、4和5所示的mtDNA。因为mtDNA 或mtDNA片段富含CpG基序，可作为TLR9通路或STING通路的激动剂，当肿瘤细胞发生 氧化应激反应时，所选的mtDNA靶序列可有效激活机体抗肿瘤天然免疫反应。
实施例3、质粒的构建和表达
(1)pMVA-2质粒的构建和扩增
将实施例2中所筛选的如SEQ ID NO.3所示的mtDNA核苷酸序列1，与实施例1中pMVA 环化之前的线性序列一起全基因合成，再通过连接，环化而成pMVA-2质粒，共2098bp。所 述的pMVA-2质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中第33～152位的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
将构建得到的pMVA-2质粒在大肠杆菌DH5a中进行扩增。
(2)pMVA-3质粒的构建和扩增
将实施例2中所筛选的如SEQ ID NO.4所示的mtDNA核苷酸序列2，与实施例1中pMVA 环化之前的线性序列一起全基因合成，再通过连接，环化而成pMVA-3质粒，共2578bp。所 述的pMVA-3质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中第33～632位的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
将构建得到的pMVA-3质粒在大肠杆菌DH5a中进行扩增。
(3)pMVA-4质粒的构建和扩增
将实施例2中所筛选的如SEQ ID NO.5所示的mtDNA核苷酸序列3，与实施例1中pMVA 环化之前的线性序列一起全基因合成，再通过连接，环化而成pMVA-4质粒，共3978bp。所 述的pMVA-4质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其中第33～2032位的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
将构建得到的pMVA-4质粒在大肠杆菌DH5a中进行扩增。
(4)pMVA-5质粒的构建和扩增
将实施例2中所筛选的SEQ ID NO.3所示的mtDNA片段的核苷酸序列1，与实施例1中pMVA-1环化之前的线性序列一起全基因合成，再通过连接，环化而成pMVA-5质粒。所 述的pMVA-5质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中第33～152位的核苷酸序列为插 入的SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。
将构建得到的pMVA-5质粒在大肠杆菌DH5a中进行扩增。
(5)pMVA-6质粒的构建和扩增
将实施例2中所筛选的SEQ ID NO.4所示的mtDNA片段的核苷酸序列2，与上述pMVA-1 环化之前的线性序列一起全基因合成，再通过连接，环化而成pMVA-6质粒。所述的pMVA-6 质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中第33～632位的核苷酸序列为插入的SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。
将构建得到的pMVA-6质粒在大肠杆菌DH5a中进行扩增。
(6)pMVA-7质粒的构建和扩增
将实施例2中所筛选的SEQ ID NO.5所示的mtDNA片段的核苷酸序列3，与实施例1中pMVA-1环化之前的线性序列一起全基因合成，再通过连接，环化而成pMVA-7质粒。所 述的pMVA-7质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其中第33～2032位的核苷酸序列为 插入的SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
将构建得到的pMVA-7质粒在大肠杆菌DH5a中进行扩增。
实施例4、阳离子生物材料的制备
1、阳离子脂质类材料(DOTAP/CHOL复合物或DOTAP)制备方法：
(1)如表1所示，将称量的无热源DOTAP和无热源胆固醇(CHOL)混合，并加入1-1.5L无水乙醇溶液，加热至50℃，搅拌使脂质完全溶解。
(2)在40℃，0.08MPa下旋蒸步骤(1)混合溶液至溶液体积的1/3，用水定容。
(3)将步骤(2)所得溶液经压力为700-800bar高压匀浆机3-10次，以及50℃挤出仪(100nm膜)1-2次后，获得粒径100-150nm，PDI＜0.3阳离子脂质类材料(DOTAP/CHOL 复合物，或DOTAP)。
表1按照不同质量比复合的DOTAP和CHOL
2、PEI聚合物制备方法：
将PEI 25kD用蒸馏水配制成6mg/mL和4mg/mL和0.4mg/mL的溶液。
3、壳聚糖制备方法：
将中分子量壳聚糖用稀酸溶解配制成6mg/mL和4mg/mL和0.4mg/mL的溶液。
实施例5、DNA/阳离子生物材料复合物的制备
将前述筛选的mtDNA或其片段，构建的质粒载体或质粒，与实施例4制备的阳离子生 物材料分别按照表2-4所示的不同浓度在无菌条件下等体积混合，并静置0.5h，以形成DNA/ 阳离子生物材料复合物；
表2不同质量比的DNA/阳离子脂质类材料
表3不同质量比的DNA/PEI 25kD复合物
表4不同质量比的DNA/壳聚糖质复合物
实施例6、DNA/阳离子生物材料复合物的表征：
1、DNA/阳离子生物材料复合物粒径、电位的测定：
(1)配制DNA/阳离子生物材料复合物检测样品：
将灭菌蒸馏水加入到实施例5制备的不同质量比的DNA/阳离子生物材料复合物中，高 速振荡，使复合物溶解，在室温下静置。
(2)检测DNA/阳离子生物材料复合物的粒径和电位
将步骤(1)配制的DNA/阳离子生物材料复合物检测样品加入纳米粒径电位分析仪(Malverl Zetasizer Nano ZS)的样品皿中，放入测试槽，设置平衡时间为1min，每个样品平 行测试3组数据。得到复合物样品的平均粒径和Zeta电位。检测结果如表5-7所示。
表5.不同质量比的DNA/阳离子脂质类材料的粒径电位
质量比(DNA：阳离子脂质) 粒径(nm) PdI zeta电位(mV)
1:1 122 0.215 14.6
1:6 149.1 0.193 23.3
1:10 140.7 0.228 23.0
1:15 134.0 0.238 25.2
1:20 124.1 0.236 23.4
表6.不同质量比的DNA/PEI 25kD复合物的粒径电位
质量比(DNA：PEI25kD) 粒径(nm) zeta电位(mV)
1:1 50.9 19.4
1:10 60.27 25.3
1:20 74.47 34.7
表7.不同质量比的DNA/壳聚糖复合物的粒径电位
质量比(DNA：壳聚糖) 粒径(nm) zeta电位(mV)
1:1 135.4 26.4
1:10 163 28.3
1:20 236.6 51.4
实施例7不同质量比的DNA/阳离子脂质类材料复合物的琼脂糖凝胶电泳检测
(1)制备1％琼脂糖凝胶：称取琼脂糖置于锥形瓶中，加入1×TAE，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，加入DNA染料Golden View，摇匀，制备为1.0％琼脂糖凝胶液。
(2)制备凝胶板：制备好凝胶板后，将步骤(1)中制备的琼脂糖凝胶冷却至65℃，倒入内槽玻璃板上，形成均与胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。
(3)加样：将DOTAP与DNA质量比分别为1:1，6:1，10:1，15:1和20:1的DNA/DOTAP 复合物检测样品，分别与上样缓冲液混合后加入到步骤(2)中制备好的凝胶孔内。
(4)电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm 处时，停止电泳。
(5)采用凝胶成像系统进行拍照保存。
不同质量比的DNA/阳离子脂质类材料复合物的琼脂糖凝胶电泳检测，如图3所示，表 明DNA/DOTAP复合物中DOTAP与DNA的质量比分别为1:1、6:1、10:1、15:1和20:1时， 在琼脂糖凝胶电泳作用下可有效滞留DNA。
实施例8、使用CCK8法检测经pMVA-1/DOTAP复合物处理后的A549细胞活性
(1)细胞铺板培养
将处于对数生长期的A549细胞制备为细胞悬液，并用10％FBS-1640稀释至5×104cells/ml，以100μl/孔接种至细胞培养96孔板，37.0℃，5％CO2条件下培养24h。细胞贴壁后，再更换无血清1640培养基饥饿培养24h。
(2)制备待测样品
将按照不同质量比(DOTAP与pMVA-1质量比分别为1:1,6:1,10:1,15:1和20:1)混合制 备得到的pMVA-1/DOTAP复合物用1640培养基稀释至200μg/ml，然后进行3倍稀释，共9个稀释梯度，分别制备为含有不同DOTAP浓度的检测样品。
(3)加样
将96孔板中1640培养基吸弃，加入步骤(2)的检测样品和对照样品，每个梯度3个平 行，共9个梯度，最后一排作为细胞空白对照，和空白对照。37.0℃，5％CO2培养48h。
(4)CCK-8检测细胞活性
将CCK-8和1640培养基按1:1混匀后，按20μl/孔加至步骤(3)的96孔板中，37.0℃，5％CO2培养2h后，于酶标仪读取OD450nm吸光值。
(5)数据分析
步骤(4)检测得到的吸光值与待测样品浓度梯度拟合4参数曲线，呈倒“S”曲线，根据拟合的曲线计算出半数抑制浓度(IC50)。
不同质量比的pMVA-1/DOTAP复合物体外抑制A549肿瘤细胞活性，如图4所示，表明pMVA-1/DOTAP复合物中DOTAP与pMVA-1质量比分别为1:1、6:1、10:1、15:1和20:1时， 均可有效抑制A549细胞的生长活性。
实施例9、A549细胞检测pMVA-1/PEI 25kD复合物生物学活性
(1)细胞铺板培养
方法同实施例8。
(2)制备待测样品
将按照不同质量比(PEI 25kD与pMVA-1，壳聚糖与pMVA-1质量比分别为1:1,10:1和 20:1)混合制备得到的复合物用1640培养基稀释至200μg/ml，然后进行3倍稀释，共9个稀释梯度，分别制备为含有不同PEI 25kD浓度的检测样品。
(3)加样
方法同实施例8。
(4)CCK-8检测细胞活性
方法同实施例8。
(5)数据分析
方法同实施例8。
不同质量比的pMVA-1/PEI 25kD复合物体外抑制A549肿瘤细胞活性，如图5所示，表 明pMVA-1/PEI 25kD复合物中DOTAP:pMVA-1质量比分别为1:1、10:1和20:1时，均可有效抑制A549细胞的生长活性。
将DNA/PEI复合物制备为肿瘤疫苗，应用于荷瘤小鼠的治疗中，可以有效诱导荷瘤小鼠 的抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤细胞的生长。
实施例10、A549细胞检测pMVA-1/壳聚糖复合物生物学活性
(1)细胞铺板培养
方法同实施例8。
(2)制备待测样品
方法同实施例9，分别制备为含有不同壳聚糖浓度的检测样品。
(3)加样
方法同实施例8。
(4)CCK-8检测细胞活性
方法同实施例8。
(5)数据分析
方法同实施例8。
不同质量比的pMVA-1/壳聚糖复合物体外抑制A549肿瘤细胞活性，如图6所示，表明 pMVA-1/壳聚糖复合物中DOTAP:pMVA-1质量比分别为1:1、10:1和20:1时，均可有效抑制A549细胞的生长活性。
将DNA/壳聚糖复合物制备为肿瘤疫苗，应用于荷瘤小鼠的治疗中，可以有效诱导荷瘤 小鼠的抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤细胞的生长。
实施例11、pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞死亡实验
1.PI-AnnexinV法检测A549细胞死亡
(1)A549细胞种板：
将处于对数生长期的A549细胞制备成单细胞悬液，以每孔约1×105个细胞接种于6孔 板中，每孔加入2ml培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养24-36h。
(2)制备加样样品：
a.将5mg/ml的pMVA-1质粒载体溶液加入到100μl 1640无血清培养基中，制备为pMVA-1质粒载体对照组；
b.将1mg/ml的DOTAP阳离子脂质溶于100μl 1640无血清培养基中，制备为DOTAP阳离子脂质对照组；
c.将实施例5制备的质量比为1:6的pMVA-1/DOTAP复合物溶解于100μl 1640无血清培 养基中，制备为pMVA-1/DOTAP复合物实验组。
(3)加样处理A549细胞：
吸出上述步骤(1)6孔板中部分培养基，使每孔培养基体积为900μl。将上述步骤(2) 中制备好的实验组pMVA-1/DOTAP复合物(pMVA-DOTAP)，及对照组pMVA-1质粒载体(PMVA)、DOTAP阳离子脂质(DOTAP)分别加入到步骤(1)中所培养的A549细胞中， 使总体积为1ml。同时设置只含有培养基的空白对照组(Control)。于37℃、5％CO2培养箱 中孵育24h。
(4)PI-Annexin V染色标记
将上述步骤(3)经不同样品处理过的A549细胞用PBS洗涤2次，取凋亡试剂盒(Annexin V-PI检测试剂盒，美国BD Biosciences公司)中Binding Buffer500μl加入每孔中，并加入10 μl PI及10μl Annexin V进行染色，于室温下，暗处孵育15min。
(5)荧光显微镜观测：
将上述步骤(4)经PI和Annexin V染色后的细胞用PBS洗涤1次，置于荧光显微镜下观测，并保存图像。
(6)PI-AnnexinV法检测A549细胞死亡结果：
如图7A所示，A549细胞经pMVA-1/DOTAP复合物处理24h后，有大量PI阳性和AnnexinV阳性细胞，而对照组pMVA-1质粒载体组和DOTAP阳离子脂质组则无明显的PI 摄取和无明显的AnnexinV标记的阳性细胞。此实验结果表明pMVA-1/DOTAP复合物可协同 诱导A549细胞死亡。
2.PI-AnnexinV法检测CT26细胞死亡
(1)实验方法：同上述1
(2)PI-AnnexinV法检测CT26细胞死亡结果：
如图7B所示，CT26细胞经pMVA-1/DOTAP复合物处理24h后，有大量PI阳性和AnnexinV阳性细胞，而对照组pMVA-1质粒载体组和DOTAP阳离子脂质组则无明显的PI 摄取和无明显的AnnexinV标记的阳性细胞。此实验结果表明pMVA-1/DOTAP复合物可协同 诱导CT26细胞死亡。
3、流式细胞术检测A549细胞死亡
(1)A549细胞种板：
方法同上述1(1)
(2)制备加样样品：
方法同上述1(2)，其中，DOTAP阳离子脂质浓度分别为4μg/ml,8μg/ml,16μg/ml和32μg/ml，并以DOTAP阳离子脂质浓度表示pMVA-1/DOTAP复合物的浓度。
(3)加样处理A549细胞：
方法同上述1(3)
(4)流式细胞术定量检测A549细胞死亡
a.用冷的PBS洗涤上述步骤(3)经不同样品处理后的A549细胞2次，用1×结合缓冲液重悬细胞，制备为密度1×106个细胞/ml的细胞悬液；
b.取上述步骤a制备得到的A549细胞悬液100μl于流式检测管中；
c.将5μl FITC Annexin V和5μl PI加入到上述步骤b的流式检测管中，轻轻混匀，于暗 处、室温孵育15min；
d.将400μl 1×结合缓冲液加入到上述步骤c的流式检测管中，并用流式细胞仪检测。
(5)流式细胞术定量检测A549细胞死亡结果：
与只加了培养基的空白对照组相比，对照组pMVA-1质粒载体组(PMVA)的A549细胞和DOTAP阳离子脂质组(DOTAP)的A549细胞中Annexin-V单阳性、PI单阳性及PI/ Annexin-V双阳性细胞未明显增加，而实验组pMVA-1/DOTA复合物组(PMVA-DOTAP)与 空白对照组和对照组相比，其PI和Annexin-V的摄取均有显著增加，且死亡细胞比例随着 pMVA-1/DOTAP复合物浓度的增加而增加，呈现明显的剂量依赖关系。如图8A所示，在 pMVA-1/DOTAP复合物浓度为4μg/ml,8μg/ml,16μg/ml和32μg/ml时，总的死亡细胞(包 括坏死细胞和凋亡细胞)比例分别为1.68％、21.63％、57.22％、65.37％。
4、流式细胞术检测CT26细胞死亡
(1)实验方法：同上述3，其中，DOTAP阳离子脂质浓度分别为2μg/ml,4μg/ml,8μ g/ml和16μg/ml，并以DOTAP阳离子脂质浓度表示实验组pMVA-1/DOTAP复合物的浓度。
(2)流式细胞术检测CT26细胞死亡结果：
如图8B所示，在CT26细胞中可观察到与A549细胞相似的实验结果，即pMVA-1/DOTAP 复合物可协同诱导肿瘤细胞死亡。
以上实验结果表明，pMVA-1质粒和DOTAP阳离子脂质分别单独作用于肿瘤细胞时，均 不能使肿瘤细胞发生凋亡或者坏死，但是当pMVA-1质粒与DOTAP阳离子脂质形成 pMVA-1/DOTAP复合物作用于肿瘤细胞时，能诱导肿瘤细胞死亡，而这种凋亡或坏死的过程 不同于DOTAP阳离子脂质单独在无血清条件下所引起肿瘤细胞发生快速的死亡，是一个缓 慢的死亡过程。
实施例12、H2DCF-DA荧光分子探针法检测pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞内ROS水平增加
(1)加样：使用培养基(空白对照组，control)、pMVA-1质粒(对照组PMVA)、DOTAP阳离子脂质(对照组DOTAP)、pMVA-1/DOTAP复合物(实验组PMVA-DOTAP)分别处理 A549细胞3h，并设置阴性对照组(NAC)：在pMVA-1/DOTAP复合物作用前使用5mM NAC 进行预处理，阳性对照组(H2O2)：在A549细胞中加入200μM H2O2。
(2)收集上述步骤(1)不同组的A549细胞，并用无菌PBS洗涤，离心后无菌PBS重 悬细胞；
(3)在上述步骤(2)制备得到的重悬细胞中加入10M CM-H2DCFDA荧光探针(美国Sigma公司)，37℃孵育0.5h后PBS洗涤并重悬；
(4)流式细胞仪(Novocyte)检测上述步骤(3)的重悬细胞，Novoexpress软件分析检 测结果。
(5)实验结果：
如图9所示，与空白对照组、对照组PMVA和DOTAP组相比，经pMVA-1/DOTAP复合 物作用后的A549细胞，其细胞内的ROS水平显著增加(*P﹤0.05)；阴性对照组在 pMVA-1/DOTAP复合物处理细胞前使用5mM NAC进行预处理，可观测到该组细胞内ROS 水平明显降低；阳性对照组为200μM H2O2处理的细胞，可观测到其ROS水平明显增高(*P ﹤0.05)。
由此可见，pMVA-1/DOTAP复合物可协同诱导A549细胞内ROS水平显著增加。
实施例13、pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞ROS增加的机制研究
实施例12已证明pMVA-1/DOTAP复合物可协同诱导A549细胞ROS水平上升。为了探究在pMVA-1/DOTAP复合物中质粒氧化程度对于肿瘤细胞死亡的影响，将pMVA-1质粒用1000mJ/cm2UV照射氧化，再与DOTAP阳离子脂质形成复合物作用于A549细胞。如图10 所示，ox-PMVA-1/DOTAP复合物作用24h后的A549细胞，与pMVA-1/DOTAP复合物组相 比，A549细胞死亡数显著增加。
该实验结果表明，pMVA-1/DOTAP复合物对肿瘤细胞的杀伤性与pMVA-1质粒在肿瘤细 胞内受氧化应激作用有关。
实施例14、pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞死亡与肿瘤细胞发生氧化应激有 关
实施例12已证明N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)作为一种抗氧化剂，对 pMVA-1/DOTAP复合物诱导肿瘤细胞ROS水平增加具有明显的抑制作用。为了进一步证实 pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞死亡是否与肿瘤细胞的氧化应激有关，采用流式细 胞术检测实施例12中在加入pMVA-1/DOTP复合物前经NAC预处理的A549细胞死亡比例。 如图11所示，在pMVA-1/DOTP复合物作用A549细胞前，用NAC预处理细胞，可以显著 减少A549细胞的死亡比例。进一步证明，pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞死亡与 肿瘤细胞发生氧化应激有关。
实施例15、pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞溶酶体破裂
1、YOYO1荧光探针法检测pMVA-1/DOTAP复合物进入A549细胞
(1)YOYO1染料(美国Life公司)荧光标记pMVA-1质粒：
a.配制YOYO1工作液：将YOYO1原液用1640无血清培养基按照1:200的体积比进行稀释。
b.将pMVA-1质粒按照1:40体积比加入上述步骤(1)中所配制好的YOYO1工作液，37℃孵育1h。
(2)YOYO1荧光标记的pMVA-1/DOTAP复合物处理A549细胞：
a.将上述步骤1制备得到的YOYO1荧光标记pMVA-1质粒与DOTAP阳离子脂质混合形成复合物
b.将上述a制备得到的YOYO1荧光标记的pMVA-1/DOTAP复合物加入到A549细胞中，并设置对照组：YOYO1荧光标记的pMVA-1质粒组(PMVA)，DOTAP阳离子脂质组 (DOTAP)，以及只含有细胞培养液的空白对照组(control)。
2、Lysotracker Red荧光探针法检测pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导A549细胞溶酶体 酸度梯度丧失
(1)配制Lysotracker Red工作液：取Lysotracker Red原液按1:20000的体积比加入到细 胞培养液中，于37℃温育。
(2)Lysotracker Red(中国碧云天公司)荧光标记A549细胞溶酶体：
a.去除上述步骤1中A549细胞培养液，并在细胞中加入上述步骤(1)配制好的Lysotracker Red染色工作液，于37℃共孵育1h；
b.去除上述步骤a中Lysotracker Red染色工作液，并加入新鲜的细胞培养液，并分别于 0.5h和3h在荧光显微镜下观察并采集荧光细胞图像；
c.收集上述步骤b中的A549细胞，流式细胞术定量检测荧光细胞数。
3、FITC-Dextran细胞定位法检测pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导A549细胞溶酶体膜 通透性增加
(1)A549细胞种板：将处于对数生长期的A549细胞制备为细胞悬液，以1×105个细胞/孔接种于6孔板中，每孔加入2ml培养基，于37℃、5％CO2培养箱内培养过夜。
(2)在步骤(1)中的细胞培养基内加入终浓度为1mg/ml的FITC-Dextran(美国Sigma 公司)，37℃避光孵育4h。
(3)无菌PBS洗涤上述步骤(2)的细胞2次，加入1640培养基，分别用培养基(空 白对照组)、pMVA-1质粒(对照组PMVA)、DOTAP阳离子脂质(对照组DOTAP)以及 pMVA-1/DOTAP复合物(实验组PMVA-DOTAP)作用A549细胞。37℃避光孵育3h。
(4)将上述步骤(3)的细胞经PBS洗涤2次，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗两次， 封片。共聚焦显微镜下观察荧光细胞并采集图像。
4、CathepsinB细胞内定位法检测pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导A549细胞溶酶体膜 通透性增加
(1)A549细胞种板：将圆形灭菌细胞爬片置于6孔板底，以1×105个细胞/孔将A549细胞接种于6孔板中，每孔加入2ml培养基，过夜培养。
(2)分别将培养基(空白对照组)、pMVA-1质粒(对照组PMVA)、DOTAP阳离子脂 质(对照组DOTAP)以及pMVA-1/DOTAP复合物(实验组PMVA-DOTAP)加入到上述步 骤(1)培养的A549细胞中，37℃孵育3h。
(3)PBS洗涤上述步骤(2)中经不同组作用的A549细胞2次，冰甲醇固定3min，PBS洗2次，用含5％FBS的0.3％Triton的PBST封片20min。
(4)将上述步骤(3)中的细胞用PBS洗1次，用1:300比例稀释人CathepsinB抗体(美国Abcam公司)，室温孵育1h后，PBS洗3次，每次5min，加入1:1000荧光二抗，室 温避光孵育1h。
(5)将上述步骤(4)中的细胞用PBS洗3次，用超纯水洗片子，除去多余水分，防荧光淬灭剂封片。固化6h，于共聚焦显微镜下观察荧光细胞并采集图像。
5、pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞溶酶体破裂实验结果：
(1)pMVA-1/DOTAP复合物进入A549细胞且协同诱导细胞溶酶体酸度梯度丧失
YOYO1荧光探针标记的pMVA-1质粒与DOTAP阳离子脂质形成复合物作用于A549细胞后，可用于pMVA-1/DOTAP复合物的示踪，再用Lysotracker Red标记A549细胞的溶酶体，分别于0.5h和3h，在荧光显微镜下采集荧光细胞图像。如图12所示，空白对照组的A549 细胞Lysotracker Red荧光强度高；经pMVA-1/DOTAP复合物处理0.5h后A549细胞，在细胞 膜及胞质边缘开始可见YOYO1标记的pMVA-1质粒，且溶酶体Lysotracker Red荧光强度出 现略微下降；当pMVA-1/DOTAP复合物作用3h后，YOYO1标记的pMVA-1质粒大量进入 胞质，溶酶体中的Lysotracker Red荧光强度显著下降，表明pMVA-1/DOTAP复合物进入A549 细胞诱导细胞溶酶体发生酸度梯度变化。
(2)流式细胞术定量检测经不同组作用的A549细胞溶酶体中Lysotracker Red荧光强度
如图13所示，Lysotracker Red荧光强度在空白对照组、对照组pMVA-1质粒组和DOTAP 阳离子脂质组作用1h、3h、6h和9h后没有显著变化；荧光强度在pMVA-1/DOTAP复合物组， 处理后1h有18.49％A549细胞Lysotracker Red荧光强度下降，在处理3h后，有76.18％A549 细胞的红色荧光强度下降。
以上实验结果表明，pMVA-1/DOTAP复合物可进入肿瘤细胞，且协同诱导肿瘤细胞溶酶 体酸度梯度失衡，且随复合物作用时间的延长，溶酶体酸度梯度丧失程度逐渐增强，溶酶体 逐渐溶解。在复合物作用1h后即出现肿瘤细胞溶酶体酸度梯度的丧失；在复合物作用3h时， 溶酶体酸度梯度的丧失已达到最大程度。
(3)FITC-Dextran细胞定位法检测A549细胞溶酶体膜通透性变化实验结果
FITC-Dextran是20kD的葡聚糖，可通过胞吞作用而进入溶酶体中。用1mg/ml的FITC-Dextran作用A549细胞3h后，使用不同组样品处理细胞，置于共聚焦显微镜下观察荧光细胞。如图14A所示，空白对照组(control)、对照组pMVA-1质粒组(PMVA)及DOTAP 阳离子脂质组(DOTAP)的A549细胞胞质内可观察到点状分布的FITC-Dextran；在 pMVA-1/DOTAP复合物组(PMVA-DOTAP)可观察到弥散分布的FITC-Dextran，表明溶酶体 膜通透性增加(LMP)。
(4)CathepsinB细胞内定位法检测A549细胞溶酶体膜通透性变化引起CathepsinB从溶 酶体中释放的实验结果
当溶酶体膜通透性发生改变时，溶酶体内的水解酶会从溶酶体内转移到细胞胞质中。因 此为了进一步证明溶酶体膜通透性增加，采用对溶酶体内的组织蛋白酶B(Cathepsin B)进 行免疫荧光染色，并对其示踪。如图14B所示，空白对照组(control)、对照组pMVA-1质粒 组(PMVA)及DOTAP阳离子脂质组(DOTAP)的Cathepsin B在A549细胞胞质中呈点状 分布；pMVA-1/DOTAP复合物组(PMVA-DOTAP)的Cathepsin B在胞质和细胞核呈弥散分 布，表明pMVA-1/DOTAP复合物可协同诱导A549细胞溶酶体膜通透性增加，使溶酶体内的 水解酶释放入进细胞质中。
以上实验结果表明，pMVA-1/DOTAP复合物进入肿瘤细胞后，协同诱导细胞溶酶体膜通 透性增加，促使溶酶体破裂，使溶酶体内的水解酶释放入细胞质中。
实施例16、pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导肿瘤细胞线粒体膜电位下降
(1)肿瘤细胞种板：分别将处于对数生长期的A549细胞和CT26细胞制备为细胞悬液， 以1×105个细胞/孔接种于6孔板中，每孔加入2ml培养基，于37℃、5％CO2培养箱内培养 过夜。
(2)加入不同样品作用肿瘤细胞：将pMVA-1质粒、DOTAP阳离子脂质、pMVA-1/DOTAP
复合物分别加入到上述步骤(1)所培养的肿瘤细胞中，于37℃共孵育15h、18h、21h和 24h。
(3)配制TMRM染色工作液(美国Life公司)：用PBS按1:100000将TMRM母液稀 释成TMRM染色工作液。
(4)吸弃上述步骤(2)中的细胞培养液，并沿孔板壁加入预热的上述步骤(3)配制的 TMRM染色工作液，于37℃避光孵育20min。
(5)收集上述步骤(4)的肿瘤细胞，流式细胞术检测分析经不同样品作用不同时间后 线粒体膜电位变化的肿瘤细胞。
四甲基罗丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM)，作为电势测定荧光探针， 进入细胞后，被细胞内酯酶剪切，产生四甲基罗丹明。四甲基罗丹明进入线粒体后，呈现强 烈荧光。当线粒体膜通道孔开放，四甲基罗丹明从线粒体中释放到细胞质中，同时其荧光强 度也显著降低。因此，可通过检测肿瘤细胞线粒体内荧光强度的变化，来验证线粒体膜通道 孔的开放状态。
如图15A所示，经pMVA-1/DOTAP复合物作用的A549细胞，在15h，18h，21h，24h 分别有31.73％,41.80％,51.76％,55.03％的细胞线粒体膜电位下降，而空白对照组和对照组pMVA-1质粒组和DOTAP阳离子脂质组的A549细胞线粒体膜电位没有显著变化；如图15B 所示，经pMVA-1/DOTAP复合物作用的CT26细胞，在15h，18h，21h和24h分别有15.95％、35.85％、50.18％、52.18％的细胞线粒体膜电位下降，而空白对照组和对照组的CT26细胞线 粒体膜电位则无显著变化。
以上实验结果表明：pMVA-1/DOTAP复合物在协同诱导肿瘤细胞溶酶体破裂后，可造成 肿瘤细胞的线粒体膜电位去极化，导致线粒体膜通道孔开放，显著改变线粒体通透性，使得 线粒体内容物释放到细胞质中。
实施例17、pMVA-1/DOTAP复合物诱导肿瘤细胞中Caspase蛋白酶的激活
(1)A549细胞种板：将处于对数生长期的A549细胞制备为细胞悬液，以1×105个细胞/孔接种于6孔板中，每孔加入2ml培养基，于37℃、5％CO2培养箱内培养过夜。
(2)加样：在步骤(1)所培养的A549细胞中加入pMVA-1/DOTAP复合物，作用12h 和24h，并设置空白对照组。
(3)待测样品制备：吸取上述步骤(2)的细胞培养液，并收集上述步骤(2)的A549细胞，使用吸取的细胞培养液悬浮。600g 4℃离心5min收集细胞，吸取上清，PBS洗涤细胞 1次，再次吸取上清后，加入裂解液，重悬细胞并沉淀，冰浴裂解15min。把上清转移到冰浴 预冷的离心管中。
(4)取上述步骤(3)少量样品用Bradford法测定蛋白浓度。
(5)检测上述步骤(3)制备的待测样品中Caspase 3、caspase8、caspase9酶活性：
a.取出适量的底物，置于冰浴上备用。
b.如表8设置反应体系：
表8.Caspase酶活性检测的反应体系
c.在上述步骤b的反应体系中加入步骤a的底物后混匀，37℃孵育60-120min。发现颜 色变化较明显时即可测定A405。
d.样品的A405减去空白对照的A405，即为样品中caspase3、Caspase8和Caspase9催化 产生的pNA的吸光度。通过标准曲线的对比计算样品中催化产生的pNA量。
e.根据上述步骤(3)Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算一个样品单位重量蛋 白中所含的caspase的酶活力单位。
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋 白酶家族。如图16所示，较空白对照组，经pMVA-1/DOTAP复合物作用12h和24h后，Caspase3, Caspase8和Caspase9均有不同程度的显著上升，且具有时间依赖性的特点。
实施例18、pMVA-1/DOTAP复合物协同诱导抗肿瘤的天然免疫反应
(1)从小鼠骨髓前体细胞中分离培养小鼠树突状细胞(BMDC)
a.从小鼠股骨和胫骨获得骨髓细胞，经筛网后收于离心管内，室温280g离心5min，弃 上清。
b.在上述步骤a的细胞中加入10ml红细胞裂解液。室温静置3min，室温280g，离心5min，弃上清。
c.用PRMI-1640培养基洗涤上述步骤b的骨髓细胞2次，室温280g，离心10min。活细胞计数，RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度至1×106个/ml。
d.在上述步骤c中加入终浓度10ng/ml重组小鼠GM-CS，将4ml/孔的细胞悬液接种于 6孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待板底长出细胞集落，吸出培养基，用培养基洗1次，每孔加入含10ng/ml GM-CSF的1640完全培养基。
e.收集上述步骤d中脱离的细胞，即BMDC细胞，室温280g离心5min，弃上清，用 含10ng/ml GM-CSF的1640完全培养基重悬细胞，以每孔1×106个/ml将细胞接种于6孔板 中待用。
(2)流式细胞术检测BMDC对模式抗原FITC-Dextran的摄取
a.收集上述步骤1所培养的BMDC细胞，分别用培养基、pMVA-1质粒、DOTAP阳离 子脂质、pMVA-1/DOTAP复合物作用24h；以及设置CT26细胞刺激DC组：包括CT26细胞， 经pMVA-1质粒处理过的CT26细胞，经DOTAP阳离子脂质处理过的CT26细胞，经 pMVA-1/DOTAP复合物处理过的CT26细胞，共孵育24h。
b.按照每孔1×106个细胞/ml将上述步骤a中的细胞铺至24孔板中，并加入终浓度为1 mg/ml的FITC-Dextran，于37℃共孵育1h。
c.PBS洗涤上述步骤b的细胞1次，加入anti-CD11b-PE、anti-CD11c-Percp5.5对细胞进 行染色。PBS洗涤并重悬细胞，4℃避光待检。
d.流式细胞术检测分析BMDC细胞的荧光强度。
(3)流式细胞术检测BMDC细胞分泌的细胞因子
a.收集上述步骤1培养至第6天的BMDC细胞，分别加入培养基，CT26细胞，经pMVA-1质粒作用3h的CT26细胞、经DOTAP脂质作用3h的CT26细胞、以及经pMVA-1/DOTAP 复合物作用3h的CT26细胞，共孵育24h。
b.收集上述步骤a中的细胞，PBS洗1次。分别将anti-CD11b-PE、anti-CD11c-Percp5.5 抗体加入流式管中，4℃避光孵育30min。
c.将上述步骤b中的BMDC细胞用PBS洗2次，染间标胞内细胞因子抗体，每管加入 1μl抗体，4℃过夜孵育。
d.将上述步骤c中染色孵育的BMDC细胞用PBS洗2次，染间标荧光二抗和直标一抗，室温避光孵育30min后用PBS洗涤细胞2次，流式细胞仪检测分析BMDC的IFN-β和IL-1β 分泌量。
DC细胞的成熟伴随着对抗原摄取能力的下降，因此，可通过检测DC细胞抗原摄取能力 来判断DC细胞是否被诱导成熟。采用FITC-Dextran作为DC细胞吞噬的模式抗原，通过检 测CD11c阳性DC细胞的FITC平均荧光强度来判断DC细胞对抗原的摄取能力。如图17所示，只经pMVA-1质粒、DOTAP阳离子脂质作用的DC细胞与空白对照组的有着类似的FITC 平均荧光强度值；经pMVA-1/DOTAP复合物作用的DC细胞，以及CT26细胞刺激的DC， 和分别经pMVA-1质粒、DOTAP阳离子脂质、pMVA-1/DOTAP复合物作用的CT26细胞刺激 的DC，其FITC平均荧光强度均有显著下降。此实验结果表明，pMVA-1/DOTAP复合物及肿 瘤细胞的刺激可抑制DC细胞的抗原摄取能力，能够促进DC细胞的成熟。
经pMVA-1/DOTAP复合物作用的CT26细胞能否刺激体外培养的BMDC分泌细胞因子，实验结果如图18所示，与空白对照组、pMVA-1质粒组、和DOTAP阳离子脂质组相比，经 pMVA-1/DOTAP复合物作用的CT26细胞所刺激BMDC的IFN-β和IL-1β分泌量均显著增 加。此实验结果表明，经pMVA-1/DOTAP复合物作用的肿瘤细胞可有效激活了STING通路， 诱导DC细胞分泌杀伤肿瘤细胞的细胞因子。
以上实验数据表明，pMVA-1/DOTAP复合物不仅可以直接诱导DC细胞的成熟，而且经 pMVA-1/DOTAP复合物作用的肿瘤细胞可以更好地激活DC细胞分泌抗肿瘤的细胞因子的功 能，以行使天然免疫反应。
实施例19、DNA/阳离子生物材料复合物治疗不同肿瘤模型小鼠实验
1、pMVA-1/DOTAP复合物可抑制宫颈癌腹腔转移裸鼠的肿瘤生长
饲养6-8周龄Balb/c雌性裸鼠。将培养至对数生长期的人源宫颈癌Hela细胞制备为细胞 悬液，采用腹腔注射的方式建立裸鼠腹腔宫颈癌腹腔转移模型，每只裸鼠注射细胞数为1× 107，每只裸鼠注射体系为200μl。
将建模成功的裸鼠按照表9随机分成4组：生理盐水组(NS)、DOTAP组(空载体组)、pMVA-1组(空药物组)和pMVA-1/DOTAP组(治疗组)。在Hela细胞接种后第3天，各实 验组按照表9分别给药，每3天腹腔给药一次，并记录各组实验鼠体重。腹腔给药4次后， 即第12d时，对照组(pMVA-1)组有1只裸鼠死亡，而且除治疗组外的其余3组裸鼠均出现 明显腹水，处死全部裸鼠。取裸鼠腹水，测腹水量，计数腹水中癌细胞量，流式细胞仪检测 腹水中凋亡细胞，吉姆萨染色观测腹水细胞；摘取肿瘤，并称量肿瘤重量；肿瘤及组织器官 多聚甲醛固定后进行免疫组化检测。
表9.pMVA-1/DOTAP复合物治疗宫颈癌腹腔转移模型裸鼠的分组情况及给药剂量
实验结果如图19所示：治疗组pMVA-1/DOTAP裸鼠体重(图19A)、腹水量(图19B)、肿瘤结节数(图19C)、以及瘤重(图19D)都显著低于其他各对照组(P＜0.01)；如图20 所示：治疗组的腹水凋亡细胞比例显著高于其他各对照组(P＜0.05)。此外，肿瘤组织切片 HE染色结果表明：治疗组的肿瘤组织中有大量的炎性细胞浸润，而其他对照组中则无或很少 有炎性细胞浸润；以吉姆萨染色观察腹水中的细胞，较对照组，pMVA-1/DOTAP复合物显著 抑制了裸鼠腹腔中肿瘤细胞和红细胞的生成；通过对裸鼠心肝脾肺肾HE染色发现各组裸鼠没有出现治疗相关的组织病变，可认为pMVA-1/DOTAP复合物具有较好的生物安全性。
由此可见，与对照组相比，pMVA-1/DOTAP复合物可直接通过天然免疫反应诱导宫颈癌 细胞凋亡，显著抑制宫颈癌细胞的生长。
2、质粒DNA/DOTAP复合物可抑制卵巢癌腹腔转移裸鼠的肿瘤生长
饲养6-8周龄Balb/c裸鼠。将培养至对数生长期的人源卵巢癌细胞系SKOV3制备为细 胞悬液，采用腹腔注射的方式建立小鼠腹腔肿瘤模型，每只小鼠注射细胞数为1×107，每只小 鼠注射体系为200μl。
将建模成功后的裸鼠按表10随机分成8组。接瘤后2天开始腹腔给药，对照组质粒DNA 组给予每只小鼠给质粒10μg；对照组DOTAP组给予每只小鼠DOTAP 100μg；治疗组质粒DNA/DOTAP复合物组给予剂量为每只小鼠质粒DNA 10μg，DOTAP 100μg，即质粒DNA 与DOTAP质量比为1:10。以后每三天给药一次，到接瘤后第35天处死全部小鼠，共给药10 次。
表10.质粒DNA/DOTAP复合物治疗卵巢癌腹腔转移模型裸鼠的分组情况及给药剂量
小鼠腹腔给药10次后，除阴性对照组有一只小鼠自然死亡之外，其余实验小鼠全部处死， 取小鼠腹水，测腹水量，计数腹水中癌细胞量。
实验结果如图21所示：3个治疗组质粒DNA/DOTAP裸鼠的腹水量(图21A)、瘤重(图21B)、以及腹水癌细胞数(图21C)都显著低于其他各对照组(P＜0.01)。
由此可见，与对照组相比，治疗组质粒DNA/DOTAP复合物可直接通过天然免疫反应诱 导卵巢癌细胞凋亡，可显著抑制卵巢癌细胞的生长。
3、质粒DNA/DOTAP复合物可抑制CT26腹腔转移小鼠的肿瘤生长
饲养6-8周龄Balb/c小鼠。将培养至对数生长期的小鼠结直肠癌细胞系CT26制备为细 胞悬液，采用腹腔注射的方式建立小鼠腹腔肿瘤模型，每只小鼠注射细胞数为1×106，每只小 鼠注射体系为100μl。
将建模成功的小鼠按照表11进行分组，于接瘤后第5天开始腹腔给药，对照组质粒DNA 组给予每只小鼠质粒DNA 10μg；对照组DOTAP组给予每只小鼠DOTAP 100μg；治疗组质粒DNA/DOTAP复合物组给予剂量为每只小鼠质粒DNA 10μg，DOTAP 100μg，即质粒DNA 与DOTAP质量比为1:10。以后每三天给药一次，共给药5次。
表11.质粒DNA/DOTAP复合物治疗CT26结直肠癌腹腔转移模型小鼠的分组情况及给药剂量
小鼠腹腔给药5次，到第3次给药后第2天，即接瘤后第13天，每组各处死2只；第4次给药后第1天，即接瘤后第15天，每组各处死3只；第5次给药第4天，即接瘤后21天， 每组各处死5只，取小鼠腹水，测量腹水量，计算腹水癌细胞数，流式细胞检测腹水凋亡细 胞；摘取肿瘤，并称量肿瘤；肿瘤及组织器官用多聚甲醛固定后进行免疫组化检测。其余小 鼠则让其自然死亡，并进行无瘤统计。
实验结果如图22所示：3个治疗组质粒DNA/DOTAP小鼠的自然死亡数显著低于其他对 照组(P＜0.01或P＜0.05)(图22A)；治疗组pMVA-3/DOTAP小鼠的瘤重(图22B)、腹水 量(图22C)、腹水癌细胞数(图22D)、以及肿瘤结节数(图22E)都显著低于其他各对照 组(P＜0.01或P＜0.05)；
由此可见，与对照组相比，治疗组质粒DNA/DOTAP复合物抑制结直肠癌CT26细胞的生长。
4、pMVA-1/DOTAP复合物可抑制小鼠肉瘤的生长
饲养6-8周龄昆明小鼠。将培养至对数生长期的小鼠肉瘤细胞系S180制备为细胞悬液， 每只小鼠的右腋部皮下注射的方式建立小鼠皮下肿瘤模型，每只小鼠注射细胞数为1×107，每 只小鼠注射体系为200μl。
接种完S180肉瘤细胞后第5天，可触及肿瘤时，将40只成瘤小鼠按照表12随机分为4 组：阴性对照组(NS)，对照组：DOTAP组、pMVA-1组，和治疗组pMVA-1/DOTAP组。并 按照表12开始皮下给药，对照组pMVA-1组给予每只小鼠质粒pMVA-1 2.5μg；对照组DOTAP 组给予每只小鼠DOTAP 25μg；治疗组pMVA-1/DOTAP复合物组给予剂量为每只小鼠质粒 DNA 2.5μg，DOTAP 25μg，即质粒DNA与DOTAP质量比为1:10。以后每三天给药一次， 共给药5次。接瘤后的21天，处死小鼠，并统计小鼠的无瘤率。
表12.pMVA-1/DOTAP复合物治疗S180肉瘤细胞皮下模型的小鼠分组情况及给药剂量
实验结果如图23所示，治疗组pMVA-1/DOTAP组小鼠的无瘤率为90％，显著高于其他 各对照组，NS组无瘤率为1％，DOTAP组和pMVA-1组均为20％。
由此表明，pMVA-1/DOTAP复合物可显著抑制小鼠肉瘤的生长。
5、pMVA-1/DOTAP复合物可抑制小鼠鼻咽癌的生长
饲养6-8周龄Balb/c裸鼠。将培养至对数生长期的人鼻咽癌细胞系CNE-2制备为细胞悬 液，每只小鼠的右腋部皮下注射的方式建立小鼠皮下肿瘤模型，每只小鼠注射细胞数为1×107， 每只小鼠注射体系为200μl。
将建模成功后的裸鼠按表13随机分成4组。接瘤后5天,可触及肿瘤时开始皮下给药， 对照组pMVA-1组给予每只小鼠给质粒4μg；对照组DOTAP组给予每只小鼠DOTAP 40μg；治疗组pMVA-1/DOTAP复合物组给予剂量为每只小鼠质粒DNA 4μg，DOTAP 40μg，即质 粒DNA与DOTAP质量比为1:10。以后每三天给药一次，到接瘤后第21天处死全部小鼠， 共给药5次，测量每组小鼠的肿瘤体积。
表13.pMVA-1/DOTAP复合物治疗CNE-2细胞皮下模型的小鼠分组情况及给药剂量
实验结果如图24所示，治疗组pMVA-1/DOTAP小鼠肿瘤体积显著低于其他各对照组， 表明pMVA-1/DOTAP复合物可显著抑制人鼻咽癌细胞皮下模型小鼠的肿瘤生长。
6、DNA/DOTAP复合物激活CT26腹腔转移模型的小鼠长期免疫应答
实验(1)：质粒DNA/DOTAP复合物治疗CT26腹腔转移模型小鼠
饲养6-8周龄Balb/c小鼠。将培养至对数生长期的小鼠结直肠癌细胞系CT26制备为细 胞悬液，采用腹腔注射的方式建立小鼠腹腔肿瘤模型，每只小鼠注射细胞数为2×105，每只小 鼠注射体系为100μl。
将建模成功后的小鼠按照表14进行分组，其中Normal组为不接种肿瘤细胞不给药组； untreated组为腹腔接种CT26细胞，但不给药；NS组为腹腔接种肿瘤细胞，给予生理盐水组。 接瘤后，第3天开始腹腔给药，治疗组质粒DNA/DOTAP复合物组给予剂量为每只小鼠质粒 DNA 15μg，DOTAP 75μg，即质粒DNA与DOTAP质量比为1:5。以后每三天给药一次， 共给药9次。
表14.质粒DNA/DOTAP复合物治疗CT26结直肠癌腹腔转移模型小鼠的分组情况及给药剂量
小鼠共给药9次，任由小鼠自然死亡，记录各实验组小鼠的自然死亡日期，统计各实验 组小鼠的体重、生存期；统计腹水量，摘取肿瘤并称重。
实验结果如图25所示，治疗组pMVA-1/DOTAP小鼠与正常组小鼠体重没有明显差异， 说明pMVA-1/DOTAP复合物对小鼠没有明显毒性(图25A)；pMVA-1/DOTAP组小鼠平均腹水量为0.3ml，显著低于阴性对照组小鼠平均腹水量1.91ml、pMVA-1组小鼠平均腹水量2.22ml 和DOTAP组小鼠平均腹水量3.11ml(图25B)。在接种肿瘤细胞后第54、57、39天，阴性对照组、pMVA-1组、DOTAP组小鼠全部死亡，pMVA-1/DOTAP组小鼠在肿瘤接种后第78 天，仍有小鼠存活。pMVA-1/DOTAP组小鼠生存期明显长于其他实验组(图25C)。小鼠死 亡后取腹腔肿瘤并称重，pMVA-1/DOTAP组小鼠平均瘤重为2.92g，阴性对照组小鼠平均瘤 重为7.91g、pMVA-1组小鼠平均瘤重为7.35g、DOTAP组小鼠平均瘤重为8.23g。与阴性对 照组、pMVA-1组和DOTAP组相比，pMVA-1/DOTAP组小鼠瘤重明显减轻(图25D)。
由此可见，pMVA-1/DOTAP复合物具有显著抑制体内肿瘤细胞生长的作用。
实验(2)：经质粒DNA/DOTAP复合物治疗后CT26腹腔转移模型小鼠对肿瘤细胞再次刺激的长期免疫应答实验
对于上述实验(1)小鼠给药9次后，治疗组pMVA-1/DOTAP共有27只小鼠腹腔瘤全部消除，将这27只小鼠按照表15重新分组；此外，选取同一批次的Normal组中14只小鼠按 照表15分组。在上述实验(1)第9次给药的第二天，根据表15的分组情况，分别皮下接种 小鼠结直肠癌细胞CT26 1×106个和小鼠乳腺癌细胞4T1 1×106个。每3天测量各组小鼠皮下 肿瘤的体积大小，肿瘤体积按以下公式计算：V＝a×b2×0.52，a代表肿瘤长径，b代表肿瘤 短径。
表15.长期免疫应答实验分组及皮下接种肿瘤细胞
上述实验(1)和(2)，结直肠癌CT26腹腔转移模型小鼠经pMVA-1/DOTAP复合物治疗后，抗CT26结直肠癌的效果达到90％以上，该治疗组小鼠分别继续皮下接种结肠癌CT26细胞和乳腺癌4T1细胞，观察CT26皮下瘤和4T1皮下瘤的生长情况。将同一批次正常小鼠(Normal组)分为两组，分别接种同样的肿瘤作为对照组。实验结果如图26所示：
(1)经过质粒DNA/DOTAP复合物治疗后小鼠的CT26皮下瘤生长得到显著抑制，CT26皮下瘤实验组小鼠几乎不成瘤(图26A)，且治疗组小鼠的生存期较对照组的显著延长。
(2)经过质粒DNA/DOTAP复合物治疗后小鼠的4T1皮下瘤，较对照组4T1皮下瘤生长更为缓慢(图26B)。
此外，对肿瘤组织进行分析显示，CT26皮下瘤和4T1皮下瘤组织中均有大量的淋巴细胞 浸润，且主要为CD4+和CD8+T淋巴细胞，而对照组的淋巴细胞浸润较少，表明 pMVA-1/DOTAP复合物可显著提高机体抗肿瘤的适应性免疫反应。实验还发现，经 pMVA-1/DOTAP复合物治疗后的小鼠脾脏NK细胞活性和CTL杀瘤活性均高于对照组。
以上实验结果表明，pMVA-1/DOTAP复合物治疗CT26腹腔转移模型小鼠后，可引起治 疗小鼠产生全身性抗肿瘤记忆性免疫应答，当遇到肿瘤细胞，包括同种类型和不同类型的肿 瘤细胞，再次刺激后，可通过记忆性T细胞及其分泌的大量免疫细胞因子，抑制肿瘤细胞的 生长，以打破肿瘤的免疫耐受作用。
实施例20、pMVA-1/DOTAP复合物与化疗联合治疗小鼠U14皮下模型
饲养6-8周龄C57雌性小鼠。将培养至对数生长期的小鼠宫颈癌细胞系U14制备为细胞 悬液，将细胞密度为2×107/ml，于实验动物的右侧背部进行皮下注射，每只小鼠注射体系为 100μl。待可触及肿瘤(肿瘤体积约为4mm×4mm×3mm，接种第5天)时，将小鼠随机分为6组，按照表16的分组和治疗方案，每三天给药一次，总共给药8次。每三天测量肿瘤体积。给药8次后，处死小鼠，并解剖皮下瘤待检。
表16.pMVA-1/DOTAP复合物与化疗联合治疗小鼠U14皮下模型的分组情况及治疗方案
其中，给药容积按每只小鼠100μl，DDP为腹腔给药且一周给药一次。DDP为Cisplatin (顺铂)；LP为pMVA-1/DOTAP复合物。
实验结果如图27所示，Cisplatin组、pMVA-1/DOTAP复合物组、和pMVA-1/DOTAP复合物与Cisplatin联合治疗组的肿瘤生长缓慢，其中联合治疗组的肿瘤生长最为缓慢，且以上 三组的肿瘤体积均显著低于NS组、DOTAP组和pMVA-1组；此外，pMVA-1/DOTAP复合物 与Cisplatin联合治疗组，较单独的Cisplatin组和pMVA-1/DOTAP复合物组，肿瘤体积明显 更小。
对肿瘤组织进行分析显示：pMVA-1/DOTAP复合物组、和pMVA-1/DOTAP复合物与Cisplatin联合治疗组的肿瘤组织中有大量的淋巴细胞浸润，而化疗组、DOTAP组、pMVA-1组和NS组则淋巴细胞浸润较少，表明pMVA-1/DOTAP复合物与Cisplatin联合治疗可进一步增强pMVA-1/DOTAP复合物抗肿瘤的适应性免疫反应。
由此可见，pMVA-1/DOTAP复合物可显著提高机体抗肿瘤的免疫应答，加强化疗的抗肿 瘤作用，二者联合应用可显著抑制肿瘤的生长，且联合治疗的抗肿瘤作用优于单独使用 Cisplatin进行治疗的作用。
实施例21、pMVA-1/DOTAP复合物与放疗联合治疗裸鼠Hela皮下模型
饲养6-8周龄裸鼠。将培养至对数生长期的人宫颈癌细胞系Hela制备为细胞悬液，将细 胞密度为1×107/ml，于实验动物的右侧背部进行皮下注射，每只小鼠注射体系为100μl。待 可触及肿瘤(肿瘤体积约为5mm×5mm×5mm，接种第7天)时，将小鼠随机分为4组，具体 给药方案见表17。接种第7天，开始给药：联合治疗组和pMVA-1/DOTAP组分别瘤内注射质粒pMVA-1/DOTAP复合物(10μg质粒pMVA-1和100μg DOTAP所形成的复合物)100 μl；NS组注射生理盐水100μl。均为瘤体内多点注射，每周给药2次，一共给药5次。放 疗组和联合治疗组于首次给药后24h(即接种第8天)开始进行放射治疗，每次放疗总剂量 2Gy，频率200cGy/min，皮源深度2mm，每2天1次放疗，共进行3次放疗。瘤内给药5次 后，测量肿瘤体积，并处死小鼠，取肿瘤组织待检。
表17.pMVA-1/DOTAP复合物与放疗联合治疗裸鼠Hela皮下模型的分组及治疗方案
实验结果如图28所示，放疗组、pMVA-1/DOTAP复合物组、和pMVA-1/DOTAP复合物与放疗联合治疗组的肿瘤体积均显著低于NS组；此外，pMVA-1/DOTAP复合物与放疗联合 治疗组，较单独的放疗组，肿瘤体积显著减少。
对肿瘤组织进行分析显示：pMVA-1/DOTAP复合物组、和pMVA-1/DOTAP复合物与放疗联合治疗组的肿瘤组织中有大量的淋巴细胞浸润，而放疗组和NS组则淋巴细胞浸润较少， 表明pMVA-1/DOTAP复合物与化疗联合治疗可进一步增强pMVA-1/DOTAP复合物抗肿瘤的 特异性免疫反应。
由此可见，pMVA-1/DOTAP复合物可显著提高机体抗肿瘤的免疫应答，加强放疗的抗肿 瘤作用，二者联合应用可显著抑制肿瘤的生长，且联合治疗的抗肿瘤作用优于单独使用放疗 进行治疗的作用。
在pMVA-1/DOTAP复合物与免疫反应调节剂联合治疗肿瘤的体内实验中，我们发现与实 施例20和21相似的实验结果：pMVA-1/DOTAP复合物可显著提高机体抗肿瘤的免疫应答， 加强免疫反应调节剂(如：细胞因子、II类HLA蛋白结合辅助分子、CD40激动剂、检查点受体拮抗剂(例如CTLA-4、PD-1、Stat3)、B7共刺激分子、FLt3激动剂和CD40L激动剂 等)的抗肿瘤作用，二者联合应用可显著抑制肿瘤的生长，且联合治疗的抗肿瘤作用优于单 独使用免疫反应调节剂进行治疗的作用。
实施例22、DNA/阳离子生物材料复合物作为佐剂，制备为肿瘤细胞疫苗在抗肿瘤中的 作用
(1)CT26结肠癌细胞原位疫苗的制备：
a.pVAX1/DOTAP复合物的制备：参照实施例3
b.凋亡、坏死CT26结肠癌细胞的制备：
将培养至对数生长期的CT26结肠癌细胞，以1×106细胞/孔接种于6孔板中，37℃，5％CO2条件下培养，待细胞贴壁后加入含200ng/ml放线菌素D培养基培养12h以诱导凋 亡。收集凋亡细胞悬液后，依次加入5μl Annexin V-FITC和10μl碘化丙啶(propidium iodide，PI；美国Sigma公司)，混匀后，室温避光孵育15min后使用流式细胞仪检测细胞凋亡，富集，稀释备用。
另取对数生长期CT26细胞用加热法，即56℃水浴1h，以制备为坏死肿瘤细胞，显微镜 下观察细胞的坏死形态，台盼蓝拒染法检测细胞死亡率，收集坏死肿瘤细胞悬液，与0.4％台 盼蓝等体积混合，并放置5～15min备用。
c.CT26结肠癌细胞疫苗的制备：
将pVAX1/DOTAP复合物作为疫苗，与坏死或凋亡的CT26结肠癌细胞混合，制备为CT26 细胞疫苗。
(2)在小鼠结肠癌CT26腹腔模型中评价CT26结肠癌细胞疫苗的抗肿瘤作用
在小鼠腹腔注射1×106CT26细胞/只。从注射后第三天开始腹腔给药治疗，分为生理盐 水组(NS)、pVAX1/DOTAP坏死细胞疫苗组(NECRO)和pVAX1/DOTAP凋亡细胞疫苗组(APOP)，通过小鼠腹腔注射给药，每周一次。记录小鼠生存期。
如图29所示，疫苗组(包括NECRO和APOP)相较于生理盐水组(NS)明显延长了小 鼠生存期，NS组在30d的生存率为0，而NECRO组和APOP组在80d时荷瘤小鼠生存率分 别为40％、80％。pVAX1/DOTAP复合物可显著提高坏死或凋亡的肿瘤细胞的免疫原性，二 者混合制备为肿瘤细胞疫苗具有良好的抗肿瘤作用。
以上实验结果表明：DNA/阳离子生物材料复合物可作为肿瘤细胞疫苗的佐剂，能够显著 提高坏死/凋亡细胞疫苗激活机体抗肿瘤的免疫反应，达到有效抑制肿瘤生长、延长生存期的 目的。
上述实施例表明，本发明的不表达外源基因的可复制的DNA与阳离子生物材料所形成的 DNA/阳离子生物材料复合物，或将这些DNA在体外经氧化后形成氧化DNA与阳离子生物材料 所形成的氧化DNA/阳离子生物材料复合物，作为肿瘤疫苗，或肿瘤细胞疫苗的佐剂，在直接 杀伤肿瘤方面发挥协同增效作用，而且还可协同激活机体的天然免疫反应和适应性反应的抗 肿瘤作用，并且诱导机体产生抗肿瘤的长期记忆免疫力，打破肿瘤免疫耐受。因此，本发明 的DNA/阳离子生物材料复合物可作为肿瘤疫苗单独使用或联合其他肿瘤治疗方式应用于不 同类型的肿瘤治疗中。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应 为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学 成都金凯生物技术有限公司
<120> 一种新型的肿瘤疫苗及其用途
<130> A170420K
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1978
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMVA的核苷酸序列
<400> 1
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gccttctact gggcggtttt atggacagca 60
agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta 120
aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag ctctgatcaa 180
gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 240
gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 300
gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 360
ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 420
acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 480
ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 540
gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 600
ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 660
gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 720
aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 780
ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 840
ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 900
ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 960
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ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat acaggtggca 1080
cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 1140
tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatagcac gtgctaaaac 1200
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 1260
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 1320
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<211> 1977
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agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta 120
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cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 1560
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 1620
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 1680
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 1740
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 1800
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 1860
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 1920
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctt 1977
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mtDNA的核苷酸序列1
<400> 3
cccattattc ctagaaccag gcgacctgcg actccttgac gttgacaatc gagtagtact 60
cccgattgaa gcccccattc gtataataat tacatcacaa gacgtcttgc actcatgagc 120
<210> 4
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mtDNA的核苷酸序列2
<400> 4
ctgaactatc ctgcccgcca tcatcctagt cctcatcgcc ctcccatccc tacgcatcct 60
ttacataaca gacgaggtca acgatccctc ccttaccatc aaatcaattg gccaccaatg 120
gtactgaacc tacgagtaca ccgactacgg cggactaatc ttcaactcct acatacttcc 180
cccattattc ctagaaccag gcgacctgcg actccttgac gttgacaatc gagtagtact 240
cccgattgaa gcccccattc gtataataat tacatcacaa gacgtcttgc actcatgagc 300
tgtccccaca ttaggcttaa aaacagatgc aattcccgga cgtctaaacc aaaccacttt 360
caccgctaca cgaccggggg tatactacgg tcaatgctct gaaatctgtg gagcaaacca 420
cagtttcatg cccatcgtcc tagaattaat tcccctaaaa atctttgaaa tagggcccgt 480
atttacccta tagcaccccc tctaccccct ctagagccca ctgtaaagct aacttagcat 540
taacctttta agttaaagat taagagaacc aacacctctt tacagtgaaa tgccccaact 600
<210> 5
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mtDNA的核苷酸序列3
<400> 5
tacgttgtag ctcacttcca ctatgtccta tcaataggag ctgtatttgc catcatagga 60
ggcttcattc actgatttcc cctattctca ggctacaccc tagaccaaac ctacgccaaa 120
atccatttca ctatcatatt catcggcgta aatctaactt tcttcccaca acactttctc 180
ggcctatccg gaatgccccg acgttactcg gactaccccg atgcatacac cacatgaaac 240
atcctatcat ctgtaggctc attcatttct ctaacagcag taatattaat aattttcatg 300
atttgagaag ccttcgcttc gaagcgaaaa gtcctaatag tagaagaacc ctccataaac 360
ctggagtgac tatatggatg ccccccaccc taccacacat tcgaagaacc cgtatacata 420
aaatctagac aaaaaaggaa ggaatcgaac cccccaaagc tggtttcaag ccaaccccat 480
ggcctccatg actttttcaa aaaggtatta gaaaaaccat ttcataactt tgtcaaagtt 540
aaattatagg ctaaatccta tatatcttaa tggcacatgc agcgcaagta ggtctacaag 600
acgctacttc ccctatcata gaagagctta tcacctttca tgatcacgcc ctcataatca 660
ttttccttat ctgcttccta gtcctgtatg cccttttcct aacactcaca acaaaactaa 720
ctaatactaa catctcagac gctcaggaaa tagaaaccgt ctgaactatc ctgcccgcca 780
tcatcctagt cctcatcgcc ctcccatccc tacgcatcct ttacataaca gacgaggtca 840
acgatccctc ccttaccatc aaatcaattg gccaccaatg gtactgaacc tacgagtaca 900
ccgactacgg cggactaatc ttcaactcct acatacttcc cccattattc ctagaaccag 960
gcgacctgcg actccttgac gttgacaatc gagtagtact cccgattgaa gcccccattc 1020
gtataataat tacatcacaa gacgtcttgc actcatgagc tgtccccaca ttaggcttaa 1080
aaacagatgc aattcccgga cgtctaaacc aaaccacttt caccgctaca cgaccggggg 1140
tatactacgg tcaatgctct gaaatctgtg gagcaaacca cagtttcatg cccatcgtcc 1200
tagaattaat tcccctaaaa atctttgaaa tagggcccgt atttacccta tagcaccccc 1260
tctaccccct ctagagccca ctgtaaagct aacttagcat taacctttta agttaaagat 1320
taagagaacc aacacctctt tacagtgaaa tgccccaact aaatactacc gtatggccca 1380
ccataattac ccccatactc cttacactat tcctcatcac ccaactaaaa atattaaaca 1440
caaactacca cctacctccc tcaccaaagc ccataaaaat aaaaaattat aacaaaccct 1500
gagaaccaaa atgaacgaaa atctgttcgc ttcattcatt gcccccacaa tcctaggcct 1560
acccgccgca gtactgatca ttctatttcc ccctctattg atccccacct ccaaatatct 1620
catcaacaac cgactaatca ccacccaaca atgactaatc aaactaacct caaaacaaat 1680
gataaccata cacaacacta aaggacgaac ctgatctctt atactagtat ccttaatcat 1740
ttttattgcc acaactaacc tcctcggact cctgcctcac tcatttacac caaccaccca 1800
actatctata aacctagcca tggccatccc cttatgagcg ggcgcagtga ttataggctt 1860
tcgctctaag attaaaaatg ccctagccca cttcttacca caaggcacac ctacacccct 1920
tatccccata ctagttatta tcgaaaccat cagcctactc attcaaccaa tagccctggc 1980
cgtacgccta accgctaaca 2000
<210> 6
<211> 2098
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMVA-2的核苷酸序列
<400> 6
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gccccattat tcctagaacc aggcgacctg 60
cgactccttg acgttgacaa tcgagtagta ctcccgattg aagcccccat tcgtataata 120
attacatcac aagacgtctt gcactcatga gccttctact gggcggtttt atggacagca 180
agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta 240
aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag ctctgatcaa 300
gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 360
gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 420
gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 480
ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 540
acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 600
ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 660
gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 720
ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 780
gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 840
aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 900
ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 960
ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 1020
ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 1080
cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttattaacgc ttacaatttc 1140
ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat acaggtggca 1200
cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 1260
tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatagcac gtgctaaaac 1320
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 1380
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 1440
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 1500
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 1560
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 1620
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 1680
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 1740
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 1800
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 1860
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 1920
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 1980
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 2040
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctgggct tttgctggcc ttttgctcac atgttctt 2098
<210> 7
<211> 2578
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMVA-3的核苷酸序列
<400> 7
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcctgaacta tcctgcccgc catcatccta 60
gtcctcatcg ccctcccatc cctacgcatc ctttacataa cagacgaggt caacgatccc 120
tcccttacca tcaaatcaat tggccaccaa tggtactgaa cctacgagta caccgactac 180
ggcggactaa tcttcaactc ctacatactt cccccattat tcctagaacc aggcgacctg 240
cgactccttg acgttgacaa tcgagtagta ctcccgattg aagcccccat tcgtataata 300
attacatcac aagacgtctt gcactcatga gctgtcccca cattaggctt aaaaacagat 360
gcaattcccg gacgtctaaa ccaaaccact ttcaccgcta cacgaccggg ggtatactac 420
ggtcaatgct ctgaaatctg tggagcaaac cacagtttca tgcccatcgt cctagaatta 480
attcccctaa aaatctttga aatagggccc gtatttaccc tatagcaccc cctctacccc 540
ctctagagcc cactgtaaag ctaacttagc attaaccttt taagttaaag attaagagaa 600
ccaacacctc tttacagtga aatgccccaa ctcttctact gggcggtttt atggacagca 660
agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta 720
aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag ctctgatcaa 780
gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 840
gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 900
gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 960
ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 1020
acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 1080
ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 1140
gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 1200
ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 1260
gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 1320
aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 1380
ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 1440
ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 1500
ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 1560
cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttattaacgc ttacaatttc 1620
ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat acaggtggca 1680
cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 1740
tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatagcac gtgctaaaac 1800
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 1860
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 1920
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 1980
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 2040
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 2100
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 2160
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 2220
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 2280
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 2340
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 2400
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 2460
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 2520
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctgggct tttgctggcc ttttgctcac atgttctt 2578
<210> 8
<211> 3978
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMVA-4的核苷酸序列
<400> 8
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gctacgttgt agctcacttc cactatgtcc 60
tatcaatagg agctgtattt gccatcatag gaggcttcat tcactgattt cccctattct 120
caggctacac cctagaccaa acctacgcca aaatccattt cactatcata ttcatcggcg 180
taaatctaac tttcttccca caacactttc tcggcctatc cggaatgccc cgacgttact 240
cggactaccc cgatgcatac accacatgaa acatcctatc atctgtaggc tcattcattt 300
ctctaacagc agtaatatta ataattttca tgatttgaga agccttcgct tcgaagcgaa 360
aagtcctaat agtagaagaa ccctccataa acctggagtg actatatgga tgccccccac 420
cctaccacac attcgaagaa cccgtataca taaaatctag acaaaaaagg aaggaatcga 480
accccccaaa gctggtttca agccaacccc atggcctcca tgactttttc aaaaaggtat 540
tagaaaaacc atttcataac tttgtcaaag ttaaattata ggctaaatcc tatatatctt 600
aatggcacat gcagcgcaag taggtctaca agacgctact tcccctatca tagaagagct 660
tatcaccttt catgatcacg ccctcataat cattttcctt atctgcttcc tagtcctgta 720
tgcccttttc ctaacactca caacaaaact aactaatact aacatctcag acgctcagga 780
aatagaaacc gtctgaacta tcctgcccgc catcatccta gtcctcatcg ccctcccatc 840
cctacgcatc ctttacataa cagacgaggt caacgatccc tcccttacca tcaaatcaat 900
tggccaccaa tggtactgaa cctacgagta caccgactac ggcggactaa tcttcaactc 960
ctacatactt cccccattat tcctagaacc aggcgacctg cgactccttg acgttgacaa 1020
tcgagtagta ctcccgattg aagcccccat tcgtataata attacatcac aagacgtctt 1080
gcactcatga gctgtcccca cattaggctt aaaaacagat gcaattcccg gacgtctaaa 1140
ccaaaccact ttcaccgcta cacgaccggg ggtatactac ggtcaatgct ctgaaatctg 1200
tggagcaaac cacagtttca tgcccatcgt cctagaatta attcccctaa aaatctttga 1260
aatagggccc gtatttaccc tatagcaccc cctctacccc ctctagagcc cactgtaaag 1320
ctaacttagc attaaccttt taagttaaag attaagagaa ccaacacctc tttacagtga 1380
aatgccccaa ctaaatacta ccgtatggcc caccataatt acccccatac tccttacact 1440
attcctcatc acccaactaa aaatattaaa cacaaactac cacctacctc cctcaccaaa 1500
gcccataaaa ataaaaaatt ataacaaacc ctgagaacca aaatgaacga aaatctgttc 1560
gcttcattca ttgcccccac aatcctaggc ctacccgccg cagtactgat cattctattt 1620
ccccctctat tgatccccac ctccaaatat ctcatcaaca accgactaat caccacccaa 1680
caatgactaa tcaaactaac ctcaaaacaa atgataacca tacacaacac taaaggacga 1740
acctgatctc ttatactagt atccttaatc atttttattg ccacaactaa cctcctcgga 1800
ctcctgcctc actcatttac accaaccacc caactatcta taaacctagc catggccatc 1860
cccttatgag cgggcgcagt gattataggc tttcgctcta agattaaaaa tgccctagcc 1920
cacttcttac cacaaggcac acctacaccc cttatcccca tactagttat tatcgaaacc 1980
atcagcctac tcattcaacc aatagccctg gccgtacgcc taaccgctaa cacttctact 2040
gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg 2100
ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca 2160
ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 2220
gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 2280
aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 2340
ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 2400
ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 2460
aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 2520
accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 2580
ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 2640
ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 2700
cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 2760
tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 2820
tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 2880
gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 2940
tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa 3000
ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt 3060
cacaccgcat acaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 3120
tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 3180
ataatagcac gtgctaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 3240
tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 3300
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 3360
gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 3420
tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 3480
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 3540
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 3600
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 3660
acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 3720
agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 3780
cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 3840
tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 3900
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctgggct tttgctggcc 3960
ttttgctcac atgttctt 3978
<210> 9
<211> 2097
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMVA-5的核苷酸序列
<400> 9
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gccccattat tcctagaacc aggcgacctg 60
cgactccttg acgttgacaa tcgagtagta ctcccgattg aagcccccat tcgtataata 120
attacatcac aagacgtctt gcactcatga gccttctact gggcggtttt atggacagca 180
agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta 240
aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag ctctgatcaa 300
gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 360
gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 420
gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 480
ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 540
acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 600
ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 660
gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 720
ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 780
gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 840
aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 900
ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 960
ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 1020
ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 1080
cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttattaacgc ttacaatttc 1140
ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat caggtggcac 1200
ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 1260
gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatagcacg tgctaaaact 1320
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 1380
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 1440
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 1500
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 1560
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca 1620
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 1680
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 1740
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 1800
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 1860
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 1920
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 1980
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 2040
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctt 2097
<210> 10
<211> 2577
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMVA-6的核苷酸序列
<400> 10
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcctgaacta tcctgcccgc catcatccta 60
gtcctcatcg ccctcccatc cctacgcatc ctttacataa cagacgaggt caacgatccc 120
tcccttacca tcaaatcaat tggccaccaa tggtactgaa cctacgagta caccgactac 180
ggcggactaa tcttcaactc ctacatactt cccccattat tcctagaacc aggcgacctg 240
cgactccttg acgttgacaa tcgagtagta ctcccgattg aagcccccat tcgtataata 300
attacatcac aagacgtctt gcactcatga gctgtcccca cattaggctt aaaaacagat 360
gcaattcccg gacgtctaaa ccaaaccact ttcaccgcta cacgaccggg ggtatactac 420
ggtcaatgct ctgaaatctg tggagcaaac cacagtttca tgcccatcgt cctagaatta 480
attcccctaa aaatctttga aatagggccc gtatttaccc tatagcaccc cctctacccc 540
ctctagagcc cactgtaaag ctaacttagc attaaccttt taagttaaag attaagagaa 600
ccaacacctc tttacagtga aatgccccaa ctcttctact gggcggtttt atggacagca 660
agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta 720
aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag ctctgatcaa 780
gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 840
gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 900
gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 960
ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 1020
acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 1080
ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 1140
gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 1200
ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 1260
gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 1320
aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 1380
ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 1440
ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 1500
ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 1560
cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttattaacgc ttacaatttc 1620
ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat caggtggcac 1680
ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 1740
gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatagcacg tgctaaaact 1800
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 1860
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 1920
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 1980
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 2040
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca 2100
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 2160
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 2220
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 2280
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 2340
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 2400
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 2460
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 2520
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctt 2577
<210> 11
<211> 3977
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMVA-7的核苷酸序列
<400> 11
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gctacgttgt agctcacttc cactatgtcc 60
tatcaatagg agctgtattt gccatcatag gaggcttcat tcactgattt cccctattct 120
caggctacac cctagaccaa acctacgcca aaatccattt cactatcata ttcatcggcg 180
taaatctaac tttcttccca caacactttc tcggcctatc cggaatgccc cgacgttact 240
cggactaccc cgatgcatac accacatgaa acatcctatc atctgtaggc tcattcattt 300
ctctaacagc agtaatatta ataattttca tgatttgaga agccttcgct tcgaagcgaa 360
aagtcctaat agtagaagaa ccctccataa acctggagtg actatatgga tgccccccac 420
cctaccacac attcgaagaa cccgtataca taaaatctag acaaaaaagg aaggaatcga 480
accccccaaa gctggtttca agccaacccc atggcctcca tgactttttc aaaaaggtat 540
tagaaaaacc atttcataac tttgtcaaag ttaaattata ggctaaatcc tatatatctt 600
aatggcacat gcagcgcaag taggtctaca agacgctact tcccctatca tagaagagct 660
tatcaccttt catgatcacg ccctcataat cattttcctt atctgcttcc tagtcctgta 720
tgcccttttc ctaacactca caacaaaact aactaatact aacatctcag acgctcagga 780
aatagaaacc gtctgaacta tcctgcccgc catcatccta gtcctcatcg ccctcccatc 840
cctacgcatc ctttacataa cagacgaggt caacgatccc tcccttacca tcaaatcaat 900
tggccaccaa tggtactgaa cctacgagta caccgactac ggcggactaa tcttcaactc 960
ctacatactt cccccattat tcctagaacc aggcgacctg cgactccttg acgttgacaa 1020
tcgagtagta ctcccgattg aagcccccat tcgtataata attacatcac aagacgtctt 1080
gcactcatga gctgtcccca cattaggctt aaaaacagat gcaattcccg gacgtctaaa 1140
ccaaaccact ttcaccgcta cacgaccggg ggtatactac ggtcaatgct ctgaaatctg 1200
tggagcaaac cacagtttca tgcccatcgt cctagaatta attcccctaa aaatctttga 1260
aatagggccc gtatttaccc tatagcaccc cctctacccc ctctagagcc cactgtaaag 1320
ctaacttagc attaaccttt taagttaaag attaagagaa ccaacacctc tttacagtga 1380
aatgccccaa ctaaatacta ccgtatggcc caccataatt acccccatac tccttacact 1440
attcctcatc acccaactaa aaatattaaa cacaaactac cacctacctc cctcaccaaa 1500
gcccataaaa ataaaaaatt ataacaaacc ctgagaacca aaatgaacga aaatctgttc 1560
gcttcattca ttgcccccac aatcctaggc ctacccgccg cagtactgat cattctattt 1620
ccccctctat tgatccccac ctccaaatat ctcatcaaca accgactaat caccacccaa 1680
caatgactaa tcaaactaac ctcaaaacaa atgataacca tacacaacac taaaggacga 1740
acctgatctc ttatactagt atccttaatc atttttattg ccacaactaa cctcctcgga 1800
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ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca 2160
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ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 2640
ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 2700
cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 2760
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gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 2940
tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa 3000
ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt 3060
cacaccgcat caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 3120
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taatagcacg tgctaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 3240
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 3300
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 3360
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 3420
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 3480
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3540
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 3600
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 3660
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 3720
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 3780
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 3840
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 3900
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 3960
tttgctcaca tgttctt 3977

Claims (48)

1.一种肿瘤疫苗，其特征在于：其成分包含DNA和阳离子生物材料的复合物；所述的DNA的长度为50～10000bp，所述阳离子生物材料为阳离子脂质类材料或阳离子聚合物中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述DNA的长度为100～6000bp。
3.根据权利要求1或2所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述DNA为线状DNA或环状DNA。
4.根据权利要求3所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述线状DNA为线粒体DNA，或线粒体DNA片段。
5.根据权利要求3所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述环状DNA为质粒。
6.根据权利要求5所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述质粒选自pMVA、pMVA-1、pVAX1、pcDNA3.1、pBR322或pUC18中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述质粒为包含复制子、抗性基因和质粒骨架序列的可复制但不具有表达外源基因的能力的质粒。
8.根据权利要求7所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述包含复制子、抗性基因和质粒骨架序列的可复制但不具有表达外源基因的能力的质粒为pMVA质粒，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示，或者其核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有90％以上的同源性。
9.根据权利要求7所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述包含复制子、抗性基因和质粒骨架序列的可复制但不具有表达外源基因的能力的质粒为pMVA-1质粒，所述pMVA-1质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；或者其核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有90％以上的同源性。
10.根据权利要求5所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的质粒负载有其他DNA。
11.根据权利要求10所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述其他DNA的长度为50～3000bp。
12.根据权利要求11所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述其他DNA的长度为100～2500bp。
13.根据权利要求10～12任一项所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述其他DNA为线粒体DNA或线粒体DNA片段。
14.根据权利要求13所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述线粒体DNA片段选自核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的DNA片段、或者核苷酸序列与SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列有90％以上的同源性的DNA片段中的至少一种。
15.根据权利要求10～14任一项所述的肿瘤疫苗，其特征在于，所述的质粒选自核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、或SEQ IDNO.11所示、或者核苷酸序列与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10或SEQ ID NO.11所示序列有90％以上的同源性的质粒中的至少一种。
16.根据权利要求1～15任一项所述的肿瘤疫苗，其特征在于，所述的DNA为氧化DNA。
17.根据权利要求16所述的肿瘤疫苗，其特征在于，所述的氧化DNA为射线照射或氧化剂处理在体外形成的氧化DNA。
18.根据权利要求17所述的肿瘤疫苗，其特征在于，所述的射线照射为紫外线、γ射线或X射线中的至少一种射线照射；所述的氧化剂为氧气、臭氧、F2、Cl2、Br2、硝酸盐、氯酸盐、高氯酸盐、HNO3、KMnO4、NaClO、CrO3、H2O2、PbO2、NaBiO3、XeF2、Ce4+或PdCl2中的至少一种。
19.根据权利要求1～18任一项所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述阳离子脂质类材料为阳离子脂质，或为阳离子脂质与辅助脂质的复合物。
20.根据权利要求19所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述阳离子脂质选自(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺(DOTMA)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)中的至少一种。
21.根据权利要求19所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的辅助脂质选自磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)或二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的至少一种。
22.根据权利要求19～21任一项所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述阳离子脂质与辅助脂质的复合物，其阳离子脂质与辅助脂质的质量比为1:0.1～1:10。
23.根据权利要求1～18任一项所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、多糖、聚酰胺-胺PAMAM或含有咪唑基团的聚合物中的至少一种。
24.根据权利要求23所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的聚乙烯亚胺的分子量为2～30kD。
25.根据权利要求24所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述聚乙烯亚胺为PEI 2kD、PEI5kD、PEI 25kD。
26.根据权利要求23所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述多糖选自壳聚糖、羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐中的至少一种。
27.根据权利要求26所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述多糖的分子量为30～50kD。
28.根据权利要求1～27任一项所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的DNA和阳离子生物材料的复合物中DNA与阳离子生物材料的质量比为1:1～1:100。
29.根据权利要求28所述的肿瘤疫苗，其特征在于：DNA与阳离子生物材料的质量比为1:1～1:50。
30.根据权利要求1～29任一项所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的DNA/阳离子生物材料复合物的粒径为1～2000nm。
31.根据权利要求30所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的DNA/阳离子生物材料复合物的粒径为50～1000nm。
32.根据权利要求1～31任一项所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的DNA/阳离子生物材料复合物的电位为1～150mv。
33.根据权利要求32所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的DNA/阳离子生物材料复合物的电位为5～100mV。
34.一种药物组合物，包含权利要求1～33任一项所述的肿瘤疫苗，和药剂学上允许的辅料或辅助性成分。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其特征在于：所述的辅料或辅助性成分为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、保护剂、吸附载体或润滑剂中至少一种。
36.制备权利要求1～33任一项所述的肿瘤疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备DNA和阳离子生物材料；(2)将步骤(1)中的DNA和阳离子生物材料混合、静置即得。
37.制备权利要求34或35所述的药物组合物方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备DNA和阳离子生物材料；(2)将步骤(1)中的DNA和阳离子生物材料混合；在DNA和阳离子生物材料混合前和/或混合过程中和/或混合后，添加药剂学上允许的辅料或辅助性成分，制备成药物组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于：所述的辅料或辅助性成分为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、保护剂、吸附载体或润滑剂中至少一种。
39.一种治疗药盒，其包含权利要求1～33任一项所述的肿瘤疫苗，或权利要求34或35所述的药物组合物，和至少一种其它肿瘤治疗药物。
40.根据权利要求39所述的治疗药盒，其特征在于：所述的其它肿瘤治疗药物选自化疗药物或免疫反应调节剂中的至少一种。
41.根据权利要求40所述的治疗药盒，其特征在于：所述的免疫反应调节剂为细胞因子、II类HLA蛋白结合辅助分子、CD40激动剂、检查点受体拮抗剂、B7共刺激分子、FLt3激动剂或CD40L激动剂中的至少一种。
42.一种抗肿瘤药物，其含有权利要求1～33任一项所述的肿瘤疫苗、或者权利要求34或35所述的药物组合物，和肿瘤抗原。
43.根据权利要求42所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的肿瘤抗原选自肿瘤相关抗原、凋亡的肿瘤细胞或坏死的肿瘤细胞中的至少一种。
44.权利要求1～33任一项所述的肿瘤疫苗、权利要求34或35所述的药物组合物在制治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。
45.根据权利要求44所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤选自宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、肉瘤或淋巴瘤。
46.权利要求1～33任一项所述的肿瘤疫苗，或权利要求34或35所述的药物组合物，与至少一种其它肿瘤治疗药物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
47.根据权利要求46所述的用途，其特征在于，所述的其它肿瘤治疗药物选自化疗药物或免疫反应调节剂中的至少一种。
48.根据权利要求47所述的用途，其特征在于，所述的免疫反应调节剂为细胞因子、II类HLA蛋白结合辅助分子、CD40激动剂、检查点受体拮抗剂、B7共刺激分子、FLt3激动剂或CD40L激动剂中的至少一种。
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