CN101716339A - IL-12及TNF-α自体肿瘤疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适用于可耐受活检及手术病人的IL-12及TNF-α自体肿瘤疫苗，该疫苗为含有IL-12基因、TNF-α基因和肿瘤细胞的组合物，具有操作简单、免疫原性及靶向性强、制备成本低和便于临床应用的特点，主要用于抗肿瘤免疫治疗，包括手术后残留、不能切除的肿瘤的治疗。

Description

IL-12及TNF-α自体肿瘤疫苗

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是适用于可耐受活检及手术病人的IL-12及TNF-α自体肿瘤疫苗。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病之一，其发病率逐年增高，且目前许多肿瘤无法用手术、放疗和化疗等常规手段治愈。随着对肿瘤发生、发展的分子机制的深入研究和生物技术的迅速发展，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗的第四种模式，并受到了越来越多的关注。肿瘤的生物治疗(Biotherapy)是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治的新疗法，它通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然(或基因工程)产生的靶向性很强的物质来取得抗肿瘤效应，主要包括体细胞疗法与细胞因子疗法、肿瘤疫苗、分子靶向治疗、放免靶向治疗、肿瘤的基因治疗和生物化疗等。其中，肿瘤疫苗是近年来国内外研究的热点之一，其原理是通过激活患者自身免疫系统，以达到清除或控制肿瘤的目的。随着分子生物学和基因工程的发展，肿瘤疫苗的研究取得了令人鼓舞的成果，现阶段研究较多的肿瘤疫苗有肿瘤细胞疫苗、肿瘤抗原疫苗、以DC(树突状细胞)为基础的疫苗以及核酸疫苗等。尽管现有疫苗表现出显著的抗肿瘤潜能，但也存在特异性差、免疫原性不强、副作用大、安全性差等缺点，故未能在临床上推广应用，如何研制出适合临床应用，且副作用小的肿瘤疫苗是目前肿瘤界面临的一项重大课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种副作用小，免疫原性及靶向性强的IL-12及TNF-α自体肿瘤疫苗。

本发明所述IL-12及TNF-α自体肿瘤疫苗为含有IL-12基因、TNF-α基因和肿瘤细胞的组合物。

所述组合物具有一种或多种医学上可接受的佐剂，如：Titer Max Gold、QS21、PLGA、乙酰壳多糖微粒、SAF、FAS-m等。

制备表达IL-12及TNF-α基因的肿瘤疫苗，是在无菌条件下将切除的肿瘤标本分离成单个肿瘤细胞，将细胞移入培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中，在37℃、5％CO₂条件下，含10％胎牛血清的DMEM培养液中培养，三天更换培养液，一周左右传代。为提高转染效率，避免脂质体对肿瘤细胞的毒性，采用声学微泡造影剂代替脂质体将IL-12真核表达质粒转染肿瘤细胞制成IL-12瘤苗，进而将TNF-α质粒转染IL-12瘤苗，最后获得含IL-12及TNF-α基因的肿瘤疫苗。

本发明所述自体肿瘤疫苗将细胞因子转染肿瘤细胞，选用的细胞因子之一为IL-12(白细胞介素-12)。IL-12主要由活化的巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞产生，有较强的免疫调节作用，能诱导PHA刺激的T细胞增殖，体外实验证明，IL-12是调节Th1细胞辅助细胞免疫功能的因素之一。IL-12全身大剂量用药虽能产生有效的抗肿瘤效果，但毒性反应严重而限制其临床应用。基因治疗的方法为局部释放IL-12，可避免上述危及生命的并发症。

本发明选用的另一细胞因子为TNF-α(肿瘤坏死因子-α)。TNF的生物活性与IL-1十分相似，只是TNF更易引起肿瘤血管阻塞，抗肿瘤作用更强。低浓度的TNF-α主要在局部发挥作用，高浓度的TNF-α可以进入血流，引起全身性反应。研究表明，TNF包括TNF-α和TNF-β。近来的研究表明人和小鼠TNF-α和β的基因都与MHC基因紧密连锁，暗示其可能参与免疫调节基因的表达调控。TNF-α是由激活的单核巨噬细胞产生的一种可溶性细胞因子，是目前发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子之一。鉴于TNF-α可直接杀伤瘤细胞而不损伤正常细胞，比化疗药物毒性小，TNF-α可望较其他细胞因子更快地大量应用于临床。目前已上市的新药唯美生(¹³¹I-chTNF)就是用放射性核素¹³¹I标记TNF发挥抗肿瘤作用。

单独使用TNF用量大，不容易获得好的效果，患者常因不能耐受其副作用而中止用药。将其它具有肿瘤抑制作用的细胞因子(如IL-2、IFN等)或某些抗肿瘤药物与TNF联合应用，既可减少各种药物的用量、降低毒副作用，又可提高疗效。因此本发明将IL-12与TNF-α联合应用，以期更大限度的杀伤肿瘤细胞，减少正常组织损伤。

将本发明所述自体肿瘤疫苗适用于可耐受活检及手术的病人，将该自体肿瘤疫苗加入免疫辅助剂Titer Max Gold回输到患者体内，以激活其自身具有免疫效应的淋巴细胞，并直接杀死肿瘤细胞，降低肿瘤局部复发及远处转移。

本发明将细胞因子与肿瘤细胞相结合，目的在于增强肿瘤免疫原性，提高T细胞对肿瘤抗原的反应性，而IL-12及TNF-α基因导入肿瘤细胞可使局部持续分泌IL-12及TNF-α，从而直接杀伤肿瘤细胞，减少正常组织损伤，从而提高抑瘤率。

本发明具有操作简单、免疫原性及靶向性强、制备成本低和便于临床应用的特点，主要用于抗肿瘤免疫治疗，包括手术后残留、不能切除的肿瘤的治疗。

附图说明

图1、PCR扩增出IL-12目的片段：IL-12目的基因理论长度1625bp，PCR产物经1％琼脂糖电泳显示成功扩增出约1700bp的mIL-12片段，大小与目的基因相符，而阴性对照pcDNA3.1(+)无明显条带出现。

图2、重组IL-12质粒的PCR鉴定：以pcDNA3.1(+)-mIL-12(lane6，7)及pORF-mIL-12(lane3，4)为PCR反应模板均扩增出约1700bp的mIL-12片段，而阴性对照无明显条带出现(lane1，2)

图3、重组IL-12质粒的酶切鉴定：HindIII、EcoR I双酶切后得2个片段，各约1700bp和5400bp(lane1)，与插入目的基因mIL-12片段及pcDNA3.1(+)载体大小相符，HindIII单酶切后(lane2)较原始环状质粒pcDNA3.1(+)(ane3)泳动稍慢。

图4、重组IL-12质粒的测序鉴定：各连接点正确，插入序列与GENEBANK序列完全相符(p40Version NM-008352.1，GI：6680398；p35Version M86672.1，GI：198336)，表明mIL-12基因已正确插入pcDNA3.1(+)载体中，证实pcDNA3.1(+)-mIL-12质粒构建成功。

图5、转染前的肿瘤细胞：转染前，肿瘤细胞呈梭形，细胞较亮，活性较好，贴壁生长，细胞数呈对数增长，生长曲线较陡。

图6、转染后的肿瘤细胞：转染48h后，将细胞转入培养瓶中，细胞贴壁，部分细胞死亡，转染pcDNA3.1(+)-mIL-12组细胞变圆，贴壁减少，生长曲线平缓，细胞数增长缓慢，与对照组相比p＜0.05，转染pORF-mIL-12组与对照组相比p＞0.05。

图7、IL-12活性检测：pcDNA3.1(+)-mIL-12转染的肿瘤细胞培养上清能明显引起ConA激活的小鼠脾细胞增殖，且呈浓度依赖性(A570分别为0.507±0.035，0.802±0.040，1.246±0.028)，与对照组相比p＜0.05(图2-3)，与O′donnell等的结果一致。

图8、成瘤的裸鼠：裸鼠右后腿皮下接种对数生长期的A549细胞2×10⁶个细胞/只后，小鼠的精神状态、食欲、活动能力下降，睡眠时间增加，成瘤率90％，平均成瘤时间为10d，未接种肿瘤的10只小鼠生存状况良好。

图9、PBS治疗组肿瘤组织病理切片：PBS治疗后肿瘤组织无明显坏死，也无巨噬细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞等浸润，肿瘤细胞较多，生长状态较好。

图10、A549瘤苗治疗组肿瘤组织病理切片：A549瘤苗治疗组与pcDNA3.1(+)-mIL-12质粒治疗组肿瘤出现大片坏死，有大量巨噬细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞等浸润。免疫组化结果证实，肿瘤组织浸润的淋巴细胞主要为CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞浸润(黄色-棕黄色颗粒)，且A549瘤苗治疗组更多(p＜0.05)，而空载体治疗组pcDNA3.1(+)及PBS治疗组无CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞(不显色)。

具体实施方式

一、制备表达IL-12及TNF-α基因的肿瘤疫苗

1、肿瘤细胞分离：将切除的肿瘤标本放入含50μg/ml庆大霉素的生理盐水中，无菌条件下快速送至实验室。在超净台内去除坏死组织、脂肪和正常组织，用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm³左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的DMEM培养基，用吸管吹打混匀，台盼蓝排斥试验检测活细胞＞80％，细胞浓度2×10⁷/ml。将细胞移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

2、肿瘤细胞培养：A549细胞在37℃、5％CO₂条件下，在含10％胎牛血清的DMEM培养液中培养，三天更换培养液，一周左右传代。传代培养时，将处于对数生长期的细胞用0.25％胰酶消化2-5min后，用DMEM培养液终止消化，在低速离心机上1500rpm离心5min，弃上清液，再用PBS液重悬细胞，再离心5min。利用ELX800微孔板读数仪调整细胞浓度后，接种到新的培养瓶。

3、制备IL-12肿瘤疫苗：IL-12真核表达质粒由发明人制备并进行鉴定(图1，2，3，4)，其生物学活性已检测(图5，6)，为提高转染效率，避免脂质体对肿瘤细胞的毒性，本发明采用声学微泡造影剂代替脂质体进行转染。

①声学微泡造影剂的配制：将声诺维(六氟化硫声学微泡)冻干制剂加入双蒸水2ml/支复溶，终浓度为20μg/ml，轻微振动5min，即成声学微泡造影剂(A液)，室温静置备用。

②浓度为1μg/μL的IL-12质粒溶液1μL加入100μl无血清无抗生素的DMEM培养液中作为B液。

③将A液及B液各100μl按体积比1∶1混合，使声学微泡造影剂充分包裹质粒，此时肉眼可见呈云雾状。室温下静置10^-15min备用。加入转染液800μl，终体积1ml，轻微振荡，使之充分混匀。

④从培养箱中取融合率达到40％^-60％的LLC细胞2瓶。用100μl转染液清洗细胞表面2次备用。

⑤将步骤③中的液体加入培养细胞中，使均匀覆盖于细胞表面。放入37℃、5％CO₂培养箱中转染20hr。

⑥弃上清液，加入新鲜DMEM液继续培养72hr，24hr换液一次。

⑦UGT1025型超声基因转染仪探头用75％酒精作偶合剂，将已经加好IL-12质粒溶液+声学微泡造影剂细胞培养瓶放置在装有一定脱气水的玻璃缸中进行超声照射，每瓶照射20s，探头声波发射设置为定时间歇触发，即两次声波发射间隔1s，每次发射声波持续1s。本实验选用0.5W/cm²超声声强。

⑧转染后的LLC细胞即为IL-12肿瘤疫苗，瘤苗中加入DMEM培养基，放入37℃、5％CO₂培养箱中大量培养，三天换液，一周左右传代。

4、制备IL-12及TNF-α肿瘤疫苗：从培养箱内取出处于对数生长期的IL-12肿瘤疫苗，将浓度为1μg/μL的TNF-α质粒溶液1μL加入100μl无血清无抗生素的DMEM培养液中作为B液，声学微泡造影剂为A液，按前述方法进行转染，最后获得含IL-12及TNF-α基因的肿瘤疫苗。

二、体外实验：

1、肿瘤疫苗IL-12及TNF-α表达：

ELISA：收集转染48h后的A549肿瘤疫苗上清，用蒸馏水将mIL-12标准品稀释至2000pg/mL，将稀释标准品及待测样品分别加入已包被mIL-12单克隆抗体的酶标板上，100μL/孔，三复孔，再加入生物素化的抗mIL-12，再加入辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，加终止液硫酸，在492nm处测OD值，用mIL-12标准品作出标准曲线(第8孔作为空白对照)，根据标准曲线求待测样品的mIL-12浓度。TNF-α的检测方法一样，只是取TNF-αELISA试剂盒检测。

RT-PCR：收集转染48h后的A549细胞，PBS洗2次，1000rpm离心5min，抽提总RNA后经DNaseI处理再进行RT-PCR，PCR的反应条件：94℃，2min预变性；94℃，50s，55℃，90s，72℃，2min，27个循环；72℃延长10min。，1％琼脂糖电泳。抽提转染pcDNA3.1(+)的LLC细胞总RNA进行RT-PCR作为阴性对照。

2、检测IL-12生物活性(T细胞增殖实验)采用“单克隆抗体捕获法”进行。首先用Na₂CO₃缓冲液(pH 9.5)稀释大鼠抗小鼠IL-12抗体至浓度为5μg/L，包被96孔板，然后加入不同稀释度的待测样品和对照样品100μl，37℃作用1h，以利于单克隆抗体将样品中的mIL-12捕获，培养孔经PBS洗涤3次后，于每孔内加入经ConA(2mg/L)和mIL-12(20mg/L)活化培养3d的裸鼠脾淋巴细胞2×10⁴，37℃，5％CO₂培养24h，采用MTT法测定淋巴细胞增殖活性。

TNF-α生物活性：TNF-α、TNF-β具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株小鼠成纤维细胞株L929作为指示细胞，通过3H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。

3、内毒素检测：经实验检测，产品的内毒素含量低于5个内毒素单位/kg，符合疫苗生产的国际标准。

结果：PCR产物经1％琼脂糖电泳显示成功扩增出约1700bp的mIL-12片段，大小与目的基因相符，而阴性对照pcDNA3.1(+)无明显条带出现。PCR鉴定、酶切鉴定及测序均证实重组IL-12质粒构建成功。含IL-12及TNF-α的A549肺癌细胞肿瘤疫苗具有生物学活性，能够促进淋巴细胞增殖，增强细胞免疫能力，诱导肿瘤细胞凋亡。

三、动物体内实验：

1、建立荷瘤鼠模型：裸鼠右后腿皮下接种对数生长期的A549细胞2×10⁶个细胞/只，观察接种肿瘤后小鼠的精神状态、食欲、活动能力、睡眠状况等。肿瘤长至直径0.5-1.0cm时，将小鼠随机分成4组，每组10只。另设一空白对照组(无肿瘤的10只小鼠)，进行生存期比较(图7)。

2、免疫程序：从培养箱内取出制备好的含IL-12及TNF-α基因的A549肿瘤疫苗，PBS洗三次，再加入免疫辅助剂Titer Max Gold(购于美国CytRx公司)，调整细胞浓度，每次每只小鼠瘤内注射2×10⁶个细胞，整个疗程分5次接种，每次间隔3d。

3、统计学处理：所得数据用x±s表示，Excel软件作图，采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，比较各实验组与对照组的差异，p＜0.05有显著性差异。

4、疗效评价：

1)特异性CTL、NK细胞活性检测：

(1)脾脏单细胞悬液的制备：(在开始治疗后第21d分别分离4组接种小鼠的脾脏细胞作为效应细胞)

①将无菌饲养小鼠断颈处死后接血，制备血清(室温放置2h后于4℃过夜，次日4000rpm离心10min，吸取上清)。

②小鼠浸泡在75％酒精中10min，用无菌眼科剪刀和镊子取出脾脏。

③无菌PBS冲洗后以眼科弯剪刀反复剪碎，无菌PBS冲洗至无菌平皿中，2000rpm离心5min，弃上清。

④沉淀中加入红细胞裂解液2ml，室温裂解2min后加入含10％小牛血清的RPMI1640完全培养基，200目尼龙网过滤制成单细胞悬液，2000rpm离心5min，弃上清。

⑤沉淀悬浮于2ml完全培养基中，即为脾细胞，计数，调至2×10⁷个细胞/ml，置于37℃5％CO₂孵箱中备用，即效应细胞。

(2)肿瘤细胞特异性CTL活性检测：采用³H-TdR释放法[10]

①取体外传代处于对数生长期的A549细胞2×10⁶个。

②加入740KBq/20μl的[3H]-TdR，混匀后于37℃，5％CO₂条件下培养4h，每0.5h振荡1次。

③标记后用Hank’s液充分洗涤细胞3次以洗去游离的[³H]-TdR，计数后调细胞浓度至4×10⁵个细胞/ml，即靶细胞。

④于96孔板中每孔分别加100μl(2×10⁶个)脾细胞，50μl(2×10⁴个细胞)及25μl(1×10⁴个细胞)[³H]-TdR标记的靶细胞，三复孔，设自发释放对照孔，37℃，5％CO₂条件下培养18h。

⑤收集细胞于玻璃纤维滤膜上，烤干，液闪仪测cpm值。

⑥按下列公式计算特异性CTL细胞杀伤活性：

CTL细胞杀伤活性＝(1-实验孔cpm/自发释放孔cpm)×100％

(3)脾脏NK细胞毒活性检测：

①取体外传代处于对数生长期的Yac-1细胞2×10⁶个，加入740KBq/20μl的³H-TdR，混匀后于37℃，5％CO₂条件下培养4h，每0.5h振荡1次。

②标记后用Hank’s液充分洗涤细胞3次以洗去游离的³H-TdR。计数后调细胞浓度至4×10⁵个细胞/ml。

③于96孔板中每孔加100μl(2×10⁶个细胞)脾细胞，50μl(2×10⁴个细胞)，25μl(1×10⁴个细胞)³H-TdR标记的Yac-1细胞，三复孔，设自发释放对照孔，37℃，5％CO₂条件下培养18h后收集细胞于玻璃纤维滤膜上，烤干。

④液闪测cpm值，按下列公式计算特异性NK细胞杀伤活性：

NK细胞杀伤活性＝(1-实验孔cpm/自发释放孔cpm)×100％

脾脏NK细胞毒活性检测方法不同之处在于其标记体外传代处于对数生长期Yac-1细胞作为靶细胞。

2)治疗前后IL-12、IFN-γ浓度的变化：主动免疫治疗前3d，5次免疫治疗后1周，分别采集小鼠血清，检测血清中IL-12、IFN-γ水平。IFN-γ及IL-12ELISA试剂盒由美国Genezyme公司提供。结果判定：每个血清标本的A(OD)值减去对照孔的A值为绝对值，根据A值计算标本的IL-12、IFN-γ浓度。

3)肿瘤组织免疫组化分析CD4⁺、CD8⁺T细胞：

(1)载玻片处理：

①清洁液浸泡，自来水冲洗。

②泡硫酸洗液过夜。

③取出后自来水冲洗，用蒸馏水冲洗后烘干。

④在无水乙醇中浸泡过夜，擦干后用铝箔包好备用。

⑤使用时取出用防脱片液浸泡1min，蒸馏水浸洗2次，晾干备用。

(2)免疫组化检测CD4⁺及CD8⁺细胞：

①瘤组织石蜡切片，60℃加温1-2h，二甲苯脱蜡2次，10min/次。

②无水乙醇洗2次，5min/次，新鲜配制的0.5％过氧化氢甲醇液中浸泡30min，水化后在0.1％的胰蛋白酶中37℃温浴45min。

③滴加大鼠抗小鼠CD4⁺、CD8⁺单抗，湿盒内1h，PBS洗3次。

④加生物素标记的二抗，37℃，湿盒内1h，PBS洗3次。

⑤加酶作用底物DAB显色，苏木精液复染40min，PBS洗3次后中性树胶封片保存。

阳性结果为细胞核呈棕褐色。

4)检测肿瘤细胞凋亡：分别取各组荷瘤鼠3只处死后，取出肿瘤组织，常规固定、切片，按试剂盒说明书进行原位末端标记(TUNEL)染色，观察细胞凋亡情况。

5)观察病理学改变：21d后处死小鼠，取治疗组和对照组肿瘤组织10％福尔马林固定，石腊包埋切片后HE染色，镜下观察病理学改变。取治疗组和对照组肿瘤组织10％福尔马林固定，石腊包埋，切片。切片二甲苯染色15min×2次，100％乙醇浸泡5min×2次，95％乙醇浸泡5min，80％乙醇浸泡3min，70％乙醇浸泡2min，50％乙醇浸泡2min，蒸馏水洗，HE染色，光学显微镜下常规病理观察(图9、图10)。

结果：裸鼠右后腿皮下接种对数生长期的A549细胞2×10⁶个细胞/只后，成瘤率90％，平均成瘤时间为10d。未接种肿瘤的10只小鼠生存状况良好。A549瘤苗治疗组与pcDNA3.1(+)-mIL-12质粒治疗组肿瘤出现大片坏死，有大量巨噬细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞等浸润。免疫组化结果证实，肿瘤组织浸润的淋巴细胞主要为CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞浸润(黄色-棕黄色颗粒)，且A549瘤苗治疗组更多(p＜0.05)，而空载体治疗组pcDNA3.1(+)及PBS治疗组无CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞(不显色)。

此结果说明含IL-12及TNF-α基因的A549肺癌细胞瘤苗能够产生针对肿瘤的免疫反应，导致肿瘤组织坏死，从而降低肿瘤局部复发及远处转，而对正常组织无损伤，适合各种实体瘤治疗，且副作用小，具有较大的发展潜力。

Claims (2)

1.IL-12及TNF-α自体肿瘤疫苗，其特征在于：为含有IL-12基因、TNF-α基因和肿瘤细胞的组合物。

2.根据权利要求1所述IL-12及TNF-α自体肿瘤疫苗，其特征在于：所述组合物具有一种或一种以上医学上可接受的佐剂。

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