JP2009291191A - Hgfrの高親和結合部位およびその拮抗剤の同定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】テスト薬剤を、i)肝細胞増殖因子受容体の細胞外IPT−3およびIPT−4ドメインをコードするポリヌクレオチド、ii)または該ドメインを含むポリペプチド、またはiii)HGFRの細胞外IPT−3ドメインおよびIPT−4ドメインを発現する細胞と接触させ、HGFRの活性、機能、安定性および/または発現を測定することからなる。
【選択図】なし
Description
(a)テスト薬剤を、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外IPT−3およびIPT−4ドメイン、あるいは少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外IPT−3およびIPT−4ドメインを発現する細胞と接触させ、
(b)肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および/または発現を測定し、次いで
(c)肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および/または発現を減少させる薬剤を選択する
工程を含む方法に関する。
たんぱく質の改変
本明細書に記載される可溶性または膜貫通型受容体および改変されたリガンドを、一般的なPCRおよび遺伝学的改変技術により作成した。全ての因子は、N−末端にそれらの親たんぱく質のリーダー配列を保存する。可溶性Metたんぱく質のアミノ酸(aa)配列(Gene Bank番号X54559)は、aa1−24(シグナルペプチド)および:デコイMet、aa25−932;Sema、aa25−515;Sema−PSI、aa25−562;PSIIPT、aa516−932;IPT、aa563−932;IPT△1、aa657−932;IPT△1−2、aa742−932;IPT−3、aa742−838;IPT−4、aa839−932に相当する。各分子のC−末端において、二重FLAG(SDYKDDDDK−配列番号:19)または単一MYC(EQKLISEEDLN−配列番号:20)エピトープ配列およびポリ−ヒスチジンタグ(HHHHHHH−配列番号:21)をたんぱく質の検出および精製のために付加した。膜貫通型の改変Met△25−741は、欠失した領域(aa25−741)を除いて野生型Metと同一である。改変されたHGFたんぱく質のアミノ酸配列(Gene Bank番号M73239)は、aa1−31(シグナルペプチド)および:HGF、aa32−728;HGF−α、aa32−473;HGF NK1、aa32−205;HGF−β、aa495−728に相当する。上記MYCまたはFLAGエピトープおよびポリ−ヒスチジンタグをC−末端に付加した。未切断HGFは以前に公表されている(Mazzone, M. et al. (2004) J Clin Invest. 114(10), 1418-1432)。NK1−NK1は、タンデムに繰り返される同一のN−末端領域HGFからなるHGF NK1の二量体形態である(隙間なくaa32−205に直接連結させたaa1−205)。全ての改変されたたんぱく質をコードするcDNAを、Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet. 25(2), 217-222で開示されるようにgfp cDNAの代わりにレンチウイルストランスファーベクターpRRLsin.PPT.CMV.eGFP.Wpre(配列番号:1)にサブクローン化した。GFPをコードする配列を、以下のcDNA:デコイmet FLAG.his(配列番号:2)、Sema FLAG.his(配列番号:3)、Sema−PSI FLAG.his(配列番号.:4)、PSI−IPT FLAG.his(配列番号:5)、IPT FLAG.his(配列番号:6)、IPT△1 FLAG.his(配列番号:7)、IPT△1−2 FLAG.his(配列番号:8)、IPT3 FLAG.his(配列番号:9)、IPT4 FLAG.his(配列番号:10)、Met△25−741(配列番号:11)、HGF MYC his(配列番号:12)、HGF−αMYC his(配列番号:13)、HGF−NK1 MYC his(配列番号:14)、HGF−β MYC his(配列番号:15)、未切断HGF MYC his(配列番号:16)、NK1−NK1 his(配列番号:17)、アンジオスタチンMYC his(配列番号:18)に置き換えた。
全ての改変された受容体と因子を、血清の非存在下で、レンチウイルスベクターを形質導入したMDA−MB−345ヒトメラノーマ細胞の条件培地から回収した。Michieli P. et al. (2002) Nat Biotechnol. 20(5), 488-495に記載されるごとく、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより因子の精製を行った。精製したプロ−HGF(最大濃度100ng/μg)を2−10% FBS(ミズーリ州、セントルイスのSigma)で37℃において24時間インキュベートすることにより、プロ−HGFの活性HGFへの変換を行った。因子の変換を、抗−HGF抗体(ミネソタ州、ミネアポリスのR&D Systems)を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。FBSとの同一のインキュベートにかけた未切断HGFを全ての測定中でプロ−HGFとして用いて、活性HGFを未処理HGFと比較した。改変リガンドの可溶性受容体への結合を、固相中のFLAG−タグ可溶性受容体および液相中のMYG−タグ改変リガンドを用いてELISAにより測定した。固定濃度(100ng/ウェル)の精製した可溶性受容体を96−ウェルELISAプレートに吸着させた。たんぱく質でコートしたプレートを改変リガンドの濃度の増加とともにインキュベートし、ビオチン化された抗−HGF抗体(ミネソタ州、ミネアポリスのR&D Systems)または抗−MYC抗体(カリフォルニア州、サンタクルーズのSanta Cruz Biotechnology)を用いて結合を明らかにした。結合データをプリズムソフトウェア(カリフォルニア州、サンディエゴのGraph Pad Software)を用いて解析し適合させた。
MDA−MB−435ヒトメラノーマ細胞をジョージタウン大学のTissue Culture Shared Resource(ワシントン、コロンビア特別区)から購入した。10% FBSを添加したDMEM(Sigma)で細胞を維持した。TOV−112Dヒト卵巣癌細胞をATCC(メリーランド州、ロックビル;ATCC番号CRL−11731)から取得し、15% FBSを添加したMCDB105培地と培地199(全てSigma)の1:1の混合物を用いて培養した。A549ヒト肺癌細胞もATCCから取得し(ATCC番号CCL−185)、10% FBSを添加したRPMI中で維持した。
Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet. 25 (2), 217-222に記載されるごとく、293T細胞の一過的なトランスフェクションによりベクターストックを生成した。簡単に説明すると、トランスフェクション用のプラスミドDNAミックスを以下のとおりに調製した:ENVプラスミド(VSV−G)、9μg;PACKAGINGプラスミドpMDLg/pRRE 16.2μg;REVプラスミド、6.25μg;TRANSFER VECTOR(プラスミド番号2−18)、37.5μg。プラスミドをTE/CaCl2溶液に希釈し、HBS溶液を加えて最大速度でボルテックスを行った。DNA/CaCl2/HBSミックスを即座に細胞プレートに滴下し、次いで37℃でインキュベートした。14−16時間後、培養した培地を新しいものに交換した。ベクター粒子を含む細胞培養上澄み液を、培地を交換してから約36時間後に回収した。回収後、上澄み液を0.2μmの細孔膜に通してろ過し、−80℃で保存した。ウイルスp24の抗原濃度をHIV−1 p24 core profile ELISA kit(マサチューセッツ州、ボストンのNEN Life Science Products)により製造業者の説明書に従って調べた。Vigna, E. and Naldini, L. (2000) J Gene Med. 2(5), 308-316に記載されるごとく、細胞を、8μg/mlのポリブレン(Sigma)の存在下で、40ng/mlのp24を用いて6ウェルプレート(2mlの培地中に105細胞/ウェル)中で形質導入させた。培地を、形質導入後約18時間で交換した。細胞の増殖とたんぱく質の産生を経時的にモニターした。次に、形質導入した細胞株を15cmプレートに播種し、80%コンフルエンスまで増殖させ、無血清培地中でインキュベートした。72時間後、組み換え可溶性たんぱく質を含む上澄み液を回収し、ろ過し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製するか、または−30℃で保存した。
Longati, P. et al. (1994) Oncogene 9(1), 49-57に記載されるごとく、抽出緩衝液(EB)を用いて、細胞溶解、免疫沈殿およびウェスタンブロット解析を行った。ECLシステム(ニュージャージー州、ピスカタウェイのAmersham Biosciences)を製造業者の説明書に従って用い、シグナルを検出した。免疫沈殿用の抗−Met抗体は、Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270により記載され、UBI(ニューヨーク州、プラシド湖)から購入された。ウェスタンブロット用の抗−Met抗体をSanta Cruzから購入した。抗−FLAG抗体をSigmaから取得した。レンチウイルスベクターを形質導入したMDA−MB−435細胞におけるMetリン酸化解析を、Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73に記載されるごとく行った。
Met△25−741を発現する、レンチウイルスベクターを形質導入したTOV−112D細胞を、ECL(登録商標) Surface Biotinylation Module kit(Amersham Biosciences)を製造業者の説明書に従って用いて表面ビオチン化解析にかけた。Mazzone, M. et al. (2004) J Clin Invest. 114(10), 1418-1432に記載されるごとく、化学的な架橋を行った。簡単に説明すると、細胞から3日間血清増殖因子を取り除き、次いで1nM HGFで3時間インキュベートした。細胞溶解物を、Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270に開示されるごとく、MetのC末端の一部に対する抗体を用いて免疫沈殿し、3−10%のポリアクリルアミド勾配を用いてSDS−PAGEにより解析し、次いで抗−HGF抗体(R&D)を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。受容体活性解析では、Met△25−741を発現するTOV−112D細胞から血清増殖因子を3日間取り除き、次に1nM HGF、未切断HGF、HGF NK1またはNK1−NK1で10分間刺激した。Longati, P. et al. (1994) Oncogene 9(1), 49-57に記載されるごとく、細胞をEBを用いて溶解した。細胞たんぱく質を上述のごとく抗−Met抗体で免疫沈殿し、抗−ホスホチロシン抗体(UBI)を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。同一のブロット物を抗−Met抗体と再結合させた(Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270)。
MDA−MB−435細胞を用いたコラーゲン侵襲アッセイを、Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73に記載されるごとく前もって形成させた球状体を用いて行った。簡単に説明すると、細胞(700細胞/ウェル)を、0.24g/mlのメチルセルロース(Sigma)の存在下で非接着性96−ウェルプレート(ドイツ、フリッケンハウゼンのGreiner)中で一晩インキュベートすることにより球状体を作成した。球状体を、ラットの尻尾に由来する1.3mg/ml I型コラーゲンマトリックス(マサチューセッツ州、ベッドフォードのBD Biosciences)および10% FBSを含むコラーゲンマトリックスに96−ウェルプレート(40球状体/ウェル)を用いて包埋した。包埋した球状体を37℃で24時間培養し、次いで、30ng/ml HGF(R&D)または因子なしでさらに24時間刺激した。各球状体から伸びる細管の数を顕微鏡を用いて評価した。1箇所の実験地点あたり少なくとも12個の球状体を分析した。
0.2mlのDMED中のレンチウイルスベクターを形質導入したMDA−MB−435腫瘍細胞(3x106細胞/マウス)を、Swiss CD−1バックグラウンドの6週齢の免疫不全nu−/−雌マウス(イタリア、カルコのCharles River Laboratories)の右後方の側腹部に皮下注射した。腫瘍の大きさを、ノギスを用いて2日ごとに測定した。腫瘍の体積を、式 V=4/3πx2y/2(式中、xは腫瘍の短径であり、yは腫瘍の長径である)を用いて算出した。注射した細胞により占められる最初の体積にほぼ相当する、15mm3の腫瘤を腫瘍陽性の閾値として選別した。腫瘍がこの閾値より低いマウスを腫瘍なしと見なした。約4週間後、マウスに麻酔をかけ、解析のために腫瘍を抽出した。動物を死体解剖した。腫瘍と肺をパラフィンで包埋し、組織学的解析用に処理した。ヘマトキシリンとエオシンで染色した連続的な肺の切片において顕微鏡により微少転移解析を行った。腫瘍切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、サンプルの同定を知らされていない各々の病理学者が分析した。導入遺伝子の発現を、抗−FLAG抗体(Sigma)を用いて免疫組織化学により腫瘍切片上で調べた。切片をメイヤーヘマトキシリン(Sigma)で対比染色した。腫瘍の血管形成を抗−フォンヴィレブランド因子抗体(デンマーク、グロストラップのDAKO)を用いて免疫組織化学により分析した。切片を上述のごとく対比染色した。血管密度を顕微鏡により測定した。1匹の動物あたり少なくとも12領域を解析した。全ての動物実験の手順は、イタリアのトリノ大学およびイタリア保健省により承認された。
統計的有意性を、両側等分散性スチューデント(Student’s)t−検定(アレイ1、コントロール群;アレイ2、実験群)を用いて調べた。解析した全てのデータについて、p<0.05を有意な閾値と想定した。全ての図において、値を平均±標準偏差として表し、統計的有意性を1個(p<0.05)または2個(p<0.01)の星により示す。
HGF/Met機能ドメインの改変
MetとHGFに含まれる機能ドメインの模式図を図1Aに表す。Metの細胞外部分は、Semaドメイン、PSIヒンジ、および4つのIPTモジュール(左図)を含む。HGFは、成熟たんぱく質においてジスルフィド結合により連結されたα−およびβ−鎖からなる。次に、α−鎖は、N末端ドメインと4つのクリングルを含む(右図)。MetとHGF間の相互作用を解析するため、本発明者らは、全てのこれらの機能ドメインを、各々、可溶性たんぱく質として発現させた。それらが適切に分泌できるように、機能ドメインを、N末端で親たんぱく質のシグナルペプチドを含むように改変した。C末端には、抗体認識用に外因性エピトープ(FLAGまたはMYC)およびたんぱく質精製用にポリヒスチジンタグを付加した。全ての改変された因子をコードするcDNAを、レンチウイルスベクターpRRLsin.PPT.CMV.Wpreにサブクローン化し、組み換えレンチウイルス粒子を材料と方法に記載されるごとく産生した。組み換えたんぱく質をレンチウイルスベクター形質導入MDA−MB−435ヒトメラノーマ細胞の条件培養から回収し、アフィニティークロマトグラフィーにより均一になるまで精製した。精製したたんぱく質をSDS−PAGEによる標準物質に対して定量化した(図1B)。
HGFと相互作用するMet細胞外ドメインの能力をELISA結合アッセイでテストした。可溶性受容体(デコイMet、Sema−PSI、Sema、PSI−IPT、IPT)を固相に固定し、上昇濃度の活性HGFに晒した。ビオチン化抗−HGF抗体を用いて結合を明らかにした。可溶性Metドメインの代わりに固相中のウシ血清アルブミン(BSA)を用いて非特異的HGF結合を調べた。材料と方法に記載されるごとく非線形回帰分析により結合親和性を調べた。これらの条件において、デコイMetはHGFに約0.2−0.3nMのKDで結合した。以前の測定と一致して、Sema−PSIとSemaは、デコイMetと比較して少なくとも1log低い親和性でHGFに結合した。驚くべきことに、PSI−IPTとIPTの両方は、デコイMetとほぼ同一の親和性をもって極めて効果的にHGFに結合した(図2A)。PSIドメインの有無は、SemaまたはIPTのいずれもHGFに対する結合親和性に影響しない。それゆえ、今まで天然に見出されるほぼ全てのSemaドメインがC末端でPSIモジュールを有することから、本発明者らは、デコイMet、Sema−PSI、およびIPTを用いて結合解析を続けた。
MetのIPT領域は、約400個のアミノ酸まで伸長し、4つのIPTドメインを含む。IPT−HGF接触面をより細かく位置付けするため、1つまたはそれ以上のドメインを欠失させた一連のIPT変異体を設計した(図3A)。IPT△1とIPT△1−2は、第1または第1の2つの免疫グロブリン様ドメインをそれぞれ欠失する、2つのIPTのN末端欠失形態である。IPT−3とIPT−4は、単一のたんぱく質として表される2つのC末端免疫グロブリン様ドメインに相当する。たんぱく質の産生と精製を上述のごとく行った。HGFのα−鎖と相互作用する改変IPTの能力を、コントロールとして全IPT領域を用いてELISA結合アッセイで調べた。IPT、IPT△1、IPT△1−2、IPT−3およびIPT−4を固相に固定し、上昇濃度のHGF−αに晒した。抗−HGF抗体を用いて結合を明らかにした。非特異的結合を上述のごとくBSAを用いて測定した。図3Bに示されるように、第1の2つの免疫グロブリン様ドメインの欠失は、実質的にHGF結合に影響しなかった。
HGFが膜アンカー受容体との関連でIPT3と4に結合できるかどうかを調べるために、細胞外領域に大きな欠失を保有するMetたんぱく質を設計した。Semaドメイン(aa25−515)、PSIドメイン(aa516−562)および第1の2つのIPTドメイン(IPT1と2、aa563−741)に相当する、アミノ酸25−741を欠失させ、IPT3と4、膜貫通へリックスおよび全細胞質領域を含む組み換え受容体を作成した(図4A)。改変された受容体Met△25−741をコードするcDNAを、上述のごとく同一のレンチウイルスベクターにサブクローン化した。組み換えレンチウイルス粒子を、RT−PCR解析により調べられるごとく、内在性Met発現を欠失するヒト卵巣癌細胞株TOV−112Dを形質導入するのに用いた(Michieli, P., et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73)。表面ビオチン化解析は、Met△25−741がTOV−112D細胞の膜上に適切に発現され、曝露されることを明らかにした(図4B)。
次に、本発明者らは、Met△25−741へのHGF結合がMetキナーゼ活性を誘導できるかどうかをテストした。この目的を達成するため、レンチウイルスベクターを形質導入したTOV−112D細胞をプロ−HGFまたは活性HGFで刺激し、細胞溶解物を上述のごとき抗−Met抗体で免疫沈殿した。受容体活性を、抗ホスホチロシン抗体を用いてウェスタンブロット解析により調べた。同一のブロット物を抗−Met抗体で再結合させて免疫沈殿した受容体の量を標準化した。特に、プロ−HGFと活性HGFの両方はMet△25−741の強いリン酸化を誘導することができた(図4D)。プロ−HGFの全長Metへの結合がキナーゼ活性を誘導せず、このことは、Semaドメインが何らかの形で活性HGF受容体への結合に依存して遊離されるMet触媒活性上の自己抑制効果を及ぼすことを示唆する。受容体刺激をまた、HGF NK1およびタンデムに繰り返される2つのNK1フラグメントからなる改変二量体リガンド(NK1−NK1;図4E)を用いて行った。図4Dに示されるように、レンチウイルスベクター形質導入TOV−112D細胞のNK1−NK1刺激がMet△25−741の強力なリン酸化を生じる一方、単量体NK1による刺激は効果を示さなかった。これらの結果は、Metの2つのC末端IPTドメイン(IPT3および4)が、HGF(より正確には、HGFのα−鎖における最小Met結合モジュールを表すHGF NK1)に結合し、細胞質キナーゼドメイン、推定上、以後のリガンド誘導受容体二量体への受容体活性のシグナルを伝達するのに十分であることを示唆する。しかしながら、それらはまた、IPT3とIPT4単独では、HGFの生物学的に活性な形態を不活性な前駆体、プロHGFと区別するのに十分でないことを示唆する。
以前の研究において、可溶性たんぱく質(デコイMet)として発現されたMetの細胞外部分が、インビトロおよび癌のマウスモデルでHGF誘導性侵襲増殖を抑制することが示された(Michieli P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73)。組み換え可溶性Sema−PSIもまた、リガンド−依存性および−非依存性Metリン酸化の両方を抑制することが示された(Kong-Beltran M. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 75-84)。これらの結果に基づいて、可溶性IPTが生存細胞でHGF/Met拮抗性活性を示すかどうかをテストした。MDA−MB−435ヒトメラノーマ細胞は、Metを発現し、HGF介在侵襲性増殖の解析用に樹立されたモデル系であり、これを可溶性デコイMet、Sema−PSIまたはIPTをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。空ベクターで形質導入した細胞をコントロールとして用いた。比較レベルの可溶性因子(約50pmol/106細胞/24時間)を分泌するレンチウイルスベクター形質導入細胞を、数日間血清飢餓とし、組み換え因子を培地中に蓄積させ、次いで組み換えHGFで刺激した。Metチロシンリン酸化を、上述のごとき抗−ホスホチロシン抗体を用いて免疫ブロッティングにより調べた。図5Aに示されるように、IPTとSema−PSIの両方がHGF誘導Metリン酸化を部分的に抑制したが、一方で、デコイMetは、Met活性を誘導するHGFの能力を完全に中和した。MetのC末端に対する抗体を用いた同一の免疫ブロット物の再結合は、免疫沈殿させたたんぱく質の量に実質的な相違がないことを明らかにした。
上記の結果は、本発明者らに癌のマウスモデルにおける可溶性IPTの治療能力を探索することを想起させた。レンチウイルスベクターを形質導入したMDA−MB−435メラノーマ細胞を、CD−1 nu−/−マウスに皮下注射し、腫瘍増殖を経時的にモニターした。約3週間後、解析のために腫瘍を抽出し、マウスを死体解剖にかけた。カプラン−マイヤー類似解析において、腫瘍非存在の動物のパーセンテージを時間に対してプロットし、腫瘍潜伏を平均日数を算出して定量化する場合、全ての改変可溶性受容体が実験上の腫瘍の出現を遅らせた。しかしながら、IPTはSema−PSIよりわずかに効率的であり、デコイMetはIPTまたはSema−PSIのいずれよりも強力であった(図6A)。経時的な腫瘍組織量解析は、IPTがデコイMetよりわずかに効率的である一方、Sema−PSIが実験の極めて早い期間のみに腫瘍増殖を抑制することを明らかにした(図6B)。導入遺伝子発現の免疫組織化学解析は、デコイMet、Sema−PSIおよびIPTが腫瘍における同様のレベルと分布となることを示した(図6C)。
HGFと細胞外IPT−3およびIPT−4ドメインとの相互作用が高親和性HGF結合に不可欠である場合、IPT−3およびIPT−4に結合し、HGFR結合に関してHGFと競合する特異的なモノクローナル抗体を作成することができる。このことはいくつかの方策により行うことができる。
異なる方法を用いて、HGFRの高親和性HGF結合部位に結合し、HGF誘導性HGFR活性を抑制する、多様な起源のテスト化合物を単離することが可能である。このことはいくつかの方策により行うことができる。
抗−IPT抗体またはIPT−結合化合物を作成するいかなる方策が用いられる場合であっても、最終産物(すなわち、IPT−3またはIPT−4に対するモノクローナル抗体、あるいはIPT−3およびIPT−4に結合する天然または合成化合物)は、これらの薬剤がHGFR活性を抑制する能力を有するかどうかを調べることを目的とした生物学的アッセイにかけられる。これらのアッセイは、培養した哺乳類動物の細胞を用いてインビトロで、または実験動物を用いてインビボで行うことができる。
Claims (11)
- 癌の治療に有用な薬理学的な活性を有する薬剤のスクリーニングおよび/または開発のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外IPT−3およびIPT−4ドメインをコードするポリヌクレオチドの使用。
- 癌の治療に有用な薬理学的な活性を有する薬剤のスクリーニングおよび/または開発のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外IPT−3およびIPT−4ドメインを含むポリペプチドの使用。
- 前記薬理学的な活性を有する薬剤が、肝細胞増殖因子受容体の触媒活性、機能、安定性および/または発現を阻害する、請求項1または2記載の使用。
- 前記薬理学的な活性を有する薬剤が、肝細胞増殖因子受容体の触媒活性、機能、安定性および/または発現を下方調節する、請求項1または2記載の使用。
- 前記薬理学的な活性を有する薬剤が、肝細胞増殖因子受容体の阻害剤および/または拮抗剤である、請求項1〜4のいずれか1項記載の使用。
- 前記薬理学的な活性を有する薬剤が、小分子阻害剤、アプタマー、アンチセンスヌクレオチド、RNAを基にした阻害剤、siRNA、抗体、ペプチド、ドミナントネガティブ因子から選択される、請求項1〜5のいずれか1項記載の使用。
- 癌が、肝細胞増殖因子受容体活性の調節不良を伴う癌である、請求項1〜6のいずれか1項記載の使用。
- 癌、好ましくは肝細胞増殖因子受容体活性の調節不良を伴う癌の治療に有用な肝細胞増殖因子受容体の拮抗剤/阻害剤として作用するテスト薬剤の能力を検出する方法であって、
(a)テスト薬剤を、i)少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外IPT−3およびIPT−4ドメインをコードするポリヌクレオチド、ii)少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外IPT−3およびIPT−4ドメインを含むポリペプチド、またはiii)少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外IPT−3およびIPT−4ドメインを発現する細胞と接触させ、
(b)肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および/または発現を測定し、次いで
(c)肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および/または発現を減少させる薬剤を選別する:
工程を含む方法。 - 前記工程(b)の測定が、細胞シグナル伝達、細胞生存、および細胞増殖を測定することを含む、請求項8から11のいずれか1項記載の方法。
- 癌を治療する医薬としての使用のための肝細胞増殖因子受容体の細胞外IPT−3およびIPT−4ドメイン。
- 癌を治療するための医薬としての使用のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外IPT−3およびIPT−4ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
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