EA017863B1 - Высокоаффинный сайт связывания hgfr и способы идентификации его антагонистов - Google Patents

Abstract

Применение полинуклеотида, кодирующего, по меньшей мере, внеклеточные домены IPT-3 и IPT-4 рецептора фактора роста гепатоцитов, или полипептида, включающего, по меньшей мере, внеклеточные домены IPT-3 и IPT-4 рецептора фактора роста гепатоцитов, для скрининга и/или разработки фармакологически активных агентов, применяемых при лечении рака, предпочтительно рака, характеризующегося разбалансировкой рецептора фактора роста гепатоцитов.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к белковому рецептору фактора роста гепатоцитов (НСЕК). Более конкретно, настоящее изобретение относится к идентификации высокоаффинного сайта связывания НСЕК с его лигандом, фактором роста гепатоцитов (НСЕ) и к способам идентификации антагонистов НСЕК, направленных на высокоаффинный сайт связывания НСЕК.

Предпосылки создания изобретения

Рецептор фактора роста гепатоцитов (также известный как Ме!) представляет собой тирозинкиназу и является продуктом протоонкогена с-те!. Он состоит из α-субъединицы размером 50 кДа и βсубъединицы размером 145 кДа, которые соединены дисульфидной связью, при этом α-субъединица представляет собой полностью внеклеточный домен, тогда как β-субъединица включает (от Ν- до Сконца) внеклеточный участок, трансмембранный домен и цитоплазматический домен тирозинкиназы. Зрелый α/β гетеродимерный рецептор образуется при протеолитическом процессинге и терминальном гликозилировании одноцепочечного предшественника размером от 170 кДа.

НСЕ, также известный как фактор рассеяния, представляет собой гепаринсвязывающий гликопротеин с широким спектром биологической активности, включающим клеточную пролиферацию, мобильность, выживание и морфогенез клеток. Он синтезируется и секретируется в виде неактивного одноцепочечного предшественника (про-НСЕ), который хранится во внеклеточном матриксе в связи с его высокой аффинностью к протеогликанам. Про-НСЕ подвергается протеолитическому расщеплению по остаткам К494-У495, так что при этом может быть образована биологически активная форма, соединенный дисульфидной связью α/β гетеродимер, где α-цепь состоит из Ν-концевого домена, за которым следуют четыре крингл-домена, и где β-цепь характеризуется структурной гомологией с сериновыми протеазами из семейства химотрипсина. Однако β-цепь не обладает протеолитической активностью, поскольку два из трех важнейших участков, которые формируют каталитическую триаду, типичную для сериновых протеаз, не сохраняются в НСЕ. Несмотря на свою способность переносить сигнал, про-НСЕ связывается с Ме! с высокой аффинностью и замещает активный НСЕ.

В последнее время проводимые исследования структурно-функциональной взаимосвязи пролили некоторый свет на взаимодействия между внеклеточной частью Ме! и НСЕ.

Внеклеточный участок Ме! имеет модулярную структуру, которая охватывает три функциональных домена: домен Зета (присутствует также в семафоринах и плексинах), который включает первые 500 остатков на Ν-конце белка и содержит семилопастную β-пропеллерную структуру, домен РЗ1 (также обнаруженный в плексинах, семафоринах и интегринах), который включает примерно 50 остатков и содержат четыре консервативных дисульфидных связи, а также дополнительные 400 остатков, которые соединяют домен РЗ1 с трансмембранной спиральной структурой и которые заняты четырьмя доменами 1РТ (иммуноглобулин-родственные домены, присутствующие в плексинах и факторах транскрипции).

НСЕ представляет собой двухвалентный лиганд, содержащий высокоаффинный сайт связывания для Ме! в α-цепи и низкоаффинный сайт связывания в β-цепи. Взаимодействие между α- и β-цепью необходимо для достижения биологической активности НСЕ; тогда как α-цепь и, более точно, Ν-домен и первый крингл достаточны для связывания Ме!, для активации необходима β-цепь.

Определение кристаллической структуры доменов ЗЕМА и РЗ1 Ме! в комплексе с β-цепью НСЕ (см., например, ^0-А-2005/108424) показало, что низкоаффинный сайт связывания НСЕ расположен на лопасти 2-3 β-пропеллера и что часть НСЕ-β, которая связывается с Ме!, представляет собой тот же участок, который сериновые протеазы используют для связывания со своими субстратами или ингибиторами. Важно отметить, что определение кристаллической структуры β-цепи НСЕ с разрешением 2,53 А и специфический мутагенный анализ показали, что остатки, вовлекаемые в связывание Ме! в кармане активации β-цепи НСЕ, подвергаются экспонированию только после протеолитического превращения проНСЕ, и это объясняет, почему про-НСЕ связывается с Ме! с высокой аффинностью без его активации. Тогда как низкоаффинное взаимодействие β-цепи НСЕ и домена Зета в Ме! хорошо охарактеризовано и структурно, и функционально, в настоящее время неизвестно, какой участок Ме! связывается с α-цепью НСЕ с высокой аффинностью. Таким образом, основной механизм, посредством которого НСЕ активирует Ме!, все еще остается малопонятным. Это является в некоторой степени неожиданным, учитывая высокую биологическую и терапевтическую важность этого пути.

Сигнальная функция НСЕ-Ме! необходима в ходе эмбриогенеза и в процессе регенерации ткани у взрослого организма. Важно отметить, что разбалансированная сигнальная функция НСЕ-Ме! играет ключевую роль в канцерогенезе и метастазировании. Несоответствующая активация Ме! посредством различных механизмов, включающих аутокринную стимуляцию НСЕ, суперэкспрессию рецептора, генную амплификацию и точечную мутацию, описана во многих случаях злокачественных образований человека и коррелирует с плохим прогнозом. В совокупности, все данные такого рода способствовали росту интереса к исследованию функции НСЕ-Ме!, в качестве мишени при терапии рака, что привело к разработке множества ингибиторов Ме!/НСЕ. Указанные ингибиторы включают соединения на основе небольших молекул, действие которых направлено на активность Ме!-киназы, нейтрализацию анти-Ме! или анти-НСЕ антител, ложных рецепторов и производных от факторов НСЕ. Тем не менее, достигают

- 1 017863 ли молекулы высокоаффинного сайта связывания для НОЕ и каков точный молекулярный механизм, лежащий в основе высокоаффинного связывания НОЕ с Мс1. все еще неизвестно. Это незнание может мешать выделению более селективных терапевтических агентов с повышенной чувствительностью и с меньшими побочными эффектами. Точное знание высокоаффинного сайта связывания Ме! для НОЕ, несомненно, может способствовать разработке высокоспецифичных антагонистов Ме!.

Краткое описание сущности изобретения

Соответственно, имеется потребность в усовершенствованных подходах к идентификации антагонистов Ме! с повышенной чувствительностью и меньшими побочными эффектами с целью разработки более эффективных терапевтических стратегий лечения рака.

Целью настоящего изобретения является разработка такого усовершенствованного подхода.

Согласно настоящему изобретению такие цели достигаются благодаря подходу, характеристики которого описаны в прилагаемой формуле изобретения. Указанная формула изобретения составляет интегральную часть технического описания, приведенного по материалам настоящего изобретения.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является идентификация высокоаффинного сайта связывания НОЕ с рецептором фактора роста гепатоцита (НОЕК), т.е. внеклеточными доменами ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 НОЕК. Другим объектом настоящего изобретения является разработка средств идентификации антагонистов НОЕК, направленных на высокоаффинный сайт связывания НОЕК с НОЕ, с целью разработки новых терапевтических стратегий лечения рака.

Согласно одному варианту настоящее изобретение относится к использованию полипептида, включающего, или полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один из внеклеточных доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 фактора роста гепатоцитов, для скрининга и/или разработки фармацевтически активных агентов, применимых при лечении рака, в частности рака, для которого характерно нерегулируемая активность рецептора фактора роста гепатоцитов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный фармацевтически активный агент представляет собой ингибитор и/или антагонист рецептора фактора роста гепатоцитов, и он может быть выбран из числа ингибиторов на основе малых молекул, аптамеров, антисмысловых нуклеотидов, РНК-ингибиторов, киРНК, антител, пептидов, доминантных отрицательных факторов.

В еще одном варианте настоящее изобретение относится к способу выявления способности исследуемого агента действовать в качестве антагониста/ингибитора рецептора фактора роста гепатоцитов, который может использоваться при лечении рака, предпочтительно рака, для которого характерно нерегулируемая активность рецептора фактора роста гепатоцитов, где указанный способ включает стадии:

(a) приведения в контакт исследуемого агента по меньшей мере с одним из внеклеточных доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 рецептора фактора роста гепатоцитов или с клетками, экспрессирующими по меньшей мере один из внеклеточных доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 рецептора фактора роста гепатоцитов;

(b) определения активности рецептора фактора роста гепатоцитов, его функции, стабильности и/или экспрессии;

(c) отбора агента, который снижает активность рецептора фактора роста гепатоцитов, его функцию, стабильность и/или экспрессию.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию внеклеточных доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 рецептора фактора роста гепатоцитов в качестве лекарственного средства для лечения рака.

Подробное описание изобретение

Ниже настоящее изобретение описывается подробно применительно к некоторым предпочтительным вариантам с помощью неограничивающих примеров и со ссылкой на прилагаемые фигуры.

На фиг. 1 проиллюстрированы процессы конструирования и очистки субдоменов Ме! и НОЕ. (А) В схематическом виде приведены сконструированные белки, использованные в данном исследовании. На левой панели: сконструированные рецепторы. ν.Τ. МЕТ означает Ме! дикого типа; ΕΧΤΚΑ означает внеклеточную часть; ΙΝΤΚΑ означает внутриклеточную часть, 8Ρ означает сигнальный пептид; 8ЕМА означает домен, гомологичный семафорину; Ρ8Ι означает домен, гомологичный плексинсемафорин-интегрину; ΙΡΤ 1-4 означает домен 1-4, гомологичный фактору транскрипции иммуноглобулина-плексина; ТМ означает трансмембранный домен; 1М означает смежный мембранный домен; ΚΌ означает киназный домен; СТ означает С-концевой фрагмент; Е означает эпитоп ЕЬАО или МУС; Н означает полигистидиновый фрагмент. Красный треугольник означает сайт протеолитического расщепления между α- и β-цепью. Правая панель: сконструированные лиганды. ν.Τ. НОЕ означает НОЕ дикого типа; ΝΏ означает Ν-домен; К 1-4 означает крингл 1-4; ΡΕΟ означает протеазоподобный домен; ЕЛ'СЕ. НОЕ означает нерасщепляемый НОЕ. Стрелка указывает замещение по аминокислотам К494О в протеолитическом сайте. (В) Окрашивание кумасси-красителем очищенных аффинной хроматографией рецепторов и лигандов. Каждая белковая группа (8еша, ЗешаФЗС ложный Ме!; Ρ8Ι-ΙΡΤ, ΙΡΤ; НОЕ-α, нерасщепляемый НОЕ, НОЕ; НОЕ ΝΚ1, НОЕ-β) была отделена путем электрофореза в 808-ЕЛСЕ в невосстановительных условиях и количественно определена по стандартной кривой, построенной на основе бычьего сывороточного альбумина (БСА). М.в. означает маркер молекулярного веса; кДа - обозначе

- 2 017863 ние килодальтон.

На фиг. 2 показаны результаты анализа продуктов взаимодействия НСЕ-Ме1 по процедуре ЕЬ1§Л. (А) Связывание субдоменов Ме! с активным НСЕ. Генетически сконструированные рецепторы иммобилизуют в твердой фазе и экспонируют с возрастающими концентрациями активного НСЕ в жидкой фазе. Наличие связывания выявляют с использованием анти-НСЕ антител. Неспецифическое связывание определяют при использовании БСА вместо очищенных рецепторов в твердой фазе. (В, С, Ό) Связывание ложного Ме!, 8ета-Р81 и ΙΡΤ с разными формами НСЕ. Генетически сконструированные рецепторы иммобилизуют в твердой фазе и экспонируют с возрастающими концентрациями активного НСЕ с МУСфрагментом, про-НСЕ, НСЕ-α или НСЕ ΝΚ1 в жидкой фазе. Наличие связывания выявляют с использованием анти-МУС антител. Неспецифическое связывание определяют при использовании ангиостатина (А8) с МУС-фрагментом в жидкой фазе.

На фиг. 3 показано, что домены ΙΡΤ 3 и 4 являются достаточными для высокоаффинного связывания с НСЕ-α. (А) Дано схематическое описание вариантов ΙΡΤ с делециями. Маркировка по цвету и условия соответствуют описанию, приведенному на фиг. 1А. (В) Анализ взаимодействия между вариантами ΙΡΤ и НСЕ-α по процедуре ЕБ18А. Генетически сконструированные ΙΡΤ иммобилизуют в твердой фазе и экспонируют с возрастающими концентрациями НСЕ-α в жидкой фазе. Наличие связывания выявляют с использованием анти-НСЕ антител.

На фиг. 4 показано, что домены ΙΡΤ 3 и 4 являются достаточными для связывания с НСЕ в живых клетках. (А) Дано схематическое описание делетированного рецептора Ме!_Д25-741 (Ме!Д25-741). Маркировка по цвету и условия соответствуют описанию, приведенному на фиг. 1А. (В) Анализ характера поверхностного биотинилирования. Клеточные белки подвергают иммунопреципитации (ΙΡ) с использованием антител против С-концевой части Ме! и анализируют путем вестерн-блоттинга (\УВ) с использованием пероксидазы хрена, конъюгированной со стрептавидином (8А). Те же самые блоты подвергают повторному зондированию с использованием анти-Ме! антител. ^.Τ. означает дикий тип; А549 означает клетки карциномы легкого человека А549; МЭА означает клетки меланомы человека МОЛ-УЭ-435; ΤΟν означает клетки карциномы яичника человека ΤΘν-112Ό; Етр!у V. означает пустой вектор. Полоса р170 соответствует непроцессированному Ме!; р145 представляет собой зрелую форму рецептора. (С) Анализ химической перекрестной сшивки. Клетки ΤΘν-112Ό, экспрессирующие Ме!д_25-74Ь и клетки ΤΘν-112Ό дикого типа (^.Τ. ΤΟν) ингибируют с НСЕ и затем подвергают химической сшивке. Клеточные лизаты подвергают иммунопреципитации с использованием анти-Ме! антител и анализируют по методу вестерн-блоттинга с использованием анти-НСЕ антител. Стрелка указывает на комплексы НСЕМе!_Д25-741. (Ό) Анализ фосфорилирования Ме!. Клетки ΤΘν-112Ό, экспрессирующие Ме!д_25-74Ь стимулируют с использованием 1% ЕВ8, в качестве отрицательного контроля, и равных количеств НСЕ, проНСЕ, НСЕ ΝΚ1 или ΝΚ1-ΝΚ1. Уровень фосфорилирования рецептора определяют путем иммунопреципитации с использованием анти-Ме! антител и процедуры вестерн-блоттинга с анти-фосфотирозиновыми антителами (ηιΉί-ρΤχτ). Те же самые блоты подвергают повторному зондированию с использованием анти-Ме! антител. Стрелки указывают на полосы, соответствующие Ме!д_25-741 или иммуноглобулинам (Ι§). (Е) Схематическое изображение ΝΚ1-ΝΚ1. В направлении от Ν- к С-концу: 8Ρ означает сигнальный пептид; ΝΏ означает домен Ν; Κ1 означает крингл 1; Н означает полигистидиновый фрагмент.

На фиг. 5 показано, что растворимый ΙΡΤ ингибирует НСЕ-индуцированный инвазивный рост ίη νί!го. (А) Клетки МОА-МВ-435, трансдуцированные лентивирусным вектором, стимулируют рекомбинантным НСЕ, и определяют фосфорилирование Ме! путем иммуноблоттинга с использованием антифосфотирозиновых антител (верхняя панель). Тот же самый блот подвергают повторному зондированию с использованием анти-Ме! антител (нижняя панель). Етр!у ν. означает пустой вектор. (В) Тест на морфогенез в направлении ветвления. Предварительно сформированные сфероиды клеток МОА-МВ-435, трансдуцированные лентивирусным вектором, погружают в коллаген и затем стимулируют рекомбинантным НСЕ с образованием разветвленных трубочек. Инвазию коллагена определяют количественно путем подсчета среднего числа трубочек, прорастающих из каждого сфероида. ЕV означает пустой вектор; ОМ означает ложный Ме!; 8Ρ означает 8ета-Ρ8I. (С) Репрезентативные снимки, полученные в рамках эксперимента, согласно пункту В. Увеличение: 200 раз.

На фиг. 6 показано, что растворимый ΙΡΤ проявляет противоопухолевую и антиметастатическую активность у мышей. Мышам линии СЭ-1 пи-/- инъецируют подкожно клетки МОА-МВ-435, трансдуцированные лентивирусным вектором, и отслеживают рост опухоли с течением времени. (А) График типа графика Каплан-Мейер по оценке латентного периода роста опухоли (на оси X показано время в днях, на оси Υ показан процент животных, не содержащих опухоли). Етр!у ν. означает пустой вектор. (В) Средний объем опухоли с течением времени. (С) Иммуногистохимический анализ срезов опухолевой ткани с использованием анти-ЕЬАС антител. Увеличение: 400 раз. (Ό) Исследование опухоли сосудов. Срезы опухолевой ткани окрашивают антителами против фактора Фон Виллебранда. Количество сосудов на квадратный мм среза опухоли определяют путем микроскопирования. ЕV означает пустой вектор; ОМ означает ложный Ме!; 8Ρ означает 8ета-Ρ8I. (Е) Анализ частоты метастазирования. После аутопсии проводят серийный анализ срезов ткани из легкого, путем микроскопирования, с целью выявления нали

- 3 017863 чия микрометастаз. Частота метастаз, т.е. количество мышей с метастазами, относительно их суммарного количества, указывается в виде процентного значения (на диаграмме) и размера фракции (в конце соответствующего столбика на диаграмме). (Е) Репрезентативные снимки микрометастаз, полученные в группе с пустым вектором. Срезы ткани легкого окрашивают гематоксилином и эозином. Пунктирной линией обозначены стенки кровеносных сосудов (νκ). Метастазные клетки (тс) обнаруживаются внутри сосудов в виде эмбол или в паренхиме. Увеличение: 400 раз.

Данные, представленные в настоящем описании, дают основания полагать, что α-цепь НСЕ связывается с участком ΙΡΤ Ме! с высокой аффинностью и что это происходит независимо от процессинга лиганда. Указанные данные также позволяют полагать, что связывание НСЕ с ΙΡΤ в том случае, когда трансмембранный Ме! не содержит домен 8ета, является достаточным для переноса сигнала, необходимого для активации рецептора, в цитоплазматический киназный домен, даже без разграничения между неактивной и активной формами лиганда. Таким образом, в совокупности, представленные данные подтверждают тот факт, что генетически сконструированные белки, полученные на основе участка ΙΡΤ и домена 8еша Ме!, способны нейтрализовать проинвазивную активность НСЕ как ίη νί!το, так и ίη νίνο.

Уже достаточно давно известно, что НСЕ представляет собой бивалентный фактор. Предшествующие исследования в области конструирования белков идентифицировали высокоаффинный Ме!связывающий сайт, включающий домен N и первый крингл НСЕ. Впоследствии в рамках биохимического и биологического анализа удалось продемонстрировать, что протеазоподобный сериновый домен НСЕ (β-цепь), будучи необязательным для связывания, выполняет ключевую роль в процессе активации рецептора. В последнее время были получены детальные кристаллографические данные и результаты исследования мутагенеза, которые дали хорошую базу для структурной и функциональной характеристики низкоаффинного Ме!-связывающего сайта на β-цепи НСЕ и его способности взаимодействовать с доменом 8ета Ме!. Интерфейс между α-цепью НСЕ и Ме! оставался, тем не менее, неисследованным. Результаты анализа малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, а также данные криоэлектронной микроскопии позволили предположить наличие контактов между Ν-концевым и первым доменом крингл НСЕ и доменом 8ета Ме!. Однако результаты анализа по методу плазмонного резонанса показали, что это взаимодействие характеризуется очень низкой аффинностью (примерно в 2 раза ниже, чем соответствующая аффинность НСЕ-β для 8ета, и в 100 раз ниже, чем соответствующая аффинность НСЕ-α для интактного рецептора). Поскольку такое слабое взаимодействие не может отвечать за наблюдаемую жесткую связь между НСЕ и Ме!, следует признать, что высокоаффинный НСЕ-связывающий сайт на Ме! до сих пор не исследован и его предстоит идентифицировать.

Представленные в настоящем описании результаты вносят определенный вклад в заполнение этого пробела и дают основание полагать, что рассматриваемый НСЕ-связывающий сайт находится в участке ΙΡΤ Ме! и, точнее, в двух последних иммуноглобулинных доменах, вблизи клеточной мембраны. Несколько представленных в настоящем описании экспериментальных доказательств указывают, что это действительно может иметь место. Во-первых, растворимый делетированный рецептор Ме!, не содержащий ничего, кроме четырех доменов ΙΡΤ (ΙΡΤ), связывается с НСЕ практически с той же аффинностью, что и полная внеклеточная часть Ме!. И наоборот, 8ета демонстрирует очень низкую активность в отношении НСЕ. Во-вторых, ΙΡΤ связывается с активным НСЕ, про-НСЕ или НСЕ-α, с неизмененной прочностью. В-третьих, делеция ΙΡΤ 1 и ΙΡΤ 2 не влияет на аффинность ΙΡΤ для любой из форм НСЕ. Вчетвертых, сконструированный рецептор Ме!, содержащий крупную делецию в эктодомене, соответствующем домену 8ета, модуль Ρ8Ι и два первых иммуноглобулиноподобных домена (Ме!_Д25-741), сохраняет способность связываться с НСЕ и переносить соответствующий сигнал для активации киназы внутрь клетки, хотя при этом не происходит разграничения между активным НСЕ и про-НСЕ. И, наконец, димерная форма НСЕ ΝΚ1, которая, как известно, содержит минимальный Ме!-связывающий домен НСЕα, способна вызывать активацию Ме!_Д25-741 столь же эффективно, если не более выражено, чем НСЕ, идентифицируя таким образом в ΙΡΤ 3-4 НСЕ ΝΚΙ-связывающий сайт.

В то время как представленные данные указывают на ключевую роль ΙΡΤ в связывании НСЕ, следует отметить, что в двух предшествующих структурно-функциональных исследованиях внеклеточной части Ме! не удалось идентифицировать какого-либо сайта связывания лиганда в данном участке. Результаты первого предварительного исследования по картированию эктодомена Ме! дали основание полагать, на основе данных ЕЫ8Л, что 8ета является необходимым и достаточным для связывания НСЕ. В рамках второго исследования была проанализирована роль домена 8ета в димеризации рецептора, и полагают, что сконструированная форма внеклеточной части Ме!, содержащая делецию в домене 8ета, не способна к сопреципитации с НСЕ.

В настоящем изобретении также показано, что взаимодействие между 8ета и ΙΡΤ наблюдается и в том случае, когда внеклеточную часть Ме! используют в качестве биотехнологического инструмента для ингибирования НСЕ-индуцированного инвазивного роста. По данным анализа ίη νί!το, а также с использованием мышиных ксенотрансплантатов растворимые белки и ΙΡΤ, и 8ета-Ρ8I демонстрировали значительный ингибирующий эффект. Однако ни один из них не демонстрировал мощного ингибирования, которое проявил полноразмерный эктодомен Ме!, который содержит и низкоаффинный, и высокоаф

- 4 017863 финный НСЕ-связывающий сайт. Это означает, что оба рассматриваемых вида взаимодействия вносят определенный вклад в контроль активности Ме!. Несмотря на то что контакт НСЕ-в-8ета уже был идентифицирован в качестве мишени для проведения терапии, представленные результаты описывают второй интерфейс, который дает возможности для фармакологической интервенции. Рекомбинантные белки или антитела, которые связываются с ΙΡΤ участком вместо истинного НСЕ, могут использоваться в качестве высококонкурентных ингибиторов Ме! при проведении лечения НСЕ/Ме!-зависимых видов рака.

Материалы и методы

Конструирование белков.

Растворимые или трансмембранные рецепторы и сконструированные лиганды, описанные в настоящей работе, были получены по стандартам процедурам ПЦР и генетической инженерии. Все факторы сохраняют консервативную последовательность своих исходных белков на Ν-конце. Аминокислотные (ак) последовательности растворимых белков Ме! (Сепе Вапк Ν. Х54559) соответствуют 1-24 (сигнальный пептид) плюс: ложный Ме1, ак 25-932; 8ета, ак 25-515; 8ета-Р81, ак 25-562; Ρ8ΙΙΡΤ, ак 516-932; ΙΡΤ, ак 563-932; 1РТД1, ак 657-932; ΙΡΤΔ1-2, ак 742-932; ΙΡΤ-3, ак 742-838; ΙΡΤ-4, ак 839-932. На С-конце каждой молекулы добавляется двойной ЕЬАС (8ΌΎΚΌΌΌΌΚ - 8ЕЦ ΙΌ N0:19) или один МУС (ЕЦКΕΙ8ΕΕΌΕΝ - 8ЕЦ ΙΌ N0:20) эпитопная последовательность и полигистидиновый фрагмент (ННННННН 8ЕЦ ΙΌ N0:21) для детекции белка и его очистки. Трансмембранный сконструированный МеЦ_25-741 идентичен Ме1 дикого типа, за исключением делетированного участка (ак 25-741). Аминокислотные последовательности сконструированных белков НСЕ (Сепе Вапк Ν. М73239) соответствуют ак 1-31 (сигнальный пептид) плюс: НСЕ, ак 32-728; НСЕ-α, ак 32-473; НСЕ ΝΚ1, ак 32-205; НСЕ-β, ак 495-728. Указанные выше эпитопы МУС или ЕЬАС и полигистидиновый фрагмент добавляют на С-конце. Нерасщепляемый НСЕ был описан ранее (Маххопе, М. е1 а1. (2004), 1. С1ш Шуей. 114(10), 1418-5 1432). ΝΚ1-ΝΚ1 представляет собой димерную форму НСЕ ΝΚ1, состоящую из того же Ν-концевого участка НСЕ, с тандемным повтором (ак 1-205, непосредственно соединенные с ак 32-205, без спейсера). кДНК, кодирующие все сконструированные белки, субклонируют в лентивирусном трансфер-векторе рЯК^δ^η.ΡΡΤ.СМV.еСЕΡ.^р^е (8ЕЦ ΙΌ Ν0:1) вместо дГр кДНК, как было описано ранее (Ео11епхг А. е1 а1. (2000), №11 Сепе1. 25(2), 217-222). Последовательность, кодирующую СЕΡ, замещают следующими кДНК: ложный те! ЕЬАС.Ык (8ΕΟ ΙΌ Ν0:2), 8ета ЕЬАО.Ыз (8ΕΟ ΙΌ Ν0:3), Зета-ΡδΙ ЕЬАС.ЬН (8ΕΟ ΙΌ Ν0:4), Ρ8Ι-ΙΡΤ ЕЬАС.Ш (8ΕΟ ΙΌ Ν0:5), ΙΡΤ ЕЬАС.Ык (8ΕΟ ΙΌ Ν0:6), ΙΡΤ Δ1 ЕЬАС.Ш (8ΕΟ ΙΌ Ν0:7), ΙΡΤ Δ1-2 ЕЬАС.ЬН (8ΕΟ ΙΌ Ν0:8), ΙΡΤ 3 ЕЬАС.Ш (8ΕΟ ΙΌ Ν0:9), ΙΡΤ 4 ЕЬАС.ЬН (8ΕΟ ΙΌ Ν0:10), МеЦ_25-7₄1 (81 № ΙΌ Ν0:11), НСЕ МУС Ь18 (8ΕΟ ΙΌ Ν0:12), НСЕ-α МУС 1ΐδ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:13), НСЕ-Ж1 МУС 118 (8ΕΟ ΙΌ Ν0:14), НСЕ-β МУС 1ΐδ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:15), нерасщепляемый НСЕ МУС Ηδ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:16), ΝΚ1-ΝΚ1 1ΐδ (8ΕΟ ΙΌ Ν0:17), МУС 1ίδ ангиостатина (8ΕΟ ΙΌ Ν0:18).

Иммуноферментный твердофазный анализ.

Все сконструированные рецепторы и факторы собирают из кондиционированной бессывороточной среды, в которой выращивались клетки меланомы человека МОА-МВ-345, трансдуцированные лентивирусным вектором. Очистку фактора проводят в рамках процедуры аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом, как было описано ранее (в работе М1сЫе11 Ρ. е! а1. (2002), №а1 Вю!ес11по1. 20(5), 488-495). Конверсию про-НСЕ в активный НСЕ осуществляют в ходе инкубации очищенного про-НСЕ (максимальная концентрация 100 нг/мкл) с наличием 2-10% ЕВ8 (81дта, 8!. Ьош8, М188оип) при температуре 37°С в течение 24 ч. Указанную конверсию фактора анализируют по методу вестерн-блоттинга с использованием анти-НСЕ антител (Ρ.&Ό 8у8!ет8, М1ппеаро118, Мшпе8о!а).

Нерасщепляемый НСЕ подвергают тем же процедурам инкубации с ЕВ8, как и в случае про-НСЕ, и далее используют во всех тестах, которые позволяют проводить сравнение активного НСЕ с непроцессированным НСЕ. Связывание сконструированных лигандов с растворимыми рецепторами определяют по методу ΕΌΙ8Α с использованием растворимых рецепторов с фрагментом ЕЬАС в твердой фазе, а также сконструированных лигандов с фрагментом МУС в жидкой фазе. Фиксированную концентрацию очищенного растворимого рецептора (100 нг/лунку) вносят для адсорбции в 96-луночные планшеты для ΕΌΙ8Α. Планшеты с наслоенным белком инкубируют с возрастающими концентрациями сконструированных лигандов, и достигаемое при этом связывание выявляют с использованием биотинилированных анти-НСЕ антител (Ρ.&Ό 8у8!ет8, М1ппеаро118, М1ппе8о!а) или анти-МУС антител (8ап!а Сгих Вю1ес1шо1оду, 8ап!а Стих, СаИГогша). Полученные данные по связыванию анализируют и оценивают с использованием программного обеспечения Ρπδΐη (Стар! Ροά 8оГШаге, 8ап О1едо, СайГогтаа).

Клеточная культура.

Клетки меланомы человека МОА-МВ-435 получают из Сеогде!о^п Ишуегайу Τίδδΐκ Си1!иге 81аге6 К.е8оигсе (^а8Ыпд!оп, 0181г1с! оГ Со1итЫа). Клетки поддерживают в среде ОМБМ с добавкой 10% ЕВ8 (81дта). Клетки карциномы яичника человека Τ0Υ-112Ό получают из АТСС (КоскуШе, Магу1апб; АТСС Ν. СКЬ-11731) и культивируют с использованием смеси 1:1 среды МСОВ 105 и среды 199 с добавкой 15% ЕВ8 (все компоненты от компании 81дта). Клетки карциномы легкого человека А549 также получают из АТСС (АТСС Ν. ССЬ-185) и поддерживают в среде ΚΡΙΗΙ с добавкой 10% ЕВ8.

- 5 017863

Лентивирусные векторы.

Основную массу вектора получают путем временной трансфекции 293Т клеток по описанной ранее методике (Έοΐΐοηζί. А. е! а1. (2000), №11 Сепе!. 25 (2), 217-222). В общих чертах, методика состоит в том, что получают смесь плазмидных ДНК для трансфекции при объединении: плазмиды ΕΝν (У8У-О), 9 мкг; УПАКОВОЧНОЙ плазмиды рМПЬд/рВВЕ, 16,2 мкг; плазмиды ΒΕν, 6,25 мкг; ТРАНСФЕРВЕКТОРА (плазмида #2-18), 37,5 мкг. Указанные плазмиды разбавляют раствором ТЕ/СаС1₂, к которому добавляют раствор НВ8, при перемешивании в вихревом смесителе с максимальной скоростью. Полученную смесь ДНК/СаС1₂/НВ8 сразу добавляют по каплям к планшету для клеток, который инкубируют при температуре 37°С. Через 14-16 ч культуральную среду заменяют свежей средой. Супернатанты клеточной культуры, содержащие векторные частицы, собирают через 36 ч после замены среды. После сбора супернатанты фильтруют через мембраны с размером пор 0,2 мкм и хранят при температуре -80°С. Концентрацию вирусного антигена р24 определяют с использованием набора для выявления основного профиля ВИЧ-1 р24 в рамках ЕЬ18А (ΝΕΝ ЫЕе 8с1епсе Ргобис!к, Вок!оп, Маккасйике!!к), в соответствии с инструкциями производителя. Далее клетки трансдуцируют в 6-луночных планшетах (10⁵ клеток/лунку в 2 мл среды) с использованием 40 нг/мл р24 в присутствии 8 мкг/мл полибрена (8щта) по описанной ранее методике (^дпа, Е. и №11бшг Ь. (2000), 1. Оепе Меб. 2(5), 308-316). Среду заменяют через 18 ч после трансдукции. С течением времени отслеживают рост клеток и оценивают продукцию белка. Далее, трансдуцированные клеточные линии высевают в чашки Петри диаметром 15 см, растят до 80% слияния и инкубируют в бессывороточной среде. Через 72 ч супернатанты, содержащие рекомбинантные растворимые белки, собирают, фильтруют и очищают аффинной хроматографией или хранят при температуре -30°С.

Иммунопреципитация и вестерн-блот анализ.

Клеточный лизис, иммунопреципитацию и вестерн-блоттинг проводят с использованием экстрагирующего буфера (ЕВ) по описанной ранее методике (Ьопдаб, Р. е! а1. (1994), Опсодепе 9(1), 49-57). Сигнал выявляют с использованием системы ЕСЬ (Атегкйат В1окс1епсек, Р1кса!атау, №\ν 1егкеу) в соответствии с инструкциями производителя. Анти-Ме! антитела, описанные Висо, Ь.Р. е! а1. (1996), 1. Ра1По1. 180(3), 266-270, получают от ИВ1 (Ьаке Р1ас1б, №\ν Уогк). Анти-Ме! антитела для вестерн-блоттинга получают от компании 8ап!а ί'πιζ. Анти-ΕΈΑΟ антитела получают от компании 8щша. Анализ фосфорилирования Ме! в клетках МИА-МВ-435, трансдуцированных лентивирусным вектором, проводят по описанной ранее методике (МкЫей, Р. е! а1. (2004), Сапсег Се11 6(1), 61-73).

Анализ сшивки НОЕ и активации Ме!.

Клетки Τ0ν-112Ό, трансдуцированные лентивирусным вектором, которые экспрессируют Ме!_Д25-741, подвергают анализу для оценки поверхностного биотинилирования с использованием модульного набора для определения поверхностного биотинилирования ЕСЬ™ (Атегкйат Вюкаепсек) в соответствии с инструкциями производителя. Химическую сшивку проводят по описанной ранее методике (Маζζοηе, М. е! а1. (2004), 1. С1ш 1пуек!. 114(10), 1418-1432). В общих чертах процедура состоит в том, что клетки подвергают депривации в отношении сывороточных факторов роста в течение 3 дней и затем инкубируют с 1 нМ НОЕ в течение 3 ч. Клеточные лизаты подвергают иммунопреципитации с использованием антител против С-концевой части Ме! по описанной ранее методике (Висо, Ь.Р. е! а1. (1996), 1. Ра11ю1. 180(3), 266-270), разрешают электрофорезом в δΌδ-РАОЕ с использованием 3-10% градиента полиакриламида и анализируют по процедуре вестерн-блоттинга с использованием анти-НОЕ антител (Β&Ό). Для проведения анализа активации рецепторов клетки Τ0ν-112Ό, экспрессирующие Ме!_Д25-741, подвергают депривации в отношении сывороточных факторов роста в течение 3 дней и затем стимулируют с использованием 1 нМ НОЕ, нерасщепляемого НОЕ, НОЕ ΝΚ1 или ΝΚ1-ΝΚ1 в течение 10 мин. Далее клетки лизируют с использованием буфера ЕВ по описанной ранее методике (Ьопдаб, Р. е! а1. (1994), Опсодепе 9(1), 49-57). Клеточные белки подвергают иммунопреципитации с использованием анти-Ме! антител по описанной ранее методике и анализируют по процедуре вестерн-блоттинга с использованием анти-фосфотирозиновых антител (ИВ1). Те же самые блоты подвергают повторному зондированию анти-Ме! антителами (Висо, Ь.Р. е! а1. (1996), 1. Ра!йо1. 180(3), 266-270).

Биологические тесты.

Тесты на инвазию коллагена с использованием клеток МИА-МВ-435 проводят с использованием предварительно сформированных сфероидов по описанной ранее методике (М1сЫе11, Р. е! а1. (2004), Сапсег Се11 6(1), 61-73). В общих чертах процедура состоит в том, что сфероиды получают при инкубации клеток в течение ночи (700 клеток/лунку) в неадгезирующих условиях в 96-луночных планшетах (Огешег, ЕпскепНаикеп, Оегтапу) в присутствии 0,24 г/мл метилцеллюлозы (81дта). Сфероиды погружают в коллагеновую матрицу, содержащую 1,3 мг/мл коллагена типа I из хвостовой части крыс (ВИ Вюкаепсек, ВебГогб, Маккасйике!!к) и 10% ЕВ8, с использованием 96-луночных планшетов (40 сфероидов/лунку). Погруженные в коллаген сфероиды культивируют при температуре 37°С в течение 24 ч и затем стимулируют с использованием 30 нг/мл НОЕ (Β&Ό) или без фактора культивируют в течение дополнительных 24 ч. Подсчитывают под микроскопом количество трубочек, прорастающих из каждого сфероида. Анализируют по меньшей мере 12 сфероидов на каждую экспериментальную точку.

- 6 017863

Тесты на канцерогенез.

Опухолевые клетки ΜΌΆ-ΜΒ-435, трансдуцированные лентивирусным вектором (3х10⁶ клеток/мышь), в 0,2 мл ΌΜΕΜ инъецируют подкожно в правый задний бок шестинедельных иммунодефицитных пи-/- самок мышей линии 8\νίδ5 СЭ-1 (Сйат1е8 Ищет ЬаЬотаФпек, Са1со, Йа1у). Размер опухоли оценивают каждые 2 дня с помощью циркуля. Объем опухоли вычисляют по формуле У=4/3пх2у/2, где х означает ось, на которой указывается размер малой опухоли; у означает ось, на которой указывается размер крупной опухоли. Массу опухоли в 15 мм³, примерно соответствующую исходному объему, занимаемому инъецированными клетками, выбирают в качестве порогового значения для оценки положительных результатов по наличию опухоли. Тех мышей, у которых опухоли ниже этого порогового значения, рассматривают как несодержащих опухоль. Примерно через 4 недели мышей умерщвляют и отбирают опухоли для анализа. Далее животных подвергают аутопсии. Опухоли и легкие погружают в парафин и обрабатывают для целей гистологического анализа. Анализ микрометастазирования проводят под микроскопом на серийных срезах ткани легкого, окрашенных гематоксилином и эозином. Срезы опухолевых тканей окрашивают гематоксилином и эозином и отправляют для анализа независимому патологу, не информированному о природе того или иного образца. Экспрессию трансгена определяют на срезах опухолевой ткани путем иммуногистохимического анализа с использованием анти-ЕТАО антител (81дша). Срезы подвергают контрастному окрашиванию гематоксилином Мейера (81дта). Ангиогенез опухоли оценивают в рамках иммуногистохимического анализа с использованием антител против фактора Фон Виллебранда (ΌΑΚΟ, С1о51гнр. Эентагк). Срезы тканей подвергают контрастному окрашиванию по указанной выше методике. Плотность сосудов оценивают под микроскопом. При этом анализируют по меньшей мере 12 полей в расчете на одно животное. Все процедуры, выполняемые на животных, одобрены Этической Комиссией Университета Турина, Италия, и Министерством Здравоохранения Италии.

Статистический анализ.

Статистическую значимость полученных результатов оценивают с использованием двустороннего гомоскедастичного критерия Стьюдента (совокупность данных 1 - контрольная группа; совокупность данных 2 - экспериментальная группа). Для всех проанализированных данных принимают в качестве порогового значения значимости показатель р<0,05. На всех чертежах приведенные значения выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, а статистическая значимость указывается одной (р<0,05) или двойной (р<0,01) стрелкой.

Результаты

Конструирование функциональных доменов НОЕ/Ме!.

Схематическое изображение функциональных доменов, содержащихся в Ме! и НОЕ, показано на фиг. 1А. Внеклеточная часть Ме! включает домен 8ета, шарнирную область Ρ8Ι и четыре модуля ΙΡΤ (левая панель). НОЕ состоит из α- и β-цепей, соединенных дисульфидным мостиком в зрелом белке. В свою очередь, α-цепь состоит из Ν-концевого домена и четырех кринглов (правая панель). Для анализа характера взаимодействия между Ме! и НОЕ авторы выражают все данные, описывающие указанные функциональные домены, применительно к индивидуальным растворимым белкам. Функциональные домены конструируют таким образом, чтобы они содержали на своем Ν-конце сигнальный пептид исходного белка, чтобы они могли быть секретированы. Добавляют на С-конце экзогенный эпитоп (ЕЬАО или МУС) для распознавания антитела и полигистидиновый фрагмент для очистки белка. Все кДНК, кодирующие сконструированные факторы, подвергают клонированию в лентивирусном векторе рЯКТ81п.РРТ.СМУ.^рге, а частицы рекомбинантного лентивируса получают по методике, описанной в разделе Материалы и методы. Рекомбинантные белки собирают из кондиционированной среды клеток меланомы человека МОА-МВ-435, трансдуцированных лентивирусным вектором, и очищают до гомогенности аффинной хроматографией. Очищенные белки оценивают количественно в рамках 8Э8-РАОЕ с использованием стандартов (фиг. 1В).

Анализ взаимодействий Ме!-НОЕ с использованием процедуры ЕЬ18А.

Способность эктодоменов Ме! взаимодействовать с НОЕ исследовали в тестах на связывание по методу ЕЬ18А. Растворимые рецепторы (ложный Ме!, 8ета-Р81, 8ета, Ρ8Ι-ΙΡΤ, ΙΡΤ) иммобилизуют в твердой фазе и экспонируют с возрастающими концентрациями активного НОЕ. Наличие связывания выявляют с использованием биотинилированных анти-НОЕ антител. Неспецифическое связывание НОЕ определяют с использованием, вместо доменов растворимого Ме!, бычьего сывороточного альбумина (БСА) в твердой фазе. Связывающую аффинность определяют в рамках нелинейного регрессионного анализа, в соответствии с описанием, приведенным в разделе Материалы и методы. В используемых условиях ложный Ме! связывается с НОЕ со значением Κ примерно 0,2-0,3 нМ. Как и в предыдущих экспериментах, 8ета-Ρ8I и 8ета связываются с НОЕ с аффинностью, которая по меньшей мере на один логарифм ниже, в сравнении с таковой для ложного Ме!. Неожиданно было обнаружено, что и Ρ8Ι-ΙΡΤ, и ΙΡΤ связываются с НОЕ очень эффективно, почти с той же эффективностью, что и ложный Ме! (фиг. 2А). Присутствие или отсутствие домена Ρ8Ι не влияет на связывающую аффинность с НОЕ ни 8ета, ни ΙΡΤ. Поскольку практически все домены 8ета, которые обнаружены в природных условиях, содержат модуль

- 7 017863

Ρ8Ι на С-конце, авторы далее проводили анализ связывания с использованием ложного Мс1. 8ета-Р81 и ΙΡΤ.

Для определения аффинности каждого из модулей Ме! относительно про-НСЕ, НСЕ-α, НСЕ ΝΚ1 и НСЕ-β и для сравнения ее с аффинностью, свойственной активному НСЕ, сконструированные рецепторы иммобилизуют в твердой фазе и экспонируют с возрастающими концентрациями лигандов, содержащих фрагмент ΜΥ С. Наличие связывания выявляют с использованием анти-ΜΥ С антител. Неспецифическое связывание определяют в жидкой фазе с использованием ангиостатина, крингл-содержащего белка (А8), который также включает присоединенный эпитоп ΜΥΟ При этом про-НСЕ, α-цепь НСЕ и НСЕ ΝΚ1, который отражает минимальный Ме!-связывающий модуль α-цепи НСЕ, связываются с ложным Ме! с аффинностью, которая в 3, 4 и 10 раз ниже в сравнении с аффинностью активного НСЕ, соответственно (фиг. 2В). Связывание НСЕ-β с ложным Ме! (или с любым другим доменом Ме!) было слишком низким для его выявления в рамках данного вида анализа. 8ета-Р81 связывается с выраженной аффинностью только с активным НСЕ, тогда как его связывание с про-НСЕ, НСЕ-α или НСЕ ΝΚ1 не превышает уровня специфического связывания (фиг. 2С). В то время как ΙΡΤ связывается с активным НСЕ, про-НСЕ и НСЕ -α примерно с одинаковой высокой аффинностью (фиг. 2В). НСЕ ΝΚ1 связывается с ΙΡΤ в 10 раз менее прочно, чем активный НСЕ, т.е. с той же аффинностью, с которой он связывается с ложным Ме!. Полученные данные позволяют полагать, что участок ΙΡΤ Ме! связывается с α-цепью НСЕ с высокой аффинностью независимо от протеолитического процессинга лиганда.

α-цепь НСЕ связывается с доменами ΙΡΤ 3 и 4 с высокой аффинностью.

Участок ΙΡΤ Ме! охватывает примерно 400 аминокислот и содержит четыре домена ΙΡΤ. Для более точного картирования интерфейса ΙΡΤ-НСЕ конструируют серию вариантов ΙΡΤ, которые содержат делецию в одном или нескольких доменах (фиг. 3А). ΙΡΤΔ1 и ΙΡΤΔ1-2 представляют собой две формы ΙΡΤ с Ν-концевой делецией, которые не содержат первый или два первых иммуноглобулиноподобных домена, соответственно. ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 соответствуют двум С-концевым иммуноглобулиноподобным доменам, экспрессируемым в виде отдельных белков. Продукцию белка и его очистку проводят по описанной выше процедуре. Способность сконструированных ΙΡΤ взаимодействовать с α-цепью НСЕ исследуют в тестах на связывание по процедуре ЕЫ8А, с использованием полноразмерного участка ΙΡΤ в качестве контроля. ΙΡΤ, ΙΡΤΔ1, ΙΡΤΔ1-2, ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 иммобилизуют в твердой фазе и экспонируют с возрастающими концентрациями НСЕ-α. Наличие связывания выявляют с использованием анти-НСЕ антител. Неспецифическое связывание определяют с использованием БСА, как было описано выше. Как показано на фиг. 3В, делеция первых двух иммуноглобулиноподобных доменов не оказывает существенного воздействия на связывание НСЕ.

Фактически, ΙΡΤΔ1-2, белок, которой соответствует двум последним иммуноглобулиноподобным доменам Ме!, связывается с α-цепью НСЕ с такой же, если не с более высокой прочностью, что и ΙΡΤ. Однако дополнительная делеция третьего или четвертого иммуноглобулиноподобного домена практически полностью устраняет возможность связывания НСЕ-α. Аналогичные результаты были получены с использованием активного НСЕ или про-НСЕ вместо НСЕ-α. Полученные данные позволяют полагать, что два последних иммуноглобулиноподобных домена Ме!, которые находятся вблизи трансмембранного спирального участка в настоящем Ме!, достаточны для связывания α-цепи НСЕ с высокой аффинностью.

Домены ΙΡΤ 3 и 4 достаточны для связывания НСЕ в живых клетках.

Для того чтобы определить, может ли НСЕ связываться с ΙΡΤ 3 и 4 в рамках мембранного рецептора, конструируют белок Ме!, содержащий крупную делецию во внеклеточном участке. Делетируют аминокислоты 25-741 на участке, соответствующем домену 8ета (ак 25-515), домену Ρ8Ι (ак 516-562) и первым двум доменам ΙΡΤ (ΙΡΤ 1 и 2, ак 563-741), получая рекомбинантные рецепторы, которые содержат домены ΙΡΤ 3 и 4, трансмембранный спиральный участок и полноразмерный цитоплазматический участок (фиг. 4А). кДНК, кодирующую сконструированный рецептор МеН_25-741, подвергают субклонированию в лентивирусном векторе, как это было описано выше. Рекомбинантные лентивирусные частицы используют для трансдукции клеточной линии карциномы яичника человека Τ0ν-112Ό, которая не содержит системы эндогенной экспрессии Ме!, что следовало из результатов анализа по методу КГ-ПЦР (М1еЫе11, Ρ., е! а1. (2004), Сапсег Се11 6(1), 61-73). Результаты анализа поверхностного биотинилирования показали, что МеН_25-741 соответствующим образом экспрессируется и открыт для взаимодействия на мембране клеток Τ0ν-112Ό (фиг. 4В).

Для определения, может ли МеН_25-741 связываться с НСЕ, клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, инкубируют в присутствии или в отсутствие рекомбинантного НСЕ и затем обрабатывают сшивающим агентом В83. Клеточные лизаты подвергают иммунопреципитации с антителом против С-концевой части Ме!, разрешают путем электрофореза в 8Ω8-ΡΑΟΕ и анализируют по методу вестернблоттинга с использованием биотинилированных анти-НСЕ антител. В качестве контроля используют клетки Τ0ν-112Ό дикого типа по процедуре такого же анализа. Полученные иммуноблоты демонстрируют четкую полосу с молекулярным весом примерно 180 кДа на треке, соответствующем клеткам, экс

- 8 017863 дрессирующим Ме!_Д25-74Ь которые были обработаны НОЕ, но не на треках, соответствующих тем же клеткам, но без НОЕ, или клеткам Τ0ν-112Ό дикого типа в присутствии или в отсутствие лиганда (фиг. 4С). Полагая, что и Ме!_Д25-74Ь и НОЕ имеют молекулярный вес примерно 90 кДа, иммунопреципитированный сшитый белок, предположительно, будет совместим с комплексом, образованным НОЕ плюс ^Ме!А25-741.

Связывание НОЕ с доменами ΙΡΤ 3 и 4 приводит к активации Ме! в живых клетках.

Далее авторы исследовали, может ли НОЕ, связывающийся с Ме!_Д25-74Ь индуцировать активацию Ме!-киназы. В этой связи, клетки Τ0ν-112Ό, трансдуцированные лентивирусным вектором, стимулируют про-НОЕ или активным НОЕ, и клеточные лизаты подвергают иммунопреципитации с использованием анти-Ме! антител, как было описано выше. Активацию рецептора определяют по методу вестернблоттинга с использованием анти-фосфотирозиновых антител. Эти же блоты подвергают повторному зондированию с использованием анти-Ме! антител для нормализации количества иммунопреципитированного рецептора. Следует отметить, что и про-НОЕ, и активный НОЕ были способны индуцировать стабильное фосфорилирование Ме1_Д25-741 (фиг. 4Ό). Поскольку связывание про-НОЕ с полноразмерным Ме! не индуцирует активацию киназы, эти данные дают основание полагать, что домен 8ета оказывает в некоторой мере аутоингибирующий эффект на каталитическую активность Ме1. которая выявляется при связывании с активным НОЕ. Стимуляцию рецептора также проводят с использованием НОЕ ΝΚ1 и сконструированного димерного лиганда, состоящего из двух фрагментов ΝΚ1 с тандемным повтором (ΝΚ1-ΝΚ1; фиг. 4Е). Как показано на фиг. 4Ό, стимуляция ΝΚ1-ΝΚ1 клеток ΤΘν-112Ό, трансдуцированных лентивирусным вектором, приводит к значительному фосфорилированию Ме!_Д25-74Ь тогда как стимуляция мономерным ΝΚ1 не оказывает такого эффекта. Полученные данные позволяют полагать, что два С-концевых домена ΙΡΤ Ме! (ΙΡΤ 3 и 4) являются достаточными для связывания с НОЕ (и, более точно, с НОЕ ΝΚ1, который отражает минимальный Ме!-связывающий модуль α-цепи НОЕ) и для переноса сигнала для активации рецептора в цитоплазматический киназный домен, предположительно, после димеризации рецептора при индукции лигандом. Однако эти данные также позволяют полагать, что ΙΡΤ 3 и 4, сами по себе, являются недостаточными для разграничения биологически активной формы НОЕ и его инактивного предшественника, про-НОЕ.

Растворимый ΙΡΤ ингибирует НОЕ-индуцированный инвазивный рост ίη νίΐτο.

В предшествующем исследовании было показано, что внеклеточная часть Ме!, экспрессируемая в виде растворимого белка (ложный Ме!), ингибирует НОЕ-индуцированный инвазивный рост как ίη νίΐτο, так и на моделях рака у мышей (М1сЫе11 Ρ. е! а1. (2004), Сапсег Се11 6(1), 61-73). Было также показано, что рекомбинантный растворимый 8ета-Ρ8I ингибирует и лиганд-зависимое, и лиганд-независимое фосфорилирование Ме! (Копд-Ве1!тап М. е! а1. (2004), Сапсег Се11 6(1), 75-84). Исходя из этих результатов, авторы исследовали, проявляет ли растворимый ΙΡΤ НОЕ/Ме! антагонистическую активность в живых клетках. Клетки меланомы человека МОЛ-МВ-435, которые экспрессируют Ме! и которые были установлены в качестве модельной системы для анализа НОЕ-опосредованного инвазивного роста, трансдуцируют лентивирусными векторами, кодирующими растворимый ложный Ме!, 8ета-Ρ8I или ΙΡΤ. Клетки, трансдуцированные пустым вектором, используют в качестве контроля. Клетки, трансдуцированные ленивирусным вектором, которые секретируют сравнимые уровни растворимых факторов (примерно 50 пмоль/10⁶ клеток/24 часа), выдерживают в бессывороточных условиях в течение нескольких дней, позволяя рекомбинантным факторам аккумулироваться в среде и затем стимулируют рекомбинантным НОЕ. Фосфорилирование Ме!-тирозина определяют путем иммуноблоттинга с антифосфотирозиновыми антителами, как было описано выше. Как показано на фиг. 5А, и ΙΡΤ, и 8ета-Ρ8I частично ингибируют НОЕиндуцированное фосфорилирование Ме!, тогда как ложный Ме! полностью нейтрализует способность НОЕ индуцировать активацию Ме!. Повторное зондирование тех же иммуноблотов антителами против С-концевого фрагмента не выявляет существенной разницы в количествах иммунопреципитированного белка.

Для исследования ингибирующего потенциала эктодоменов Ме! в условиях, позволяющих лучше оценить биологические характеристики, такие же клетки используют для проведения теста на НОЕзависимый морфогенез по ветвлению. Сформированные клеточные сфероиды высевают в трехмерную коллагеновую матрицу и затем стимулируют рекомбинантным НОЕ для образования трубчатых структур. Ветвление определяют количественно путем подсчета среднего числа трубочек, прорастающих из каждой колонии. Как показано на фиг. 5В, и растворимый ΙΡΤ, и 8ета-Ρ8I ингибируют НОЕиндуцированное ветвление колоний (пустой вектор, 17,5 трубочки/колонию; ΙΡΤ, 4,0 трубочки/колонию; Зета-ГБС 6,7 трубочки/колонию). Однако в соответствии с результатами, полученными в экспериментах по фосфорилированию, ложный Ме! демонстрировал более мощный НОЕ-ингибирующий эффект, чем его субдомен (2,5 трубочки/колонию). Репрезентативные снимки морфологии колоний показаны на фиг. 5С.

Растворимый ΙΡΤ демонстрирует противоопухолевую и антиметастатическую активность у мышей.

Полученные выше результаты дали основание авторам настоящего изобретения исследовать терапевтический потенциал растворимого ΙΡΤ на моделях рака у мышей. Клетки меланомы МПЛ-МВ-435,

- 9 017863 трансдуцированные лентивирусным вектором, инъецируют подкожно мышам СЭ-1 пи-/- и отслеживают опухолевый рост с течением времени. Примерно через три недели опухоли удаляют для анализа и мышей подвергают аутопсии. При проведении анализа, аналогичного методу Каплана-Мейер, строят графики, где процент животных без опухолей наносят на график в зависимости от оси времени, и латентность опухоли подсчитывают количественно, как среднее значение в днях, при этом было показано, что все сконструированные растворимые рецепторы задерживают появление экспериментальных опухолей. Однако ΙΡΤ был значительно более эффективным ингибитором, чем §еша-Р81, и ложный Ме! был более мощным ингибитором, чем ΙΡΤ или 8ета-Р81 (фиг. 6А). Анализ наличия опухолей с течением времени показал, что ΙΡΤ был лишь немного менее эффективным, чем ложный Ме!, тогда как 8ета-Р81 ингибировал опухолевый рост только на очень ранних стадиях эксперимента (фиг. 6В). Иммуногистохимический анализ экспрессии трансгена показал, что ложный Ме!, 8ета-Р81 и ΙΡΤ характеризуются близкими уровнями и картиной распределения по опухоли (фиг. 6С).

Поскольку НОЕ является мощным про-ангиогенным фактором, было исследовано, приводит ли ингибирование НОЕ/Ме! в опухолях к нарушению ангиогенеза. Срез опухолевой ткани анализируют иммуногистохимическими методами с использованием антител против фактора Фон Виллебранда, а также определяют плотность сосудов под микроскопом (фиг. 6Ό). Было показано, что ΙΡΤ снижает плотность опухолевых сосудов в 1,5 раза, тогда как ложный Ме! приводит к более мощному ингибированию (примерно в 4 раза); 8ета-Ρ8I не оказывает выраженного эффекта на опухолевый ангиогенез. У описанных выше мышей после аутопсии отбирают легкие и далее проводят обработку для проведения гистологического анализа. Серийные срезы тканей легкого окрашивают гематоксилином и эозином и анализируют под микроскопом для определения наличия микрометастаз. Полученные результаты проиллюстрированы на фиг. 6А. В контрольной группе 4 из 6 мышей (67%) содержат микрометастазы. В ΙΡΤ и 8ета-Ρ8I группах метастазы обнаружены только у 1 из 6 мышей (17%), тогда как в группе с ложным Ме! метастазы не были обнаружены. Метастазные поражения обнаруживаются и в паренхимных (внесосудистых), и в эмболических образованиях (внутрисосудистых; см. фиг. 6Е в качестве репрезентативных снимков).

Идентификация высокоаффинного сайта связывания НОЕ на НОЕВ согласно настоящему описанию позволяет разрабатывать новые процедуры, ведущие к созданию более специфических ингибиторов/антагонистов НОЕ и НОЕВ. Приведенные ниже неограничивающие примеры новых способов идентификации ингибиторов/антагонистов НОЕ/НОЕВ направлены на высокоаффинный сайт связывания НОЕВ или на использование высокоаффинного сайта связывания НОЕВ в качестве создания новых ингибиторов/антагонистов.

Разработка моноклональных антител, которые связываются с внеклеточными доменами ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 НОЕВ, препятствуя связыванию НОЕ.

Ввиду того что взаимодействие НОЕ с внеклеточными доменами ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 необходимо для высокоаффинного связывания НОЕ, можно создать специфические моноклональные антитела, которые связываются с ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 и конкурируют с НОЕ за связывание с НОЕВ. Этого можно достичь в рамках нескольких стратегий.

(A) Рекомбинантный белок или пептид, полученный из ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4, получают по стандартным методам генетической инженерии или химического синтеза. Указанный белок или пептид инъецируют соответствующему лабораторному животному (обычно мыши или крысе) для проявления иммунной реакции. Далее у данного иммунизированного животного отбирают спленоциты и сливают их с миеломной клеточной линией и отбирают антитело-продуцирующие гибридомные клоны по стандартным методам работы с моноклональными антителами. Антитела против ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 далее подвергают скринингу по процедуре ЕЫ8А, аналогично методам согласно настоящему описанию, в которых используются рекомбинантный ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 в твердой фазе, а также продуцируемые гибридомой антитела в жидкой фазе. Наличие связывания выявляют с использованием противомышиных иммуноглобулиновых антител, которые доступны в коммерческом варианте. Альтернативно, антитела подвергают скринингу на их способность замещать рекомбинантный НОЕ (в жидкой фазе) из ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 (в твердой фазе) или по их способности к иммунопреципитации с рекомбинантными белками ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4.

(B) Полинуклеотидную последовательность, кодирующую ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4, встроенную в соответствующий вектор экспрессии, инъецируют непосредственно лабораторному животному, чтобы на данный генный продукт у животного проявилась иммунная реакция. Далее антитела против ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 выделяют и подвергают скринингу по описанной выше методике.

(C) Полинуклеотидную последовательность, кодирующую ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4, встроенную в соответствующий вектор экспрессии, переносят в линию клеток млекопитающего, где указанные клетки не экспрессируют НОЕВ, для достижения экспрессии ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 на клеточной поверхности. Клетки, экспрессирующие ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4, далее инъецируют лабораторному животному для проявления иммунного ответа, и антитела против ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 выделяют и подвергают скринингу по описанной выше методике.

(Ό) Библиотеку нативных антител, созданную по стандартным методикам генетической инженерии (например, по технологии, известной как проявление фага) из лимфоцитов млекопитающего (предпочтительно лимфоцитов человека, например, лимфоцитов, инфильтрующих опухоль, экспрессирующую

- 10 017863

НОРК), подвергают скринингу с использованием белков ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4. Положительные клоны (т.е. те клоны, которые связываются с ΙΡΤ-3 и ΓΡΤ-4 с высокой аффинностью) затем выделяют, размножают, и полученные антитела характеризуют биохимически.

(Е) Человеческие В-клетки памяти выделяют из периферической крови пациента с опухоль, которая экспрессирует НОРК, в соответствии с методами ряда исследований (включая Τημμίαί Е. е! а1. (2004), №11 Меб. 10(8), 871-875). Как только культуры иммортализованных В-клеток памяти человека устанавливаются, любой специалист со средним знанием в данной области может провести скрининг на клетки, секретирующие антитела против ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4, с использованием методов, приведенных в настоящем описании, в разделе (А). После идентификации таких антителопродуцирующих клеток, желательное антитело может быть клонировано в рамках полимеразно-цепной реакции и стандартных процедур генетической инженерии.

Идентификация исследуемого соединения, которое связывается с внеклеточными доменами ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 НОРК, ингибируя активность НОРК.

При использовании разных подходов возможно выделить исследуемые соединения разного происхождения, которые связываются с высокоаффинным сайтом связывания НОР на НОРК и препятствуют НОР-индуцированной активации НОРК. Это может быть достигнуто в ходе нескольких стратегий.

(A) С использованием тестов по процедуре ЕЫ8А, аналогичных описанным в настоящей работе, любой специалист со средним уровнем знаний в данной области может провести скрининг в библиотеке соединений (включая, без ограничения, библиотеку химически синтезированных соединений, библиотеку природных соединений, библиотеку малых молекул, пептидную библиотеку) для поиска агентов, которые замещают НОР во взаимодействии с ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4. При проведении тестов данного вида рекомбинантные белки ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 иммобилизуют в твердой фазе и инкубируют с фиксированным количеством НОР, содержащимся в жидкой фазе. После экспозиции с соединениями из библиотеки определяют уровень связывания НОР с помощью коммерчески доступных анти-НОР антител.

(B) С использованием клеточной линии, экспрессирующей сконструированную форму НОРК, которая во внеклеточной части не содержит ничего, кроме доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4, как и в случае приведенной ранее в описании процедуры, т.е. Ме1_Д25-741, любой специалист со средним уровнем знаний в данной области может провести скрининг библиотеки соединений (включая, без ограничения, библиотеку химически синтезированных соединений, библиотеку природных соединений, библиотеку малых молекул, пептидную библиотеку) для поиска агентов, которые замещают НОР во взаимодействии с ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 или которые ингибируют НОР-индуцированную активацию НОРК. Это же может быть достигнуто в случае приведения указанных сконструированных клеток в контакт с соединениями библиотеки, с последующим определением уровня НОР-индуцированного фосфорилирования НОРК, как описано в настоящем исследовании, или с использованием других способов, которые позволяют выявить активацию НОРК, включая метод анализа рассеяния, тест на инвазию восстановленной матрицы, тест на морфогенез в направлении ветвления, тест на выживание клеток или любые другие биологические тесты ίη νίίτο, описанные в МюЫей, Ρ. е! а1. (2004), Сапсег Се11 6(1), 61-73.

(C) С использованием сконструированной клеточной линии согласно приведенному выше описанию любой специалист со средним уровнем знаний в данной области может провести скрининг генетической библиотеки (включая, без ограничения, библиотеку экспрессии кДНК, библиотеку короткошпилечных РНК, библиотеку антисмысловых ДНК, библиотеку случайных нуклеотидов) для поиска полинуклеотидных или генных продуктов, которые замещают НОР во взаимодействии с ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 или которые ингибируют НОР-индуцированную активацию НОРК. Это может быть достигнуто путем трансфекции, трансдукции или введения любым другим способом соединения из нуклеотидной библиотеки в указанные клетки, с последующим тестированием способности НОР активировать экспрессируемую этими клетками делетированную форму НОРК. Активацию НОРК определяют по методике, описанной в разделе (В).

Репрезентативные функциональные тесты, которые позволяют определить биологическую активность соединений, связывающихся с внеклеточными доменами ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 НОРК.

Независимо от того, какая стратегия используется для создания анти-ΙΡΤ антител или ΙΡΤсвязывающих соединений, конечный продукт (например, моноклональные антитела против ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 и природных или синтетических соединений, которые связываются с ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4) далее подвергают анализу в рамках биологических тестов, направленных на определение, обладают ли данные агенты способностью препятствовать проявлению активности НОРК. Указанные тесты могут проводиться ίη νίίτο с использованием культуры клеток млекопитающих или ίη νίνο с использованием лабораторных животных.

(А) Тест на рассеяние. Эпителиальные клетки, растущие в виде компактных колоний в чашке Петри и экспрессирующие НОРК, индуцируют к рассеянию путем стимуляции НОР. В результате стимуляции НОР клетки в чашке Петри становятся более обособленными и диспергированными. Этот тест может проводиться в присутствии нескольких исследуемых соединений. Среди исследуемых соединений ингибитор/антагонист НОР/НОРК может быть идентифицирован по отсутствию рассеянного фенотипа в ответ на стимуляцию НОР.

- 11 017863 (B) Тест на миграцию клеток. Клетки, экспрессирующие НОРК, обладают способностью мигрировать по градиенту НОР. Иными словами, клетки притягиваются хемотоксически в направлении повышенных концентраций НОР. Эта способность может быть использована при проведении скрининга ингибиторов НОР в экспериментальной камере Бойдена. Клетки высевают в первой камере и вносят НОР во вторую камеру, которая отделена от первой камеры пористой мембраной. Клетки мигрируют через мембрану и поступают во вторую камеру, где находится более концентрированный НОР. Агенты, которые ингибируют этот процесс, идентифицируются как ингибиторы/антагонисты НОР/НОРК.

(C) Тест на миграцию Тгап5\\е11^|Л1 или повторный тест на инвазию с использованием восстановленной матрицы. Указанный тест представляет собой вариацию метода, описанного выше в разделе (В), в ходе которого пористые мембраны покрывают слоем коллагена, Ма1гще1™ или других восстановленных органических матриц. Клетки, для того чтобы мигрировать, должны вначале расщепить органическую матрицу. Этот тест представляет собой более жесткий вариант исследования, которое позволяет измерить, в большей мере, инвазию, а не просто миграцию клеток.

(Ό) Тест на инвазию коллагена или тест на морфогенез по ветвлению. В рамках данного теста клетки млекопитающего, экспрессирующие НОРК (предпочтительно эпителиальные клетки или клетки карциномы), высевают в трехмерном слое коллагена и затем оставляют расти до образования сфероидов, где каждый из них содержит примерно 1000 клеток. Альтернативно, сфероиды могут быть предварительно сформированы путем инкубирования клеток в течение ночи в неадгезивных условиях в 96-луночных планшетах в присутствии метилцеллюлозы, как было описано в Мю1пе1г Р. с1 а1. (2004), Сапсег Се11 6(1), 61-73. После того как сфероиды погружаются в коллагеновый слой, их стимулируют НОР и инкубируют при температуре 37°С. Это приводит к прорастанию трубок и сфероидов; каждая трубочка формируется несколькими клетками, организованными в виде трубчатой структуры и поляризованными таким образом, что имеется одна сторона клетки, которая обращена к внутреннему просвету, и вторая сторона, которая обращена к наружной среде. По мере проведения теста трубочки начинают ветвиться и образовывать более сложную архитектуру. Этот тест является высокоспецифичным для НОР. Агенты, которые ингибируют данный процесс, с очень высокой степенью вероятности могут быть отнесены к высокоспецифичным антагонистам НОР/НОРК.

(Е) Митогенный тест. НОР обладает способностью индуцировать репликацию ДНК и клеточное деление в некоторых клетках, экспрессирующих НОРК. Наиболее отзывчивыми клетками являются первичные гепатоциты, обычно это гепатоциты мыши или крысы. Для тестирования НОР-индуцированной репликации ДНК клетки подвергают депривации в отношении сывороточных факторов роста и затем стимулируют возрастающими концентрациями НОР. Сразу после этого добавляют радиоактивный тимидин и клетки инкубируют при температуре 37°С в течение примерно одного дня. После тщательной промывки и фиксации определяют радиоактивный тимидин, включенный в клеточную ДНК, путем жидкого сцинтилляционного счета или с использованием других стандартных методик, которые позволяют количественно определить уровень радиоактивности.

(Р) Тест на выживание. НОР обладает способностью защищать НОРК-экспрессирующие клетки от апоптоза или запрограммированной гибели клеток. Это свойство может использоваться для определения активности НОРК в тесте на выживание. Клетки подвергают предварительной инкубации с НОР и исследуемым соединением (потенциальным ингибитором НОРК) и затем подвергают воздействию апоптозного стимула, такого как токсическое вещество, отсутствие возможности адгезии, гипоксия, тепловой шок, облучение или повреждение ДНК. По истечению соответствующего периода времени измеряют уровень гибели клеток по стандартным методикам, включая метод ΤϋΝΕΤ (использование терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы для переноса биотин-άϋΤΡ к свободной 3'-ОН расщепленной ДНК), нуклеосомный метод, метод электрофоретического расщепления ДНК (оценка эффекта лестницы), метод определения активности каспазы, метод окрашивания красителем, специфичным для жизнеспособной клетки, или в рамках любых вариаций указанных методов.

(О) Тест на канцерогенез у мышей. В рамках данного теста активность потенциального ингибитора НОР/НОРК выявляют непосредственно у лабораторного животного, предпочтительно мыши или крысы. Имеется несколько способов получения опухоли у мыши. Чаще всего используемая стратегия включает получение ксенотрансплантата, т.е. трансплантата опухолевых клеток (обычно человеческого происхождения) у животного-реципиента (обычно у иммунодефицитной мыши). Клетки могут быть имплантированы подкожно (быстрый и простой метод получения экспериментальной опухоли) или ортотропно, т.е. в тот же самый орган, из которого данная опухолевая клетка была выделена (например, клетки карцинома молочной железы имплантируются в жировой слой молочной железы, клетки карциномы толстой кишки имплантируются в слизистую кишечника, клетки гепатокарциномы имплантируются в паренхиму печени и т.п.). Независимо от используемого метода инъекция опухолевых клеток лабораторному животному может привести к образованию экспериментальной опухоли. Далее такое животное с опухолью может использоваться для оценки противоопухолевого потенциала исследуемых соединений. АнтиНОР/НОРК антитела или соединения могут быть введены животному, содержащему опухолевые поражения, характеризующиеся разбалансированной сигнальной функцией НОР/НОРК, с использованием

- 12 017863 для такого введения наиболее подходящего известного способа, включая внутривенную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, использование осмотического насоса, пероральное введение, введение с помощью суппозитория, введение согласно протоколу генной терапии, путем локального введения и т.п. После проведения лечения в течение соответствующего периода времени, животное подвергают эвтаназии, отбирают опухоль и органы для анализа.

(H) Тест на метастазогенез у мыши. Экспериментальные метастазы могут быть индуцированы у мыши путем системной инъекции опухолевых клеток. Указанные клетки захватываются капиллярами легкого и впоследствии в ходе экстравазации приводят к образованию легочных метастаз. Образование таких метастаз может быть количественно оценено после аутопсии в рамках подходов, включающих микроскопирование, гистологический анализ, иммуногистохимические методы, оценку на уровне всего организма. Исследуемые соединения доставляются по методу, описанному в разделе (С).

(I) Протокол генной терапии. В том случае, если ингибитор НСЕ/НСЕК представляет собой антитело, рекомбинантный белок, пептид или малую молекулу интерферирующей РНК, доставка в организм животного с опухолью может быть достигнута согласно протоколу генной терапии. Данный метод состоит в том, что вначале желательный полинуклеотид встраивают в вектор доставки, который может быть выбран из числа лентивирусных векторов, аденовирусных векторов, ретровирусных векторов, оголенной ДНК или любой их вариации. Далее указанный векторный препарат может быть доставлен системно или местно в опухоль в зависимости от локализации опухоли, от выбранного вектора или от гистотипа опухоли. Биологические эффекты генной терапии анализируют в соответствии с описанием, приведенным для других соединений в разделе (С).

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение полинуклеотида, кодирующего полипептид, состоящий из внеклеточных доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 рецептора фактора роста гепатоцитов, для скрининга и/или разработки фармакологически активных агентов, полезных при лечении рака.
2. 2. Применение полипептида, состоящего из внеклеточных доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 рецептора фактора роста гепатоцитов, для скрининга и/или разработки фармакологически активных агентов, полезных при лечении рака.
3. 3. Применение по п.1 или 2, где указанный фармакологически активный агент препятствует проявлению каталитической активности, функции, стабильности и/или экспрессии рецептора фактора роста гепатоцитов.
4. 4. Применение по п.1 или 2, где указанный фармакологически активный агент осуществляет регуляцию по типу отрицательной обратной связи каталитической активности, функции, стабильности и/или экспрессии рецептора фактора роста гепатоцитов.
5. 5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный фармакологически активный агент представляет собой ингибитор и/или антагонист рецептора фактора роста гепатоцитов.
6. 6. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный фармакологически активный агент выбирают из ингибиторов в виде малых молекул, аптамеров, антисмысловых нуклеотидов, ингибиторов на основе РНК, киРНК, антител, пептидов, негативных доминантных факторов.
7. 7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где рак представляет собой рак, характеризующийся нарушением активности рецептора фактора роста гепатоцитов.
8. 8. Способ выявления способности исследуемого агента действовать в качестве антагониста/ингибитора рецептора фактора роста гепатоцитов, полезного при лечении рака, предпочтительно рака, характеризующегося нарушением активности рецептора фактора роста гепатоцитов, включающий стадии:

   (a) приведения исследуемого агента в контакт с ί) полинуклеотидом, кодирующим полипептид, состоящий из внеклеточных доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 рецептора фактора роста гепатоцитов, ίί) полипептидом, состоящим из внеклеточных доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 рецептора фактора роста гепатоцитов, или ш) клетками, экспрессирующими внеклеточные домены ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4, трансмембранную спираль и полный цитоплазматический участок рецептора фактора роста гепатоцитов;

   (b) измерения активности рецептора фактора роста гепатоцитов, его функции, стабильности и/или экспрессии;

   (c) отбора агента, который снижает активность, функцию, стабильность и/или экспрессию рецептора фактора роста гепатоцитов.
9. 9. Способ по п.8, где указанное измерение на стадии (Ь) включает измерение сигнальной функции в клетках, выживания клеток и клеточной пролиферации.
10. 10. Применение внеклеточных доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 рецептора фактора роста гепатоцитов в качестве лекарственного средства для лечения рака.
11. 11. Применение вектора, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, состоящий из внеклеточных доменов ΙΡΤ-3 и ΙΡΤ-4 рецептора фактора роста гепатоцитов, в качестве лекарственного средства для лечения рака.