TW202246354A - 抗烯醇化酶1（eno1）抗體及其應用 - Google Patents

Abstract

本發明涉及與ENO1結合的抗體及其應用。該等應用涵蓋使用此類抗體治療及診斷與ENO1活化及其惡化相關的疾病或病症。特定而言，本發明的抗體與在癌細胞表面上的ENO1結合，且可用於減少癌細胞生長及轉移並延長存活時間。本發明的抗體也可用於檢測ENO1、診斷及預後癌症、以及監測癌症惡化。本發明也提供篩選用於癌症治療的候選藥劑的方法。

Description

抗烯醇化酶1(ENO1)抗體及其應用

相關申請案。本申請案依據35 U.S.C. §119主張在2021年3月22日提出申請之美國臨時申請案第63/164,137號的權益，該臨時申請案係以全文引用方式併入本文。

本發明涉及一種與烯醇化酶1(ENO1)結合的抗體及其應用。特定而言，本發明的抗體與在癌細胞表面上的ENO1結合，且可有效減少癌細胞生長及轉移並延長存活時間。本發明的抗體也可用於檢測ENO1、診斷及預後癌症、以及監測癌症惡化。本發明也提供一種篩選用於癌症治療的候選藥劑的方法。

烯醇化酶1(ENO1)，也稱作α-烯醇化酶，為一種參與丙酮酸合成的代謝酶，其也已知作為纖維蛋白溶酶原受體並媒介纖維蛋白溶酶的活化及細胞外基質降解 ¹。基於這些機轉，ENO1有助於多種細胞及生理過程，諸如蛋白水解、細胞外基質重塑、代謝、生長控制、腫瘤轉移、以及過敏反應 ^{2 、 3}。

已在許多不同的腫瘤類型中觀察到ENO1 mRNA或蛋白的過度表現，腫瘤類型包括肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、以及睪丸癌 ^{3 、 4}。ENO1除了作為糖酵解酶的作用外，其還在大多數腫瘤的細胞表面處表現，在該處ENO1與尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化物受體(uPAR)、整合素、以及某些負責黏著、遷移及增殖的細胞骨架蛋白形成多蛋白複合物 ⁵。在腫瘤中，ENO1可調控血管內及細胞周圍的纖維蛋白溶解活性，以促進細胞遷移及癌症轉移 ^6–8。另外，ENO1的表現濃度可作為有價值的診斷生物標記，因為其與患者結果相關，諸如癌症存活及預後相關 ^9–11。例如，在非小細胞肺癌(NSCLC)患者中，那些具有表現高濃度ENO1的腫瘤細胞的患者具有相對較差的無病存活率及整體存活率 ¹²。最近的發現已示出，靶向ENO1可能為克服耐藥性的新穎方法 ¹³。因此，腫瘤相關抗原(TAA)-ENO1已成為癌症治療的有趣標靶。

上皮間質轉化(EMT)為一種細胞程序，其天然存在於廣泛的組織類型及發育階段中 ¹⁴。然而，基於EMT對器官纖維化 ^{15 、 16}、治療抗性 ¹⁷、發炎反應 ^{18 、 19}、免疫抑制 ^{20 、 21}、以及轉移性細胞播散的貢獻 ²²，很明顯地EMT在許多人類疾病及癌症的發病機轉中也很重要。另外，越來越多的證據示出EMT參與許多腫瘤轉移過程，其包括腫瘤細胞在原發腫瘤部位的局部侵入、血管內的內滲、藉由血管分布的循環、到遠端組織的實質中的外滲、以及微轉移沉積物的存活 ^{23 、 24}。為了區分上皮及間質軸的極端上的細胞，研究人員通常會檢查某些細胞特徵；上皮細胞表現出上皮細胞-細胞連接、頂端-基底極性及缺乏運動性，而間質細胞表現出更高的運動性、侵入性及對細胞凋亡的抗性、以及缺乏頂端-基底極性的紡錘形形態 ²⁵。EMT通常檢測為從上皮到間質表現型的形態學轉變，其包括上皮細胞標記(例如E-鈣黏蛋白、α-連環蛋白及γ-連環蛋白)的損失及間質標記(例如波形蛋白、N-鈣黏蛋白及纖維黏連蛋白)的獲得；此轉變是由諸如SLUG、SNAIL及TWIST的EMT活化轉錄因子(EMT-TF)來執行的 ^{23 、 26}。因此，EMT-TF在癌症形成、生長及轉移中的多效作用已變得廣為人知，這是其與許多上皮腫瘤類型中的不良臨床結果相關的深層原因。

Wnt訊息傳遞為胚胎發育及成人細胞損傷與修復過程的關鍵路徑。在Wnt配體與其受體結合後，β-連環蛋白破壞複合物使細胞溶質β-連環蛋白磷酸化的能力受到抑制。未磷酸化的β-連環蛋白在細胞溶質中積累並易位到細胞核，在細胞核中其活化Wnt標靶基因的表現。這種基因調控需要與轉錄因子的TCF/LEF家族整合，且在許多情況下(包括癌症惡化)，對控制細胞增殖、分化及存活是重要的 ^{27 、 28}。除了在細胞核中的作用外，E-鈣黏蛋白還與在細胞表面處的β-連環蛋白形成複合物，這有助於維持細胞-細胞連接 ²⁹。與Wnt配體結合類似，E-鈣黏蛋白的負調控也可增加細胞質及細胞核區室中β-連環蛋白的濃度，這刺激細胞生長並提供與EMT的機械式連接 ³⁰。

控制EMT的另一個重要訊息傳遞路徑是由肝細胞生長因子受體(HGFR；也稱作c-Met)所刺激。HGFR及其配體HGF涉及許多正常及病理的生物學過程，諸如肝臟、胎盤、肌肉及神經系統的胎兒發育 ^{31 、 32}。出生後，HGF-HGFR路徑的活化似乎涉及EMT ³³，以及肝、腎及表皮再生 ³¹。重要的是，HGFR訊息傳遞也促進腫瘤生長、侵入、耐藥性、血管新生，尤其是癌幹細胞的產生及維持。HGFR訊息傳遞路徑的活化可藉由若干不同的機轉發生，其包含增加的HGF表現、增強的HGFR蛋白表現、或藉由改變影響HGFR活化的其他因素或路徑 ³⁴。在HGFR活化後，其羧基末端尾部的磷酸化產生募集細胞內轉接子及受質的多功能接受位置(PI3K、Src等) ³⁵。因此，涉及增殖、存活、細胞活動力、侵入及轉移的若干路徑可藉由此關鍵訊息傳遞路徑活化。

吾人之前的發現表明，裝載抗癌藥物的ENO1靶向脂質體作為癌症治療的靶向藥物遞送系統具有巨大的應用潛力 ³⁶。然而，尚不清楚關於ENO1何以參與致癌作用的詳細訊息傳遞機轉，且迄今為止並無抗ENO1藥物候選物進行臨床試驗。在此領域中，仍需有效的抗ENO1抗體。

本文揭示與ENO1結合的抗體及其應用。可被抗體靶向的細胞包括癌細胞。應用包括但不限於癌症治療以及癌症的診斷及預後。特定而言，抗體可用於減少癌細胞生長及轉移並延長存活時間。抗體也可用於檢測ENO1以及癌症的診斷及預後，以及監測患有癌症患者的癌症惡化。

因此，在一方面，本發明提供一種抗ENO1抗體或其抗原結合片段，其包含： (a)重鏈可變區(V _H)，其包含含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的重鏈互補決定區1(HC CDR1)、含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的重鏈互補決定區2(HC CDR2)、以及含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈互補決定區3(HC CDR3)；以及 (b)輕鏈可變區(V _L)，其包含含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的輕鏈互補決定區2(LC CDR2)、以及含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的輕鏈互補決定區3(LC CDR3)。

在一些具體實施例中，V _H包含SEQ ID NO:15的胺基酸序列，及/或V _L包含SEQ ID NO:16的胺基酸序列。

也提供一種包含編碼如本文所述的抗ENO1抗體或抗原結合片段的核苷酸序列的重組核酸，以及一種包含該重組核酸的宿主細胞。

進一步提供一種包含如本文所述的抗ENO1抗體或其抗原結合片段以及生理學上可接受的載體的組合物。

在另一方面，本發明提供一種抑制ENO1下游訊息傳遞及/或治療與ENO1下游訊息傳遞活化相關的疾病或病症之方法，其藉由向有此需要的個體施用有效量的抗ENO1抗體或其抗原結合片段或包含如本文所述的抗ENO1抗體或其抗原結合片段的組合物。

在一些具體實施例中，疾病或病症為癌症及其轉移。

在某些具體實施例中，癌症選自由以下組成的群組：肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、及睪丸癌。在一具體實例中，癌症為肺癌。

在具體實施例中，如本文所述的抗體或其抗原結合片段以有效抑制有此需要的個體中的腫瘤生長及轉移的量施用。

在具體實施例中，如本文所述的抗體或其抗原結合片段以有效延長有此需要的個體的存活時間的量施用。

在另一方面，本發明提供一種用於檢測ENO1的方法，其包含： (i)使如本文所述的抗體或其抗原結合片段與有此需要的個體的細胞接觸；以及 (ii)檢測抗體或其抗原結合片段與細胞的結合。

在一些具體實施例中，方法在活體外進行，其中細胞存在於從個體獲得的生物樣品中。在一些具體實施例中，方法在活體內進行，其中細胞存在於個體中。

在一些具體實施例中，個體處於癌症的風險中，或被懷疑患有癌症。

在一些具體實施例中，個體患有癌症。

在一些具體實施例中，如本文所述的檢測ENO1的方法進一步包含使檢測的結果與參考濃度進行比較，並基於比較的結果判定患有癌症的個體的預後，其中升高的ENO1濃度表明消極預後。

在具體實施例中，消極預後選自由以下組成的群組：降低的存活率、增加的腫瘤生長、增加的轉移風險、增加的復發風險、及其任何組合。

在又一方面，本發明提供一種監測患有癌症的患者中癌症惡化的方法，其包含： (a)在第一時間點提供來自患者的第一生物樣品； (b)在第二時間點提供來自患者的第二生物樣品，第二時間點晚於第一時間點； (c)檢測第一生物樣品及第二生物樣品中ENO1的濃度，其中藉由如本文所述的抗ENO1抗體或其抗原結合片段的免疫測定來進行檢測；以及 (d)基於第一生物樣品及第二生物樣品中的ENO1濃度來判定患者的癌症惡化，其中與第一生物樣品相比，第二生物樣品中升高的ENO1濃度表明癌症惡化。

本發明也描述一種抗ENO1抗體或其抗原結合片段或一種包含如本文所述的相同抗體或其抗原結合片段的組合物，其用於抑制ENO1下游訊息傳遞及/或治療與ENO1下游訊息傳遞活化相關的疾病或病症。進一步揭示的為一種抗ENO1抗體或其抗原結合片段或一種包含如本文所述的相同抗體或其抗原結合片段的組合物的用途，其係用於製備藥劑，該藥劑用於抑制ENO1下游訊息傳遞及/或治療與ENO1下游訊息傳遞活化相關的疾病或病症。這種疾病或病症的實例為癌症及其轉移。在某些具體實施例中，癌症選自由以下組成的群組：肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、及睪丸癌。在一具體實例中，癌症為肺癌。

本發明也揭示一種抗ENO1抗體或其抗原結合片段或一種包含如本文所述的相同抗體或其抗原結合片段的組合物，其用於檢測ENO1、診斷及預後癌症、及/或監測患有癌症的患者中癌症惡化。進一步揭示的為一種抗ENO1抗體或其抗原結合片段或一種包含如本文所述的相同抗體或其抗原結合片段的組合物的用途，其係用於製備試劑盒，該試劑盒用於檢測ENO1、診斷及預後癌症、及/或監測患有癌症的患者中癌症惡化。試劑盒包含抗ENO1抗體或其抗原結合片段或包含如本文所述的相同抗體或其抗原結合片段的組合物，以及使用試劑盒檢測ENO1的說明書。特定而言，試劑盒為免疫測定試劑盒。在某些具體實施例中，癌症選自由以下組成的群組：肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、及睪丸癌。在一具體實例中，癌症為肺癌。

本發明也提供一種篩選用於癌症治療的候選藥劑的方法。具體而言，本發明的方法包含(i)將藥劑與在癌細胞的細胞表面上表現ENO1的癌細胞接觸；(ii)檢測藥劑與在癌細胞的細胞表面上的ENO1的結合及/或測量癌細胞中一或多個ENO1下游訊息傳遞事件/組分的濃度；以及(iii)基於檢測及/或測量的結果來判定藥劑是否為候選抗癌藥。

下面描述闡述本發明的一或多個具體實施例的細節。本發明的其他特徵或優點從以下若干具體實施例的詳細描述以及所附申請專利範圍將顯而易見。

下面的描述僅僅是為了說明本發明的各種具體實施例。因此，本文所討論的具體實施例或改良不應解釋作對本發明的範圍的限制。對本發明所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見的是，在不背離本發明的範圍的情況下可進行各種改變或等同替換。

I 、定義

為了提供對本發明的清楚與容易的理解，首先定義某些用語。在詳細描述中闡述其他定義。除非另有定義，否則本文使用的所有技術及科學用語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般理解的相同含義。

如本文中使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數指稱物件。因此，例如提及「一種組分」，其包括複數個該組分及本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的等同物。

「包含(comprise)」或「包含(comprising)」等詞大體上以包括/包括(include/including)的意義使用，其是指能存在一或多種特徵、成分或組分。「包含(comprise)」或「包含(comprising)」等詞涵蓋「由…組成(consists)」或「由…組成(consistingof)」等詞。

如本文所用，「多肽」乙詞涉及經由肽鍵連接的胺基酸殘基組成的聚合物。「蛋白」乙詞通常涉及相對大的多肽。「肽」乙詞通常涉及相對短的多肽(例如含有高達100、90、70、50、30、20或10個胺基酸的殘基)。

如本文所用，「大約」或「約」等詞涉及本發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解的可接受偏差的程度，其可根據其所使用的上下文而在一定程度上變化。特定而言，「大約」或「約」可指具有在引用的值附近的±10%或±5%或±3%的範圍內的數值。

如本文所用，「基本上同一」乙詞涉及兩個序列具有80%或更高、較佳85%或更高、更佳90%或更高、甚至更佳95%或更高的同一性。

如本文所用，「抗體」乙詞(可與抗體複數形式互換使用)是指具有特異性結合特定標靶抗原分子的能力的免疫球蛋白分子。如本文所用，「抗體」乙詞不僅包括完整的(即全長)抗體分子，且也包括其保留抗原結合能力的抗原結合片段，例如Fab、Fab’、F(ab’) ₂及Fv。這些片段也是本領域眾所周知的，且經常在活體外及活體內使用。「抗體」乙詞也包括嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及免疫球蛋白分子的任何其他修飾的構型，其包含所需特異性的抗原識別位點，包括抗體的胺基酸序列變體、抗體的醣苷化變體及共價修飾的抗體。

完整或完全的抗體包含兩條重鏈及兩條輕鏈。每條重鏈含有一個可變區(V _H)及一個第一、第二及第三恒定區(C _H1、C _H2及C _H3)；且每條輕鏈含有一個可變區(V _L)及一個恒定區(C _L)。抗體呈「Y」形，Y的主幹經由雙硫鍵結合在一起的兩條重鏈的第二及第三恒定區所組成。Y的每條臂包括與單條輕鏈的可變區及恆定區結合的單條重鏈的可變區及第一恆定區。輕鏈的可變區及重鏈的可變區負責抗原結合。兩條鏈中的可變區大體上負責抗原結合，其各自含有三個高度可變區，稱作互補決定區(CDR)；也就是包括HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3的重(H)鏈CDR以及包括LCCDR1、LCCDR2與LCCDR3的輕(L)鏈CDR。三個CDR藉由框架區(FR1、FR2、FR3及FR4)連接，框架區較CDR更高度保守並形成支持高度變異區的支架。重鏈及輕鏈的恆定區不負責抗原結合，但參與各種效應子功能。根據免疫球蛋白的重鏈恆定結構域的抗體胺基酸序列，其可分為不同的種類。有五大類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別被稱作α、δ、ε、γ及μ。

如本文所用，「抗原結合片段」或「抗原結合結構域」等詞涉及負責抗原結合的完整抗體分子的部分或區域。抗原結合片段能夠結合與親代抗體結合的相同抗原。抗原結合片段的實例包括但不限於：(i)Fab片段，其可為由V _H- C _H1鏈及V _L- C _L鏈所組成的單價片段；(ii)F(ab’) ₂片段，其可為由兩個Fab片段在鉸鏈區處藉由雙硫鍵連接所組成的二價片段；(iii)Fv片段，其由藉由非共價相互作用締合在一起的抗體分子的V _H及V _L結構域所組成；(iv)單鏈Fv(scFv)，其可為由V _H結構域及V _L結構域經由肽連接子所組成的單一多肽鏈；以及(v)(scFv) ₂，其可含有藉由肽連接子連接的兩個V _H結構域及經由雙硫鍵與兩個V _H結構締合的兩個V _L結構域。

如本文所用，「嵌合抗體」乙詞涉及含有來自不同來源，例如不同物種的多肽的抗體。在一些具體實施例中，在嵌合抗體中，輕鏈及重鏈的可變區可模擬衍生自一種哺乳動物(例如非人類哺乳動物，諸如小鼠、兔及大鼠)的抗體的可變區，而恆定區可與衍生自另一種哺乳動物(諸如人類)的抗體中的序列同源。

如本文所用，「人源化抗體」乙詞涉及包含源自人類抗體的框架區及一或多個來自非人類(通常為小鼠或大鼠)免疫球蛋白的CDR的抗體。

如本文所用，「人類抗體」乙詞涉及其中輕鏈及重鏈序列的基本上整個序列，包括互補決定區(CDR)，來自人類基因的抗體。在一些情況下，人類抗體可包括一或多個不由人類生殖細胞系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基，例如藉由在一或多個CDR或在一或多個FR中的突變，諸如以便例如降低可能的免疫原性、增加親和力、以及消除可能導致不欲折疊的半胱胺酸等。

如本文所用，「特異性結合(specific binds)」或「特異性結合(specifically binding)」等詞涉及兩個分子之間的非隨機結合反應，諸如抗體與其標靶抗原的表位的結合。「特異性結合」標靶抗原或表位的抗體為本領域熟知的用語，且判定這種特異性結合的方法也為本領域所熟知。若抗體以較其結合其他物質更大的親和力/親合力、更容易、及/或更長的持續時間結合標靶抗原，則抗體「特異性結合」標靶抗原。換句話說，藉由閱讀此定義也應理解到，例如，特異性結合第一標靶抗原的抗體可特異性或不特異性或優先結合第二標靶抗原。因此，「特異性結合」或「優先結合」不一定需要(儘管其可包括)排他性結合。一般來說，結合的親和力可根據解離常數(K _D)來定義。通常，當用於抗體時，特異性結合可涉及以下抗體：以低於約10 ^-7M，諸如約10 ^-8M或更低，諸如約10 ^-9M或更低、約10 ^-10M或更低、約10 ^-nM或更低、約10 ^-12M或更低、或甚至更低的K _D值特異性結合(識別)其標靶，且以相當於其與非特異性抗原(諸如BSA或酪蛋白)結合的親和力低至少10倍，諸如低至少100倍，例如低至少1,000倍或低至少10,000倍的K _D的親和力結合特異性標靶。

如本文所用，「核酸」或「多核苷酸」等詞可涉及由核苷酸單元組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，諸如去氧核糖核酸(「DNA」)及核糖核酸(「RNA」)，以及核酸類似物，其包括具有非天然存在的核苷酸的那些。可例如使用自動DNA合成儀合成多核苷酸。應理解到，當核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示時，這也包括其中「U」取代「T」的RNA序列(即A、U、G、C)。「cDNA」乙詞涉及與mRNA互補或相同的單鏈或雙鏈形式的DNA。

如本文所用，「互補」乙詞涉及兩個多核苷酸的相互作用表面的拓撲相容性或匹配在一起。當第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結合配偶體的核苷酸序列相同時，第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。因此，序列5′-ATATC-3′的多核苷酸與序列5’-GATAT-3’的多核苷酸互補。

如本文所用，「編碼」乙詞涉及多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的天然性質，該多核苷酸用作生物過程中合成其他聚合物及大分子的模板，其具有給定的RNA轉錄物(即rRNA、tRNA及mRNA)序列或給定的胺基酸序列以及由此產生的生物學性質。因此，若由基因產生的mRNA的轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白，則該基因編碼蛋白。本發明所屬技術領域中具有通常知識者應理解到，由於基因密碼的退化性，因此許多不同的多核苷酸及核酸可編碼相同的多肽。也應理解到，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可使用不影響由本文所述的多核苷酸編碼的多肽序列的常規技術進行核苷酸置換，以反映其中待表現多肽的任何特定宿主有機體的密碼子使用。因此，除非另有說明，否則「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」涵蓋彼此為退化的且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。

如本文所用，「重組核酸」乙詞涉及具有非天然連接在一起的序列的多核苷酸或核酸。重組核酸可用載體的形式存在。「載體」可含有給定感興趣的核苷酸序列及調控序列。載體可用於表現給定的核苷酸序列(表現載體)或維持給定的核苷酸序列，以便對其複製、操控或在不同位置之間(例如在不同有機體之間)轉移。為了上述目的，可使載體引入合適的宿主細胞。「重組細胞」涉及已使重組核酸引入其中的宿主細胞。「轉化細胞」是指藉由重組DNA技術使編碼感興趣的蛋白的DNA分子引入其中的細胞。

載體可為各種類型，包括質體、黏接質體、游離基因體、F型黏接質體(fosmid)、人工染色體、噬菌體、病毒載體等。通常，在載體中，給定的核苷酸序列可操作地連接到調控序列，使得當載體被引入宿主細胞時，給定的核苷酸序列可在調控序列的控制下在宿主細胞中表現。調控序列可包含，例如但不限於，啟動子序列(例如巨細胞病毒(CMV)啟動子、猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、T7啟動子、及醇氧化酶基因( AOX1)啟動子)、起始密碼子、複製起點、強化子、分泌訊息序列(例如　-交配因子訊息)、終止密碼子、以及其他控制序列(例如Shine-Dalgarno序列及終止序列)。較佳地，載體可進一步含有用於隨後的篩選/選擇步驟的標記序列(例如抗生素抗性標記序列)。為了產生蛋白，在載體中，給定的感興趣的核苷酸序列可與不同於上述調控序列的另一個核苷酸序列連接，以便產生融合多肽並有利於隨後的純化步驟。該融合多肽包括用於純化目的之標籤，例如His標籤。

如本文所用，「治療」乙詞涉及向患有病症、病症的病徵或病況、或病症的惡化的個體施用一或多種活性劑，目的為治癒、癒合、減輕、緩和、改變、補救、改善、改進或影響病症、病症的病徵或病況、由病症引起的殘疾、或病症的惡化或患病傾向。

如本文所用，本文所用的「診斷」乙詞大體上包括判定個體是否可能受到給定疾病、病症或功能障礙的影響。本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常基於一或多個診斷指標(即標記)進行診斷，該標記的存在、不存在或量表明疾病、病症或功能障礙的存在或不存在。本領域應理解到，診斷並不意味著以100%的準確度判定特定疾病的存在或不存在，而是指個體中存在某些疾病的可能性增加。

如本文所用，本文所用的「預後」乙詞大體上涉及臨床病況或疾病的可能病程及結果的預測。通常藉由評估疾病的因素或病徵來進行患者的預後，這些因素或病徵表明疾病的有利或不利病程或結果。應理解到，「預後」乙詞不一定涉及以100%準確度預測疾病的病程或結果的能力。反而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解到，「預後」乙詞涉及將發生某一病程或結果的增加的概率；也就是說，當與未表現出病況的那些個體相比時，在表現出給定病況的患者中更可能發生病程或結果。可理解的是，積極預後通常涉及有益的臨床結果或前景，諸如個體的癌症病況不復發的長期存活，而消極(差)預後通常涉及不良的臨床結果或前景，諸如癌症復發或惡化。

II 、抗 ENO1 抗體

本發明至少部分基於產生能可靠地檢測癌細胞表面上的ENO1的抗ENO1單株抗體(mAb-22)。mAb-22的重鏈可變區(V _H)及輕鏈可變區(V _L)及其互補決定區(HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3)(LCCDR1、LCCDR2及LCCDR3)的胺基酸序列如下表1所示。請參見實例2.5。本發明的抗ENO1抗體包括mAb-22及其功能性變體。

在一些具體實施例中，本發明的抗ENO1抗體為mAb-22的功能性變體，其特徵在於包含(a)包含SEQ ID NO: 2的HC CDR1、SEQ ID NO: 4的HC CDR2及SEQ ID NO: 6的HC CDR3的V _H；以及(b)包含SEQ ID NO: 9的LC CDR1、SEQ ID NO: 11的LC CDR2及SEQ ID NO: 13的HC CDR3的V _L，或其抗原結合片段。

在一些具體實施例中，本發明的抗ENO1抗體具有(a)包含SEQ ID NO: 2的HC CDR1、SEQ ID NO: 4的HC CDR2及SEQ ID NO: 6的HC CDR3的V _H；以及(b)包含SEQ ID NO: 9的LC CDR1、SEQ ID NO: 11的LC CDR2及SEQ ID NO: 13的HC CDR3的V _L，可包含SEQ ID NO: 15或與其基本上相同的胺基酸序列的V _H及包含SEQ ID NO: 16或與其基本上相同胺基酸序列的V _L。特定而言，本發明的抗ENO1抗體包含包括V _H及V _L，該V _H包含與SEQ ID NO: 15具有至少80%(例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列，且該V _L包含與SEQ ID NO: 16具有至少80%(例如82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%)同一性的胺基酸序列。本發明的抗ENO1抗體也包括任何重組(改造)衍生抗體，其由編碼本文所述相關V _H或V _L胺基酸序列的多核苷酸序列所編碼。

「基本上同一」乙詞可指變體的相關胺基酸序列(例如FR、CDR、V _H或V _L中的)與參考抗體相比病無實質性差異，使得變體相對於參考抗體具有基本上相似的結合活性(例如親和力、特異性或兩者)及生物活性。這種變體可包括微小的胺基酸變化。可理解的是，多肽可具有有限數量的變化或修飾，該等變化或修飾可在多肽的與其活性或功能無關的特定部分內進行，且仍產生具可接受濃度的等同或相似生物活性或功能的變體。在一些實例中，胺基酸殘基變化為保守性胺基酸置換，其涉及胺基酸殘基的化學結構與另一個胺基酸殘基的化學結構相似，且多肽功能、活性或其他生物學效應對性質的影響較小或基本上無影響。通常，與CDR區相反，在FR區中可進行相對更多的置換，只要其對抗體的結合功能及生物活性無不利影響(諸如結合親和力與原始抗體相比降低超過50%)。在一些具體實施例中，參考抗體和變體之間的序列同一性可為約80%、82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%、或99%、或更高。可根據改變本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的改變多肽序列的方法製備變體，諸如在編譯此類方法的參考文獻中找到的，如Molecular Cloning：A Laboratory Manual, J. Sambrook等人編輯，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989。例如，胺基酸的保守置換包括在以下群內的胺基酸之間進行的置換：(i)A、G；(ii)S、T；(iii)Q、N；(iv)E、D；(v)M、I、L、V；(vi)F、Y、W；以及(vii)K、R、H。

本文所述的抗體可為動物抗體(例如小鼠衍生的抗體)、嵌合抗體(例如小鼠-人類嵌合抗體)、人源化抗體、或人類抗體。本文所述的抗體也可包括其抗原結合片段，例如Fab片段、F(ab’) ₂片段、Fv片段、單鏈Fv(scFv)及(scFv) ₂。可藉由本領域已知的方法製備抗體或其抗原結合片段。

III 、抗體的製備

本領域的許多傳統方法可用於獲得抗體或其抗原結合片段。

在一些具體實施例中，本文提供的抗體可藉由傳統融合瘤技術製備。一般來說，標靶抗原，例如腫瘤抗原，其任選地與載體蛋白，例如鑰孔戚血藍蛋白共軛，及/或與佐劑，例如，例如完全弗氏佐劑混合，可用於使宿主動物免疫以產生與該抗原結合的抗體。收集分泌單株抗體的淋巴細胞，並與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤。接著篩選以這種方式形成的融合瘤殖株以鑑定及選擇分泌所欲單株抗體的那些。

在一些具體實施例中，本文提供的抗體可經由重組技術製備。在相關方面，也提供編碼所揭示的胺基酸序列的經分離的核酸，以及包含此類核酸的載體及以該等核酸轉化或轉染的宿主細胞。

例如，包含編碼這種抗體的重鏈及輕鏈可變區的核苷酸序列的核酸可經由常規技術選殖到表現載體(例如細菌載體，諸如大腸桿菌載體、酵母載體、病毒載體或哺乳動物載體)中，且可使任何載體引入合適的細胞(例如細菌細胞、酵母細胞、植物細胞或哺乳動物細胞)中以表現抗體。編碼本文所述抗體的重鏈及輕鏈可變區的核苷酸序列的實例如下表1所示。哺乳動物宿主細胞株的實例為人類胚胎腎臟細胞株(293細胞)、幼倉鼠腎臟細胞(BHK細胞)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、非洲綠猴腎臟細胞(VERO細胞)、以及人類肝臟細胞(Hep G2細胞)。用於表現本文所述抗體的重組載體通常含有編碼抗體胺基酸序列的核酸，該等核酸可操作地連接到組成型或誘導型啟動子。典型的載體含有可用於調控編碼抗體的核酸表現的轉錄及翻譯終止子、起始序列及啟動子。載體任選地含有用於原核及真核系統的選擇標記。在一些實例中，重鏈及輕鏈編碼序列兩者都包括在相同的表現載體中。在其他實例中，使抗體的每條重鏈及輕鏈選殖到個別的載體中並單獨產生，其可隨後在用於抗體組裝的合適的條件下培養。

用於表現本文所述抗體的重組載體通常含有編碼抗體胺基酸序列的核酸，該等核酸可操作地連接到組成型或誘導型啟動子。重組抗體可在原核或真核表現系統中產生，諸如細菌、酵母、昆蟲及哺乳動物細胞。典型的載體含有可用於調控編碼抗體的核酸表現的轉錄及翻譯終止子、起始序列及啟動子。載體任選地含有用於原核及真核系統的選擇標記。可進一步分離或純化所產生的抗體蛋白以獲得基本上均質的製劑，用於進一步的測定及應用。合適的純化程序例如可包括在免疫親和或離子交換管柱上分離、乙醇沉澱、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、高效能液相層析法(HPLC)、硫酸銨沉澱、以及凝膠過濾。

當需要全長抗體時，本文所述的任何V _H及V _L鏈的編碼序列可與免疫球蛋白的Fc區的編碼序列連接，且可在合適的宿主細胞中表現及組裝所得的編碼全長抗體重鏈及輕鏈的基因，該宿主細胞例如為植物細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞。

可經由常規方法製備抗原結合片段。例如，F(ab’) ₂片段可藉由胃蛋白酶消化全長抗體分子來產生，且Fab片段可藉由還原F(ab’) ₂片段的雙硫鍵來製備。或者，也可經由重組技術，藉由在合適的宿主細胞中表現重鏈及輕鏈片段，並使其在活體內或活體外組裝形成所欲的抗原結合片段，來製備這些片段。可經由重組技術，藉由使編碼重鏈可變區的核苷酸序列及編碼輕鏈可變區的核苷酸序列連接，來製備單鏈抗體。較佳地，在兩個可變區之間併入柔性連接子。

可進一步修飾一種抗體以在抗體(諸如另一種蛋白及/或藥物或載體)的N-末端及/或C-末端處與一或多個額外元件共軛。較佳地，與額外元件共軛的抗體保留所欲的結合特異性及治療效果，同時提供由額外元件產生的額外性質，例如有助於溶解度、儲存或其他處理性質、細胞滲透性、半衰期、降低超敏反應、控制輸送及/或分配。其他具體實施例包括標記(例如染料或螢光團)的共軛，用於測定、檢測、追踪等。在一些具體實施例中，抗體可與額外元件共軛，諸如肽、染料、螢光團、碳水化合物、抗癌劑、脂質等。另外，抗體可直接經由Fc區附著到脂質體的表面，例如以形成免疫脂質體。

IV 、組合物

根據本發明，抗ENO1抗體與可醫藥上可接受的載體配製成組合物，以便輸送及吸收。

如本文所用，「醫藥上可接受」是指載體與組合物中的活性成分相容，且較佳可穩定該活性成分且對接受個體是安全的。該載體可為活性成分的稀釋劑、媒介物、賦形劑或基質。通常，包含如本文所述抗ENO1抗體作為活性成分的組合物可呈溶液形式，諸如如水溶液，例如鹽水溶液，或其可呈粉末形式提供。合適的賦形劑也包括乳糖、蔗糖、右旋糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶型纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、殺菌水、糖漿、以及甲基纖維素。該組合物也可含有接近生理條件所需的醫藥上可接受的輔助物質，例如pH調控及緩沖劑，諸如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。組合物的形式可為片劑、丸劑、粉劑、錠劑、小包、糖劑、酏劑、懸浮劑、洗劑、溶液、糖漿、軟明膠膠囊及硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液、以及包裝粉末。本發明的組合物可經由任何生理學上可接受的路徑傳輸，諸如口服、腸胃外(諸如肌肉內、靜脈內、皮下及腹膜內)、經皮、栓劑、以及鼻內方法。在某些具體實施例中，本發明的組合物作為液體可注射製劑施用，其可作為即用型劑型或作為可複溶的穩定粉末提供。

V 、治療

根據本發明，本文所述的抗ENO1抗體可特異性結合ENO1，並能夠抑制ENO1下游訊息傳遞路徑，其例如包括減弱HGF觸發的HGFR及其下游訊息傳遞組分的磷酸化、降低ENO1和HGFR之間的結合、及/或降低SLUG穩態蛋白濃度。因此，本文所述的抗ENO1抗體有利於治療與ENO1下游訊息傳遞活化相關的疾病及病症。

因此，本文揭示一種抑制ENO1下游訊息傳遞及/或治療與ENO1下游訊息傳遞活化相關的疾病或病症的方法。方法包含向有此需要的患者施用有效量的如本文所述的抗ENO1抗體作為活性成分或包含該抗體的組合物。在一些具體實施例中，ENO1下游訊息傳遞的活化與增殖疾病或病症(例如癌症及其轉移)有關。在某些具體實施例中，癌症選自由以下組成的群組：肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、及睪丸癌，已觀察到其具有ENO1 mRNA或蛋白過度表現的特徵。在一具體實例中，癌症為肺癌。

本文所用的「有效量」乙詞涉及在治療的個體或細胞中賦予所欲生物效應的活性成分的量。有效量可根據各種原因而改變，諸如施用路徑及頻率、接受該藥品的個體的體重及種類、以及施用目的。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可基於本文的揭示內容、已建立的方法、及其自身經驗來判定每種情況下的劑量。

藉由本文所述的治療方法所治療的個體可為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物包括但不限於農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠、及大鼠。需要治療的人類個體可為患有、有風險患有、或懷疑患有目標疾病/病症(諸如癌症)的人類患者。懷疑患有任何這種目標疾病/病症的個體可能顯示出疾病/病症的一或多種症狀。處於疾病/病症風險中的個體可為具有該疾病/病症的一或多種風險因素的個體。

在一些具體實施例中，需要藉由本發明的方法來治療的個體具有表現(例如過度表現)ENO1的細胞或組織。可在可能疾病的第一個徵象之前或在疾病診斷之前或之後啟動如本文所述的抗體療法。

在一些具體實施例中，如本文所述的抗體療法可與本領域已知的一或多種癌症療法組合使用。這些已知的癌症療法包括手術、放射、化療、細胞療法、及其任何組合。

VI 、診斷及預後

已在許多不同的腫瘤類型中觀察到ENO1，且已知其與降低的存活率及不良預後高度相關。因此，本發明提供一種使用如本文所述的抗ENO1抗體檢測ENO1的方法，用於診斷及預後目的。一般而言，本文所述的檢測方法包含(i)使本文所述的抗ENO1抗體或其抗原結合片段與有此需要的個體的細胞接觸；(ii)檢測抗體或其抗原結合片段與細胞的結合。細胞可存在於活體外，其中細胞存在於分離自有此需要的個體的生物樣品中或存在於有此需要的個體體內。個體可為處於癌症風險中或懷疑患有癌症的個體，或可能正在接受癌症治療的患有癌症的個體。如本文所述的檢測方法可用於鑑定肯順從癌症療法的個體及/或監測癌症惡化或對療法的反應。

在一些具體實施例中，當在活體外進行檢測方法時，生物樣品可為任何類型的樣品，諸如體液樣品或其中可能存在癌細胞的組織樣品。這種樣品的實例包括但不限於血液、尿液、唾液、腦脊液、腹水、淋巴液、乳頭抽吸液、支氣管肺泡灌洗液、精液、或來自肺臟、乳房、子宮頸、結腸、胃臟、肝臟、卵巢、胰臟、前列腺、皮膚、及睪丸的組織或活體組織樣品。例如，從個體獲得生物樣品，且使用本文所述的抗ENO1抗體藉由免疫測定分析生物樣品，以檢測樣品中ENO1的存在或濃度。免疫測定的實例包括但不限於西方墨點法、酵素結合免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、放射免疫沉澱測定(RIPA)、免疫螢光測定(IFA)、ELFA(酵素結合螢光免疫測定)、電化學發光(ECL)、以及毛細管凝膠電泳(CGE)。

在一些具體實施例中，當在活體內進行檢測方法時，可在需要的整個活的個體中使用合適的活體內成像技術。例如，本文所述的抗ENO1抗體可被可檢測地標記並施用於有需要的個體，且使用本領域可用的成像方法來檢測經結合的可檢測地標記的抗體。

在一些具體實施例中，檢測方法可用於預後目的。特定而言，方法可進一步包含使檢測的結果與ENO1參考濃度進行比較，並基於比較的結果判定個體的預後，其中升高的ENO1濃度表明消極預後。在一些具體實施例中，參考濃度可涉及在正常個體或樣品中測量的濃度，該等樣品諸如為未患病的組織或細胞(鄰近的非癌性/正常組織)。在一些具體實施例中，參考濃度可為標準值，其可代表癌症患者群體中標記(例如ENO1)的平均或中位數量。通常，選擇這樣的癌症患者群體以在例如年齡、癌症類型及/或種族背景下與候選個體相配。較佳地，這樣的癌症患者群體及候選個體為相同物種(例如人類)。

在一些具體實施例中，為了監測癌症惡化，對患有癌症的個體進行檢測方法。特定而言，從癌症患者的不同時間點獲得生物樣品，並基於ENO1的表現濃度判定患者中的癌症惡化，其中隨時間升高的ENO1濃度表明癌症惡化。

在一個具體實施例中，檢測方法包含 (i)在第一時間點提供來自癌症患者的第一生物樣品； (ii)在第二時間點提供來自患者的第二生物樣品，第二時間點晚於第一時間點； (c)檢測第一生物樣品及第二生物樣品中ENO1的濃度，其中藉由如本文所述的抗體或其抗原結合片段的免疫測定來進行檢測；以及 (iv)基於第一生物樣品及第二生物樣品中的ENO1濃度來判定患者的癌症惡化，其中與第一生物樣品相比，第二生物樣品中升高的ENO1濃度表明癌症惡化。

也提供用於實施本發明方法的試劑盒。特定而言，試劑盒包含如本文所述的抗ENO1抗體或其抗原結合片段或包含其的組合物，以及使用試劑盒活體外檢測ENO1的存在或含量的說明書(例如書面、磁帶、VCR、CD-ROM等)，例如在來自有需要的個體的生物樣品中或在有需要的個體體內。試劑盒的測定形式可例如為晶片或ELISA。

VII 、抗癌候選試劑的篩選方法

根據本發明，與癌細胞表面上的ENO1結合及/或ENO1下游訊息傳遞的負調控對於抑制癌症生長及惡化是關鍵的。因此，本發明提供一種篩選用於癌症療法的候選藥劑的方法，該方法是基於與癌細胞表面上的ENO1結合及/或負調控ENO1下游訊息傳遞的活性。

具體而言，本發明的方法包含(i)將藥劑與在癌細胞的細胞表面上表現ENO1的癌細胞接觸；(ii)檢測藥劑與在癌細胞的細胞表面上的ENO1的結合及/或測量癌細胞中一或多個ENO1下游訊息傳遞事件/組分的濃度；以及(iii)基於檢測及/或測量的結果來判定藥劑是否為候選抗癌藥。

在一些具體實施例中，顯示藥劑與在細胞表面上的ENO1結合的檢測的結果表明藥劑具有抗癌作用。

在一些具體實施例中，測量結果示出與不存在試劑時相比，存在試劑時癌細胞中ENO1下游訊息傳遞事件/組分中一或多個的濃度降低，該等測量結果表明試劑具有抗癌作用。

在一些具體實施例中，一或多個ENO1下游訊息傳遞事件/組分包含HGF觸發的HGFR的磷酸化、ENO1和HGFR之間的締合、及/或SLUG穩態蛋白。

在一些具體實施例中，抗癌作用包含抑制腫瘤生長及/或轉移。

在一些具體實施例中，癌症選自由以下組成的群組：肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、及睪丸癌。

在一具體實施例中，癌症為肺癌。

本文所述的藥劑篩選可使用活體外細胞模型進行。多種測定可用於此目的，例如免疫沉澱及西方墨點法。接著，可例如藉由細胞存活力測定及/或細胞侵入測定及/或使用活體內動物腫瘤/轉移模型來進一步分析試劑的功能活性。用於篩選的試劑可為抗體或小分子化合物。

本發明藉由以下實例進一步說明，提供這些實例是為了說明而非限制。根據本文揭示，熟悉本發明所屬領域人員應當理解，可在所揭示的具體實施例中進行許多改變，且在不脫離本發明精神及範圍下仍可獲得相同或相似結果。

實例

ENO1表現與許多癌症類型(包括肺癌)的存活率降低及預後不良顯著相關。然而，ENO1在致癌作用中的功能仍不得而知，且目前仍未有批准用於臨床應用的基於ENO1的治療藥物。在此研究中，吾人發現ENO1的高度表現存在於轉移性肺癌細胞株及惡性腫瘤中，且其與肺癌患者的整體存活率差相關。活體外功能研究顯示，敲低ENO1會降低癌細胞增殖及侵入性，而這些過程藉由ENO1過度表現而增強。另外，ENO1在原位異種移植模型中促進腫瘤生長，並在尾靜脈注射模型中增強肺臟腫瘤轉移。這些作用可能是由間質標記(N-鈣黏蛋白及波形蛋白)及上皮-間質轉化調控子SLUG的正調控，以及E-鈣黏蛋白表現的同時負調控所媒介。機轉上，ENO1可與肝細胞生長因子受體(HGFR)相互作用，並藉由增加HGFR及Wnt共受體LRP5/6的磷酸化來活化HGFR及Wnt訊息傳遞。這些訊息傳遞反應的活化經由Src-PI3K-AKT訊息傳遞及β-連環蛋白破壞複合物的去活化最終正調控SLUG及β-連環蛋白而降低GSK-3β活性。另外，吾人產生一種嵌合抗ENO1單株抗體(chENO1-22)，其可降低癌細胞的增殖及侵入。chENO1-22藉由抑制ENO1媒介的GSK3β去活化以促進SLUG蛋白泛蛋白化及降解來抑制癌細胞侵入。另外，在尾靜脈注射動物模型中，chENO1-22抑制肺臟腫瘤轉移並延長存活時間。總之，吾人的發現闡明肺癌轉移中ENO1調控的分子機轉，並引入一種用於肺癌潛在治療用途的新穎抗體。

1. 材料及方法

1.1 細胞培養物及試劑

NL-20、CL1-5、H460細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，並由ATCC基於DNA圖譜、細胞基因學分析及同工酶學作鑑定。按照ATCC方案培養細胞，復甦後傳代少於6個月。NL-20為衍生自正常支氣管的永生化、無致瘤性人類支氣管上皮細胞株。購自Lonza的NHBE細胞為正常人類支氣管上皮細胞。Hop62、CL1-0及CL141細胞為楊泮池博士(台灣大學)所慷慨饋贈。Gsk-3抑制劑BIO購自Sigma-Aldrich。

1.2 逆轉錄酶 -PCR 及西方墨點法

如先前所述進行逆轉錄酶-PCR及免疫墨點法 ³⁷。在免疫墨點法測定中使用下列初級抗體：抗ENO1(11204-1-AP；Proteinech)、抗E-鈣黏蛋白(24E10；Cell Signaling Technology)、抗波形蛋白(D21H3；Cell Signaling Technology)、抗N-鈣黏蛋白(610920；BD Biosciences)、抗SNAIL(C15D3；Cell Signaling Technology)、抗TWIST(GTX127310；GeneTex)、抗SLUG(C19G7；Cell Signaling Technology)、抗GSK-3β(27C10；Cell Signaling Technology)、磷酸-GSK-3β(Y216) (612312；BD Biosciences)、磷酸-GSK-3β(Ser9)(5B3；Cell Signaling Technology)、抗-非-磷酸(活性)β-連環蛋白(D13A1；Cell Signaling Technology)、抗-β-連環蛋白(D10A8；Cell Signaling Technology)、磷酸-Src家族(Tyr416)(D49G4；Cell Signaling Technology)、磷酸-PI3激酶p85(Tyr458)/p55(Tyr199)(Cell Signaling Technology)、磷酸-Akt(Ser473)(Cell Signaling Technology)、抗FLAG(F3165；Sigma-Aldrich)及抗Myc(9E10；Santa Cruz Biotechnology)、以及抗HGFR(D1C2；Cell Signaling Technology)，適當使用山葵過氧化酶(HRP)共軛的兔抗小鼠或山羊抗兔二級抗體(Santa Cruz Biotechnology)。

1.3 流式細胞術

在裝有407、488、633 nm雷射的Beckman Dickinson LSR-II流式細胞儀(Cornell Biotechnology；Flow Cytometery Core Facility)上進行流式細胞術。進行典型的單色分析。使用GraphPad Prism(v 6.0)進行曲線擬合及數據分析。藉由未配對的學生t檢定獲得P值。使用Countess II(Invitrogen)進行細胞計數。

1.4 組織微陣列及免疫組織化學

組織微陣列從商業來源(SuperBioChips)獲得。總共測試9個正常肺臟樣品、40個原發性肺癌樣品以及10個轉移性肺癌細胞。用於染色的初級抗體靶向抗ENO1(Abcam Biotechnology)。對識別資訊不知情獨立主持人將IHC的訊息分級為0(無表現)、1(微弱表現)、2(中度表現)、以及3(強烈表現)。也評估以百分比表示的陽性染色的面積。

1.5 標靶蛋白的功能分析

產生含有shRNA及pLKO.1空載體或pLKO-螢光素酶對照組的慢病毒(pLKO.1)，並按照標準程序用於感染癌細胞。如先前所述藉由嘌黴素選擇來建立穩定的轉染子 ³⁸。除了轉染後基因產物的過度表現外，也藉由功能測定來評估標靶基因的作用。藉由先前所述的方案評估細胞形態、增殖速率以及侵入能力的變化 ³⁸。

1.6 細胞存活力

藉由胰蛋白酶化收集細胞，並使其再懸浮於含有10% FBS的RPMI中。接著使細胞以每孔3000個的密度鋪在96孔盤中並培養隔夜。以每種濃度的藥物處理四次複製；對照組加入PBS緩衝液。加入WST-1後，使試劑在96孔盤中保持1小時。監測450 nm處的吸光度。

1.7 基質膠侵入測定 Transwell 細胞侵入測定

使用24孔transwell盤(Costar)與聚碳酸酯過濾器(孔徑8 μm)進行基質膠侵入測定。在冰上以4℃無血清培養基使基質膠稀釋到1 mg/ml，並加入到盤的上腔室中。在37℃培養箱中培養30分鐘後，加入具有1 × 10 ⁵個細胞/ml的細胞懸浮液。對於下腔室，加入800 μl具有10% FBS的培養基。16-24小時後，以95%甲醇固定細胞5分鐘。結晶紫(0.1%)用於染色細胞。接著在顯微鏡下觀察transwell盤。

1.8 活體內原位肺臟腫瘤及轉移模型

雌性非肥胖糖尿病/嚴重複合型免疫缺乏症(NOD-SCID)小鼠用於建立原位肺臟腫瘤及轉移性肺癌異種移植模型。對於原位異種移植模型，使穩定表現螢光素酶並被shENO1或對照組shCtrl感染的1 × 10 ⁵個CL1-5細胞原位注射到NOD-SCID小鼠的肺臟實質中。對於轉移模型，藉由尾靜脈注射使穩定表現螢光素酶並被shENO1或對照組shCtrl感染的1 × 10 ⁶個CL1-5細胞注射到小鼠。所有動物研究均獲得台灣台北國防醫學院的實驗動物照護及使用委員會批准。

1.9 免疫螢光分析

細胞生長至合適的匯合濃度如所示進行處理。實驗結束時，藉由加入多聚甲醛(PFA)在4℃下固定細胞20分鐘。去除PFA，接著以PBS清洗細胞3次，並在37℃下以2 ml成像封閉緩衝液(PBS中的3% BSA)封閉1小時。以PBS清洗盤兩次，接著在室溫下以初級抗體處理1小時。去除初級抗體，並以PBS清洗盤兩次。接著加入二級抗體1小時。使盤在含有1 mg/ml DAPI的PBS中清洗一次，接著以PBS清洗一次。樣品在4℃保存直到成像為止。

1.10      TOP/FOP Wnt 活性測定

使CL1-5細胞(每孔2 × 10 ⁴個細胞)接種在24孔盤中。使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)使質體轉染到細胞中。螢光素酶報導子(TOPflash或FOPflash)或與pGL4.74 hRluc-TK構築體(海腎螢光素酶)共轉染。藉由雙螢光素酶報導子測定系統統(Promega，Madison，WI，USA)測量螢光素酶活性。轉錄活性藉由在轉染後48小時標準化為海腎螢光素酶濃度的螢火蟲螢光酵素的表現來判定。以雙螢光素酶報導子檢測試劑盒(Promega)進行測量。

1.11 磷酸 -RTK 陣列分析

根據製造商的方案，使用人類磷酸-RTK陣列試劑盒(R&D Systems)來判定49種不同RTK的酪胺酸磷酸化的相對濃度。簡言之，在以陣列緩衝液1封閉1小時後，使陣列與300 µg蛋白溶胞產物在4℃下培養隔夜。清洗陣列並與抗磷酸-酪胺酸-HRP檢測抗體一同培養。使用化學試劑混合物產生訊號，並使用化學發光成像系統(GE ImageQuant LAS4000)捕捉訊號。使用ImageJ軟體對每個磷酸-RTK陣列訊號的強度進行定量；相對於陰性對照組斑點，判定來自每對重複斑點的平均訊號的相對強度。

1.12      GST 下拉

在GST下拉分析中，使His-HGFR與麩胱甘肽珠結合的GST-ENO1或單獨珠結合的GST(對照組)在下拉緩衝液(PierceTM GST蛋白相互作用下拉試劑盒)中在4℃下培養1小時。

1.13 免疫沉澱 (IP)- 西方墨點法

使蛋白溶胞產物與抗FLAG瓊脂糖珠(A2220；Sigma-Aldrich，USA)、抗Myc瓊脂糖珠(C3956；Sigma-Aldrich，USA)一同培養用於共IP實驗，或與抗SLUG(C19G7；Cell Signaling Technology, Inc.，USA)一同培養用於泛蛋白化(Ub)測定。在免疫墨點法中使用下列初級抗體：抗ENO1(11204-1-AP；Proteintech)、抗SLUG(C19G7；Cell Signaling Technology)、抗FLAG(F3165；Sigma-Aldrich)、抗Myc(9E10；Santa Cruz Biotechnology)、抗泛素(P4D1；Cell Signaling Technology)、以及抗HGFR(D1C2；Cell Signaling Technology)。適當使用山葵過氧化酶(HRP)共軛的兔抗小鼠或山羊抗兔二級抗體(Santa Cruz Biotechnology)。

1.14 抗腫瘤抗原的單株抗體的產生

根據標準程序 ³⁹，經過一些修改 ^40–42，進行抗腫瘤抗原mAb的產生。簡言之，取出免疫小鼠的脾臟，使脾臟細胞與NSI/1-Ab4-1(NS-1)骨髓瘤細胞融合。以無血清DMEM培養基清洗脾臟細胞及骨髓瘤細胞兩次。使最終沉澱物在15 ml錐形管中混合，並在1分鐘內加入1 ml 50% (v/v)聚乙二醇(GIBCO BRL)，同時輕輕攪拌。藉由緩慢(1分鐘)加入1ml DMEM兩次，接著緩慢加入(2分鐘)8 ml無血清的DMEM培養基來稀釋混合物。使混合物離心，並使經融合的細胞沉澱物再懸浮在補充有15% FBS的DMEM培養基、次黃嘌呤-胺蝶呤-胸苷(HAT)培養基、以及融合瘤選殖因子中，並分配在96孔組織培養物盤中。藉由ELISA篩選融合瘤聚落，以便分泌與腫瘤抗原結合的mAb。藉由有限稀釋對選定的殖株進行次選殖。使用同型試劑盒對最終的融合瘤殖株進行同型分析。在異十八烷刺激過(pristane-primed)的BALB/c小鼠中產生腹水。融合瘤細胞株在含有10%熱去活化FBS的DMEM培養基中生長。以蛋白G瓊脂糖4B凝膠親和純化單株抗體。ELISA測定及西方墨點法用於測量抗體的活性及特異性。

1.15      ELISA

以2%多聚甲醛固定細胞培養物(96孔)盤(Corning Costar)，並以1%牛血清白蛋白(BSA)封閉。使細胞加入到盤中並培養1小時。隨後將板以含有0.1%(w/v)Tween-20(PBST0.1)的PBS清洗盤，接著以辣山葵過氧化酶共軛的抗小鼠IgG(115-035-062；Jackson ImmunoResearch Laboratories)一同培養1小時。清洗後，使板與受質溶液(鄰苯二胺二鹽酸鹽；P6787，Sigma)一同培養。加入3N Hcl終止反應，並使用微盤讀取器在490 nm處檢測訊號。

1.16 免疫金標記

以4%甲醛固定CL1-5細胞，並加工用於冷凍切片。以BSA封閉切片，接著以chENO1抗體-22(40 µg/ml)或NHIgG標記ENO1。固定後，使樣品染色並以穿透式電子顯微鏡上檢查。

1.17 統計分析

數據表示為平均值± SEM。使用學生t檢定進行兩組之間的數據比較。以GraphPad Prism軟體5.0版進行統計學分析。所有統計學檢驗均為雙測的，且P值＜ 0.05被認為是統計顯著的。

2. 結果

2.1  ENO1 在轉移性癌細胞株及患者中高度表現，且其高度表現與肺癌患者較差的整體存活率相關

為了評估ENO1表現和肺癌惡性腫瘤之間的相關性，吾人測量一組肺癌細胞及臨床NSCLC標本中的ENO1蛋白濃度。與非轉移性細胞株(CL1-0及Hop62)相比，ENO1蛋白濃度在高度轉移性肺癌細胞株(CL1-5及CL141)中升高，且在正常人類支氣管上皮(NHBE)細胞或NL-20永生化人類支氣管上皮細胞中僅檢測到微弱表現(圖1A)。另外，根據使用嵌合ENO1抗體(圖9)的流式細胞術分析(圖1B)，與NHBE或NL-20細胞相比，ENO1的表面表現在CL1-5細胞中被正調控。另外，吾人進行免疫金標記測定以證實ENO1蛋白定位。預期在CL1-5細胞的細胞表面、細胞質及細胞核中檢測到ENO1(圖1C)。在NSCLC患者的臨床腫瘤樣品中，ENO1表現增加與TNM及轉移階段增加有關，但ENO1 mRNA及蛋白在正常肺臟組織中並不豐富(圖1D到圖1F及圖10)。另外，基於ENO1蛋白表現濃度的存活分析顯示，與具有低ENO1表現的患者相比，具有高度ENO1表現的NSCLC患者的存活率顯著降低(圖1G)。另外，根據Kaplan-Meier繪圖儀資料庫(KM繪圖儀，http://kmplot.com/analysis/)(圖1H)及TCGA數據庫(圖1I)，ENO1的高mRNA表現與NSCLC患者的較差整體存活率密切相關。總之，這些發現表明ENO1的高度表現和肺癌惡性腫瘤之間存在很強的相關性。

2.2  ENO1 增強肺癌細胞存活力及侵入力

為了在活體外研究ENO1在肺癌細胞中的生物學功能，吾人建立組成型ENO1敲低系統。CL1-5或CL-141細胞被攜帶靶向ENO1(shENO1-1、shENO1-2)的不同編碼序列的兩種小髮夾RNA(shRNA)之一或對照組非靶向shRNA(shLacZ)的慢病毒感染(圖2A)。敲除ENO1顯著降低細胞存活力(圖2B)及細胞侵入(圖2C)。吾人也在CL1-0細胞中穩定過度表現ENO1，其通常表現出低ENO1表現(圖2D)，且吾人發現ENO1過度表現顯著增強細胞存活力(圖2E)並同時增加侵入細胞的數目(圖2F)。總之，這些結果表明ENO1在活體外增加肺癌細胞的存活力及侵入力。

2.3  ENO1 促進異種移植模型中肺癌的致瘤性及轉移

腫瘤生長、侵入及轉移為腫瘤惡化中的關鍵步驟。首先，為了研究ENO1對體內致瘤性的作用，吾人建立原位異種移植模型。使穩定表現螢光素酶並被shENO1或shCtrl感染的十萬個CL1-5細胞原位注射到NOD-SCID小鼠的肺臟實質中。使用基於螢光素的生物發光檢測腫瘤尺寸，吾人發現注射ENO1敲低細胞的小鼠較注射shCtrl感染的細胞的小鼠具有更低的螢光素酶訊號，這表明ENO1敲低腫瘤的腫瘤生長速率較低(圖3A及圖3B)。在植入後21天採集肺臟組織，並使用蘇木精伊紅染色來檢測肺臟結節。

為了進一步測試ENO1是否可能影響肺癌轉移，吾人研究在靜脈內注射穩定表現螢光素酶的CL1-5細胞並被shENO1或shCtrl感染的NOD-SCID小鼠中的肺臟結節的形成。注射後31天收集小鼠肺臟，並計算肺臟結節的數目。如圖3C及圖3D所示，與ENO1敲低組相比，在注射對照組shCtrl細胞的小鼠肺臟中存在更強的螢光素酶訊號。另外，ENO1敲低細胞產生的轉移性肺臟結節較對照組細胞更少(圖3E)。總之，這些數據證明ENO1在異種移植模型中促進腫瘤形成肺癌細胞的轉移行為中扮演重要角色。

2.4  ENO1 經由 HGFR- 及 WNT- 驅動的上皮 - 間質轉化增強癌細胞侵入

先前的研究已表明EMT與癌症的侵入、轉移及惡化有關。與顯示纖維母細胞樣間質特徵的對照組細胞相比，因為ENO1敲低CL1-5細胞表現出更像上皮細胞的表現型(圖4A)，因此吾人決定在ENO1敲低及對照組細胞中繪製EMT相關基因的表現譜。吾人發現ENO1敲低抑制間質標記N-鈣黏蛋白、波形蛋白的表現以及EMT調控子SLUG的蛋白濃度，但同時增強E-鈣黏蛋白的表現(圖4B)。藉由免疫螢光在CL1-5細胞中也觀察到ENO1媒介的SLUG表現的正調控。相比之下，在CL1-0細胞中ENO1的異位表現增加N-鈣黏蛋白、波形蛋白及SLUG的濃度，但同時降低E-鈣黏蛋白。有趣的是，ENO1不影響SLUG mRNA濃度(圖4C)。MG132(26S蛋白酶體抑制劑)處理增加SLUG穩態蛋白濃度，這表明蛋白濃度主要受降解所控制(圖4D)。與對照組細胞相比，ENO1的敲低導致泛蛋白化的SLUG濃度增加(圖4E)，且根據環己醯胺處理後的蛋白濃度，其縮短SLUG蛋白半衰期(圖4F及圖4G)。基於這些結果，吾人得出ENO1調控SLUG蛋白的穩定性但不調控其表現的結論。

由於已知Wnt訊息傳遞拮抗劑GSK-3β經由磷酸化及泛素媒介的蛋白水解來影響SLUG蛋白轉換，因此吾人假設ENO1藉由調控GSK-3β來穩定SLUG。事實上，在以GSK3β抑制劑處理後，在ENO1敲低細胞中SLUG被正調控；同時，β-連環蛋白的活性形式也增加(圖5A)。有趣的是，吾人發現敲除ENO1增強GSK-3β(圖5A)，且其也降低Wnt訊息傳遞活性，如藉由TOP/FOP螢光素酶報導子測定所測量的(圖5B)。共焦免疫螢光顯示ENO1敲低也降低核β-連環蛋白濃度(圖5C)。為了進一步測試β-連環蛋白及SLUG是否參與ENO1誘導的細胞侵入，吾人過度表現組成型活性β-連環蛋白(β-連環蛋白△45)或載體對照組，並發現β-連環蛋白△45的過度表現恢復ENO1敲低細胞的侵入能力，但不影響對照組細胞的侵入(圖5D)。另外，吾人也過度表現突變型SLUG(Slug-4SA；SLUG蛋白，其中GSK-3β靶向的四個絲胺酸殘基被丙胺酸取代)或野生型Slug(Slug-WT) ⁴³，並發現突變型Slug的過度表現恢復ENO1敲低細胞中的侵入能力及細胞增殖，但野生型Slug並無恢復。接著，吾人分析一組肺癌細胞中的SLUG蛋白濃度，發現與非轉移性細胞株(CL1-0及Hop62)及正常人類支氣管上皮(NHBE)細胞相比，SLUG蛋白濃度在高度轉移性肺癌細胞株(CL1-5及CL141)中升高。此表現組讓人聯想到ENO1在細胞株中的表現(圖1A)。將患者樣品分層為低ENO1、高ENO1及SLUG組，並分析每組的存活率。分析示出，具有高ENO1及高SLUG表現的患者具有最差的整體存活率(圖5E)。總之，這些數據支持ENO1經由GSK3β-SLUG訊息傳遞軸促進惡性細胞侵入的想法。

因為表現ENO1細胞的表現型通常由受體酪胺酸激酶(RTK)活化所引起，因此吾人進一步檢查是否有任何RTK可能參與GSK3β-SLUG軸的ENO1調控。以被shLacZ及shENO1感染的CL1-5細胞的溶胞產物處理人類磷酸-RTK陣列，揭示各組之間HGFR磷酸化濃度的極端差異。這結果藉由西方墨點法證實(敲除ENO1降低磷酸化HGFR的濃度)，其也用於探測已知的下游訊號。HGFR磷酸化與Src-PI3K-AKT路徑的活化及GSK-3β破壞複合物的去活化，以及與CL1-5及CL141細胞中穩定的SLUG及β-連環蛋白同時發生(圖5F)。另外，經純化的重組ENO1可拯救shENO1敲低細胞表現型，諸如HGFR及WNT下游訊息傳遞(圖5F)，且也可拯救shENO1敲低-抑制性細胞侵入能力(圖5G)。已知HGF為標準Wnt訊息傳遞的重要反式活化子，這是由HGFR刺激的GSK-3β依賴性LRP5/6磷酸化所媒介的效應 ⁴⁴，且吾人的數據示出ENO1可增強Wnt訊息傳遞(圖5B到圖5D及圖5F)。因此，吾人測試ENO1是否經由LRP5/6磷酸化來活化Wnt訊息傳遞。事實上，敲低ENO1降低LRP5/6的磷酸化，但其不影響LRP5/6蛋白表現(圖5F)。

令人驚訝的是，吾人也發現ENO1對HGFR活化是必需的，係因敲低ENO1阻止HGF活化HGFR及其下游訊息傳遞(圖6A)。因此，吾人試圖去定義ENO1誘導HGFR磷酸化的機轉。吾人進行GST下拉測定，其中GST-ENO1融合蛋白或GST單獨與純化的His標記的HGFR一同培養，以檢查純化的ENO1和HGFR蛋白之間的直接相互作用。下拉結果示出，在吾人的實驗條件下，His-HGFR與GST-ENO1結合，而非與GST單獨結合(圖6B)。接著，吾人使用非細胞滲透性交聯劑DTSSP，以藉由膜蛋白萃取及IP-西方墨點法進一步證實ENO1與細胞表面的HGFR結合(圖6C)。另外，吾人進行外源性(圖6D)及內源性ENO1與HGFR的共免疫沉澱(Co-IP)，以驗證ENO1和HGFR之間的相互作用(圖6E)。為了進一步證實相互作用，吾人也產生若干Myc標記的HGFR截短突變體，如圖6F的上圖所示。Co-IP測定示出，與ENO1相互作用需要對應於HGFR的胺基酸52–496的SEMA結構域(圖6F)。ENO1和HGFR之間的相互作用是明顯的。因此，吾人提出ENO1可能藉由直接的蛋白-蛋白相互作用來活化HGFR，而ENO1誘導的LRP5/6的磷酸化可能依賴於HGFR活化。吾人也發現ENO1誘導的HGFR活化對於LRP5/6所媒介的SLUG及β-連環蛋白的穩定是必需的；抑制表現ENO1細胞中的HGFR活性會降低LRP5/6磷酸化(圖6G)，且敲低LRP5及LRP6兩者會降低ENO1誘導的SLUG及β-連環蛋白穩定性(圖11)。總之，這些數據示出ENO1藉由調控HGFR及WNT-驅動的EMT來增強癌細胞侵入。

2.5 抗 ENO1 治療性單株抗體的產生及特性化

儘管許多報導已示出ENO1的表現與許多癌症類型(諸如肺癌 ¹²)的存活率降低及預後不良顯著相關，但目前尚無用於臨床的抗ENO1的治療性抗體獲得批准。因此，吾人產生可用於癌症研究及治療的抗ENO1 mAb。吾人藉由小鼠融合瘤篩選來鑑定四種候選的抗ENO1 mAb。吾人的結果示出，藉由細胞ELISA測定，所有四種抗ENO1 mAb均具有對對CL1-5細胞的高度結合活性(圖9A)。重要的是，流式細胞術實驗表明，抗ENO1 mAb-22(ENO1-22)能可靠地檢測CL1-5細胞表面上的ENO1(圖9B)。吾人鑑定來自融合瘤細胞的抗ENO1 mAb-22抗體的V _H及V _L結構域中的胺基酸序列(表1)。 表1

V H 結構域
FW1	CDR1	FW2	CDR2
QVQLQQSGPEVVRPGVSVKISCKGSGYTFT (SEQ ID NO: 1)	DYAMH (SEQ ID NO: 2)	WVKQSHAKSLEWIG (SEQ ID NO: 3)	VISTYNGNTNYNQKFKG (SEQ ID NO: 4)
FW3	CDR3	FW4
KATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCAR (SEQ ID NO: 5)	SPLRY (SEQ ID NO: 6)	WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 7)
V L 結構域
FW1	CDR1	FW2	CDR2
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTC (SEQ ID NO: 8)	RASSSVSYMH (SEQ ID NO: 9)	WYQQKPGSSPKPWIY (SEQ ID NO: 10)	ATSNLAS (SEQ ID NO: 11)
FW3	CDR3	FW4
GVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC (SEQ ID NO: 12)	QQWSSNPLT (SEQ ID NO: 13)	FGAGTKLELK (SEQ ID NO: 14)
重鏈和輕鏈的全長胺基酸序列
重鏈	QVQLQQSGPEVVRPGVSVKISCKGSGYTFT DYAMHWVKQSHAKSLEWIG VISTYNGNTNYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCAR SPLRYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 15)
輕鏈	QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTC RASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIY ATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC QQWSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 16)

接著，吾人使抗ENO1 mAb-22抗體的可變結構域選殖到人類IgG Fc載體中以產生嵌合ENO1-22(chENO1-22)。吾人證實chENO1-22的結合活性，發現抗體保留對活CL1-5細胞的高度親和力(圖9C)，且ENO1-KD細胞證實ENO1的結合特異性(圖9D)。另外，吾人進行免疫金標記測定以證實ENO1蛋白定位。預期在CL1-5細胞的細胞表面、細胞質及細胞核中檢測到ENO1(圖1C)；接著以ENO1敲低CL1-5細胞(圖7A)或過度表現ENO1的CL1-0細胞(圖7B)來驗證ENO1的結合特異性。

接著，吾人評估chENO1-22的抗癌潛力，包括抗增殖和抗侵入作用。chENO1-22在活體外抑制腫瘤細胞生長(圖7C)及癌細胞侵入(圖7D)，但不能檢測表面形式ENO1的mENO1-37則無法抑制癌細胞侵入(圖7D)。吾人接著試圖測試chENO1-22的抗癌作用是否是由於其抑制ENO1下游訊息傳遞路徑所致。事實上，chENO1-22處理抑制ENO1-HGFR的下游訊號，包括SLUG及活性β-連環蛋白的濃度(圖7E)。另外，chENO1-22處理減弱HGF觸發的HGFR及其下游訊息傳遞組分的磷酸化(圖7F)。這些結果與shENO1敲低相似。mAb也降低ENO1和HGFR之間的締合，如藉由內源性蛋白的co-IP所檢測到的(圖7G)。藉由以chENO1-22處理來降低SLUG穩態蛋白濃度，而以MG132處理來增加SLUG穩態蛋白濃度(圖7H)。另外，chENO1-22縮短SLUG蛋白的半衰期，如以環己醯亞胺處理所評估的(圖7I)。這些數據示出，chENO1-22抑制肺癌侵入可能是ENO1-HGFR軸訊息傳遞受到抑制的結果，這讓SLUG蛋白快速降解。

2.6  chENO1-22 抗體減少活體內肺癌細胞轉移

接著吾人想進一步分析活體內對腫瘤轉移的治療效果，因此吾人使CL1-5螢光素酶細胞經由尾靜脈注射到NOD-SCID小鼠中以建立轉移性異種移植模型；隨後以對照組正常人類IgG(NHIgG)或chENO1-22(10或20 mg/kg)來處理經注射的小鼠。mAb處理4周後，無論劑量是10或20 mg/kg，在接受chENO1-22的小鼠肺部中均觀察到較NHIgG更弱的螢光素酶訊號(圖8A及圖8B)。因此，chENO1-22治療顯著抑制肺腫瘤轉移。另外，與經NHIgG處理的小鼠相比，經chENO1-22處理的小鼠維持正常體重(圖12)並示出改善的存活率(圖8C)。

基於這些發現，吾人在圖8D中提出ENO1何以藉由HGFR-Src-PI3K-AKT-GSK3β-SLUG及WNT-GSK3β-SLUG訊息傳遞軸促進細胞侵入的模型。

3. 討論

吾人的研究結果示出，ENO1蛋白在NSCLC細胞中高度表現，但在正常肺臟組織中表現較弱。另外，高度ENO1表現與肺癌患者的TMN階段及不良結果呈正相關。這些發現表明，ENO1為肺癌潛在有價值的診斷生物標記及/或治療標靶。侵入-轉移級聯可簡化為兩個關鍵步驟：(i)癌細胞從原發性腫瘤擴散到遠端組織，以及(ii)藉由侵入癌細胞而在遠端器官移生，形成微轉移 ²²。靶向ENO1的shRNA的表現在活體外抑制肺癌細胞的侵入能力，並在活體內破壞微轉移的形成及腫瘤細胞的轉移性移生。因此，ENO1可能在肺癌轉移中扮演重要角色。另外，靶向ENO1的shRNA在原位腫瘤模型中抑制肺癌生長，這表明ENO1也可能參與肺癌惡化。總之，這些發現證實ENO1可作為肺癌的治療標靶。

在此研究中，吾人揭示ENO1何以參與致癌作用的一些新穎特徵。儘管先前若干研究示出ENO1可調控血管內及細胞周圍的纖維蛋白溶解活性以促進細胞遷移及癌症轉移 ^6–8，但尚不清楚詳細的訊息傳遞機轉。在此研究中，吾人示出ENO1和HGFR之間的直接蛋白-蛋白相互作用會刺激HGFR訊息傳遞。另外，先前已知HGFR會誘導GSK3依賴性LRP5/6磷酸化 ⁴⁴，且吾人進一步發現ENO1觸發HGFR活性以活LRP5/6-GSK3β-β-連環蛋白標準Wnt路徑。因此，吾人揭示ENO1藉由Wnt共受體LRP5/6-GSK3β訊息傳遞來調控複雜的Wnt-/β-連環蛋白路徑。另外，吾人發現ENO1和HGFR之間的相互作用觸發HGFR-Src-PI3K-AKT-GSK3β訊息傳遞軸。有趣的是，這兩條路徑(Wnt及AKT)協調穩定β-連環蛋白及SLUG以促進EMT。

經改變的鈣黏蛋白型態為EMT的一個公認特點。E-鈣黏蛋白的丟失代表獲得侵入性的關鍵步驟，而N-鈣黏蛋白的增加表示促侵入表現型；這種「鈣黏蛋白轉換」與許多癌症的不良臨床預後有關 ⁴⁵。在目前的研究中，吾人示出敲低ENO1藉由減少間質基因(N-鈣黏蛋白、波形蛋白及SLUG)及正調控上皮基因E-鈣黏蛋白來抑制間質轉化。這些結果揭示ENO1參與肺癌惡化的先前未描述的分子機轉。已顯示Slug(為一種EMT-TF)在轉錄上抑制E-鈣黏蛋白的表現 ²²並促進各種癌症類型中的癌症侵入及轉移 ^{46 、 47}。先前研究示出，SLUG-E-鈣黏蛋白軸與多種類型的NSCLC的癌症轉移及不良臨床結果相關 ^{46 、 48}，這表明SLUG關鍵性地參與肺癌惡化。事實上，吾人的研究表明敲低SLUG減少肺癌細胞侵入，且其參與ENO1促進的細胞侵入。另外，吾人發現ENO1+及SLUG+組的NSCLC患者具有最差的整體存活期( P= 0.022；圖5D)，這證明ENO1及SLUG在NSCLC結果中的重要作用。

吾人也證明ENO1定位在肺癌細胞的細胞膜，這點是藉由流式細胞術及免疫金測定來證實。這種觀察表明ENO1可能是肺癌中可靶向的治療標靶。接著，吾人產生抗ENO1、chENO1-22的治療性mAb，其經吾人使用而在肺癌異種移植模型中減少腫瘤生長及阻斷腫瘤轉移。chENO1-22的潛在作用機轉為抑制ENO1-HGFR訊息傳遞。由於在此研究中chENO1-22減少腫瘤惡化及轉移性移生，因此這表明此mAb可轉化為臨床應用。 參考文獻：1.       Gatenby, R.A. & Gillies, R.J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nat Rev Cancer 4, 891-899 (2004). 2.       Hsiao, K.C. , et al.Surface alpha-enolase promotes extracellular matrix degradation and tumor metastasis and represents a new therapeutic target. PLoS One 8, e69354 (2013). 3.       Diaz-Ramos, A., Roig-Borrellas, A., Garcia-Melero, A. & Lopez-Alemany, R. alpha-Enolase, a multifunctional protein: its role on pathophysiological situations. J Biomed Biotechnol 2012, 156795 (2012). 4.       Capello, M., Ferri-Borgogno, S., Cappello, P. & Novelli, F. alpha-Enolase: a promising therapeutic and diagnostic tumor target. 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無

當結合附圖閱讀時，將更好理解前面發明內容及下面本發明的詳細描述。為了說明本發明，附圖中示出目前較佳的具體實施例。然而，應理解到本發明不限於所示出的精確配置及手段。

在圖式中：

圖 1A 到圖 1I ： ENO1 在轉移性癌細胞株中高度表現，並與肺癌患者較差的整體存活率相關。(圖1A)使用抗ENO1抗體，藉由西方墨點法在NHBE、NL-20及人類肺癌細胞株中來分析ENO1表現。α-微管蛋白用作內部對照組。(圖1B)使用藻紅素(PE)共軛的山羊抗小鼠IgG，藉由流式細胞術評估嵌合ENO1 mAb(chENO1)或正常人類IgG(NHIgG)與活NHBE、NL-20或CL1-5細胞的結合。X軸：PE螢光強度；Y軸：事件的數目。(圖1C)CL1-5細胞中ENO1的免疫金標記。以4%甲醛固定細胞，並加工用於冷凍切片。以BSA封閉切片，接著以chENO1-22 (40 µg/ml)或NHIgG標記ENO1。固定後，使樣品染色並在穿透式電子顯微鏡上檢查。(圖1D)從TCGA數據庫分析NSCLC腫瘤組織(T)及鄰近的非癌組織(N)中ENO1的mRNA表現。(圖1E)代表性影像示出在肺癌階段的全譜(原始放大倍數，40×；比例尺=200 μm)樣品中的ENO1免疫組織化學染色。(圖1F)免疫組織化學染色數據表示為ENO1陽性染色的面積百分比。每組的中位數由水平線表示。(圖1G)基於來自組織微陣列數據的肺癌患者預後訊息的ENO1蛋白表現的整體存活分析。使用Kaplan-Meier繪圖儀(KM繪圖儀)(圖1H)及TCGA數據庫(I)來分析OS。提供來自網頁的具有95%信賴區間的風險比(HR)及對數秩P值。** P＜0.01且*** P＜0.001。

圖 2A 到圖 2F ：活體外鑑定 ENO1 在肺癌細胞中的分子功能。(圖2A)藉由西方墨點法分析被攜帶對照組shRNA(shLacZ)或ENO1 shRNA(shENO1-1及shENO1-2)的慢病毒感染的CL1-5或CL-141細胞中ENO1的表現。α-微管蛋白用作內部對照組。使用ENO1敲低CL1-5或CL-141細胞(圖2B)及CL1-0細胞(圖2E)進行細胞增殖(WST-1)測定。吸光度值以來自四個獨立實驗的平均值± SEM表示。使用ENO1敲低CL1-5或CL-141細胞(圖2C)及CL1-0細胞(圖2F)進行基質膠侵入測定。計算侵入細胞的數目，且結果以來自三個獨立實驗的平均值± SEM表示。(* P＜ 0.5及*** P＜ 0.001，學生t檢定)(圖2D)以AS2-ENO1-FLAG轉染的CL1-0細胞或空載體中ENO1的表現，使用抗FLAG抗體藉由西方墨點法進行分析。

圖 3A 到圖 3E ： ENO1 敲低抑制小鼠異種移植模型中的腫瘤生長及肺腫瘤轉移。CL1-5-Luci細胞被攜帶對照組shLacZ或shENO1(各自也表現螢光素酶)的慢病毒感染，並移植到NOD-SCID小鼠的肺實質(1 × 10 ⁵細胞)(圖3A及圖3B)或注射到NOD-SCID小鼠的尾靜脈(1 × 10 ⁶細胞)中。(圖3C、圖3D、圖3E)。藉由生物發光成像來監測肺中的腫瘤形成。(圖3E)在從示出在(圖3C)中的小鼠切除的肺的蘇木精及伊紅染色後，計算腫瘤結節的數目。** P＜ 0.05；*** P＜ 0.001。

圖 4A 到圖 4G ： ENO1 藉由調控 SLUG 穩定性來促進 EMT 。(圖4A)被攜帶對照組shLacZ或shENO1的慢病毒感染的CL1-5細胞的形態。(圖4B)在被shLacZ或shENO1感染的CL1-5細胞(左)或被載體或ENO1-FLAG感染的CL1-0細胞(右)中，藉由西方墨點法檢測EMT標記或調控劑的表現。(圖4C)在被shLacZ或shENO1感染的CL1-5細胞中藉由qRT-PCR檢測到EMT標記或調控劑的表現。(圖4D)藉由使用或不使用10 mM MG132(蛋白酶體抑制劑)處理6小時，接著進行西方墨點法，來分析ENO1敲低細胞中這些基因的蛋白表現。(圖4E)被攜帶shLacZ或shENO1的慢病毒感染的CL1-5細胞。轉染後24小時，在細胞收集之前以10mM MG132處理細胞6小時。使用抗SLUG抗體(左圖)及輸入組(右圖)免疫沉澱溶胞產物。以所示抗體進行西方墨點法以檢測蛋白相互作用。(圖4F)SLUG蛋白在被shLacZ或shENO1感染的CL1-5細胞中的穩定性。以100 μg環己醯胺(CHX)在所示間隔處理細胞，並進行西方墨點法分析。(圖4G)所示組中SLUG半衰期的定量。** P＜ 0.05；*** P＜ 0.001。

圖 5A 到圖 5G ： ENO1 經由活化 HGFR-Src-PI3K-AKT 及 Wnt-β- 連環蛋白訊息傳遞來降低 GSK3β 活性而穩定 SLUG 。(圖5A)在使用或不使用2 μM GSK3β抑制劑(BIO)處理24小時後，藉由西方墨點法分析ENO1敲低細胞(shENO1-1)中的蛋白表現。(圖5B)以TOP報導子轉染一組細胞，CMV：海腎螢光素酶；以FOP報導子轉染第二組細胞，CMV：海腎螢光素酶，如圖所示。TOP及FOP報導子如下：驅動螢光素酶的β-連環蛋白反應性「T細胞因子(TCF)元件」(TOP)；及也驅動螢光素酶的非β-連環蛋白反應性突變元件(FOP)。來自這兩個報導子的訊息的比率反映β-連環蛋白特異性標準Wnt訊息傳遞，其中每個報導子標準化為海腎螢光素酶作為內部對照組。72小時後，在ENO1敲低CL1-5細胞或對照組細胞中測量Wnt訊息傳遞。(圖5C)使用共焦免疫螢光測定檢測CL1-5細胞中β-連環蛋白的表現。使用63x物鏡觀察樣品。綠色螢光代表β-連環蛋白，而藍色螢光為DAPI染劑。下圖示出核SLUG的平均強度的定量。(圖5D)對表現所示質體組合的CL1-5細胞進行基質膠侵入測定。(圖5E)NSCLC患者整體存活率的TCGA數據分析(肺腺癌的RNA-序列數據)，該等NSCLC患者具有ENO1低/SLUG低、ENO1高/SLUG低、ENO1低/SLUG高、及ENO1高/SLUG高。患者按照中位數進行分組。(圖5F)在被shLacZ或ENO1 shRNA感染的CL1-5細胞中或以重組ENO1處理30分鐘(1 μg/mL)的ENO1 shRNA細胞中，藉由西方墨點法檢測蛋白濃度。P：磷酸化蛋白濃度，t：總蛋白濃度。(圖5G)使用被shLacZ或ENO1 shRNA感染的CL1-5細胞或以重組ENO1處理30分鐘(1或2 μg/mL)的ENO1 shRNA細胞，進行基質膠侵入測定。計算侵入細胞的數目，且結果以來自三個獨立實驗的平均值± SEM表示。**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001。

圖 6A 到圖 6G ： ENO1 與 HGFR 締合，且為 HGFR 所必需的。(圖6A)以載體或人類HGF刺激被shLacZ或ENO1 shRNA細胞感染的CL1-5細胞10分鐘，接著進行免疫墨點法。(圖6B)GST下拉(pull-down)測定。GST-瓊脂糖珠結合的GST-ENO1或GST蛋白與經純化的His-HGFR一同培養。清洗後，藉由與SDS-PAGE上樣緩衝液一同煮沸來釋放珠結合蛋白及5%輸入的His-HGFR蛋白。接著以抗His或ENO1抗體對樣品進行西方墨點法。(圖6C)從CL1-5細胞提取膜蛋白，並使親和交聯的ENO1的IP與HGFR結合。(圖6D)以FLAG標記的ENO1後，從CL1-5細胞製備免疫沉澱物。以抗ENO1(IP:ENO1)或抗HGFR(IP:HGFR)抗體免疫沉澱溶胞產物，並以抗HGFR及抗ENO1抗體進行墨點法。(圖6E)從CL1-5細胞製備免疫沉澱物。以抗ENO1(IP:ENO1)或抗HGFR(IP:HGFR)抗體免疫沉澱溶胞產物，並以抗HGFR及抗ENO1抗體進行墨點法。(圖6F)上圖：繪製HGFR結構域的示意圖。以抗Myc抗體免疫沉澱不同Myc標記的HGFR構築體或空載體進行72小時，並藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)分離。以抗FLAG或抗Myc抗體探測免疫墨點。(圖6G)以HGFR抑制劑處理被shLacZ或ENO1 shRNA細胞感染的CL1-5細胞24小時，並以hHGF刺激10分鐘，接著進行免疫墨點法。

圖 7A 到圖 7I ： chENO1-22 抗體藉由抑制 ENO1-HGFR 軸媒介的下游訊息傳遞促進 SLUG 蛋白降解，來降低活體外癌細胞增殖及侵入。使用藻紅素(PE)共軛的山羊抗人類IgG，藉由流式細胞術評估抗chENO1-22與被攜帶LacZ或ENO1 shRNA的慢病毒感染的活CL1-5細胞(圖7A)或以AS2-ENO1-FLAG或空載體轉染的CL1-0細胞(圖7B)的結合的定量。(圖6C)使用兩種抗ENO1的小鼠mAb處理的CL1-5細胞進行細胞增殖(WST-1)測定。抗體濃度為10 μg/ml，且在抗體處理後8、24、48或72小時測定OD值。(圖6D)使用以抗ENO1的小鼠mAb處理的CL1-5細胞進行基質膠侵入測定。對侵入細胞進行定量，且結果以三個獨立實驗的平均值± SEM表示(* P＜ 0.05，學生t檢定)。下圖示出基質膠侵入測定中侵入細胞的區域。(圖6E)藉由西方墨點法檢測以NHIgG或chENO1-22處理的CL1-5細胞的蛋白濃度。(圖6F)以NHIgG或chENO1-22處理CL1-5細胞4小時，並以載體或hHGF刺激10分鐘，接著進行西方墨點法。(圖6G)以NHIgG或chENO1-22處理CL1-5細胞4小時，並以抗ENO1(IP:ENO1)或抗HGFR(IP:HGFR)抗體免疫沉澱，接著進行西方墨點法。(圖6H)在細胞收集及隨後的西方墨點法之前，以10 mM MG132及chENO1-22處理CL1-5細胞6小時。(圖6I)Slug蛋白在以NHIgG或chENO1-22處理的CL1-5細胞中的穩定性。以100 μg環己醯胺(CHX)在所示間隔處理細胞，並進行西方墨點法分析。下圖示出所示組中SLUG半衰期的定量。*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001。

圖 8A 到圖 8D ： chENO1-22 抗體減少活體內肺癌細胞轉移。(圖8A)使一百萬個CL1-5-Luci細胞靜脈注射到NOD-SCID小鼠中，且使正常人類IgG對照組或chENO1-22抗體每周靜脈注射兩次，總共注射八次。進行每周生物發光成像以監測靜脈注射的腫瘤細胞的生長(存活天數中位數：對數秩，p = 0.0019)。(圖8B)藉由生物發光成像來監測肺中的腫瘤形成。(圖8C)生成Kaplan-Meier曲線以分析存活率。(圖8D)工作模型描述藉由調控HGFR-Src-PI3K-AKT-GSK3β-SLUG及HGFR-WNT-GSK3β-SLUG軸，ENO1促進細胞侵入。(a)ENO1增加HGFR及Wnt共受體LPR5/6的磷酸化與降低GSK-3β活性，以增強SLUG穩定性及抑制E-鈣黏蛋白表現。最終，癌細胞侵入能力增強。(b)chENO1-22 mAb藉由阻斷ENO1-HGFR軸媒介的下游訊息傳遞來促進SLUG蛋白泛蛋白化及降解，從而抑制癌細胞侵入。

圖 9A 到圖 9D ：藉由融合瘤技術篩選抗 ENO1 mAb 的結合活性及特異性。在活細胞上藉由細胞ELISA(圖9A)及流式細胞術，使用藻紅素(PE)共軛的山羊抗小鼠IgG作為二級抗體，來分析四種抗ENO1 mAb與CL1-5細胞的結合活性(圖9B)。X軸：PE螢光強度；Y軸：事件的數目。使用藻紅素(PE)共軛的山羊抗人類IgG，藉由流式細胞術評估抗chENO1-22與活CL1-5細胞(圖9C)或被攜帶LacZ或ENO1 shRNA的慢病毒感染的CL1-5細胞(圖9D)的結合的定量。

圖 10 ： ENO1 表現與肺癌患者更嚴重的癌症階段有關。免疫組織化學染色數據表示為ENO1陽性染色的強度百分比。根據ENO1染色強度，ENO1表現被分為4個類別中的1個：3：強烈表現；2：中度表現；1：微弱或模糊表現；以及0：無表現。

圖 11 ： LRP5 及 LRP6 對於 ENO1 誘導的 SLUG 及 β- 連環蛋白穩定性是必需的。以載體或hHGF刺激被shLacZ或ENO1 shRNA或LRP5/6 shRNA感染的CL1-5細胞10分鐘，接著進行西方墨點法。

圖 12 ： ChENO1-22 抗體減少活體內肺癌細胞轉移。給小鼠施用10或20 mg/kg的chENO1，並示出經治療小鼠的體重。

圖 13 ：本發明的 chENO1-22 抗體的 V _H 及 V _L 的胺基酸序列。

                         序列表
          <![CDATA[<110>  中央研究院]]>
          <![CDATA[<120>  抗烯醇化酶1(ENO1)抗體及其應用]]>
          <![CDATA[<150>  63/164,137]]>
          <![CDATA[<151>  2021-03-22]]>
          <![CDATA[<160>  16    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
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          <![CDATA[<211>  30]]>
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          Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 
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          <![CDATA[<211>  17]]>
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          <![CDATA[<400>  9]]>
          Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 
          1               5                   10                  15      
          Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Arg Pro Gly Val 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ser Pro Leu Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser 
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  106]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 
                      100                 105     
          

Claims (36)

1. 一種特異性結合烯醇化酶1(ENO1)之抗體或其抗原結合片段，其包含： (a)重鏈可變區(V _H)，其包含含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的重鏈互補決定區1(HC CDR1)、含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的重鏈互補決定區2(HC CDR2)、以及含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈互補決定區3(HC CDR3)；以及 (b)輕鏈可變區(V _L)，其包含含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的輕鏈互補決定區2(LC CDR2)、以及含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的輕鏈互補決定區3(LC CDR3)。
2. 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其中該V _H包含SEQ ID NO: 15的胺基酸序列。
3. 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其中該V _L包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列。
4. 一種重組核酸，其包含編碼如請求項1到3中任一項所定義的抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。
5. 一種宿主細胞，其包含請求項4之重組核酸。
6. 一種組合物，其包含如請求項1到3中任一項所定義的抗體或其抗原結合片段及載體。
7. 一種抑制烯醇化酶1(ENO1)下游訊息傳遞及/或治療與ENO1下游訊息傳遞活化相關的疾病或病症之方法，其包含向有此需要的個體施用有效量的如請求項1到3中任一項所定義的抗體或其抗原結合片段或如請求項4的組合物。
8. 如請求項7之方法，其中該疾病或病症為癌症及其轉移。
9. 如請求項8之方法，其中該癌症選自由以下組成的群組：肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、及睪丸癌。
10. 如請求項9之方法，其中該癌症為肺癌。
11. 如請求項8到10中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段以有效抑制有此需要的該個體中的腫瘤生長及轉移的量施用。
12. 如請求項7到10中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段以有效延長有此需要的該個體的存活時間的量施用。
13. 一種檢測烯醇化酶1(ENO1)之方法，其包含： (i)使如請求項1到3中任一項所定義的抗體或其抗原結合片段與有此需要的個體的細胞接觸；以及 (ii)檢測該抗體或其抗原結合片段與該細胞的結合。
14. 如請求項13之方法，其中該細胞存在於從該個體獲得的生物樣品中，或該細胞存在於該個體中。
15. 如請求項13之方法，其中該個體有患癌症的風險或被懷疑患有癌症。
16. 如請求項13之方法，其中該個體患有癌症。
17. 如請求項16之方法，其進一步包含使該檢測的結果與參考濃度進行比較，並基於該比較的結果判定該個體的預後，其中升高的ENO1濃度表明消極預後。
18. 如請求項17之方法，其中該消極預後選自由以下組成的群組：降低的存活率、增加的腫瘤生長、增加的轉移風險、增加的復發風險、及其任何組合。
19. 如請求項15到18中任一項之方法，其中該癌症選自由以下組成的群組：肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、及睪丸癌。
20. 如請求項19之方法，其中該癌症為肺癌。
21. 一種監測患有癌症的患者中癌症惡化之方法，其包含： (i)在第一時間點提供來自該患者的第一生物樣品； (ii)在第二時間點提供來自該患者的第二生物樣品，該第二時間點晚於該第一時間點； (iii)檢測該第一生物樣品及該第二生物樣品中烯醇化酶1(ENO1)的濃度，其中藉由如請求項1到3中任一項所定義的抗體或其抗原結合片段的免疫測定來進行該檢測；以及 (iv)基於該第一生物樣品及該第二生物樣品中的ENO1濃度來判定該患者的癌症惡化，其中與該第一生物樣品相比，該第二生物樣品中升高的ENO1濃度表明癌症惡化。
22. 如請求項21之方法，其中該癌症選自由以下組成的群組：肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、及睪丸癌。
23. 如請求項22之方法，其中該癌症為肺癌。
24. 一種如請求項1到3中任一項所定義之抗體或其抗原結合片段或如請求項4之組合物，其用於在有此需要的個體中抑制ENO1下游訊息傳遞及/或治療與ENO1下游訊息傳遞活化相關的疾病或病症。
25. 一種如請求項1到3中任一項所定義之抗體或其抗原結合片段或如請求項4之組合物，其用於檢測ENO1、診斷及癌症預後、以及監測癌症惡化。
26. 一種如請求項1到3中任一項所定義之抗體或其抗原結合片段或如請求項4之組合物之用途，其係用於製備藥劑，該藥劑用於抑制ENO1下游訊息傳遞的活化及/或治療與ENO1下游訊息傳遞活化相關的疾病或病症。
27. 如請求項26之用途，其中該疾病或病症為癌症及其轉移。
28. 一種如請求項1到3中任一項所定義之抗體或其抗原結合片段或如請求項4之組合物之用途，其係用於製備試劑盒，該試劑盒用於檢測ENO1、診斷及癌症預後、以及監測癌症惡化。
29. 一種用於進行如請求項13到23中任一項之方法之試劑盒，其包含如請求項1到3中任一項所定義之抗體或其抗原結合片段或如請求項4之組合物，以及使用該試劑盒檢測ENO1的說明書。
30. 一種篩選用於癌症治療的候選藥劑之方法，其包含： (i)將藥劑與在癌細胞的細胞表面上表現ENO1的癌細胞接觸； (ii)檢測該藥劑與在該癌細胞的細胞表面上的ENO1的結合，且較佳進一步測量該癌細胞中一或多個ENO1下游訊息傳遞事件/組分的濃度；以及 (iii)基於該檢測及/或該測量的結果來判定該藥劑是否為候選抗癌藥。
31. 如請求項30之方法，其中顯示該藥劑與在該細胞表面上的ENO1結合的檢測結果表明該藥劑具有抗癌作用。
32. 如請求項30之方法，其中顯示該癌細胞中該一或多個ENO1下游訊息傳遞事件/組分的濃度降低的測量結果表明該藥劑具有抗癌作用。
33. 如請求項30到32中任一項之方法，其中該一或多個ENO1下游訊息傳遞事件/組分包含HGF觸發的HGFR的磷酸化、ENO1和HGFR之間的締合、及/或SLUG穩態蛋白。
34. 如請求項30到33中任一項之方法，其中該抗癌作用包含抑制腫瘤生長及/或轉移。
35. 如請求項30到34中任一項之方法，其中該癌症選自由以下組成的群組：肺癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、及睪丸癌。
36. 如請求項35之方法，其中該癌症為肺癌。

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