KR20120004097A - Ｖｅｇｆｒ―３을 포함하는 허혈질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3)의 신규한 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 VEGFR-3 단백질 또는 유전자를 이용한 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 VEGFR-3는 허혈 손상시 허혈 중심부위(ischemic core)의 뇌 대식세포(brain macrophage)에서 과발현되어 식세포 작용(phagocytosis) 및 세포증식 활성을 촉진시킬 수 있고, 나아가 신경혈관재생(neurovascular remodeling) 및 외부 대식세포를 침윤(infiltrating exogenous macrophage)하는 활성을 통해 허혈 질환을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으므로 허혈질환을 위한 새로운 치료제로 사용될 수 있다.

Description

ＶＥＧＦＲ―３을 포함하는 허혈질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating ischemia compriging vascular endothelial growth factor receptor-3}

본 발명은 VEGFR-3을 포함하는 허혈질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, VEGFR-3 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자들을 함유하는 허혈질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 허혈질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

우리나라 사망 원인 중 2위를 차지하는 질환인 뇌혈관 질환이란 흔히 뇌졸중이라고도 하며, 뇌에 있는 혈관이 막히거나 터져서 발생하는 병으로, 크게 뇌경색과 뇌출혈의 두 가지 유형으로 나눌 수 있다.

뇌경색은 허혈성 뇌혈관 질환이라고도 하며, 뇌혈관이 막혀서 뇌에 혈액과 산소 공급이 되지 못하여 뇌세포가 죽게 되어 발생하는 질환을 의미한다. 상기 뇌출혈은 출혈성 뇌혈관 질환이라고도 하며, 뇌혈관이 터져 피가 흐르고 고여서 뇌 손상이 오는 경우를 의미한다. 이러한 뇌경색이나 뇌출혈로 인해 뇌의 기능을 잃게 되면 외견상 반신마비, 언어 장애 및 의식 장애 등의 신체증상이 나타나기도 하며, 심한 경우에는 사망할 수도 있다.

이 중 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌의 혈류가 감소되어 뇌세포에 산소와 포도당의 공급이 이루어지지 않아 해마 CA1 영역에 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)가 유발되어 발생되는 질환을 의미한다(Kirino, Brain Res., 239, pp57-69(1982); Petito et al., Neurology, 37, pp1281-1286(1987); Pulsinelli et al., Ann. Neurol., 11, pp491-498(1982)). 또한, 허혈성 뇌질환은 뇌졸중이나 심장마비와 같은 병리학적 상황에서 뇌에 혈액이 공급되지 않음으로써 유발되는 것으로 알려져 있다(Nedergaard, Acta. Neurol. Scand., 77, pp81-101(1988); White et al., Neurology, 43, pp1656-1665(1993)). 또한, 허혈성 뇌질환은 혈전증(thrombosis), 색전증(em bolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack) 및 소경색(lacune) 등으로 세분할 수 있다.

또한, 일시적인 뇌허혈 및 재관류(reperfusion)에 의해 발생되는 해마 CA1영역에서의 지연성 신경세포사의 원인은 세포 내로 칼슘의 과다유입(Hara et al., Brain Res. Bull., 29, pp659-665(1992); Nedergaard, Acta Neurol. Scand., 77, pp81-101(1988))이나 프리 라디칼(free radical) 관련 신경세포 손상 및 글루타메이트-수용체 매개 신경세포 손상이라고 알려져 있다(Won et al., Neurosci. Lett., 301, pp139-142(2001)). 즉, 뇌허혈이 발생하면 신경세포의 탈분극이 일어나고, 시냅스의 글루타메이트가 유리되어 세포 외 글루타메이트의 농도가 증가한다. 또한, ATP(Adenosine Triphosphate)의 감소로 인해 발생하는 능동수송의 역전은 세포 외 글루타메이트의 축적을 가속시킨다. 세포 외 글루타메이트의 축적은 NMDA(N-methyl-D-aspartic Acid), AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4 -isoxazole-propionic acid) 및 메타보트로픽 글루타메이트 수용체(metabotropic glutamate receptor)의 연속적인 활성을 유도하여, 칼슘의 세포 내 과다 유입을 초래한다(Olney et al., Science, 244, pp1360-1362(1989)). 칼슘의 세포 내 유입은 특히 칼슘 의존성 프로테아제, 리파제 및 모듈레이터의 활동을 촉발시키고, 결국 프리 라디칼을 포함하는 세포 독성분자가 생성되어 DNA 및 세포막 등의 세포 구조물을 파괴하여 신경세포사가 유발되는 것으로 알려져 있다.

한편, 지금까지 뇌허혈성 질환 치료를 위해 사용되고 있는 치료약으로는 티크로피딘(ticlopidine), 시로스타졸(cilostazole) 및 프로스타시크린(prostacycline)과 같은 혈소판 응집 억제제나 항트롬빈제제가 있다. 그러나 이러한 약제는 종종 두통, 심계항진 및 간에 부담을 주는 등 부작용을 나타내는 단점이 있어 그 사용에 제한이 따른다.

특히 국내의 경우, 뇌허혈에 의한 뇌신경세포 손상의 예방 및 치료에 대한 약효가 입증되지 않았음에도 불구하고, 노화 관련 건강식품인 DHEA 및 멜라토닌(Melatonine)을 남용하기도 한다.

또한, 뇌졸중 치료에는 급성기 치료와 재발 방지를 위한 예방 치료가 있는데, 뇌졸중이 발생한 3시간 이내에 병원에 가서 급성 뇌졸중 치료를 받아야 치료 효과를 볼 수 있으며, 이보다 늦어지면 치료 효과를 보기 힘든 것으로 알려져 있다. 즉, 일단 뇌혈관 질환에 이환되면 비가역적인 신경세포 손상으로 인해, 운동능력 저하, 성적능력 저하, 기억력 감퇴 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, 최근 뇌신경 세포의 재생이 가능하다는 것이 보고되기는 하였으나, 이러한 뇌신경 세포의 재생은 그 조직학적 특성을 고려하면 쉽지만은 않은 문제점이 있다.

또한, 허혈성 뇌질환은 아직도 발병 원인 및 치료 등에 어려움이 존재하고 있으며, 허혈성 뇌 손상에는 다양한 병태 생리학적 기전이 관여하고 있어 이와 같은 허혈성 뇌질환의 특성을 고려하면, 치료보다는 예방이 강조되어야 하며 나아가 허혈질환의 예방 또는 치료 효과가 우수한 새로운 치료제의 발굴이 시급한 실정이다.

따라서 본 발명의 목적은 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 이용한 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 허혈 질환은 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 허혈 질환은 국소뇌허혈 질환일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질은 허혈 손상시 허혈 중심부위(ischemic core)의 대식세포(brain macrophage)에서 과발현되어 식세포 작용(phagocytosis), 세포증식 활성, 신경혈관 재생(neurovascular remodeling) 또는 외부 대식세포의 침윤(infiltrating exogenous macrophage) 활성을 촉진시켜 허헐 손상을 치료하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질은 허혈 손상시 허혈 주변부위(peri-infarct region)의 성상세포(astrocyte)에서 과발현되어 상기 성상세포의 활성을 촉진시켜 허혈 손상을 치료하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은,

(a) VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;

(b) 상기 VEGFR-3 단백질의 양, VEGFR-3 단백질의 활성 또는 VEGFR-3 유전자의 발현양을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, VEGFR-3 단백질의 양, VEGFR-3 단백질의 활성 또는 VEGFR-3 유전자의 발현양이 상기 시료를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 증가되는 경우, 상기 시료는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 VEGFR-3 단백질의 양을 측정하는 것은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 것이고, 상기 VEGFR-3 유전자의 발현양을 측정하는 것은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 허혈 질환은 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 허혈 질환은 국소뇌허혈 질환일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 VEGFR-3는 허혈 손상시 허혈 중심부위(ischemic core)의 뇌 대식세포(brain macrophage)에서 과발현되어 식세포 작용(phagocytosis) 및 세포증식 활성을 촉진시킬 수 있고, 나아가 신경혈관재생(neurovascular remodeling) 및 외부 대식세포를 침윤(infiltrating exogenous macrophage)하는 활성을 통해 허혈 질환을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으므로 허혈질환을 위한 새로운 치료제로 사용될 수 있다.

도 1은 국소뇌허혈이 유도된 쥐의 전뇌에서 VEGFR-3 mRNA 양의 변화를 나타낸 것으로서, 1a는 대조군 쥐에서 VEGFR-3의 발현을 혼성화를 통해 확인한 것이고, 1b 및 1c는 허혈 재관류 후 3일 후의 VEGFR-3 발현을 허혈을 유도한 동측 대뇌 반구 및 허혈을 유도하지 않은 반대측의 대뇌 반구에서 관찰한 것을 나타낸 것이고, 1d는 허혈 중심부 및 주변부에서의 VEGFR-3 발현을 허혈 재관류 후 7일째 관찰한 것을 나타낸 것이며, 1e는 14일째를 관찰한 것이며, 1f 및 1g는 재관류 후 3일, 7일 및 14일째의 VEGFR-3 발현 정도를 RT-PCR을 통해 분석한 것을 나타낸 사진 및 그래프이며, 1h~1k는 상기 1b~1e의 허혈 중심부를 확대하여 나타낸 것이고, 1l~1o는 1b~1e의 주변부를 확대하여 나타낸 것이다.
도 2에서 2a 내지 2e는 허혈 중심부에 있는 뇌 대식세포에서의 VEGFR-3 발현 정도를 VEGFR-3, Iba1 및 ED1으로 삼중 표지한 결과를 나타낸 것이고, 2f 내지 2j는 허혈 손상된 주변부에서의 VEGFR-3 발현 정도를 VEGFR-3, Iba1 및 ED1으로 삼중 표지한 결과를 나타낸 것이며, 2k 및 2l은 Iba1 단일 표지된 세포 및 VEGFR-3와 Iba1로 이중 표지된 세포의 절대 세포수를 허혈 중심부 및 주변부에서 각각 측정한 값을 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3에서 3a 내지 3e는 허혈 재관류 후 3일째 주변부에서 VEGFR-3 발현 정도를 VEGFR-3, GFAP 및 NESTIN으로 삼중 표지한 결과를 나타낸 것이고, 3f 내지 3i는 VEGFR-3의 발현 세포가 GFAP 및 NESTIN에 대해 양성인 맥관구조와의 관련성을 사진으로 나타낸 것이다.
도 4에서 4a 내지 4d는 허혈 재관류 3일째 허혈 중심부에서 뇌 대식세포를 VEGFR-3, Iba1 및 PCNA로 삼중 표지한 결과를 나타낸 것이고, 4e 내지 4h는 VEGFR-3를 발현하는 뇌 대식세포가 혈관과 관련성이 있다는 것을 사진으로 나타낸 것이며, 4i 내지 4l은 VEGFR-3 및 Iba1에 양성인 뇌 대식세포는 대부분 NG2에 양성인 것을 나타낸 것이고, 4m 내지 4p는 VEGFR-3 및 NG2에 양성인 뇌 대식세포가 Ki67에 양성인 것을 나타낸 사진이다.
도 5는 허혈 손상된 주변 부위에서 VEGFR-3이 발현하는 뇌 대식세포의 특징을 나타낸 것으로서, 5a 내지 5d는 허혈 재관류 3일째 VEGFR-3 및 Iba1에 양성인 세포는 PCNA에 양성인 것을 나타낸 것이고, 5e 내지 5h는 VEGFR-3 및 Iba1에 양성인 뇌 대식세포가 NG2에 양성인 것을 나타낸 것이며, 5i 내지 5l은 VEGFR-3 및 NG2에 양성인 뇌 대식세포가 Ki67에 양성인 것을 나타낸 사진이다.
도 6은 산소결핍 유도 후 6시간 및 하루가 경과한 후 해마절편배양에서 VEGFR-3이 발현되는 세포의 형태를 관찰한 사진을 나타낸 것으로서, 6a 내지 6h는 VEGFR-3 및 Iba1으로 이중 표지한 것을 나타낸 것이고, 6i 내지 6n은 VEGFR-3를 GFAP 또는 NeuN으로 이중 표지한 결과를 나타낸 사진이다.

본 발명은 허혈 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 새로운 치료제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

일반적으로 혈관신생은 이미 존재하는 모세혈관 또는 모세관후 세정맥으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정을 말하며, 배란, 배 발생, 상처 치유 및 심근에서 측부 혈관 생성을 포함하는 많은 생리학적 과정의 중요한 구성요소이다. 이러한 혈관신생은 종양의 성장 및 전이, 당뇨성 망막병증 및 황반 변성과 같은 많은 병리 상태에서 중요한 역할을 하며, 많은 경우에 이러한 과정은 다양한 사이토카인 및 성장 인자에 반응하는 기존 혈관 내피 세포의 활성화로 시작한다.

또한, 혈관 내피 세포의 성장인자인 VEGF는 처음에 소포별 세포의 조건화된 매질 및 다양한 세포주로부터 정제되었고, 최근에는 VEGF의 많은 구조적 상동체 및 스플라이싱된 형태들이 보고되고 있다. 이렇게 다양한 형태의 VEGF는 고친화도 리간드로서 VEGF 수용체(VEGFR) 집단에 결합하여 세포내에서 다양한 신호전달에 관여하는데, VEGFR는 타이로신 키나제 수용체로서 혈관신생의 중요한 조절자로 작용한다. 특히, 치료적 혈관형성과 관련된 보고에 의하면, 사지의 허혈증과 심허혈의 동물 모델에서 VEGF같은 혈관형성 인자의 투여는 측부 혈류를 증가시켜서 조직의 손상을 감소시킨다고 보고되어 있어 신생혈관 형성이 신체의 다양한 허혈 질환 지쵸에 중요한 역할을 할 수 있다는 사실로 인식되고 있다.

한편, VEGFR 패밀리는 크게 3가지 주요 아형인 VEGFR-1, VEGFR-2(또는 "KDR"로 일컬음) 및 VEGFR-3로 분류될 수 있는데, 본 발명에서는 허혈 질환의 치료제로서 VEGFR 패밀리 중 VEGFR-3에 관심을 가지게 되었다.

VEGFR-3는 막관통 타이로신 키나제 수용체로서 초기 발생 시에는 내피 세포에서 광범위하게 발현되며(Pajusola K., et al., Cancer Res. 53(16):3845 (1992)), 발생 후기의 VEGFR-3 발현은 림프관 발생을 제한시키기도 한다고 알려져 있다(Kaipainen, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3566-3570,1995). 또한, 성인에 있어서 림프관 내피 및 다수의 고내피 정맥은 VEGFR-3가 발현되며, 발현의 증가는 전이성 림프절 및 림프관종의 림프동에서 일어난다고 알려져 있고, VEGF-C의 골수 조혈 활성을 매개할 수 있는 CD34+ 조혈 세포의 서브세트에서 과발현된다는 내용이 알려져 있다. 이러한 보고들에 의해 VEGFR-3는 태아 혈관계의 발생 및 림프관 신생에 있어서 중요한 역할을 제시하고 있다고 할 수 있다.

반면, 본 발명에서는 VEGFR-3의 과발현이 허혈 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 동물 모델을 대상으로 뇌에 국소적 허혈 손상을 일으킨 후, 허혈 손상을 일으키지 않은 대조군과 비교하여 VEGFR-3의 발현 변화를 조사하였는데, 그 결과, 뇌에서 허혈 손상 중심부 및 주변부 모두에서 VEGFR-3의 발현이 대조군에 비해 증가되는 것으로 나타났다.

보다 구체적으로 동물 모델로서 쥐를 대상으로 국소적허혈을 유도한 후, 허혈을 유도한 부위와 반대쪽 부위(허혈이 유도되지 않은 부위)에서 시간별 VEGFR-3의 발현 변화를 in situ hybridization 방법을 통해 분석한 결과, 허혈 중심부에서는 3일째 및 7일째에 VEGFR-3의 발현이 대조군에 비해 현저하게 증가한 것으로 나타났고, 허혈이 유도된 주변부위에서도 VEGFR-3의 발현이 증가한 것으로 나타났으며, 특히 주변부위에서는 VEGFR-3가 발현된 세포들이 허혈 중심부를 둘러싼 형태인 벨트 유사 경계의 형태로 존재하는 것으로 나타났다(도 1a 내지 1d 참조).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 semiquantitative RT-PCR 방법을 사용하여 국소허혈을 유도한 후, VEGFR-3의 발현 변화를 분석한 결과, 역시 국소적허혈 유도에 따라 VEGFR-3의 발현은 증가하는 것으로 나타났고, 특히 VEGFR-3의 발현 증가는 허혈 유도후 14일째까지 증가하다가 이후부터 감소하는 것으로 나타났다(도 1f 및 1g 참조).

또한, 본 발명자들은 국소적허혈 유도 후, VEGFR-3의 발현이 증가되는 양상을 허혈 중심부(ischemic core) 및 주변부(peri-infarct penumbra zone)을 대상으로 각각 관찰한 결과, 중심부의 경우 둥근 형태를 나타내는 많은 세포들에서 VEGFR-3가 발현되고, 또한 3일째 및 7일째에는 내부에 혈관 유사 구조의 형태가 관찰되었으며(도 1h 내지 1k 참조), 주변부의 경우에도 VEGFR-3의 발현이 증가되는 것으로 나타났으며, 상기 발현은 허혈 유도 후 7일째 가장 많이 발현되는 것으로 나타났다(도 1l 내지 1o 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 허혈이 유된 뇌조직의 경우, VEGFR-3의 발현이 증가된다는 사실을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 뇌허혈과 VEGFR-3의 발현과의 관련성을 보다 구체적으로 확인하기 위해, 쥐를 대상으로 허혈-재관류를 유발시킨 후, 시간별로 신경세포 및 신경교세포(성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia) 및 대식세포(macrophage))에서 VEGFR-3을 발현하는 세포들의 형태를 각각 분석하였다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 허혈이 유도된 중심부에서 VEGFR-3을 발현하는 세포의 형태를 분석하기 위해 세포 특이적인 마커들을 사용하여 이중 또는 삼중 염색법을 수행하였는데, 중심부(ischemic core)의 경우, VEGFR-3가 발현되는 세포들이 대식세포의 마커인 ED1과 미세아교세포 마커인 Iba1에 대해 양성으로 나타났고(도 2a 내지 2e 참조), 주변부의 경우, VEGFR-3는 Iba1에 양성을 보이는 소수의 세포에 위치하고 있는 것으로 나타났다(도 2f 내지 2j 참조).

또한, 허혈 중심부 및 주변부에 대하여 VEGFR-3, GFAP(성상세포의 마커) 및 NESTIN(신경세포 분화 마커)을 이용하여 염색 분석을 수행한 결과, 중심부에서는 VEGFR-3 및 GFAP가 이중 염색된 세포들은 거의 관찰되지 않은 반면, 주변부에서는 VEGFR-3가 발현되는 세포들의 대부분이 GFAP로 표지된 성상세포들이었으며, 이러한 성상세포에서는 모두 신경세포 분화 마커인 네스틴(nestin)이 발현되고 있는 것으로 나타났다(도 3a 내지 3e 참조). 또한, VEGFR-3의 발현은 모세혈관보다 큰 혈관형성과 관련이 있으며, GFAP 및 네스틴이 함께 발현되고 있는 것으로 나타났다(도 3f 내지 3i 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 허혈이 발생되는 경우, 허혈 중심부 및 주변부의 세포에서 VEGFR-3의 발현이 증가되고 VEGFR-3의 발현이 증가된 세포는성상세포의 활성을 통해 신경세포의 분화를 촉진시켜 허혈 손상을 치료 및 개선할 수 있다(Brenneman DE, et. al., Cytokine regulation of neuronal survival. J Neurochem , 1992, 58, 454-460).

본 발명의 다른 일실시예에서는 미세아교세포(microglia), 대식세포(macrophage)에서 VEGFR-3을 발현하는 세포들의 형태를 분석하였는데, 먼저 허혈 중심부의 경우 VEGFR-3 및 Iba1로 이중 표지된 대부분의 세포들은 세포증식 마커인 PCNA에 양성인 것으로 나타났고(도 4a 내지 4d 참조), VEGFR-3을 발현하는 뇌의 대식세포는 혈관과 밀접한 관계가 있는 것으로 나타났다(도 4e 내지 4h 참조). 또한, VEGFR-3 및 NG2와 Iba1 또는 세포증식 마커인 Ki67을 이용한 삼중 염색 결과, NG2와 Iba1로 이중 염색된 세포는 허혈 재관류 후 3일째 및 7일째에 중심부에서 관찰되었으며, 대부분 VEGFR-3를 발현하는 것으로 나타났고(도 4i 내지 4l 참조), VEGFR-3 및 NG2로 이중 염색된 세포들은 중심부에서 Ki67을 공동으로 발현하는 것으로 나타났으며(도 4m 내지 4p 참조), 주변부의 경우에도 VEGFR-3 및 Iba1으로 이중 표지된 세포들이 NG2에 양성인 것으로 나타났고, VEGFR-3 및 NG2로 이중 표지된 세포들의 대부분에서 세포증식 마커인 Ki67이 발현되는 것으로 나타났다(도 5e 내지 5l 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 허혈 손상이 발생되면, 손상된 세포 부위에서 VEGFR-3의 발현이 유도되고 세포 증식 마커들의 발현이 증가된다는 것을 알 수 있었으며, 궁극적으로 허혈 손상된 세포의 증식을 다시 촉진시키는 작용을 통해 허혈로 인한 세포 손상을 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 VEGFR-3를 발현하는 뇌의 대식세포가 국소적허혈 유발 이후 외부의 대식세포를 침윤(infiltrating)하는 작용을 하는지의 여부를 확인함과 동시에 VEGFR-3를 발현하는 뇌의 대식세포의 오리진(origin)을 조사하기 위해, 허혈 손상과 유사한 OGD(oxygen-glucose deprivation)를 유도한 이후 OHC(organotypic hippocampal slice culture:해마절편배양)에서 VEGFR-3을 발현하는 세포의 형태를 관찰하였는데, 이때 상기 OGD에는 미세아교세포(microglia)가 in vivo와 동일한 특성을 유지하며, 침범한 단핵구가 존재하지 않는 특징이 있다.

분석 결과, OGD를 유도하지 않은 배지에서 배양한 쥐 해마 조직의 경우, 모든 시간에 걸쳐 기본적인 VEGFR-3의 발현이 NeuN 면역반응성을 나타내는 CA1 피라미딜 뉴론(pyramidal neuron)에서 검출된 반면, OGD가 유도된지 6시간 후 및 하루가 경과한 경우에는 피라미딜 뉴런은 유의성 있게 감소된 것으로 나타났고, VEGFR-3 및 Iba1의 이중 표지 결과에서는 Iba1 면역반응성 미세아교세포에서 VEGFR-3은 아예 발현되지 않았거나 매우 소량 발현되는 것으로 나타났다.

대신, OGD 유도 1일 이후 CA1 지역에서 VEGFR-3가 GFAP 또는 NeuN으로 이중 염색된 것을 관찰한 결과, VEGFR-3이 발현되는 대부분의 세포에서는 GFAP가 공동 발현되는 것으로 나타났고(도 6i 내지 6k 참조), 일부 표지된 세포에서는 NeuN 면역반응성을 나타내는 뉴런이 지속적으로 존재하는 것으로 나타났다(도 6l 내지 6n 참조).

따라서 상기와 같은 실험 결과들을 통해 본 발명자들은 뇌조직에서 허혈이 유발되는 경우, 뇌 조직에서 VEGFR-3의 발현이 증가된다는 사실을 알 수 있었으며, 특히 허혈 중심부에서는 VEGFR-3가 뇌 대식세포에서 발현된다는 사실 및 주변부에서는 반응성 성상세포에서 VEGFR-3가 발현된다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 대부분의 VEGFR-3가 발현되는 뇌의 대식세포는 NG2에 양성인 것으로 나타났으며, 세포 증식이 활발한 것으로 나타났고, 나아가 허혈 손상이 유발된 in vitro 모델의 경우 내재적인 미세아교 세포에서는 VEGFR-3의 발현 유도가 유의성 있게 증가하지는 않는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질은 허혈 손상시 허혈 중심부위(ischemic core)의 대식세포(brain macrophage)에서 과발현되어 식세포 작용(phagocytosis), 세포증식 활성, 신경혈관 재생(neurovascular remodeling) 또는 외부 대식세포의 침윤(infiltrating exogenous macrophage) 활성을 촉진시켜 허헐 손상을 치료할 수 있는 특징이 있고, 또한, 상기 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질은 허혈 손상시 허혈 주변부위(peri-infarct region)의 성상세포(astrocyte)에서 과발현되어 상기 성상세포의 활성을 촉진시켜 허혈 손상을 치료할 수 있는 특징이 있다.

이로써 본 발명자들은 허혈 손상이 유도된 뇌에서 VEGFR-3가 반응성 성상세포에서 유도될 수 있으며, 유도된 VEGFR-3는 특히 뇌의 대식세포에서 발현됨을 통해 국소적 허혈이 발생하였을 경우, 혈액에 의한 외부의 대식세포를 침윤(infiltrating)할 수 있다는 사실과 신경교 작용을 통해 허혈 손상을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다(Takano T, Oberheim N, Cotrina ML, Nedergaard M. Astrocytes and ischemic injury. Stroke. 2009 Mar;40(3 Suppl):S8-12; Neumann J, Gunzer M, Gutzeit HO, Ullrich O, Reymann KG, Dinkel K.Microglia provide neuroprotection after ischemia. FASEB J. 2006 Apr;20(6):714-6 참조).

따라서 본 발명에 따른 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3)은 허혈 손상 후, VEGFR-3의 과발현에 의해 허혈 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으므로, 본 발명은 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있고, 상기 아미노산은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 “과발현”은 정상조직세포에 비하여, 세포에서 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로의 발현량이 현저하게 증가된 것을 의미한다.

상기 "핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

상기 "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 "프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"단백질"은 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다.

"항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날(단일클론) 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

또한 상기 본 발명에 따른 VEGFR-3을 함유하는 조성물이 치료할 수 있는 질환인 “허혈(ischemia)"은 혈액을 공급하는 혈관의 수축, 폐색 또는 차단에 의해 야기되는, 신체 부위로 혈액의 부적절한 유입 또는 부족을 의미한다. 상기 허혈은 조직 저산소증을 야기한다. "저산소증"은 혈액 또는 조직에서 불충분한 산소 수준을 의미하는데, 예를 들면, 혈관 폐색에 의해 야기되는 혈액 공급의 부족의 결과일 수 있다. 이는 혈전, 임의의 외부 순환 물질에 의한 색전, 또는 동맥경화와 같은 혈관 질환에 의한 혈동맥 또는 정맥의 방해로 일어날 수 있는 것이다.

상기 허혈성 질환은 산소에 대한 타겟 조직 요구량이 공급에 비하여 상대적으로 증가될 때 발생될 수 있다. 혈류에서의 감소는 갑작스럽게 시작되고 짧게 지속될 수 있거나 (급성 허혈증) 또는 느리게 개시되고 길게 지속되거나 또는 빈번하게 나타날 수 있다 (만성 허혈증). 급성 허혈증은 종종, 국소적이고, 비가역적 조직 괴사와 관련되고 (경색), 반면에 만성 허혈증은 통상적으로 일시적 저산소증 손상과 연관이 있다.

즉, 본 발명은 급성, 일시적 또는 만성이든지 간에, 임의의 허혈성 질환과 관련된 의학적 상처를 치료하는 것에 적용되는 방법에 관한 것이다. 허혈 질환은 저산소증 또는 허혈증, 감소된 조직 관혈류 또는 저혈류를 포함하는데, 인급성 허혈성 사건은 수술, 장기 이식, 경색 (예, 뇌, 내장, 심근, 폐 등), 외상, 모욕 또는 상해 등과 관련된 것들을 포함할 수 있다. 허혈증과 연관된 만성적 사건들은 고혈압, 당뇨병,폐색성 동맥 질환, 만성 정맥 부전증, 레이노 병 (Raynaud's disease), 간경변, 선천성 심장 질환, 전신성 경화증 등을 포함할 수 있다. 허혈증과 연관된 다른 질병 또는 질환들은 상처 치유, 위내장 병변, 자가면역 질환 및 신경변성 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특수 조건의 예는, 상처 치유, 허혈성 발작, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관 질환, 신장 동맥 질환, 위내장 병변,화상, 피부 이식, 혈관 이식물, 장기 재생(예, 생체 외 및 생체 내), 골 회복 질환, 간질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 재생 질환, 및 평활근 세포 질환을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게 상기 허혈 질환은 국소뇌허혈일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 VEGFR-3 단백질 또는 VEGFR-3 유전자가 세포 내에서 발현될 수 있도록 VEGFR-3 유전자를 함유하는 발현 벡터를 유효성분으로 포함할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 VEGFR-3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 SOCS6와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 VEGFR-3의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 VEGFR-3의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 VEGFR-3의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 VEGFR-3의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른　단백질과　융합으로　만들어진　융합단백질　등이 이에 포함될 수 있다. 본 발명에서 VEGFR-3 단백질은 DNA 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있으며 이를 위하여 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로 VEGFR-3 단백질은 상기 VEGFR-3 유전자를 사용하여 세균, 효모, 식물 세포주 및 동물 세포주 내에서 재조합 방식으로 주입하는 유전공학 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물에 포함되는 발현벡터는 상기 VEGFR-3 유전자가 삽입된 발현벡터를 말하며 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다.

본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또한, 본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 VEGFR-3 단백질 또는 VEGFR-3 유전자를 포함하는 발현벡터를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 허혈질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 허혈질환의 "치료" 또는 "치료요법" 은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 허혈질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 허혈질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 허혈질환의 증상을 경감시킴.

(4) 허혈질환의 재발을 예방함, 및

상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

나아가 본 발명은 상기와 같이 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 뿐만 아니라 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은 (a) VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 VEGFR-3 단백질의 양, VEGFR-3 단백질의 활성 또는 VEGFR-3 유전자의 발현양을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, VEGFR-3 단백질의 양, VEGFR-3 단백질의 활성 또는 VEGFR-3 유전자의 발현양이 상기 시료를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 증가되는 경우, 상기 시료는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 먼저 VEGFR-3 유전자 또는 단백질을 포함하는 허혈 질환 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 VEGFR-3 유전자의 발현양, VEGFR-3 단백질의 양 또는 VEGFR-3 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다.

상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드 또는 천연 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 VEGFR-3 유전자의 발현양, VEGFR-3 단백질의 양 또는 VEGFR-3 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, VEGFR-3 유전자의 발현양, VEGFR-3 단백질의 양 또는 VEGFR-3 단백질의 활성이 증가되는 것이 측정되면 상기 시료는 허혈질환을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.

상기에서 VEGFR-3 유전자의 발현양, VEGFR-3 단백질의 양 또는 VEGFR-3 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.

상기에서 VEGFR-3 단백질의 양을 측정하는 것은 VEGFR-3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용할 수 있으며, VEGFR-3 유전자의 발현양을 측정하는 것은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 바람직하게는 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

국소뇌허혈 이후의 VEGFR -3의 발현 양상 분석

<1-1> 동물 모델 준비

모든 실험적 동물 과정은 한국 카톨릭 대학의 가톨릭 윤리 위원회(Catholic Ethics Committee)로부터 승인을 받고(CUMC09U029), 미국 NIH(National Institutes of Health) 가이드 및 실험 동물 사용(NIH Publication No. 80-23, revised 1996)에 따라 수행하였다. 실험에는 성인 수컷 백서(Sprague Dawley rat)(250-300 g)를 이용하였고, Longa에 의해 공지된 intraluminal thread 방법으로 일시적 국소허혈을 유도하였다. 즉, 오른쪽 외부 경동맥을 4-0 실크 봉합선으로 봉합시키고, 3-0 원형 팁 나일론 봉합선을 오른쪽 경동맥내로 주입시켰다. 이후, 상기 봉합선은 내부 경동맥으로 진전시켜 중대뇌동맥을 폐색시켰다. 60분 후, 경동맥으로부터 수술 봉합선을 제거하여 폐색을 재관류시켰다. 또한, 사용한 동물 모델들은 허열을 유발시키는 과정 동안 가열 램프를 사용하여 체온이 37.5± 0.3℃가 되도록 유지시켰다. 대조군으로는 폐색을 유도하지 않은 것을 제외하고는 상기와 같이 동일하게 쉠-처리 쥐(Sham-operated rats)를 사용하였다. 또한, 60분 동안 지속적인 허혈 과정 결과 오른쪽 중대뇌동맥의 영역은 경색이 크게 일어난 반면, 왼쪽 중대뇌동맥 영역은 허혈 손상이 일어나지 않았다. 재관류 후 1, 3, 7, 및 14일 동안 살려둔 후, 각각의 시점에서 상기 쥐들을(7마리:실험군 3마리:대조군) 16.9%의 우레탄으로 마취시키고, 4% 파라포름알데히드를 함유하는 고정액으로 경심관류 고정(transcardial perfusion)에 의해 치사시켰다. 또한 상기 치사된 쥐에서 허혈 손상된 오른쪽 반구체와 손상되지 않은 왼쪽 반구체는 각각 분리시키고, 액체 질소에 즉시 얼렸으며, 이러한 뇌 샘플들은 -70℃의 온도에 보관하여 이후 실험에 사용하였다.

<1-2> semi - quantitative RT - PCR

상기 실시예 <1-1>에서 준비된 쥐 모델로부터 수득한 뇌 샘플들을 대상으로 각 뇌 조직에서의 VEGFR-3의 발현 양을 확인하기 위해 semi-quantitative RT-PCR 방법을 수행하였는데, 즉, 상기 허혈이 유도된 쥐의 뇌 반구체 및 대조군의 뇌 반구체로부터 트리졸 시약(인비트로젠, CA, USA)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 이후, 역전사 M-MLV(다카라 코리아사)을 이용하여 상기 시약의 제조업체에서 공지한 방법에 따라 일차 cDNA를 합성하였고, 이후 상기 역전사 합성물 1ul를 Perfect Premix Version 2.1(Ex Taq version)을 이용하여 PCR 증폭하였다. 이때, 프라이머로는 서열번호 2로 표시되는 VEGFR-3의 유전자(Genebank:NM_053652.1의 1222~1763 뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는)를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 서열번호 3(센스 프라이머:5’-ctgaggcagaatatcagtctggag-3‘) 및 4(안티센스 프라이머:5’-agatgctcatacgtgtagttgtcc-3‘)의 프라이머를 각각 사용하여 수행하였으며, PCR 조건은 94℃에서 4분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 반응을 30회 반복 수행하였고, 72℃에서 10분간 연장반응을 수행하였다. 이후 각각의 PCR 산물 중 10ul를 1.5%의 아가로즈겔 상에서 전기영동 시켰다. 또한, 이때 semi-quantitative 측정을 위해 GAPDH의 mRNA 발현양을 기준으로 VEGFR-3의 mRNA를 정량분석 하였으며, Et-Br로 염색된 아가로즈 겔 상에서 광학 밀도 측정으로 VEGFR-3/GAPDH의 비율을 계산하여 VEGFR-3의 발현양, 즉 VEGFR-3의 mRNA 양을 분석하였다.

<1-3> in situ hybridization histochemistry

본 발명자들은 상기 RT-PCR 방법 이외에도 면역조직 화학염색 방법을 통해 상기 <1-1>의 쥐 모델로부터 수득한 뇌 샘플들에서 VEGFR-3의 발현을 조사하기 위해 다음과 같이 in situ hybridization histochemistry 방법을 수행하였다. 즉, 상기 <1-2>에서 사용한 서열번호 3 및 4의 프라이머에 DIG(digoxigenin)을 표시시켰다(Shin et al., 2008). 그런 뒤, coronal cytostat 절편(25um 두께)을 혼성용액으로 희석(150ng/ml)시킨 센스 및 안티센스 프라이머로 18시간 동안 52℃에서 혼성화 시켰고, 기질로서 4-니트로블루 테트라졸리움 클로라이드(0.35mg/ml) 및 5-qmfhah-4-클로로-3-인돌일포스페이트(0.18mg/ml)를 이용하여 알칼라인 포스파타제-겹합된 양의 항-DIG 항체(로체, 독일)로 가시화 하였다. 이후 상기 조직 샘플들은 현미경으로 관찰하였고, 디지털 카메라로 사진현상 하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 가짜 수술을 수행한 대조군 쥐의 경우, VEGFR-3의 발현은 대뇌 피질 뉴론, 특히 피질의 깊은 층에서 발현되고 있는 것으로 나타났고, 선조 신경원(striatal neurons)에서는 약하게 발현되는 것으로 나타났다(도 1 a 참조). 또한 대조군 쥐의 경우 상기 조직과 근접한 조직에서 VEGFR-3에 특이적인 프라이머를 이용한 혼성화 분석 결과, 세포내에서 상기 프라이머로 표지된 형광이 나타나지 않았다.

반면, 허혈을 유도된 쥐의 전뇌(forebrain)에서 VEGFR-3의 발현 정도는 허혈 손상 후 시간이 경과할수록 허혈이 유도되지 않은 반대측(contralateral region)에 비해 허혈 중심부(ischemic core)에서 VEGFR-3의 발현양이 증가하는 것으로 나타났으며(도1 b:허혈 유도 후 3일째, 도 1d는 허혈 유도 후 7일째), VEGFR-3가 발현되는 세포들의 경우 허혈 중심부를 감싸는 벨트형 경계가 존재하는 뇌경색 주변부에서 특히 발현양이 증가하는 것으로 나타났고, 허혈 손상 유도 후 3일째 및 7일째 발현양이 가장 많은 것으로 나타났다. 14일째에는 발현 정도가 재관류 후 7일째와 유사한 것으로 나타난 반면, 발현양은 허혈 중심(ischemic core)부 및 경계부에서 모두 감소하는 것으로 나타났다(도 1e 참조).

또한, 허혈이 유도된 뇌의 반구체 및 대조군 뇌(허혈 유도하지 않은)의 반구체로부터 수득한 RNA를 대상으로 semi-quantitative RT-PCR을 수행한 결과, 허혈이 유도되지 않은 군에 비해 허혈이 유도된 군의 경우 VEGFR-3가 더 많이 발현되어 있는 것으로 나타났고, 특히 허혈 유도 후 3일 및 7일째에 VEGFR-3의 발현이 현저히 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 1f 및 1g 참조).

나아가, 허혈 중심부에서의 VEGFR-3 발현 정도를 분석한 결과, 허혈손상을 유도한 경우, 허혈 중심부(ischemic core)에서는 VEGFR-3가 발현되어 구형의 형태를 갖는 세포들이 많이 관찰되었고, 재관류 후 3일째 및 7일째에는 혈관과 같은 구조를 관찰할 수 있었다(도 1h 및 1j 참조). 한편, 14일째는 VEGFR-3의 발현 정도가 대조군에 비해 증가된 것으로 나타났으나, 허혈 유도 후 7일째에 비해서는 감소된 것으로 나타났다(도 1k 참조).

반면, 주변 경계 영역에서 VEGFR-3의 발현정도는 허혈 유도 후 재관류 3일(도 1l 참조) 및 7일째(도 1n 참조)에 그 발현 정도가 허혈 손상이 유도되지 않은 반구체(도 1m 참조)에 비해 증가되는 것으로 나타났고, 특히 재관류 7일째에 가장 많은 양이 발현되는 것으로 나타났다(도 1o 참조).

< 실시예 2>

국소뇌허혈 이후 아교세포에서의 VEGFR -3의 발현 양상 분석

본 발명자들은 뇌허혈 손상 중심부에서 VEGFR-3를 발현하는 세포의 형태를 관찰하기 위해 세포 특이적인 마커를 사용하여 이중 및 삼중 표지 실험을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 <1-3>에 따른 방법으로 혼성화 실험에 사용한 조직 샘플들을 상온에서 바이오틴-결합된 마우스 단일클론 항-DIG 항체(jackson immunoresearch, USA)로 2시간 동안 반응시켰다. 이중 및 삼중 면역형광 조직화학 분석을 위해 상기 절편들은 4℃에서 다음과 같은 항체들과 밤새도록 반응시켰다; 즉, 상기 항체들은 polyclonal rabbit anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA; dilution 1:1500), monoclonal mouse anti-nestin(Biogenesis, Poole, UK; dilution 1:500), polyclonal rabbit anti-ionized calcium-binding adaptor molecule 1(Iba1 Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan; dilution 1:500), monoclonal mouse anti-ED1(Serotec; Oxford, UK; dilution 1:100), monoclonal mouse anti-NG2 chondroitin sulfate proteoglycan(NG2; Chemicon International Inc. dilution 1:500), polyclonal rabbit anti-NG2(Chemicon International Inc.; dilution 1:500), polyclonal rabbit anti-laminin(SIGMA, St. Louis, MO, USA dilution 1:100), monoclonal mouse anti-proliferating cellular nuclear antigen(PCNA; Dako, CA, USA; dilution 1:100) 및 polyclonal rabbit anti-Ki67 (Novocastra laboratories Ltd., UK; dilution 1:1000)을 사용하였다.　또한 상기 항체 염색은 다음과 같은 2차 항제들을 사용하여 가시화 하였다: Cy3-conjugated streptavidin (Jackson ImmunoResearch dilution 1:1500), FITC-conjugated anti-mouse antibody (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:50), FITC-conjugated anti-rabbit antibody (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:50) Cy5-conjugated anti-rabbit antibody (Jackson ImmunoResarch; dilution 1:500) 및 Cy5-conjugated anti-mouse antibody (Jackson ImmunoResearch; dilution 1:500)을 사용하였다. 이때 대조군으로는 상기 일차 항체를 반응 용액에서 제거시킨 후 사용하였으며, 각 조직내 세포에서의 핵산 염색은 DAPI(4′,6-diamidino-2′-phenyindole; Roche; dilution 1:1000)로 10분간 반응시켰다. 이후 각 절편들은 4개의 레이저((Diode 405, Argon 488, HeNe 543, HeNe 633)가 구비된 공초첨 현미경((LSM 510 Meta; Carl Zeiss Co., Ltd., Germany)DMF 통해 관찰하였고, Tiff 파일명으로 이미지를 저장하였다.

이중 및 삼중 표지 염색에 따른 분석 결과, 허혈 손상 중심부위 및 주변 부위에서 VEGFR-3를 발현하는 뇌 대식세포의 경우, 허혈 손상 후 3일째 및 7일째에 VEGFR-3를 발현하는 뇌 대식세포가 허혈 손상 중심부위에서 가장 많은 것으로 나타난 반면, 14일째에는 점점 감소하는 것으로 나타났다(도 2a 내지 2e 참조). 반면, 주변 부위를 관찰한 결과, VEGFR-3의 발현은 소수의 세포(IBA1+) 부위에서 관찰되었으며, 대부분의 세포들은 VEGFR-3의 발현이 관찰되지 않았다(도 2f 내지 2j 참조).

또한, 본 발명자들은 일시적으로 VEGFR-3를 발현하는 미세아교세포(microglia) 또는 대식세포와 CNS 아교세포 또는 대식세포와의 관계를 확인하기 위해 중심부위 및 주변부위에서의 모든 Iba 1 면역반응 세포간에 VEGFR-3/Iba 1으로 이중염색된 세포의 수를 정량분석 하였는데, 그 결과, 재관류 3일째에 중심부위에서는 평균적으로 85%의 Iba 1 표지된 세포가 VEGFR-3를 발현하는 것으로 나타났고, 주변 부위에서는 39%가 발현하는 것으로 나타났다(도 2k 참조). 또한, 재관류 7일째에는 중심부위 및 주변부위에서 각각 92% 및 45%의 Iba 1 표지된 세포가 VEGFR-3를 발현하는 것으로 나타났다(도 2l 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 주변 부위에서 보다 제약적인 분포를 갖는 중심 부위에 있는 뇌의 모든 대식세포에서 VEGFR-3가 유도된다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 허혈 손상의 주변 부위에 있는 VEGFR-3을 발현하는 세포의 경우, VEGFR-3, GFAP 및 NESTIN으로 삼중 염색한 결과, 허혈 손상된 쥐의 주변 영역에서 VEGFR-3을 발현하는 주된 세포가 GFAP-면역 반응성 성상세포인 것으로 나타났고, 상기 성상세포는 모두 NESTIN을 발현하는 것으로 나타났다(도 3a~3e 참조). 또한, VEGFR-3의 발현은 혈관 프로파일과 관련성이 있는 것으로 나타났고, GFAP 및 NESTIN과 공동 발현되고 있다는 사실을 알 수 있었다(도 3f~3i 참조).

나아가 본 발명자들은 허혈뇌에서 VEGFR-3를 발현하는 활성화된 아교세포 또는 대식세포의 특성을 분석하기 위해, VEGFR-3 및 앞서 기술한 특정 세포 마커들과의 공동 표지 실험을 통해 허혈 중심부위 및 주변부위에서 VEGFR-3를 발현하는 아교세포 또는 대식세포를 비교하였다.

그 결과, 허혈 중심부위의 경우, VEGFR-3과 Iba 1이 이중 표지된 대부분의 세포가 세포 증식 마커인 PCNA에 대해 양성인 것으로 나타났고(도 4a 내지 4d), VEGFR-3을 발현하는 뇌 대식세포는 혈관과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다(도 4e 내지 4h 참조).

한편, Matsumoto 등에 의해 보고된 바에 의하면 희돌기아교세포(oligodendrocyte) 전구세포의 마커인 Iba 1 및 NG2를 발현하는 대식세포형의 세포가 일시적인 MCA 폐색 후 쥐 뇌의 허혈 중심부위에 축적되어 있다고 알려진 바 있으며, 이러한 세포는 세포 증식이 좋다는 특징이 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 VEGFR-3를 발현하는 세포가 이와 유사한 특징이 있는 것으로 판단히였고, 이러한 이러한 점에 비추어 본 발명자들은 VEGFR-3, NG2 및 Iba 1 또는 Ki67(세포 증식 마커)을 사용하여 삼중 표지 염색을 수행하였는데, 그 결과, Iba 1 및 NG2로 이중 표지된 둥근형태의 세포는 허혈 중심부에서 재관류 후 3일째 및 7일째에 관찰되었고, 대부분은 VEGFR-3를 발현하는 것으로 나타났다(도 4i 내지 4l 참조). 또한, 허혈 중심부에서 대부분 VEGFR-3 및 NG2로 이중 표지된 세포는 Ki67을 공동으로 발현하는 것으로 나타났다(도 4m 내지 4p 참조). 반면, Iba 1 양성 아교세포에 덧붙여, NG2 면역반응성 또한 세포내에서 혈관주위 세포의 형태적 특징을 나타내는 혈관과 관련성이 있는 것으로 관찰되었는데, 즉, NG2는 혈관주위 세포에서 발현되고 있는 것으로 나타났고, VEGFR-3 및 Iba 1은 음성인 것으로 나타났다(도 4i 내지 4l 참조).

나아가 주변부위(peri infarct zone)에서 VEGFR-3 및 Iba 1으로 이중 표지된 세포의 경우 PCNA에 대해서 양성인 것으로 나타났고(도 5a 내지 5d), 또한, NG2에도 양성인 것으로 나타났으며, 대부분의 VEGFR-3 및 NG2로 이중 표지된 세포의 경우 Ki67이 발현되고 있는 것으로 나타났다(도 5i 내지 5l 참조).

< 실시예 3>

OGD 이후 OHC 에서 VEGFR -3를 발현하는 세포 및 아교세포와의 관련성 분석

해마 슬라이스 배양액을 Stoppini 등에 의해 개시된 방법에 따라 제조하였는데, 즉, 슬라이스 배양액은 먼저 7일된 Sprague Dawley 쥐의 pups를 이용하였는데, 상기 쥐를 4%의 chloral hydrate로 마취시킨 다음 단두시켰다. 이후, 해마를 분리하였고, McIlwain 조직 chopper를 사용하여 400um의 황단 분할로 잘랐다. 이후, 해마 슬라이스들은 50% 최소필수배지(Gibco-invitrogen, USA), 25% horse serum, 6.5mg/ml의 글루코스 및 HEPES(pH 7.15)가 함유된 25% Eagle's balanced 염 용액으로 이루어진 배지를 포함하는 6-웰 플레이트에 있는 0.4um의 기공크기를 갖는 멸균된 Millcell 막위에 올려놓았다. 이후, 37℃의 온도 및 5%의 이산화탄소가 있는 조건하에 유지시켰고, 일주일에 두 번씩 배지를 교체하였다. 해마 슬라이스들은 손상된 세포막을 갖는 세포에서 DNA를 염색할 수 있는 형광시료 및 propidium iodide(PI)로 염색하였다. 또한 이때 상기 시료로 염색하기 전에 PI는 상기 배지에 0.5ug/ml의 농도로 24시간 첨가하였고, PI 음성 슬라이스들은 형광현미경을 이용하여 세포들을 관찰하였다.

또한, 하혈 손상된 동물 모델의 제작을 위해 OGD(oxygen-glucose deprivation)를 유발시키는 과정은 Laake 등(1999) 및 Zhong 등(2003)에 의해 공지된 방법에 따라 혈청이 없는 배지, 즉 글루코스가 없는 DMEM 배지에 2mM L-글루카민이 첨가된 배지를 이용하여 수행하였다. 상기 배지는 95% N2 및 5% 이산화탄소를 함유하는 기체를 갖는 습한 저장성 챔버에서 1시간 동안 37℃의 온도로 포화시켰고, 10일 배양 후, 해마 슬라이드들은 40분 동안 상기 저장성 챔버 내에서 혈청이 없는 배지 상에서 배양하였다. 이때 대조군으로는 글루코스가 첨가된 배지 및 대기압하의 조건을 제외하고는 상기와 동일한 실험과정을 수행하였다. 상기 방법으로 OGD가 유도된 슬라이스들은 다시 대기압하 및 정상의 배양 배지에서 배양시켜 회복시켰다. 이후, 신경원 손상을 조사하기 위해, 상기 회복 조건의 마지막 2시간 동안 상기 배지에 5ug/ml의 농도로 PI를 첨가하였으며, 이후 해마 슬라이스들은 0.1M 인산 버퍼(pH 7.4)에 용해된 4%의 파라포름알데히드로 4℃에서 4시간 동안 고정시켰고, 상기 기술된 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 혼성화시켰다. 혼성화 후, 일부 슬라이스들은 4℃에서 밤새도록 바이오틴 결합된 마우스 단일클론 항-dig 항체(jackson immunoresearch)로 반응시켰고, 이중 면역형광 조직화학법을 상기 기술된 방법과 동일하게 수행하였다.

그 결과, OGD를 유도하지 않은 정상 상태로 쥐의 해마 조직을 배양한 결과, VEGFR-3은 발현되는 것으로 나타난 반면, OGD를 유도한 후, 6시간 후 및 하루가 경과한 경우에는 VEGFR-3의 발현이 감소된 것으로 나타났으며(도 6a 내지 6h 참조), 특히 VEGFR-3 및 Iba1의 이중 표지 결과에서는 Iba1 면역반응성 아교세포에서 VEGFR-3이 아예 발현되지 않았거나 매우 소량 발현되는 것으로 나타났다. 또한, VEGFR-3이 CA1 부분에서 GFAP 또는 NeuN과 이중 표지시켰을 경우, OGD 유도 1일 이후에는 VEGFR-3이 발현되는 대부분의 세포에서 GFAP가 공동 발현되는 것으로 나타났고(도 6i 내지 6k 참조), 일부 표지된 세포에서는 NeuN 면역반응성을 나타내는 뉴런이 지속적으로 존재하는 것으로 나타났다(도 6l 내지 6n 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Composition for preventing or treating ischemia compriging vascular endothelial growth factor receptor-3 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1363 <212> PRT <213> VEGFR-3 amino acid sequence <400> 1 Met Gln Pro Gly Ala Ala Leu Asn Leu Arg Leu Trp Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gln Gly Leu Ala Asn Gly Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu 20 25 30 Asn Ile Thr Glu Asp Ser Tyr Val Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser 35 40 45 Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro Leu Glu Trp Thr Trp Pro Gly Ala 50 55 60 Gln Glu Val Leu Thr Thr Gly Gly Lys Asp Ser Glu Asp Thr Arg Val 65 70 75 80 Val His Asp Cys Glu Gly Thr Glu Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu 85 90 95 Leu Leu Ala Gln Thr His Ala Asn Asn Thr Gly Ser Tyr His Cys Tyr 100 105 110 Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Thr 115 120 125 Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Lys His Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp 130 135 140 Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp Ser Met Trp Val Pro Cys Leu Val 145 150 155 160 Ser Ile Pro Gly Leu Asn Ile Thr Leu Arg Ser Gln Ser Ser Ala Leu 165 170 175 His Pro Asp Gly Gln Glu Val Leu Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Arg 180 185 190 Val Pro Thr Gln Leu Leu Arg Asp Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr 195 200 205 Thr Trp Gly Asp Gln Asn Phe Leu Ser Asn Leu Phe Val Val His Ile 210 215 220 Thr Gly Asn Glu Leu Tyr Asp Ile Gln Leu Tyr Pro Lys Lys Ser Met 225 230 235 240 Glu Leu Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Val Trp Ala 245 250 255 Glu Phe Asp Ser Gly Val Thr Phe Asp Trp Asp Tyr Pro Gly Lys Gln 260 265 270 Ala Glu Arg Ala Lys Trp Val Pro Glu Arg Arg Ser Gln Gln Thr His 275 280 285 Thr Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Ile His Asn Val Ser Gln Asn Asp 290 295 300 Leu Gly Pro Tyr Val Cys Glu Ala Asn Asn Gly Ile Gln Arg Phe Arg 305 310 315 320 Glu Ser Thr Glu Val Ile Val His Glu Lys Pro Phe Ile Ser Val Glu 325 330 335 Trp Leu Lys Gly Pro Val Leu Glu Ala Thr Ala Gly Asp Glu Leu Val 340 345 350 Lys Leu Pro Val Lys Leu Ala Ala Tyr Pro Pro Pro Glu Phe Gln Trp 355 360 365 Tyr Lys Asp Arg Lys Ala Val Thr Gly Arg His Asn Pro His Ala Leu 370 375 380 Val Leu Lys Glu Val Thr Glu Ala Ser Ala Gly Val Tyr Thr Leu Ala 385 390 395 400 Leu Trp Asn Ser Ala Ala Gly Leu Arg Gln Asn Ile Ser Leu Glu Leu 405 410 415 Val Val Asn Val Pro Pro His Ile His Glu Lys Glu Ala Ser Ser Pro 420 425 430 Ser Ile Tyr Ser Arg His Ser Arg Gln Thr Leu Thr Cys Thr Ala Tyr 435 440 445 Gly Val Pro Gln Pro Leu Ser Val Gln Trp His Trp Arg Pro Trp Thr 450 455 460 Pro Cys Lys Thr Phe Ala Gln Arg Ser Leu Arg Arg Arg Gln Gln Arg 465 470 475 480 Asp Gly Met Pro Gln Cys Arg Asp Trp Lys Glu Val Thr Thr Gln Asp 485 490 495 Ala Val Asn Pro Ile Glu Ser Leu Asp Ser Trp Thr Glu Phe Val Glu 500 505 510 Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser Lys Leu Val Ile Gln Asp Ala Asn Val 515 520 525 Ser Ala Met Tyr Lys Cys Val Val Val Asn Lys Val Gly Gln Asp Glu 530 535 540 Arg Leu Ile Tyr Phe Tyr Val Thr Thr Ile Pro Asp Gly Phe Ser Ile 545 550 555 560 Glu Ser Glu Pro Ser Glu Asp Pro Leu Glu Gly Gln Ser Val Arg Leu 565 570 575 Ser Cys Arg Ala Asp Asn Tyr Thr Tyr Glu His Leu Arg Trp Tyr Arg 580 585 590 Leu Asn Leu Ser Thr Leu His Asp Ala Gln Gly Asn Pro Leu Leu Leu 595 600 605 Asp Cys Lys Asn Val His Leu Phe Ala Thr Pro Leu Glu Ala Asn Leu 610 615 620 Glu Glu Ala Glu Pro Gly Ala Arg His Ala Thr Leu Ser Leu Asn Ile 625 630 635 640 Pro Arg Val Ala Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Val Cys Glu Val Gln 645 650 655 Asp Arg Arg Ser Gln Asp Lys His Cys His Lys Lys Tyr Leu Ser Val 660 665 670 Gln Ala Leu Glu Ala Pro Arg Leu Thr Gln Asn Leu Thr Asp Leu Leu 675 680 685 Val Asn Val Ser Asp Ser Leu Glu Met Arg Cys Pro Val Ala Gly Ala 690 695 700 His Val Pro Ser Ile Val Trp Tyr Lys Asp Glu Arg Leu Leu Glu Lys 705 710 715 720 Glu Ser Gly Ile Asp Leu Ala Asp Ser Asn Gln Arg Leu Ser Ile Gln 725 730 735 Arg Val Arg Glu Glu Asp Ala Gly Arg Tyr Leu Cys Ser Val Cys Asn 740 745 750 Ala Lys Gly Cys Val Asn Ser Ser Ala Ser Val Ala Val Glu Gly Ser 755 760 765 Glu Asp Lys Gly Ser Met Glu Ile Val Ile Leu Ile Gly Thr Gly Val 770 775 780 Ile Ala Val Phe Phe Trp Val Leu Leu Leu Leu Ile Phe Cys Asn Met 785 790 795 800 Lys Arg Pro Ala His Ala Asp Ile Lys Thr Gly Tyr Leu Ser Ile Ile 805 810 815 Met Asp Pro Gly Glu Val Pro Leu Glu Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Ser 820 825 830 Tyr Asp Ala Ser Gln Trp Glu Phe Pro Arg Glu Arg Leu His Leu Gly 835 840 845 Arg Val Leu Gly His Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Ser Ala 850 855 860 Phe Gly Ile Asn Lys Gly Ser Ser Cys Asp Thr Val Ala Val Lys Met 865 870 875 880 Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu His Arg Ala Leu Met Ser Glu 885 890 895 Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly Asn His Leu Asn Val Val Asn Leu 900 905 910 Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Asn Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu 915 920 925 Phe Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Phe Leu Arg Val Lys Arg Asp 930 935 940 Thr Phe Asn Pro Tyr Ala Glu Lys Ser Pro Glu Gln Arg Arg Arg Phe 945 950 955 960 Arg Ala Met Val Glu Gly Ala Lys Ala Asp Arg Arg Arg Pro Gly Ser 965 970 975 Ser Asp Arg Ala Leu Phe Thr Arg Phe Leu Met Gly Lys Gly Ser Ala 980 985 990 Arg Arg Ala Pro Leu Val Gln Glu Ala Glu Asp Leu Trp Leu Ser Pro 995 1000 1005 Leu Thr Met Glu Asp Leu Val Cys Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg Gly 1010 1015 1020 Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala 1025 1030 1035 1040 Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Ser Asp Ile Val Lys Ile Cys Asp Phe 1045 1050 1055 Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly 1060 1065 1070 Ser Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp 1075 1080 1085 Lys Val Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu 1090 1095 1100 Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gln Ile 1105 1110 1115 1120 Asn Glu Glu Phe Cys Gln Arg Leu Lys Asp Gly Thr Arg Met Arg Ala 1125 1130 1135 Pro Glu Leu Ala Thr Pro Ala Ile Arg His Ile Met Gln Ser Cys Trp 1140 1145 1150 Ser Gly Asp Pro Lys Ala Arg Pro Ala Phe Ser Asp Leu Val Glu Ile 1155 1160 1165 Leu Gly Asp Leu Leu Gln Gly Gly Gly Trp Gln Glu Glu Glu Glu Glu 1170 1175 1180 Arg Met Ala Leu His Ser Ser Gln Ser Ser Glu Glu Asp Gly Phe Met 1185 1190 1195 1200 Gln Ala Ser Thr Thr Ala Leu His Ile Thr Glu Ala Asp Ala Asp Asp 1205 1210 1215 Ser Pro Pro Ser Met His Cys His Ser Leu Ala Ala Arg Tyr Tyr Asn 1220 1225 1230 Cys Val Ser Phe Pro Gly Arg Leu Ala Arg Gly Thr Lys Thr Pro Gly 1235 1240 1245 Ser Ser Arg Met Lys Thr Phe Glu Glu Leu Pro Met Thr Pro Thr Thr 1250 1255 1260 Tyr Lys Ala Ser Met Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu Ala 1265 1270 1275 1280 Ser Glu Glu Phe Glu Glu Leu Glu Ser Arg His Arg Pro Glu Gly Ser 1285 1290 1295 Phe Ser Cys Lys Gly Pro Gly Gln His Met Asp Ile Pro Arg Gly His 1300 1305 1310 Pro Asp Pro Gln Gly Arg Arg Arg Arg Pro Thr Gln Gly Ala Gln Gly 1315 1320 1325 Gly Lys Val Phe Tyr Asn Asn Glu Tyr Gly Glu Val Ser Gln Pro Cys 1330 1335 1340 Thr Glu Gly Asp Cys Cys Pro Ser Ala Gly Ser Thr Phe Phe Ala Asp 1345 1350 1355 1360 Ser Ser Tyr <210> 2 <211> 5853 <212> DNA <213> VEGFR-3 polynucleotide sequence <400> 2 ggtccgcgcc ccgccggcgc ctcggcgcgc gctctcactc ccagcctaga gctgcggccg 60 cgcaggtccc acccgcgccc aggggccgga gatgcagccg ggcgctgcgc tgaacctgcg 120 cctgtggctc tgcctcggac tcctccaagg cctggcaaat ggttactcca tgacccctcc 180 aaccctgaac atcacagagg attcatatgt gattgacacc ggggacagcc tatccatatc 240 ctgcagggga cagcaccccc tcgagtggac ctggccaggg gcccaggagg tactgaccac 300 aggtgggaag gacagtgaag acacacgggt tgtgcatgac tgtgaaggca cagaagctag 360 gccctactgc aaggtgctac tgctggccca gactcacgcc aacaacacgg gcagctacca 420 ctgctactac aagtacatca aggcccggat tgagggcacc acagctgcca gcacctatgt 480 gtttgtaaga gactttaaac accctttcat caacaaacct gacacgctcc tggtcaacag 540 gaaggactcg atgtgggtgc cctgcttggt gtccattccc ggcctcaaca tcacactgcg 600 ctcgcaaagc tcagcgctgc accccgacgg gcaggaggtg ctgtgggatg accgccgggg 660 catgcgggtg cccactcaac tgttgcgcga tgccctgtac ctgcagtgcg agaccacctg 720 gggtgaccag aacttccttt ccaatctctt cgtcgtgcac atcacaggca atgagctcta 780 tgacatccag ctgtacccca agaagtcaat ggagctgttg gttggagaga agctggtttt 840 gaactgtaca gtgtgggctg agttcgactc aggtgtcacc ttcgactggg attatccagg 900 gaagcaggca gagcgggcta agtgggtacc tgagcggcgt tcccagcaga cccacacaga 960 actctccagc atcctgacca tccacaatgt cagccagaat gacctgggcc cctatgtgtg 1020 tgaggccaac aatgggattc agcggttccg ggaaagcaca gaggtcattg tgcacgaaaa 1080 gcccttcatc agtgtcgagt ggctcaaagg acctgtcctg gaggccacag ccggtgacga 1140 gctggtgaag ctacccgtga agctggcagc ttatccccca ccggagttcc aatggtacaa 1200 ggacagaaag gcagtgactg ggcgccacaa tccccatgct ctggtgctca aagaggtgac 1260 cgaggccagc gcaggggtct acactctcgc cctgtggaac tctgcagctg gtctgaggca 1320 aaacatcagt ctggagctgg tggtgaatgt gcctcctcac atccacgaaa aggaagcctc 1380 ttcacccagc atctactccc gccacagtcg ccagaccctc acctgcaccg cctatggagt 1440 accccaaccc ctcagtgtcc agtggcactg gaggccctgg acaccctgca agacgtttgc 1500 ccagcgcagc ctccggaggc ggcagcagcg ggatggcatg ccacagtgcc gagactggaa 1560 ggaggtgacc actcaggatg ctgtgaaccc catcgagagt ctggacagct ggacggagtt 1620 tgtggagggg aagaataaga cggtgagcaa gctggtgatc caggatgcca atgtgtcagc 1680 catgtacaag tgtgtggtcg tcaacaaagt gggccaggat gagagactca tctacttcta 1740 tgtgaccacc atcccggacg gtttcagtat cgagtcggag ccttctgagg atcccttaga 1800 aggccagtcc gtgcgcctca gctgccgggc ggacaactac acgtacgaac atctgcgctg 1860 gtaccggctc aacctctcca cactgcacga tgctcaaggg aaccccctat tgctggactg 1920 caaaaacgtg cacctgtttg ccacgcccct agaggccaac ctagaggagg cagagcccgg 1980 ggcccgccac gccaccctca gtttgaatat cccccgagtg gcgcccgagg acgagggtga 2040 ctacgtgtgt gaagtgcagg ataggcgcag ccaggacaag cactgccaca agaagtacct 2100 gtccgtgcag gccctggaag ctcctcggct cacgcagaac ttgaccgacc tcctggtgaa 2160 cgtgagtgac tccctggaga tgcgatgccc ggtggctgga gcgcatgtgc ccagtattgt 2220 gtggtacaaa gatgaaaggc tcctggagaa agagtcggga atcgacctgg cagactccaa 2280 tcagaggctg agcatccagc gcgtgcgcga ggaggacgca ggtcgttatc tgtgcagcgt 2340 gtgcaatgcc aagggctgcg taaactcctc tgccagcgtg gcagtggaag gctctgaaga 2400 taaaggcagc atggagattg tgatactcat tggcactggc gtcatcgcag ttttcttctg 2460 ggtcctcctc ctgctcatct tctgtaacat gaaaaggcct gcccatgcag acatcaagac 2520 gggctacctg tccatcatca tggaccccgg ggaggtgcct ttggaggagc agtgtgaata 2580 cctgtcctat gacgccagcc agtgggagtt ccccagggaa aggttgcacc tcgggagagt 2640 cctaggccac ggggcttttg ggaaggtggt ggaagcctca gcttttggca tcaataaagg 2700 cagcagctgt gacaccgtgg ctgtgaagat gctgaaagag ggcgctactg ccagcgagca 2760 ccgtgccctg atgtcggagc tcaagatcct aattcacatc ggcaaccatc tcaacgtggt 2820 caacctccta ggggcgtgca ccaagcccaa cggccctctc atggtgatcg tggagttttg 2880 caaatacggc aacctctcca acttcttgcg tgtcaagcgg gacacgttca acccctacgc 2940 ggagaagtct ccggagcaac gcaggcgctt ccgcgccatg gtagaaggcg ccaaagctga 3000 taggaggaga cctggaagca gcgacagggc cctgttcacg cggttcctga tgggcaaagg 3060 aagtgcacgg cgagccccac ttgtccaaga agctgaggac ctatggctga gcccactgac 3120 catggaagac cttgtatgct acagcttcca agttgcccgg ggaatggagt tcctggcttc 3180 ccgcaagtgc attcacagag acctggctgc tcggaacatc ctactgtcag aaagtgacat 3240 agtgaagatc tgcgactttg gcctcgctcg ggacatctac aaagaccccg actatgtccg 3300 aaagggcagt gcccgacttc ctctgaaatg gatggccccc gagagcatct ttgataaggt 3360 gtacaccacg cagagtgatg tgtggtcctt cggcgtgctg ctgtgggaga tcttctcatt 3420 gggggcctct ccataccctg gggtacagat caatgaggag ttctgccagc ggctgaagga 3480 tggcactcga atgagagccc cggaactggc cactcctgcc atacgccaca tcatgcagag 3540 ttgctggtct ggagacccta aagcaagacc tgctttctct gacctagtgg agatcctggg 3600 ggacctgctt cagggcggag gctggcagga ggaggaagag gagcgcatgg ccctgcacag 3660 ctctcagagc tccgaggagg atggcttcat gcaggcatcc accacagctc tacatatcac 3720 cgaagcagac gctgatgata gtccacccag catgcattgc cacagcctgg cagccagata 3780 ttacaactgt gtgtcctttc ctgggcgcct ggccagaggc actaagactc caggctcttc 3840 caggatgaag acatttgaag aattgcccat gacccctaca acctacaaag cctccatgga 3900 taaccagaca gacagcggga tggtgctggc ctcagaagag tttgaggagc tagaaagcag 3960 gcatagacca gaaggcagct tcagctgtaa aggtcctggc cagcacatgg atattcccag 4020 aggacaccct gacccccagg ggaggcggcg acggcccact caaggggcac aaggaggcaa 4080 ggtgttttat aacaacgagt atggggaggt ctcccagcca tgtacagaag gtgactgctg 4140 cccgtctgct ggctccacct tcttcgcaga cagcagctac taaggaacat gtggcaaggc 4200 ctcctgcccg ttgctgcaac cggctctgac agctgggctg gaggcccagg ttgggaattc 4260 aactcctctg actccagccc tggaggtgtt ttatgtccca cccccactac agcctccata 4320 tccaggaaga gtcaaactca gacaacgagg gctcccttga actctgtacc gctcctgtac 4380 ccttccctgg gcagccaccc tcacccgcac attcgattgc cttgtagctc agcctccaca 4440 gatgctggcc ctggaataag cactctggca gagaattctt ctccagcacc tattttcatc 4500 gctctggtgg gcgacagggt tctcataagg aatacatatg tctgagagtc acacgatgaa 4560 tcaagaaaga gttagaccag agccaccatg tcctggcccc aaaccatcct ctccacacac 4620 acagtccctc tacttccaac tgcttcctgc ttccttctcc tggccccgga gggctgaaga 4680 aagatatttt ctatctcaaa gtcacagagg aggagtggag gagggggagg actcctctga 4740 gcatctatct agctcgtggg tagctgtctg tacacaatga ctaatcacaa tgaggcaacg 4800 cctctgcccc tgagtgttga gaagaaccgt ttttttgttt gtgtgtgtgt gtgtgtgttg 4860 gttttttttt ttttaatcag aagatcgggc gctgttgtaa agaatttact catcaaaaga 4920 tcatctggaa aagaagccca atcaataact gttctagatc ctagtcccca ataactgaag 4980 ggcggacatg acacaacatg ccagtcacca cagctcttcc cccgccccct ctctcgaagg 5040 ctcccaggct ccaccggcct ggtctagaac ctaagacacc agctgctgtt ctgatccccc 5100 ctcactgtgg gtctttcctc tagagcctgg atctgattgt ctgtggattc tgtcaaggaa 5160 agcttcaggg gctggtacag aggaccacat ggctgggggc cactcagcca tcaccccgtg 5220 tccccttggg ggcccctgcc ttcagcttac cctatacttt tacctgactt taacacctaa 5280 acaaatcaaa cctctgtcct gaacgatccc tccagcccag ctcctgctgc cccccccccc 5340 cacctccgtc atggccagaa gaaaccttca tgaagattag ccctgatgat ccctagcccc 5400 atcccaaaaa gaacgcttgc aggacaggcg accatacagc aagcaggggc ttgctcagca 5460 gaccctcccc actaagtgca ttgttctcct atgatatgtt gaaccgcatg tatgactgta 5520 gtcctctttg tccctgtgga gcccccaccc ctattcctcc acatctaacc tgtctgtggg 5580 attgagtgtc aagctcacca ctaggaagta gagactgttc tctcagagga ccgaaggctg 5640 caaatggggc tgcagagccc ttctcaaacc ctcccttacg tatcacctgt ctgtgtcacc 5700 tctcctgact tgtaactaca cacatacgaa atgtactggg gaagaaaacg tgctctgccc 5760 tttttggcag tgttctgaaa tgagctaaga tatttaacga aagataataa taaatttgat 5820 gccagtcttt gagttataaa aaaaaaaaaa aaa 5853 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR-3 sense primer <400> 3 ctgaggcaga atatcagtct ggag 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR-3 antisense primer <400> 4 agatgctcat acgtgtagtt gtcc 24

Claims (12)

1. VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 핵산은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것을 특징으로 하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 허혈 질환은 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 허혈 질환은 국소뇌허혈 질환인 것을 특징으로 하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질은 허혈 손상시 허혈 중심부위(ischemic core)의 대식세포(brain macrophage)에서 과발현되어 식세포 작용(phagocytosis), 세포증식 활성, 신경혈관 재생(neurovascular remodeling) 또는 외부 대식세포의 침윤(infiltrating exogenous macrophage) 활성을 촉진시켜 허헐 손상을 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질은 허혈 손상시 허혈 주변부위(peri-infarct region)의 성상세포(astrocyte)에서 과발현되어 상기 성상세포의 활성을 촉진시켜 허혈 손상을 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
8. (a) VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;
   (b) 상기 VEGFR-3 단백질의 양, VEGFR-3 단백질의 활성 또는 VEGFR-3 유전자의 발현양을 측정하는 단계; 및
   (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, VEGFR-3 단백질의 양, VEGFR-3 단백질의 활성 또는 VEGFR-3 유전자의 발현양이 상기 시료를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 증가되는 경우, 상기 시료는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
10. 제8항에 있어서,
    상기 VEGFR-3 단백질의 양을 측정하는 것은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 것이고, 상기 VEGFR-3 유전자의 발현양을 측정하는 것은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용하는 것을 특징으로 하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
11. 제8항에 있어서,
    상기 허혈 질환은 상처 치유, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관성 질환, 신동맥 질환, 위장관 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식편, 장기 치료, 골 회복 질환, 간 질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 수리 질환, 및 평활근 세포 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 허혈 질환은 국소뇌허혈 질환인 것을 특징으로 하는 허혈 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
    
    
    

Images