WO2015182815A1 - Ndrg3 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Ndrg3 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2015182815A1
WO2015182815A1 PCT/KR2014/006010 KR2014006010W WO2015182815A1 WO 2015182815 A1 WO2015182815 A1 WO 2015182815A1 KR 2014006010 W KR2014006010 W KR 2014006010W WO 2015182815 A1 WO2015182815 A1 WO 2015182815A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ndrg3
protein
expression
cells
ndrg3 protein
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/006010
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
염영일
이동철
박경찬
손현암
강민호
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Publication of WO2015182815A1 publication Critical patent/WO2015182815A1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • composition for the prevention and treatment of ischemic disease containing NDRG3 expression or activity promoter as an active ingredient
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases containing NDRG3 protein, or NDRG3 expression or activity promoter as an active ingredient, and more specifically, to promote NDRG3 protein and its mutants, or NDRG3 expression or activity. It relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases containing a protein or compound as an active ingredient.
  • Ischemia is a blockage of the blood supply to the heart and other tissues that results from the inability to supply oxygen and various nutrients contained in the blood.
  • oxygen and nutrients must be supplied through the blood vessels.
  • Representative organs damaged by ischemia are heart and brain tissue. The heart is supplied with the oxygen and nutrition it needs through the vessels called coronary veins. However, if you do not receive the required amount of blood flow, metabolites build up in the heart muscle and fall into hypoxia, which can cause dysfunction. This is called myocardial ischemia.
  • myocardial ischemia heart failure caused by myocardial ischemia is called ischemic heart disease. The disease is largely divided into angina and myocardial infarction. In general, men are more likely to develop and are older than women, and those who are at risk are more likely to occur.
  • Hypoxia-inducible factor-1 is a nuclear transcription factor that is induced by a large amount in the hypoxic state to maintain oxygen homeostasis in cells, such as erythropoiesi s and neovascularization ( angiogenesi s) and glycolysis s).
  • HIF 1 is divided into two groups, ⁇ and ⁇ .
  • HIF-1 a is a transcription factor. It degrades but is known to stabilize the protein itself in the hypoxic state.
  • Stabilized HIF-1 la binds to HNT- ⁇ ARNT, moves to the nucleus and expresses genes involved in angiogenesis and metabolism (Semenza et al., 1999; Wang et al., 1995; Wang and Semenza 1995) .
  • HIF-1 activity has recently emerged as a major new drug target because it is closely related to the pathological mechanisms of various chronic metabolic diseases such as cancer development and metastasis, rheumatoid arthritis, ischemic stroke and atherosclerosis.
  • various chronic metabolic diseases such as cancer development and metastasis, rheumatoid arthritis, ischemic stroke and atherosclerosis.
  • HIF histoneumatoid arthritis
  • ischemic stroke ischemic stroke and atherosclerosis
  • the NDRG family of genes was first expressed in the name of Ndrl as a gene with increased expression in N ⁇ Myc mutant mice. Since its human ortholog NDRG1 has been identified in human cell lines, it has been called by Drgl, Cap43, and RTP / r it42. Four different constitutive genes have been reported in the NDRG group genes. These four types of NDRGl, NDRG2, NDRG3, and NDRG4 have high homology, but the expression patterns vary considerably with individual development and growth. Have been reported (Qu et al., Mol Cel l Biochem, 2002 (229), 35-44, Deng et al., Int J Cancer, 2003 (106), 342-7).
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic disease, which contains an NDRG3 protein or an NDRG3 expression or activity promoter as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic disease, which contains an N-myc downstream regul ated gene 3 (NDRG3) protein expression or activity promoter as an active ingredient. to provide.
  • NDRG3 N-myc downstream regul ated gene 3
  • the present invention is the NDRG3 protein or at least one amino acid of the 47th arginine, 66th asparagine or 296 valine, which is the PHD2 docking site of the NDRG3 protein in the amino acid sequence of the protein is substituted with aspartic acid or glutamine is substituted with glutamic acid It provides a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease containing the mutant as an active ingredient.
  • the present invention is a NDRG3 protein or at least one of the 47th arginine, 66th asparagine or 296 valine, which is the PHD2 docking site of the NDRG3 protein in the amino acid sequence of the protein, is replaced with aspartic acid, or 97th glutamine as glutamic acid.
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a substituted bivariate, or a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease containing the cell containing the vector as an active ingredient.
  • the present invention for the prevention and treatment of ischemic disease containing a protein or compound that inhibits hydroxylation of the 294th prine site in the amino acid sequence of the NDRG3 protein and promotes the expression of the NDRG3 protein as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition.
  • step 2) when the expression or activity of the NDRG3 protein of step 1) is reduced compared to a normal control group, determining that there is an ischemic disease or that there is a risk of having an ischemic disease.
  • test substance in a hypoxic state to a cell line expressing any one or more of NDRG3 and ⁇ ⁇ , RACK1 or c-Raf;
  • 3) provides a method for screening a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease, comprising selecting a test substance whose binding degree of step 2) is increased compared to an untreated control group.
  • 3) provides a method for screening a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease, comprising selecting a test substance whose binding degree of step 2) is increased compared to an untreated control group.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of NDRG3 protein expression or activity It provides a method for preventing ischemic disease comprising administering a promoter to a subject.
  • the present invention also provides a method for treating ischemic disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of an NDRG3 protein expression or activity promoter.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of NDRG3 protein or any one or more amino acids of the 47th arginine, 66th asparagine or 296th valine, which is a PHD2 docking site of the NDRG3 protein, in the amino acid sequence of the protein is substituted with aspartic acid or 97 It provides a method for preventing ischemic disease comprising administering to a subject a mutant in which the first glutamine is substituted with glutamic acid.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of NDRG3 protein or any one or more amino acids of the 47th arginine, 66th asparagine or 296th valine, which is a PHD2 docking site of the NDRG3 protein, in the amino acid sequence of the protein is substituted with aspartic acid or 97
  • a method for treating ischemic disease comprising administering to a subject a mutant in which the first glutamine is substituted for glutamic acid.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of NDRG3 protein or amino acid sequence of any one or more of the 47th arginine, 66th asparagine or 296th valine, which is the PHD2 docking site of the NDRG3 protein in the amino acid sequence of the NDRG3 protein is substituted with aspartic acid or 97
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a mutant in which the first glutamine is substituted with glutamic acid, or a method for preventing ischemic disease comprising administering to the individual a cell comprising the vector.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of NDRG3 protein or any one or more amino acids of the 47th arginine, 66th asparagine or 296th valine, which is a PHD2 docking site of the NDRG3 protein, in the amino acid sequence of the protein is substituted with aspartic acid or 97
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a mutant in which a first glutamine is substituted with glutamic acid, or a method for treating ischemic disease comprising administering a cell containing the vector to a subject.
  • the present invention also provides a method for preventing ischemic disease, comprising administering to a subject a protein or compound that inhibits hydroxylation of the 294 th frine region in the amino acid sequence of the NDRG3 protein in a pharmaceutically effective amount.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of an amino acid of NDRG3 protein.
  • a method for treating ischemic disease comprising administering to a subject a protein or compound that inhibits the hydroxylation of the 294 th Purlin site in the sequence.
  • the present invention also provides the use of an NDRG3 protein expression or activity promoter for use as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases.
  • the present invention is any one of the NDRG3 protein or PHD2 docking site of the NDRG3 protein in the amino acid sequence of the NDRG3 protein for use as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease, the 47th arginine, 66th as if ragin or 296 valine
  • a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease the 47th arginine, 66th as if ragin or 296 valine
  • the use of a mutant wherein the above amino acid is substituted with aspartic acid or the 97th glutamine with glutamic acid.
  • the present invention is an NDRG3 protein for use as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic disease or amino acid of any one or more of the 47th arginine, 66th asparagine or 296th valine which is a PHD2 docking site of the NDRG3 protein in the amino acid sequence of the protein
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a mutant substituted with this aspartic acid or a 97th glutamine substituted with glutamic acid, or a cell comprising the vector is provided.
  • the present invention provides the use of a protein or compound that inhibits the hydroxylation of the 294 th prin region in the amino acid sequence of the NDRG3 protein for use as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • the NDRG3 of the present invention is increased in expression and activity by lactic acid produced in a persistent hypoxic reaction, thereby binding to c-Raf and RACK1 by acting as a scaf fo ld protein, wherein RACK1 By mobilizing the PKC protein to form a single complex consisting of four different materials, thereby activating the c-Raf-ERK signaling pathway to promote cell proliferation and angiogenesis, thereby expressing the NDRG3 protein, or NDRG3 expression or Activity promoters can be usefully used as pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of ischemic diseases. [Brief Description of Drawings]
  • La is a diagram showing a pCAGGS plasmid encoding human NDRG3 for the preparation of NDRG3 overexpressing transgenic mice.
  • Lb confirms that the human NDRG3 gene is inserted into genomic DNA of TG-2, TG-8 and TG-13 mice in the production of NDRG3 overexpressing transgenic mice.
  • Figure lc shows the expression of the human NDRG3 gene in the liver tissues of established NDRG3 overexpressing transgenic mice TG-2, TG-8 and TG-13.
  • FIG. 2 is a diagram showing the antigen-antibody reaction between the produced rabbit anti—NDRG3 antibody and human NDRG3 (N66D) variant.
  • FIG. 3A is a diagram schematically illustrating a process of selecting candidate proteins that bind to PHD2.
  • Figure 3b is a diagram showing a protein binding to PHD2.
  • Figure 3c is a diagram showing the binding of PHD2 and NDRG3 protein.
  • FIG. 4A shows the binding of PHD2 and NDRG3 under hypoxia (hypoxia, 1% 0 2 ) (FIG. 4A, top) and in vitro (FIG. 4A, bottom).
  • Figure 4b is a diagram confirming the induction of NDRG3 protein by PHD2 inhibition in MCF-7 cells in the normal oxygen state (normoxia, 21% 0 2 ).
  • Figure 4c is a diagram confirming the induction of NDRG3 protein by PHD2 inhibition in HeLa cells under normal oxygen state.
  • Figure 5a is a diagram confirming the inhibition of NDRG3 protein expression by the PHD family group and VHL deletion in the normal oxygen state.
  • 5B is a diagram confirming binding of the PHD family group and the NDRG3 protein.
  • FIG. 6A shows the PHD2 docking site of NDRG3 through protein-protein docking simulation.
  • Figure 6b is a diagram confirming the binding force of the PHD2 docking site and PHD2 of NDRG3 confirmed by the docking simulation.
  • Figure 7a is a diagram confirming the ubiquitination (ubiquitination) of the NDRG3 protein after treatment with a proteasome inhibitor (MG132) in the normal oxygen state.
  • Figure 7b is a diagram confirming the ubiquitination of NDRG3 protein in the normal oxygen state.
  • Figure 8a confirms the accumulation of NDRG3 protein according to the persistent hypoxic state It is also.
  • Figure 8b is a diagram confirming the accumulation of NDRG3 protein according to the persistent hypoxic state in the cell.
  • Figure 8c is a diagram confirming the accumulation of NDRG3 protein according to the persistent hypoxic state in several types of cancer cells.
  • Figure 8d is a diagram confirming the inhibition of ubiquitination of NDRG3 protein in a persistent hypoxic state.
  • Figure 9a is a diagram confirming the change in NDRG3 protein expression according to the normal oxygen state and persistent hypoxic state.
  • Figure 9b is a diagram confirming the change in the expression of NDRG3 protein when restored to a normal oxygen state from a hypoxic state.
  • Figure 10a is a diagram confirming the NDRG3 protein hydroxylation (hydroxy 1 at i on) target site.
  • Figure 10b is a diagram confirming the binding of hydroxy 1 at i on the NDRG3 protein and PHD2 / VHL.
  • Figure 11a is a diagram confirming the change in the expression of R A and HIF protein of NDRG3 according to the change of oxygen state
  • Lib is a diagram confirming the expression change of NDRG3 protein according to HIF and PHD2 inhibition.
  • Lie is a diagram showing the expression change of NDRG3 protein in MCF-7 (HIF-1 + / + and VHL + / + ) and 786-0 (HIF-r and VHL _ / —) cells under hypoxic conditions.
  • 12A is a diagram analyzing the functions of NDRG3 and HIF-1 associated with hypoxic reaction.
  • 12B is a diagram analyzing the function of each gene upregulated in cells overexpressing the NDRG3 protein in the normal oxygen state and cells under the hypoxic state.
  • Figure 13a is a diagram confirming the change in angiogenic activity due to NDRG3 deletion in the hypoxic state.
  • Figure 13b is a diagram confirming the expression changes of angiogenesis markers IL8, IL1 ⁇ , ⁇ ⁇ , C0X-2 and PAI-1 due to NDRG3 deletion in hypoxic state.
  • FIG. 13C shows the in vivo changes in angiogenesis due to NDRG3 deletion. It is also.
  • 14A is a diagram confirming cell growth changes due to NDRG3 deletion.
  • FIG. 14B is a diagram confirming tumor formation change due to NDRG3 and / or HIF deletion.
  • Figure 14c is a diagram confirming the tumor formation change by the expression of the ectopi c variant NDRG3 (N66D).
  • FIG. 14D shows the tumor volume change in mice implanted with NDRG3 and / or HIF deleted tumor cells.
  • Figure 14e3 ⁇ 4 ectopic variant NDRG3 (N66D) is a diagram confirming the change in the volume of the tumor in the mouse transplanted tumor cells.
  • Figure 14f is a diagram confirming the expression changes of the cell proliferation marker Ki-67 and angiogenesis marker IL8 protein by NDRG3 or HIF deletion in tumor tissues.
  • Figure Mg is a diagram confirming the change in the expression of angiogenesis markers due to NDRG3 or HIF deletion in tumor tissue.
  • Figure 15a is a diagram confirming the changes in protein expression and lactic acid (Lactate) production of NDRG3 and HIF-1 ⁇ according to the oxygen state.
  • Figure 15b is a diagram confirming the changes in the protein expression and lactic acid (Lactate) production of NDRG3 and HIF-1 ⁇ according to the persistent hypoxia after treatment with sodium oxamate (LDHAO actate dehydrogenase A) inhibitor.
  • Figure 15c is a diagram confirming the change in expression of NDRG3 protein according to lactic acid production in the hypoxic state.
  • Figure 15d is a diagram confirming the expression change of the left NDRG3 protein according to glycolysis by 2-deoxyglucose (2-DG).
  • Figure 15e is a diagram confirming the expression change of NDRG3 protein according to the excessive lactic acid production by pyruvate (Pyruvate) or LDHA.
  • Figure 15f is a diagram confirming the ubiquitination change of NDRG3 protein by lactic acid production.
  • 16A shows the recombinant NDRG3 (G138W) variant and recombinant NDRG3 wild-type protein mutated at the lactic acid binding site of the NDRG3 protein.
  • 16B shows recombinant NDRG3 wild type and recombinant NDRG3 (G138W) variant proteins. This confirms the lactic acid binding.
  • Figure 16c is a diagram confirming the expression change of the mutant L-lactate binding site # of NDRG3 in the hypoxic state.
  • Figure 16d is a diagram confirming the expression of NDRG3 protein by reoxygenat ion.
  • Figure 17a is a diagram confirming the change in cell growth by lactic acid inhibition and ectopic variant NDRG3 (N66D) expression.
  • FIG. 17B is a diagram showing changes in cellular colony formation by lactic acid production inhibition and / or expression of ectopic variant NDRG3 (N66D).
  • Figure 17c is a diagram confirming the change in cell growth by LDHA deletion and / or ectopic variant NDRG3 (N66D) expression.
  • FIG. 17D shows tumor formation changes in mice implanted with LDHA deletion and / or ectopic variant NDRG3 (N66D) expressed tumor cells. .
  • Figure 17e is a diagram confirming the change in NDRG3 protein expression by the inhibition of lactic acid production and / or ectopic variant NDRG3 (N66D) expression in a persistent hypoxic state.
  • Figure 17f is a diagram confirming the change in lactic acid production by the expression of ectopic variant NDRG3 (N66D) in a persistent hypoxic state.
  • 18 is a diagram confirming the changes in angiogenesis by the inhibition of lactic acid production and expression of 7 or ectopic variant NDRG3CN66D) in a persistent hypoxic state.
  • Figure 19a is a diagram confirming the change in phosphorylation of the protein (phosphorylat i on) by NDRG3 deletion in the hypoxic state.
  • 19B shows the expression of ERK1 / 2 protein according to NDRG3 protein expression . It is the figure which confirmed the change of activity.
  • Figure 19c is a diagram confirming the change in Raf-ERKl / 2 activity by NDRG3 deletion in a persistent hypoxic state.
  • 19D is a diagram confirming binding of NDRG3 protein and C- R a f in vitro (in-vi tro, left) and in cells (right).
  • Figure 19e is a diagram confirming the change in Raf-ERKl / 2 activity by NDRG3 protein deletion or ectopic variant NDRG3 (N66D) expression.
  • Figure 19f is a diagram confirming the phosphorylation change of c-Raf according to the inhibition of PKC- ⁇ activity with ectopic variant NDRG3 (N66D) and / or PKC-I.
  • Figure 19g is a diagram confirming the change in NDRG3 protein expression and Raf-ERKl / 2 activity according to the inhibition of lactic acid production in hypoxic state.
  • Figure 20a is a diagram confirming the binding between the NDRG3 protein and RACK-1.
  • Figure 20b is a diagram confirming the change in Raf-ERKl / 2 activity according to NDRG3 deletion or ectopic variant NDRG3 (N66D), RACK-1 and / or Raf expression.
  • Figure 20c is a diagram confirming the binding between the ectopic variant NDRG3 (N66D) and PKC- ⁇ by the RACK1 deletion in the hypoxic state.
  • Figure 20d is a diagram confirming the change in ERK1 / 2 activity by inhibition of PKC— ⁇ activity in the hypoxic state.
  • 20E is a diagram confirming the complex formation of the recombinant heterotopic variant NDRG3 (N66D) with c—Raf, RACK1, and PKC— ⁇ .
  • Figure 20f is a diagram confirming the complex formation of NDRG3, c-Raf, RACK1 and PKc- ⁇ through the simulation.
  • Figure 21a is a diagram confirming the tumor formation of NDRG3 overexpressing transgenic mice and control mice.
  • Figure 21B is a diagram confirming tumor formation in the lung, intestine and lower abdomen (hypogastrium) of NDRG3 overexpressing transgenic mice and control mice.
  • 21C is a diagram illustrating ⁇ cells and ⁇ cells in mesenteric lymph nodes, spleen and liver tissues of NDRG3 overexpressing transgenic mice and control mice.
  • FIG. 21D shows glutamic synthetase (GS) and heat shock protein 70 (heat shock protein 20, HSP), which are hepatocellular carcinoma markers (hepatoce lular carcinoma (HCC)) in liver tissues of NDRG3 overexpressing transgenic mice and control mice. It is a figure which confirmed the expression of the cell proliferation markers PCNA and Ki-67.
  • GS glutamic synthetase
  • HSP heat shock protein 20
  • HCC hepatocellular carcinoma markers
  • Figure 21e is a diagram confirming the mR A expression of ERK1 / 2 activity and angiogenesis markers in liver tissues of NDRG3 overexpressing transgenic mice and control mice.
  • FIG. 22 is a diagram confirming the expression of NDRG3 and ERK1 / 2 activity in liver cancer patients.
  • FIG. 23 is a diagram of the mechanism of NDRG3 as a mediator of the Raf-ERK pathway induced by lactic acid in persistent hypoxic reaction.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease, which contains an NDRG3 (N-myc downstream-regulated gene 3) protein expression or activity promoter as an active ingredient.
  • NDRG3 N-myc downstream-regulated gene 3
  • the NDRG3 protein is preferably composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the expression promoter of the NDRG3 protein is the 47th arginine, 66th asparagine, 68th lysine, 69th serine, 72th asparagine, 73th alanine, and 73th alanine of NDRG3 protein.
  • the 47th arginine or 66th asparagine site which is the PHD2 docking site of the NDRG3 protein, is more preferable. Most preferably, but not limited to, binding to the 66th asparagine site to reduce the interaction with PHD2 to promote the expression of NDRG3 protein.
  • the expression promoter of the NDRG3 protein preferably promotes lactic acid binding to the 62nd aspartic acid, 138th glycine, 139th alanine, or 229th tyrosine, which are the lactic acid (Lactate) binding sites of the NDRG3 protein.
  • the activity promoter of the NDRG3 protein promotes the binding degree of any one or more of NDRG3 and ⁇ , RACK1 or c-Raf.
  • the ischemic disease is preferably one selected from the group consisting of cerebral ischemia, cardiac ischemia, diabetic vascular heart disease, heart failure, myocardial hypertrophy, retinal ischemia, ischemic colitis, ischemic acute renal failure, stroke, brain trauma and neonatal hypoxia. It is not limited.
  • the inventors selected a candidate protein gene NDRG3 (SEQ ID NO: 1) that binds to the PHD2 protein involved in HIF activity in order to find a HIF ⁇ independent factor associated with hypoxia, and NDRG3 in hypoxia.
  • NDRG3 overexpressing transgenic C57 / BL6 mice TG-2, TG ⁇ 8 and TG-13 were prepared (see FIGS. La-lc, and FIGS. 3a-3c), recombinant human Anti-NDRG3 polyclonal antiserum was obtained from rabbi t with NDRG3 protein (amino acids 32-315, SEQ ID NO: 2) as an antigen, and was subjected to affinity chromatography using NDRG3 peptide (amino acids 244-255, SEQ ID NO: 3). Purification produced the Levit anti-human NDRG3 polyclonal antibody (see FIG. 2).
  • the inventors have performed immunoprecipi tat ion, western blot ting, in vitro (in vitro) in order to confirm the relationship between PHD2 and NDRG3 proteins according to the oxygen state.
  • -vi tro Pull-down assay and RT-PCR resulted in binding to the PHD2 protein of the four families of PHD families, PHD2 and E3 ubiquitin ligase (l).
  • NDRG3 protein 3 ⁇ 4 is a unique substrate of PHD2 and a substrate of post-transcriptional process of PHD2 / VHL-mediated NDRG3 (Fig. 4a to 4c, and 5a and 5b).
  • protein As a result of protein docking simulation, the PHD2 docking site of NDRG3 was confirmed, and the 47th or 66th amino acid position of the PHD2 docking site NDRG3 was more important (FIGS. 6A and 6B).
  • In-vivo ubiquit inat ion assay showed that NDRG3 was ubiquitized via the PHD2 / VHL-mediated proteasome pathway by binding PHD2 to the NDRG3 docking site in normal oxygen. Confirmed removal (see FIGS. 7A and 7B).
  • the present inventors performed immunoprecipitation, Western blotting, immunofluorescence staining, and in vivo ubiquitination assay to confirm the oxygen-dependency of NDRG3 protein.
  • HIF decreases gradually after expression increases in the early stages of hypoxia, but by confirming that expression and accumulation of ND RG3 protein increases as hypoxia persists, NDRG3 plays an important role in HIF-independently sustained hypoxic reactions. (See FIGS. 11A-11C).
  • NDRG3 protein is a cell proliferation ( prol i ferat ion), angiogenesis (angiogenensi s), cell growth (cel l growth) was found to be the most relevant (Fig. 12a and 12b), in vivo angiogenesis assay (in- vivo angiogenesi s assay) And the in-vivo transplanted tumor volume measurement and ⁇ analysis results confirmed that the neovascularization and cell proliferation and tumor growth is promoted by NDRG3 in hypoxic reaction (Fig. 13a and 13c, and 14a) To Fig.
  • the inventors in the low oxygen state In order to confirm the association between lactic acid production and increased expression of NDRG3 protein, measurement of lactic acid production in hypoxic state, Western blotting, immunoprecipitation, and in vitro ubiquitin assay were performed to produce lactic acid by hypoxic reaction. It was confirmed that ubiquitination of NDRG3 protein was inhibited and HIF-independently increased by lactic acid binding to lactic acid binding sites including 62nd, 138th, 139th or 229th of NDRG3 (FIGS.
  • NDRG3 ectopic variant NDRG3
  • the present inventors have carried out in vitro kinase assay, pull-down assay, immunoprecipitation method in order to confirm the molecular regulation mechanism of the hypoxic reaction mediated by NDRG3.
  • Western blotting confirmed that inhibition of NDRG3 expression in hypoxic state inhibited the phosphorylation of c-Raf and ERK1 / 2, thereby NDRG3 in the c-Raf—ERK1 / 2 pathway activated by hypoxic reaction induced lactic acid. It was confirmed that this is an important mediator of the c-Raf-ERKl / 2 signal (see FIGS. 19A-19G).
  • NDRG3 binds to RACK1 to induce PKC- ⁇ , forms NDRG3-RACK1-PKC-P -c-Raf complex with c-Raf, and c is induced by PKC- ⁇ .
  • -Raf protein is phosphorylated to activate the c-Raf / ERK signal
  • NDRG3 regulated by lactic acid is a scaf fo ld protein that modulates the activity of c-Raf (FIGS. 20A to FIG. 20 f).
  • the present inventors performed immunohistochemical analysis (immunoh stochemical anaylys is) using the NDRG3 overexpressing transgenic mice prepared above to confirm the pathological changes caused by NDRG3, RT-PCR was performed to confirm the expression of Western blotting gene expression to confirm the expression of activated ER 1/2 protein.
  • Tumors were found in various organs such as lung, intestine and liver of NDRG3 overexpressed mouse. Lymphoma-expressing B-cells and T-cells were found in secondary lymphoid organs such as mesenteric lymph nodes and spleen. It was confirmed that the expression of cell proliferation markers and angiogenesis markers was increased (see FIGS. 21A-21E).
  • abnormal expression of NDRG3 activates the c-Raf / ERK pathway to form tumors. And promote angiogenesis.
  • NDRG3 of the present invention is downregulated by ubiquitination by PHD / VHL mediated pathway by binding PHD2 to the PHD2 docking site of NDRG3 in normal oxygen state, and in the early stage of hypoxia, accumulation of HIF-1a protein due to inactivation of PHD2.
  • This induced up-regulation of genes (LDHA, PD 1, etc.) associated with metabolic adaptation of cells following hypoxia activates glycolysis.
  • the expression of NDRG3 protein is then increased by lactic acid produced / accumulated by increased glycolysis, along with the inhibition of the 294th plinin hydroxylation, the hypoxia target site of NDRG3 by hypoxic PHD2 inactivation.
  • the increased NDRG3 acts as a scaffold protein in sustained hypoxic reaction to bind c-Raf and RACK1, and after the bound RACK1 mobilizes the PKC- ⁇ protein to form a complex, c-Raf is phosphorylated by PKC
  • the c-Raf-ERKl / 2 pathway is activated to promote cell proliferation and angiogenesis (see FIG. 23), so that the NDRG3 protein and its ectopic mutants, or proteins or compounds that promote the expression or activity of NDRG3, ischemic It can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing diseases and tea.
  • the present invention is the amino acid sequence of the NDRG3 protein or the amino acid sequence of the ND G3 protein PHD2 docking site of the 47th arginine, 66th asparagine or 296 valine at least one amino acid is substituted with aspartic acid or 97th glutamine to glutamic acid
  • a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases containing substituted mutants as an active ingredient is provided.
  • the NDRG3 protein is preferably composed of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. .
  • the ischemic diseases include cerebral ischemia, cardiac ischemia, diabetic vascular heart disease, heart failure, myocardial hypertrophy, retinal ischemia, ischemic colitis, ischemic acute renal failure, stroke, brain trauma and It is preferably one selected from the group consisting of neonatal hypoxia, but is not limited thereto.
  • heterotopic mutants of NDRG3 and NDRG3 mediated by lactate produced by hypoxia reaction form complexes with RACK1, PKC- ⁇ and c-Raf, and lactate-NDRG3-c-Raf. Since angiogenesis is promoted through the -ERK signaling pathway, the NDRG3 or a mutant thereof may be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • At least one amino acid of the 47th arginine, the 66th asparagine, or the 296th valine which is a PHD2 docking site of the NDRG3 protein or the amino acid sequence of the NDRG3 protein, is substituted with aspartic acid or glutamine is substituted with glutamic acid. It provides a vector comprising a polynucleotide encoding the mutant, or a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease containing the cell containing the vector as an active ingredient.
  • the NDRG3 protein is preferably composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the vector is preferably, but not limited to, linear DNA, plasmid DNA, or recombinant viral vectors.
  • the recombinant viral vector is preferably any one selected from the group consisting of retrovirus (Retrovi rus), adenoviral (Adenovi rus), Hepes simplex vi rus and Lentivirus (Lent ivirus) It is not limited to this.
  • the polynucleotide encoding the NDRG3 protein is within a range that does not change the amino acid sequence of the protein expressed from the coding region due to degeneracy of the codon or in consideration of the codons preferred in the organism to express the protein.
  • various modifications may be made, and various modifications or modifications may be made within a range that does not affect the expression of genes in portions other than the coding region, and those skilled in the art may include such modified genes. I can understand well. That is, of the present invention
  • one or more nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or supersynthesis thereof, which are also included in the scope of the present invention.
  • the sequence of such polynucleotides may be single or double stranded, and may be DNA molecules or RNA (mRNA) molecules.
  • the cell is preferably any one selected from the group consisting of hematopoietic stem cells, dendritic cells and tumor cells, but is not limited thereto.
  • heterotopic mutants of NDRG3 and NDRG3 mediated by lactic acid produced by hypoxia reaction form complexes with RACK1, PKC- ⁇ and c-Raf, and angiogenesis through the lactate-NDRG3-C-Raf-ERK signaling pathway. Since it promotes, a vector encoding the NDRG3 or a mutant thereof or a cell including the vector can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • the present invention is to prevent and treat ischemic diseases containing a protein or compound that inhibits hydroxyl 1 at i on the 294 th proline in the amino acid sequence of the NDRG3 protein as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition.
  • the ischemic disease is preferably one selected from the group consisting of cerebral ischemia, cardiac ischemia, diabetic vascular heart disease, heart failure, myocardial hypertrophy, retinal ischemia, ischemic colitis, ischemic acute renal failure, stroke, brain trauma and neonatal hypoxia. It is not limited.
  • the NDRG3 mediated by the lactic acid produced by the hypoxia response increases the NDRG3 protein by inactivating the 294th plin, and promotes angiogenesis through the lactic acid -NDRG3-c-Raf-ERK signaling pathway.
  • a protein or compound that inhibits the hydroxylation of the 294th plin moiety in the amino acid sequence of may be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • the composition of the present invention can be preferably formulated into a pharmaceutical composition comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredient for administration.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated in liquid solutions are sterile and biocompatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be used in combination, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary.
  • composition of the present invention may be prepared using a pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvant may include an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, an expanding agent, Solubilizers such as lubricant lubricants or flavoring agents can be used.
  • compositions of the present invention may be formulated into injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or tablets by additionally adding diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants.
  • injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or tablets by additionally adding diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants.
  • the method disclosed in Remington's Pharmaceut i cal Science, Mack Publ i Shing Company, Easton PA may be formulated according to the disease or component according to the appropriate method in the art.
  • composition of the present invention is conventional through the intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, sternum, transdermal, nasal, inhalation, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal routes. May be administered in such a manner.
  • Dosage amount of the composition means the amount required to achieve the effect of preventing or treating ischemic disease.
  • the type and content of active and other ingredients in the composition, the type of formulation and the age of the patient, body weight, general health, sex and diet, time of administration, route of administration and rate of treatment, duration of treatment, simultaneous use It can be adjusted according to various factors including the drug. In the case of an adult (based on 60kg body weight), it is preferable to administer 20-52 mg once daily parenterally, and may be appropriately determined by the experience of a person of ordinary skill in the art.
  • NDRG3 protein 1) measuring the expression or activity of NDRG3 protein from a sample isolated from the subject; And 2) when the expression or activity of the NDRG3 protein of step 1) is reduced compared to a normal control group, determining to have ischemic disease or risk of having ischemic disease, for providing information for diagnosing ischemic disease.
  • the feed of step 1) is preferably any one selected from the group consisting of cells, tissues, blood, serum, saliva and urine, but is not limited thereto.
  • the expression or activity level of NDRG3 protein in step 1) is measured by any one selected from the group consisting of enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemical staining, Western blotting and protein chip. Preferred but not limited to this.
  • the present invention can be usefully used as a method for detecting a protein to provide information for ischemic disease diagnosis. have.
  • the present invention can be usefully used as a method for detecting a protein to provide information for ischemic disease diagnosis. have.
  • 3) provides a method for screening a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease, comprising selecting a test substance whose expression or activity of NDRG3 protein of step 2) is increased compared to an untreated control.
  • the expression or activity level of the NDRG3 protein of step 3) is preferably measured by any one selected from the group consisting of enzyme immunoassay, immunohistochemical staining, western blotting and protein chip, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a process in which NDRG3 is mediated by lactic acid produced by hypoxia reaction.
  • angiogenesis is promoted through the NDRG3-c-Raf-ERK signaling pathway, it can be usefully used as a method for detecting proteins to provide information for ischemic disease diagnosis.
  • the present invention 1) treating the test substance in a hypoxic state to a cell line expressing at least one of NDRG3 and PKC- ⁇ , RACK1 or c-Raf;
  • 3) provides a method for screening a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease, comprising the step of selecting the test substance to increase the binding degree of step 2) compared to the untreated control.
  • the expression or activity level of the NDRG3 protein of step 3) is preferably measured by any one selected from the group consisting of enzyme immunoassay, immunohistochemical staining, western blotting and protein chip, but is not limited thereto.
  • the present invention is ischemic because NDRG3 mediated by lactic acid produced by hypoxia reaction forms complex with RACK1, PKC- ⁇ and c-Raf, and promotes angiogenesis through the lactate -NDRG3—C—Raf-ERK signaling pathway. It can be usefully used as a screening method for a pharmaceutical composition for preventing and treating diseases.
  • the present invention can be usefully used as a screening method for a pharmaceutical composition for preventing and treating diseases.
  • test substance 1) treating the test substance to NDRG3, PKC- ⁇ , RACK1 and c-Raf proteins in vitro;
  • 3) provides a method for screening a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease, comprising selecting a test substance whose binding degree of step 2) is increased compared to an untreated control group.
  • the expression or activity level of the NDRG3 protein in step 2) was determined by in vitro pull-down assay, immunoprecipitation (i ⁇ unoprecipi tat ion) and Western blotting (Western Blot t). It is preferable to measure by any one selected from the group consisting of ing), but is not limited thereto.
  • NDRG3 mediated by lactic acid produced by hypoxia reaction forms a complex with RACKl, PKC- ⁇ and c-Raf, and through lactic acid -NDRG3-c-Raf-ERK signaling pathway. Since it promotes angiogenesis, it can be usefully used as a screening method of the pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • the present invention also provides a method for preventing ischemic disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of an NDRG3 protein expression or activity promoter.
  • the present invention also provides a method for treating ischemic disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of an NDRG3 protein expression or activity promoter.
  • the NDRG3 protein is preferably composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the expression promoter of NDRG3 protein is 47th arginine, 66th asparagine, 66th asparagine, 68th lysine, 69th serine, 72th asparagine, 73rd alanine, 76th asparagine, 77th phenylalanine, 78th glutamic acid, 81st glutamine, 97th Glutamine, 98th Glutamine, 99th Glutamic Acid, 100th Glycine, 101th Alanine, 102th Plin, 103th Serine, 203th Leucine, 204th Aspartic Acid, 205th Leucine, 208th Threonine, 209 1st tyrosine, 211th methionine, 212th histidine, 214th alanine, 215th glutamine, 216th aspartic acid, 217th isoleucine, 218th asparagine, 219th glutamine, 296th valine, 297th va
  • the NDRG3 protein expression promoter is preferably promoted lactic acid binding to the lactic acid binding site of the NDRG3 protein 62nd aspartic acid, 138th glycine, 139th alanine or 229th tyrosine.
  • the activity promoter of the NDRG3 protein preferably promotes the degree of binding of NDRG3 to any one or more of PKC- ⁇ , RACK1 or c_Raf.
  • the ischemic disease is preferably one selected from the group consisting of cerebral ischemia, cardiac ischemia, diabetic vascular heart disease, heart failure, myocardial hypertrophy, retinal ischemia, ischemic colitis, ischemic acute renal failure, stroke, cerebral trauma and neonatal hypoxia. It is not limited.
  • ectopic mutants of NDRG3 and NDRG3 mediated by lactic acid produced by hypoxia reaction form complexes with RACK1, P C- ⁇ and c-Raf, and blood vessels through the lactate-NDRG3-C-Raf-ERK signaling pathway. Since it promotes angiogenesis, the protein or compound that promotes the expression or activity of the NDRG3 can be usefully used in the pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of NDRG3 protein or amino acid sequence of any one or more of the 47th arginine, 66th asparagine or 296th valine, which is the PHD2 docking site of the NDRG3 protein, is substituted with aspartic acid or the 97th It provides a method for preventing ischemic disease comprising administering to a subject a mutant in which glutamine is substituted with glutamic acid.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of NDRG3 protein or any one or more amino acids of the 47th arginine, 66th asparagine or 296th valine, which is a PHD2 docking site of the NDRG3 protein, in the amino acid sequence of the protein is substituted with aspartic acid or 97
  • a method for treating ischemic disease comprising administering to a subject a mutant in which the first glutamine is substituted for glutamic acid.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of NDRG3 protein or amino acid of any one or more of the 47th arginine, 66th asparagine or 296th valine, which is the PHD2 docking site of the NDRG3 protein, in the amino acid sequence of the protein is substituted with aspartic acid or 97
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a mutant in which the first glutamine is substituted with glutamic acid, or a method for preventing ischemic disease comprising administering to the individual a cell comprising the vector.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of NDRG3 protein or A polynucleotide encoding a mutant in which at least one amino acid of the 47th arginine, 66th asparagine or 296 valine, which is the PHD2 docking site of the NDRG3 protein, is substituted with aspartic acid or glutamic acid with glutamic acid in the amino acid sequence
  • a vector, or a method for treating ischemic disease comprising administering a cell comprising the vector to a subject.
  • the NDRG3 protein is preferably composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the vector is preferably, but not limited to, linear DNA, plasmid DNA, or recombinant viral vector.
  • the recombinant viral vector is preferably any one selected from the group consisting of retrovirus, adenovirus, hepes simplex virus, and lentivirus, but is not limited thereto.
  • the cell is preferably any one selected from the group consisting of hematopoietic stem cells, dendritic cells and tumor cells, but is not limited thereto.
  • heterotopic mutants of NDRG3 and NDRG3 mediated by lactic acid produced by hypoxia reaction form complexes with RACK1, PKC- ⁇ and c-Raf, and angiogenesis through the lactate-NDRG3-C—Raf-ERK signaling pathway. Since it promotes, the NDRG3 or a mutant thereof, a vector encoding the mutant, or a cell including the vector may be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • the present invention also provides a method for preventing ischemic disease, comprising administering to a subject a protein well or a compound that inhibits hydroxylation of the 294th Purlin site in an amino acid sequence of a NDRG3 protein in a pharmaceutically effective amount. .
  • the present invention also provides a method for treating ischemic disease comprising administering to a subject a protein or compound that inhibits hydroxylation of the 294th proline region in the amino acid sequence of the NDRG3 protein in a pharmaceutically effective amount.
  • the ischemic disease is preferably any one selected from the group consisting of cerebral ischemia, cardiac ischemia, diabetic vascular heart disease, heart failure, myocardial hypertrophy, retinal ischemia, ischemic colitis, ischemic acute renal failure, stroke, brain trauma and neonatal hypoxia. It is not limited to this.
  • NDRG3 mediated by lactic acid produced by hypoxia reaction results in an increase of NDRG3 protein by inactivation of the 294th plin and promotes angiogenesis through the lactic acid -NDRG3-c-Raf-ERK signaling pathway.
  • a protein or compound that inhibits the hydroxylation of the 294th plin moiety in the amino acid sequence of may be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • the present invention also provides the use of an NDRG3 protein expression or activity promoter for use as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases.
  • the NDRG3 protein is preferably composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the expression promoter of NDRG3 protein is 47th arginine, 66th asparagine, 68th lysine, 69th serine, 72th asparagine, 73th alanine, 76th asparagine of NDRG3 protein.
  • PHD2 it is preferable to inhibit binding of PHD2 to any one or more PHD2 docking sites selected from the group consisting of 298th glutamine ⁇ 300th glycine and 301 lysine. 47th arginine, 66th asparagine of NDRG3 protein. More preferably, it inhibits the binding of PHD2 to any one or more PHD2 docking sites selected from the group consisting of 68th lysine, 69th serine, 97th glutamine and 296th valine, and the 47th arginine, which is the PHD2 docking site of NDRG3 protein.
  • the first asparagine site it is more preferable to target the first asparagine site, and it is most preferable to bind to the 47th arginine or 66th asparagine site of the NDRG3 protein to reduce the interaction with PHD2 to promote the expression of the NDRG3 protein.
  • the expression promoter of the NDRG3 protein binds 3 ⁇ 4 acid ⁇ ( ⁇ ⁇ ⁇ 6) of the NDRG3 protein. It is preferred, but not limited, to promote lactic acid binding to the 62nd aspartic acid, 138th glycine, 139th alanine or 229th tyrosine.
  • the activity promoter of the NDRG3 protein preferably promotes the degree of binding of NDRG3 to any one or more of PKC- ⁇ , RACK1 or c-Raf.
  • the ischemic disease is preferably any one selected from the group consisting of cerebral ischemia, cardiac ischemia, diabetic vascular heart disease, heart failure, myocardial hypertrophy, retinal ischemia, ischemic colitis, ischemic acute renal failure, stroke, brain trauma and neonatal hypoxia. It is not limited.
  • heterotopic mutants of NDRG3 and NDRG3 mediated by lactic acid produced by hypoxia reaction form complexes with RACK1, PKC- ⁇ and c-Raf, and angiogenesis through the lactate-NDRG3-C-Raf-ERK signaling pathway. Since to promote the protein or compound that promotes the expression or activity of the NDRG3 can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • the present invention is an NDRG3 protein for use as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic disease or amino acid of any one or more of the 47th arginine, 66th asparagine or 296th valine which is the PHD2 docking site of the NDRG3 protein in the amino acid sequence of the protein.
  • the present invention is an NDRG3 protein for use as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases or amino acids of any one or more of the 47th arginine, 66th asparagine or 296th valine which is the PHD2 docking site of the NDRG3 protein in the amino acid sequence of the protein
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a mutant substituted with this aspartic acid or a 97th glutamine substituted with glutamic acid, or a cell comprising the vector is provided.
  • the NDRG3 protein is preferably composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the vector is preferably, but not limited to, linear DNA, fulllasmid DNA, or recombinant viral vector.
  • the recombinant viral vector is any one selected from the group consisting of retroviruses, adenoviruses, hepes simplex viruses, and lentiviruses.
  • the cell is preferably any one selected from the group consisting of hematopoietic stem cells, dendritic cells and tumor cells, but is not limited thereto.
  • ectopic mutants of NDRG3 and NDRG3 mediated by lactic acid produced by hypoxia reaction complex with RACK1, PKC- ⁇ and c-Raf, and angiogenesis through the lactate-NDRG3-C-Raf-ERK signaling pathway Since it promotes, the NDRG3 or a mutant thereof, a vector encoding the mutant or a cell containing the vector can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • the present invention also provides the use of a protein or compound that inhibits the hydroxylation of the 294th plin site in the amino acid sequence of the NDRG3 protein for use as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • the ischemic disease is preferably any one selected from the group consisting of cerebral ischemia, cardiac ischemia, diabetic vascular heart disease, heart failure, myocardial hypertrophy, retinal ischemia, ischemic colitis, ischemic acute renal failure, stroke, brain trauma and neonatal hypoxia. It is not limited.
  • the NDRG3 mediated by the lactic acid produced by the hypoxia response increases the NDRG3 protein by inactivating the 294th plin, and promotes angiogenesis through the lactic acid -NDRG3-c-Raf-ERK signaling pathway.
  • a protein or compound that inhibits the hydroxylation of the 294th plin moiety in the amino acid sequence of may be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease.
  • Example 1 Preparation of a DRG3 Overexpressing Transgenic Mouse In order to confirm the effect of the expression of NDRG3 on the biochemical characteristics ⁇ NDRG3 overexpressing transgenic mice were constructed.
  • human NDRG3 cDNA sequence (SEQ ID NO: 1) as shown in the diagram of Figure la is a CAG-promoter (cytomegalovirus enhancer and chicken ⁇ ⁇ actin promoter) and Levit ⁇ -globin polya
  • the linearized construct was injected into the pronuclei of three C57 / BL6 mouse fertilized eggs.
  • the tails of each of the three C57 / BL6 mice were cut and mouse tail lysis buffer (60 mM Tris pH 8.0 / 100 mM EDTA / 0.5% SDS, 500 ug / ml Proteinase).
  • the genotype was confirmed by PCR using the primers of Table 1 below (Fig. Lb).
  • the transgenic mice overexpressing NDRG3 by genotyping by acquiring each of the F1 generation mice by mating with the normal mice and genotyping in the same manner as described above Lineages TG-2, TG-8 and TG-13 were established.
  • RT-PCR was performed using the primers of Table 1 above to confirm overexpression of NDRG3 in the NDRG3 overexpressing transgenic mice TG-2, TG-8 and TG-13 (FIG. Lc). ).
  • IPTG isopropyl-13-D-thiog lactoside
  • the strain was then centrifuged at 4,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C and resuspended with buffé 50 mM HEPES (pH 7.5) and 150 mM NaCl], followed by a 3 second pulse for 2 minutes in an ice bucket. Sonication and again centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C.
  • the recombinant protein was then purified according to the manufacturer's procedure via Ni-NTA agarose affinity chromatography using Ni-NTA agarose resin (Resin).
  • the purified human NDRG3 recombinant protein (amino acids 32-315) was then immunized with rabbitb (New Zealand White).
  • Antisera were purified by affinity chromatography using NDRG3 peptide (QNDNKSKTLKCS; amino acids 244-255, SEQ ID NO: 3) to obtain anti-NDRG3 antibodies.
  • NDRG3 peptide QNDNKSKTLKCS; amino acids 244-255, SEQ ID NO: 3
  • Western blotting was performed.
  • Myc-tagged NDRG1 expression vector Myc-tagged NDRG2 expression vector
  • Myc-tagged NDRG4 expression vector and Myc-tagged NDRG3 expression vector were cloned.
  • the Myc-tagged NDRG3 expression vector was used as a template, and the site-designated mutation was performed according to the manufacturer's procedure using the KOD—Plus-Mut agenesis kit (Toyobo) as the primer of Table 2 below. This was performed to obtain a Myc-tagged NDRG3 (N66D) variant in which the 66th asparagine (Asn, N) of NDRG3 was replaced with aspartic acid.
  • NDRGl-Myc, NDRG2-Myc, NDRG4—Myc and NDRG3 (N66D) -Myc were treated with DMEM containing io% FBS (Gibco BRL) and 100 U / ml penicillin (penici 11 in, Gibco BRL).
  • HEK293T cells (ATCC) cultured in medium were transfected using Lipofectamine (Invitrogen) according to the manufacturer's procedure. The transformed cells were then incubated for 24 hours in a 37 ° C0 2 incubator (Sanyo) and recovered.
  • the recovered cells were then lysed using lysine buffer 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 100 mM KC1, 20 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM EDTA, protease inhibitor cocktail (Roche)]. And lysate the cell protein lysate (30 g) with 9% SDS-PAGE, followed by nitrocellulose. Membranes were transferred to Cnitrocel lulose membranes (PALL Life Sciences). Then, after the obtained anti-NDRG3 antibody was treated with the primary antibody, the HRP-conjugated secondary antibody was attached to the primary antibody attached to the membrane, and confirmed by using ECL (Pierce chemical co, USA). 2).
  • the prepared anti-NDRG3 antibody binds only the NDRG3 (N66D) variants except NDRGl, NDRG2 and NDRG4, the anti-NDDRG3 antibody binds the NDRG3 antibody and variants to the antigen It was an antibody, and thus was used to confirm the molecular biological function of the NDRG3 of the present invention (Fig. 2).
  • HIF- ⁇ Hypoxia-inducible Factor-1 ⁇
  • Protein bands showing different immunoprecipitation patterns in the PHD2-Flag samples were then separated from SDS-PAGE gels and digested with trypsin for micro-LC-MS / MS analysis.
  • the digested protein was injected into a fused silica capillary column (100 mm inner diameter, 360 mm outer diameter) including a 5-mm particle size Aqua C18 reverse phase column of 8 cm.
  • the column was transferred to an Agilent HP 1100 4th IX pump and the peptide separated using a flow rate of 250 ⁇ ⁇ 2 / min as the separation system.
  • buffer A 5% acetonitrile and 0.1% formic acid
  • buffer B 8OT acetonitrile and 0.3 W formic acid
  • the eluted peptides were separated by electrospray method at 2.3 kV DC potential with LTQ linear ion trap mass spectrometer (Thermo Finnigan).
  • a data dependent scan consisting of one full MS scan (400-1400 m / z) and five data dependent MS / MS scans were used to generate the MS / MS spectra of the eluted peptides.
  • MS / MS spectra were then analyzed from the NCBI human protein sequence database using Bioworks version 3.1.
  • DTASelect was used to filter the search results, Xcorr values were applied to the different charge states of the peptide: 1.8 applied to single charged peptides, 2.5 applied to double charged peptides, 3.5 to tricharge Applied as peptide (FIG. 3B).
  • MCF-7 cell lysates transformed with the control and Flag-tagged PHD2 constructs were immunoprecipitated using anti-FLAG M2 affinity gel (Signia), followed by electrophoresis with 9% SDS-PAGE. And nitrocells were transferred to nitrocellulose membranes (PALL Life Sciences). next. After treatment with anti-NDRG3 antibody and anti-Flag antibody as the primary antibody, HRP 'conjugated secondary antibody was attached to the primary antibody attached to the membrane. This was confirmed using ECL (Pierce chemical co, USA) (Fig. 3c).
  • Immunoprecipitation and Western blotting to identify the effects of the interaction of NDRG3 and PHD2 as binding proteins of PHD2 and the interaction of PHD2 and NDRG3 in NDRG3 protein expression. And an in-vitro pull-down assay.
  • the cells were transformed into HeLa cells (ATCC) cultured and maintained at 1) oxygen for 24 hours, and then lysed. Cell lysates were then immunoprecipitated using anti-FLAG M2 beads. Western blotting was performed with anti-NDRG3 and anti-Flag antibodies as primary antibodies (FIG. 4A, above).
  • PHD2 was cloned into the pET-28a recombinant plasmid by the method described in Example 1, transformed into E.
  • NDRG3 was cloned into PGEX-4T-2 recombinant plasmid, transformed into E. coli strain BL21, and purified using GST-binding agarose resin (ELPIS BIOTECH, South Korea). Then, the recombinant protein His— PHD2 10 and / or recombinant protein GST-NDRG3 10 was The final concentration was 0.2 mg / ⁇ incubated for 4 hours at 4 ° C with Ni-NTA agarose resin (resin).
  • NDRG3 protein Although the basic expression level of NDRG3 protein was insufficient in HeLa cells, when the activity of PHD2 was inhibited by DFX, which is a PHD2 inhibitor in MCF-7 and HeLa cells, expression of NDRG3 protein was decreased. By confirming the weighting, it was confirmed that NDRG3 accumulates drug-dependently as PHD2 activity is inhibited, and that NDRG3 is an intrinsic substrate of PHD2 (FIGS. 4B and 4C).
  • the PHD family consists of PHDl, PHD2, PHD3, P4HTM and P4HA1, and these families are reported to play an important role in the regulation of HIF proteins (Wenger, RH et al., Curr. Pharm. Des., 2009 ( 15), 3886-3894). Therefore, in order to confirm the relationship between VHL and NDRG3, a target protein of the P3 family other than PHD2 and the E3 ubiquitin ligase complex, RNA and PHD knockdown cells and the PHD family are overexpressed. Cells were subjected to RT-PCR, immunoprecipitation and Western blotting.
  • s iVHU si GENOME SMARTpool, Dharmacon) and Samchully Pharmaceutical Korea to produce the siRNA using the sequence of the following [Table 3] and then transformed into HeLa cells according to the manufacturer's procedure using lipofectamine Switch to GFP, PHDl, PHD2, PHD3, Cells with inhibited expression of P4HTM, P4HA1 or VHL were obtained, and each of the expressed cells inhibited cells were recovered after maintenance culture under normal oxygen (21% 0 2 ) for 48 hours. Then, the recovered cells were isolated from total RNA using Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), And then reacted with the isolated RNA 5 transcriptase to synthesize cDNA. Visualization after electrophoresis with agarose gel (FIG.)
  • Flag-tagged PHDl Flag-tagged PHD2, Flag-tagged PHD3, Flag-tagged P4HTM and Flag-tagged P4HA1 expression vectors, and NDRG3 expression vectors to confirm the interaction of the NDRG3 protein with the PHD family
  • NDRG3 expression vectors to confirm the interaction of the NDRG3 protein with the PHD family
  • Each of the NDRG3 and the Flag-tagged PHD families was transformed with HeLa cells by the method described, treated with 20 ⁇ MG132 for 8 hours at steady state and then cells were harvested and lysed. Immunoprecipitated with anti-FLAG M2 beads and Western blotting was performed with anti-NDRG3 antibodies (FIG. 5B). As a result, as shown in FIG. 5A and FIG.
  • NDRG3 when the expression of PHD2 and VHL was suppressed by RA interference, NDRG3 was accumulated, and PHD2 was the main post-transcriptional in stabilization of NDRG3 protein in the PHD family group. It is a posttranslat ional regulator, and under normal oxygen conditions , NDRG3 is the target protein of ubiqutin, thus confirming that NDRG3 is the substrate of PHD2 / VHL-mediated post-transcriptional process (FIGS. 5A and 5B).
  • the protein-protein docking simulation of the predicted target protein was performed by HEX6.3 (DW Ritchie, et al., Genet, 2000 (39), 178-194).
  • shape and electrostatics were chosen as the correlation ion type and bumps and volumes were selected after the procedure. The remaining options used the default configuration (default conf igurat ion).
  • NDRG3-EGLN1 single target docking
  • the simulation was performed using the options listed above once. Docking for multiple target structures (ie NDRG3 and PHD2) was performed through two-step experiments. In the first step, NDRG3 was used as the receptor protein in the docking experiment for each target.
  • the resulting protein-protein interaction was used as a receptor protein for docking of other proteins.
  • the input order for the second experiment is PHD2. It was. Docking calculations were performed by root-mean-square deviat ion (RMSD) and the results were filtered where the output from a single input matched the output from multiple inputs. Among the filtered results, the most stable one was selected using the HEX6.3 total score (sum of shape scores and vestibular scores) (FIG. 6A).
  • a site-designated mutation was performed according to the manufacturer's procedure using the KOD-Plus-Mut agenesi s kit (Toyobo) using the NDRG3-Myc expression vector as a template.
  • Myc-tagged NDRG3 (R47D) variant in which the 47th arginine (Arg, R) of NDRG3 was replaced with aspartic acid (Asp, D), and Myc, which replaced 66th asparagine (Asn, N) of NDRG3 with aspartic acid.
  • -Tagged NDRG3 (N66D) variant, Myc-tagged NDRG3 (Q97E) variant replacing glutamic acid (Glu, E) with 97th glutamine (Gin, Q) of NDRG3, 296th valine (Val, V) of NDRG3 Myc-tagged NDRG3 (V296D) variants were obtained with aspartic acid. Then, as in ⁇ Example 3>, each of the Myc-tagged NDRG3 variants, Flag-tagged PHD2, and HA-tagged VHL constructs were simultaneously transformed into HEK293T cells (ATCC), and the transformation was performed. HEK293T cells were treated with 20 ⁇ MG132 for 8 hours and then lysed. The cell lysates were immunoprecipitated using anti-Myc affinity gel (Sigma), and Western blotting was performed using anti-Flag, anti-HA and Hansi Myc antibodies as primary antibodies (FIG. 6B).
  • the NDRG3 V296D) variant and the NDRG3 (Q97E) variant bind PHD2
  • the NDRG3 variant mutating the 47th or 66th position of NDRG3 does not bind PHD2
  • the 66th amino acid position was important for the docking of PHD2 and confirmed that it is also associated with VHL (FIG. 6B).
  • MG132 was used to inhibit proteasome activity and Western blotting and in vivo ubiquitination assay was performed.
  • a transfection vector (MSCV retrovirus system) was prepared using the full-length NDRG3 cDNA (SEQ ID NO: 1) and the pMSCVneo retrovirus vector (Clontech).
  • lipofectamine (Invitrogen) was used to transfect the GP293 cell line.
  • the cell supernatant containing NDRG3-retrovirus or control -retrovirus was treated with HeLa cells for 24 hours, such as 6 ⁇ g / m ⁇ polybrene, and then 8 hours for the cells overexpressed with NDRG3.
  • Cells were obtained after treatment with or without 20 ⁇ MG132, and Western blotting was performed using anti-NDRG3 antibody and anti- ⁇ -actin antibody (FIG. 7A).
  • ubiquitination assay was performed to confirm the ubiquitination of NDRG3 in the normal oxygen state.
  • shNDRG3 Sigma-Aldrich, SEQ ID NO: 4
  • lent ivirus vectors were used to inhibit the expression of NDRG3.
  • the vector for transfection was produced.
  • the packing cell lines were transfected as above.
  • the cell supernatant containing the NDRG3 shRNA expressing lentivirus was treated with HeLa cells with 6 ⁇ g / m polybrene and maintained in DMEM medium containing 10% FBS, followed by control HeLa cells.
  • HeLa cells with suppressed NDRG3 expression and HeLa cells overexpressed with NDRG3 were transformed with HA-tagged ubiquitin as described in Example 3, treated with 20 ⁇ MG132 for 8 hours, and then cells were obtained and lysed. It was. The cell lysate was then precleared with 30 ⁇ protein G-agarose beads (bead, Sant a Cruz Biotechnology) and immunoprecipitated with an anti-NDRG3 antibody, followed by daubiquitin. The polyubiquit inated form of NDRG3 was confirmed by western blotting using anti-HA antibody (FIG. 7B).
  • PHD2 Since the activity of PHD2 depends on the effectiveness of 0 2 , NDRG3 protein, a unique substrate of PHD2, can also be used for immunoprecipitation, Western blotting, and immunization using several cells with different oxygen states to determine whether oxygen status affects stability. Fluorescence and in vivo ubiquitination assays were performed.
  • MCF-7 cells cultured in DMEM medium containing 10% FBS and 100 U / ml penicillin were treated with 1%, 3%, 5% and 21% 0 2 and 92-94% N 2 and 5% C0. after 2 using a 0 2 / C0 2 incubator with a gas mixture consisting maintained over time, thereby obtaining the cells, and then, the ⁇ example 3> to dissolve the cells, such as, and wherein the cell lysate - NDRG3 and anti- Western blotting using ⁇ -actin confirmed the expression of NDRG3 and graphed it (FIG. 8A).
  • a mixed gas consisting of 1% 0 2 and 94% N 2 and 5% C0 2 for MCF-7 cells cultured in cover slips with DMEM medium containing 10% FBS and 100 U / ml penicillin Using a 0 2 / C0 2 incubator containing a hypoxic state was maintained over time. 4) fixed with paraformaldehyde / PBS for 20 minutes, infiltrated with 0.3% TritonX-100 / PBS for 5 minutes at room temperature, followed by blocking solution (PBS with 1% BSA). Incubate for 30 minutes.
  • the cells were then reacted with anti-NDRG3 antibody (1 / 1,000) for 1 hour at room temperature and washed, followed by secondary antibody [Alexa Flour 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (1 / 1,000), or Alexa Flour 594-conjugated goth anti-mouse IgG (1 / 1,000); Amersham] and DAPI (3 ⁇ , Sigma). Then visualized using a Zeiss LSM 510 confocal microscope (FIG. 8B).
  • MCF-7 (breast), PLC / PRF / 5 liver), Huh-1 (liver), HeLa (uterine cervix), HEK293T (cultured in DMEM medium containing 10% FBS and 100 U / ml penicillin) Renal) and MCF-10A (breast) cells and SM80 colon and cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FBS and 100 U / ml penicillin) and IMR-90 lung) were prepared using an O2 / CO2 incubator as described above. After keeping in hypoxic state (1% 0 2 ) over time, cells were obtained.
  • the cells were lysed as in ⁇ Example 3> and the cell lysates were Western blotting using anti—NDRG3 and anti- ⁇ -actin to confirm the expression of NDRG3 and graphed (FIG. 8C).
  • in vivo ubiquitination assay was performed to confirm the ubiquitination of NDRG3 in the hypoxic state.
  • HA-tagged ubiquitin and Myc-tagged NDRG3 were transformed into HeLa cells as in ⁇ Example 3>, and then cultured in normal oxygen for 40 hours and treated with 20 ⁇ MG132 for 8 hours. next. After incubation in hypoxic state (1% 0 2 ) for 24 hours, cells were obtained and lysed. The cell lysate was then precleared with 30 ⁇ protein G-agarose beads (Sad Cruz Santa Biotechnology), followed by immunoprecipitation with anti-Myc antibody, and Western blotting with anti-HA antibody. (FIG. 8D).
  • FIG. 8D it was confirmed that the NDRG3 protein decreased ubiquitination under the hypoxic state (FIG. 8D).
  • FIG. 8D it was confirmed that the increase in the accumulation of NDRG3 protein under hypoxic conditions, unlike the normal oxygen conditions through the results, and ubiquitination is reduced.
  • MCF-7 cells and normal oxygen maintained for 24 hours in a hypoxic state (1% 0 2 ) as shown in Example ⁇ 5 ⁇ 1> in order to confirm the expression change of the NDRG3 protein when recovering to normal oxygen state
  • MCF-7 cells were maintained and cultured with time in state (21% 0 2 ), and lysed as in ⁇ Example 3>, followed by anti-NDRG3, anti-HIF-la and anti- ⁇ -actin antibodies.
  • Western blotting and graphing FIG. 9B).
  • LC-MS / MS analysis was performed, and Western blotting was performed using cells overexpressing NDRG3 variants prepared with site-directed mutations. In addition, immunoprecipitation and Western blotting were performed to confirm the relationship between the hypoxic target site of NDRG3 protein and PHD2 / VHL under normal oxygen.
  • NDRG3 P294A variants Myc-tagged by performing site-directed mutations as in Example ⁇ 4-3> to replace the 294th plin (Pro, P), which is expected to be the NDRG3 protein target site, with alanine (Al a, A) NDRG3 P294A variants were constructed. Then, the NDRG3 variant or wild-type NDRG3 construct was transformed into HEK293T cells as in ⁇ Example 3>, and then cultured under normal oxygen (21% 0 2 ) for 40 hours and 20 ⁇ l for an additional 8 hours. Cells treated with ⁇ 132 and untreated cells were obtained. After the obtained cells were lysed, Western blotting was performed using anti-Myc and anti- ⁇ -actin antibodies (Fig. 10b, above).
  • Fl ag-tagged PHD2, HA-tagged VHL, and Myc-tagged NDRG3P294A variant or Myc-tagged NDRG3 were simultaneously transformed into HEK293T cells as in ⁇ Example 3> for 40 hours.
  • Cells were obtained by incubating under normal oxygen (21% 0 2 ) and treating 20 ⁇ MG132 for an additional 8 hours. Then, the obtained cells were lysed and then surface-precipitated with anti-Myc affinity gel, and Western blotting was performed using anti-Fl ag, anti-HA, and anti-Myc antibodies (FIG. 10b, bottom).
  • Example ⁇ 5-2> steady state oxygen (21% 0 2), such as to ensure the expression of HIF protein of the oxygen status cultured MCF-7 cells, and hypoxia (1 % 02), after recovering the MCF-7 cells maintained and maintained by the time, half were Western blot using anti-HIF-la, anti-HIF-2a and anti- ⁇ -actin as in ⁇ Example 3>. Routing was performed to confirm the expression of the protein, and half performed RT-PCR as in Example ⁇ 4-2> to confirm the expression of the mRNA (FIG. 11A).
  • PLC / PRF / 5 cells Treated with PLC / PRF / 5 cells with polybrene, maintained in DMEM medium containing 10% FBS, and then inhibited control PLC / PRF / 5 cells, the HIF-la or HIF-2a expression.
  • PLC / PRF / 5 cells were treated with PHD2 inhibitor DFX (desferrioxamine) 1 mM over time under normal oxygen (21%), and cells were obtained and lysed as in ⁇ Example 3>.
  • MCF-7 HIF-1 + / + and VHL + / +
  • HIF-1 ⁇ and VHL loci loci
  • 786-0 HIF-r / _ and VHL _ / _
  • hypoxia 1% 0 2
  • Cells were harvested and lysed as described above, and the cell lysates were subjected to western blotting using anti-NDRG3, anti-HIF-la and anti- ⁇ -actin (FIG. 11C).
  • microarra ⁇ based transcriptome data were analyzed using the Gene Set Analyzer (GAzer) assay using cells in which NDRG3 expression was suppressed. Expression profiling was performed.
  • Huh-7 in which expression of NDRG3 or HIF-1 ⁇ was suppressed by the method described in Examples ⁇ 4 ⁇ 4> and ⁇ 5-4> using shNDRG.3 and shHIF-l ci.
  • the cells were maintained and cultured at a time of hypoxia (13 ⁇ 4 0 2 ) as in Example ⁇ 5-2>, and the cells were recovered.
  • total RNA was isolated from the recovered cells using an RNA isolation kit (RNeasy midi-prep, Qiagen) according to the manufacturer's procedure.
  • NDRG3 deletion showed statistically significant expression change in the functional gene group under 24 hours hypoxia, and hypoxia function most affected by NDRG3 deletion was angiogenesis.
  • hypoxia function most affected by NDRG3 deletion was angiogenesis.
  • cell proliferation while glycolysis is one of the least relevant functions.
  • hypoxia function was glycolysis, whereas angiogenesis and cell proliferation were found to be less related (FIG. 12A).
  • Example ⁇ 4-4> Huh_7 (2X10 5 cells / ml) and control Huh-7 cells in which NDRG3 expression was suppressed using shNDRG3 by the method described in Example ⁇ 4-4> were subjected to hypoxia (1% 0 2 ) for 24 hours. Cultures (1 ml) were collected and cultured for 6-12 hours in a 6-well dish coated with Matrigel with HUVEC human umbilical vein endothelial cells (lxi0 5 cells / ml). Tube formation was observed (FIG. 13A).
  • NDRG3 deletion obtained by the method described in Example ⁇ 6-1> to confirm the expression of angiogenesis markers IL8, IL1 ⁇ and ⁇ , C0X-2 and PAI-1 due to NDRG3 deletion in hypoxic state Huh-7 cells and control Huh-7 cells were maintained in culture for 24 hours under normal oxygen (21% 0 2 ) or under hypoxic (1% 0 2 ) and then cells were recovered.
  • the NDRG3 (N66D) variant prepared by the method described in Example ⁇ 4-3> was transformed into HeLa cells as described in ⁇ Example 3>, and the cells were recovered after maintenance for 24 hours under normal oxygen. It was.
  • RNA was isolated and RT-PCR was performed by the method described in Example ⁇ 4-4>.
  • expression of NDRG3 was confirmed by Western blotting of each of the cells using the anti-Nov NDRG3 antibody as in ⁇ Example 3>.
  • a matrigel plug assay was performed for in vivo angiogenesis analysis by NDRG3 deletion.
  • cold Matrigel (BD Biosciences) were combined with NDRG3 deleted Huh-7 cells (1 ⁇ 10 6 cells / ml) and control Huh-7 cells (lxiO 6 cells / ml) obtained by the method described in Example ⁇ 6-1> above.
  • the mixed Matrigel 500 i was then subcutaneously injected into the abdominal region of 6 week old female BALB / c mice (Japan SIX).
  • mice were sacrificed and Matrigel plaques were obtained, homogenized with 500 ⁇ water in a bucket of hemoglobin quantification and washed by centrifugation at 12,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. Then, only the supernatant was separated, and then reacted according to the manufacturer's procedure using Drabkin's reagent (Sigma) and graphed by measuring the absorbance at a wavelength of 570 nm with an absorbance spectrophotometer (FIG. 13C).
  • Drabkin's reagent Sigma
  • NDRG3 In order to confirm the effect of NDRG3 on cell proliferation among the highly related functions of NDRG3 in hypoxia confirmed by the analysis of ⁇ 6-1>, cell growth was analyzed by ⁇ assay and transplanted in vivo. Tumor volume was measured and immunofluorescence staining, western blotting and RT-PCR were performed.
  • ⁇ assay was performed to confirm cell growth due to NDRG3 deletion.
  • NDRG3, HIF-1 ⁇ , HIF-2 ⁇ , NDRG3 and HIF prepared by the methods described in Examples ⁇ 4-4> and ⁇ 5-4> to confirm the degree of tumor formation due to NDRG3 and HIF deletion.
  • Huh-7 cells (2 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ ) that inhibited ⁇ 1 ⁇ , or NDRG3 and HIF-2 ⁇ expression were administered subcutaneously to the 6 week old female BALB / c mouse flank (FIG. 14B).
  • the NDRG3 (N66D) mutant produced by the method described in Example ⁇ 4-3> was transformed in the same manner as in ⁇ Example 3> to the Huh-1 cells (2X10 6 cells / 100 ⁇ ) as described above. Administration was subcutaneously in the flank (FIG. 14C). Then, images were compared to compare tumor size on Days 16 and 20, respectively (FIG. 14B and FIG. 14C).
  • mice transplanted with NDRG3, HIF-1 ⁇ , HIF-2 ⁇ , NDRG3 and HIF-1 ⁇ , or Huh-7 cells with suppressed NDRG3 and HIF-2 ⁇ expression (FIG. 14D) and the NDRG3 (N66D) Tumor volume was measured using a caliper at a given time after transplantation in mice transplanted with Huh-1 cells overexpressing the mutant (FIG. 14E). Tumor volume was graphed by measuring length (a), width (b) and height (c) as shown in Equation 1 below (FIGS. 14D and 14E).
  • mice transplanted with Huh-7 cells (2X10 6 cells / 100 ⁇ ), which inhibited the expression of NDRG3, HIF-la, and HIF-2a 10% formalin at Fixed for one day. Then paraffin (par inf fin) was treated and sectioned 4 m.
  • mice transplanted with Huh-7 cells (2 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ ) that inhibited the expression of NDRG3, HIF-1 a and HIF-2 a were extracted and frozen with liquid nitrogen.
  • RT-PCR was performed to confirm the expression of mRNA by the method described in Example ⁇ 4x2>, and Western-anti-NDRG3 and anti- ⁇ -actin antibodies were assayed by the method described in ⁇ Example 2>. Blotting was performed to confirm the expression of the protein (FIG. 14G).
  • mice transplanted with NDRG3-inhibited cells ' is suppressed over time compared to the control and mice transplanted with HIF-expressed cells, particularly.
  • mice transplanted with NDRG3 and HIF-l a or-2 a co-deleted cells it was confirmed that no tumor was generated (FIGS. 14B and 14D).
  • mice transplanted with cells overexpressing the NDRG3 (N66D) mutant in which the docking site of PHD2 was mutated increased significantly compared to the control group, especially in the control group until 20 days after transplantation, whereas NDRG3 ( N66D) mutant overexpressing cell transplantation mice by confirming that the tumor size increases up to about 900 ⁇ 3 , it was confirmed that tumor growth is promoted by the NDRG3 (N66D) variant (Fig. 14b to 14e).
  • NDRG3 plays an important role in promoting angiogenesis and cell proliferation in persistent hypoxia.
  • Example ⁇ 5-2> a normal oxygen state (21%) or maintained in a hypoxic state (1% 0 2 ) as described in Example ⁇ 5-2> above.
  • the cells were harvested and lysed as in ⁇ Example 3>.
  • the cell lysates were then subjected to Western blotting using anti-NDRG3, anti-HIF-la and anti- ⁇ -actin, followed by manufacturer's procedure using EnzyChromTM L-Lactate Assay Kit (BioAssay Systems). L-Lactate production was measured and graphed accordingly. Values were normalized to L-lactic acid standard curve (FIG. 15A).
  • MCF-7 cells were treated with sodium oxamate, a concentration of lactate dehydrogenase A (LDHA) inhibitor, by concentration. After the maintenance culture for 24 hours in a hypoxic state (1% 0 2 ), and the cells were recovered and lysed as in ⁇ Example 3>. Then, Western blotting was performed using anti-NDRG3, anti-HIF-la, and anti- ⁇ -actin as described above, and L-Lactate production was measured and graphed. Values were normalized to L-lactic acid standard curve (FIG. 15B).
  • LDHA lactate dehydrogenase A
  • Example ⁇ 4-2> LDHA using siLDHA (si GENOME SMARTpool, Dharmacon) or siMCT4 (si GENOME SMARTpool, Dharmacon) by the method described in Example ⁇ 4-2> to determine the effect of L-lactic acid production on NDRG3 protein expression Or monocarboxylate involved in lactic acid export (monocarboxy late)
  • MCT4 monocarboxylate involved in lactic acid export
  • MCF-7 cells were treated with concentration of 2-deoxyglucose (2-DG) that inhibits glycolysis by concentration and the above Examples ⁇ 5- 2> after 24 hours maintenance culture in a hypoxic state (1% 0 2 ), and recovering and lysing these cells as in ⁇ Example 3> and Western using anti-NDRG3 and anti - ⁇ -actin Blotting was performed (FIG. 15D).
  • 2-DG 2-deoxyglucose
  • a Flag-tagged LDHA expression vector was prepared, and then transformed into HeLa cells as in ⁇ Example 3> and normal oxygen state (21% 0 2 ) It was kept incubated for 24 hours under. Then, additionally treated with 50 mM pyruvate and maintained in light hypoxia (3% 0 2 ) for 24 hours, cells were recovered and lysed, and anti-NDRG3, anti-Flag and anti- ⁇ - Western blotting was performed using actin (FIG. 15E).
  • in vitro ubiquitin assay was performed to confirm the effect of lactic acid production on the ubiquitination of NDRG3.
  • Flag-tagged PHD2 and HA-tagged VHL were transformed into HEK293T cells as in ⁇ Example 3>, and the cells were recovered and lysed. Subsequently, the protein lysate 500 was reacted for one day at 4 ° C. using an anti-HA affinity gel (Sigma) or an anti-Flag affinity gel (Sigma) and centrifuged to obtain recombinant PHD2 proteins or VHL proteins. It was.
  • 4 ug 500 ng ubiquitin-active enzyme (Ubiquit in one act ivat ing enzyme; El, Upstate), 1 g ubiquit in—conjugat ing enzyme; E2 (UbcH5a), Upstate), 50 ⁇ solution containing 2.5!
  • Ig Ubiquitin I Flag (Sigma), 20 mM HEPES (pH 7.3), 5 mM MgC12, 1 mM DTT, and 2 mM ATP was reacted at 37 ° C for 1 hour. Next, the mixture is GST-linked After incubating for 4 hours at 4 ° C with agarose resin, the precipitate was washed and Western blotting was performed using anti-Flag as in ⁇ Example 3> (FIG. 15F).
  • NDRG3 variant recombinant protein was prepared using NDRG3 recombinant protein and site-directed mutation and used in-vitro binding assay. ) ; Immunostaining and western blotting were performed.
  • Example ⁇ 4-1> pGEX-4T-2-NDRG3 cloned by the method described in Example ⁇ 4-1> to confirm the interaction between L-lactic acid and NDRG3 protein as a template 4] using the primer of [4-3]
  • the site-specific mutation was carried out as shown in Example ⁇ 4-3> Glycine (Glycine, G), the 138th amino acid in the L- lactic acid binding site of NDRG3 to tryptophan (W)
  • G138W Substituted pGEX-4T-2-NDRG3 variant constructs were obtained.
  • the recombinant plasmid PGEX-4T-2—NDRG3 wild type and -NDRG3 (G138W) were transformed into E. coli strain BL21, and GST-binding as in ⁇ Example 2>. Purification using agarose resin. Then, after electrophoresis with 9% SDS-PAGE as in ⁇ Example 3>, stained with Coomassie Brilliant Blue to confirm the detection, and to confirm the expression of the recombinant protein, anti-GST and anti-NDRG3 antibodies Western blotting was performed using (Fig. 16a).
  • NDRG3 bound agarose resin was transferred to a flash solution containing 2 ra ⁇ LSC-cocktails (PerkinElmer) and graphed by measuring 1 4 C values (FIG. 16B, left also GST, the GST-NDRG3 recombinant protein ( 50 ⁇ g) or the GST-NDRG3 (G138W variant recombinant protein (50 g) was reacted with 0.5 u Ci of L- [ 14 C] _lactic acid (PerkinElmer) for 1 hour at 30 ° C. 14 C values were measured and graphed (FIG. 16B, right).
  • the NDRG3 variant was prepared to confirm the interaction with the binding site of L-lactic acid and NDRG3 protein in the hypoxic state.
  • site-directed mutations were performed as in Example ⁇ 4-3>.
  • Myc-NDRG3 (D62L) variant in which the aspartic acid (Asp, D), the 62nd amino acid of NDRG3, was replaced with leucine (Leu, L), and the glycine, the 138th amino acid, of the L-lactic acid binding site of NDRG3.
  • the -NDRG3 (A139E) variant and the Myc-NDRG3 (Y229P) variant in which the 229th amino acid tyrosine (Tyr, Y) of the L-lactic acid binding site of NDRG3 were replaced with prine (Pro, P) were obtained.
  • each of the Myc-NDRG3 and Myc-NDRG3 variants was transformed into HEK293T cells as in ⁇ Example 3>, followed by normal oxygen state (21% 0 2 ) as in Example ⁇ 5-2>, the hypoxic (1% 02), or 20 ⁇ after MG132 treatment maintained for 24 hours under hypoxia (1% 0 2) and the cell culture was collected and dissolved.
  • the cell lysates were then subjected to Western blotting using anti-Myc and anti- ⁇ -actin antibodies (FIG. 16C). : ⁇
  • MCF-7 cells were maintained in the hypoxic state (1% 0 2 ) for 24 hours in order to confirm expression with NDRG3 protein when the hypoxic state was restored to normal oxygen state, and then replaced with fresh medium and further normal oxygen state. incubated over time under maintained (21% 0 2) and recovering and dissolving the cells, such as the ⁇ example 3>. The cell lysates were then subjected to Western blotting using anti—NDRG3, anti-HIF-la and anti- ⁇ ⁇ -actin antibodies (FIG. 16D).
  • the HIF-la protein is rapidly removed upon reoxygenation, whereas NDRG3 is in a hypoxic state.
  • NDRG3 protein accumulated by lactic acid complex was confirmed to remain stable in the cell even when restored to normal oxygen state (FIG. 16D). Therefore, the results of the ⁇ Example 7> confirmed that the hypoxic-induced lactic acid acts as a sensor of the company in the persistent hypoxic reaction to promote HIF-independent biological reaction by NDRG3.
  • Lactic acid from hypoxia - In order to confirm the effect NDRG3 is on in the dependent cell growth ", NDRG3 variants and ⁇ assay, colony formation assay by lactic acid generated using a suppressor cells (colony forming assay) and in vivo (in vivo) 'The volume of the transplanted tumor was measured and performed.
  • an isotropic variant NDRG3 (N66D) expression vector was expressed in Huh-1 as in Example ⁇ 4-3>.
  • cells were cultured in 96-well plates with Huh-1 cells and the NDRG3 (N66D) variant overexpressing Huh-1 cells 1,000 cells / well, treated with sodium oxamate at different concentrations, and in a mild hypoxic state (3 % 0 2 ) was maintained incubated with time.
  • a mild hypoxic state (3 % 0 2 ) was maintained incubated with time.
  • the 3 ⁇ 4 ⁇ assay as in Example ⁇ 6-3> (Fig. 17a).
  • colony formation assays were performed to determine the effect of ectopic variant NDRG3 (N66D) on cell growth after lactic acid production inhibition.
  • 6-well plates were inoculated with Huh-1 cells and the NDRG3 (N66D) variant overexpressing Huh-1 cells 0.5 ⁇ 10 4 cells / 2, followed by treatment or no treatment with sodium oxamate 40 mM and normal oxygen (21% 0 2 ) were incubated for 10 days with dilution with fresh medium every 3 days. Colonies formed after 10 days of culture were identified and fixed with 100% methyl alcohol, followed by staining with 30% Gimsa stain solut ion (Sigma) (FIG. 17B).
  • a ⁇ assay was performed to confirm the effect of ectopic variant NDRG3 (N66D) on cell growth.
  • LDHA by the method described in Example ⁇ 4-4> was performed.
  • the NDRG3 (N66D) variant expression vector was obtained as in ⁇ Example 3>.
  • LDHA deletion and NDRG3 (N66D) variant overexpressing Huh-1 cells were obtained.
  • control GFP-deleted Huh-1 cells, the LDHA-deleted Huh-1 cells and the LDHA-deleted / NDRG3 (N66D) overexpressing Huh-1 cells were incubated at 1, 000 cells / well in 96-well plates, and in a light hypoxic state. (3% 0 2 ) was maintained incubated with time. Then, to confirm cell growth, graphs were performed by performing the MTT assay as in Example ⁇ 6-3> (FIG. 17C).
  • the tumor volume was measured after transplantation of tumor cells in mice to determine the effect of ectopic variant NDRG3 (N66D) on cell growth after inhibition of lactic acid production by LDHA deletion in vivo.
  • the control GFP deleted Huh-1 cells, the LDHA deleted Huh-1 cells and the LDHA deleted / NDRG3 (N66D) overexpressing Huh-1 cells were transplanted into BALB / c mice by the method described in Example ⁇ 6-3>. Then, at a given time, the tumor volume was measured and graphed using a caliper (FIG. 17D).
  • Hum-1 cells and the NDRG3CN66D variant overexpression Huh-1 cells were treated with or without 40 mM sodium oxamate. After maintenance and cultivation in a light hypoxic state at time, cells were recovered and lysed as in ⁇ Example 3>. The cell lysates were then subjected to western blotting using anti-NDRG3 and anti- ⁇ -actin antibodies (FIG. 17E).
  • Huh-1 cells and NDRG3CN66D which were treated or treated without sodium oxamate and maintained in a light hypoxic state for hours, in order to confirm the effect of the ectopic variant NDRG3 (N66D) on lactic acid production under continuous hypoxia.
  • Variant overexpressing Huh-1 cells were harvested and graphed by measuring L-Lactate production by the method described in Example ⁇ 7-1>. Values were normalized to L-lactic acid standard curve (FIG. 17F).
  • FIGS. 17A to 17D when sodium oxamate was treated in a hypoxic state, cell growth was inhibited in a concentration-dependent manner, while sodium oxamate was treated in a hypoxic state when an ectopic variant of NDRG3 was overexpressed. Cell growth was confirmed to increase (FIG. 17A). Hypoxic NDRG3 ectopic variant was over-expressed even in normal oxygen condition, Similarly, tumor growth was confirmed to be accelerated (FIG. 17B).
  • NDRG3 NDRG3 variant ectopic variant overexpressing cells.
  • Example ⁇ 6-2> the control cells and the NDRG3 (N66D) variant overexpressing Huh-1 cells were treated with or without sodium oxamate and hypoxic (1% 0 2 ) after 24 hours of maintenance culture, the cells were recovered as in Example ⁇ 6-2> and a tube formation assay was performed (FIG. 18).
  • FIG. 18 As a result, as shown in FIG. 18, when sodium oxamate was treated to inhibit lactic acid production, angiogenesis was suppressed in a hypoxic state, whereas when NDRG3 ectopic variant was overexpressed, angiogenesis was suppressed even when lactic acid production was suppressed.
  • NDRG3 is an important mediator for lactic acid-induced angiogenesis in persistent hypoxia (FIG. 18). Therefore, lactic acid is an important signal for hypoxic cell proliferation and angiogenesis through the results of Example 8, and NDRG3 is an important mediator of lactic acid-induced cell proliferation and angiogenesis in a persistent hypoxic state. It was confirmed to work.
  • Example ⁇ 4-4> After preparing GFP or NDRG3 deleted PLC / PRF / 5 cells using the control group shGFP or shNDRG3 by the method described in Example ⁇ 4-4>, the cells were stored under hypoxic state (1% 0 2 ). The cells were maintained for a period of time and recovered as in ⁇ Example 3>. Then, the phosphorylated protein was identified according to the manufacturer's procedure using the human phosphorylation-kinase array kit (Human Phosph Kinase Array kit) (FIG. 19A).
  • the prepared cells were maintained in a hypoxic state for 24 hours, and the cells were recovered and lysed as in ⁇ Example 3>, and anti-NDRG3, anti-phosphorylation ⁇ c-Raf (S338), anti-c- Western blotting was performed using Raf, anti-phosphorylation-B—RAFKS445), anti-B-RAF1, anti-phosphorylation-A-RA S299), anti-A-RAF and anti-actin antibodies (FIG. 19C). , under) .
  • Example ⁇ 4-1> the purified recombinant proteins c-Raf-Hi s and NDRG3-GST were reacted with Ni-NTA agarose resin to perform Hi s pull-down.
  • Western blotting was performed using an anti-NDRG3 antibody as in ⁇ Example 3> (FIG. 19D, left).
  • Fl ag-tagged c-Raf expression vector HeLa cells were transformed as in the Flag-tagged c-Raf bag.
  • the Flag-c-Raf overexpressed HeLa cells were maintained in a hypoxic state (1 ⁇ 2 0 2 ) for 24 hours, followed by immunoprecipitation using anti-FLAG M2 beads, and Western blot using anti-NDRG3 antibody. Routing was performed (FIG. 19D, right).
  • SK-HEP-1 cells with suppressed expression of NDRG3 were prepared using the control shGFP or shNDRG3 by the method described in Example ⁇ 4-4>.
  • NDRG3 deletion / c-Raf overexpressing cells were obtained by transformation as in ⁇ Example 3> using a tagged c-Raf expression vector.
  • NDRG3 (N66D) and c-Raf overexpressing HE 293T cells were obtained by transformation as described in ⁇ Example 3> using Myc-tagged NDRG3 (N66D) and Fl ag-tagged c-Raf expression vector. .
  • the cells were maintained in a normal oxygen state (21% 0 2 ) for 24 hours, and the cells were recovered and lysed as in ⁇ Example 3>, followed by anti-NDRG3, anti-phosphorylation -c-Raf ( S338), anti-c-Raf, anti-phosphorylated -B-RAFKS445), anti-B-RAF1, anti-phosphorylated -ERK1 / 2, anti-ERK1 / 2 and anti- ⁇ -actin antibodies was performed (FIG. 19E).
  • in vitro kinase assay was performed using [Y-32P] -ATP (PerkinElmer) label to confirm phosphorylation by NDRG3 in hypoxic state.
  • HEK293T cells transformed with Myc-tagged NDRG3 (N66D) expression vector were prepared as in ⁇ Example 3>, and then NDRG3 protein was immunoprecipitated using an anti-Myc affinity gel. Subsequently, the immunoprecipitated NDRG3 complex was subjected to radiolabeling and treated or untreated with the PKC inhibitor PKC-I 5 ⁇ and included in 40 ⁇ reaction buffer PKC activity buffer and SignaTECT protein kinase C assay kit (Promega).
  • PKC coactivation buffer 10 [ ⁇ -32 ⁇ ] - ⁇ of uCi, and 2 / g of purified c—Raf-GST recombinant protein] were reacted at 30 ° C. for 1 hour.
  • the reaction mixture was then electrophoresed with 8% SDS-PAGE and 32 P-labeled c-Raf was detected by autoradiography (FIG. 19F).
  • MCF-7 cells were maintained for 24 hours under normal condition (21% 0 2 ) to confirm the lactic acid dependence of NDRG3-mediated molecular pathway activity in the hypoxic state, and Example 7-1 above.
  • LDHA expression-inhibited MCF-7 cells obtained by the method described in the above, cells treated with or without sodium oxamate were maintained in a hypoxic state (1% 0 2 ) for 24 hours. Then, after recovering and lysing the cells as in Example 3, anti-NDRG3, anti-phosphorylation -c-Raf (S338), anti-c-Raf, anti-phosphorylation -ERK1 / 2, anti-ERK1 Western blotting was performed using / 2 and anti- ⁇ -actin antibody (FIG. 19G).
  • Figs. 19A to 19D when NDRG3 is deleted, phosphorylation of ERK1 / 2 is decreased in a persistent hypoxic state (Figs. 19A and 19C, above), and the expression of NDRG3 protein in normal oxygen state is decreased.
  • FIG. 19B By confirming that the phosphorylation level of ERK1 / 2 differs in proportion to the expression level of NDRG3 protein in different cell types (FIG. 19B), it was confirmed that NDRG3 activates ERK1 / 2 in persistent hypoxic reaction.
  • FIGS. 19E and 19F when the ectopic variant of NDRG3 (N66D) is overexpressed, phosphorylation of ERK1 / 2 and c-Raf is induced even in the normal oxygen state (FIG. 19E), and the NDRG3 heterotopic variant molecule is also expressed in vitro. It was confirmed that the host complex mediated phosphorylation of the recombinant c-Raf protein (FIG. 19F).
  • RACK1 is a scaffold protein for PKC. It is well known for maintaining active conformat ions (Lendahl, U. et al., Nat. Rev. Genet., 2009 (10)). , 821-832), PKC is c-Raf. Phosphorylation and activation have been reported (Epstein, A. C. et al., Cell, 2001 (107), 43-54, Mahon, P. c. Et al., Genes Dev, 2001 (15), 2675-2686).
  • NDRG3 and / or Flag-tagged RACK1 expression vector was transformed into HeLa cells as in ⁇ Example 3> and under normal oxygen state (21 ⁇ 3 ⁇ 40 2 ) After 20 ⁇ M MG132 was incubated for 8 hours, the cells were recovered and lysed and immunoprecipitated using anti-FLAG M2 beads. Then, Western blotting was performed using an anti-NDRG3 antibody to confirm NDRG3 bound to RACK-1 (FIG. 20A).
  • NDRG3 (N66D) overexpression and / or RACK1 deletion HeLa using Myc-NDRG3 (N66D) expression vector and / or siRACKKsiGENOME SMARTpool, Dharmacon to confirm the relationship between proteins involved in NDRG3 kinase pathway in hypoxic state After the cells were prepared and maintained in hypoxic condition (1% 0 2 ) for 24 hours, the As in ⁇ Example 3>, immunoprecipitation was performed using an anti-Myc affinity gel and Western blotting was performed using an anti-PKC- ⁇ antibody (FIG. 20C).
  • HeLa cells were treated under the fixed oxygen state (21% 0 2 ), or PKOCGO which is a PKC inhibitor; GO 6976) 1 ⁇ or PKOKLY; LY333531) treated with 5 ⁇ M and maintained in a hypoxic state (1% 02) for 24 hours, and then the cells were recovered and lysed as shown in ⁇ Example 3>, and anti-phosphorylation -ERK1 / 2 and anti-ERK1 / Western blotting was performed using 2 antibodies (FIG. 20D).
  • the Fl ag ⁇ c-Raf and Flag-RACKl expression vector, and / or Myc-NDRG3 (N66D) expression vector were used in the above ⁇ Example HEK293T cells were transformed as shown in 3>, and the cells were recovered and lysed for 24 base acids under normal oxygen. Subsequently, immunoprecipitation was performed using anti-Myc affinity gel followed by electrophoresis with SDS-PAGE, followed by Western blotting using anti-Flag, anti-Myc and anti-PKC- ⁇ antibodies (FIG. 20E). .
  • Example ⁇ 4-3> protein docking simulations were performed as in Example ⁇ 4-3>. Docking for multiple target structures (ie NDRG3, RAF1, RACKKGNB2L1) and PKC- ⁇ ) was performed through a two-step experiment. In the first step, NDRG3 was used as the receptor protein in the docking experiment for each target. In the second step, the resulting protein-protein interactions were used as receptor proteins for docking of other proteins. The input order for the second experiment was c-Raf, RACK1 and ⁇ .
  • the docking calculation was handed by root-mean-square devi at ion (RMSD) and the results were filtered where the output from a single input matched the output from multiple inputs. In the filtered results increment, the most stable one was selected using the HEX6.3 total score (sum of shape scores and vestibular scores) (FIG. 20f, above), and also the following sequence of steps for protein structure modeling.
  • RMSD root-mean-square devi at ion
  • FIG. 20c shows that NDRG3 interacts with RACK1 and PKC- ⁇ in the hypoxic state to promote c-Raf-ERK phosphorylation (FIGS. 20A-20D).
  • NDRG3 is present in the cell complexed with c-Raf, RACK1, and PKC- ⁇ as shown in Figs. 20E and 20F (Fig. 20E), NDRG3-c through docking shunting and protein structure modeling.
  • the flexibility of -Raf ⁇ RACK1-PKC— ⁇ quaternary complex formation was confirmed (FIG. 20O.
  • NDRG3 interacts with RACK1, thereby inducing NDRG3-RACK1 complexes.
  • 3 is phosphorylated, thus confirming that NDRG3 regulated by lactic acid is the scaffold protein of c-Raf and RACK1.
  • NDRG3 overexpressing transgenic C57 / BL6 mice 40 mice and control mice (32) prepared to overexpress the NDRG3 gene as a whole by the method described in Example 1 above. Tumors were determined by stages up to 24 months and then graphed using a tumor-free Kaplan Meier assay. (FIG. 21A).
  • lymph nodes, spleen, and liver tissues were extracted from the NDRG3 overexpressing transgenic mice and control mice, and then fixed at room temperature with 1 formalin for 1 day.
  • the immobilized tissue was then treated with paraffin and sectioned at 4 ⁇ and then transferred to silanylated slides (Histoserv).
  • the sectioned tissue slides were treated with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) for antigen retrieval and heated at 10 CTC for 2 minutes.
  • the slides are then cooled and treated with 3% hydrogen peroxide / PBS for 5 minutes to inactivate tissue intracellular peroxidase, followed by 10% non-immune Mau ⁇ or Goat serum. Blocked for 30 minutes. Then, labeled with anti-CD45R and anti-CD3 antibodies for the detection of CD45R and T cell markers CD3, which are expressed in lymphomas, the label is a DAB (3, 3'-diaminobenzidine) substrate. Chromogen (chromogen) solution was detected by ABC vidin-biot in complex method and observed and photographed under a microscope. In addition, the slides were counterstained with hematoxylin-eosin (H & E) and observed and photographed under a microscope (FIG. 21C).
  • H & E hematoxylin-eosin
  • liver tissues of three types of NDRG3 overexpressing transgenic mice TG-2, TG-8, and TG-13 prepared by the method described in ⁇ Example 1> were examined to confirm the effect of NDRG3 overexpression on liver tumor. After extraction, it fixed and sectioned as mentioned above. The sectioned liver tissue was then used to perform and visualize immunohistostaining as above.
  • the sectioned tissue was immunofluorescent stained using an anti-NDRG3 antibody by the method described in Example ⁇ 4-1> and visualized using a confocal microscope (FIG. 21D).
  • liver tissue was extracted from the NDRG3 overexpressing transgenic mice and control mice and frozen with liquid nitrogen. Then, RT-PCR was performed by the method described in Example ⁇ 4-2>. In addition, the tissues were dissolved as in ⁇ Example 2> and Western blotting was performed using anti-NDRG3, anti-phosphorylated -ERK1 / 2 and anti-ERK1 / 2 antibodies (FIG. 21E).
  • FIGS. 21A to 21C tumors began to form after 9 months in NDRG3 overexpressing transgenic mice (FIG. 21A), and tumors were found in various organs including the lung, intestine, and lower abdomen. (FIG. 21B).
  • lymphoma-expressing B-cells and T-cells were found in the mesenteric lymph nodes and splenic secondary lymphoid organs, as well as in the liver of NDRG3 overexpressing mice (FIG. 21C).
  • hepatocellular carcinoma markers and cell proliferation markers was remarkably high in all three types of NDRG3 overexpressing mice (FIG. 20D), and IL-, which is a molecular angiogenesis marker.
  • IL- which is a molecular angiogenesis marker.
  • l a, IL- ⁇ , IL-6, C0X-2 and PAI-1 mR A expression increased, and by confirming that the phosphorylation of ERK1 / 2 increased (FIG. 21E), the results showed that NDRG3 was expressed in tumorigenicity and Neovascularization Promotion was confirmed histologically.
  • tissue microarray analysis was performed using liver cancer tissue from human liver cancer patients. Specifically, tissue samples were obtained from patients with pathologically defined HCC at Inje University Paik Hospital. All the tissue samples were fixed with 10% complete formalin and treated with paraffin. Next, a core tissue biopsy (diameter 2 mm) is performed with the paraffin-treated HCC tissue sample (donor blocks), and a trephin instrument (Superbiochips Laboratories, Seoul, Korea) is used. Were aligned to a new recipient paraffin block (tissue array block). Results The tissue array block included 104 HCCs and 20 non-neoplastic liver tissues.
  • Immunohistochemical staining was performed by the method described in Example ⁇ 11-1> above using the 4- / zm section of the tissue array block. For detection of NDRG3 or phosphorylated -ERK1 / 2, it was labeled with anti- NDRG3 and anti-phosphorylated -ERK1 / 2 antibody. In addition, normal saline was used as a negative control. Samples showing> 10% moderate hardness cytoplasmic staining and / or cell membrane staining for NDRG3 and nuclear staining for> 10% mild phosphorylation -ERK were positively scored. Statistical significance between the expression levels of NDRG3 protein and phosphorylated -ERK was assessed by the ⁇ 2 test (FIG. 22).
  • NDRG3 protein is rarely found in the normal liver, whereas in the liver of HCC patients, the expression of NDRG3 protein is strongly expressed in the cytoplasm and plasma membrane, the expression of phosphorylated ERK1 / 2 protein is remarkable It was confirmed that the increase. In particular, it was confirmed that ERK1 / 2 protein was phosphorylated in 19 (76%) HCC tissues out of 25 HCC tissues expressing NDRG3 protein (FIG. 22). Thus, the results confirm that abnormal expression of NDRG3 promotes tumor formation and activates the ERK1 / 2 pathway.
  • the inactivation of PHD2 induces the accumulation of HIF-l a protein at an early stage of hypoxia, and as a result, a gene related to metabolic adaptation of cells (LDHA) due to hypoxia , PDK1, etc.) are upregulated to activate glycolysis. Then, with the phenomenon of inhibiting the 294th plin hydroxyl hydroxylation, which is the hypoxia target site of NDRG3 due to hypoxic PHD2 inactivation. The expression of NDRG3 protein is increased by lactic acid produced / accumulated by increased glycolysis.
  • LDHA metabolic adaptation of cells
  • the increased NDRG3 acts as a scaffold protein in sustained hypoxic reactions to bind c-Raf and RACK1, and the bound RACK1 recruits P C- ⁇ protein to form ⁇ mer, followed by c-Raf by the PKC And phosphorylation of ERK1 / 2 to activate the c-Raf-ERK pathway, thereby promoting cell proliferation and angiogenesis (FIG. 23).
  • the preparation examples for the compositions of the present invention are given below.
  • Lactose 100 nig Magnesium stearate 2 nig The above components were mixed and then compressed into tablets according to a conventional method for preparing tablets.
  • Magnesium stearate 2 nig After mixing the above components, according to the manufacturing method of the usual capsule The capsule was prepared by layering the capsule.
  • 1 g NDRG3 protein, or 1 g lactose, 1 g lactose, 1 g xylitol, and 0.5 g of the above components were mixed to prepare 4 g per ring according to a conventional method.
  • NDRG3 protein, or NDRG3 protein expression or activity promoter 150 nig Soybean extract 50 nig Glucose 200 nig Starch 600 nig After mixing the above components, add 30 mg of ethane and dry at 60 ° C to form granules. Filled in the gun.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 NDRG3 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 저산소증(hypoxia) 반응으로 생성된 젖산(lactate)에 의해 매개된 NDRG3이 젖산-NDRG3-c-Raf-ERK 신호 경로를 통해 세포증식(proliferation) 및 혈관신생(angiogenesis)을 촉진함을 확인함으로써, 상기 NDRG3 단백질, 또는 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성을 촉진하는 촉진제를 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭]
NDRG3 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 NDRG3 단백질， 또는 NDRG3 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으 로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세 하게 NDRG3 단백질 및 이의 돌연변이체， 또는 NDRG3 발현 또는 활성을 촉진하는 단 백질 또는 화합물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조 성물에 관한 것이다.
【배경기술】
허혈은 심장 및 기타 조직에서 혈액공급의 차단으로 산소와 혈액 내에 포함되어 있는 여러 가지 영양분이 공급되지 못해 일어나는 현상이다. 신체 각 부분이 기능을 정상적으로 수행하려면 혈관을 통하여 적절한 산소와 영양이 공급되어야 한다. 허혈증으로 인해 손상 받는 대표적인 장기가 심장 및 뇌 조직이다. 심장은 관상등맥이라는 혈관을 통해 필요한 산소와 영양을 공급받는다. 그러나 필요한 양만큼의 혈류량을 공급받지 못하면 심장근육에 대사산물이 쌓이고 저산소증에 빠지게 되어 기능에 장애가 생기는데， 이러한 경우를 심근허혈이라고 한다. 그리고 심근허혈로 생기는 심장기능의 장애를 허혈성심질환이라고 한다ᅳ 질환은 크게 협심증과 심근경색증으로 나뉜다. 일반적으로 남성이 여성에 비해 발생빈도가 높고 연령이 높을수록， 위험요소를 갖춘 사람일수록 발생빈도가 높다.
저산소유도인자 (Hypoxia-induci ble factor-1 ; HIF-1)는 저산소 상태에서 다량 유도 발현되는 핵 전사인자로서 세포 내에서의 산소 항상성을 유지하기 위해서 , 적혈구 생성 (erythropoiesi s), 신혈관생성 (angiogenesi s) 및 해당과정 (glycolysi s)에 관련된 유전자를 발현시키는 기능을 한다. HIF 1은 α와 β 두 가지의 군으로 나뉘어지며 HIF-l a는 전사인자로서 정상산소 분압에서는 분해되지만 저산소 상태에서는 단백질 자체가 안정화되는 것으로 알려져 있다. 안정화된 HIF-l a는 HIF-Ιβ 인 ARNT와 결합하여 핵으로 이동하여 혈관생성과 대사에 관여하는 유전자들을 발현시킨다 (Semenza et al . , 1999； Wang et al . , 1995； Wang and Semenza 1995) . HIF-1의 활성은 암 발생과 전이， 류마티스성 관절염， 허혈성 뇌졸중ᅳ 동맥경화증 등 다양한 만성 대사성 질환의 병리학적 기전과 밀접한 관계가 있기 때문에 최근 주요 신약 표적으로 부상하고 있다. 그러나， HIF의 촉진만으로 저산소 반웅에 의해 유도되는 허혈성 질환의 진행올 완전히 막을 수 없고， 이를 통해 HIF-비의존적으로 유도되는 조절 경로가 유도됨이 보고되고 있다. 따라서, 다양한 허혈성 질환 치료를 위해 HIF 뿐만 아니라 HIF 비의존적 -조절 경로에 관여하는 인자의 촉진 물질을 결합하껴 사용하는 전략이 필요하다.
NDRG군 유전자는 Nᅳ Myc 돌연변이 쥐에서 발현이 증가하는 유전자로써 Ndrl이라는 이름으로 처음 밝혀지기 시작했다. 이의 인간 올소로그 (human ortholog) NDRG1이 인간 세포주에서 동정되면서부터 Drgl , Cap43 , RTP/r it42등과 같은 이름으로 불려지기 시작했다. NDRG군 유전자에는 서로 다른 4종류의 구성 유전자들이 보고되어 있으며， 이들 4종류의 NDRGl , NDRG2, NDRG3 및 NDRG4는 높은 유사성 (homo logy)을 가지지만 개체의 발달과 성장에 따라 발현 형태가 상당히 다른 것으로 보고되어 있다 (Qu et al . , Mol Cel l Biochem, 2002(229) , 35-44， Deng et al . , Int J Cancer , 2003( 106) , 342-7) . 따라서， 이러한 발현차이로 보면 이들 유전자들이 서로 다른 기능을 할 것으로 예상되고 있으나， 아직 이들의 명확한 기능에 관한 보고는 없었다. 이에， 본 발명자들은 허혈성 질환 치료를 위하여 저산소증과 관련된 HIF- 비의존적 인자를 찾기 위해 노력한 결과， 저산소 반응으로 생성된 젖산 ( lactate)에 의해 NDRG3의 발현 및 활성이 증가하고, 상기 젖산—매개된 NDRG3이 Raf-ERK 신호 경로를 통해 세포증식 및 신생혈관생성을 촉진하므로， 상기 NDRG3 단백질 및 NDRG3의 발현 또는 활성을 촉진하는 촉진제를 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다. 【발명의 상세한 설명】 【기술적 과제】 본 발명의 목적은 NDRG3 단백질, 또는 NDRG3 발현 또는 활성 촉진제를 유효 성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
【가술적 해결방법】 본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 NDRG3(N-myc downstream regul ated gene 3) 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 증 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상뫼 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 들연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위를 하이드록실화 (hydroxylat ion)를 억제하여 NDRG3 단백질의 발현을 촉진하는 단백질 또는 화합물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검개체로부터 분리된 시료로부터 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성올 측정하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성이 정상 대조군에 비해 감소한 경우， 허혈성 질환을 갖거나 허혈성 질환을 가질 위험성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는， 허혈성 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 NDRG3 단백질의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) NDRG3 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 세포주에서 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성을 확인하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성이 무처리. 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) NDRG3과 ΡΚΟ β , RACK1 또는 c-Raf 중 어느 하나 이상을 발현하는 세포주에 저산소 상태에서 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 세포주에서 NDRG3과 PKC- β ， RAC 1 또는 c-Raf 증 어느 하나 이상의 결합 정도를 확인하는 단계 ; 및
3) 상기 단계 2)의 결합 정도가 무처리 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은
1) 시험관 내에서 ( in vi tro) NDRG3 , PKC-β , RACK1 및 c:-Raf 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 NDRG3 , PKC-β , RACK1 및 c-Raf 단백질 중 하나 이상의 결합 정도를 확인하는 단계; 및 -
3) 상기 단계 2)의 결합 정도가 무처리 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스 if라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌, 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포의 용도를 제공한다.
아울러， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물의 용도를 제공한다.
【유리한 효과】 본 발명의 NDRG3은 지속적인 저산소 반웅에서 생성된 젖산에 의해 발현 및 활성이 증가하고， 이를 통해 스캐폴드 ( scaf fo l d) 단백질로 작용함으로써 c-Raf 및 RACK1과 결합하고， 이 때 RACK1을 통해 PKC 단백질을 동원함으로써 상가 4가지 물 질로 이루어지는 단일 복합체를 형성하고， 이를 통해 c-Raf-ERK 신호 경로를 활성 화하여 세포 증식 및 신생혈관생성을 촉진하므로， 상기 NDRG3 단백질， 또는 NDRG3 발현 또는 활성 촉진제를 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. [도면의 간단한 설명】
도 la는 NDRG3 과발현 형질전환 마우스의 제조하기 위하여 인간 NDRG3을 암호화하는 pCAGGS 플라스미드를 나타낸 도이다.
도 lb는 NDRG3 과발현 형질전환 마우스의 생산 과정에 있는 TG-2, TG-8 및 TG-13 마우스의 게놈 DNA에 인간 NDRG3 유전자가 삽입되어 있음을 확인한 도이다. 도 lc는 확립된 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 TG-2, TG-8 및 TG-13의 간 조직에서 인간 NDRG3 유전자의 발현올 확인한도이다.
도 2는 제작한 레빗 (rabbit) 항— NDRG3 항체와 인간 NDRG3(N66D) 변이체와의 항원 -항체 반웅을 확인한 도이다.
도 3a는 PHD2와 결합하는 후보 단백질을 선별하는 과정을 모식화한 도이다. 도 3b는 PHD2와 결합하는 단백질을 나타낸 도이다.
도 3c는 PHD2 및 NDRG3 단백질의 결합을 나타낸 도이다.
도 4a는 저산소 상태 (hypoxia, 1% 02) 하에서 (도 4a， 위) 및 시험관 내에서 (in-vitro) (도 4a, 아래) PHD2 및 NDRG3의 결합을 나타낸 도이다.
도 4b는 정상 산소 상태 (normoxia, 21% 02) 하에 있는 MCF— 7 세포에서 PHD2 억제에 의한 NDRG3 단백질 유도를 확인한 도이다.
도 4c는 정상 산소 상태 하에 있는 HeLa 세포에서 PHD2 억제에 의한 NDRG3 단백질 유도를 확인한 도이다.
도 5a는 정상 산소 상태에서 PHD 패밀리 군 및 VHL 결실에 의한 NDRG3 단백질 발현 억제를 확인한 도이다.
도 5b는 PHD 패밀리 군 및 NDRG3 단백질의 결합을 확인한 도이다.
도 6a는 단백질-단백질 도킹 (docking) 시물레이션을 통해 NDRG3의 PHD2 도킹 부위 (docking site)를 확인한 도이다.
도 6b는 도킹 시뮬레이션으로 확인한 NDRG3의 PHD2 도킹 부위와 PHD2의 결합력을 확인한 도이다.
도 7a는 정상 산소 상태에서 프로테아좀 (proteasome) 억제제인 MG132 처리 후 NDRG3 단백질의 유비퀴틴화 (ubiquitination)을 확인한 도이다.
도 7b는 정상 산소 상태에서 NDRG3 단백질의 유비퀴틴화를 확인한 도이다. 도 8a는 지속적인 저산소 상태에 따른 NDRG3 단백질의 축적을 확인한 도이다.
도 8b는 세포 내에서 지속적인 저산소 상태에 따른 NDRG3 단백질의 축적을 확인한 도이다.
도 8c는 여러 종류의 암 세포에서 지속적인 저산소 상태에 따른 NDRG3 단백질의 축적을 확인한 도이다.
도 8d는 지속적인 저산소 상태에서 NDRG3 단백질의 유비퀴틴화 억제를 확인한 도이다.
도 9a는 정상 산소 상태 및 지속적인 저산소 상태에 따른 NDRG3 단백질 발현 변화를 확인한 도이다.
도 9b는 저산소 상태에서 정상 산소 상태로 회복될 때 NDRG3 단백질의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 10a는 NDRG3 단백질꾀 하이드록실화 (hydroxy 1 at i on) 표적 부위를 확인한 도이다.
도 10b는 NDRG3 단백질의 하이드록실화 (hydroxy 1 at i on) 표적 부위 및 PHD2/VHL의 결합을 확인한 도이다.
도 11a는 산소 상태 변화에 따른 NDRG3의 R A 및 HIF 단백질의 발현 변화를 확인한 도이다,
도 lib는 HIF 및 PHD2 억제에 따른 NDRG3 단백질의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 lie는 저산소 상태 하에 있는 MCF-7(HIF-1+/+ 및 VHL+/+) 및 786-0(HIF-r 및 VHL_/— ) 세포에서 NDRG3 단백질의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 12a는 저산소 반웅과 관련된 NDRG3 및 HIF-1의 기능을 분석한 도이다. 도 12b는 정상산소 상태에서 NDRG3 단백질을 과발현 하는 세포 및 저산소 상태하에 있는 세포에서 상향 조절되는 각 유전자들의 기능을 분석한 도이다.
도 13a는 저산소 상태에서 NDRG3 결실에 의한 혈관생성 활성의 변화를 확인한 도이다.
도 13b는 저산소 상태에서 NDRG3 결실에 의한 신생혈관생성 마커 IL8 , IL1 α , Ιίΐ β , C0X-2 및 PAI-1의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 13c는 NDRG3 결실에 의한 생체 내 ( in-vivo) 혈관생성 변화를 확인한 도이다.
도 14a는 NDRG3 결실에 의한 세포 성장 변화를 확인한 도이다.
도 14b는 NDRG3 및 /또는 HIF 결실에 의한 종양 형성 변화를 확인한 도이다. 도 14c는 이소성 (ectopi c) 변이체 NDRG3(N66D) 발현에 의한 종양 형성 변화를 확인한 도이다.
도 14d는 NDRG3 및 /또는 HIF 결실된 종양 세포를 이식한 마우스에서 종양의 부피 변화를 확인한 도이다.
도 14e¾ 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 발현된 종양 세포를 이식한 마우스에서 종양의 부피 변화를 확인한 도이다.
도 14f는 종양 조직에서 NDRG3 또는 HIF 결실에 의한 세포증식 마커 Ki-67 및 신생혈관생성 마커 IL8 단백질의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 Mg는 종양 조직에서 NDRG3 또는 HIF 결실에 의한 신생혈관생성 마커의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 15a는 산소 상태에 따른 NDRG3과 HIF-1 α의 단백질 발현 및 젖산 (Lactate)의 생성 변화를 확인한 도이다.
도 15b는 LDHAO actate dehydrogenase A) 억제제인 소듐 옥사메이트 ( sodium oxamate) 처리 후 지속적인 저산소 상태에 따른 NDRG3과 HIF-1 α의 단백질 발현 및 젖산 (Lactate)의 생성 변화를 확인한 도이다.
도 15c는 저산소 상태에서 젖산 생성에 따른 NDRG3 단백질의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 15d는 2—데옥시글루코오스 (2-deoxyglucose , 2-DG)에 의한 해당과정 (glycolysi s)에 따른 NDRG3 단백질왼 발현 변화를 확인한 도이다.
도 15e는 피루베이트 (Pyruvate) 또는 LDHA에 의한 과다한 젖산 생성에 따른 NDRG3 단백질의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 15f는 젖산 생성에 의한 NDRG3 단백질의 유비퀴틴화 변화를 확인한 도이다.
도 16a는 NDRG3 단백질의 젖산 결합 부위를 돌연변이한 재조합 NDRG3(G138W) 변이체 및 재조합 NDRG3 야생형 단백질을 확인한 도이다.
도 16b는 재조합 NDRG3 야생형 및 재조합 NDRG3(G138W) 변이체 단백질와 젖산의 결합을 확인한 도이다.
도 16c는 저산소 상태에서 NDRG3의 L-젖산 결합부위 # 돌연변이한 변이체의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 16d는 재산소화 (reoxygenat ion)에 의한 NDRG3 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 17a는 젖산 생성 억제 및 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 발현에 의한 세포 성장 변화를 확인한 도이다.
도 17b는 젖산 생성 억제 및 /또는 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 발현에 의한 세포 콜로니 (colony) 형성 변화를 확인한 도이다. ·
도 17c는 LDHA 결실 및 /또는 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 발현에 의한 세포성장 변화를 확인한 도이다.
도 17d는 LDHA 결실 및 /또는 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 발현된 종양 세포를 이식한 마우스에서 종양 형성 변화를 확인한 도이다. .
도 17e는 지속적인 저산소 상태에서 젖산 생성 억제 및 /또는 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 발현에 의한 NDRG3 단백질 발현 변화를 확인한 도이다.
도 17f는 지속적인 저산소 상태에서 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 발현에 의한 젖산 생성 변화를 확인한 도이다.
도 18은 지속적인 저산소 상태에서 젖산 생성 억제 및 7또는 이소성 변이체 NDRG3CN66D) 발현에 의한 혈관생성 변화를 확인한 도이다.
도 19a는 저산소 상태에서 NDRG3 결실에 의한 단백질의 인산화 (phosphorylat i on) 변화를 확인한 도이다.
도 19b는 NDRG3 단백질 발현에 따른 ERK1/2 단백질의. 활성 변화를 확인한 도이다.
도 19c는 지속적인 저산소 상태에서 NDRG3 결실에 의한 Raf-ERKl/2 활성 변화를 확인한 도이다.
도 19d는 시험관 내에서 ( in-vi tro, 왼쪽) 및 세포 내에서 (오른쪽) NDRG3 단백질 및 C-Raf의 결합을 확인한 도이다.
도 19e는 NDRG3 단백질 결실 또는 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 발현에 의한 Raf-ERKl/2 활성 변화를 확인한 도이다. 도 19f는 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 및 /또는 PKC-I에 와한 PKC-β 활성 억제에 따른 c— Raf의 인산화 변화를 확인한 도이다.
도 19g는 저산소 상태에서 젖산 생성 억제에 따른 NDRG3 단백질 발현 및 Raf-ERKl/2 활성 변화를 확인한 도이다.
도 20a는 NDRG3 단백질 및 RACK-1 간의 결합을 확인한 도이다.
도 20b는 NDRG3 결실 또는 이소성 변이체 NDRG3(N66D)， RACK-1 및 /또는 Raf 발현에 따른 Raf-ERKl/2 활성 변화를 확인한 도이다.
도 20c는 저산소 상태에서 RACK1 결실에 의한 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 및 PKC-β 간의 결합을 확인한 도이다.
도 20d는 저산소 상태에서 PKC— β 활성 억제에 의한 ERK1/2 활성 변화를 확인한 도이다.
도 20e는 재조합 이소성 변이체 NDRG3(N66D)와 c— Raf , RACK1 및 PKC— β의 복합체 형성을 확인한도이다.
도 20f는 시뮬레이션을 통한 NDRG3 , c-Raf , RACK1 및 PKc-β의 복합체 형성을 확인한 도이다.
도 21a는 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 종양 형성 여부를 확인한 도이다.
도 21b는 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 폐, 장 및 하복부 (hypogastr ium)에서 종양 형성을 확인한 도이다.
도 21c는 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 장간막 림프절 (Mesenter ic lymph node) , 비장 및 간 조직에서 Β 세포 및 Τ 세포를 확인한 도이다.
도 21d는 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 간 조직에서 간세포암종 마커 (hepatoce l lular carcinoma , HCC)인 글루타민합성효소 (glutamine synthetase , GS) 및 열충격단백질 70(heat shock protein 20， HSP) , 및 세포증식 마커인 PCNA 및 Ki-67의 발현을 확인한 도이다.
도 21e는 NDRG3 과발현 형질잔환 마우스 및 대조군 마우스의 간조직에서 ERK1/2의 활성 및 신생혈관생성 마커의 mR A 발현을 확인한 도이다.
도 22는 간암 환자에서 NDRG3의 발현 및 ERK1/2 활성을 확인한 도이다. 도 23은 지속적인 저산소 반웅에 있어서 젖산에 의해 유도된 Raf-ERK 경로의 매개자로서 NDRG3의 기전을 도식화한 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 NDRG3(N-myc downstream-regulated gene 3) 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 NDRG3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 NDRG3 단백질의 발현 촉진제는 NDRG3 단백질의 47번째 알기닌 (Arginine) , 66번째 아스파라긴 (Asparagine)， 68번째 라이신 (Lysine) , 69번째 세린 (Ser ine) , 72번째 아스파라긴， 73번째 알라닌 (Alanine) , 76번째 아스파라긴， 77번째 페닐알라닌 (Phenyl alanine) , 78번째 글루탐산 (Glutami c acid) , 81번째 글루타민 (Glutamine) , 97번째 글루타민， 98번째 글루타민， 99번째 글루탐산， 100번째 글라이신 (Glyc ine) , 101번째 알라닌， 102번째 프를린 (Prol ine) , 103번째 세린, 203번째 류신 (Leucine) , 204번째 아스파르트산 (Aspart i c ac id) , 205번째 류신， 208번째 쓰레오닌 (Threonine) , 209번째 타이로신 (Tyrosine)， 211번째 메티오닌 (Methionine) , 212번째 히스티딘 (Hi st idine)， 214번째 알라닌， 215번째 글루타민， 216번째 아스파르트산， 217번째 이소류신 ( Isoleucine) , 218번째 아스파라긴， 219번째 글루타민， 296번째 발린 (Val ine) , 297번째 발린 298번째 글루타민， 300번째 글라이신 및 3이번째 라이신으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 PHD2 도킹 부위 (docking si te)에 PHD2의 결합을 억제하는 것이 바람직하고， NDRG3 단백질의 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴， 68번째 라이신， 69번째 세린， 97번째 글루타민 및 296번째 발린으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 PHD2 도킹 부위에 PHD2의 결합을 억제하는 것이 보다 바람직하며 , NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌 또는 66번째 아스파라긴 부위를 표적으로 하는 것이 보다 바람직하고， 상기 NDRG3 단백질의 47번째 알기닌 또는 66번째 아스파라긴 부위에 결합하여 PHD2와의 상호작용을 감소시켜 NDRG3 단백질의 발현을 촉진하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 NDRG3 단백질의 발현 촉진제는 NDRG3 단백질의 젖산 (Lactate) 결합 부위인 62번째 아스파르트산, 138번째 글라이신， 139번째 알라닌 또는 229번째 타이로신에 젖산의 결합을 촉진하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 NDRG3 단백질의 활성 촉진제는 NDRG3과 ΡΚΟβ， RACK1 또는 c-Raf 중 어느 하나 이상의 결합 정도를 촉진하는 것이 바람직하다.
상기 허혈성 질환은 뇌허혈， 심장허혈， 당뇨병성 혈관심장질환， 심부전, 심근비대증， 망막허혈， 허혈성 대장염， 허혈성 급성 신부전증， 뇌졸중， 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 저산소증과 관련된 HIFᅳ 비의존적 인자를 찾기 위하여 HIF의 활성에 관여하는 PHD2 단백질과 결합하는 후보 단백질 증 NDRG3(서열번호 1)을 선별하였고, 저산소증에 있어서 NDRG3 단백질의 분자생화학적 기능을 확인하기 위하여 NDRG3 과발현 형질전환 C57/BL6 마우스 TG-2 , TGᅳ 8 및 TG-13올 제작하였고 (도 la 내지 도 lc , 및 도 3a 내지 도 3c 참조) , 재조합 인간 NDRG3 단백질 (아미노산 32-315， 서열번호 2)를 항원으로 레빗 (rabbi t )에서 항 -NDRG3 다클론 항혈청을 획득하고 NDRG3 펩타이드 (아미노산 244-255 , 서열번호 3)를 이용하여 친화 크로마토그래피를 통해 정제하여 레빗 항- 인간 NDRG3 다클론 항체를 제조하였다 (도 2 참조) .
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 산소 상태에 따른 PHD2 및 NDRG3 단백질의 관계를 확인하기 위하여 면역침전법 ( immunoprecipi tat ion)， 웨스턴 블럿팅 (western blot t ing) , 시험관내 ( in-vi tro) 풀—다운 분석법 (pul l-down assay) 및 RT-PCR을 수행한 결과， 4 종류의 PHD 패밀리 군 중 PHD2 단백질과 결합하고， PHD2 및 E3 유비퀴틴 (ubiqui t in) 연결효소 ( l igase) 복합체의 표적 단백질인 VHL 억제에 의해 NDRG3 단백질의 축적이 증가하는 것을 확인함으로써， NDRG3 단백 ¾이 PHD2의 고유한 기질이며， NDRG3인 PHD2/VHL-메개 전사후 과정의 기질임을 확인하였다 (도 4a 내지 도 4c , 및 도 5a 및 도 5b 참조) . 또한， 단백질ᅳ 단백질 도킹 시물레이션을 수행한 결과 NDRG3의 PHD2 도킹 부위 (docking si te)를 확인하고， 상기 PHD2 도킹 부위 증 NDRG3의 47번째 또는 66번째 아미노산 위치가 더욱 중요한 부위임을 확인하였고 (도 6a 및 도 6b) , 생체 내 유비퀴틴화 분석법 ( In-vivo ubiquit inat ion assay)를 수행한 결과 정상 산소 상태에서 PHD2가 상기 NDRG3 도킹 부위에 결합함으로써 PHD2/VHL-매개 프로테아좀 (proteasome) 경로를 통해 NDRG3이 유비퀴틴화되어 제거됨을 확인하였다 (도 7a 및 도 7b 참조) . 또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 NDRG3 단백질의 산소-의존성을 확인하기 위하여， 면역침전법， 웨스턴 블럿팅， 면역형광염색법 및 생체내 유비퀴틴화 분석법을 수행한 결과 유방， 간， 자궁경부， 신장 및 대장 등 여러 암세포에서 저산소 상태가 지속될수록 NDRG3 단백질의 유비퀴틴화는 감소하고 NDRG3 단백질의 발현 및 축적이 증가하고 반대로， 정상 산소 상태로 산소 상태가 회복되면 NDRG3 단백질의 발현이 천천히 제거되며 (도 8a 내지 도 8d, 및 도 9a 및 도 9b 참조) , 특히， 질량 분석법을 수행한 결과 산소 -의존적으로 NDRG3의 294번째 프를린 (prol ine)이 하이드록실화 (hydroxy 1 at ion) 되고 이 프를린 아미노산이 알라닌 (Alanine)으로 치환된 돌연변이체는 발현이 증가되므로 NDRG3의 294번째 프를린 하이드록실화가 저산소증 표적 부위임을 확인하였다 (도 10a 및 도 10b) . 또한， HIF는 저산소 상태 초기 단계에 발현이 증가한 후 점점 감소하지만， 저산소 상태가 지속될수록 NDRG3 단백질의 발현 및 축적이 증가하는 것을 확인함으로써， NDRG3은 HIF-비의존적으로 지속적인 저산소 반웅에서 중요한 기능을 함을 확인하였다 (도 11a 내지 도 11c 참조) .
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 저산소 반응에 있어서 NDRG3 단백질의 생화학적 기능을 확인하기 위하여 유전자 발현 프로파일링 (prof i l ing)을 수행한 결과， HIF와 달리 NDRG3 단백질은 세포증식 (prol i ferat ion) , 신생혈관생성 (angiogenensi s)， 세포성장 (cel l growth)과 가장 관련성이 높음을 확인하였고 (도 12a 및 도 12b) , 생체내 혈관생성분석법 ( in- vivo angiogenesi s assay) 및 생체내 ( in-vivo) 이식한 종양 부피 측정 및 ΜΊΤ 분석법을 수행한 결과 저산소 반웅에서 NDRG3에 의해 신생혈관생성 및 세포증식 및 종양 성장이 촉진됨을 확인하였다 (도 13a 및 도 13c， 및 도 14a 내지 도 14g) . 또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 저산소 상태에서 젖산 생성과 NDRG3 단백질의 발현 증가와의 관련성을 확인하기 위하여, 저산소 상태에서 젖산 생성 측정， 웨스턴 블럿팅, 면역침전법， 시험관내 유비퀴틴 분석법을 수행한 결과， 저산소 반웅으로 젖산이 생성되고， 생성된 젖산이 NDRG3의 62번째， 138번째, 139번째 또는 229번째를 포함한 젖산 결합 부위에 결합함으로써 NDRG3 단백질의 유비퀴틴화가 억제되고 HIF-비의존적으로 발현이 증가함을 확인하였고 (도 15a 내지 도 15f , 및 도 16a 내지 도 16d 참조)， MTT 분석법, 콜로니 형성 분석법 (colony forming assay) , 생체내 이식한 종양 부피 측정 및 류브 형성 분석법을 수행한 결과 젖산 생성 억제에도 이소성 변이체 NDRG3(N66D)가 발현된 경우 세포증식 및 혈관생성이 촉진되는 것을 확인함으로써, NDRG3이 지속적인 저산소 상태에서 젖산에 의해 유도된 세포증식 및 혈관생성의 중요한 매개자로 작용함을 확인하였다 (도 17a 내지 도 17f , 및 도 18 참조) .
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 NDRG3에 의해 매개된 저산소 반응의 분자적 조절 기전을 확인하기 위하여 시험관내 키나아제 분석법 ( in- vi tro kinase assay) , 풀ᅳ다운 분석법， 면역침전법 및 웨스턴 블럿팅을 수행한 결과 저산소 상태에서 NDRG3 발현 억제로 c-Raf 및 ERK1/2의 인산화가 억제되는 것을 확인함으로써 저산소 반웅으로 유도된 젖산에 의해 활성화된 c-Raf— ERK1/2 경로에서 NDRG3이 c-Raf-ERKl/2 신호의 중요한 매개자임을 확인하였다 (도 19a 내지 도 19g 참조) . 또한， 단백질 구조 모델링을 수행한 결과 NDRG3이 RACK1과 결합하여 PKC- β를 유도하고 c-Raf와 함께 NDRG3-RACK1-PKC-P -c-Raf 복합체를 형성하며 , 유도된 PKC-β에 의해 c-Raf 단백질이 인산화되어 c-Raf /ERK 신호가 활성화됨을 확인함으로써， 젖산에 의해 조절된 NDRG3이 c-Raf의 활성을 조절하는 스캐폴드 단백질 (scaf fo ld protein)임을 확인하였다 (도 20a 내지 도 20 f 참조) . 아울러， 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 NDRG3에 의한 병리학적 변화를 확인하기 위하여 상기 제작한 NDRG3 과발현 형질전환 마우스를 이용하여 면역조직화학적 분석법 ( immunohi stochemical anaylys i s)를 수행하고， NDRG3과 활성화된 ER 1/2 단백질의 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블럿팅 유전자 발현변화를 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행한 결과， NDRG3 과발현 형질전환 마우스의 폐， 장， 간 등 다양한 장기에서 종양이 발견되고 장간막 림프절 및 비장 등 2차 림프기관에서 림프종 발현 B-세포 및 T-세포가 발견되는 것을 확인하였으며， 세포증식 마커 및 신생혈관생성 마커의 발현이 증가하는 것을 확인하였다 (도 21a 내지 도 21e 참조) . 또한， 간암환자로부터 분리한 간암 조직 샘플에서도 NDRG3 단백질의 발현 및 ERK1/2 단백질의 활성이 촉진되는 것을 확인함으로써 (도 22 참조) , NDRG3의 비정상적인 발현이 c-Raf/ERK 경로를 활성화함으로써 종양 형성 및 신생혈관형성을 촉진함을 확인하였다.
따라서， 본 발명의 NDRG3은 정상 산소 상태에서는 NDRG3의 PHD2 도킹 부위에 PHD2가결합하여 PHD/VHL 매개 경로에 의해 유비퀴틴화 되어 하향조절되고， 저산소 상태 초기단계에서는 PHD2의 비활성으로 HIF-l a 단백질의 축적이 유도되어 저산소증에 따른 세포의 대사 적웅 (metabol ic adaptat ion)과 관련된 유전자 (LDHA , PD 1 등)가 상향조절되어 해당과정이 활성화된다. 그 후， 저산소 상태의 PHD2 비활성에 의한 NDRG3의 저산소증 표적 부위인 294번째 프를린 하이드록실화 억제 현상과 함께, 증가된 해당과정에 의해 생성 /축적된 젖산에 의해 NDRG3 단백질의 발현이 증가한다. 상기 증가된 NDRG3이 지속적인 저산소 반웅에서 스캐폴드 단백질로 작용하여 c-Raf 및 RACK1과 결합하고， 결합된 RACK1이 PKC-β 단백질을 동원하여 복합체를 형성한 후， 상가 PKC에 의해 c-Raf가 인산화되어 c-Raf-ERKl/2 경로가 활성화되어 세포 증식 및 신생혈관생성이 촉진되므로 (도 23 참조)， 상기 NDRG3 단백질 및 이의 이소성 돌연변이체， 또는 NDRG3의 발현 또는 활성을 촉진하는 단백질 또는 화합물올 허혈성 질환 예방 및 차료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 ND G3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌, 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 쎄방 및 치료용 약학적 조성물을쎄공한다. - 상기 NDRG3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다. .
상기 허혈성 질환은 뇌허혈， 심장허혈， 당뇨병성 혈관심장질환， 심부전， 심근비대증， 망막허혈， 허혈성 대장염， 허혈성 급성 신부전증， 뇌졸중， 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 (hypoxi a) 반웅으로 생성된 젖산 ( l actate)에 의해 매개된 NDRG3 및 NDRG3의 이소성 돌연변이체가 RACK1 , PKC-β 및 c-Raf와 복합체를 형성하고， 젖산 -NDRG3-c-Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로，；상기 NDRG3 또는 이의 돌연변이체를 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 NDRG3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 백터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 재조합 바이라스성 백터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 바이러스성 백터는 레트로바이러스 (Retrovi rus) , 아데노바이러스 (Adenovi rus) , 헤스페스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex vi rus) 및 렌티바이러스 (Lent ivirus)로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 NDRG3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여， 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고， 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며， 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉， 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한， 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실， 삽입 또는 이들의 초합에 의해 변이될 수 있으며， 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며， DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.
상기 세포는 조혈줄기세포， 수지상세포 및 종양세로로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반웅으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3 및 NDRG3의 이소성 돌연변이체가 RACK1 , PKC- β 및 c-Raf와 복합체를 형성하고， 젖산 -NDRG3-C- Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로， 상기 NDRG3 또는 이의 돌연변이체를 암호화하는 백터 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 (Pro l ine) 부위의 하이드록실화 (hydroxy 1 at i on)를 억제하는 단백질 또는 화합물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 허혈성 질환은 뇌허혈, 심장허혈， 당뇨병성 혈관심장질환， 심부전， 심근비대증， 망막허혈， 허혈성 대장염， 허혈성 급성 신부전증， 뇌졸중， 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반응으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3이 294번째 프를린이 비활성화되어 NDRG3 단백질이 증가되고， 젖산 -NDRG3-c-Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로, 상기 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물을 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수， 멸균수， 링거액， 완충 식염수， 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액， 말토 덱스트린 용액， 글리세를， 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 흔합하여 사용할 수 있으며， 필요에 따라 항산화제， 완충액， 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 ,있으며， 상기 보조제로는 부형제， 붕해제， 감미제， 결합제， 피복제， 팽창제， 윤활제 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.
또한， 본 발명의 조성물은 희석제， 분산제， 계면활성제， 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액， 유탁액 등과 같은 주사용 제형， 환약， 캡슐， 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington ' s Pharmaceut i cal Science , Mack Publ i shing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. ~
또한， 본 발명의 조성물은 정맥내， 동맥내， 복강내， 근육내， 동맥내， 복강내， 흉골내， 경피， 비측내， 흡입, 국소， 직장， 경구， 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여량은 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서， 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령， 체중， 일반 건강 상태， 성별 및 식이， 투여 시간， 투여 경로 및 조성물의 분비율， 치료 기간， 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 통상 성인 (체중 60kg 기준)의 경우 비경구로 1일 1회 20~52 mg으로 투여하는 것이 바람직하며， 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 경험에 의하여 적절히 결정될 수도 있다, 또한 > 본 발명은
1) 피검개체로부터 분리된 시료로부터 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계 ; 및 2) 상기 단계 1)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성이 정상 대조군에 비해 감소한 경우, 허혈성 질환을 갖거나 허혈성 질환을 가질 위험성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는， 허혈성 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 NDRG3 단백질의 검출 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 사료는 세포, 조직， 혈액， 혈청， 타액 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성 정도는 효소면역분석법 (ELISA) , 면역조직화학염색， 웨스턴 블럿팅 (Western Blot t ing) 및 단백질 칩 (chip)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반옹으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3이 젖산- NDRG3-Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로， 허혈성 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질의 검출 방법으로 유용하게 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은
1) NDRG3 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포주에서 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성을 확인하는 단계 ; 및
3) 상기 단계 2)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성이 무처리 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 3)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성 정도는 효소면역분석법， 면역조직화학염색, 웨스턴 블럿팅 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반웅으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3이 젖산-
NDRG3-c-Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로， 허혈성 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질의 검출 방법으로 유용하게 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 1) NDRG3과 PKC-β , RACK1 또는 c-Raf 증 어느 하나 이상을 발현하는 세포주에 저산소 상태에서 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포주에서 NDRG3과 PKC- , RAC 1 또는 c-Raf 중 어느 하나 이상의 결합 정도를 확인하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 결합 정도가 무처리 대조군에 비해 증가하는 피검물질올 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 3)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성 정도는 효소면역분석법， 면역조직화학염색， 웨스턴 블럿팅 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반웅으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3이 RACK1 , PKC-β 및 c-Raf와 복합체를 형성하고, 젖산 -NDRG3— C— Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로， 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은
1) 시험관 내에서 ( in vi tro) NDRG3 , PKC-β， RACK1 및 c-Raf 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 NDRG3 , PKC-β , RACK1 및 c-Raf 단백질 중 하나 이상의 결합 정도를 확인하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 결합 정도가 무처리 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성 정도는 시험관내 풀 -다운 어세이 ( in一 vi tro pul l一 down assay) , 면역침전법 ( i睡 unoprecipi tat ion) 및 웨스턴 블럿팅 (Western Blot t ing)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반웅으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3이 RACKl , PKC-β 및 c-Raf와 복합체를 형성하고， 젖산 -NDRG3-c-Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로， 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법을 제공한다. 상기 NDRG3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 NDRG3 단백질의 발현 촉진제는 NDRG3 단백질의 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴， 68번째 라이신， 69번째 세린, 72번째 아스파라긴， 73번째 알라닌， 76번째 아스파라긴， 77번째 페닐알라닌， 78번째 글루탐산， 81번째 글루타민， 97번째 글루타민， 98번째 글루타민， 99번째 글루탐산, 100번째 글라이신， 101번째 알라닌， 102번째 프를린， 103번째 세린， 203번째 류신， 204번째 아스파르트산， 205번째 류신， 208번째 쓰레오닌， 209번째 타이로신， 211번째 메티오닌， 212번째 히스티딘， 214번째 알라닌， 215번째 글루타민， 216번째 아스파르트산， 217번째 이소류신， 218번째 아스파라긴， 219번째 글루타민， 296번째 발린， 297번째 발린， 298번째 글루타민， 300번째 글라이신 및 3이번째 라이신으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 PHD2 도킹 부위에 PHD2의 결합을 억제하는 것이 바람직하고， NDRG3 단백질의 47번째 알기닌, 66번째 아스파라긴， 68번째 라이신， 69번째 세린， 97번째 글루타민 및 296번째 발린으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 PHD2 도킹 부위에 PHD2의 결합을 억제하는 것이 보다 바람직하며 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌 또는 66번째 아스파라긴 부위를 표적으로 하는 것이 보다 바람직하고， 상기 NDRG3 단백질의 47번째 알기닌 또는 66번째 아스파라긴 부위에 결합하여 PHD2와의 상호작용을 감소시켜 NDRG3 단백질의 발현을 촉진하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 NDRG3 단백질의 발현 촉진제는 NDRG3 단백질의 젖산 결합 부위인 62번째 아스파르트산, 138번째 글라이신， 139번째 알라닌 또는 229번째 타이로신에 젖산의 결합을 촉진하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 NDRG3 단백질의 활성 촉진제는 NDRG3과 PKC- β , RACK1 또는 c_Raf 중 어느 하나 이상의 결합 정도를 촉잔하는 것이 바람직하다.
상기 허혈성 질환은 뇌허혈, 심장허혈， 당뇨병성 혈관심장질환, 심부전， 심근비대증, 망막허혈， 허혈성 대장염， 허혈성 급성 신부전증, 뇌졸중， 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반웅으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3 및 NDRG3의 이소성 돌연변이체가 RACK1 , P C- β 및 c-Raf와 복합체를 형성하고， 젖산 -NDRG3-C- Raf-ERK신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로， 상기 NDRG3의 발현 또는 활성을 촉진하는 단백질 또는 화합물을 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물토 유용하게 사용할 수 있다. 또한 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌, 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법을 제공한다.
상기 NDRG3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 백터는 선형 DNA , 플라스미드 DNA , 또는 재조합 바이러스성 백터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 바이러스성 백터는 레트로바이러스, 아데노바이러스， 헤스페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 세포는 조혈줄기세포， 수지상세포 및 종양세로로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반웅으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3 및 NDRG3의 이소성 돌연변이체가 RACK1 , PKC- β 및 c-Raf와 복합체를 형성하고， 젖산 -NDRG3-C— Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로， 상기 NDRG3 또는 이의 돌연변이체， 상기 돌연변이체를 암호화하는 백터 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백잘 또는 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프롤린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물올 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법을 제공한다.
상기 허혈성 질환은 뇌허혈， 심장허혈， 당뇨병성 혈관심장질환, 심부전， 심근비대증, 망막허혈, 허혈성 대장염， 허혈성 급성 신부전증, 뇌졸중， 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반웅으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3이 294번째 프를린이 비활성화되어 NDRG3 단백질이 증가되고， 젖산 -NDRG3-c-Raf -ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로, 상기 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물을 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제의 용도를 제공한다.
상기 NDRG3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 NDRG3 단백질의 발현 촉진제는 NDRG3 단백질의 47번째 알기닌, 66번째 아스파라긴, 68번째 라이신, 69번째 세린, 72번째 아스파라긴, 73번째 알라닌, 76번째 아스파라긴. 77번째 페닐알라닌, 78번째 글루탐산, 81번째 글루타민, 97번째 글루타민, 98번째 글루타민, 99번째 글루탐산, 100번째 글라이신, 101번째 알라닌, 102번째 프를린, 103번째 세린, 203번째 류신, 204번째 아스파르트산, 205번째 류신, 208번째 쓰레오닌， 209번째 타이로신, 211번째 메티오닌, 212번째 히스티딘, 214번째 알라닌, 215번째 글루타민. 216번째 아스파르트산. 217번째 이소류신, 218번째 아스파라긴, 219번째 글루타민. 296번째 발린. 297번째 발린. 298번째 글루타민ᅳ 300번째 글라이신 및 301번째 라이신으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 PHD2 도킹 부위에 PHD2의 결합을 억제하는 것이 바람직하고. NDRG3 단백질의 47번째 알기닌, 66번째 아스파라긴. 68번째 라이신, 69번째 세린， 97번째 글루타민 및 296번째 발린으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 PHD2 도킹 부위에 PHD2의 결합을 억제하는 것이 보다 바람직하며 , NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌 또는 66번째 아스파라긴 부위를 표적으로 하는 것이 보다 바람직하고, 상기 NDRG3 단백질의 47번째 알기닌 또는 66번째 아스파라긴 부위에 결합하여 PHD2와의 상호작용을 감소시켜 NDRG3 단백질의 발현을 촉진하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 NDRG3 단백질의 발현 촉진제는 NDRG3 단백질의 ¾산 ^(^∑^ 6 ) 결합 부위인 62번째 아스파르트산， 138번째 글라이신， 139번째 알라닌 또는 229번째 타이로신에 젖산의 결합을 촉진하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 NDRG3 단백질의 활성 촉진제는 NDRG3과 PKC- β , RACK1 또는 c-Raf 중 어느 하나 이상의 결합 정도를 촉진하는 것이 바람직하다.
상기 허혈성 질환은 뇌허혈ᅳ 심장허혈， 당뇨병성 혈관심장질환， 심부전, 심근비대증， 망막허혈， 허혈성 대장염， 허혈성 급성 신부전증， 뇌졸중, 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반웅으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3 및 NDRG3의 이소성 돌연변이체가 RACK1 , PKC- β 및 c-Raf와 복합체를 형성하고， 젖산 -NDRG3-C- Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로， 상기 NDRG3의 발현 또는 활성을 촉진하는 단백질 또는 화합물을 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌, 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포의 용도를 제공한다.
상기 NDRG3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 벡터는 선형 DNA , 풀라스미드 DNA , 또는 재조합 바이러스성 백터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 재조합 바이러스성 백터는 레트로바이러스， 아데노바이러스， 헤스페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 세포는 조혈줄기세포， 수지상세포 및 종양세로로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반응으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3 및 NDRG3의 이소성 돌연변이체가 RACK1 , PKC- β 및 c-Raf와 복합체를 형성하고， 젖산 -NDRG3-C- Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로， 상기 NDRG3 또는 이의 돌연변이체, 상기 돌연변이체를 암호화하는 백터 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물의 용도를 제공한다.
상기 허혈성 질환은 뇌허혈， 심장허혈， 당뇨병성 혈관심장질환， 심부전， 심근비대증， 망막허혈， 허혈성 대장염， 허혈성 급성 신부전증， 뇌졸중， 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 저산소증 반응으로 생성된 젖산에 의해 매개된 NDRG3이 294번째 프를린이 비활성화되어 NDRG3 단백질이 증가되고， 젖산 -NDRG3-c-Raf-ERK 신호 경로를 통해 혈관신생을 촉진하므로, 상기 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물을 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> DRG3 과발현 형질전환마우스의 제작 NDRG3의 발현이 생화학적 특징에 미치는 영향을 확인하기 위하여ᅳ NDRG3 과발현 형질전환 마우스를 제작하였다.
구체적으로， 도 la의 모식도와 같이 인간 NDRG3 cDNA 서열 (서열번호 1)을 CAG-프로모터 (거대세포바이러스 인핸서 (cytomegalovirus enhancer) 및 치킨 (chicken) βᅳ액틴 프로모터) 및 레빗 β -글로빈 (globin) 폴리아데닐화 (polyadenylation) 서열을 포함하는 pCAGGS 플라스미드에 클로닝하여 선형화한 후， 상기 선형화된 컨스트럭트 (construct)를 3마리의 C57/BL6 마우스 수정란의 전핵 (pronuclei)으로 주입하였다. 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여 상기 3마리의 C57/BL6 마우스 각각의 꼬리를 잘라 마우스 꼬리 용해 버퍼 (mouse tail lysis buffer, 60 mM Tris pH 8.0/100 mM EDTA/ 0.5% SDS, 500 ug/ml Proteinase K)를 이용해 게놈 DNA( genomic DNA)를 추출한 후， 하기 [표 1]의 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 유전자형을 확인하였다 (도 lb). 상기 3마리의 C57/BL6 마우스 각각에서 이식된 NDRG3을 발현하는 것을 확인한후， 정상 마우스와 교배하여 F1 세대의 마우스 각각을 획득하고 상기와 동일한 방법으로 유전자형을 확인하여 NDRG3을 과발현하는 형질전환 마우스의 계통 TG-2, TG-8 및 TG-13을 확립하였다.
【표 11
Figure imgf000030_0001
또한， 상기 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 TG-2, TG-8 및 TG-13에서 NDRG3의 과발현을 다시 한번 확인하기 위하여 상기와 같이 [표 1]의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다 (도 lc).
<실시예 2> 인간 DRG3항체의 제조
인간 NDRG3 단백질에 대한 항체를 제조하기 위하여， 재조합 인간 NDRG3 단백질의 아미노산 32-315 서열 (서열번호 2)을 pET-28a 백터로 클로닝 하고 대장균 균주 BL21로 형질전환하고， 상기 형질전환된 대장균 균주 BL21를 37°C에서 100 mg/mi 엠피실린 (ampicillin)이 포함된 LB 배지로 0D값이 0D595=0.5가 될 때까지 배양한 후 1 mM 농도의 IPTG(isopropyl-13-D-thiog lactoside)를 첨가하여 16°C에서 12시간동안 유도 (induction)하였다. 그 다음， 상기 균주를 4°C에서 15분 동안 4,000 rpm으로 원심분리하고 버페 50 mM HEPES (pH 7.5) 및 150 mM NaCl]로 재현탁한 후， 2분 동안 3초 펄스 (pulse)로 얼음통 안에서 초음파 분쇄 (sonication)하고 다시 4°C에서 15분 동안 12,000 rpm으로 원심분리하였다. 그 다음， 재조합 단백질은 Ni-NTA 아가로오스 레진 (Resin)을 이용하여 Ni-NTA 아가로오스 친화 크로마토그래피를 통해 제조사의 절차에— 따라 정제하였다. 그 다음， 상기 정제한 인간 NDRG3 재조합 단백질 (아미노산 32-315)을 레빗 (rabbif, New Zealand White)에 면역화하였다. 다클론 항혈청 (polyclonal antisera)의 생산은 AbFrontier (서울， 대한민국)에 의뢰하여 제작하였다. 항혈청은 NDRG3 펩타이드 (QNDNKSKTLKCS; 아미노산 244 ~ 255， 서열번호 3)를 이용하여 친화 크로마토그래피로 정제하여 항 -NDRG3 항체를 획득하였다. 상기 항ᅳ NDRG3 항체의 특이성을 확인하기 위하여， 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
구체적으로， Myc-태그된 NDRG1 발현 백터， Myc-태그된 NDRG2 발현백터，
Myc-태그된 NDRG4 발현백터 및， Myc-태그된 NDRG3 발현 백터를 클로닝하였다. 또한, NDRG3 변이체를 제작하기 위하여 상기 Myc-태그된 NDRG3 발현 백터를 주형으로 하여 하기 [표 2]의 프라이머로 KOD—Plus-Mut agenesis 키트 (Toyobo)를 이용해 제조사의 절차에 따라 부위 -지정 돌연변이를 수행하여 NDRG3의 66번째 아스파라긴 (Asn, N)을 아스파르트산으로 치환한 Myc-태그된 NDRG3(N66D) 변이체를 획득하였다. 그 다음， 상기 NDRGl-Myc, NDRG2-Myc , NDRG4— Myc 및 NDRG3(N66D)-Myc 각각을 io% FBS(Gibco BRL) 및 100 U/ml 패니실린 (penici 11 in, Gibco BRL)이 포함된 DMEM 배지로 배양한 HEK293T 세포 (ATCC)에 리포펙타민 (Lipofectamine) (Invitrogen)을 이용하여 제조사의 절차에 따라 형질전환 (transfection)하였다. 그 다음， 상기 형질전환된 세포를 37°C C02 배양기 (Sanyo)에서 24시간 동안 배양하고 회수하였다. 그 다음， 상기 회수한 세포를 용해 버페 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 100 mM KC1 , 20 mM HEPES (pH 7.9)， 10 mM EDTA, 프로테아제 억제제 (protease inhibitor) 칵테일 (Roche)]를 이용하여 용해하고， 상기 세포의 단백질 용해물 (30 g)을 9% SDS-PAGE로 전기영동한 후， 니트로셀를로오스 막 Cnitrocel lulose membranes) (PALL Life Sciences)으로 전달시켰다. 그 다음， 일차 항체로 상기 획득한 항 -NDRG3 항체를 처리하여 반웅시킨 후， 상기 막에 붙은 일차 항체에 HRP-접합 이차 항체를 붙이고, 이를 ECL(Pierce chemical co, USA)을 이용하여 확인하였다 (도 2).
【표 2】
Figure imgf000032_0001
그 결과， 도 2에 나타낸 바와 같이， 제조된 항 -NDRG3 항체는 NDRGl, NDRG2 및 NDRG4를 제외한 NDRG3(N66D) 변이체에만 결합하는 것을 확인함으로써， 상기 항- NDDRG3 항체는 NDRG3 항체 및 변이체를 항원으로 결합하는 항체이며， 따라서， 본 발명의 NDRG3의 분자생물학적 기능을 확인하기 위해 사용하였다 (도 2).
<실시예 3> PHD2의 결합 단백질로서 NDRG3 확인
정상산소에서 PHD2(Prolyl -hydroxylase domain 2)는 저산소에 의해 유도되는 유전자의 발현에 중요한 전사인자인 HIF-Ια (Hypoxia-inducible Factor- 1α)의 활성을 조절한다고 보고되고 있다 (Wenger, R. H. et al. , Curr. Pharm. Des. , 2009(15), 3886-3894) . 따라서 , 저산소 반웅 (hypoxia responses)에 있어서 PHD2에 의해 HIF-비의존적으로 조절되는 인자를 찾기 위하여， 면역침전법 (immunoprecipitation), 면역염색 (immunostaining) 및 마이크로 -LO MS/MS 분석법을 수행하였다.
구체적으로， PHD2 결합 단백질을 확인하기 위하여 도 3a의 모식도와 같이 Flag-태그된 PHD2를 암호화하는 컨스트럭트 (construct)를 제작한 후， 10% FBSCGibco BRL) 및 100 U/ml 패니실린 (penici 11 in, Gibco BRL)이 포함된 DMEM 배지로 배양한 MCF-7 세포 (ATCC)에 상기 컨스트럭트 및 대조군 (mock)을 리포펙타민 (Lipofectamine) (Invitrogen)을 이용하여 제조사의 절차에 따라 형질전환 (transfection)하였다. 그 다음， 상기 형질전환된 세포에 프로테아좀 (proteasome) 억제제인 MG132 10 μΜ를 처리하고 92-94% Ν2, 5% C02 및 1% 02로 구성된 흔합 기체가 포함된 02/C02 배양기 (Sanyo)를.이용하여 24시간 동안 저산소 (hypoxia) 상태를 유지하고， 용해 버페 1% Triton X-100, 150 mM NaCl， 100 mM C1, 20 mM HEPESCpH 7.9)， 10 mM EDTA, 프로테아제 억제제 (protease inhibitor) 칵테일 (Roche)]를 이용하여 용해하였다. 상기 세포의 단백질 용해물 (1 mg)올 항- FLAG M2 친화 겔 (Sigma)을 이용하여 4°C에서 하투 동안 반웅하고 원심분리하여 면역침전한 후， 9% SDS-PAGE로 전기영동하고 코마시 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue, CBB)로 염색하였다. 그 다음, 상기 PHD2-Flag 샘플에서 다른 면역침전 패턴을 나타내는 단백질 밴드를 SDS-PAGE 겔로부터 분리하고 마이크로- LC-MS/MS 분석을 위하여 트립신 (trypsin)으로 겔을 소화하였다. 상기 소화된 단백질은 8 cm의 5-mm 입자 사이즈 Aqua C18 역상 컬럼을 포함한 융합된 실리카 모세관 컬럼 (100 隱 내부지름， 360 mm 외부 지름)에 주입하였다. 상기 컬럼은 Agilent HP 1100 4차 IX 펌프에 옮기고 분리 시스템으로 250 η·2/분의 유속을 사용하여 펩티드를 분리하였다. 또한， 버퍼 Α(5% 아세토니트릴 (acetonitrile) 및 0.1%포름산 (formic acid)) 및 버퍼 B(8OT 아세토니트릴 및 0.W 포름산)를 120 분 구배 (gradients)를 위해 사용하였다. 용출된 펩티드는 LTQ 선형 이온 트랩 질량분석기 (Thermo Finnigan)로 2.3 kV DC 전위로 전기분무 방법으로 분리되었다. 하나의 전체 MS 스캔 (400-1,400 m/z)으로 구성된 데이터 의존적 스캔 및 5개의 데이터 의존적 MS/MS 스캔은 용출된 펩티드의 MS/MS 스펙트럼을 발생시키기 위해 사용되었다. 그 다음， MS/MS 스펙트럼은 Bioworks version 3.1을 이용하여 NCBI 인간 단백질 서열 데이터베이스로부터 분석되었다. DTASelect는 검색 결과를 필터링하기 위해 사용하였고， Xcorr 값은 펩티드의 다른 전하 상태에 적용되었다: 1.8은 단일전하 펩티드 (singly charged peptides)로 적용되었고， 2.5는 이중전하 펩티드로 적용되었고， 3.5는 삼증전하 펩티드로 적용되었다 (도 3b).
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이， PHD2-Flag 샘플로부터 적출된 단백질 중 질량분석으로 10 종류의 PHD2 결합 단백질을 확인하였고， 그 중 분화 및 발생， 저산소증뿐만 아니라 세포 증식 (proliferation), 이동 (migration) 및 침입 (invasion)과 연관이 있는 유전자 패밀리에 속하는 NDRG3을 선택하였다 (도 3b). 또한, 상기 NDRG3이 PHD2 결합 단백질임을 다시 한번 더 확인하기 위하여 면역침전법 및 웨스턴 블¾팅을 수행하였다.
구체적으로, 상기 대조군 및 Flag-태그된 PHD2 컨스트럭트를 형질전환한 MCF-7 세포 용해물을 항 -FLAG M2 친화 겔 (Signia)을 이용하여 면역침전한 후， 9% SDS-PAGE로 전기영동하고 니트로셀를로오스 막 (nitrocellulose membranes) (PALL Life Sciences)으로 전달시켰다. 그 다음. 일차 항체로 항 -NDRG3 항체 및 항 -Flag 항체를 처리하여 반웅시킨 후, 상기 막에 붙은 일차 항체에 HRPᅳ접합 이차 항체를 붙이고. 이를 ECL(Pierce chemical co, USA)을 이용하여 확인하였다 (도 3c).
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 . 면역침강된 FLAG 비드로부터 분리된 42 KDa의 단백질을 확인함으로써, NDRG3이 PHD2의 결합단백질임을 확인하였다 (도 3c).
<실시예 4> PHD2의 고유 기질로서 NDRG3 확인
<4-1> PHD2 및 NDRG3의 상호작용 확인
PHD2의 결합 단백질로서 NDRG3과 PHD2의 상호작용 및 NDRG3 단백질 발현에 있어서 PHD2 및 NDRG3의 상호작용이 미치는 영향을 확인하기 위하여 면역침전법 및 웨스턴 블럿팅. 및 시험관내 (in-vitro) 풀 -다운 분석법 (pull-down assay)를 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>과 같이 Flag-태그된 PHD2를 암호화하는 컨스트럭트를 10% FBS(Gibco BRL) 및 100 U/ml 패니실린 (penici 11 in, Gibco BRL)이 포함된 DMEM 배지로 배양한 HeLa 세포 (ATCC)에 형질전환하고, 24시간 동안 1 ) 산소로 저산소 상태를 유지한 후 용해하였다. 그 다음, 세포 용해물을 항 -FLAG M2 비드를 이용하여 면역침전하고. 일차항체로 항 -NDRG3 및 항— Flag 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 4a, 위). 또한, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 PHD2를 pET-28a 재조합 플라스미드에 클로닝하고 대장균 균주 BL21에 형질전환한 후, Ni-NTA 아가로오스 레진을 이용하여 정제하였다. 또한, NDRG3을 PGEX-4T-2 재조합 플라스미드에 클로닝하고 대장균 균주 BL21에 형질전환한 후, GST-결합 아가로오스 레진 (ELPIS BIOTECH, 한국)을 이용하여 정제하였다. 그 다음， 상기 재조합 단백질 His— PHD2 10 및 /또는 재조합 단백질 GST-NDRG3 10 을 최종 농도 0.2 mg/ ^로 Ni-NTA 아가로오스 (Giagen) 레진 (resin)과 함께 4°C에서 4 시간 동안 배양하였다. 그 다음 레진에 결합한 NDRG3 단백질을 SDS 시료 완충용액을 처리하고 상기 <실시예 3>과 같이 SDS-PAGE로 전기영동한 후， 일차항체로 항 -NDRG3 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 4a, 아래). 또한， PHD2 및 NDRG3 간의 기능적 관계를 확인하기 위하여 MCF-7 세포 (도„
4b) 또는 HeLa 세포 (도 4c)를 정상 산소 상태 (21% 02)하에서 24 시간 동안 PHD2 억제제인 DFX(desferrioxamine)를 농도별로 처리한 후, 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 용해하였다. 상기 세포 용해물은 항 -NDRG3, 항 -HIF-la 및 항 -β-액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅올 수행하였다 (도 4b 및 도 4c).
그 결과， 도 4a에 나타낸 바와 같이， 저산소 상태 하에서 면역침전된
PHD2와 NDRG3이 결합하며， 재조합된 PHD2 및 NDRG3이 결합하는 것을 확인함으로써， PHD2 및 NDRG3이 직접적으로 상호작용함을 확인하였다 (도 4a) ·
또한， 도 4b 및 도 4c에 나타낸 바와 같이， HeLa 세포에서 NDRG3 단백질의 기본 발현 수준이 미비하지만， MCF-7 및 HeLa 세포 모두 PHD2 억제제인 DFX에 의해 PHD2의 활성이 억제된 경우 NDRG3 단백질의 발현이 중가하는 것을 확인함으로써， PHD2 활성이 억제됨에 따라 약물 -의존적으로 NDRG3이 축적되며， NDRG3이 PHD2의 고유 기질임을 확인하였다 (도 4b 및 도 4c).
<4-2> PHD패밀리 단백질 및 NDRG3의 상호작용확인
PHD 패밀리는 PHDl, PHD2, PHD3, P4HTM 및 P4HA1 으로 구성되어 있으며， 이들 패밀리는 HIF 단백질의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다 (Wenger, R. H. et al. , Curr. Pharm. Des. , 2009(15), 3886-3894) . 따라서， PHD2 이외 다른 PHD 패밀리 및 E3 유비퀴틴 (ubiquitin) 연결효소 (ligase) 복합체의 표적 단백질인 VHL와 NDRG3 간의 관련성올 확인하기 위하여, RNA 간섭으로 PHD가 낙다운 (knockdown)된 세포 및 PHD 패밀리가 과발현된 세포를 이용해 RT-PCR, 면역침전법 및 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
구체적으로, s iVHU si GENOME SMARTpool, Dharmacon) 및 삼천리제약 (한국)에 의뢰하여 하기 [표 3]의 서열을 이용하여 siRNA를 제작한 후 리포펙타민을 이용하여 제조사의 절차에 따라 HeLa 세포에 형질전환하여， GFP, PHDl, PHD2, PHD3, P4HTM, P4HA1 또는 VHL의 발현이 억제된 세포를 획득하고， 상기 각각의 발현아 억제된 세포를 48 시간 동안 정상 산소 상태 (21% 02) 하에서 유지 배양한 후 회수하였다. 그 다음， 상기 회수한 세포를 Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 총 RNA를 분리한 후， 분리한 RNA 5 휼 역전사효소 (reverse transcriptase)와 함께 반웅시켜 cDNA를 합성하고， PCR 산물을 아가로스 겔로 전기영동한 후 시각화하였다 (도 )·
【표 3】
Figure imgf000036_0001
또한， PHD 패밀리와 NDRG3 단백질의 상호작용을 확인하기 위하여 Flag- 태그된 PHDl, Flag—태그된 PHD2, Flag-태그된 PHD3 ， Flag-태그된 P4HTM 및 Flag- 태그된 P4HA1 발현 백터, 및 NDRG3 발현백터를 제작한 후， 상기 <실시예 3>에 기재된 방법으로 NDRG3 및 상기 Flag-태그된 PHD 패밀리 각각을 HeLa 세포로 형질전환하고， 정상 상태에서 20 μ Μ MG132를 8 시간 동안 처리한 후 세포를 획득하여 용해하였다ᅳ 그 다음, 상기 세포 용해물을 항 -FLAG M2 비드로 면역침전하고， 항 -NDRG3 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 5b) . 그 결과， 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이， R A 간섭을 이용하여 PHD2 및 VHL의 발현을 억제한 경우 NDRG3이 축적되는 것을 확인함으로써， PHD 패밀리 군 중에서 PHD2가 NDRG3 단백질의 안정화에 있어서 주된 전사후 조절자 (posttranslat ional regulator)이고， 정상 산소 상태에서 ,NDRG3은 유비퀴틴 (ubiqut in)의 표적 단백질이며， 따라서 NDRG3이 PHD2/VHL-매개 전사후 과정의 기질임을 확인하였다 (도 5a 및 도 5b) .
<4-3> NDRG3에서 PHD2의 도킹부위 확인
PHD2의 기질로서 NDRG3에 PHD2가 도킹 (docking)하는 위치를 확인하기 위하여， 면역침전법 및 단백질 도킹 시물레이션 (docking simulat ion)을 수행하고， 상기 도킹 시뮬레이션을 통해 확인한 NDRG3의 여러 추정상 PHD2-도킹 부위와 PHD2와의 결합력을 확인하기 위하여, 부위 -지정 돌연변이 (site-di rect mutat ion)를 이용하여 도킹 부위를 돌연변이한 NDRG3 변이체를 이용하여 면역침전법 및 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. .
구체적으로， 예측되는 표적 단백질의 단백질-단백질 도킹 시뮬레이션은 HEX6.3(D.W. Ri tchie , et al . , Genet , 2000(39) , 178-194)에 의해 수행되었다. 계산 선택사항에 있어서， 모양 (shape) 및 정전기학 (electrostat i st ics)은 상관관계 타입 (correlat ion type)으로 선택되었고， 범프 (bumps) 및 볼륨 (volumes)은 과정 후 선택되었다. 나머지 선택사항은 디폴트 배열 (default conf igurat ion)을 사용하였다. 단일 표적 도킹 (즉， NDRG3-EGLN1)을 위하여， 시물레이션은 상기 나열된 선택사항을 한번 사용하여 수행되었다. 다중 표적 구조를 위한 도킹 (즉， NDRG3 및 PHD2)은 두 -단계 실험을 통해 수행되었다. 첫 단계에서는， NDRG3이 각각의 표적을 위한 도킹 실험에서 수용체 단백질로서 사용되었다. 두 번째 단계에서는， 결과물 단백질-단백질 상호작용이 다른 단백질의 도킹을 위한 수용체 단백질로서 사용되었다. 두 번째 실험을 위한 입력값 ( input order)는 PHD2로 하였다. 도킹 계산은 RMSD(root-mean-square deviat ion)에 의해 수행되었고 결과는 단일 입력으로부터의 산출값이 다중 입력으로부터의 산출값과 일치하는 곳에서 필터링하였다. 필터링된 결과값 중에서, 가장 안정된 하나를 HEX6.3 총 점수 (모양 점수 및 전정기학 점수의 합)를 이용하여 선택하였다 (도 6a) .
또한， 도킹 시뮬레이션으로 확인한 NDRG3의 도킹부위와 PHD2의 결합력을 확인하기 위하여 NDRG3-Myc 발현 백터를 주형으로 KOD-Plus-Mut agenesi s 키트 (Toyobo)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 부위 -지정 돌연변이를 수행하여 NDRG3의 47번째 알기닌 (Arg, R)을 아스파르트산 (Asp, D)으로 치환한 Myc-태그된 NDRG3(R47D) 변이체， NDRG3의 66번째 아스파라긴 (Asn, N)을 아스파르트산으로 치환한 Myc-태그된 NDRG3(N66D) 변이체， NDRG3의 97번째 글루타민 (Gin, Q)을 글루탐산 (Glu, E)으로 치환한 Myc-태그된 NDRG3(Q97E) 변이체， NDRG3의 296번째 발린 (Val , V)을 아스파르트산으로 치환한 Myc-태그된 NDRG3(V296D) 변이체를 획득하였다. 그 다음， 상기 <실시예 3>과 같이 상기 각각의 Mycᅳ태그된 NDRG3 변이체， Flag-태그된 PHD2 및 HA-태그된 VHL 컨스트력트를 동시에 HEK293T 세포 (ATCC)로 형질전환하고， 상기 형질전환된 HEK293T 세포에 8 시간 동안 20 μ Μ MG132를 처리한 후 용해하였다. 상기 세포 용해물은 항 -Myc 친화겔 (Sigma)을 이용하여 면역침전하고， 일차항체로 항 -Flag, 항 -HA 및 한ᅳ Myc 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 6b) .
그 결과， 도 6a에 나타낸 바와 같이， 공개된 PHD2 기질 (Structure . 2009(7)， 981-9)과 NDRG3 기질 사이의 도킹 모델로부터 NDRG3의 추정상 PHD2-도킹 부위로 47번째 알기닌 (Arginine) , 66번째 아스파라긴 (Asparagine)， 68번째 라이신 (Lysine) , 69번째 세린 (Serine) , 72번째 아스파라긴， 73번째 알라닌 (Alanine) , 76번째 아스파라긴， 77번째 페닐알라닌 (Phenylalanine)， 78번째 글루탐산 (Glutamic acid) , 81번째 글루타민 (Glutamine)， 97번째 글루타민， 98번째 글루타민， 99번째 글루탐산， 100번째 글라이신 (Glycine) , 101번째 알라닌， 102번째 프를린 (Prol ine) , 103번째 세린， 203번째 류신 (Leucine) , 204번째 아스파르트산 (Aspart ic acid) , 205번째 류신, 208번째 쓰레오닌 (Threonine) , 209번째 타이로신 (Tyrosine) , 211번째 메티오닌 (Methionine) , 212번째 히스티딘 (Hist idine) , 214번째 알라닌， 215번째 글루타민， 216번째 아스파르트산， 217번째 이소류신 (Isoleucine), 218번째 아스파라긴， 219번째 글루타민, 296번째 발린 (Valine), 297번째 발린， 298번째 글루타민， 300번째 글라이신 및 3이번째 라이신 부위를 확인하였고, 상기 PHD2-도킹 부위 중 47번째, 66번째, 97번째 및 296번째 아미노산 위치가 더욱 중요함을 확인하였다 (도 6a).
또한, 도 6b에 나타내 바와 같이, NDRG3 V296D) 변이체 및 NDRG3(Q97E) 변이체는 PHD2와 결합하는 반면， NDRG3의 47번째 위치 또는 66번째 위치를 돌연변이한 NDRG3 변이체가 PHD2와 결합하지 않으며， 또한， PHD2와 높은 친화도를 보이는 NDRG3 변이체는 VHL에 의해 많은 양으로 면역침전되는 것을 확인함으로써 , NDRG3 변이체가 다양한 PHD2-결합력 (V296D>Q97E>R47D=N66D)올 나타내며， 정상 산소 상태하에서 NDRG3의 47번째 및 66번째 아미노산 위치가 PHD2의 도킹에 중요하며， VHL과도 관련이 있음을 확인하였다 (도 6b).
<4-4> 정상산소 상태에서 PHD2/VHL-매개 프로테아좀 경로에 의한 NDRG3의 조절 확인
정상산소 상태 하에서 PHD2 및 E3 유비퀴틴 연결효소 복합체의 표적 요소인
VHL이 NDRG3의 단백질 발현 및 조절에 미치는 영향을 확인하기 위하여， MG132를 이용하여 프로테아좀 (proteasome) 활성을 억제하고 웨스턴 블럿팅 및 생체 내 유비퀴틴화 분석법 (In-vivo ubiquitination assay)을 수행하였다.
구체적으로， 전장 NDRG3 cDNA (서열번호 1) 및 pMSCVneo 레트로바이러스 백터 (Clontech)를 이용하여 형질감염용 백터 (MSCV 레트로바이러스 시스템)를 제작하였다ᅳ 바이러스 제작을 위하여， 리포펙타민 (Lipofectamine)(Invitrogen)을 사용하여 GP293 세포주에 형질감염하였다. 48시간 후， NDRG3-레트로바이러스 또는 대조 -레트로바이러스가 포함된 세포 상층액을 6 μg/m\ 폴리브렌 (polybrene)와 같이 HeLa 세포에 24 시간 처리한 다음， 상기 NDRG3이 과발현된 세포에 8 시간 동안 20 μΜ MG132를 처리 또는 무처리한 후 세포를 획득하고， 항 -NDRG3 항체 및 항 -β- 액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 7a) ·
또한， 정상 산소 상태에서 NDRG3의 유비퀴틴화를 확인하기 위하여 생체 내 유비퀴틴화 분석법을 수행하였다. 먼저, NDRG3의 발현을 억제하기 위해 shNDRG3(Sigma-Aldrich, 서열번호 4) 및 렌티바이러스 ( lent ivirus) 백터를 이용하여 형질감염용 백터를 제작하였다. 바이러스 제작을 위하여, 상기와 같이 패킹 세포주에 형질감염하였다. 그 다음， 상기 NDRG3 shRNA 발현 렌티바이러스가 포함된 세포 상층액을 6 μg/m 폴리브렌 (polybrene)와 함께 HeLa 세포에 처리한 후 10% FBS을 포함한 DMEM 배지에서 유지한 다음， 대조군 HeLa 세포， 상기 NDRG3 발현이 억제된 HeLa 세포 및 상기 NDRG3이 과발현된 HeLa 세포를 상기 <실시예 3>과 같이 HA—태그된 유비퀴틴로 형질전환하고， 8 시간 동안 20 μ Μ MG132를 처리한 후 세포를 획득하여 용해하였다. 그 다음， 상기 세포 용해물은 30 ≠ 단백질 G-아가로오스 비드 (bead , Sant a Cruz Bi otechno logy)를 첨가하여 프리클리어 (prec l ear )한 후 항 -NDRG3 항체로 면역침전하고， 다유비퀴틴화된 (polyubi qui t inated) 형태의 NDRG3을 항 -HA 항체를 아용하여 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다 (도 7b) .
그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이， 정상 산소 상태에서 MG132로 프로테아좀을 억제한 경우 NDRG3이 과발현된 세포에서 NDRG3 단백질이 활발하게 유비퀴틴화 되는 것을 확인함으로써， 정상 산소 상태에서 NDRG3이 유비퀴틴화 되어 프로테아좀 경로를 통해 분해되는 것을 확인하였다 (도 7a 및 도 7b) . 따라서， 상기 <실시예 4>의 결과들을 통해 NDRG3이 고유한 PHD2-상호작용하는 단백질이고， 상기 NDRG3 단백질의 발현은 PHD2/VHL-매개 프로테아좀 경로에 의해 전사후 조절됨을 확인하였다. <실시예 5>저산소상태에서 I)RG3의 발현 확인
<5-1> NDRG3 단백질의 산소-의존적 발현 확인
PHD2의 활성은 02 유효성에 의존적이므로 PHD2의 고유 기질인 NDRG3 단백질 또한 안정성에 있어서 산소 상태가 영향을 미치는지 확인하기 위하여， 산소 상태를 달리한 여러 세포를 이용하여 면역침전법， 웨스턴 블럿팅， 면역형광염색법 및 생체내 유비퀴틴화 분석법을 수행하였다.
구체적으로， 10% FBS 및 100 U/ml 패니실린이 포함된 DMEM 배지로 배양된 MCF-7 세포를 1%， 3% , 5% 및 21% 02와 92-94% N2 및 5% C02로 구성된 혼합 기체가 포함된 02/C02 배양기를 이용하여 시간별로 유지한 후, 세포를 획득하였다, 그 다음, 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 용해하고， 세포 용해물을 항 -NDRG3 및 항- β-액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅하여 NDRG3의 발현을 확인하고， 그래프화하였다 (도 8a).
또한， 10% FBS 및 100 U/ml 패니실린이 포함된 DMEM 배지로 커퍼슬립 (cover slips)에서 배양된 MCF-7 세포를 1% 02와 94% N2 및 5% C02로 구성된 흔합 기체가 포함된 02/C02 배양기를 이용하여 저산소 상태를 시간별로 유지하였다. 그 다음， 20분 동안 4 ) 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)/PBS로 고정하고， 상온에서 5분 동안 0.3% TritonX-100/PBS로 침투화한 후， 차단 용액 (1% BSA가 포함된 PBS)으로 30분 동안 배양하였다. 그 다음， 상기 세포를 상온에서 1시간 동안 항- NDRG3 항체 (1/1 ,000)로 반웅하고 세척한 후, 2차 항체 [Alexa Flour 488-접합된 고트 (goat) 항 -레빗 IgG (1/1,000), 또는 Alexa Flour 594- 접합된 고트 항-마우스 IgG (1/1,000)； Amersham] 및 DAPI (3 μΜ, Sigma)로 반웅시켰다. 그 후， Zeiss LSM 510 공초점 현미경을 이용하여 시각화하였다 (도 8b).
또한， 10% FBS 및 100 U/ml 패니실린이 포함된 DMEM 배지로 배양된 MCF- 7(유방)， PLC/PRF/5 간)， Huh-1(간) , HeLa (자궁경부)， HEK293T (신장) 및 MCF- 10A (유방) 세포 및 10% FBS 및 100 U/ml 패니실린이 포함된 RPMI 1640 배지로 배양된 SM80 대장) 및 IMR-90 폐)를 상기와 같이 O2/CO2 배양기를 이용하여 저산소 상태 (1% 02)에서 시간별로 유지한 후， 세포를 획득하였다. 그 다음， 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 용해하고， 세포 용해물을 항— NDRG3 및 항 -β-액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅하여 NDRG3의 발현을 확인하고ᅳ 그래프화하였다 (도 8c). 또한, 저산소 상태에서 NDRG3의 유비퀴틴화를 확인하기 위하여 생체 내 유비퀴틴화 분석법을 수행하였다. 상기 <실시쎄 3>과 같이 HA-태그된 유비퀴틴 및 Myc-태그된 NDRG3을 HeLa 세포에 형질전환한 후， 40시간 동안 정상산소 상태에서 배양하고 8 시간 동안 20 μΜ MG132를 처리하였다. 그 다음. 24시간 ^안 추가적으로 저산소 상태 (1% 02)에서 배양한 후， 세포를 획득하여 용해하였다. 그 다음， 상기 세포 용해물은 30 μί 단백질 G-아가로오스 비드 (bead, Santa Cruz Biotechnology)를 첨가하여 프리클리어한 후 항 -Myc 항체로 면역침전하고， 항 -HA 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅하였다 (도 8d).
그 결과, 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이， 세포에서 02 농도가 감소할수록， 그리고 시간이 지속될수록 NDRG3 단백질의 축적이 증가하는 것을 확인함으로써, 02 농도에 반비례하게 NDRG3 단백질이 축적됨을 확인하였다 (도 8a 및 도 8b) .
또한， 도 8c에 나타낸 바와 같이， 저산소 상태에 따른 NDRG3 단백질의 축적은 비 -형질전환된 세포뿐만 아니라 대장, 간， 자궁경부， 신장， 폐 등 다양한 조직 유래 암세포에서 동일하게 나타나는 것을 확인함으로써， 02 농도 및 NDRG3 단백질의 반비례 관계는 전형적인 현상임을 확인하였다 (도 8c) .
또한， 도 8d에 나타낸 바와 같이， 저산소 상태 하에 NDRG3 단백질이 유비퀴틴화가 감소하는 것을 확인하였다 (도 8d) . 따라서，:상기 결과들을 통해 정상산소 상태와 달리 저산소 상태 하에 NDRG3 단백질의 축적은 증가하고， 유비퀴틴화는 감소하는 것을 확인하였다.
<5-2>산소상태에 따른 NDRG3 단백질의 안정성 확인
저산소 상태 및 정상 산소 상태에 따른 NDRG3 단백질의 발현 변화를 확인하기 위하여， 산소 상태를 달리한 쎄포를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
구체적으로， 지속적인 저산소 상태에서 NDRG3 단백질의 발현을 확인하기 위하여 상기 실시예 <5-1>과 같이 저산소 상태 ( 1% 02)에서 시간별로 유지 배양한 MCF-7 세포 및 정상 산소 상태 (21% 02)에서 유지 배양한 MCF-7 세포를 획득하여 상기 <실시예 3>과 같이 용해한 후, 항 -NDRG3 , 항 -HIF-l a 및 항 - β -액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅하고 그래프화하였다 (도 9a) ·
또한， 정상 산소 상태로 회복될 때 NDRG3 단백질의 발현 변화를 확인하기 위하여 상기 실시예 <5ᅳ1〉과 같이 저산소 상태 ( 1% 02)에서 24시간 동안 유지 배양한 MCF-7 세포 및 정상 산소 상태 (21% 02)에서 시간별로 유지 배양한 MCF-7 세포를 획득하여 상기 <실시예 3>과 같이 용해한 후， 항 -NDRG3 , 항 -HIF-l a 및 항- β -액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅하고 그래프화하였다 (도 9b) .
그 결과， 도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이， HIF-l a 단백질의 경우 저산소증 초기 단계에서 발현이 유도되고 저산소증이 지속됨에 따라 단백질의 발현이 감소하는 반면， NDRG3 단백질의 경우 저산소증 말기 단계까지 발현이 지속적으로 유지되는 것을 확인하였다. 또한， 상기 지속적으로 저산소 상태에 의해 유도된 NDRG3 발현은 세포가 정상 산소 상태로 다시 돌아갈 때까지 천천히 제거되는 것을 확인하였다 (도 9a 및 도 9b) .
<5-3>산소상태에 따른 NDRG3 단백질의 안정성 조절 기전 확인
저산소 상태에서 NDRG3 단백질의 표적 부위를 확인하기 위하여， 마이크로-
LC-MS/MS 분석법을 수행하고， 부위 -지정 돌연변이로 제작한 NDRG3 변이체가 과발현된 세포를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 또한， 정상 산소 상태에서 NDRG3 단백질의 저산소 표적 부위와 PHD2/VHL의 관련성을 확인하기 위하여， 면역침전법 및 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
구체적으로， 저산소 상태 하에서 NDRG3 단백질의 표적 부위를 확인하기 위하여 상기 실시예 <4-2〉에 기재된 방법으로 획득한 NDRG3이 과발현된 HeLa 세포에 20 μ Μ MG132를 처리한 후 세포를 획득하여 용해하고 상기 <실시예 3>과 같이 항 -Myc 친화겔로 면역침전하고 마이크로 -LC-MS/MS 분석을 수행하였다 (도 10a) . 또한， 상기 마이크로 -LC— MS/MS 분석법의 결과를 통해 확인한 NDRG3 단백질 표적 부위와 PHD2/VHL의 결합을 확인하기 위하여 먼저. NDRG3 단백질 표적 부위로 예상되는 294번째 프를린 (Pro , P)을 알라닌 (Al a , A)으로 치환하기 위하여 상기 실시예 <4-3>과 같이 부위 -지정 돌연변이를 수행하여 Myc-태그된 NDRG3 P294A 변이체를 제작하였다. 그 다음， 상기 NDRG3 변이체 또는 야생형 NDRG3 컨스트럭트를 상기 <실시예 3>과 같이 HEK293T 세포로 형질전환한 후， 40시간 동안 정상 산소 상태 (21% 02) 하에서 배양하고 추가적으로 8시간 동안 20 μ Μ MG132을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 획득하였다. 상기 획득한 세포는 용해 후， 항ᅳ Myc 및 항 - β -액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 10b , 위) . 또한， Fl ag-태그된 PHD2 , HA—태그된 VHL , 및 상기 Myc-태그된 NDRG3P294A 변이체 또는 Myc-태그된 NDRG3을 상기 <실시예 3>과 같이 HEK293T 세포에 동시에 형질전환한 후， 40시간 동안 정상 산소 상태 (21% 02) 하에서 배양하고 추가적으로 8시간 동안 20 μ Μ MG132을 처리하여 세포를 획득하였다. 그 다음， 상기 획득한 세포를 용해 후， 항ᅳ Myc 친화겔로 면연침전하고， 항 -Fl ag , 항 -HA 및 항 -Myc 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 10b , 아래) .
그 결과， 도 10a에 나타낸 바와 같이， 질량 분석을 통해 NDRG3의 294번째 프를린이 PHD2-매개 저산소증 표적 부위이며, 상기 부위가 산소 의존적으로 하드록실화 (hydroxylation) 되는 부위임을 확인하였다 (도 10a).
또한， 도 10b에 나타낸 바와 같이， 예상되는 저산소증 표적 부위인 NDRG3 294번째 아미노산 부위를 알라닌으로 치환한 NDRG3 변이체를 과발현시킨 세포의 경우 정상 산소 상태에서 NDRG3 단백질 변이체의 축적이 증가하고 (도 10b， 위)， 또한， PHD2 및 VHL과의 결합이 감소하는 것 (도 10b, 아래)을 확인함으로써， 상기 NDRG3 단백질 부위가 정상 산소 상태에서 PHD2/VHL과 상호작용하고， 산소 의존적으로 PHD2에 의해 조절됨을 확인하였다 (도 10b). <5-4>산소상태에 따른 HIF-비의존적 DRG3발현 조절 확인
산소 상태에 따라 NDRG3 발현 조절이 HIF 단백질과 관련이 있는지 확인하기 위하여， 산소 상태를 달리한 세포를 이용하여 웨스턴 블럿팅 및 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로， 산소 상태에 따른 HIF 단백질의 발현을 확인하기 위하여 상기 실시예 <5-2>와 같이 정상 산소 상태 (21% 02)에서 24 시간 동안 유지 배양한 MCF-7 세포 및 저산소 상태 (1% 02)에서 시간별로 유지 배양한 MCF-7 세포를 회수한 후， 절반은 상기 <실시예 3〉과 같이 항 -HIF-la , 항 -HIF-2a 및 항 -β-액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하여 단백질의 발현을 확인하고， 절반은 상기 실시예 <4-2>와 같이 RT-PCR을 수행하여 mRNA의 발현을 확인하였다 (도 11a) ·
또한， HIF 및 PHD2의 억제에 따른 NDRG3 단백질의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 먼저， HIF-la 또는 HIF-2a의 발현을 억제하기 위하여 상기 실시예 <4-4〉와 같이 shHIF-la (Sigma-Aldrich), shHIF-2 a (Sigma- Aldrich) 또는 대조군 shGFP 및 렌티바이러스 백터를 이용하여 형질감염용 백터를 제작하였다. 그 다음， 상기 shHIF-la 또는 shHIF-2 a 발현 렌티바이러스가 포함된 세포 상층액을 6
Figure imgf000044_0001
폴리브렌 (polybrene)와 함께 PLC/PRF/5 세포에 처리한 후， 10% FBS을 포함한 DMEM 배지에서 유지한 다음， 대조군 PLC/PRF/5 세포， 상기 HIF-la 또는 HIF-2a 발현이 억제된 PLC/PRF/5 세포를 정상 산소 상태 (21% )하에서 PHD2 억제제인 DFX(desferrioxamine) 1 mM을 시간별로 처리한 후， 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 획득하여 용해하고， 상기 용해물을 항 -NDRG3, 항 -HIF- l a， 항 -HIF-2 a 및 항 -β -액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 lib) . 또한， HIF 및 VHL이 결실에 따른 NDRG3 단백질의 발현을 확인하기 위하여 MCF-7(HIF-1+/+ 및 VHL+/+) , 및 HIF-1 α 및 VHL 좌위 ( loci )가 유전적으로 방해된 786-0(HIF-r/_ 및 VHL_/_) 세포를 상기 실시예 <5-2>와 같이 저산소 상태 ( 1% 02)에서 24시간 동안 유지 배양한 후， 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수하여 용해하고, 상기 세포 용해물을 항 -NDRG3, 항 -HIF-l a 및 항 -β -액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 11c) .
그 결과， 도 11a에 나타낸 바와 같이， 저산소 상태 초기단계에서 HIF-l a 단백질의 발현이 현저히 증가하는 것과 상관없이 저산소 상태가 지속되는 동안 NDRG3 mRNA의 발현 수준이 변화되지 않고 지속적으로 유지되는 것올 확인하였다 (도 11a) .
또한, 도 lib 및 도 11c에 나타낸 바와 같이， 정상 산소 상태에서 HIF의 결실에 영향을 받지 않고 PHD2의 활성 억제가 지속됨에 따라 NDRG3 단백질의 축적이 증가함을 확인하였고 (도 lib) , 저산소 상태에서도 HIF 및 VHL 결실에 영향을 받지 않고 NDRG3 단백질이 발현이 보존됨을 확인하였다 (도 11c) . 따라서， 상기 <실시예 5>의 결과들을 통해， NDRG3 단백질의 발현은 산소 의존적으로 PHD2에 의해 조절되고， 저산소 상태가 지속될수록 NDRG3의 발현이 지속되며， 이때 NDRG3 단백질 및 mRNA의 발현은 HIF 활성에 직접적으로 영향을 받지 않음을 확인하였고， 따라서 NDRG3이 HIF-비의존적으로 지속된 저산소 반응에 있어서 주요한 기능을 가짐을 확인하였다.
<실시예 6>지속적인 저산소 반웅의 조절자로서 NDRG3 확인
<6-1> 저산소상태에서 NDRG3의 기능 확인
저산소 반웅에 있어서 NDRG3의 기능을 확인하기 위하여， NDRG3의 발현이 억제된 세포를 이용하여 마아크로어레이 -기반 트랜스크립톰 데이터 (microarra^ based transcr iptome data)를 GAzer(Gene Set Analyzer) 분석법을 통한 유전자 발현 프로파일링 (prof i l ing)을 수행하였다.
구체적으로， shNDRG.3 및 shHIF-l ci를 이용하여 상기 실시예 <4ᅳ 4> 및 실시예 <5-4>에 기재된 방법으로 NDRG3 또는 HIF-1 α의 발현이 억제된 Huh-7 세포를 제작한 후， 상기 실시예 <5-2>와 같이 저산소 상태 (1¾ 02)에서 시간별로 유지 배양하고 세포를 회수하였다. 그 다음， 상기 회수한 세포로부터 전체 RNA를 RNA 분리 키트 (RNeasy midi-prep, Qiagen)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 분리하였다. 그 다음， 마이크로어레이 (microarray) 분석을 위하여 상기 분리한 전체 RNA 200 ng을 Illumina TotalPrep™ RNA 증폭 키트를 이용하여 증폭한 후， 증폭된 cRNA 700 ng을 HumanHT-12 v3/v4 발현 비드칩 (Expression BeadChip)을 이용하여 16시간 동안 58°C에서 흔성화하였다. 세척 및 염색 후， 비드칩을 일루미나 비드어레이 리더 (Illumina BeadArray Reader) 및 비드 스캔 (Bead Scan) 소프트웨어 (Illumina)를 이용하여 스캐닝하였다. 발현된 유전자는 GCXgene ontology) 분석을 이용하여 기능별로 구분하였다 (Ashburner， M. et al . , Nat. Genet., 2000(25), 25-29) . 이 과정에서， Z 점수 (표준값) 변환은 각각의 유전자 그룹화에 의한 표준화된 편차 점수를 계산하기 위하여 사용되었다. Z 점수 값은 GO 생물학적 과정의 활성을 가리킨다 (도 12a).
또한， 상기 <실시예 3>과 같이 NDRG3(N66D) 변이체를 HeLa 세포에 형질전환한 후， 대조군 보다 1.5배 이상의 발현 증가를 나타내는 136개의 유전자， 정상산소 상태보다 저산소 상태에서 1,5배 이상의 발현 증가를 보이는 1535개 유전자， 그리고 NDRG3(N66D) 변이체의 과발현과 저산소 상태에서 공통적으로 증가되는 유전자 68개를 선발하고， 상기 선발된 유전자들의 기능을 조사하기 위해 GAzer(Gene Set Analyzer)분석을 통해 기능별로 분류한 생물학적 온를로지의 Z 점수 (표준값)를 다이어그램으로 나타내었다 (도 12b).
그 결과， 도 12a에 나타낸 바와 같이， NDRG3 결실은 통계학적으로 24시간 저산소 상태 하에 기능적 유전자 그룹에서 중요한 발현 변화가 나타나는 것을 확인하였고， NDRG3 결실에 의해 가장 많이 영향을 받은 저산소증 기능이 혈관생성 (angiogenesis) 및 세포 증식 (proliferation)임을 확인하였고， 반면 해당과정 (glycolysis)은 가장 관련이 적은 기능 중 하나임을 확인하였다. 반대로, HIF-la의 경우， 저산소증 기능 중 가장 관련성이 높은 기능이 해당과정인 반면， 혈관생성 및 세포증식은 관련성이 적음을 확인하였다 (도 12a).
또한， 도 12b에 나타낸 바와 같이， 정상 산소 상태에서 PHD2의 도킹 부위를 돌연변이한 NDRG3 N66D 변이체를 과발현시킨 경우， 혈관생성 >세포증식 =세포성장 세포사멸 ( apoptos i s ) =세포이동 ( ce 11
migration):^fl당과정 순으로 상향조절이 이루어짐을 확인하였다 (도 12b). 따라서， 상기 결과를 통해 NDRG3이 저산소증 반웅에 있어서 중요한 기능을 가짐을 확인하였다.
<6-2>저산소 상태에서 DRG3에 의한 혈관생성 촉진 확인
상기 <6-1>의 분석으로 확인한 저산소증에서 NDRG3의 관련성이 높은 기능 중 혈관생성에 있어서 NDRG3의 영향을 확인하기 위하여， NDRG3 발현이 억제된 세포를 이용하여 튜브 형성 분석법 (tube forming assay) , RT-PCR, 웨스턴 블럿팅 및 생체 내 혈관생성 분석법 (in-vivo angiogenesis assay)을 수행하였다.
구체적으로， NDRG3 결실에 의한 혈관생성 활성 변화를 확인하기 위하여 튜브 형성 분석법을 수행하였다. 먼저， 상기 실시예 <4-4〉에 기재된 방법으로 shNDRG3을 이용하여 NDRG3의 발현이 억제된 Huh_7 (2X105 세포 /ml) 및 대조군 Huh-7 세포를 저산소 상태 (1% 02)하에서 24시간 동안 배양한 다음 배양액 (1 ml)을 회수하여 HUVEC human umbilical vein endothelial cells)(lxi05 세포 /ml) 세포 와 함께 미리 마트리겔 (Matrigel)로 코팅한 6-웰 디쉬에서 6-12 시간동안 배양하여 튜브 형성을 관찰하였다 (도 13a).
또한, 저산소 상태에서 NDRG3 결실로 인한 신생혈관생성 마커인 IL8, IL1 α 및 ΙΙΛβ , C0X-2 및 PAI-1의 발현을 확인하기 위하여 상기 실시예 <6-1>에 기재된 방법으로 획득한 NDRG3 결실 Huh-7 세포 및 대조군 Huh-7 세포를 정상 산소 상태 (21% 02) 하에서 또는 저산소 상태 (1% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양한 후 세포를 회수하였다. 또한， 상기 실시예 <4-3>에 기재된 방법으로 제작한 NDRG3(N66D) 변이체를 상기 <실시예 3>과 같이 HeLa 세포에 형질전환하고 정상 산소 상태 하에서 24시간 동안 유지 배양한 후 세포를 회수하였다. 그 다음， 상기 실시예 <4— 4>에 기재된 방법으로 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR을 수행하였다. 또한， 상기 각각의 세포 일부를 항ᅳ NDRG3 항체를 이용하여 상기 <실시예 3>과 같이 웨스턴 블럿팅을 수행하여 NDRG3의 발현을 확인하였다 (도 13b).
또한， NDRG3 결실에 의한 생체내 혈관생성 분석을 위하여 마트리겔 플러그 분석법 (matrigel plug assay)을 수행하였다. 먼저， 차가운 매트리겔 (BD Biosciences)을 상기 실시예 <6-1〉에 기재된 방법으로 획득한 NDRG3 결실 Huh-7 세포 (1X106 세포 /ml) 및 대조군 Huh-7 세포 (lxiO6 세포 /ml)와 흔합하였다. 그 다음, 상기 흔합된 매트리겔 500 i 를 6주된 암컷 BALB/c 마우스 (Japan SIX)의 복부 부위로 피하주입하였다. 7일 후， 상기 마우스를 희생하고 매트리겔 플라그를 획득한 후， 헤모글로빈 정량을 위하여 (hemoglobin quantification) 얼음통 안에서 500 μί 물로 균질화하고 4°C에서 15분 동안 12,000 rpm으로 원심분리하여 세척하였다. 그 다음， 상층액만 분리한 후， Drabkin's 시약 (Sigma)을 이용하여 제조사의 절차에 따라 반응시키고 흡광광도계로 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 그래프화하였다 (도 13c).
그 결과， 도 13a 및 도 13b에 나타낸 바와 같이， 저산소 상태 하에서 NDRG3 발현이 억제된 세포의 경우 대조군에 비해 튜브 형성이 감소하는 것을 확인함으로써， NDRG3 결실이 저산소 반웅으로 유도된 혈관생성 활성을 억제함을 확인하였다 (도 13a). 또한， 저산소 상태에 있는 NDRG3 결실된 세포 (도 13b, 왼쪽)에서는 신생혈관생성의 표지 인자인 IL8, ILla 및 ILip， C0X-2 및 PAI-1 mRNA의 발현이 현저하게 감소하는 반면， PHD2 결합 부위가 돌연변이된 NDRG3(N66D) 변이체가 과발현된 세포 (도 13b, 오른쪽)에서 상기 인자의 mRNA 발현이 증가하는 것으로 확인함으로써， 저산소증 반웅에서 NDRG3에 의해 신생혈관생성 인자의 발현이 증가하여 혈관생성 활성이 촉진됨을 확인하였다 (도 13a 및 도 13b).
또한， 도 13c에 나타낸 바와 같이, NDRG3의 발현이 억제된 세포를 이식한 마우스에서 해모글로빈 농도가 감소하는 것을 확인함으로써， 상기 결과와 동일하게 생체 내에서 NDRG3에 의해 혈관생성이 촉진됨을 확인하였다 (도 13c).
<6-3>저산소 상태에서 DRG3에 의한 세포증식 촉진 확인
상기 <6-1>의 분석으로 확인한 저산소증에서 NDRG3의 관련성이 높은 기능 중 세포증식에 있어서 NDRG3의 영향을 확인하기 위하여， Μπ 분석법을 수행하여 세포성장을 분석하고， 생체내 (in vivo) 이식한 종양 부피를 측정하고， 면역형광염색법， 웨스턴 블럿팅 및 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로， NDRG3 결실에 의한 세포성장을 확인하기 위하여 ΜΊΤ 분석법을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 <6-1>에 기재된 방법으로 획득한 NDRG3 결실 Huh- 1 세포 및 대조군 Huh— 1 세포를 2,000 세포 /웰의 개수로스웰 (well) 플레이트 (plaste)에 분주하고 37°C, 5% C02 배양기， 저산소 상태 (3% 02)에서 시간별로 배양하였다. 그 다음， PBS로 희석한 1 mg/ ΜΊΤ 용액을 처리하여 2시간 동안 반웅한 후， 상기 MTT가 포함된 배지를 제거하고 ΜΊΤ 포르마잔 크리스탈 (formazan crystal)을 용해하기 위하여 100 fd DMS0을 처리하였다. 그 다음， 흡광광도계로 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다 (도 14a).
또한， NDRG3 및 HIF 결실에 따른 종양 형성 정도를 확인하기 위하여 상기 실시예 <4-4> 및 <5— 4>에 기재된 방법으로 제작한 NDRG3, HIF-1 α , HIF-2 α , NDRG3 및 HIF-1 α , 또는 NDRG3 및 HIF-2 α 발현이 억제된 Huh-7 세포 (2X106 세포 /100 ≠) 각각을 6 주된 암컷 BALB/c 마우스 옆구리의 피하에 투여하였다 (도 14b). 또한， 상기 실시예 <4-3>에 기재된 방법으로 제작한 NDRG3(N66D) 변이체를 상기 <실시예 3>과 같이 형질전환한 Huh-1 세포 (2X106 세포 /100 ^)를 상기와 같이 마우스 옆구리의 피하에 투여하였다 (도 14c). 그 다음， 각각 투여 16일， 20일에 종양의 크기를 비교하기 위해 이미지화하였다 (도 14b 및 도 14c).
또한， 상기 NDRG3, HIF-1 α , HIF-2 α , NDRG3 및 HIF-1 α， 또는 NDRG3 및 HIF-2 α 발현이 억제된 Huh-7 세포를 이식한 마우스 (도 14d) 및 상기 NDRG3(N66D) 변이체가 과발현된 Huh-1 세포를 이식한 마우스 (도 14e)에서 이식 후 주어진 시간에 캘리퍼 (caliper)를 이용하여 종양의 부피를 측정하였다. 종양의 부피는 길이 (a), 넓이 (b) 및 높이 (c)를 측정하여 하기 [수학식 1]과 같이 계산하여 그래프화하였다 (도 14d 및 도 14e).
【수학식 1】 종양부피 _종양길이 종양넓이 (6)χ종양높이 (
2 또한， 상기 NDRG3, HIF-la 및 HIF-2 a 발현이 억제된 Huh-7 세포 (2X106 세포 /100 βί)를 이식한 마우스의 종양 조직을 적출한 후， 상은에서 10% 포르말린 (formaline)으로 하루동안 고정하였다. 그 다음， 파라핀 (par inf fin)을 처리하고 4 m 섹션화하였다. 그 다음, 상온에서 5분 동안 0.3% TritonX- 100/PBS로 침투화하고 차단 용액 (1% BSA가 포함된 PBS)으로 30분 동안 배양한 후， 상기 실시예 <5-1>에 기재된 방법으로 일차 항체로 세포 증식 바이오마커인 Ki 67 확인을 위한 항 -ki67 항체, 혈관생성 바이오마커인 IL8, CD31을 확인하기 위한 항- IL8, 항 -CD31 및 항 -NDRG3으로 반응하고， 이차 항체 [Alexa Flour 488-접합된 고트 (goat ) 항 -레빗 IgG ( 1/1ᅳ 000)， 또는 Alexa Flour 594- 접합된 고트 항-마우스 IgG ( 1/1 ,000) ] 및 DAPI로 반웅 후 Zei ss LSM 510 공초점 현미경을 이용하여 시각화하였다 (도 Wf )
또한， 상기 NDRG3, HIF-l a 및 HIF-2 a 발현이 억제된 Huh-7 세포 (2 X 106 세포 /100 ≠)를 이식한 마우스의 종양 조직을 적출한 후 액체질소로 동결하였다. 그 다음， 상기 실시예 <4ᅳ2>에 기재된 방법으로 RT-PCR을 수행하여 mRNA의 발현을 확인하고， 상기 <실시예 2〉에 기재된 방법으로 항 -NDRG3 및 항 -β -액틴 항체로 웨스턴 블럿팅을 수행하여 단백질의 발현을 확인하였다 (도 14g) .
그 결과， 도 14a에 나타낸 바와 같이, 가벼운 저산소 상태에서 NDRG3이 결실된 세포의 경우 대조군에 비해 시간이 경과함에 따라 세포 성장이 감소하는 것을 확인하였다 (도 14a) .
또한， 도 14b 내지 도 14e에 나타낸 바와 같이， NDRG3 발현이 억제된 세포'를 이식한 마우스의 종양 크기가 대조군 및 HIF 발현이 억제된 세포를 이식한 마우스에 비해 시간이 경과함에 따라 억제되고, 특히， NDRG3 및 HIF-l a 또는 - 2 a의 동시 결실된 세포를 이식한 마우스의 경우 종양이 생성되지 않는 것을 확인하였다 (도 14b 및 도 14d) . 반면， PHD2의 도킹 부위가 돌연변이된 NDRG3(N66D) 변이체를 과발현한 세포를 이식한 마우스의 종양 크기는 대조군에 비해 현저히 증가하고， 특히 이식 후 20일까지 대조군의 경우 종양이 형성되지 않는 반면 NDRG3(N66D) 변이체 과발현 세포 이식 마우스의 경우 약 900 腿 3까지 종양 크기가 증가하는 것을 확인함으로써， NDRG3(N66D) 변이체에 의해 종양 성장이 촉진됨을 확인하였다 (도 14b 내지 도 14e) .
또한， 도 14f 및 도 14g에 나타낸 바와 같이， NDRG3 결실 세포 이식 마우스의 종양 조직의 경우 세포 증식 마커인 Ki— 67의 단백질 발현이 억제됨을 확인하였다 (도 14f ) . 또한， NDRG3 결실 세포 이식 마우스의 종양 조직에서 종양 혈관생성 마커인 IL8 및 CD31의 단백질 및 mRNA 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (도 14f 및 도 14g) . 따라서， 상기 <실시예 6>의 결과들올 통해 NDRG3이 지속적인 저산소 상태에서 혈관생성 및 세포증식을 촉진하는데 중요한 역할을 함을 확인하였다.
<실시예 Ί> NDRG3-매개된 저산소 반웅에서 L-젖산 (L-Lactate) 생성의 효과 확인 <7-1>저산소 상태에서 NDRG3 단백질 축적 및 젖산 생성 확인
상기 실시예 <5-2〉를 통해 확인한 장기 유도기 ( long lag per iods)의 NDRG3 단백질 축적 및 분해는 NDRG3의 저산소성 발현 조절에 있어서 여러 단계가 관여함을 나타낸다. 따라서， 저산소증과 관련된 생화학적 특징 및 NDRG3의 관련성을 확인하기 위하여， 저산소 상태에서 젖산 생성 측정， 웨스턴 블럿팅 및 RTᅳ PCR을 수행하고， NDRG3의 유비퀴틴화를 확인하기 위하여 시험관내 ( in-vi tro) 유비퀴틴 분석법을 수행하였다.
구체적으로， MCF-7 세포를 상기 실시예 <5-2>와 같이 정상 산소 상태 (21% )에서 24시간 동안 유지 배양하거나또는 저산소 상태 ( 1% 02)에서 시간별로 유지 배양한 후， 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수하여 용해하였다. 그 다음, 상기 세포 용해물을 항 -NDRG3, 항 -HIF-l a 및 항 -β—액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하고， EnzyChromTM L-젖산 분석법 키트 (BioAssay Systems)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 L-젖산 (L-Lactate) 생성을 측정하여 그래프화하였다. 값은 L-젖산 표준 곡선으로 정규화하였다 (도 15a) .
또한， L-젖산 생성 억제가 NDRG3 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MCF-7 세포에 LDHA( lactate dehydrogenase A) 억제제인 소듐 옥사메이트 (sodium oxamate)를 농도별로 처리하고 상기 실시예 <5-2〉와 같이 저산소 상태 ( 1% 02)에서 24시간 동안 유지 배양한 후， 상기 <실시예 3〉과 같이 세포를 회수하여 용해하였다. 그 다음, 상기와 같이 항 -NDRG3 , 항 -HIF-l a 및 항- β -액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하고， L-젖산 (L-Lactate) 생성을 측정하여 그래프화하였다. 값은 L-젖산 표준 곡선으로 정규화하였다 (도 15b) . 또한， L-젖산 생성량이 NDRG3 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 실시예 <4— 2>에 기재된 방법으로 siLDHA( si GENOME SMARTpool , Dharmacon) 또는 siMCT4( si GENOME SMARTpool , Dharmacon)를 이용하여 LDHA 또는 젖산 수출 (export )에 관여하는 모노카복실레이트 수송체 (monocarboxy late transproter )인 MCT4가 결실된 MCF-7 세포를 제작한 후， 상기 실시예 <5-2>와 같이 저산소 상태 ( 1% 02)에서 24시간 동안 유지 배양하고， 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수하여 용해하였다. 그 다음， 상기와 같아항ᅳ NDRG3 , 항 -HIF-l a 및 항ᅳ βᅳ액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하고， L-젖산 (L-Lactate) 생성을 측정하여 그래프화하였다 (도 15c) . 또한， LDHA 및 MCT4 결실을 확인하기 위하여 상기 실시예 <4-2>와 같이 RT-PCR을 수행하였다 (도 15c) .
또한， 해당과정 억제가 NDRG3 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MCF-7 세포에 해당과정을 억제하는 2ᅳ데옥시글루코오스 (2-deoxyglucose , 2- DG)를 농도별로 처리하고 상기 실시예 <5-2>와 같이 저산소 상태 ( 1% 02)에서 24시간 동안 유지 배양한 후， 상기 <실시예 3〉과 같-이 세포를 회수 및 용해하고 항 -NDRG3 및 항 -β -액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 15d) .
또한, 과다한 젖산 생성에 의한 NDRG3 단백질의 발현을 확인하기 위하여 Flag—태그된 LDHA 발현 백터를 제작한 후， 상기 <실시예 3>과 같이 HeLa 세포에 형질전환하고 정상 산소 상태 (21% 02) 하에 24시간 동안 유지 배양하였다. 그 다음， 추가적으로 피루베이트 (pyruvate) 50 mM을 처리하고 가벼운 저산소 상태 (3% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양한 후， 세포를 회수 및 용해하고 항 -NDRG3 , 항- Flag 및 항 -β -액틴을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 15e) .
또한， 젖산 생성이 NDRG3의 유비퀴틴화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 시험관내 유비퀴틴 분석법을 수행하였다. 먼저, Flag-태그된 PHD2 및 HA-태그된 VHL을 상기 <실시예 3〉과 같이 HEK293T 세포에 형질전환한 후， 세포를 회수하여 용해하였다. 그 다음， 단백질 용해물 (500 )을 항 -HA 친화겔 (Sigma) 또는 항- Flag 친화겔 (Sigma)를 이용하여 4°C에서 하루동안 반웅하고 원심분리하여 재조합 PHD2 단백질들 또는 VHL 단백질들을 획득하였다. 그 다음， L-젖산 (pH 7.0， 20 mM)을 처리 또는 무처리하고， 상기 재조합 PHD2/VHL-결합 단백질들， 상기 실시예 <4ᅳ1>에 기재된 방법으로 획득한 재조합 인간 NDRG3-GST(4 ug) , 500 ng 유비퀴틴- 활성 효소 (ubiqui t in一 act ivat ing enzyme； El , Upstate) , 1 g 유비쥐틴一접합 효소 (ubi qui t in—conjugat ing enzyme； E2(UbcH5a) , Upstate) , 2.5 !ig 유비퀴틴一 Flag (Sigma) , 20 mM HEPES (pH 7.3) , 5 mM MgC12 , 1 mM DTT, 및 2 mM ATP가 포함된 50 μί 용액으로 37°C에서 1시간 동안 반웅시겼다. 그 다음， 상기 흔합물을 GST-결합 아가로오스 레진으로 4°C에서 4시간 동안 배양한 후， 침전물을 세척하고 상기 <실시예 3>과 같이 항 -Flag을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 15f ) .
그 결과， 도 15a 및 15b에 나타낸 바와 같이， 저산소 상태 초기단계에서 HIF-l a 단백질의 발현이 현저하게 증가한 후 감소하지만 젖산 생성 및 NDRG3 단백질의 축적은 저산소 상태가 지속될수록 현저하게 증가하는 것을 확인하였다 (도 15a) . 반대로， 소듐 옥사메이트를 처리하여 젖산 생성을 억제한 경우, NDRG3 단백질 축적이 젖산의 발현과 비례하게 억제되는 것을 확인함으로써 (도 15b) , 저산소 상태에서 NDRG3 단백질의 발현은 젖산 생성과 관련이 있음을 확인하였다 (도 15a 및 도 15b) . ：" ᅳ
또한， 도 15c 내지 도 15e에 나타낸 바와 같이, LDHA 결실 또는 2- 데옥시글루코오스 처라를 통해 해당과정을 억제하여 젖산 생성이 억제된 경우， 저산소 상태에서 NDRG3 단백질의 발현이 감소하는 반면， MCT4 결실， 또는 LDHA 과발현 및 /또는 피루베이트 포함 배지 공급을 통해 젖산이 증가될 경우， 저산소 상태에서 NDRG3 단백질의 축적이 증가하는 것을 확인함으로써， HIF 단백질의 저산성 유도와 달리， NDRG3 단백질 축적에 있어서 산소 결핍뿐만 아니라 해당화 젖산 (glycolyt ic lactate) 생산이 추가적으로 요구됨을 확인하였다 (도 15c 내지 도 15e) .
또한， 도 15f에 나타낸 바와 같이， 젖산을 처리한 경우 PHD2/VHL 복합체에 의한 재조합 NDRG3 단백질의 유비퀴틴화가 감소되는 것을 확인함으로써 , 저산소 상태 하에 젖산 생성으로 NDRG3 단백질의 유비퀴틴화가 억제되고 세포내에서 축적됨을 확인하였다 (도 15f ) .
<7-2> 저산소 상태에서 DRG3 및 젖산의 결합 확인
산소 상태에 따른 젖산 및 NDRG3 단백질의 상호작용을 확인하기 위하여， NDRG3 재조합 단백질 및 부위 -지정 돌연변이를 이용하여 NDRG3 변이체 재조합 단백질을 제작하고 이를 이용하여 시험관내 ( in-vi tro) 결합 분석법 (binding assay) ; 면역염색 및 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
구체적으로， L-젖산 및 NDRG3 단백질의 상호작용을 확인하기 위하여 상기 실시예 <4-1〉에 기재된 방법으로 클로닝한 pGEX-4T-2-NDRG3을 주형으로 하기 [표 4]의 프라이머를 이용하여 상기 실시예 <4-3>과 같이 부위 -지정 돌연변이를 수행하여 NDRG3의 Lᅳ젖산 결합부위 중 138번째 아미노산인 글리신 (Glycine , G)을 트립토판 (Tryptophan, W)으로 치환된 pGEX-4T-2-NDRG3(G138W) 변이체 컨스트럭트를 획득하였다. 그 다음， 상기 제조된 재조합 단백질의 발현을 위하여, 상기 재조합 플라스미드 PGEX-4T-2— NDRG3 야생형 및 -NDRG3(G138W)를 대장균 균주 BL21에 형질전환하고， 상기 <실시예 2〉와 같이 GST-결합 아가로오스 레진을 이용하여 정제하였다. 그 다음， 상기 <실시예 3>과 같이 9% SDS-PAGE로 전기영동한 후， 쿠마쉬 브릴리언트 블루로 염색하여 검출을 확인하고， 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위하여 항 -GST 및 항 -NDRG3 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 16a) .
【표 4】
Figure imgf000054_0001
또한， L-젖산 및 NDRG3 단백질의 상호작용을 확인하기 위하여 시험관내 결합 분석법을 수행하였다. GST 또는 상기 GST-NDRG3 재조합 단백질 (50 «g)을 30°C에서 1시간 동안 비표지된 L-젖산 (pH 7.0 , Sigma) 및 L-[ 14C]_ 젖산 (PerkinElmer ) 0.5 μ (: ί와 함께 반웅시켰다. 그 다음, GST-결합 아가로오즈 레진을 첨가하여 4시간 동안 반웅한 후 상기 반웅 흔합물에서 NDRG3-GST 단백질이 결합된 레진을 획득한 후， PBS로 불순물을 제거한 다음， 상기 NDRG3 결합된 아가로오스 레진을 2 ra^ LSC-칵테일 (PerkinElmer )이 포함된 섬광 용액으로 옮기어 14C 값을 측정하여 그래프화하였다 (도 16b , 왼쪽 또한， GST, 상기 GST-NDRG3 재조합 단백질 (50 ^g) 또는 상기 GST-NDRG3(G138W 변이체 재조합 단백질 (50 g)을 30°C에서 1시간 동안 L-[ 14C]_젖산 (PerkinElmer ) 0.5 u Ci과 반웅한 후， 상기와 동일한 방법으로 14C 값을 측정하여 그래프화하였다 (도 16b , 오른쪽) .
또한， 저산소 상태에서 L-젖산 및 NDRG3 단백질의 결합부위와의 상호작용을 확인하기 위하여 NDRG3 변이체를 제작하였다. 먼저， Myc-태그된 NDRG3 발현 백터를 주형으로 상기 실시예 <4-3>과 같이 부위 -지정 돌연변이를 수행하여 NDRG3의 L-젖산 결합부위 중 62번째 아미노산인 아스파르트산 (Asp, D)을 류신 (Leu, L)으로 치환한 Myc-NDRG3(D62L) 변이체， NDRG3의 L-젖산 결합부위 중 138번째 아미노산인 글리신 (G)을 아르기닌 (Arg, R)으로 치환한 Myc-NDRG3(G138W) 변이체， NDRG3의 L-젖산 결합부위 증 139번째 아미노산인 알라닌 (Ala, A)을 글루탐산 (Glu, E)으로 치환한 Myc-NDRG3(A139E) 변이체 및 NDRG3의 L-젖산 결합부위 중 229번째 아미노산인 타이로신 (Tyr, Y)을 프를린 (Pro, P)으로 치환한 Myc-NDRG3(Y229P) 변이체를 획득하였다. 그 다음， 상기 Myc-NDRG3 및 Myc-NDRG3 변이체 각각을 HEK293T 세포에 상기 <실시예 3>과 같이 형질전환한 후, 상기 실시예 <5-2>와 같이 정상 산소 상태 (21% 02)， 저산소 상태 (1% 02)， 또는 20 μΜ MG132 처리 후 저산소 상태 (1% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양하고 세포를 회수 및 용해하였다. 그 다음, 상기 세포 용해물을 항 -Myc 및 항 -β-액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿.팅을 수행하였다 (도 16c). ： ᅳ
또한， 저산소 상태에서 정상 산소 상태로 회복될 때 NDRG3 단백질와 발현을 확인하기 위하여 MCF-7 세포를 저산소 상태 (1% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양한 후, 새로운 배지로 교체하고 추가적으로 정상 산소 상태 (21% 02) 하에서 시간별로 유지 배양하고 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수 및 용해하였다. 그 다음， 상기 세포 용해물을 항— NDRG3, 항 -HIF-la 및 항ᅳ β-액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 16d).
그 결과， 도 16a 내지 16c에 나타낸 바와 같이, NDRG3 및 NDRG3의 젖산 결합 부위가 돌연변이된 NDRG3(G138W) 변이체의 재조합 단백질의 발현을 확인하였고 (도 16a), 시험관 내에서 NDRG3 재조합 단백질의 경우 젖산과의 결합이 증가하고 (도 16b, 왼쪽)， NDRG3 변이체의 경우 젖산-결합력이 감소하는 것을 확인하였다 (도 16b, 오른쪽). 또한， 저산소 상태에서 정상적인 NDRG3는 단백질의 축적이 증가하는 반면， NDRG3의 젖산 결합 부위를 돌연변이한 변이체 모두 저산소 상태에서 단백질 축적이 감소하는 것을 확인함으로써 (도 16C), 저산소 상태에서 NDRG3이 젖산과 결합하고， 이는 NDRG3 단백질의 축적과 관련이 있음을 확인하였다 (도 16a 내지 도 16c).
또한， 도 16d에 나타낸 바와 같이， HIF-la 단백질은 재산소화 (reoxygenation)되면 빠르게 제거되지만， 반면 저산소 상태에서 NDRG3 젖산 복합체를 어루어 축적된 NDRG3 단백질은 정상 산소 상태로 회복되어도 세포에서 안정하게 유지되는 것을 확인하였다 (도 16d) . 따라서， 상기 <실시예 7〉의 결과들을 통해 저산소-유도된 젖산이 지속적인 저산소 반웅에 있어사 의 센서로 작용하여 NDRG3에 의한 HIF-비의존적 생물학적 반웅이 촉진됨을 확인하였다.
―
<실시예 8> 저산소 반웅에서 젖산-의존적 NDRG3의 기능 확인
<8-1>저산소 반웅에서 NDRG3에 의한 젖산-의존적 세포성장촉진 확인
저산소 상태에서 젖산 -의존적 세포성장에 있어서 NDRG3이 미치는 영향을" 확인하기 위하여， NDRG3 변이체 및 젖산 생성이 억제된 세포를 이용하여 ΜΊΤ 분석법， 콜로니 형성 분석법 (colony forming assay) 및 생체내 ( in vivo) '이식한 종양의 부피를 측정올 수행하였다.
구체적으로， 젖산 생성 억제 후 이소성 (ectopi c) 변이체 NDRG3(N66D)가 세포성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 실시예 <4-3>과 같이 아소성 변이체 NDRG3(N66D) 발현 백터를 Huh-1 세포에 형질전환한 후, 96-웰 플레이트에 Huh-1 세포 및 상기 NDRG3(N66D) 변이체 과발현 Huh-1 세포 1 , 000 세포 /웰로 배양하고， 농도별로 소듐 옥사메이트를 처리하고 가벼운 저산소 상태 (3% 02) 하에서 시간별로 유지 배양하였다. 그 다음， 세포 성장을 확인하기 위하여 상기 실시예 <6-3>과 같이 ¾ΠΤ 분석법을 수행하여 그래프화하였다 (도 17a) .
또한， 젖산 생성 억제 후 이소성 변이체 NDRG3(N66D)가 세포성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여 콜로니 형성 분석법을 수행하였다. 6-웰 플레이트에 Huh- 1 세포 및 상기 NDRG3(N66D) 변이체 과발현 Huh-1 세포 0.5 X 104 세포 /2 로 접종한 후， 소듐 옥사메이트 40 mM을 처리 또는 무처리하고 정상 산소 상태 (21% 02) 하에서 3일 마다 새로운 배지로 회석하면서 10일 동안 배양하였다. 배양 10일 후 형성된 콜로니를 확인하여 100% 메틸 알코올 (methyl alcohol )로 고정한 다음， 30% 김사 염색 용액 (gi emsa stain solut ion; Sigma)으로 염색하여 계수하였다 (도 17b) . 또한， 저산소 상태에서 LDHA 결실에 의한 젖산 생성 억제 후 이소성 변이체 NDRG3(N66D)가 세포성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여 ΜΊΤ 분석법을 수행하였다, 먼저, 상기 실시예 <4-4>에 기재된 방법으로 LDHA가 결실된 Huh-1 세포를 제작한 후， 상기 <실시예 3>과 같이 NDRG3(N66D) 변이체 발현백터로 형질전환하여， LDHA 결실 및 NDRG3(N66D) 변이체 과발현 Huh-l 세포를 획득하였다. 그 다음， 대조군 GFP 결실 Huh-1 세포， 상기 LDHA 결실 Huh-1 세포 및 상기 LDHA 결실 /NDRG3(N66D) 과발현 Huh-1 세포를 96-웰 플레이트에 1 , 000 세포 /웰로 배양하고， 가벼운 저산소 상태 (3% 02) 하에서 시간별로 유지 배양하였다. 그 다음 세포 성장을 확인하기 위하여 상기 실시예 <6-3>과 같이 MTT 분석법을 수행하여 그래프화하였다 (도 17c) .
또한， 생체 내에서 LDHA 결실에 의한 젖산 생성 억제 후 이소성 변이체 NDRG3(N66D)가 세포성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여 마우스에 종양세포를 이식 후 종양 부피를 측정하였다. 상기 대조군 GFP 결실 Huh-1 세포, 상기 LDHA 결실 Huh-1 세포 및 상기 LDHA 결실 /NDRG3(N66D) 과발현 Huh-1 세포를 상기 실시예 <6-3>에 기재된 방법으로 BALB/c 마우스에 이식한 후， 주어진 시간에 캘리퍼를 이용하여 종양부피를 측정하여 그래프화하였다 (도 17d) .
또한， 지속적인 저산소 상태에서 젖산 생성 억제가 이소성 변이체 NDRG3(N66D) 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Huh-1 세포 및 상기 NDRG3CN66D) 변이체 과발현 Huh-1 세포에 소듐 옥사메이트 40 mM을 처리 또는 무처리하고 가벼운 저산소 상태 하에서 시간별로 유지 배양한 후 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수 및 용해하였다. 그 다음, 상기 세포 용해물을 항 -NDRG3 및 항 - β -액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 17e) .
또한, 지속적인 저산소 상태에서 젖산 생성에 있어서 이소성 변이체 NDRG3(N66D)의 영향을 확인하기 위하여 상기와 같이 소듐 옥사메이트를 처리 또는 무처리하고 가벼운 저산소 상태 하에서 시간별로 유지 배양한 Huh-1 세포 및 상기 NDRG3CN66D) 변이체 과발현 Huh-1 세포를 회수하여 상기 실시예 <7-1>에 기재된 방법으로 L-젖산 (L-Lactate) 생성을 측정하여 그래프화하였다. 값은 L-젖산 표준 곡선으로 정규화하였다 (도 17f ) .
그 결과， 도 17a 내지 17d에 나타낸 바와 같이， 저산소 상태에서 소듐 옥사메이트를 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 성장이 억제되는 반면， NDRG3의 이소성 변이체가 과발현된 경우 저산소 상태에서 소듐 옥사메이트를 처리하여도 세포 성장이 증가하는 것을 확인하였다 (도 17a) . 정상 산소 상태에서도 젖산 생성이 억제되어도 NDRG3 이소성 변이체가 과발현된 경우 저산소 상태와 마찬가지로 종양 성장이 촉진되는 것을 확인하였다 (도 17b) . 또한， LDHA 결실을 통해 젖산 생성을 저해한 경우 시험관 내에서 및 생체 내에서 종양 성장이 억제되는 반면， LDHA가 결실되어도 NDRG3 이소성 변이체가 과발현된 경우에는 종양 성장이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다 (도 17c 및 17d) .
또한， 도 17e 및 도 17f에 나타낸 바와 같이, 저산소 상태에서 소듐 옥사메이트를 처리하여 젖산 생성을 억제한 경우 NDRG3의 축적이 억제되는 반면， NDRG3 이소성 변이체가 과발현된 경우 젖산 생성 억제에도 불구하고 NDRG3 변이체의 축적이 지속되는 것을 확인하였다 (도 17e) . 또한, 저산소 상태에서 소듐 옥사메이트를 처리한 경우 무처리한 경우 모두 NDRG3 이소성 변이체가 과발현되어도 젖산 생성에는 변화가 없는 것을 확인함으로써, NDRG3 이소성 변이체는 젖산 생산에 직접적인 효과가 없음을 확인하였다 (도 17f ) . 따라서， 상기 결과를 통해 지속적인 저산소 상태에서 젖산 -유도된 세포성장에 있어서 NDRG3이 중요한 매개자임을 확인하였다. <8-2> 저산소 반웅에서 DRG3에 의한 젖산-의존적 혈관생성 촉진 확인
저산소 상태에서 젖산-의존적 혈관생성에 있어서 NDRG3이 미치는 영향을 확인하기 위하여， NDRG3 변이체 이소성 변이체 과발현 세포를 이용하여 류브 형성 분석법을 수행하였다.
구체적으로， NDRG3(N66D) 변이체가 과발현된 Huhᅳ 1 세포를 제작한 후， 대조군 세포 및 상기 NDRG3(N66D) 변이체 과발현 Huh-1 세포에 소듐 옥사메이트를 처리 또는 무처리하고 저산소 상태 ( 1% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양한 후 상기 실시예 <6-2>와 같이 세포를 회수하여 튜브 형성 분석법을 수행하였다 (도 18) . 그 결과， 도 18에 나타낸 바와 같이， 소듐 옥사메이트를 처리하여 젖산 생성을 억제한 경우 저산소 상태에서 혈관생성이 억제되는 반면， NDRG3 이소성 변이체가 과발현된 경우 젖산 생성을 억제하여도 저산소 상태에서 혈관생성이 다시 증가하는 것을 확인함으로써， NDRG3이 지속적인 저산소 상태에서 젖산-유도된 혈관생성에 중요한 매개자임을 확인하였다 (도 18) . 따라서， 상기 <실시예 8>의 결과를 통해 젖산은 저산소성 세포증식 및 혈관생성의 중요한 신호이며， NDRG3이 지속적인 저산소 상태에서 젖산-유도된 세포증식 및 혈관생성의 중요한 매개자로 작용함을 확인하였다.
<실시예 9> NDRG3-매개된 저산소 반웅의 분자적 조절 확인
<9-1>저산소상태에서 NDRG3에 의한 c-Raf-ERK활성 조절 확인
저산소 상태에서 젖산-유도된 분자적 반응에서 NDRG3의 역할을 확인하기 위하여， 시험관내 키나아제 분석법 ( in-vi tro kinase assay) , 풀ᅳ다운 분석법， 면역침전법 및 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <4-4>에 기재된 방법으로 대조군 shGFP 또는 shNDRG3을 이용하여 GFP 또는 NDRG3 결실 PLC/PRF/5 세포를 제작한 후， 상기 세포를 저산소 상태 ( 1% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양하고 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수하였다. 그 다음， 인간 인산화-키나아제 어레이 키트 (Human Phosph으 Kinase Array ki t )를 이용하여 제조사의 절차에 따라 인산화된 단백질을 확인하였다 (도 19a) .
또한， NDRG3의 발현 정도에 따른 분자적 조절 기능을 확인하기 위하여 Huh- 1， Huh-7 및 786-0 세포를 정상 산소 상태 (21% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양한 후， 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수 및 용해하고， 항 -NDRG3 , 항- 인산화 -ERK1/2 , . 항 -ERK1/2 및 항 - β -액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 19b) .
또한， 저산소 상태에서 NDRG3의 분자적 기능을 확인하기 위하여 상기 실시예 <4-4>에 기재된 방법으로 대조군 shGFP 또는 shNDRG3을 이용하여 GFP 또는 NDRG3 결실 SK-HEP-1 세포를 제작한 후， 상기 세포를 저산소 상태 하에서 시간별로 유지 배양하고 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수 및 용해하고， 항 -인산화- ERK1/2 , 항 -ERK1/2 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 19c , 위) . 또한， 상기 제작한 세포를 저산소 상태 하에서 24시간 동안 유지 배양하고 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수 및 용해하고， 항 -NDRG3 , 항-인산화ᅳ c-Raf (S338)， 항 -c-Raf , 항-인산화 -B— RAFKS445) , 항 -B-RAF1 , 항-인산화 -A-RA S299)ᅳ 항 -A-RAF 및 항 - -액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 19c , 아래) .
또한， 시험관 내에서 저산소 반응에 의한 NDRG3 및 c-Raf의 상호작용을 확인하기 위하여 먼저 c-Raf를 암호화하는 재조합 플라스미드 pET-28a-c-Raf 컨스트력트를 클로닝하였다. 그 다음， 상기 실시예 <7-1>과 같이 상기 c-Raf 발현 백터를 BL21 대장균 균주에 형질전환하여 재조합 단백질을 획득한 후， 상기 c-Raf 재조합 단백질은 Ni-NTA 아가로오스 레진을 이용하여 제조사의 절차에 따라 정제하였다. 그 다음， 상기 실시예 <4-1>과 같이 상기 정제된 재조합 단백질 c- Raf-Hi s 및 NDRG3-GST를 Ni-NTA 아가로오스 레진과 함께 반웅시켜 Hi s 풀-다운을 수행한 후， 상기 <실시예 3>과 같이 항 -NDRG3 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 19d , 왼쪽) . 또한, Fl ag-태그된 c-Raf 발현 백터를 클로닝한 후, 상기 Flag-태그된 c-Raf 백테 · 상기 <실시예 3>과 같이 HeLa 세포에 형질전환 하였다. 그 다음， 상기 Flag-c-Raf 과발현된 HeLa 세포를 저산소 상태 ( ½ 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양한 후， 항 -FLAG M2 비드를 이용하여 면역침전하고 항 -NDRG3 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 19d , 오른쪽) .
또한， 저산소 상태에서 NDRG3의 분자적 기능을 확인하기 위하여 상기 실시예 <4-4〉에 기재된 방법으로 대조군 shGFP 또는 shNDRG3을 이용하여 NDRG3의 발현이 억제된 SK-HEP-1 세포를 제작하고， Flag-태그된 c-Raf 발현 백터를 이용하여 상기 <실시예 3>과 같이 형질전환하여 NDRG3 결실 /c-Raf 과발현 세포를 획득하였다. 또한， Myc-태그된 NDRG3(N66D) 및 Fl ag-태그된 c-Raf 발현 백터를 이용하여 상기 <실시예 3>과 같이 형질전환하여 NDRG3(N66D) 및 c-Raf 과발현 HE 293T 세포를 획득하였다. 그 다음， 상기 세포들을 정상 산소 상태 (21% 02)에서 24시간 동안 유지 배양하고， 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수 및 용해한 후， 항 -NDRG3 , 항-인산화 -c-Raf (S338) , 항 -c-Raf , 항-인산화 -B-RAFKS445) , 항 -B-RAF1 , 항-인산화 -ERK1/2 , 항 -ERK1/2 및 항 -β -액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 19e) .
또한, 저산소 상태에서 NDRG3에 의한 인산화를 확인하기 위하여 [ Y -32P]- ATP(PerkinElmer ) 표지를 이용하여 시험관내 키나아제 분석법을 수행하였다. 먼저， 상기 <실시예 3>과 같이 Myc-태그된 NDRG3(N66D) 발현 백터로 형질전환된 HEK293T 세포를 제작한 후， 항 -Myc 친화 겔을 이용하여 NDRG3 단백질을 면역침전하였다. 그 다음, 방사선 표지를 위하여 상기 면역침전된 NDRG3 복합체에 하고 PKC 억제제인 PKC-I 5 μ Μ을 처리 또는 무처리하고 40 μΐ 반웅 버페 PKC 활성 버퍼 및 SignaTECT 단백질 키나아제 C 분석 키트 (Promega)에 포함된 PKC 공동활성 버퍼, 10 uCi의 [γ-32Ρ]-ΑΤΡ, 및 2 /g의 정제된 c— Raf-GST 재조합 단백질]로 30°C에서 1시간 동안 반웅하였다. 그 다음， 상기 반웅 흔합물을 8% SDS-PAGE로 전기영동하고 32P-표지된 c-Raf는 자가방사선법 (autoradiography)으로 검출하였다 (도 19f).
또한， 저산소 상태에서 NDRG3-매개된 분자적 경로 활성의 젖산 의존성을 확인하기 위하여 MCF— 7 세포를 정상 상태 (21% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양하고， 및 상기 실시예 <7-1>에 기재된 방법으로 획득한 LDHA 발현 억제된 MCF- 7 세포， 소듐 옥사메이트를 처리 또는 무처리한 세포를 저산소 상태 (1% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양하였다. 그 다음, 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수 및 용해한 후， 항 -NDRG3, 항-인산화 -c-Raf (S338), 항 -c-Raf, 항-인산화 -ERK1/2, 항- ERK1/2 및 항 -β-액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 19g).
그 결과, 도 19a 내지 도 19d에 나타낸 바와 같이, NDRG3이 결실된 경우 지속적인 저산소 상태에서 ERK1/2의 인산화가 감소하며 (도 19a, 및 도 19c, 위)， 정상 산소 상태에서 NDRG3 단백질의 발현이 서로 다른 여러 종류의 세포에서 NDRG3 단백질의 발현정도에 비례적으로 ERK1/2의 인산화 수준이 차이가 남을 확인함으로써 (도 19b), 지속적인 저산소 반웅에서 NDRG3이 ERK1/2를 활성화함을 확인하였다. 또한， NDRG3이 결실된 경우 저산소 상태가 지속될수록 ERK1/2 인산화뿐만 아니라， c-Raf 및 B-RAF1의 인산화도 억제되고 (도 19c, 아래)， 시험관 내에서 (19d, 왼쪽) 및 세포 내에서 저산소 반웅으로 (19d, 오른쪽) NDRG3과 c-Raf가 상호작용하는 것을 확인함으로써， NDRG3이 저산소 상태에서 ERK 및 c-Raf의 활성화에 관여함을 확인하였다 (도 19a 내지 도 19d).
또한， 도 19e 및 도 19f에 나타낸 바와 같이, 이소성 변이체인 NDRG3(N66D)가 과발현된 경우 정상 산소 상태에서도 ERK1/2 및 c-Raf의 인산화가 유도되고 (도 19e), 시험관 내에서도 NDRG3 이소성 변이체 분자적 복합체가 재조합 c-Raf 단백질의 인산화를 매개함을 확인하였다 (도 19f).
또한, 도 19g에 나타낸 바와 같이， 저산소 상태에서 젖산 생성을 억제한 경우 NDRG3 단백질의 발현도 억제되고， c-Raf-ERK 경로의 활성이 억제되는 것을 확인하였다 (도 19g). 따라서， 상기 결과들을 통해 NDRG3이 저산소 반응에서 젖산에 의해 유도된 C-Raf-ERK 신호 활성의 필수 매개자로서 역할을 함을 확인하였다.
<9-2>저산소상태에서 DRG3에 의한 키나아제 경로 조절 확인
RACK1은 PKC에 대한 스캐폴드 단백질 (scaffold protein)로.서 활성화 형태변환 (active conformat ion)을 유지하는 것으로 잘 알려져 있고 (Lendahl， U. et al. , Nat. Rev. Genet., 2009(10), 821-832) , PKC는 c-Raf를. 인산화하고 활성화하는 것으로 보고되고 있다 (Epstein, A. C. et al. , Cell, 2001(107), 43- 54， Mahon, P. c. et al. , Genes Dev, 2001(15), 2675-2686) . 따리서， 저산소 상태에서 NDRG3에 의한 키나아제 경로 활성에 있어서 RACK1의 관련성 '을 확인하기 위하여， 면역침전법， 웨스턴 블럿팅을 수행하고， NDRG3과 키나아제 경로에 관여하는 단백질들 간의 복합체 형성을 확인하기 위하여 단백질 구조 모델링을 수행하였다.
구체적으로， NDRG3과 RACK1의 상호작용올 확인하기 위하여 NDRG3 및 /또는 Flag-태그된 RACK1 발현 백터를 상기 <실시예 3〉과 같이 HeLa 세포에 형질전환하고 정상 산소 상태 (21<¾ 02) 하에서 20 μΜ MG132를 8시간 동안 처리하여 배양한 후， 세포를 회수 및 용해하고， 항 -FLAG M2 비드를 이용하여 면역침전하였다. 그 다음， RACK-1와 결합한 NDRG3을 확인하기 위하여 항 -NDRG3 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 20a).
또한， NDRG3에 의한 키나아제 경로에 관여하는 단백질 간의 관계를 확인하기 위하여 상기 실시예 <9ᅳ1>과 같이 C-Raf, RACKl 과발현 및 /또는 NDRG3 결실 HEK293T 세포， 및 c-Raf, RACKl 및 /또는 NDRG3(N66D) 과발현 HEK293T 세포에 PKC-KLY333531) 5 μΜ을 처리 또는 무처리하여 정상 산소 상태 하에서 24시간 동안 유지 배양한 후， 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수 및 용해하고 항ᅳ NDRG3, 항ᅳ인산화 -c-Raf (S338), 항 -c-Raf, 항-인산화 -ERKl/2, 항 -ERKl/2, 항 -RACKl 및 항- β-액틴 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 20b).
또한， 저산소 상태에서 NDRG3에 의한 키나아제 경로에 관여하는 단백질 간의 관계를 확인하기 위하여 Myc-NDRG3(N66D) 발현백터 및 /또는 siRACKKsiGENOME SMARTpool, Dharmacon)을 이용하여 NDRG3(N66D) 과발현 및 /또는 RACK1 결실 HeLa 세포를 제작하고 저산소 상태 (1% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양한 후， 상기 <실시예 3>과 같이 항 -Myc 친화겔을 이용하여 면역침전하고 항 -PKC-β 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 20c) .
또한， 저산소 상태에서 PKC가 ERK 활성화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 HeLa 세포를 정산 산소 상태 (21% 02) 하에서, 또는 PKC 억제제인 PKOKGO; GO 6976) 1 μ Μ 또는 PKOKLY; LY333531) 5 μ Μ을 처리하고 저산소 상태 ( 1% 02) 하에서 24시간 동안 유지 배양한 후， 상기 <실시예 3>과 같이 세포를 회수 및 용해하고 항-인산화 -ERK1/2 및 항 -ERK1/2 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하엿다 (도 20d) .
또한， 저산소 상태에서 NDRG3-cRaf— RACK1-PKC— β 복합체의 형성을 확인하기 위하여 Fl agᅳ c-Raf 및 Flag-RACKl 발현 백터， 및 /또는 Myc-NDRG3(N66D) 발현백터를 상기 <실시예 3>과 같이 HEK293T 세포에 형질전환하고 정상 산소 상태 하에서 24기산 동안 유지 배양한 후 세포를 회수 및 용해하였다. 그 다음， 항 -Myc 친화 겔을 이용하여 면역침전한 후 SDS-PAGE로 전기영동한 후 항 -Flag, 항 -Myc 및 항- PKC- β항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하엿다 (도 20e) .
또한, 저산소 상태에서 NDRG3-cRaf-RACKl-PKC- β 복합체의 형성을 확인하기 위하여 상기 실시예 <4-3>과 같이 단백질 도킹 시물레이션을 수행하였다. 다중 표적 구조를 위한 도킹 (즉， NDRG3 , RAF1 , RACKKGNB2L1) 및 PKC- β )은 두—단계 실험을 통해 수행되었다. 첫 단계에서는, NDRG3이 각각의 표적을 위한 도킹 실험에서 수용체 단백질로서 사용되었다. 두 번째 단계에서는， 결과물 단백질- 단백질 상호작용이 다른 단백질의 도킹을 위한 수용체 단백질로서 사용되었다. 두 번째 실험을 위한 입력값 ( input order )는 순서대로 c-Raf , RACK1 및 ΡΚΟβ로 하였다. 도킹 계산은 RMSD( root -mean-square devi at ion)에 의해 수핸되었고 결과는 단일 입력으로부터의 산출값이 다중 입력으로부터의 산출값과 일치하는 곳에서 필터링하였다. 필터링된 결과값 증에서, 가장 안정된 하나를 HEX6.3 총 점수 (모양 점수 및 전정기학 점수의 합)를 이용하여 선택하였다 (도 20f , 위)， 또한, 단백질 구조 모델링을 위하여 하기의 일련의 과정을 수행하였다. 첫 단계에서， PDB(protein data bank) 서열 데이터베이스에서 잘 알려진 구조로부터 상동성 모델링에 사용되는 주형 후보를 찾기 위해 단백질-단백질 BLAST(BLASTp) 검색을 수행하고, 10 3보다 작은 P-값을 가지는 것 중에서 가장 일치도 ( ident i ty scores)가 높은 하나를 확인하였다. 두번째 단계에서， 정렬 과정 (alignment process)를 수행하기 위하여 BLAST를 수행하고， 구조에 있어서 제한된 공간 (restrained spaces)을 확인하였다. 세번째 단계에서， 단백질 구조의 예측이 잘 알려진 상동성 모델링 프로그램인 Modeller 9vl0 (N. Eswar, M. A. et al. , Current Protocols in Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc. , Sup lement 15, 5.6.1-5.6.30, 2006)을 이용하여 수행되었고， 마지막으로， 가장 좋은 단백질 모델을 DOPE Discrete Optimized Protein Energy) 평가방법 (Shen MY, et al. , Protein Sci. 2006 Nov; 15(11) :2507-24)에 기반하여 선택하였다 (도 20f, 아래). 그 결과， 도 20a 내지 도 20d에 나타낸 바와 같이， RACK1이 NDRG3과 상호작용하는 것을 확인하였다 (도 20a). 또한， RACK1이 과발현되어도 NDRG3이 결실된 경우 c-Raf 및 ERK1/2 인산화가 억제되는 반면 NDRG3(N66D) 변이체가 과발현된 경우 c-Raf 및 ERK1/2 인산화가 증가하고， RACK1 및 NDRG3(N66D) 단백질이 과발현되어도 PKC의 활성이 억제된 경우 c-Raf 및 ERK1/2의 인산화가 억제되는 것을 확인하였다 (도 20b). 특히， 저산소 상태에서 RACK1이 결실된 경우 NDRG3과 PKC의 상호작용이 억제되고 (도 20c), PKC 억제제에 의해 PKC의 활성이 억제된 경우 저산소 상태에서 ERK1/2의 인산화가 억제되는 것을 확인함으로써 (도 20d), 저산소 상태에서 NDRG3이 RACK1 및 PKC-β와 상호작용하여 c-Raf-ERK 인산화를 촉진하는 것을 확인하였다 (도 20a 내지 도 20d).
또한， 도 20e 및 도 20f에 나타낸 바와 같이 세포 내에서 NDRG3이 c-Raf, RACK1 및 PKC-β와 복합체를 형성하여 존재하고 (도 20e), 도킹 스물레이션을 및 단백질 구조 모델링을 통해 NDRG3-c-Rafᅳ RACK1-PKC— β 4차 (quaternary) 복합체 형성의 유연성을 확인하였다 (도 20O. 따라서 상기 <실시예 10〉의 결과들을 통해 NDRG3이 RACK1와 상호작용하고， 이를 통해 NDRG3-RACK1 복합체에 유도되는 PKC|3에 의한 c-Raf가 인산화되며， 따라서 젖산쎄 의해서 조절된 NDRG3이 c-Raf 및 RACK1의 스캐폴드 단백질임을 확인하였다.
<실시예 10> NDRG3발현에 따른 병리학적 변화확인
<10-1> NDRG3과발현 형질전환마우스에서 종양 형성 및 신생혈관생성 촉진 확인 병리학적으로 NDRG3의 발현이 미치는 영향을 확인하기 위하여， NDRG3 과발현 형질전환 마우스를 이용하여 면역조직화학적 분석법 (i顏 unohistocheniical analysis)을 수행하여 종양 형성을 확인하고, NDRG3의 발현 및 활성화된 ERK1/2 단백질의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿팅, 유전자 발현 변화를 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로， NDRG3 과발현이 종양 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 NDRG3 유전자가 전체적으로 과발현되도록 제작된 NDRG3 과발현 형질전환 C57/BL6 마우스 (40마리) 및 대조군 마우스 (32마리)에서 24개월 까지 시기별로 종양 생성 여부를 판별한 후 비 -종양 (tumor free) 카플란마이어 (Kaplan Meier) 분석법을 이용하여 그래프화하였다. (도 21a). 또한， NDRG3 과발현이 여러 조직의 종양 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 18개월 된 상기 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 폐， 20개월 된 상기 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 장， 및 9개월 된 상기 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 하복부 (hypogastrium) 조직을 적출한 후 종양 형성을 관찰하였다 (도 21b).
또한 NDRG3 과발현이 림프종 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에서 장간막 림프절 (Mesenteric lymph node), 비장 (spleen) 및 간 (liver) 조직을 이용하여 면역조직학적 분석법올 수행하였다. 먼저, 상기 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에서 림프절， 비장， 및 간 조직을 적출한 후, 상온에서 1 포르말린으로 하루동안 고정하였다. 그 다음， 상기 고정된 조직에 파라핀을 처리하고 4 μιτι로 섹션화한 후， 실라닌화된 (silanylated) 슬라이드 (Histoserv)로 옮겼다. 항원 검색을 위하여 상기 섹션화된 조직 슬라이드에 0.01 M 구연산염 버퍼 (pH6.0)를 처리하고 10CTC에서 2분 동안 가열하였다. 그 다음， 상기 슬라이드를 식히고 조직의 세포내 퍼옥시다아제 (peroxidase)를 비활성화하기 위하여 5분 동안 3% 과산화수소 (hydrogen peroxide) /PBS를 처리한 후， 10% 비면역 마우^ 또는 고트 (goat) 혈청으로 30분 동안 차단하였다. 그 다음， 림프종에서 발현되는 B 세포 마커인 CD45R 및 T 세포 마커인 CD3의 검색을 위하여 항 -CD45R 및 항 -CD3 항체로 표지화하고， 상기 표지는 DAB(3, 3'-diaminobenzidine) 기질 크로모젠 (chromogen) 용액을 이용하여 ABC vidin-biot in complex) 방법으로 검출하고 현미경으로 관찰 및 촬영하였다. 또한， 상기 슬라이드는 헤마톡실린- 에오진 (H&E)으로 대조염색하여 현미경으로 관찰 및 촬영하였다 (도 21c) .
또한， NDRG3 과발현이 간종양에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 제작한 3 종류의 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 TG- 2， TG-8 및 TG-13 각각의 간 조직을 적출한 후， 상기와 같이 고정하여 섹션화하였다. 그 다음, 상기 섹션화된 간 조직을 이용하여 상기와 같이 면역조직학적 염색을 수행하고 시각화하였다. 세포증식 마커인 PCNA 및 Ki-67 , 간세포암종 (hepatocel lular carcinoma, HCC) 마커인 글루타민합성효소 (glutamine synthetase , GS) 및 열충격 단백질 70(heat shock prot i en 70， HSP)의 검색을 위하여 항 -PCNA, 항 -HSP70 , 항 -Ki-67 및 항ᅳ GS 항체로 표지화하였다. 또한， 상기 섹션화된 조직올 상기 실시예 <4-1>에 기재된 방법으로 항 -NDRG3 항체를 이용하여 면역형광염색하고 공초점 현미경을 이용하여 시각화하였다 (도 21d) .
또한, NDRG3 과발현이 분자적으로 간종양에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 및 대조군 마우스에서 간 조직을 적출한 후 액체질소로 동결하였다. 그 다음， 상기 실시예 <4-2〉에 기재된 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. 또한, 상기 조직을 이용하여 상기 <실시예 2>와 같이 용해하고 항- NDRG3 , 항-인산화 -ERK1/2, 항 -ERK1/2 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (도 21e) .
그 결과， 도 21a 내지 도 21c에 나타낸 바와 같이， NDRG3 과발현 형질전환 마우스에서 9개월 이후 종양이 형성되기 시작하고 (도 21a) , 폐， 장 및 하복부를 포함한 다양한 장기에서 종양이 발견되는 것을 확인하였다 (도 21b) . 또한， NDRG3 과발현 마우스의 간뿐만 아니라 장간막 림프절 및 비장 둥 2차 림프기관에서 림프종 발현 B-세포 및 T-세포가 발견되는 것을 확인하였다 (도 21c) .
또한， 도 21d 및 도 21e에 나타낸 바와 같이， 3 종류의 NDRG3 과발현 형질전환 마우스 모두 간세포암종 마커 및 세포증식 마커의 발현이 현저하게 높게 나타나고 (도 20d) , 분자적으로 신생혈관생성 마커인 IL-l a , IL-Ιβ , IL-6, C0X-2 및 PAI-1 mR A 발현이 증가하며， ERK1/2의 인산화가 증가하는 것을 확인함으로써 (도 21e) , 상기 결과들을 통해 NDRG3이 종양형성 및 신생혈관생성을 촉진하는 것을 조직학적으로 확인하였다.
<10-2> 암환자에서 DRG3 발현 및 키나아제 경로 활성 확인
암에서 NDRG3의 임상적 관련성을 확인하기 위하여， 인간 간암환자의 간암 조직을 이용하여 조직 마이크로어레이 (Ti ssue mi croarray) 분석법을 수행하였다. 구체적으로， 인제대학교 백병원에서 병리학적으로 정의된 HCC를 가진 환자로부터 적출된 조직 샘플을 제공받았다. 상기 모든 조직 샘플은 10% 완층된 포르말린으로 고정하고 파라핀을 처리하였다. 그 다음， 상기 파라핀 처리된 HCC 조직 샘플 (공여자 블락 (blocks) )올 가지고 코어 조직 생체검사 (지름 2 mm)를 수행하고， 트레핀 (trephin) 기구 (Superbiochips Laborator i es , Seoul , Korea) 를 이용하여 새로운 수여자 파라핀 블락 (조직 어레이 블락)에 정렬되었다. 결과 조직 어레이 블락은 104개 HCC 및 20개 비 -신생 간조직을 포함하였다. 상기 조직 어레이 블락의 4-/zm 섹션을 이용하여 상기 실시예 <11-1>에 기재된 방법으로 면역조직학적 염색을 수행하였다. NDRG3 또는 인산화 -ERK1/2 검색을 위하여 항ᅳ NDRG3 및 항-인산화 -ERK1/2 항체로 표지 하였다. 또한， 일반 식염수가 음성대조군으로 사용되었다. >10% 중경도의 세포질 염색을 보이는 샘플 및 /또는 NDRG3에 대한 세포막 염색 및 〉10% 약경도의 인산화 -ERK에 대한 핵염색은 양성 점수화 하였다. NDRG3 단백질 및 인산화 -ERK의 발현 수준 사이의 통계학적 유의성은 χ 2 테스트로 평가되었다 (도 22) .
그 결과， 도 22에 나타낸 바와 같이， 정상 간에서는 NDRG3 단백질이 거의 발견되지 않는 반면, HCC 환자의 간의 경우 세포질 및 원형질막에서 NDRG3 단백질의 발현이 강하게 나타나며, 이때 인산화된 ERK1/2 단백질의 발현이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 특히， NDRG3 단백질을 발현하는 25개 HCC 조직 중에서 19 (76%)개 HCC 조직에서 ERK1/2 단백질이 인산화됨을 확인하였다 (도 22) . 따라서, 상기 결과를 통해 NDRG3의 비정상적인 발현이 종양 형성을 촉진하고 ERK1/2 경로를 활성화함을 확인하였다.
<실시예 11>저산소 반웅에서 DRG3의 조절 메커니즘 확인
상기 <실시예 3> 내지 <실시예 11>의 결과들을 바탕으로 저산소 반웅에 있어서 NDRG3의 역할에 관한 도식 모델을 완성하였다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 저산소 상태 초기 단계에 PHD2의 비활성으로 HIF-l a 단백질의 축적이 유도되고, 그 결과 저산소증에 따른 세포의 대사 적웅 (met abo l i c adapt at i on)과 관련된 유전자 (LDHA , PDK1 등)가 상향조절되어 해당과정이 활성화된다. 그 후, 저산소 상태의 PHD2 비활성에 의한 NDRG3의 저산소증 표적 부위인 294번째 프를린 하이드록실화 억제 현상과 함께. 증가된 해당과정에 의해 생성 /축적된 젖산에 의해 NDRG3 단백질의 발현이 증가한다. 상기 증가된 NDRG3이 지속적인 저산소 반웅에서 스캐폴드 단백질로 작용하여 c-Raf 및 RACK1과 결합하고, 결합된 RACK1이 P C- β 단백질을 동원하여 ^합체를 형성한 후, 상기 PKC에 의해 c-Raf 및 ERK1/2가 인산화되어 c-Raf-ERK 경로가 활성화됨으로써 세포 증식 및 신생혈관생성이 촉진됨을 확인하였다 (도 23 ) . 하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시한다. <제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1>산제의 제조
NDRG3 단백질, 또는 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
NDRG3 단백질, 또는 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제 100 nig 옥수수전분 100
유 당 100 nig 스테아린산 마그네슘 2 nig 상기의 성분을 흔합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조 NDRG3 단백질， 또는 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제 100 nig 옥수수전분 100 mg
Figure imgf000069_0001
스테아린산 마그네슘 2 nig 상기의 성분을 흔합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서
Figure imgf000069_0002
캡슐에 층전하여 캡술제를 제조하였다.
<l-4>환의 제조
NDRG3 단백질， 또는 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제 1 g 유당 1.5 g 글리세린 1 g 자일리를 0.5 g 상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<l-5>과림의 제조
NDRG3 단백질， 또는 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제 150 nig 대두 추출물 50 nig 포도당 200 nig 전분 600 nig 상기의 성분을 흔합한 후， 30% 에탄을 100 mg을 첨가하여 60°C에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
NDRG3(N-myc downstream-regulated gene 3) 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
'
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 NDRG3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 NDRG3 단백질 발현 촉진제는 NDRG3 단백질의 47번째 알기닌 (Arginine), 66번째 아스파라긴 (Asparagine)， 68번째 라이신 (Lysine), 69번째 세린 (Serine), 72번째 아스파라긴， 73번째 알라닌 (Alanine)ᅳ 76번째 아스파라긴， 77번째 페닐알라닌 (Phenylalanine), 78번째 글루탐산 (Glutamic acid), 81번째 글루타민 (Glutamine), 97번째 글루타민， 98번째 글루타민， 99번째 글루탐산 100번째 글라이신 (Glycine), 1이번째 알라닌， 102번째 프를린 (Prol ine) , 103번째 세린, 203번째 류신 (Leucine), 204번째 아스파르트산 (Aspart ic acid), 205번째 류신， 208번째 쓰레오닌 (Threonine), 209번째 타이로신 (Tyrosine)， 211번째 메티오닌 (Methionine), 212번째 히스티딘 (Histidine)， 214번째 알라닌， 215번째 글루타민， 216번째 아스파르트산， 217번째 이소류신 (Isoleucine), 218번째 아스파라긴，' 219번째 글루타민, 296번째 발린 (Valine), 297번째 발린， 298번째 글루타민， 300번째 글라이신 및 3이번째 라이신으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 PHD2 도킹 부위 (docking site)에 PHD2의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 4]
제 1항에 있어서， 상기 NDRG3 단백질 발현 촉진제는 NDRG3 단백질의 젖산 (Lactate) 결합 부위인 62번째 아스파르트산, 138번째 글라이신， 139번째 알라닌 또는 229번째 타이로신에 젖산의 결합을 촉진하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 NDRG3 단백질 활성 촉진제는 NDRG3과 PKC- β， RAC 1 또는 c-Raf 중 어느 하나 이상의 결합 정도를 촉진하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 6】
NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 NDRG3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 8】
제 6항에 있어서， 상기 허혈성 질환은 뇌허혈， 심장허혈， 당뇨병성 혈관심장질환, 심부전， 심근비대증， 망막허혈， 허혈성 대장염， 허혈성 급성 신부전증， 뇌졸중， 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 조성물.
【청구항 9】
NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 10】
제 9항에 있어서， 상기 백터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 재조합 바이러스성 백터인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 11】
제 9항에 있어서 , 상기 상기 재조합 바이러스성 백터는 레트로바이러스 (Retrovirus) , 아데노바이러스 (Adenovirus) , 헤스페스 심풀렉스 바이러스 (Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스 (Lent ivirus)로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 12】
제 9항에 있어서， 상기 세포는 조혈줄기세포， 수지상세포 및 종양세로로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 13】
NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 (Prol ine) 부위의 하이드록실화 (hydroxy 1 at ion)를 억제하는 단백질 또는 화합물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 14】
1) 피검개체로부터 분리된 시료로부터 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성이 정상 대조군에 비해 감소한 경우， 허혈성 질환을 갖거나 허혈성 질환을 가질 위험성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는， 허혈성 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 NDRG3 단백질의 검출 방법.
【청구항 15】
제 14항에 있어서, 상기 단계 1)의 시료는 세포， 조직， 혈액， 혈청， 타액 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 NDRG3 단백질의 검출 방법.
【청구항 16】
제 14항에 있어서， 상기 단계 1)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성 정도는 효소면역분석법 (ELISA) , 면역조직화학염색， 웨스턴 블럿팅 (Western Blott ing) 및 단백질 칩 (chip)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 NDRG3 단백질의 검출 방법 .
【청구항 17]
1) NDRG3 단백질 발현 세포주에 피검물질올 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포주에서 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성을 확인하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 NDRG3 단백질의 발현 또는 활성이 무처리 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법.
【청구항 18】
1) NDRG3과 PKC-β , RACK1 또는 c-Raf 중 어느 하나 아상을 발현하는 세포주에 저산소 상태에서 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 세포주에서 NDRG3과 PKC- , RACK1 또는 c-Raf 중 어느 하나 이상의 결합 정도를 확인하는 단계 ; 및
3) 상기 단계 2)의 결합 정도가 무처리 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법
【청구항 19]
1) 시험관 내에서 ( in vi tro) NDRG3 , PKC- β , RACK1 및 c-Raf 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 NDRG3 , PKC-β , RACK1 및 c-Raf 단백질 중 하나 이상의 결합 정도를 확인하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 결합 정도가 무처리 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법 .
[청구항 20】
약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법.
【청구항 21】
약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법 .
【청구항 22】
약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성ᅳ질환 예방방법 -.
【청구항 23】
약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법 .
【청구항 24】
약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법.
[청구항 25】
약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌 , 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법 .
【청구항 26】
약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방방법.
. .
【청구항 27]
약학적으로 유효한 양의 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물올 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 치료방법 .
【청구항 28】
허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질 발현 또는 활성 촉진제의 용도.
【청구항 29]
허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체의 용도.
【청구항 30】
허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에서 NDRG3 단백질의 PHD2 도킹 부위인 47번째 알기닌， 66번째 아스파라긴 또는 296번째 발린 중 어느 하나 이상의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되거나 97번째 글루타민이 글루탐산으로 치환된 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터， 또는 상기 백터를 포함하는 세포의 용도.
【청구항 31】
허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 NDRG3 단백질의 아미노산 서열에서 294번째 프를린 부위의 하이드록실화를 억제하는 단백질 또는 화합물의 용도.
PCT/KR2014/006010 2014-05-26 2014-07-04 Ndrg3 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 WO2015182815A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140062873 2014-05-26
KR10-2014-0062873 2014-05-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015182815A1 true WO2015182815A1 (ko) 2015-12-03

Family

ID=54699127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/006010 WO2015182815A1 (ko) 2014-05-26 2014-07-04 Ndrg3 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101663029B1 (ko)
WO (1) WO2015182815A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120004097A (ko) * 2010-07-06 2012-01-12 가톨릭대학교 산학협력단 Ｖｅｇｆｒ―３을 포함하는 허혈질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20120009847A (ko) * 2010-07-21 2012-02-02 단국대학교 산학협력단 Ｘｉａｐ 단백질을 포함하는 허혈성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물
KR20120134940A (ko) * 2011-06-03 2012-12-12 전남대학교산학협력단 골 형성 또는 혈관신생 촉진용 펩타이드 ｂｆｐ 4 및 이의 용도

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2523740C (en) * 2003-05-01 2012-05-15 Innogene Kalbiotech Pte Ltd Lactate containing pharmaceutical composition and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120004097A (ko) * 2010-07-06 2012-01-12 가톨릭대학교 산학협력단 Ｖｅｇｆｒ―３을 포함하는 허혈질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20120009847A (ko) * 2010-07-21 2012-02-02 단국대학교 산학협력단 Ｘｉａｐ 단백질을 포함하는 허혈성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물
KR20120134940A (ko) * 2011-06-03 2012-12-12 전남대학교산학협력단 골 형성 또는 혈관신생 촉진용 펩타이드 ｂｆｐ 4 및 이의 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUN, ZHONGCHAN ET AL.: "Variation of NDRG2 and c-Myc expression in rat heart during the acute stage of ischemia/reperfusion injury", HISTOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY, vol. 135, no. 1, 2011, pages 27 - 35, XP055240768, ISSN: 0948-6143 *
YAMAMOTO, HITOMI ET AL.: "NDRG4 protein-deficient mice exhibit spatial learning deficits and vulnerabilities to cerebral ischemia", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 286, no. 29, 2011, pages 26158 - 26165, XP055240767, ISSN: 0021-9258 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150136000A (ko) 2015-12-04
KR101663029B1 (ko) 2016-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ji et al. The deubiquitinating enzyme cylindromatosis mitigates nonalcoholic steatohepatitis
Tang et al. Selective inhibition of STRN3-containing PP2A phosphatase restores hippo tumor-suppressor activity in gastric cancer
Dale et al. A selective chemical probe for exploring the role of CDK8 and CDK19 in human disease
Cheng et al. FAM129B, an antioxidative protein, reduces chemosensitivity by competing with Nrf2 for Keap1 binding
Chen et al. ATP6V0D1 promotes alkaliptosis by blocking STAT3-mediated lysosomal pH homeostasis
Liu et al. Diabetes mellitus exacerbates post‐myocardial infarction heart failure by reducing sarcolipin promoter methylation
Wang et al. CLEC5A knockdown protects against cardiac dysfunction after myocardial infarction by suppressing macrophage polarization, NLRP3 inflammasome activation, and pyroptosis
Zuo et al. Thymidine kinase 1 drives skin cutaneous melanoma malignant progression and metabolic reprogramming
EP2845588A1 (en) PIN1 inhibitors for use in the prevention and/or treatment of theileriosis, and related applications
US20240139125A1 (en) Bi-1 antagonists and their uses
US9752151B2 (en) Composition for treatment or metastasis suppression of cancers which includes p34 expression inhibitor or activity inhibitor as active ingredient
US9383364B2 (en) Predictive marker of DNMT1 inhibitor therapeutic efficacy and methods of using the marker
Benichou et al. The transcription factor ChREBP Orchestrates liver carcinogenesis by coordinating the PI3K/AKT signaling and cancer metabolism
WO2015182815A1 (ko) Ndrg3 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR20110085153A (ko) Ｓｈ３ｒｆ２ 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
KR101721492B1 (ko) Ndrg3 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물
US20190002989A1 (en) Mcl-1 as a therapeutic target in scffbw7 deficient neoplasm
KR101767605B1 (ko) Ndrg3 단백질을 이용한 젖산의 정량 방법
US20130157959A1 (en) Use of hades as tumor suppressor target
Cheng et al. RGCC-mediated PLK1 activity drives breast cancer lung metastasis by phosphorylating AMPKα2 to activate oxidative phosphorylation and fatty acid oxidation
KR101695740B1 (ko) Ndrg3 과발현 형질전환 동물모델 및 이의 용도
WO2014018620A1 (en) Methods and compounds for reducing threonyl-trna synthetase activity
KR102536092B1 (ko) Lrp5 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101904343B1 (ko) Ndrg3 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR101945292B1 (ko) 방사선 치료후 재발암의 치료를 위한 바이오마커

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14893629

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14893629

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1