CN113677699A - 神经调节蛋白-4化合物和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及神经调节蛋白(NRG)4化合物和使用NRG4化合物治疗的方法。

Description

神经调节蛋白-4化合物和使用方法
本发明涉及神经调节蛋白(NRG)4化合物和使用NRG4化合物治疗的方法。本发明的NRG4化合物优选与人表皮生长因子受体(HER)4具有有效的结合，并且具有与该结合相关的有效活性。优选的NRG4化合物可用于改善心脏功能和/或治疗疾病，在所述疾病中HER4结合和由此产生的活性起重要作用，例如心力衰竭(HF)，包括射血分数降低的HF(HFrEF)。
对于新的、改善的HF的治疗方法，存在未满足的医疗需求。目前可用的疗法旨在减缓疾病进展并改善症状，并且依靠血流动力学变化来减少衰竭心脏的工作量。这些疗法包括这样的活性剂，其旨在：(A)降低心率，例如β受体阻断剂和伊伐布雷定；(b)降低血压，例如血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂(ARB)、盐皮质激素受体拮抗剂(MRA)和沙库巴曲/缬沙坦
Figure BDA0003289999020000011
和/或(c)治疗或预防容量超负荷，例如利尿剂和MRA。然而，这些治疗并不直接治疗心脏，并且具有实际局限性，例如需要调整剂量和监测低血压。此外，即使这些现有的治疗选择是可获得的，所有HF患者，即使是症状轻微的患者，也有很高的死亡风险。参见，例如，Ahmed A,A propensity matched study of NewYork Heart Association class and natural history end points in heart failure,AM.J.CARDIOL.2007；99(4):549-553。因此，需要新的和改善的HF治疗。
已经开展了确定新治疗选择的研究和开发工作。例如，WO2014/187342旨在描述通过延长NRG的释放来预防、治疗或延迟HF，所述NRG据报道包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4。该公开还描述了一项临床研究，据报道其在慢性心力衰竭患者中进行了延长的NRG-1施用。
然而，仍然需要治疗选择，其与现有疗法相比，具有改善的效力和降低的毒性风险。需要改善长期结果的疗法，包括提高生存率和降低住院率。还需要通过改变血流动力学以外的机制来改善心脏功能的疗法，所述疗法具有改变或逆转疾病的潜力。还需要耐受性更好的疗法，尤其包括对于患有例如低血压、低血钾和肾功能不全等伴随疾病的患者的治疗。还需要改善晚期疾病患者的生活质量(QOL)的疗法。本发明寻求满足一种或多种这些关键的未满足的需求。
因此，本发明提供了NRG4化合物，其具有与选择性结合HER4相关的活性。本发明的NRG4化合物几乎不与HER3结合，导致与HER3相关的毒性和/或耐受性问题的风险降低。
本发明还提供了使用NRG4化合物治疗或预防CVD和相关病症，尤其包括HF的方法。本发明优选的NRG4化合物和方法降低CV相关的死亡或HF相关的住院风险，降低心肌梗塞(MI)或中风的风险，降低需要左心室辅助装置(LVAD)或心脏移植的概率，改善心脏功能和结构，和/或改善与HF相关的症状和身体限制，从而改善QoL。优选的NRG4化合物和方法可以与标准护理(SoC)结合使用，无需剂量调整(titration)或监测，并且不会增加低血压、恶化肾功能、导致电解质失衡、导致肝功能障碍、增加肿瘤发生率、和/或导致持续性精子减少症。
本发明还提供了NRG4化合物，与人NRG4的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)相比，其包含第1位的D残基变为G残基的修饰，以及多达五个额外的修饰。
本发明还提供NRG4化合物，其包含下式：
X0GHEEPCGX8SHKSFCLNGGLCYX22IPTX26PSPFCRCVX35NYTGARCEX44VFL；其中:X0选自T、PT、MPT、S、GS、GGS、GGGS和(GGGGXλ)n，其中Xλ是Q、A、E或S，以及n＝1-5(SEQ ID NO:5),或不存在；X8是E或P；X22是Q或V；X26是F或I；X35是E或A；且X44是H、K或E(SEQ ID NO:2)。
在另一方面，本发明提供了在需要其的患者中治疗或预防HFrEF的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的NRG4化合物24-96小时。
本发明的另一个实施方案提供了本发明的NRG4化合物，其用于治疗。
本发明的另一个实施方案提供了NRG4化合物，其用于治疗或预防HFrEF，其中施用所述NRG4化合物24-96小时。
本发明的另一个实施方案提供了NRG4化合物，其用于制备治疗或预防HFrEF的药物，其中施用所述NRG4化合物24-96小时。
本发明的另一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含本发明的NRG4化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一个实施方案提供泵装置，其包含本发明的NRG4化合物。在某些实施方案中，泵是贴片泵(patch pump)。
NRG4是NRG蛋白质家族的四个成员之一，该家族本身是称为表皮生长因子(EGF)蛋白质的更大蛋白质家族的一部分。EGF蛋白质家族包括EGF本身，以及称为EGF样蛋白质的其他蛋白质，它们具有与EGF相似的某些结构特征。EGF样蛋白质包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4，以及肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、转化生长因子-α、双调蛋白(AR)、上皮调节蛋白(EPR)、epigen、betacellulin(BTC)和这些蛋白质的各种同种型。虽然这些配体是细胞外膜蛋白，但各种细胞刺激导致细胞金属蛋白酶活化，导致蛋白水解释放蛋白质的EGF结构域，然后该结构域自由结合受体并启动信号传导。EGF蛋白质家族的各种成员具有广泛的多种发育相关作用，包括与正常发育相关的作用以及与包括癌症在内的许多疾病的病理学相关的作用。这些作用是通过与称为ErbB受体家族的四种受体酪氨酸激酶亚家族的相互作用来介导的：EGFR(ErbB-1)、HER2(ErbB-2)、HER3(ErbB-3)、HER4(ErbB-4),和这些受体的同种型。NRG家族成员本身具有不同作用，这通过它们与EGFR、HER3和HER4的特定相互作用介导。虽然HER2不与NRG家族的成员结合，但HER2通过与EGFR、HER3和HER4(一旦被配体化后)形成异二聚体来促进下游信号传导。因此，本文提及的HER3(或HER3/2或HER2/3)或HER4(或HER4/2或HER2/4)活性，应理解为由配体(例如NRG家族的成员)与HER3或HER4结合，以及随后结合的受体与HER2的异二聚化后的下游信号传导产生的活性。
如上所述，NRG家族的不同成员具有由不同受体亲和力和活性谱介导的不同作用。例如，NRG1化合物与HER3和HER4的细胞外结构域相互作用，并在多个器官的正常发育和癌症的发病机制中发挥作用。HER4结合及由此产生的活性与心脏功能和结构改善相关，而HER3结合及由此产生的活性与癌症、恶心、腹泻和肝毒性相关。参见，例如，O'Shea S,Johnson K,Clark R,Sliwkowski MX,Erickson SL.Effects of in vivo heregulinbeta1 treatment in wild type and ErbB gene-targeted mice depend on receptorlevels and pregnancy.AM J PATHOL.2001；158(5):1871-80；Mendes-Ferreira P,DeKeulenaer GW,Leite-Moreira AF,Brás-Silva C.Therapeutic potential ofneuregulin-1 in cardiovascular disease.DRUG DISCOV TODAY.2013；18(17-18):836-42.综述。另一方面，NRG4结合并激活HER4，但几乎不或不与HER3结合或对其具有活性。
NRG4作为115个氨基酸的前体蛋白表达，其具有如SEQ ID NO:3所示的序列：
MPTDHEEPCG PSHKSFCLNG GLCYVIPTIP SPFCRCVENY TGARCEEVFL PGSSIQTKSNLFEAFVALAV LVTLIIGAFY FLCRKGHFQR ASSVQYDINL VETSSTSAHH SHEQH(SEQ ID NO：3)。表达的蛋白质是跨膜蛋白质，其具有跨膜部分、细胞质部分和细胞外部分，其中包括在细胞刺激下蛋白水解释放的EGF部分。本发明的NRG4化合物包含上述表达蛋白(SEQ ID NO：3)中从氨基酸编号4-50的部分，其位于表达蛋白的胞外部分，如下面SEQ ID NO:1所示:
DHEEPCGPSH KSFCLNGGLC YVIPTIPSPF CRCVENYTGA RCEEVFL(SEQ ID NO：1)。为免生疑问，本发明NRG4化合物的的上下文中，任何氨基酸修饰的编号在本文中均基于上文SEQID NO：1中所示的序列。
当在本文中使用时，术语“NRG4化合物”是指包含全部或部分SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其变体或缀合物的蛋白质或肽。当在本文中使用时，术语“变体”是指相对于人蛋白质的氨基酸序列具有一个或多个修饰的氨基酸序列。此类修饰包括用另一个天然或非天然氨基酸取代天然人序列中的一个或多个氨基酸和/或天然人序列中的一个或多个氨基酸的缺失或添加。当在本文中使用时，术语“缀合物”是指蛋白质或肽，其包含全部或部分SEQID NO：1或其变体并且通过共价键连接至蛋白质、肽或其他化学部分。此类连接包括例如IgG Fc区、人白蛋白、富含甘氨酸的肽或脂肪酸部分。此外，除非另有明确说明，当NRG4化合物在本文的实施方案中描述或在权利要求中引述时，应理解该化合物可为游离形式或盐形式。
本发明提供了NRG4化合物，其包含式SEQ ID NO:1，并在其中具有一个或多个修饰，并且所述NRG4化合物比天然人NRG4具有更强的HER4亲和力和HER4结合相关活性，并且其至少与天然人NRG4同样地，相较于HER3受体，更选择性结合HER4受体。对HER4和HER3受体的亲和力和效力可以通过本领域已知的技术来确定，包括在以下实施例中描述的那些。在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物具有HER4结合导致的效力，该效力至少为天然人NRG1 EGF结构域最大效力的50％。在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物具有HER4结合导致的效力，该效力高达天然人NRG1 EGF结构域最大效力的90％。
当在本文中用于描述某些NRG4化合物时，术语“无HER3结合相关活性”是指当使用体外测定法(例如以下实施例中描述的那些测定法)进行测试时，这些化合物与HER3结合相关的活性不高于天然NRG4。
本发明的NRG4化合物相对于上文所示SEQ ID NO：1的氨基酸序列，包含一个或多个修饰，至少包括第1位的D被G取代(即，D1G)。发现D1G取代显著改善了与HER4的结合，而不会对超越HER3的选择性产生负面影响，包括在相对于野生型NRG4氨基酸序列包含额外修饰的NRG4化合物的情况。在本发明的某些优选实施方案中，发现与D1G组合，例如，在HER4结合和/或相对于HER3的选择性方面，具有有益效果的其他氨基酸修饰包括在第8位、第22位、第26位、第35位和第44位中的一个或多个位置上的修饰，尤其包括以下中的一个或多个：P8E、V22Q、I26F、E35A、E44H和E44K。本发明的NRG4化合物的特别优选的实施方案是三变体，其具有选自以下列表的三个氨基酸取代的组合：D1G/I26F/E44K；D1G/I26F/P8E；D1G/I26F/E44H；和D1G/V22Q/E44K。本发明的NRG4化合物的一个最优选的实施方案包含以下三氨基酸取代：D1G/V22Q/E44K，如SEQ ID NO:4所示：
GHEEPCGPSHKSFCLNGGLCYQIPTIPSPFCRCVENYTGARCEKVFL
(SEQ ID NO:4)
在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物还可以在上述SEQ ID NO:1的序列的C-或N-末端处包括一个或多个氨基酸，其全长表达的蛋白质将示于SEQ ID NO:3中，条件是包含的此类氨基酸不会消除其强于天然的对HER4的结合和对HER4的活性、或相对于HER3的选择性。
在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物还可包含在SEQ ID NO：3所示的全长蛋白质中不存在的一个或多个额外氨基酸或其他化学部分。例如，本发明的某些NRG4化合物通过共价键与蛋白质、富含甘氨酸的肽和/或其他化学部分缀合。在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物包含富含甘氨酸的肽，其包含序列(GGGGXλ)n，其中Xλ是Q、A、E或S，并且其中n＝1-5(SEQ ID NO：5)。在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物在N-末端包含SEQ ID NO：5所示的序列，其中Xλ是S，并且n＝1。
在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物包括下式：
X0GHEEPCGX8SHKSFCLNGGLCYX22IPTX26PSPFCRCVX35NY TGARCE X44VFL；其中：X0选自T、PT、MPT、S、GS、GGS、GGGS和(GGGGXλ)n，其中Xλ是Q、A、E或S，以及n＝1-5(SEQ ID NO:5),或不存在；X8是E或P；X22是Q或V；X26是F或I；X35是E或A；且X44是H、K或E(SEQ ID NO:2)。
在某些实施方案中，X8是P；X22是V；X26是I；X35是E；且X44是E。在其他实施方案中，X8是E；X22是V；X26是I；X35是E；且X44是E。在其他实施方案中，X8是P；X22是Q；X26是I；X35是E；且X44是E。在其他实施方案中，X8是P；X22是V；X26是F；X35是E；且X44是E。在其他实施方案中，X8是P；X22是V；X26是I；X35是A；且X44是H或E。在其他实施方案中，X8是P；X22是V；X26是F；X35是E；且X44是K。在其他实施方案中，X8是P；X22是V；X26是F；X35是E；且X44是H。在其他实施方案中，X8是E；X22是V；X26是F；X35是E；且X44是E。在优选的实施方案中，X8是P；X22是Q；X26是I；X35是E；且X44是K。
在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物包含IgG Fc区。如本文所用，术语“IgGFc区”是指人IgG抗体片段的恒定区。特别地，Fc区包括抗体的CH2和CH3恒定区结构域，并且还可以包括一些或全部铰链区。包含在本发明的某些NRG4化合物中的IgG Fc区可包含来自IgG抗体的一条重链或两条重链的恒定区的片段，其彼此通过非共价相互作用和二硫键连接。当在本文中使用时，术语IgG Fc区还包括这样的抗体片段的形式，其已被修饰、延长和/或截短，例如，以改变NRG4化合物的性质或特征，例如其效力和/或药代动力学。在本发明的某些实施方案中，人IgG Fc区也可以去除一些或全部铰链区，以简化二硫键介导的Fc二聚化。本发明的某些实施方案中，IgG Fc区包含具有不同氨基酸序列的两条重链的二聚体，其可通过本领域已知的技术制备。参见，例如，Lewis SM等人，NAT.BIOTECHNOL.32(2):191-8(2014)；Carter,J.IMMUNOL.METHODS,248(1-2):7-15(2001)；Ridgway,J.B等人PROTEINENG.9(7):617-2(1996)。
一个优选的IgG Fc区是以下两条氨基酸链的二聚体：ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:6)；和ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:7)。
另一个优选的IgG Fc区是以下两条氨基酸链的二聚体：ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:8)；和ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:9)。
在本发明的NRG4化合物包含IgG Fc区的某些实施方案中，IgG Fc区通过接头的方式连接。在某些实施方案中，接头是肽接头，其包含上文SEQ ID NO:5中列出的序列，其中Xλ是Q、A、E或S，并且n＝1-5。在某些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:5的序列，其中Xλ是S并且n是3。在本发明的NRG4化合物包含通过肽接头的方式连接的IgG Fc区的某些实施方案中，肽接头的N-末端残基直接融合至IgG Fc区的一条链的C-末端残基，并且NRG4激动剂的N-末端残基直接融合至肽接头的C-末端残基。
在本发明的某些NRG4化合物中包含的IgG Fc区可以在生产和/或施用方面具有优势。关于生产，可以使用本领域已知的生物表达技术，例如以下实施例中描述的那些技术，快速生产此类化合物。使用此类技术的快速生产在研究和开发的所有阶段提供了效率，特别是包括在生产用于筛选结合和/或活性的NRG4变体方面。关于施用，包含IgG Fc区的NRG4化合物可具有延长的药代动力学特征，包括长达约14天的血清暴露。
然而，尽管有这些优点，但也发现长期暴露于NRG4，包括超过约8天的血清暴露，可能会产生心脏毒性风险，如下面的实施例所述。还发现，通过制备具有较短药代动力学半衰期(包括约8天的血清暴露)的化合物(例如，通过使用修饰的Fc区)，可以减轻毒性风险，尽管并非在所有物种中都消除了毒性风险。
还发现，与上述8-14天的暴露持续时间相比，提供对NRG4化合物较短的暴露期间能够提供足够和持续的效力，而没有上述段落中描述的NRG4化合物的心脏毒性风险。这种暴露持续时间的示例是约1至约7天，优选2、3或4天。因此，在某些实施方案中，本发明提供治疗或预防HFrEF的方法，其中以足以提供持续约24至约168小时的治疗有效血清浓度的量施用NRG4化合物。在某些实施方案中，以足以提供持续约24至约96小时的治疗有效血清浓度的量施用NRG4化合物。在某些实施方案中，以足以提供持续约24小时的治疗有效血清浓度的量施用NRG4化合物。在某些实施方案中，以足以提供持续约48小时的治疗有效血清浓度的量施用NRG4化合物。在某些实施方案中，以足以提供持续约72小时的治疗有效血清浓度的量施用NRG4化合物。在某些实施方案中，以足以提供持续约96小时的治疗有效血清浓度的量施用NRG4化合物。
上段中描述的暴露持续时间可以通过提供具有药代动力学特征的NRG4化合物的单次“弹丸式”注射，以允许血清暴露持续上段中描述的时间段来实现；或者通过连续施用(例如，通过使用泵)快速清除NRG4化合物，以持续上段中描述的时间段来实现。
当在本文中使用时，术语“持续效力”是指心力衰竭相关的改善，其超出了施用NRG4化合物的时间段。例如，在某些实施方案中，以足以提供持续72小时的治疗有效血清浓度的量施用NRG4化合物，在某些实施方案中，此类治疗方案的效力可以持续约6天(施用持续时间的约2倍)至约4个月(施用持续时间的约30倍)的时间段。在本文的某些实施方案中，相对于施用持续时间(即，提供治疗有效血清浓度的时间量)的效力持续时间(即，看到临床益处的时间量)被确定为“效力:施用比率”。在某些实施方案中，效力:施用比率的范围为约2至约50。在某些实施方案中，效力:施用比率的范围为约20至约45。在某些实施方案中，效力:施用比率为约22、约30、或约45。
这种持续的效力允许相对不频繁地以足以提供持续期望时间段的治疗有效血清浓度的量施用NRG4化合物。在某些实施方案中，每六个月施用一次NRG4化合物。在某些实施方案中，NRG4化合物的施用频率不超过每周一次。在其他实施方案中，每两个月施用一次NRG4化合物。在其他实施方案中，每个月施用一次NRG4化合物。在某些优选的实施方案中，每季度施用一次NRG4化合物。在其他优选的实施方案中，每六个月施用一次NRG4化合物。
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(to treat)”包括抑制、减缓、停止或逆转现有症状或疾患的进展或严重性。根据本发明，心力衰竭或HFrEF的治疗可以反映在与心力衰竭相关的多种测量值中的一种或多种中，包括例如：左心室射血分数(LVEF)的增加、收缩末期左心室腔容积(LVESV)的增加、左心室舒张末期压(LVEDP)的降低、CV死亡和/或心力衰竭住院风险的降低、总死亡风险的降低、心肌梗塞(MI)风险的降低、中风风险的降低、需要左心室辅助装置(LVAD)植入和/或心脏移植的风险的降低、心力衰竭症状和身体限制的改善和/或生活质量(QoL)的改善。根据本发明实施方案的治疗的某些益处可在治疗至少1个月后实现。根据本发明实施方案的治疗的某些益处可在治疗至少6个月后实现。根据本发明实施方案的治疗的某些益处可在治疗至少1年后实现。
在某些实施方案中，根据本发明的NRG4化合物的施用导致LVEF的显著改善。在某些实施方案中，根据本发明的NRG4化合物的施用导致LVEF改善至少5％。在某些实施方案中，在6个月的治疗后，根据本发明的NRG4化合物的施用导致LVEF改善至少5％。在某些实施方案中，在1年的治疗后，根据本发明的NRG4化合物的施用导致LVEF改善至少5％。在某些实施方案中，在1年的治疗后，根据本发明的NRG4化合物的施用导致LVESV改善至少5％。在某些实施方案中，在1年的治疗后，根据本发明的NRG4化合物的施用导致LVEDP的显著降低。在某些实施方案中，根据本发明的NRG4化合物的施用导致整体纵向应变(GLS)的显著降低。在某些实施方案中，根据本发明的NRG4化合物的施用导致GLS降低至少3.5％。在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物的施用导致CV死亡和/或HF住院风险降低至少15％。在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物的施用导致总死亡率、MI、中风、LVAD植入或心脏移植中的一种或多种风险的显著降低。在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物的施用导致心力衰竭和/或QoL的症状和身体限制的显著改善。
此外，如上所述，根据本发明的某些实施方案的NRG4化合物的施用能够在心力衰竭相关测量值中提供改善，例如上述那些测量值，而不增加安全风险。因此，在优选的实施方案中，根据本发明的NRG4化合物的施用不会导致安全风险的增加，例如不会增加低血压；肾功能恶化；电解质失衡；肝功能障碍；肿瘤或持续性精子减少的发生。
当在本文中使用时，术语“治疗有效量”是指在患者中提供期望效果的NRG4化合物的量或剂量。在具有扩展的药代动力学特征的NRG4化合物的情况下，这样的剂量可以是单次或多次剂量施用时给予的量。在一段时间内施用更快速作用的化合物的情况下，例如如上所述的24-96小时输注，剂量或量可以表示为在该时间段内施用的NRG4化合物的总质量，例如，总mg，或可以表示为NRG4化合物在该时间内施用的速率，例如，mg/min，或可以表示为NRG4化合物在施用期间的血浆浓度。本领域技术人员通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果可以容易地确定有效量。在某些实施方案中，每季度一次施用的剂量可落在足以在施用期间提供约3至约100nM的血浆浓度的剂量范围内。
根据本发明的NRG4化合物的施用通常是肠胃外施用，例如静脉内(IV)、皮下(SC)或腹膜内(IP)施用。因此，在本发明的某些实施方案中，静脉内施用NRG4化合物。在本发明的其他实施方案中，腹膜内施用NRG4化合物。在其他实施方案中，皮下施用NRG4化合物。
为了控制暴露持续时间以获得优化的持续效力，同时具有足够的到心脏毒性的空间(margin)，优选通过连续或间歇输注进行NRG4化合物的肠胃外施用。例如，许多类型的输注泵用于输注范围广泛的药物，并且此类泵可用于施用根据本发明的NRG4化合物。最近，已经开发出比传统装置更小且直接附着至患者的皮肤的贴片泵，使得对患者日常活动的干扰最小化。因此，在某些实施方案中，通过输注泵或贴片泵施用NRG4化合物。优选地，通过贴片泵施用NRG4化合物。
本发明还包括可用于生产本发明的NRG4化合物的新型中间体和方法。本发明的中间体和NRG4化合物可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用化学合成或生物表达的方法，例如以下实施例中描述的那些方法。
关于化学合成，可以以不同方式组合所描述的每条路线的具体合成步骤，以制备本发明的NRG4化合物。试剂和起始材料对于本领域普通技术人员来说是容易获得的。
关于生物表达，在将序列可操作地连接至表达控制序列后，在宿主细胞中表达化合物。这些化合物可以容易地在哺乳动物细胞中(例如CHO、NSO、HEK293、BHK或COS细胞)；在细菌细胞中(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或荧光假单胞菌)；在昆虫细胞中、或在真菌或酵母细胞中产生，使用本领域已知的技术培养这些细胞。可以通过众所周知的方法将包含感兴趣的多核苷酸序列的载体转移到宿主细胞中，该方法根据细胞宿主的类型而变化。可以使用多种蛋白质纯化方法，并且这些方法是本领域已知的。
如上所述，所有HF患者，即使是症状较轻的那些患者，也有很高的死亡风险。因此，当在本文中使用时，提及“需要治疗心力衰竭(HF)的患者”可以指广泛范围的患有HF的个体，包括具有如下所述的广泛范围的疾病严重性的那些个体。纽约心脏协会(NYHA)提供了HF程度或严重程度的分类方案，总结在下表1中：
Figure BDA0003289999020000131
表1。
在某些实施方案中，有需要的患者处于NYHA II-IV级心力衰竭。在某些实施方案中，有需要的患者处于NYHA II级心力衰竭。在某些实施方案中，有需要的患者处于NYHAIII级心力衰竭。在某些实施方案中，有需要的患者处于NYHA IV级心力衰竭。在某些实施方案中，有需要的患者处于NYHA II-III级心力衰竭。
如上所述，现有的心力衰竭治疗选择，包括当前的护理标准，通过血流动力学机制(例如，降低血压、心率和/或血浆量，以降低衰竭心脏的工作负荷)改善症状并减缓疾病进展。相比之下，本发明的NRG4化合物通过不同的作用机制实现其作用，即，选择性HER4结合及其产生的活性，其直接改善心肌细胞存活和细胞代谢并促进心肌再生。由于这些不同的作用机制，本发明的NRG4化合物可以在现有SoC之上施用而无需剂量调整或监测。因此，在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物可以与一种或多种额外的心力衰竭治疗组合施用。在某些实施方案中，一种或多种额外的心力衰竭治疗选自β阻断剂、ACE抑制剂、ARB、MRA、利尿剂、伊伐布雷定和沙库巴曲/缬沙坦
Figure BDA0003289999020000141
在某些实施方案中，本发明的NRG4化合物可以与SGLT2抑制剂或sGC活化剂组合施用。
本发明的NRG4化合物还可用于治疗其他疾病或病症，包括但不限于保留射血分数的心力衰竭(HFpEF)、其他心脏相关的疾患或病症、帕金森病、阿尔茨海默病、肠易激综合征、骨骼疾患、肾脏疾病、糖尿病、代谢疾病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
其他的实施方案描述如下：
一种NRG4化合物，与人NRG4的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)相比，其包含第1位的D残基变为G残基的修饰，以及多达五个额外的修饰。
前述实施方案的NRG4化合物，其具有不超过4个的额外的修饰。在一个实施方案中，NRG4化合物具有不超过3个的额外的修饰。在一个实施方案中，NRG4化合物具有不超过2个的额外的修饰。
上述实施方案中任一项的NRG4化合物，其中所述化合物在选自8、22、26、35和44的位置上包括至少一个修饰。
一种化合物，其包含下式：
X0GHEEPCGX8SHKSFCLNGGLCYX22IPTX26PSPFCRCVX35NY TGARCE X44VFL，其中：X0选自T、PT、MPT、S、GS、GGS、GGGS和(GGGGXλ)n，其中Xλ是Q、A、E或S，以及n＝1-5(SEQ ID NO:5),或不存在；X8是E或P；X22是Q或V；X26是F或I；X35是E或A；X44是H、K或E(SEQ ID NO:2)。
上述实施方案的化合物，其中X8是P；X22是V；X26是I；X35是E；且X44是E。
上述实施方案中任意的化合物，其中X8是E；X22V；X26是I；X35是E；且X44是E。
上述实施方案中任意的化合物，其中X8是P；X22是Q；X26是I；X35是E；且X44是E。
上述实施方案中任意的化合物，其中X8是P；X22是V；X26是F；X35是E；且X44是E。
上述实施方案中任意的化合物，其中X8是P；X22是V；X26是I；X35是A；且X44是H或E。
上述实施方案中任意的化合物，其中X8是P；X22是V；X26是F；X35是E；X44是K。
上述实施方案中任意的化合物，其中X8是P；X22是V；X26是F；X35是E；且X44是H。
上述实施方案中任意的化合物，其中X8是E；X22是V；X26是F；X35是E；且X44是E。
上述实施方案中任意的化合物，其中X8是P；X22是Q；X26是I；X35是E；且X44是K。
前述实施方案的化合物，其中X0是SEQ ID NO：5，其中Xλ是S，且n＝1。
一种包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的化合物。
一种包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的化合物。
一种包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的化合物。
一种包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的化合物。
一种包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的化合物。
一种包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的化合物。
一种包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的化合物。
一种包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的化合物。
一种包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的化合物。
一种包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的化合物。
一种包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的化合物。
一种由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成的化合物。
前述实施方案中任意的化合物，其中所述化合物通过共价键连接至蛋白质、肽或其他化学部分。前述实施方案中任意的化合物，其中所述化合物连接至IgG Fc区、人白蛋白、富含甘氨酸的肽或脂肪酸部分中的一个或多个。前述实施方案中任意的化合物，其中所述化合物连接至IgG Fc区。前述实施方案的化合物，其中所述IgG Fc区包含SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的二聚体或SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的二聚体。前述实施方案的化合物，其中X0是SEQ ID NO：5，其中Xλ是S，n＝3。
上述实施方案中任意的化合物，其中所述化合物与HER4结合相关的活性大于天然人NRG4。
上述实施方案中任意的化合物，其中所述化合物与HER4结合相关的活性是天然人NRG1最大活性的至少50％。
上述实施方案中任意的化合物，其中所述化合物与HER4结合相关的活性是天然人NRG1最大活性的至少70％。
上述实施方案中任意的化合物，其中所述化合物与HER4结合相关的活性是天然人NRG1最大活性的至少90％。
上述实施方案中任意的化合物，其中所述化合物不具有与HER3结合相关的活性。
一种药物组合物，其包含上述实施方案中任意的化合物。
一种泵装置，其包含上述实施方案中任意的化合物。
一种在有此需要的患者中治疗或预防HF的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的NRG4化合物。在一个实施方案中，NRG4化合物是上述实施方案中任意的化合物。
一种NRG4化合物，其用于治疗或预防HFrEF。在一个实施方案中，NRG4化合物是上述实施方案中任意的化合物。
一种NRG4化合物，用于制备治疗或预防HFrEF的药物。在一个实施方案中，NRG4化合物是上述实施方案中任意的化合物。
在一个实施方案中，化合物施用24-168小时。在一个实施方案中，化合物施用24-96小时。在一个实施方案中，化合物施用24、48、72或96小时。在一个实施方案中，化合物施用96小时。
在一个实施方案中，化合物的施用频率不超过每个月一次。在一个实施方案中，化合物的施用频率不超过每季度一次(Q3M)。在一个实施方案中，化合物以Q3M施用。在一个实施方案中，化合物以Q3M施用，施用持续96小时。在一个实施方案中，化合物每六个月施用一次。
在一个实施方案中，效力:施用比率为约2至约50。在一个实施方案中，效力:施用比率为约20至约45。在一个实施方案中，效力:施用比率为约22、约30或约45。
在一个实施方案中，治疗持续至少6个月。
在一个实施方案中，治疗持续至少1年。
在一个实施方案中，化合物导致LVEF显著增加。在一个实施方案中，化合物导致LVEF增加至少5％。在一个实施方案中，在治疗1年后，化合物导致LVEF改善5％。
在一个实施方案中，化合物导致LVESV显著增加。在一个实施方案中，化合物导致LVESV改善5％。在一个实施方案中，在治疗1年后，化合物导致LVESV改善5％。
在一个实施方案中，化合物导致LVEDP显著降低。在一个实施方案中，在治疗1年后，化合物导致LVEDP显著降低。
在一个实施方案中，化合物导致整体纵向应变(GLS)显著降低。在一个实施方案中，化合物导致GLS降低至少3.5％。
在一个实施方案中，化合物导致LVEDV显著改善。
在一个实施方案中，化合物导致CV死亡和/或HF住院风险的显著降低。
在一个实施方案中，化合物导致CV死亡风险降低至少15％。
在一个实施方案中，化合物导致HF住院风险降低至少15％。
在一个实施方案中，化合物导致总死亡率、MI、中风、LVAD植入或心脏移植中的一种或多种风险的显著降低。
在一个实施方案中，化合物导致心力衰竭的症状和身体限制和/或QoL的显著改善。
在一个实施方案中，化合物不导致：增加低血压；肾功能恶化；电解质失衡；肝功能障碍；肿瘤或持续性精子减少的发生。
在一个实施方案中，肠胃外施用化合物。
在一个实施方案中，静脉内、皮下或腹膜内施用化合物。
在一个实施方案中，通过输注泵施用化合物。
在一个实施方案中，通过贴片泵施用化合物。
在一个实施方案中，治疗有效量是提供约3至约100nM的血清浓度的化合物的量。
在一个实施方案中，将化合物施用于心力衰竭NYHA II-IV级的患者。
在一个实施方案中，将化合物施用于心力衰竭NYHA II-III级的患者。
在一个实施方案中，化合物与一种或多种额外的心力衰竭治疗同时或顺序组合施用。在一个实施方案中，一种或多种额外的心力衰竭治疗选自β受体阻断剂、ACE抑制剂、ARB、MRA、利尿剂、伊伐布雷定和沙库巴曲/缬沙坦
Figure BDA0003289999020000181
在一个实施方案中，化合物与SGLT2抑制剂和/或sGC活化剂同时或顺序组合施用。
在一个实施方案中，施用的NRG4化合物是本发明的NRG4化合物。
通过下面的实施例进一步说明本发明，其不应被解释为限制。
示例化合物的制备
本发明NRG4化合物的示例在下表2中描述。
Figure BDA0003289999020000191
表2。示例NRG4化合物的组分。在第四列中列出的SEQ ID NO中提供了示例化合物的完整氨基酸序列，不包括任何IgG Fc区序列。示例1-8和10-11进一步包含IgG Fc区。示例1-8和10的IgG Fc区包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的二聚体，其中上表第三列中鉴定的序列的N-末端氨基酸融合至SEQ ID NO：7的C-末端氨基酸。示例11的IgG Fc区包含SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9的二聚体，其中上表第三列中鉴定的序列的N-末端氨基酸融合至SEQID NO：9的C-末端氨基酸。
生物表达
使用CHO GSKO细胞系在哺乳动物细胞表达系统中产生包含Fc区的NRG4化合物的示例。GS基因敲除通过消除内源性GS背景活性来加强选择严格性，该GS背景允许低生产力或无生产力细胞在选择条件下存活。可以将编码本发明的Fc融合体knob链和hole链的基因亚克隆到含谷氨酰胺合成酶(GS)的各表达质粒中以进行共转染，或者可以将两条链亚克隆到一个含GS的表达质粒中。或者，如果需要改变任一链的相对表达水平，可以将不同比率的knob链和hole链组合到一个含GS的表达(质粒)中。编码knob链或hole链的cDNA序列与信号肽的编码序列框内融合，该信号肽的编码序列可以是鼠κ前导序列，以增强期望产物向细胞培养基中的分泌。该表达由病毒巨细胞病毒(CMV)启动子驱动。
CHO GSKO细胞可以被瞬时或稳定转染。为了稳定转染，使用电穿孔和适量的重组knob链和hole链表达质粒转染CHO GSKO细胞，并将转染的细胞以足够的细胞密度维持在悬浮培养中。通过在不含谷氨酰胺、含25μM甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的无血清培养基中生长并在32-37℃和5-7％CO2下培养，完成转染细胞的选择。Fc融合体从CHO细胞分泌到培养基中。
使用以下任一方法纯化蛋白质：(1)Protein A亲和色谱法，然后是阳离子交换或疏水相互作用色谱法(或其他合适的方法)；或(2)多模式色谱法，然后是疏水相互作用色谱法(或其他合适的方法)。
对于从蛋白A色谱法开始的纯化，将来自收获培养基的蛋白质捕获到MabSelectSuRe蛋白A树脂(GE Healthcare)上。然后用运行缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.4或含有Tris的运行缓冲液)短暂洗涤树脂，以去除非特异性结合的物质。然后用低pH溶液(例如，20mM乙酸/5mM柠檬酸)从树脂上洗脱蛋白质。合并含有Fc融合体的级分。可以根据需要通过添加碱(例如0.1M Tris，pH8.0)来提高pH。在这个阶段，Fc融合体可用于筛选结合/活性，或者如果需要，可以使用树脂(如Phenyl Sepharose Hp)通过疏水相互作用色谱法进一步纯化。可以使用含500mM至0mM梯度的硫酸钠的10mM磷酸钠溶液，pH 7，超过10个柱体积，从Phenyl Sepharose HP柱上洗脱Fc融合体。Fc融合体可以通过使用Superdex 200柱(GE Healthcare)、通过尺寸排阻色谱法进一步纯化，其中在PBS，pH 7.4中等度洗脱，或将缓冲液置换为期望的缓冲液。以这种方式纯化示例1-8和10。
对于从多模式色谱法开始的纯化，将来自收获培养基的蛋白质捕获到CaptoMMC树脂(GE Healthcare)上。然后用100mM柠檬酸盐，pH5.0(“A”缓冲液)短暂洗涤树脂，之后用80％/20％的“A”缓冲液和25mM磷酸钠、1M氯化钠、pH 7.5(“B”缓冲)洗涤。然后在70％“B”缓冲液中从树脂上洗脱期望的蛋白质。可以使用树脂如Phenyl Sepharose HP(GEHealthcare)、通过疏水相互作用色谱法进一步纯化Fc融合体。可以使用含800mM至0mM线性梯度的硫酸钠的20mM Tris,pH 8，从Phenyl Sepharose HP柱上洗脱Fc融合体。可以使用QSepharose柱(GE Healthcare)通过离子交换色谱法进一步纯化Fc融合体。可以使用含0mM至1mM氯化钠梯度的20mM Tris,pH 8，从柱上洗脱Fc融合体。合并级分，并将缓冲液置换为期望的缓冲液，用于保存。以这种方式纯化示例11。
化学合成
也可以使用Fmoc/t-Bu策略通过固相肽合成生产本发明的NRG4化合物，其是不包含IgG Fc区的肽(例如，上表2中的示例9)。在SymphonyX自动肽合成仪(PTI ProteinTechnologies Inc.)上合成肽。
Fmoc-L-Leu-Wang树脂(0.3-0.8毫摩尔/克，200-400目，Chem-Impex)用于合成肽。使用含20％v/v哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护。使用含10当量的Fmoc-氨基酸、0.9M二异丙基碳二亚胺(DIC)和0.9M氧化苦参碱(Oxyma)(1:1:1摩尔比)的DMF，在25℃下进行2小时的氨基酸偶联。使用DMF进行洗涤步骤，并且洗涤步骤包括在每个偶联和脱保护步骤之后。下表3提供了其他详细信息。
Figure BDA0003289999020000221
表3。Fmoc-脱保护和偶联方案。
主序列中使用的所有氨基酸均为L氨基酸：Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Asp(Otbu)-OH,Fmoc-Glu(Otbu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH。
在完成上述肽-树脂的延伸后，去除最终的Fmoc基团，并在使肽裂解之前用二氯甲烷洗涤树脂。将1.5mL水、三异丙基硅烷、苯甲硫醚、1,2乙二硫醇(1:1:1)的溶液加入13mL三氟乙酸(TFA)中，将所得裂解混合物加入树脂中，并在反应注射器中混合2.5小时。将含有裂解肽的TFA溶液转移到含有冷二乙醚的50mL锥形瓶中。将沉淀的肽溶液离心旋转，形成厚的团块，倾析出乙醚。在进行重新折叠之前，重复醚沉淀两次，以洗涤残留的混合物。
将粗肽溶解在水中，必要时加入乙腈。在乙腈和水中将粗肽浓度调节至2.5-3mg/mL(200mL)。然后使样品进行直接重新折叠。通过在0.1Mtris缓冲液(pH 8)中以GSSG:GSH(2mM:1mM)的比率添加氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽，来制备重新折叠缓冲液。将粗肽溶液添加到重新折叠缓冲液中至浓度为0.13-0.15mg/mL(稀释20倍)，并将重新折叠混合物保持在4℃下，不搅拌。1天后，通过添加高达0.2％的TFA以使pH值达到3.0，来淬灭重新折叠的混合物。然后过滤和纯化淬灭的溶液。
将肽溶液加载到HPLC柱上，然后在触发梯度之前用缓冲液A平衡。缓冲液A：0.1％TFA的水溶液；缓冲液B：100％乙腈。梯度：100分钟内从10％B到25％B。流速：18mL/分钟；在220nm处检测(Waters2489检测仪)。柱：Waters Symmetry Prep C18柱,7μm,19x300mm(Waters Part#WAT066245)。由UV自动触发并使用Waters级分收集器III收集级分。
合并的含有所需肽的级分组合并冻干。
体外研究
HER4/NRG-Fc结合测定法，用于筛选NRG4变体的改善的结合
结合测定法用于针对HER4受体高通量筛选NRG4变体Fc融合蛋白，以鉴定具有增加受体活化和信号传导潜力的亲和力驱动的变体。用含2μg/ml的抗His标签抗体的PBS包被ELISA板，以促进在用1％BSA/PBS/0.1％Tween 20封闭板后，标准化捕获C-末端His标记的HER4受体细胞外结构域(ECD)构建体(5μg/ml HER4 ECD)。在表达培养基中将饱和量的未纯化NRG4-Fc变体(从10μg/ml开始，在1％BSA/PBS/0.1％Tween 20中系列稀释)与捕获的受体孵育1小时。洗涤后，用抗人Fc特异性碱性磷酸酶第二检测试剂比色检测结合的变体NRG4-Fc，以定量结合。变体与受体结合的孵育时间或后续洗涤步骤的持续时间不同，以进一步鉴定分别由亲和力结合速率和解离速率驱动的结合变体。该筛选过程将示例1中包括的D1G修饰鉴定为具有高亲和力，并且具有增加受体活化和信号传导的潜力，如下表4中的数据所示。
Figure BDA0003289999020000241
表4。与HER4细胞外结构域的结合。
如表4中所示，在该研究中，包括D1G修饰的示例1在相似剂量下与WT NRG1具有相似的HER4结合，并且在相似剂量下与HER4的结合显著更高于WT NRG4。
CHO人和大鼠HER2-4和HER2-3细胞系的产生
使用过表达人或大鼠HER受体的CHO-K1细胞的基于细胞的测定法用来测定NRG4化合物的活性。CHO-K1细胞(ATCC)在含有5％FBS和20mM HEPES、40μg/mL L-脯氨酸、1x抗生素的DMEM-F12 3:1中生长，并每2-3天用TripLE Express(Gibco)1:5分离。根据制造商的说明，用Fugene 6(Promega)、用编码成对的HER受体(hHER2-3、hHER2-4、rHER2-3和rHER2-4)的质粒DNA转染细胞。包括HER2，是因为该受体不结合配体，而是用于下游信号传导的HER受体的优选二聚化配偶体。用嘌呤霉素(12ug/ml)和潮霉素(1mg/ml)选择转染的细胞3-4周，然后通过有限稀释克隆到96孔板中获得克隆系。通过Taqman方法，通过HER2、HER3或HER4的适当基因表达选择克隆系。NRG1诱导的磷酸化ERK1/2反应证实了具有适当受体表达的克隆系。使克隆生长、收获、分装到冷冻管中，然后在液氮下冷冻以进行长期储存。
通过人HER2-HER4介导的ERK1/2磷酸化体外筛选分子
磷酸化ERK1/2活性测定法用于测定NRG4化合物的效力。在测量人HER2-HER4介导的ERK1/2磷酸化的刺激的研究中分析了示例1-8和10与WT人NRG1和/或人NRG4相比的效力。该测定法包括表达人HER2和HER4的CHO-K1稳定系。CHO-hHER2-hHER4(克隆1H6)细胞在如下中常规培养：DMEM:F12(3:1)、5％FBS、40μg/mL L-脯氨酸、10μg/mL嘌呤霉素和1mg/mL潮霉素，37℃，5％CO2。用1X PBS洗涤细胞两次，用0.05％胰蛋白酶/0.53μM EDTA分离并通过300xg离心10m，收集。将细胞重新悬浮在维持培养基中。将20,000个细胞/孔以30μL接种到384孔多聚-D-赖氨酸细胞培养板(Greiner，目录号781946)中。平板用制造商的盖子盖住，并移至5％CO2、80％+湿度的37℃组织培养箱中，使其贴壁。24小时后，将培养基从平板中移除，并使用Biomek FX液体处理器替换为30μL无血清饥饿培养基(含0.1％BSA的低葡萄糖DMEM)。将平板放回孵育箱中，持续24小时。
在饥饿培养基中在透明的384W平板(Greiner，目录号781185)中制备瞬时表达hFcNRG4变体的293F上清液，4pt 1:8系列稀释(平均剂量范围250pM至140000pM)。从细胞培养板中去除培养基，并使用Biomek FX液体处理器将30uL/孔制备的变体压印到平板中。用箔密封将板密封并在室温下在定轨振荡器上刺激15分钟。然后用50uL冷PBS洗涤细胞一次。向细胞中加入30uL裂解缓冲液，并在室温下在定轨振荡器上振荡10m。
通过AlphaScreen SureFire磷酸化-ERK1/2试剂盒(T202/Y204)(Perkin Elmer,目录号TGRES)或
Figure BDA0003289999020000262
UltraTM pERK1/2测定试剂盒与AlphaScreen蛋白A IgG检测试剂盒(Protein-A)(PerkinElmer,目录号6760617)一起进行ERK1/2磷酸化的检测。CHO-K1细胞裂解后，将4μL裂解液转移至配有384W Biomek FX的384WAlpha Proxiplate(Perkin Elmer，目录号6008280)。将4uL阳性和阴性裂解物(PerkinElmer,TGRES-L)添加到可用孔中作为对照。使用Forumlatrix Mantis将5uL/孔的受体混合物(包含抗磷酸化-Thr202/Tyr204抗体和蛋白A缀合的受体珠)添加到平板中。将平板密封，以300xg离心1分钟，并在室温下在定轨振荡器上孵育2小时。通过Mantis分配2μL/孔供体混合物(包含链霉亲和素包被的供体珠和针对远端ERK1/2表位的生物素化抗体)。将板密封，以300xg离心1分钟，并在室温下在定轨振荡器上孵育2小时，然后在Perkin ElmerEnvision 2103多标签阅读器(HTS Alpha模式，激发时间：40ms，总测量时间：130ms)上读取。
每个样品都根据XLFit针对重复的每个板上包括的亲本hFcNRG4剂量反应作图。该数据以四参数拟合绘制在GraphPad Prism中，并提取EC50效力值。结果在表5和6中提供。
Figure BDA0003289999020000261
Figure BDA0003289999020000271
表5。与WT NRG4相比，示例1-5的活性。示例1-5的数据代表两个重复的平均值，并标明标准偏差。
如表5中的数据所示，与其对HER4增加的亲和力一致，在本研究中，与野生型NRG4相比，D1G修饰还显著增加了对HER4和HER2的活性，包括包含额外氨基酸修饰的示例。
样品 EC50(nM)
WT NRG1 0.3192
WT NRG4 1.2980
示例6 0.3947
示例7 0.5629
示例8 0.4033
示例10 0.2448
表6。示例6-8和10与WT NRG1和NRG4相比的活性。
如表6中的数据所示，在本研究中，示例6-8和10(每个都包括D1G修饰和额外的修饰)与WT NRG4相比显示对HER4和HER2增加的活性，并且与WT NRG1具有相似的活性。
用于测试纯化蛋白质的人和大鼠HER2-4或HER2-3磷酸化-ERK1/2(Thr202/ Tyr204)测定法
磷酸化-ERK1/2活性测定法用于测定纯化的NRG4化合物的效力和选择性，该测定法使用过表达人或大鼠HER受体的CHO-K1细胞。使用选择培养基(DMEM-F12 3:1，含5％FBS和20mM HEPES、40μg/mL L-脯氨酸、1x抗生素、12μg/mL嘌呤霉素、1mg/mL潮霉素B)培养表达人或大鼠HER受体的CHO-K1细胞系。在第-1天(磷酸化-ERK1/2测定法前一天)，用PBS洗涤细胞一次，用无酶细胞分离溶液(GIBCO cat#13151-014)分离，并重新悬浮在铺板培养基(DMEM-F12 3：1，含有20mM HEPES、1x抗生素、0.2％FBS)中。将细胞以每孔每0.1mL 10,000个细胞铺板在96孔多聚D-赖氨酸包被的平板(BD cat#354640)中。将细胞在37℃5％CO2的组织孵育箱中过夜培养。在第1天(pERK1/2测定法当天)，将平板在室温下孵育30分钟。除去培养基，然后加入在PBS-20mM HEPES-0.005％BSA中稀释的不同浓度的50μL配体。天然人NRG1和NRG4肽购自Reprokine(Tampa,FL)。刺激时间为30min(hHER2-4 1H6系除外，其刺激15min)。在刺激结束时，去除配体并添加70μL裂解缓冲液(根据制造商的配方制备，PerkinElmer cat#ALSU-PERK-A10K)。将平板在室温下在平板振荡器上以350rpm搅拌孵育10分钟，然后在冰上不振荡孵育1小时。将30μL细胞裂解液转移到96孔白色Optiplate(PerkinElmer cat#6002290)中，用于磷酸化-ERK1/2测定法测。简而言之，将7.5μL受体珠添加到Optiplate中的30μL裂解液中。用铝箔覆盖平板并在平板振荡器上以350rpm搅拌在室温下孵育1小时。然后加入7.5μL供体珠，用铝箔覆盖平板，在平板振荡器上以350rpm搅拌室温孵育2小时，或在4℃下过夜孵育(读数前将平板在室温下加热2小时)。在Envision仪器(AlphaTechnology兼容的读板器)上获得Alpha信号数据。根据测定方案制备供体珠和受体珠。使用AlphaScreen SureFire p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)测定试剂盒(Cat#TGRES50k)或
Figure BDA0003289999020000282
UltraTM p-ERK 1/2(Thr202/Tyr204)测定试剂盒(PerkinElmer cat#ALSU-PERK-A10K)生成显示的数据。NRG1肽的活性在两种类型的测定法中相似。将从Envision仪器获得的原始数据输入GraphPad Prism软件(第7版)中。由可变斜率四参数剂量反应曲线生成EC50值。通过表示NRG4化合物的平均最大原始数据除以每板的天然人NRG1的平均最大原始数据并乘以100，生成最大NRG1活性数据的百分比。数据在下表7-9中提供。N值反映运行的独立测定法的数量。
Figure BDA0003289999020000281
Figure BDA0003289999020000291
表7。人HER2/HER4测定法。
Figure BDA0003289999020000292
表8。大鼠HER2/HER4测定法。
如表7所示，野生型人NRG1肽对人HER4和HER2受体显示有效活性，而野生型人NRG4肽表现为弱的部分激动剂。示例9-11表现出有效的活性，EC50值比野生型人NRG1更有效，最大活性％大于野生型人NRG4肽并接近人NRG1的最大活性。如表8所示，在大鼠HER4HER2受体上获得了类似的结果，相对于人NRG1的效力略有增加，最大活性接近人NRG1。总之，所示的NRG4化合物的示例相对于天然人NRG4在人和大鼠HER4 HER2受体上表现出更高的磷酸化-ERK1/2活性，并接近天然人NRG1的活性。
Figure BDA0003289999020000293
Figure BDA0003289999020000301
表9。人和大鼠HER2/HER3测定法
如表9中所示，野生型人NRG1肽对人HER3 HER2受体表现出有效活性，而野生型人NRG4肽和所有示例均对该受体对没有活性，表明对HER4 HER2受体对具有不同的选择性。总之，NRG4化合物的示例表现出对HER3 HER2受体没有磷酸化-ERK1/2活性，因此表明维持了野生型NRG4肽对HER4和HER2受体的选择性。
体内研究
示例9对大鼠MI模型中的心脏功能和结构的影响
在射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)大鼠模型中进行了两项非临床效力药理学研究，以研究示例9的血浆浓度和暴露持续时间。这两项研究都测量了对患有手术诱导的心肌梗塞的雄性Sprague Dawley大鼠心脏功能和结构的影响。
两项研究都使用了类似的方法。购买患有手术诱导的心肌梗塞的雄性SpragueDawley大鼠，并在整个过程中进行麻醉和积极通风。在第四和第五根肋骨之间切开一个切口，露出心脏。左冠状动脉永久结扎。假手术动物进行相同的步骤，只是将丝线缝合在左冠状动脉周围而不结扎。所有大鼠都单独饲养在温度和湿度受控的房间中，并保持12小时的光照/黑暗循环。手术后两到三周，大鼠接受经胸壁超声心动图，使用Vevo 2100超声系统测定射血分数(EF％)和左心室尺寸(LVD)。根据EF％和LVD随机分配治疗组之间的大鼠。
EF％和LVD的测量值表示为平均值±标准误差(SE)。使用
Figure BDA0003289999020000311
13软件(SASInstitute,Inc.；Cary,NC)进行统计分析，并且使用Dunnett检验进行治疗组间的统计比较。在P<0.05时接受统计显著性。
用于测定示例9的非临床效力的血浆浓度的研究设计。以10μl/h的输注速率，通过
Figure BDA0003289999020000312
泵(型号2ML1；
Figure BDA0003289999020000313
渗透泵；Cupertino，CA)持续皮下施用(SC)示例9或载剂(1X Dulbecco氏磷酸缓冲盐水[DPBS])4天。示例9使用泵输注施用的剂量水平是0.22、0.73、2.18和7.28mg/kg/天。在第4天，收集血液样品以测定血浆浓度并移除输注泵。给药开始后7天，评估所有动物的心脏功能(EF％)和结构(LVD)。给药开始后14天，评估载剂治疗组和两个最高剂量组的EF％和LVD。
结果。当使用渗透泵施用96小时时，示例9的治疗显示剂量依赖性心脏功能(EF％)的改善(表10)。以2.18和7.28mg/kg/天施用的高剂量组在开始输注后2周表现出改善的心脏功能(表10)。这些剂量分别达到29.62和72.24nM的稳态血浆浓度(表11)。与载剂组相比，所有治疗的MI动物表现出较低的LVD扩张(表10)。
Figure BDA0003289999020000314
Figure BDA0003289999020000321
表10。96小时输注对HFrEF大鼠模型中EF的影响。缩写：N＝动物数量；ND＝未确定；SE＝标准误差。*p<0.05vs载剂。
剂量(mg/kg/天) 平均值(nM) 标准偏差
0.22 2.59 0.71
0.73 9.94 1.59
2.18 29.62 4.86
7.28 72.24 13.66
表11。输注96小时后在大鼠血浆中的暴露。
确定非临床效力的输注持续时间的研究设计。以10μl/h的输注速率，通过
Figure BDA0003289999020000322
泵皮下施用2.18mg/kg/天的示例9或载剂(DPBS)48、72或96小时。在指定的输注阶段结束时，收集血液样品以确定血浆浓度并移除输注泵。给药开始后7天，评估所有动物的心脏功能(EF％)和结构(LVD)。
结果。如表12中所示，在该研究中，当使用
Figure BDA0003289999020000324
泵施用48至96小时时，示例9的治疗显示输注持续时间依赖性心脏功能的改善。示例9输注72小时和96小时在给药开始后第7天导致EF显著改善。与载剂组相比，所有治疗的MI动物表现出较低的LVD扩张。
Figure BDA0003289999020000323
Figure BDA0003289999020000331
表12。示例9输注多个持续时间对心脏功能的影响。缩写：N＝动物数量；ND＝未确定；SE＝标准误差。*p<0.05vs载剂。
输液时间(小时) 平均值(nM) 标准偏差
48 40.13 6.37
72 47.28 17.85
96 31.42 9.86
表13。示例9输注后在心肌梗塞大鼠模型血浆中的暴露。
非临床数据显示，当示例9的血浆浓度维持在3至100nM达72至96小时的持续时间时，HFrEF大鼠模型中的LVEF改善。
示例10对大鼠MI模型中的心脏功能和结构的影响
在射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)大鼠模型中进行非临床效力药理学研究，以评估卡托普利治疗、示例10治疗或组合治疗后的心脏功能和结构变化。
方法。购买患有手术诱导的心肌梗塞的雄性Sprague Dawley大鼠，并在整个过程中进行麻醉和积极通风。在第四和第五根肋骨之间切开一个切口，露出心脏。左冠状动脉永久结扎。所有大鼠都单独饲养在温度和湿度受控的房间中，并保持12小时的光照/黑暗循环。手术后两到三周，大鼠接受经胸壁超声心动图，使用Vevo 2100超声系统测定射血分数(EF％)和左心室尺寸(LVD)。根据EF％和LVD随机分配治疗组之间的大鼠。
EF％和LVD的测量值表示为平均值±标准误差(SE)。使用
Figure BDA0003289999020000341
13软件(SASInstitute,Inc.；Cary,NC)进行统计分析，并且使用Dunnett检验进行治疗组间的统计比较。在P<0.05时接受统计显著性。
研究设计。MI手术后三周，根据EF％和LVD，将动物随机分为2个治疗组(安慰剂或卡托普利，饮用水中2g/L，自由摄入)。给药开始后3周和4周，通过经胸壁超声心动图评估心脏功能(EF％)和结构(LVD)。根据心脏功能(EF％)和结构(LVD)，将动物进一步随机分为另外的以下组：安慰剂、示例10、卡托普利和示例10+卡托普利。在示例10组动物在第2次随机分组后第4周接受单次注射。在第5周和第6周评估心脏功能(EF％)和结构(LVD)。
结果。结果在表14中提供。
Figure BDA0003289999020000342
Figure BDA0003289999020000351
表14。卡托普利、示例10的单次注射或组合疗法对射血分数降低的心力衰竭大鼠模型中EF的影响。缩写：AVG＝平均值。s.e.＝标准误差。*p<0.05vs载剂。
如表14中所示，虽然卡托普利治疗在6周的治疗过程中减缓了心脏功能下降(无统计学显著性)，但示例10治疗在单次治疗后显著改善了心脏功能(EF％)并减少了LV扩张。
示例11对大鼠MI模型中的心脏功能和结构的影响
在射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)大鼠模型中进行非临床效力药理学研究，以鉴定示例11的剂量-反应关系。
方法。患有手术诱发的心肌梗塞的雄性Sprague Dawley大鼠购自Charles River。简而言之，在整个过程中将大鼠麻醉并积极通风。在第四和第五根肋骨之间切开一个切口，露出心脏。左冠状动脉永久结扎。假手术动物进行相同的步骤，只是将丝线缝合在左冠状动脉周围而不结扎。所有大鼠都单独饲养在温度和湿度受控的房间中，并保持12小时的光照/黑暗循环。手术后三周，大鼠接受经胸壁超声心动图，使用Vevo2100超声系统测定射血分数(EF％)和左心室尺寸(LVD)。根据EF％和LVD随机分配治疗组之间的大鼠。
EF％和LVD的测量值表示为平均值±标准误差(SE)。使用
Figure BDA0003289999020000361
13软件(SASInstitute,Inc.；Cary,NC)进行统计分析，并且使用Dunnett检验进行治疗组间的统计比较。在P<0.05时接受统计显著性。
研究设计。MI手术后两到三周，将动物分配到各治疗组并通过单次注射载剂(DPBS)或3种剂量水平(0.3、1、3mg/kg)之一的示例11进行治疗。给药后7天、14天和21天，评估所有动物的心脏功能(EF％)和结构(LVD)。
结果。结果在表15中提供。
Figure BDA0003289999020000362
表15。示例11对射血分数降低的心力衰竭大鼠模型中EF的影响。缩写：N＝动物数量；s.e.＝标准误差。*p<0.05vs载剂。
如表15中所示，示例11治疗显示剂量依赖性改善心脏功能(EF％)。高剂量组在治疗后2周表现出改善的心脏功能。在研究过程中，未观察到各组之间LVD扩张的差异(数据未显示)。
示例9-11对心脏毒性的影响
在大鼠和/或食蟹猴中对示例9-11进行毒理学研究。将示例10以0.3mg/kg的单次SC注射施用于大鼠，这导致超过168小时的可检测血浆浓度。处死大鼠，组织检查显示心脏变性和坏死。将示例11以30mg/kg的单次SC注射施用于大鼠；96小时检测不到血浆浓度。处死大鼠，组织检查显示没有心脏变性和/或坏死的证据。将示例11通过SC弹丸式注射以单次3mg/kg剂量施用于雄性和雌性猴子。与其在大鼠中的药代动力学相反，在猴子中单次注射导致可检测的血浆浓度，需要超过168小时才能清除。处死猴子，组织检查显示心脏变性和坏死。将在大鼠中SC施用后显示半衰期小于1小时的示例9通过皮下(SC)植入泵以多个剂量施用，各剂量产生的血浆浓度范围为3-300nM，持续96-168小时。处死大鼠，组织检查显示没有心脏变性和/或坏死的证据。将在猴子中SC施用后的半衰期小于5小时的示例9通过手术放置SC或静脉内(IV)导管以多个剂量施用，各剂量产生的血浆浓度范围为30-1000nM，持续96小时。处死猴子，组织检查显示没有心脏毒性和/或坏死的证据。这些数据表明通过限制暴露于NRG4化合物的持续时间，可以施用NRG4化合物而不引起心脏毒性。
序列
SEQ ID NO:1–人NRG4
DHEEPCGPSH KSFCLNGGLC YVIPTIPSPF CRCVENYTGA RCEEVFL
SEQ ID NO:2–NRG4化合物
X0GHEEPCGX8SHKSFCLNGGLCYX22IPTX26PSPFCRCVX35NYTGARCEX44VFL
其中：
X0选自T、PT、MPT、S、GS、GGS、GGGS和(GGGGXλ)n，其中Xλ是Q、A、E或S，且n＝1-5(SEQID NO:5)，或不存在；
X8是E或P；
X22是Q或V；
X26是F或I；
X35是E或A；和
X44是H、K或E。
SEQ ID NO:3表达的人NRG4全序列
MPTDHEEPCG PSHKSFCLNG GLCYVIPTIP SPFCRCVENY TGARCEEVFL PGSSIQTKSNLFEAFVALAV LVTLIIGAFY FLCRKGHFQR ASSVQYDINL VETSSTSAHH SHEQH
SEQ ID NO:4–NRG4化合物
GHEEPCGPSH KSFCLNGGLC YQIPTIPSPF CRCVENYTGA RCEKVFL
SEQ ID NO:5–富含甘氨酸的肽或接头
(GGGGXλ)n
其中：
Xλ是Q、A、E或S；和
n为1-5。
SEQ ID NO:6–IgGFc区
ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:7–IgGFc区
ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:8–IgG Fc区
ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:9–IgG Fc区
ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:10–NRG4化合物
GGGGSGGGGSGGGGS GHEEPCGPSH KSFCLNGGLC YVIPTIPSPF CRCVENYTGA RCEEVFL
SEQ ID NO:11–NRG4化合物
GGGGSGGGGSGGGGS GHEEPCGESH KSFCLNGGLC YVIPTIPSPF CRCVENYTGA RCEEVFL
SEQ ID NO:12–NRG4化合物
GGGGSGGGGSGGGGS GHEEPCGPSH KSFCLNGGLC YQIPTIPSPF CRCVENYTGA RCEEVFL
SEQ ID NO:13–NRG4化合物
GGGGSGGGGSGGGGS GHEEPCGPSH KSFCLNGGLC YVIPTFPSPF CRCVENYTGA RCEEVFL
SEQ ID NO:14–NRG4化合物
GGGGSGGGGSGGGGSGHEEPCGPSH
KSFCLNGGLCYVIPTIPSPFCRCVANYTGA RCEEVFL
SEQ ID NO:15– NRG4化合物
GGGGSGGGGSGGGGSGHEEPCGPSHKSFCLNGGLCYVIPTFPSPFCRCVENYTGARCEKVFL
SEQ ID NO:16–NRG4化合物
GGGGSGGGGSGGGGSGHEEPCGPSHKSFCLNGGLCYVIPTFPSPFCRCVENYTGARCEHVFL
SEQ ID NO:17–NRG4化合物
GGGGSGGGGSGGGGSGHEEPCGESHKSFCLNGGLCYVIPTFPSPFCRCVENYTGARCEEVFL
SEQ ID NO:18–NRG4化合物
GGGGSGHEEPCGPSHKSFCLNGGLCYQIPTIPSPFCRCVENYTGARCEKVFL
SEQ ID NO:19–NRG4化合物
GGGGSGGGGSGGGGSGHEEPCGPSHKSFCLNGGLCYQIPTIPSPFCRCVENYTGARCEKVFL
SEQ ID NO:20
GGGS
Figure IDA0003289999060000011
Figure IDA0003289999060000021
Figure IDA0003289999060000031
Figure IDA0003289999060000041
Figure IDA0003289999060000051
Figure IDA0003289999060000061
Figure IDA0003289999060000071
Figure IDA0003289999060000081
Figure IDA0003289999060000091
Figure IDA0003289999060000101
Figure IDA0003289999060000111
Figure IDA0003289999060000121

Claims (39)

1.一种NRG4化合物，与人NRG4的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)相比，其包含第1位的D残基变为G残基的修饰，以及多达五个额外的修饰。
2.一种化合物，其包含下式：
X0GHEEPCGX8SHKSFCLNGGLCYX22IPTX26PSPFCRCVX35NYTGARCEX44VFL
其中：
X0选自T、PT、MPT、S、GS、GGS、GGGS和(GGGGXλ)n，其中Xλ是Q、A、E或S，且n＝1-5(SEQ IDNO:5)，或不存在；
X8是E或P；
X22是Q或V；
X26是F或I；
X35是E或A；和
X44是H、K或E
(SEQ ID NO：2)。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中X8是P；X22是V；X26是I；X35是E；X44是E。
4.根据权利要求2所述的化合物，其中X8是E；X22是V；X26是I；X35是E；X44是E。
5.根据权利要求2所述的化合物，其中X8是P；X22是Q；X26是I；X35是E；X44是E。
6.根据权利要求2所述的化合物，其中X8是P；X22是V；X26是F；X35是E；X44是E。
7.根据权利要求2所述的化合物，其中X8是P；X22是V；X26是I；X35是A；X44是H或E。
8.根据权利要求2所述的化合物，其中X8是P；X22是V；X26是F；X35是E；X44是K。
9.根据权利要求2所述的化合物，其中X8是P；X22是V；X26是F；X35是E；X44是H。
10.根据权利要求2所述的化合物，其中X8是E；X22是V；X26是F；X35是E；X44是E。
11.根据权利要求2所述的化合物，其中X8是P；X22是Q；X26是I；X35是E；X44是K。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的化合物，其还包含IgG Fc区。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中X0是SEQ ID NO:5，其中Xλ是S，n＝3，并且其中所述IgG Fc区包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的二聚体，其中所述X0的N末端氨基酸与SEQID NO：7的C-末端氨基酸融合。
14.根据权利要求12所述的化合物，其中X0是SEQ ID NO:5，其中Xλ是S，n＝3，并且其中所述IgG Fc区包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的二聚体，其中所述X0的N末端氨基酸与SEQID NO：9的C-末端氨基酸融合。
15.根据权利要求2-11中任一项所述的化合物，其中X0是SEQ ID NO：5，其中Xλ是S，n＝1。
16.根据权利要求2-11中任一项所述的化合物，其中所述化合物包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ IDNO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
17.一种由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成的化合物。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有大于天然人NRG4的与HER4结合相关的活性，并且所述化合物与HER4结合相关的活性是天然人NRG1的最大活性的至少70％。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中所述化合物不具有与HER3结合相关的活性。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1-19中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
21.一种泵装置，其包含权利要求1-19中任一项所述的化合物。
22.一种治疗或预防有需要的患者中HFrEF的方法，所述方法包括向所述患者施用一定量的NRG4化合物，所述量足以提供持续24-96小时的治疗有效血清浓度的所述NRG4化合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述效力:施用比率的范围为约2至约50。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中所述NRG4化合物通过Q3M连续皮下输注施用24-96小时。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述NRG4化合物通过贴片泵施用。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述治疗持续至少1年。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述方法导致LVEF的显著增加。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述方法导致GLS的显著降低。
29.根据权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述方法导致LVEDV的显著改善。
30.根据权利要求22-29中任一项所述的方法，其中所述方法导致CV死亡风险的显著降低。
31.根据权利要求22-30中任一项所述的方法，其中所述方法导致HF相关的住院风险的显著降低。
32.根据权利要求22-31中任一项所述的方法，其中所述患者患有NYHAII或III型心力衰竭。
33.根据权利要求22-32中任一项所述的方法，其中所述NRG4化合物是如权利要求1-19中任一项所述的NRG4化合物。
34.一种NRG4化合物，其用于治疗或预防HFrEF的用途。
35.根据权利要求34所述用途的NRG4化合物，其中所述NRG4化合物通过Q3M连续皮下输注施用24-96小时。
36.根据权利要求34-35中任一项所述用途的NRG4化合物，其中效力:施用比率范围为约2至约50。
37.根据权利要求34-36中任一项所述用途的NRG4化合物，其中所述NRG4化合物通过贴片泵施用。
38.根据权利要求34-37中任一项所述用途的NRG4化合物，其中所述患者患有NYHA II或III型心力衰竭。
39.根据权利要求1至19中任一项所述的NRG4化合物，其用于治疗或预防HFrEF的用途，其中所述NRG4化合物施用48-96小时。
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