KR20210134699A

KR20210134699A - 뉴레귤린-4 화합물 및 사용 방법

Info

Publication number: KR20210134699A
Application number: KR1020217031066A
Authority: KR
Inventors: 조나단 웨슬리 데이; 조셉 조지 호이어; 아비나쉬 뭅피디; 웨이 니; 제임스 데이비드 판쿡
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2021-11-10
Also published as: JOP20210264A1; IL286697A; US20200354421A1; WO2020205840A1; MX2021011983A; DOP2021000194A; EP3947428A1; US11242370B2; CA3132135A1; CL2021002455A1; TW202104251A; MA55532A; JP7036953B2; ECSP21072840A; US20220112255A1; AR121035A1; PE20212326A1; EA202192288A1; SG11202110484VA; JP2021522314A

Abstract

본 발명은 뉴레귤린 (NRG) 4 화합물, 및 NRG4 화합물을 이용한 치료 방법에 관한 것이다.

Description

뉴레귤린-4 화합물 및 사용 방법

본 발명은 뉴레귤린 (NRG) 4 화합물, 및 NRG4 화합물을 이용한 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 NRG4 화합물은 바람직하게는 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER) 4에 대한 강력한 결합 및 상기 결합과 연관된 강력한 활성을 갖는다. 바람직한 NRG4 화합물은 심장 기능을 개선하고/거나, HER4 결합 및 생성된 활성이 중요한 역할을 하는 질환, 예컨대, 심부전 (HF)과 같은, 박출률이 감소한 HF (HFrEF)를 비롯한, 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다.

HF에 대한 새롭고 개선된 치료법에 대한 의학적 요구는 충족되지 못한 상태이다. 현재 이용가능한 요법은 질병 진행 속도를 저속화시키고, 증상을 개선시키고, 혈역학적 변화에 의존하여 쇠약해진 심장의 작업부하를 감소시키기 위한 것이다. 이러한 요법은 (a) 심박수를 감소시키기 위한 것으로 의도되는 작용제, 예컨대, 베타 차단제 및 이바브라딘; (b) 혈압을 감소시키기 위한 것으로 의도되는 작용제, 예컨대, 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제, 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB), 무기질 코르티코이드 수용체 길항제 (MRA), 및 사쿠비트릴/발사르탄 (엔트레스토 (ENTRESTO)®); 및/또는 (c) 용적 과부하를 치료 또는 예방하는 것으로 의도되는 작용제, 예컨대, 이뇨제 및 MRA를 포함한다. 그러나, 이러한 치료는 심장을 직접 치료하지 않고, 예컨대, 용량 적정 및 저혈압 모니터링을 수행하여야 하는 것과 같이 실질적인 한계가 있다. 추가로, 이러한 기존 치료 옵션을 사용할 수 있음에도 불구하고, 모든 HF 환자, 심지어 경미한 증상이 있는 환자도 사망할 위험이 높다. 예컨대, 문헌 [Ahmed A, A propensity matched study of New York Heart Association class and natural history end points in heart failure, AM. J. CARDIOL. 2007;99(4):549-553]을 참조한다. 따라서, 새롭고 개선된 HF 치료가 요구되고 있다.

새로운 치료 옵션을 확인하기 위한 연구 및 개발 노력이 착수되었다. 예를 들어, WO2014/187342는 NRG1, NRG2, NRG3 및 NRG4를 포함하는 것으로 언급된 NRG의 방출 연장을 통해 HF를 예방, 치료 또는 지연시키는 것을 기술하는 것을 목적으로 한다. 이 공개문헌은 또한 만성 심부전 환자에서 NRG-1의 연장된 투여에 대해 수행된 것으로 알려진 임상 연구를 기술한다.

그럼에도 불구하고, 기존 요법과 비교하여 효능이 개선되고, 독성 위험이 감소된 치료 옵션이 여전히 요구되고 있다. 생존율 증가 및 입원율 감소를 비롯한, 장기적인 결과를 개선시키는 요법이 요구되고 있다. 또한, 혈역학적 성질의 변경 이외의 기전을 통해 질환을 변형시키거나, 또는 역전시킬 수 있는 잠재력이 있는 심장 기능을 개선시키는 요법도 요구되고 있다. 특히, 예컨대, 저혈압, 저칼륨혈증 및 신장 기능장애와 같은 동반이환을 보이는 환자의 치료와 관련된 것을 포함하여 내약성이 더욱 우수한 요법도 요구되고 있다. 또한, 질환이 진행된 환자의 삶의 질 (QOL)을 개선시키는 요법도 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 중요한 미충족 요구 중 하나 이상을 충족시키고자 한다.

따라서, 본 발명은 HER4에 대한 선택적 결합과 연관된 활성을 갖는 NRG4 화합물을 제공한다. 본 발명의 NRG4 화합물은 HER3에 거의 결합하지 않거나, 전혀 결합하지 않음에 따라, 그 결과, HER3과 연관된 독성 위험 및/또는 내약성 문제는 감소된다.

본 발명은 또한 NRG4 화합물을 이용하여 CVD 및 관련 병태, 특히, HF를 비롯한 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 NRG4 화합물 및 방법은 CV-관련 사망 또는 HF-관련 입원의 위험을 감소시키고/거나, 심근경색 (MI) 또는 뇌졸중의 위험을 감소시키고/거나, 좌심실 보조 장치 (LVAD) 또는 심장 이식을 필요로 할 확률을 감소시키고/거나, 심장 기능 및 구조를 개선시키고/거나, HF와 연관된 증상 및 신체적 제한을 개선시켜 QoL을 개선시킨다. 바람직한 NRG4 화합물 및 방법은 적정 또는 모니터링을 수행해야 할 필요 없이, 표준 치료 (SoC)와 조합하여 사용될 수 있고, 저혈압을 증가시키지 않고/거나, 신장 기능을 악화시키지 않고/거나, 전해질 불균형을 초래하지 않고/거나, 간 기능장애에 기여하지 않고/거나, 종양 발병률을 증가시키지 않고/거나, 지속적인 정액저하증을 유발하지 않는다.

본 발명은 또한 인간 NRG4의 아미노산 서열 (서열식별번호(SEQ ID NO:) 1)과 비교하여 1번 위치의 D 잔기의 G 잔기로의 변형 및 최대 5개의 추가 변형을 포함하는 NRG4 화합물을 제공한다.

본 발명은 또한 하기 식을 포함하는 NRG4 화합물을 제공한다:

;

상기 식에서:X₀은 T, PT, MPT, S, GS, GGS, GGGS, 및 (GGGGX_λ)_n으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 X_λ는 Q, A, E 또는 S이고, n=1-5이거나 (서열식별번호 5), 또는 존재하지 않고;X₈은 E 또는 P이고; X₂₂는 Q 또는 V이고; X₂₆은 F 또는 I이고; X₃₅는 E 또는 A이고; X₄₄는 H, K 또는 E이다(서열식별번호 2).

또 다른 측면에서, 본 발명은 HFrEF 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 NRG4 화합물을 24-96시간 동안 투여하는 단계를 포함하는, HFrEF 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 HFrEF를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 요법에서 사용하기 위한, 본 발명의 NRG4 화합물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 HFrEF 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 NRG4 화합물이며, 24-96시간 동안 투여되는 NRG4 화합물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 HFrEF 치료용 또는 예방용 의약 제조에서 사용하기 위한 NRG4 화합물이며, 여기서 24-96시간 동안 투여되는 NRG4 화합물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 NRG4 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 NRG4 화합물을 포함하는 펌프 장치를 제공한다. 특정 실시양태에서, 펌프는 패치 펌프이다.

NRG4는 NRG 단백질 패밀리의 4개 구성원 중 하나이며, 그 자체가 표피 성장 인자 (EGF) 단백질로 알려진 더 큰 단백질 패밀리의 일부이다. 단백질의 EGF 패밀리는 EGF 자체 뿐만 아니라, EGF와 유사한 특정 구조적 특징을 공유하는, EGF 유사 단백질로 알려진 다른 단백질을 포함한다. EGF 유사 단백질은 NRG1, NRG2, NRG3 및 NRG4 뿐만 아니라, 헤파린 결합 EGF 유사 성장 인자 (HB-EGF), 형질전환 성장 인자-α, 암피레귤린 (AR), 에피레귤린 (EPR), 에피겐, 베타셀룰린 (BTC) 및 상기 단백질의 다양한 이소형을 포함한다. 이러한 리간드는 세포외 막 단백질인 반면, 다양한 세포 자극은 세포 메탈로프로테아제 활성화를 초래하여 단백질의 EGF 도메인의 단백질 분해 방출을 초래하고, 이는 이어서, 수용체에 자유롭게 결합하고, 신호전달을 개시한다. 단백질의 EGF 패밀리의 다양한 구성원은 정상적인 발생 뿐만 아니라, 암을 비롯한 많은 질환의 병리 모두와 관련된 효과를 비롯한, 광범위한 다양한 발생-관련 효과를 가지고 있다. 효과는 EGFR (ErbB-1), HER2 (ErbB-2), HER3 (ErbB-3), HER4 (ErbB-4)인 ErbB 수용체 패밀리로 지칭되는 4가지 수용체 티로신 키나제의 서브패밀리, 및 상기 수용체의 이소형과의 상호작용을 통해 매개된다. NRG 패밀리의 구성원 자체는 EGFR, HER3 및 HER4와 그의 특정 상호작용을 통해 매개되는 다른 효과를 가지고 있다. HER2는 NRG 패밀리의 구성원에 결합하지 않지만, HER2는 일단 리간드화되고 나면, EGFR, HER3 및 HER4와 이종이량체를 형성함으로써 하류 신호전달을 촉진한다. 따라서, 본원에서 HER3 (또는 HER3/2 또는 HER2/3) 또는 HER4 (또는 HER4/2 또는 HER2/4) 활성에 대한 언급은 리간드, 예컨대, NRG 패밀리의 구성원의 HER3 또는 HER4에의 결합, 이어서, 후속되는 HER2와 상기 결합된 수용체의 이종이량체화 후 하류 신호전달의 결과로 발생하는 활성으로 이해되어야 한다.

상기 언급한 바와 같이, NRG 패밀리의 다른 구성원은 다른 수용체 친화도 및 활성 프로파일에 의해 매개되는 다른 효과를 갖다. 예를 들어, NRG1 화합물은 HER3 및 HER4의 세포외 도메인과 상호작용하고, 여러 기관의 정상적인 발생 및 암의 발병기전에서 역할을 한다. HER4 결합 및 그로부터 발생하는 활성은 심장 기능 및 구조 개선과 연관이 있는 반면, HER3 결합 및 그로부터 발생하는 활성은 암, 메스꺼움, 설사 및 간독성과 연관이 있다. 예컨대, 문헌 [O'Shea S, Johnson K, Clark R, Sliwkowski MX, Erickson SL. Effects of in vivo heregulin beta1 treatment in wild type and ErbB gene-targeted mice depend on receptor levels and pregnancy. AM J PATHOL. 2001;158(5):1871-80]; [Mendes-Ferreira P, De Keulenaer GW, Leite-Moreira AF, Bras-Silva C. Therapeutic potential of neuregulin-1 in cardiovascular disease. DRUG DISCOV TODAY. 2013;18(17-18):836-42. Review]를 참조한다. 한편 NRG4는 HER4에 결합하여 그를 활성화시키지만, HER3에는 거의 결합하지 않거나, 또는 전혀 결합하지 않거나, 또는 그에 대해 활성을 갖지 않는다.

NRG4는 하기 서열식별번호 3에 기재된 서열을 갖는 115개의 아미노산 전구체 단백질로서 발현된다:

(서열식별번호 3). 발현된 단백질은 세포 자극시 단백질가수분해에 의해 방출되는 EGF 부분을 포함하는 것으로서, 막횡단 부분, 세포질 부분 및 세포외 부분을 갖는 막횡단 단백질이다. 본 발명의 NRG4 화합물은 하기 서열식별번호 1에 기재된 바와 같이, 발현된 단백질의 세포외 부분에 있는 아미노산 번호 4-50으로부터의 상기 기재된 발현된 단백질 (서열식별번호 3)의 부분을 포함한다:

(서열식별번호 1). 의심의 여지를 피하기 위해, 본 발명의 NRG4 화합물과 관련하여 임의의 아미노산 변형에 대한 본원의 넘버링은 상기 서열식별번호 1에 기재된 서열을 기초로 한다.

본원에서 사용될 때, "NRG4 화합물"이라는 용어는 서열식별번호 1의 아미노산 서열의 모두 또는 그의 일부를 포함하는 단백질 또는 펩티드, 또는 그의 변이체 또는 접합체를 의미한다. 본원에서 사용될 때, "변이체"라는 용어는 인간 단백질의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 변형을 갖는 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 변형은 천연 인간 서열 중의 하나 이상의 아미노산의 또 다른 천연 또는 비천연 아미노산으로의 치환 및/또는 천연 인간 서열 중 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 부가를 포함한다. 본원에서 사용될 때, "접합체"라는 용어는 서열식별번호 1의 모두 또는 그의 일부, 또는 그의 변이체를 포함하고, 공유 결합에 의해 단백질, 펩티드 또는 다른 화학적 모이어티에 부착된 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 상기 부착은 예를 들어, IgG Fc 영역, 인간 알부민, 글리신이 풍부한 펩티드 또는 지방산 모이어티를 포함한다. 추가로, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, NRG4 화합물이 실시양태에서 기술되거나, 또는 본원 청구범위에서 언급될 때, 화합물은 유리 또는 염 형태일 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명은 서열식별번호 1의 식을 포함하고, 여기서 그에 대한 하나 이상의 변형을 갖고, 천연 인간 NRG4보다 더 강력한 HER4 친화도 및 HER4 결합 관련 활성을 갖고, 적어도 천연 인간 NRG4만큼 HER3 수용체보다는 HER4 수용체에의 결합에 선택적인 NRG4 화합물을 제공한다. HER4 및 HER3 수용체에 대한 친화도 및 효력은 하기 실시예에 기재된 것을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물은 천연 인간 NRG1 EGF 도메인의 최대 효력의 적어도 50%인 HER4 결합으로부터 발생한 효력을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물은 천연 인간 NRG1 EGF 도메인의 최대 효능의 최대 90%인 HER4 결합으로부터 발생한 효능을 갖는다.

특정 NRG4 화합물을 설명하는 데 본원에서 사용될 때, 용어 "HER3 결합 관련 활성이 없다"는 것은 이들 화합물이 예컨대, 하기 실시예에 기술된 것과 같은 시험관내 검정을 사용하여 시험할 때 천연 NRG4의 것보다 HER3 결합과 연관된 활성이 더 크지 않음을 의미한다.

본 발명의 NRG4 화합물은 적어도 1번 위치의 D의 G 잔기로의 치환 (즉, D1G)을 비롯한, 상기 서열식별번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형을 포함한다. D1G 치환은 야생형 NRG4 아미노산 서열에 대한 추가 변형을 함유하는 NRG4 화합물과 관련된 것을 포함하여, HER3에 대한 선택성에는 부정적인 영향을 미치지 않으면서 HER4에 대한 결합을 유의하게 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 특정 바람직한 실시양태에서 D1G와 조합하여 - 예컨대, HER3 대비 HER4 결합 및/또는 선택성의 측면에서 - 유익한 효과를 갖는 것으로 밝혀진 다른 아미노산 변형은 위치 8, 22, 26, 35 및 44 중 하나 이상에서의 변형을 포함하며, 특히, 하기: P8E, V22Q, I26F, E35A, E44H 및 E44K 중 하나 이상의 것을 포함한다. 본 발명의 NRG4 화합물의 특히 바람직한 실시양태는 하기 목록으로부터 선택된 3개의 아미노산 치환의 조합을 갖는 삼중 변이체이다: D1G/I26F/E44K; D1G/I26F/P8E; D1G/I26F/E44H; 및 D1G/V22Q/E44K. 본 발명의 NRG4 화합물의 가장 바람직한 실시양태는 서열식별번호 4에 기재된 바와 같은, 하기 3개의 아미노산 치환: D1G/V22Q/E44K을 포함한다:

(서열식별번호 4).

특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물은 또한 서열식별번호 3에 기재된 전장 발현된 단백질에서 발견되는 상기 서열식별번호: 1에 기재된 서열의 C- 또는 N-말단 단부에 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있되, 단, 상기 아미노산의 포함은 HER3 대비 HER4에 대해 그의 더욱 강력한 천연 결합 및 그에의 활성 또는 선택성을 제거하지 않는다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물은 또한 서열식별번호 3에 기재된 전장 단백질에서 발견되지 않는 하나 이상의 추가 아미노산 또는 다른 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 NRG4 화합물은 공유 결합에 의해 단백질, 글리신이 풍부한 펩티드 및/또는 다른 화학적 모이어티에 접합된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물은 서열 (GGGGX_λ)_n을 포함하는 글리신 풍부 펩티드를 포함하며, 여기서 X_λ는 Q, A, E 또는 S이고, 여기서 n = 1-5이다 (서열식별번호 5). 특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물은 서열식별번호: 5에 기재된 서열을 포함하며, 여기서 X_λ는 S이고, N-말단 단부에서 n = 1이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물은 식:

을 포함하고;

특정 실시양태에서, X₈은 P이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 I이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 E이다. 다른 실시양태에서,X₈은 E이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 I이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 E이다. 다른 실시양태에서, X₈은 P이고; X₂₂는 Q이고; X₂₆은 I이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 E이다. 다른 실시양태에서, X₈은 P이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 F이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 E이다. 다른 실시양태에서, X₈은 P이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 I이고; X₃₅는 A이고; X₄₄는 H 또는 E이다. 다른 실시양태에서, X₈은 P이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 F이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 K이다. 다른 실시양태에서, X₈은 P이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 F이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 H이다. 다른 실시양태에서, X₈은 E이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 F이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 E이다. 바람직한 실시양태에서, X₈은 P이고; X₂₂는 Q이고; X₂₆은 I이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 K이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물은 IgG Fc 영역을 포함한다. 본원에 사용되는 바, "IgG Fc 영역"이라는 용어는 인간 IgG 항체 단편의 불변 영역을 지칭한다. 특히, Fc 영역은 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역 도메인을 포함하고, 또한 힌지 영역의 일부 또는 그 모두를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 NRG4 화합물에 포함된 IgG Fc 영역은 IgG 항체의 하나의 중쇄, 또는 비공유 상호작용 및 이황화 결합을 통해 서로 회합된 2개의 중쇄로부터의 불변 영역의 단편을 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 때, IgG Fc 영역이라는 용어는 또한 예를 들어, NRG4 화합물의 특성 또는 특징, 예컨대, 그의 효력 및/또는 약동학적 특징을 변경시키기 위해 변형, 신장 및/또는 말단절단된 상기 항체 단편의 버전을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 IgG Fc 영역은 또한 이황화 매개된 Fc 이량체화를 단순화하기 위해 제거된 힌지 영역의 일부 또는 전부를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 IgG Fc 영역은 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있는 상이한 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 이량체를 포함한다. 예컨대, [Lewis SM, et al. NAT. BIOTECHNOL. 32(2):191-8 (2014)]; [Carter, J. IMMUNOL. METHODS, 248(1-2):7-15 (2001)]; [Ridgway, J. B. et al. PROTEIN ENG. 9(7):617-2 (1996)]을 참조한다.

한 바람직한 IgG Fc 영역은 하기 2개의 아미노산 쇄의 이량체이다:

(서열식별번호 6); 및

(서열식별번호 7).

또 다른 바람직한 IgG Fc 영역은 하기 2개의 아미노산 쇄의 이량체이다:

(서열식별번호 8); 및

(서열식별번호 9).

본 발명의 NRG4 화합물이 IgG Fc 영역을 포함하는 특정 실시양태에서, IgG Fc 영역은 링커를 통해 부착된다. 특정 실시양태에서, 링커는 X_λ가 Q, A, E 또는 S이고, n = 1-5인 상기 서열식별번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 펩티드 링커이다. 특정 실시양태에서, 링커는 X_λ가 S이고, n은 3인 서열식별번호: 5의 서열을 포함한다. 본 발명의 NRG4 화합물이 펩티드 링커에 의해 부착된 IgG Fc 영역을 포함하는 특정 실시양태에서, 펩티드 링커의 N-말단 잔기는 IgG Fc 영역의 한 쇄의 C-말단 잔기에 직접 융합되고, NRG4 효능제의 N-말단 잔기는 펩티드 링커의 C-말단 잔기에 직접 융합된다.

본 발명의 특정 NRG4 화합물에 IgG Fc 영역을 포함하는 것은 생산 및/또는 투여와 관련하여 이점을 가질 수 있다. 생산과 관련하여, 상기 화합물은 예컨대, 하기 실시예에 기술된 것과 같은, 관련 기술분야에 공지된 생물학적 발현 기술을 사용하여 신속하게 생산될 수 있다. 상기 기술을 사용한 신속한 생산은 특히 결합 및/또는 활성에 대한 스크리닝을 위한 NRG4 변이체의 생산을 포함하는 연구 및 개발의 모든 단계에서 효율성을 제공한다. 투여와 관련하여, IgG Fc 영역을 포함하는 NRG4 화합물은 약 14일만큼 긴 혈청 노출을 포함하여 연장된 약동학적 프로파일을 가질 수 있다.

그러나, 상기 장점에도 불구하고, 약 8일 초과의 혈청 노출을 포함하여 NRG4에 장기간 노출되면 하기 실시예에서 언급되는 바와 같이 심장 독성 위험이 발생할 수 있다는 것도 발견되었다. 또한, 독성 위험은 약 8일의 혈청 노출을 포함하여 다소 더 짧은 약동학적 반감기를 갖는 화합물을 제조함으로써 (예컨대, 변형된 Fc 영역의 사용을 통해) 모든 종에서 제거되지는 않지만, 약화될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

또한 상기 기술된 8-14일의 노출 기간과 비교하여 NRG4 화합물에 대한 단기 노출을 제공하는 것이 상기 단락에서 기술된 NRG4 화합물의 심장 독성 위험 없이 충분하고, 지속적인 효능을 제공할 수 있다는 것이 발견되었다. 상기 노출 기간의 예는 약 1 내지 약 7일, 바람직하게는 2, 3 또는 4일이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 NRG4 화합물이 약 24 내지 약 168시간 동안 치료상 효과적인 혈청 농도를 제공하기에 충분한 양으로 투여되는 것인, HFrEF를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, NRG4 화합물은 약 24 내지 약 96시간 동안 치료상 효과적인 혈청 농도를 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, NRG4 화합물은 약 24시간 동안 치료상 효과적인 혈청 농도를 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, NRG4 화합물은 약 48시간 동안 치료상 효과적인 혈청 농도를 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, NRG4 화합물은 약 72시간 동안 치료상 효과적인 혈청 농도를 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, NRG4 화합물은 약 96시간 동안 치료상 효과적인 혈청 농도를 제공하기에 충분한 양으로 투여된다.

상기 단락에서 기술된 노출 기간은 상기 단락에 기술된 기간 동안 혈청 노출을 허용하는 약동학적 프로파일을 갖는 NRG4 화합물의 단일 볼루스 주사를 제공하거나, 또는 상기 단락에 기술된 기간 동안 빠르게 제거되는 NRG4 화합물의 연속 투여 (예컨대, 펌프 사용을 통해)를 통해 달성될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "지속적인 효능"이라는 용어는 NRG4 화합물이 투여되는 기간을 넘어 연장되는 심부전-관련 개선을 지칭한다. 예를 들어, NRG4 화합물이 72시간 동안 치료상 효과적인 혈청 농도를 제공하기에 충분한 양으로 투여되는 특정 실시양태에서, 특정 실시양태에서는 상기 치료 요법의 효능은 약 6일 (~2X 투여 기간) 내지 약 4개월 (~30X 투여 기간) 범위의 기간 동안 지속될 수 있다. 투여 기간 (즉, 치료상 효과적인 혈청 농도가 제공되는 시간의 양) 대비 효능 기간 (즉, 임상적 이점이 나타나는 시간의 양)은 본원의 특정 실시양태에서 "효능:투여 비"로서 확인된다. 특정 실시양태에서, 효능:투여 비 범위는 약 2 내지 약 50이다. 특정 실시양태에서, 효능:투여 비 범위는 약 20 내지 약 45이다. 특정 실시양태에서, 효능:투여 비는 약 22, 약 30, 또는 약 45이다.

상기 지속적인 효능을 통해 NRG4 화합물은 원하는 기간 동안 치료적으로 효과적인 혈청 농도를 제공하기에 충분한 양으로 상대적으로 저빈도로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, NRG4 화합물은 매 6개월마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, NRG4 화합물은 주 1회 이하로 빈번하게 투여된다. 다른 실시양태에서, NRG4 화합물은 격월로 투여된다. 다른 실시양태에서, NRG4 화합물은 월 1회 투여된다. 특정 바람직한 실시양태에서, NRG4 화합물은 분기마다 1회 투여된다. 다른 바람직한 실시양태에서, NRG4 화합물은 6개월마다 1회 투여된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "치료하는(treating)" 또는 "치료하는(to treat)"은 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 억제, 저속화, 정지 또는 역전시키는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 심부전 또는 HFrEF의 치료는 예를 들어, 좌심실 박출률 (LVEF) 증가, 수축기말 좌심실 내강 용적 (LVESV) 증가, 좌심실 확장기말압 (LVEDP) 감소, CV 사망 및/또는 심부전 입원 위험 감소, 전체 사망 위험 감소, 심근경색 (MI)의 위험 감소, 뇌졸중 위험 감소, 좌심실 보조 장치 (LVAD) 이식 및/또는 심장 이식의 필요성 위험 감소, 심부전의 증상 및 신체적 제한 개선 및/또는 삶의 질 (QoL) 개선을 비롯한, 심부전과 관련된 다양한 척도 중 하나 이상에 반영될 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따른 치료의 특정 이점은 적어도 1개월 동안의 치료 후에 달성될 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따른 치료의 특정 이점은 적어도 6개월 동안의 치료 후에 달성될 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따른 치료의 특정 이점은 적어도 1년 동안의 치료 후에 달성될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 NRG4 화합물의 투여는 LVEF를 유의하게 개선시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 NRG4 화합물의 투여는 LVEF를 적어도 5% 개선시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 NRG4 화합물의 투여는 6개월 동안의 치료 후에 LVEF를 적어도 5% 개선시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 NRG4 화합물의 투여는 적어도 1년 동안의 치료 후에 LVEF를 적어도 5% 개선시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 NRG4 화합물의 투여는 적어도 1년 동안의 치료 후에 LVESV를 적어도 5% 개선시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 NRG4 화합물의 투여는 1년 동안의 치료 후에 LVEDP를 유의하게 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 NRG4 화합물의 투여는 전체 종축 변형 (GLS)을 유의하게 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 NRG4 화합물의 투여는 GLS를 적어도 3.5% 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물의 투여는 CV 사망 및/또는 HF 입원 위험을 적어도 15% 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물의 투여는 전체 사망, MI, 뇌졸중, LVAD 이식 또는 심장 이식 중 하나 이상의 것의 위험을 유의하게 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물의 투여는 심부전의 증상 및 신체적 제한 개선 및/또는 QoL을 유의하게 개선시킨다.

추가로, 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 특정 실시양태에 따른 NRG4 화합물의 투여는 안전성 위험을 증가시키지 않으면서, 심부전-관련 척도, 예컨대, 상기 기술된 것을 개선시킬 수 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 NRG4 화합물의 투여는 예컨대, 저혈압 증가; 신장 기능 악화; 전해질 불균형; 간 기능장애; 종양 또는 지속적인 정액저하증 발병과 같은 안전성 위험을 증가시키지 않는다.

본원에서 사용될 때, "치료 유효량"이라는 용어는 환자에게 원하는 효과를 제공하는 NRG4 화합물의 양 또는 용량을 지칭한다. 확장된 약동학적 프로파일을 갖는 NRG4 화합물의 경우, 상기 용량은 단일 또는 다중 용량 투여시 제공되는 양일 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 예컨대, 24-96시간의 주입과 같이 일정 기간에 걸쳐 투여되는 보다 신속한 작용을 하는 화합물의 경우, 용량 또는 양은 해당 기간 동안 투여된 NRG4 화합물의 총 질량으로, 예컨대, 총 mg로, 또는 그 시간 동안 NRG4 화합물이 투여되는 속도로, 예컨대, mg/min, 또는 투여 기간 동안 NRG4 화합물의 혈장 농도로 표시될 수 있다. 유효량을 결정하는 것은 공지된 기술을 사용하고, 유사한 상황에서 얻은 결과를 관찰함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 분기당 1회 투여를 위한 투여량은 투여 기간 동안 약 3 내지 약 100 nM의 혈장 농도를 제공하기에 충분한 투여량 범위에 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 NRG4 화합물의 투여는 전형적으로 비경구적으로, 예컨대, 정맥내 (IV), 피하 (SC) 또는 복강내 (IP)이다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서, NRG4 화합물은 정맥내로 투여된다. 본 발명의 다른 실시양태에서에서, NRG4 화합물은 복강내로 투여된다. 다른 실시양태에서, NRG4 화합물은 피하로 투여된다.

심장 독성에 대한 충분한 마진과 함께, 최적화되고 지속적인 효능을 위한 노출 기간을 제어하기 위해, NRG4 화합물의 비경구 투여는 바람직하게는 연속적 또는 간헐적 주입에 의한 것이다. 예를 들어, 많은 유형의 주입 펌프가 광범위한 약물을 주입하는 데 사용되며, 이러한 펌프는 본 발명에 따른 NRG4 화합물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 보다 최근에는, 종래 장치보다 작고, 환자의 피부에 직접 부착되어 환자의 일상 활동을 최소로 방해하는 패치 펌프가 개발되었다. 따라서, 특정 실시양태에서, NRG4 화합물은 주입 펌프 또는 패치 펌프에 의해 투여된다. 바람직하게는, NRG4 화합물은 패치 펌프에 의해 투여된다.

본 발명은 또한 본 발명의 NRG4 화합물의 생산에 유용한 신규한 중간체 및 프로세스를 포함한다. 본 발명의 중간체 및 NRG4 화합물은 예컨대, 하기 실시예에 기술된 것과 같은 화학적 합성 또는 생물학적 발현을 사용하는 프로세스를 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.

화학적 합성과 관련하여, 기술된 각 경로에 대한 특정 합성 단계는 본 발명의 NRG4 화합물을 제조하기 위해 상이한 방식으로 조합될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 쉽게 입수할 수 있다.

생물학적 발현과 관련하여, 화합물은 서열이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 후에 숙주 세포에서 발현될 것이다. 화합물은 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 배양되는, 포유동물 세포, 예컨대, CHO, NSO, HEK293, BHK, 또는 COS 세포에서; 박테리아 세포, 예컨대, E. 콜라이(E. coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 또는 슈도모나스 플루오르센스(Pseudomonas fluorescens)에서; 곤충 세포에서, 또는 진균 또는 효모 세포에서 쉽게 생성될 수 있다. 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 이러한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

상기 언급된 바와 같이, 모든 HF 환자, 심지어 경미한 증상을 보이는 환자도 사망할 위험이 높다. 따라서, 본원에서 사용될 때, 심부전 (HF) 치료를 "필요로 하는 환자"에 대한 언급은 하기 기술되는 바와 같이 광범위한 질환 중증도를 갖는 개체를 비롯한, HF를 앓는 광범위한 개체를 지칭할 수 있다. 뉴욕 심장 협회(New York Heart Association: NYHA)는 하기 표 1에 요약된 바와 같은 HF의 정도 또는 중증도에 대한 분류 체계를 제공하였다:

표 1.

특정 실시양태에서, 필요로 하는 환자는 심부전 NYHA 클래스 II-IV를 앓는 환자이다. 특정 실시양태에서, 필요로 하는 환자는 심부전 NYHA 클래스 II를 앓는 환자이다. 특정 실시양태에서, 필요로 하는 환자는 심부전 NYHA 클래스 III을 앓는 환자이다. 특정 실시양태에서, 필요로 하는 환자는 심부전 NYHA 클래스 IV를 앓는 환자이다. 특정 실시양태에서, 필요로 하는 환자는 심부전 NYHA 클래스 II-III을 앓는 환자이다.

상기 언급한 바와 같이, 현행 표준 치료를 포함하여 심부전에 대한 기존 치료적인 치료 옵션은 혈역학적 기전 (예컨대, 혈압, 심박수 및/또는 혈장 부피 감소)을 통해 증상을 개선시키고, 질환 진행을 저속화시켜 부전 환자의 작업부하를 감소시킨다. 그에 반해, 본 발명의 NRG4 화합물은 심근세포 생존 및 세포 대사를 직접적으로 개선하고 심근 재생을 촉진하는 상이한 작용 기전, 즉, 선택적 HER4 결합 및 그로부터 야기되는 활성을 통해 그 효과를 달성한다. 이러한 상이한 작용 기전에 기인하여, 적정 또는 모니터링 없이 기존 SoC 외에도 본 발명의 NRG4 화합물이 투여될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물은 심부전에 대한 하나 이상의 추가 치료와 함께 조합하여 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 심부전에 대한 하나 이상의 추가 치료는 베타 차단제, ACE 억제제, ARB, MRA, 이뇨제, 이바브라딘 및 사쿠비트릴/발사르탄 (엔트레스토®)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 NRG4 화합물은 SGLT2 억제제 또는 sGC 활성제와 함께 조합하여 투여될 수 있다.

본 발명의 NRG4 화합물은 또한 박출률 보존 심부전 (HFpEF), 다른 심장 관련 장애 또는 병태, 파킨슨병, 알츠하이머병, 과민성 대장 증후군, 골격 장애, 신장 질환, 당뇨병, 대사 질환, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 및 비알콜성 지방간염 (NASH)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 질환 또는 병태 치료에서 유용성을 가질 수 있다.

추가 실시양태는 하기 기술된다:

인간 NRG4의 아미노산 서열 (서열식별번호 1)과 비교하여 1번 위치의 D 잔기의 G 잔기로의 변형 및 최대 5개의 추가 변형을 포함하는 NRG4 화합물.

4개 이하의 추가 변형을 갖는 상기 실시양태의 NRG4 화합물. 한 실시양태에서, NRG4 화합물은 3개 이하의 추가 변형을 갖는다. 한 실시양태에서, NRG4 화합물은 2개 이하의 추가 변형을 갖는다.

상기 기술된 실시양태 중 임의의 것에서, 화합물이 8, 22, 26, 35 및 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 위치에 적어도 하나의 변형을 포함하는 것인 NRG4 화합물.

하기 식을 포함하는 화합물:

;

X₈은 P이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 I이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 E인 것인, 상기 실시양태의 화합물.

X₈은 E이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 I이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 E인 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

X₈은 P이고; X₂₂는 Q이고; X₂₆은 I이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 E인 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

X₈은 P이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 F이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 E인 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

X₈은 P이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 I이고; X₃₅는 A이고; X₄₄는 H 또는 E인 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

X₈은 P이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 F이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 K인 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

X₈은 P이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 F이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 H인 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

X₈은 E이고; X₂₂는 V이고; X₂₆은 F이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 E인 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

X₈은 P이고; X₂₂는 Q이고; X₂₆은 I이고; X₃₅는 E이고; X₄₄는 K인 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

X₀이 서열식별번호 5이고, 여기서 X_λ는 S이고, n=1인 것인, 상기 실시양태의 화합물.

서열식별번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.

서열식별번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 화합물.

화합물이 공유 결합에 의해 단백질, 펩티드 또는 다른 화학적 모이어티에 부착된 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물. 화합물이 IgG Fc 영역, 인간 알부민, 글리신이 풍부한 펩티드 또는 지방산 모이어티 중 하나 이상의 것에 부착된 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물. 화합물이 IgG Fc 영역에 부착된 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물. IgG Fc 영역이 서열식별번호 6과 서열식별번호 7, 또는 서열식별번호 8과 서열식별번호 9의 이량체를 포함하는 것인, 상기 실시양태의 화합물. X₀이 서열식별번호 5이고, 여기서 X_λ는 S이고, n=3인 것인, 상기 실시양태의 화합물.

화합물이 천연 인간 NRG4의 것보다 더 큰 HER4 결합 관련 활성을 갖는 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

화합물이 천연 인간 NRG1의 최대 활성의 것의 적어도 50%인 HER4 결합 관련 활성을 갖는 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

화합물이 천연 인간 NRG1의 최대 활성의 것의 적어도 70%인 HER4 결합 관련 활성을 갖는 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

화합물이 천연 인간 NRG1의 최대 활성의 것의 적어도 90%인 HER4 결합 관련 활성을 갖는 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

화합물이 HER3 결합 관련 활성이 없는 것인, 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물.

상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물을 포함하는 제약 조성물.

상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물을 포함하는 펌프 장치.

HF 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 NRG4 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, HF 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 HF를 치료 또는 예방하는 방법. 한 실시양태에서, NRG4 화합물은 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물이다.

HFrEF를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 NRG4 화합물. 한 실시양태에서, NRG4 화합물은 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물이다.

HFrEF 치료용 또는 예방용 의약 제조에서 사용하기 위한 NRG4 화합물. 한 실시양태에서, NRG4 화합물은 상기 실시양태 중 임의의 것의 화합물이다.

한 실시양태에서, 화합물은 24-168시간 동안 투여된다. 한 실시양태에서, 화합물은 24-96시간 동안 투여된다. 한 실시양태에서, 화합물은 24, 48, 72 또는 96시간 동안 투여된다. 한 실시양태에서, 화합물은 96시간 동안 투여된다.

한 실시양태에서, 화합물은 주 1회 이하로 빈번하게 투여된다. 한 실시양태에서, 화합물은 분기별 1회 (Q3M) 이하로 빈번하게 투여된다. 한 실시양태에서, 화합물은 Q3M으로 투여된다. 한 실시양태에서, 화합물은 Q3M으로 96시간 동안 투여된다. 한 실시양태에서, 화합물은 6개월마다 1회 투여된다.

한 실시양태에서, 효능:투여 비는 약 2 내지 약 50이다. 한 실시양태에서, 효능:투여 비는 약 20 내지 약 45이다. 한 실시양태에서, 효능:투여 비는 약 22, 약 30, 또는 약 45이다.

한 실시양태에서, 치료는 적어도 6개월 동안 계속 진행된다.

한 실시양태에서, 치료는 적어도 1년 동안 계속 진행된다.

한 실시양태에서, 화합물은 LVEF를 유의하게 증가시킨다. 한 실시양태에서, 화합물은 LVEF를 적어도 5% 증가시킨다. 한 실시양태에서, 화합물은 치료 1년 후 LVEF를 5% 개선시킨다.

한 실시양태에서, 화합물은 LVESV를 유의하게 증가시킨다. 한 실시양태에서, 화합물은 LVESV를 적어도 5% 개선시킨다. 한 실시양태에서, 화합물은 치료 1년 후 LVESV를 5% 개선시킨다.

한 실시양태에서, 화합물은 LVEDP를 유의하게 감소시킨다. 한 실시양태에서, 화합물은 치료 1년 후 LVEDP를 유의하게 감소시킨다.

한 실시양태에서, 화합물은 전체 종축 변형 (GLS)을 유의하게 감소시킨다. 한 실시양태에서, 화합물은 GLS를 적어도 3.5% 감소시킨다.

한 실시양태에서, 화합물은 LVEDV를 유의하게 개선시킨다.

한 실시양태에서, 화합물은 CV 사망 및/또는 HF 입원 위험을 유의하게 감소시킨다.

한 실시양태에서, 화합물은 CV 사망 위험을 적어도 15% 감소시킨다.

한 실시양태에서, 화합물은 HF 입원 위험을 적어도 15% 감소시킨다.

한 실시양태에서, 화합물은 전체 사망, MI, 뇌졸중, LVAD 이식 또는 심장 이식 중 하나 이상의 것의 위험을 유의하게 감소시킨다.

한 실시양태에서, 화합물은 심부전의 증상 및 신체적 제한 및/또는 QoL을 유의하게 개선시킨다.

한 실시양태에서, 화합물은 저혈압 증가; 신장 기능 악화; 전해질 불균형; 간 기능장애; 종양 또는 지속적인 정액저하증 발병을 초래하지 않는다.

한 실시양태에서, 화합물은 비경구적으로 투여된다.

한 실시양태에서, 화합물은 정맥내, 피하로 또는 복강내로 투여된다.

한 실시양태에서, 화합물은 주입 펌프에 의해 투여된다.

한 실시양태에서, 화합물은 패치 펌프에 의해 투여된다.

한 실시양태에서, 치료 유효량은 약 3 내지 약 100 nM의 혈청 농도를 제공하는 화합물의 양이다.

한 실시양태에서, 화합물은 심부전 NYHA 클래스 II-IV를 앓는 환자에게 투여된다.

한 실시양태에서, 화합물은 심부전 NYHA 클래스 II-III를 앓는 환자에게 투여된다.

한 실시양태에서, 화합물은 심부전을 위한 하나 이상의 추가 치료와 함께 동시 또는 순차적 조합으로 투여된다. 한 실시양태에서, 심부전을 위한 하나 이상의 추가 치료는 베타 차단제, ACE 억제제, ARB, MRA, 이뇨제, 이바브라딘 및 사쿠비트릴/발사르탄 (엔트레스토®)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 화합물은 SGLT2 억제제 및/또는 sGC 활성제와 함께 동시 또는 순차적 조합으로 투여된다.

한 실시양태에서, 투여되는 NRG4 화합물은 본 발명의 NRG4 화합물이다.

본 발명은 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예 화합물의 제조

본 발명의 NRG4 화합물의 실시예는 하기 표 2에 기술되어 있다.

표 2. 실시예 NRG4 화합물의 성분. 임의의 IgG Fc 영역 서열을 배제한, 실시예 화합물에 대한 완전한 아미노산 서열은 제4열에 열거된 서열식별번호로 제공된다. 실시예 1-8 및 10-11은 IgG Fc 영역을 추가로 포함한다. 실시예 1-8 및 10의 IgG Fc 영역은 서열식별번호 6 및 서열식별번호 7의 이량체를 포함하며, 여기서 상기 표의 제3열에서 확인되는 서열의 N 말단 아미노산은 서열식별번호 7의 C-말단 아미노산에 융합되어 있다. 실시예 11의 IgG Fc 영역은 서열식별번호 8 및 서열식별번호 9의 이량체를 포함하며, 여기서 상기 표의 제3열에서 확인되는 서열의 N 말단 아미노산은 서열식별번호 9의 C-말단 아미노산에 융합되어 있다.

생물학적 발현

Fc 영역을 포함하는 NRG4 화합물의 실시예는 CHO GSKO 세포주를 사용하여 포유동물 세포 발현 시스템에서 제조된다. GS 유전자 넉아웃은 선별 조건하에서 낮거나, 또는 비생산적인 세포의 생존을 허용할 수 있는 내인성 GS 배경 활성을 제거함으로써 엄격한 선별을 가능하게 한다. 본 발명의 Fc 융합 놉 쇄 및 홀 쇄를 코딩하는 유전자를 공동 형질감염을 위한 개별 글루타민 신테타제 (GS)-함유 발현 플라스미드로 서브클로닝할 수 있거나, 또는 상기 2개의 쇄를 모두 단일 GS-함유 발현 플라스미드로 서브클로닝할 수 있다. 대안적으로, 어느 쇄든 그의 상대적인 발현 수준을 변경시켜야 하는 경우에는 놉 쇄 및 홀 쇄를 다른 비로 단일 GS-함유 발현으로 조합할 수 있다. 놉 쇄 또는 홀 쇄를 코딩하는 cDNA 서열을 프레임 내에서, 뮤린 카파 리더 서열일 수 있는 신호 펩티드의 코딩 서열과 융합시켜 원하는 생성물의 세포 배양 배지로의 분비를 증진시킬 수 있다. 발현은 바이러스 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터에 의해 구동된다.

CHO GSKO 세포는 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염될 수 있다. 안정적인 형질감염을 위해, CHO GSKO 세포를 전기천공법 및 적절한 양의 재조합 놉 쇄 및 홀 쇄 발현 플라스미드를 사용하여 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 적절한 세포 밀도로 현탁 배양물에서 유지시킨다. 형질감염된 세포의 선별은 글루타민 무함유의, 25 μM 메티오닌 술폭시민 (MSX) 함유 무혈청 배지에서의 성장에 의해 달성되고, 32-37℃ 및 5-7% CO2에서 인큐베이션시킨다. Fc 융합물은 CHO 세포에서 배지로 분비된다.

단백질은 (1) 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 이어서, 양이온 교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (또는 다른 적합한 방법); 또는 (2) 다중모드 크로마토그래피, 이어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (또는 다른 적합한 방법)를 사용하여 정제된다.

단백질 A 크로마토그래피로 시작하는 정제를 위해, 수확된 배지로부터의 단백질을 맙셀렉트 슈어 프로테인 A(MabSelect SuRe Protein A) 수지 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare)) 상에서 포획한다. 이어서, 수지를 전개 완충제, 예컨대, 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) (pH 7.4), 또는 트리스(Tris) 함유 전개 완충제로 간단히 세척하여 비특이적으로 결합한 물질을 제거한다. 이어서, 저 pH 용액, 예컨대, 20 mM 아세트산/5 mM 시트르산을 이용하여 수지로부터 단백질을 용출시킨다. Fc 융합물을 함유하는 분획을 풀링한다. 필요에 따라, 염기, 예컨대, 0.1 M 트리스 (pH 8.0)를 첨가함으로써 pH를 증가시킬 수 있다. 이 단계에서, Fc 융합물은 결합/활성을 스크리닝하는데 이용될 수 있거나, 또는 원하는 경우, 수지, 예컨대, 페닐 세파로스 HP(Phenyl Sepharose HP)를 이용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 10 칼럼 부피에 걸쳐 10 mM 인산나트륨 (pH 7) 중 500 mM 내지 0 mM 구배의 황산나트륨을 이용하여 페닐 세파로스 HP 칼럼으로부터 Fc 융합물을 용출시킬 수 있다. Fc 융합물을 PBS (pH 7.4) 중 등용매 용출시키면서, 또는 원하는 완충제로 완충제를 교환하면서, 슈퍼덱스(Superdex) 200 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 실시예 1-8 및 10을 상기 방식으로 정제한다.

다중모드 크로마토그래피로 시작하는 정제를 위해, 수확된 배지로부터의 단백질을 캅토MMC(CaptoMMC) 수지 (GE 헬쓰케어) 상에서 포획한다. 이어서, 수지를 100 mM 시트레이트 (pH 5.0) ("A" 완충제)로 간단히 세척한 후, "A" 완충제 및 25 mM 인산나트륨, 1 M 염화나트륨 (pH 7.5) ("B" 완충제)의 80%/20% 세척제로 세척한다. 이어서, 70% "B" 완충제에서 수지로부터 원하는 단백질을 용출시킨다. 수지, 예컨대, 페닐 세파로스 HP (GE 헬쓰케어)를 이용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 Fc 융합물을 추가로 정제할 수 있다. 20 mM 트리스 (pH 8) 중 800 mM 내지 0 mM 선형 구배의 황산나트륨을 이용하여 페닐 세파로스 HP 칼럼으로부터 Fc 융합물을 용출시킬 수 있다. Q 세파로스 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 이용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 Fc 융합물을 추가로 정제할 수 있다. 20 mM 트리스 (pH 8) 중 0 M 내지 1 M 염화나트륨 구배를 이용하여 칼럼으로부터 Fc 융합물을 용출시킬 수 있다. 분획을 풀링하고, 보관을 위해 원하는 완충제로 완충제를 교환한다. 실시예 11을 상기 방식으로 정제한다.

화학적 합성

IgG Fc 영역을 포함하지 않는 펩티드인 본 발명의 NRG4 화합물 (예컨대, 상기 표 2의 실시예 9)을 또한 Fmoc/t-Bu 전략법을 사용하여 고체상 펩티드 합성에 의해 생성할 수 있다. 펩티드를 심포니X(SymphonyX) 자동화 펩티드 합성기 (PTI 프로테인 테크놀러지즈 인크.(PTI Protein Technologies Inc.))에서 합성한다.

펩티드를 합성하는 데 Fmoc-L-Leu-Wang 수지 (0.3-0.8 mmole/그램, 200-400 메시, 켐-임펙스(Chem-Impex))를 이용한다. DMF 중의 20% v/v 피페리딘 용액을 이용하여 Fmoc 탈보호화를 수행한다. 아미노산 커플링은 25℃에서 2 h 동안 DMF 중에서 10 당량의 Fmoc-아미노산, 0.9 M 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 0.9 M 옥시마(Oxyma) (1:1:1 몰비)를 사용하여 수행한다. 세척 단계는 DMF를 이용하여 수행되며, 모든 커플링 및 탈보호화 단계 후에 포함된다. 추가의 세부 사항은 하기 표 3에 제공되어 있다.

표 3. Fmoc-탈보호화 및 커플링 프로토콜.

주 서열에서 사용된 모든 아미노산은 L 아미노산이다: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(Otbu)-OH, Fmoc-Glu(Otbu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH.

상기 기술된 펩티드-수지의 신장을 완료한 후, 최종 Fmoc 기를 제거하고, 펩티드를 절단하기 전에 메틸렌 클로라이드로 수지를 세척한다. 물, 트리이소프로필실란, 티오아니솔, 1,2 에탄디티올 (1:1:1)로 이루어진 용액 1.5 mL를 트리플루오로아세트산 (TFA) 13 mL에 첨가하고, 생성된 절단 칵테일을 수지에 첨가하고, 반응 시린지에서 2.5 h 동안 혼합한다. 절단된 펩티드를 함유하는 TFA 용액을 냉 디에틸 에테르가 함유된 50 mL 원뿔형 바이알로 옮긴다. 침전된 펩티드 용액은 두꺼운 펠렛으로 스핀 다운시키고, 에테르는 경사분리한다. 리폴딩을 진행하기 전 에테르 침전을 2회 반복하여 잔류 칵테일을 세척한다.

조 펩티드를 물에 용해시키고, 필요한 경우, 아세토니트릴을 첨가한다. 조 펩티드 농도를 아세토니트릴 및 물 중에서 2.5-3 mg/mL (200 mL)로 조정한다. 이어서, 샘플을 리폴딩에 직접 적용한다. 0.1 M 트리스 완충제 (pH 8) 중 GSSG:GSH (2 mM:1 mM)인 비로 산화된 글루타티온 및 환원된 글루타티온을 첨가하여 리폴딩 완충제를 제조한다. 조 펩티드 용액을 0.13-0.15 mg/mL 농도가 되도록 (20배 희석) 리폴딩 완충제에 첨가하고, 리폴딩 혼합물을 교반하지 않고 4℃에서 유지시켰다. 1일 후, pH가 3.0이 되도록 하기 위해 TFA를 최대 0.2%까지 첨가하여 리폴딩 혼합물을 켄칭한다. 이어서, 켄칭된 용액을 여과하고, 정제한다.

펩티드 용액을 HPLC 칼럼 상에 로딩한 후, 이어서, 완충제 A로 평형화시킨 후, 구배화시킨다. 완충제 A: 물 중 0.1% TFA; 완충제 B: 100% 아세토니트릴. 구배: 100 min 동안 10% B 에서 25% B. 유속: 18 mL/min; 220 nm에서 검출 (워터스 2489 디텍터(Waters 2489 Detector)). 칼럼: 워터스 시메트리 프렙 C18(Waters Symmetry Prep C18) 칼럼, 7 ㎛, 19 x 300 mm (워터스 파트(Waters Part) #WAT066245). 분획을 UV에 의해 자동 트리거하고, 워터스 프랙션 콜렉터 III(Waters Fraction Collector III)을 이용하여 수집한다.

원하는 펩티드를 함유하는 풀링된 분획을 조합하고, 동결건조시켰다.

시험관내 연구

개선된 결합을 위한 NRG4 변이체를 스크리닝하기 위한 HER4 / NRG - Fc 결합 검정

결합 검정을 사용하여 HER4 수용체에의 NRG4 변이체 Fc 융합 단백질의 고처리량 스크리닝을 수행하여 수용체 활성화 및 신호전달을 증가시킬 수 있는 잠재능이 있는 친화성 구동 변이체를 확인한다. ELISA 플레이트를 1% BSA/PBS/0.1% 트윈(Tween) 20 (HER4 세포외 도메인 (ECD), 5 ㎍/ml)으로 차단한 후, 플레이트를 PBS 중 2 ㎍/ml의 항-His 태그 항체로 코팅하여 C-말단 His-태그부착된 HER4 수용체 ECD 구축물의 표준화된 포획을 촉진시킨다. 발현 배지 중 포화량의 비정제된 NRG4-Fc 변이체 (10 ㎍/ml로 시작, 1% BSA/PBS/0.1% 트윈 20 중에서 연속 희석)를 1시간 동안 포획된 수용체와 함께 인큐베이션시킨다. 세척 후, 결합된 변이체 NRG4-Fc를 항-인간 Fc-특이적 알칼리성 포스파타제 2차 검출 시약으로 비색적으로 검출하여 결합을 정량화한다. 수용체에 대한 변이체 결합의 인큐베이션 시간 또는 후속 세척 단계의 지속 시간은 각각 친화도 온-레이트 및 오프-레이트에 의해 구동되는 결합 변이체를 추가로 식별하기 위해 달라질 수 있다. 상기 스크리닝 프로세스 결과, 실시예 1에 포함된 D1G 변형은 하기 표 4의 데이터에 제시된 바와 같이, 높은 친화성과 수용체 활성화 및 신호전달을 증가시키는 잠재능을 갖는 것으로 확인된다.

표 4. HER4 세포외 도메인에의 결합

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, D1G 변형을 포함하는 실시예 1은 본 연구에서 유사한 용량에서 WT NRG1에 대해 유사한 HER4 결합을 보이고, 유사한 용량에서 WT NRG4보다 유의하게 더욱 큰 HER4 결합을 보인다.

CHO 인간 및 래트 HER2 -4 및 HER2 -3 세포주의 생성

인간 또는 래트 HER 수용체를 과다발현하는 CHO-K1 세포를 사용하는 세포 기반 검정을 사용하여 NRG4 화합물의 활성을 측정한다. CHO-K1 세포 (ATCC)를 20 mM HEPES, 40 ㎍/mL L-프롤린, 1x 항생제와 함께 5% FBS를 포함하는 DMEM-F12 3:1 중에서 성장시키고, 트리플 익스프레스(TripLE Express) (기브코(Gibco))를 사용하여 매 2-3일마다 1:5로 분할하였다. 세포를 제조사의 설명서에 따라 퓨진 6(Fugene 6) (프로메가(Promega))을 이용하여 쌍을 이룬 HER 수용체 (hHER2-3, hHER2-4, rHER2-3 및 rHER2-4)를 코딩하는 플라스미드 DNA로 형질감염시킨다. HER2도 포함시키는 데, 그 이유는 상기 수용체가 리간드에는 결합하지 않지만, 하류 신호전달을 위한 HER 수용체의 바람직한 이량체화 파트너가 되기 때문이다. 형질감염된 세포를 3-4주 동안 퓨로마이신 (12 ug/ml) 및 히그로마이신 (1 mg/ml)으로 선별하고, 96 웰 플레이트로의 제한된 희석 클로닝에 의해 클론 세포주를 수득한다. 택맨(Taqman) 방법에 의하여 HER2, HER3 또는 HER4의 적절한 유전자 발현에 의해 클론 세포주를 선별한다. 적절한 수용체 발현을 보이는 세포주를 NRG1 유도 포스포-ERK ½ 반응에 의해 확인한다. 클론을 성장시키고, 수확하고, 냉동바이알로 분취한 후, 장기간 보관을 위해 액체 질소에서 냉동시킨다.

시험관내 인간 HER2 - HER4 매개 ERK 1/2 인산화에 의한 분자 스크리닝

포스포-ERK1/2 활성 검정을 이용하여 NRG4 화합물의 효능을 측정한다. 인간 HER2-HER4 매개 ERK 1/2 인산화 자극을 측정하는 연구에서 WT 인간 NRG1 및/또는 인간 NRG4와의 비교로 실시예 1-8 및 10의 효력을 분석한다. 본 검정은 인간 HER2 및 HER4를 발현하는 CHO-K1 안정한 세포주를 포함한다. CHO-hHER2-hHER4 (클론 1H6) 세포를 통상적으로 37℃, 5% CO₂에서 DMEM: F12(3:1), 5% FBS, 40 ㎍/mL L-프롤린, 10 ㎍/mL 퓨로마이신 및 1 mg/mL 히그로마이신 중에서 배양한다. 세포를 1X PBS를 이용하여 2회 세척하고, 0.05% 트립신/0.53 μM EDTA로 해리시키고, 10 m 동안 300 x g로 원심분리하여 수집한다. 세포를 유지 배지 중에 재현탁시킨다. 30 ㎕ 중 20,000개의 세포/웰로 384 웰 폴리-D-리신 세포 배양 플레이트 (그라이너(Greiner), 카탈로그 번호 781946)에 시딩한다. 플레이트를 제조사의 리드로 덮고, 5% CO₂, 80%+ 습도의 37℃ 조직 배양 인큐베이터로 이동시키고, 부착시킨다. 24h 후, 배지를 플레이트로부터 제거하고, 바이오메크 FX(Biomek FX) 액체 처리기를 사용하여 30 ㎕ 무혈청 기아 배지 (0.1% BSA를 포함하는 저 글루코스 DMEM)로 대체한다. 플레이트는 24 h 동안 인큐베이터로 복귀시킨다.

293F 상청액으로서 일시적으로 발현된 hFcNRG4 변이체를 4pt 1:8 연속 희석액 (평균 용량 범위 250 pM 내지 140,000 pM)으로서 투명 384W 플레이트 (그라이너, 카탈로그 번호 781185) 중 기아 배지 중에서 제조한다. 배지를 세포 배양 플레이트로부터 제거하고, 바이오메크 FX 액체 처리기를 사용하여 30 uL/웰 제조 변이체를 플레이트로 스탬핑한다. 플레이트를 호일 실로 실링하고, 회전 진탕기 상에서 실온하에 15분 동안 자극시킨다. 이어서, 세포를 50 uL 냉 PBS로 1회 세척한다. 30 uL 용해 완충제를 세포에 첨가하고, 회전 진탕기 상에서 RT하에 10m 동안 진동시킨다.

알파스크린 슈어파이어(AlphaScreen SureFire) 포스포-ERK1/2 키트 (T202/Y204) (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 카탈로그 번호 TGRES) 또는 알파리사® 슈어파이어® 울트라™ p ERK1/2(AlphaLISA® SureFire ® Ultra™ p ERK1/2) 검정용 키트를 알파스크린 프로테인 A IgG 디텍션 키트(AlphaScreen Protein A IgG Detection Kit)(프로테인-A(Protein-A)) (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6760617)와 함께 사용하여 ERK 1/2의 인산화 검출을 수행한다. CHO-K1 세포 용해 후, 4 ㎕ 용해물을 384W 바이오메크 FX를 이용하여 있는 384W 알파 프록시플레이트(Alpha Proxiplate) (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6008280)로 옮긴다. 4 uL 양성 및 음성 용해물 (퍼킨 엘머, TGRES-L)을 대조군으로서 사용가능한 웰에 첨가한다. 5 uL/웰 수용자 믹스 (항-포스포-Thr202/Tyr204 항체 및 프로테인 A 접합 수용체 비드 함유)를 포럼라트릭스 만티스(Forumlatrix Mantis)를 이용하여 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 실링하고, 1 min 동안 300 x g로 스핀 다운하고, 회전 진탕기 상에서 실온하에 2hr 동안 인큐베이션시킨다. 2 ㎕/웰 공여자 믹스 (스트렙트아비딘 코팅 공여자 비드 및 원위 ERK1/2 에피토프에 대한 비오티닐화된 항체)를 만티스에 의해 분배한다. 플레이트를 실링하고, 1 min 동안 300 x g로 스핀 다운하고, 회전 진탕기 상에서 실온하에 2hr 동안 인큐베이션시킨 후, 퍼킨 엘머 인비젼 2103 멀티라벨 리더(Envision 2103 Multilabel Reader) (HTS 알파(HTS Alpha) 모드, 여기 시간: 40 ms, 총 측정 시간: 130 ms) 상에서 판독한다.

각 샘플을 모체 hFcNRG4 용량 반응에 대해 플롯팅하고, XLFit에서 복제하여 모든 플레이트에 포함시킨다. 상기 데이터를 4 파라미터 피트로 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에서 플롯팅하고, EC50 효력 값을 추출한다. 결과는 표 5 및 6에 제공되어 있다.

표 5. WT NRG4와 비교된 실시예 1-5의 활성. 실시예 1-5에 대한 데이터는 두 복제물의 평균을 나타내며, 표준 편차도 제시되어 있다.

표 5의 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, HER4에 대한 그의 친화성 증가와 일관되게, 본 연구에서 추가의 아미노산 변형도 포함하는 실시예의 것을 비롯하여, D1G 변형은 또한 야생형 NRG4와 비교하여 HER4 및 HER2에서 활성을 유의하게 증가시킨다.

표 6. WT NRG1 및 NRG4와 비교된 실시예 6-8 및 10의 활성.

표 6의 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 본 연구에서 각각 D1G 변형 및 추가 변형을 포함하는 실시예 6-8 및 10은 WT NRG4와 비교하여 HER4 및 HER2에 대해 증가된 활성을 보이고, WT NRG1과 비교하여 유사한 활성을 보인다.

정제된 단백질을 시험하기 위한 인간 및 래트 HER2 -4 또는 HER2 -3 포스포 -ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) 검정

인간 또는 래트 HER 수용체를 과다발현하는 CHO-K1 세포와 함께 포스포-ERK1/2 활성 검정을 이용하여 정제된 NRG4 화합물의 효력 및 선택성을 측정한다. 인간 또는 래트 HER 수용체를 발현하는 CHO-K1 세포주를 선별 배지 (20 mM HEPES, 40 ㎍/mL L-프롤린, 1x 항생제, 12 ㎍/mL 퓨로마이신, 1 mg/mL 히그로마이신 B와 함께 5% FBS를 포함하는 DMEM-F12 3:1)를 이용하여 배양하였다. -1일째에 (포스포-ERK1/2 검정 전날), 세포를 PBS로 1회 세척하고, 효소 무함유 세포 해리 용액 (기브코 카탈로그 번호 13151-014)으로 탈착시키고, 플레이팅 배지 (20 mM HEPES, 1x 항생제, 0.2% FBS를 포함하는 DMEM-F12 3:1) 중에 재현탁시킨다. 세포를 96 웰 폴리-D-리신 코팅된 플레이트 (BD 카탈로그 번호 354640) 중에 웰당 0.1 mL당 10,000개의 세포로 플레이팅한다. 세포를 37℃하에 5% CO2에서 밤새도록 조직 배양 인큐베이터에서 배양한다. 1일째 (pERK1/2 검정 당일), 플레이트를 실온에서 30 min 동안 인큐베이션시킨다. 배양 배지를 제거한 후, PBS-20 mM HEPES-0.005% BSA 중에 다양한 농도로 희석된 리간드 50 ㎕를 첨가한다. 천연 인간 NRG1 및 NRG4 펩티드는 레프로카인(Reprokine: 미국 플로리다주 탬파)으로부터 구입한 것이다. 자극 시간은 30 min이다 (단, 예외적으로, hHER2-4 1H6 세포주의 경우, 자극을 위해 15 min 사용). 자극 종료시, 리간드를 제거하고, 70 ㎕ 용해 완충제 (제조사의 레시피에 따라 제조, 퍼킨 엘머 카탈로그 번호 ALSU-PERK-A10K)를 첨가한다. 플레이트를 350 rpm으로 교반하면서, 플레이트 진탕기 상에서 실온하에 10 min 동안 인큐베이션시킨 후, 진탕시키지 않고 1시간 동안 얼음 상에서 수행한다. 30 ㎕ 세포 용해물을 포스포-ERK1/2 검정을 위해 96 웰 백색 옵티플레이트(Optiplate) (퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6002290)로 옮긴다. 간략하면, 7.5 ㎕ 수용자 비드를 옵티플레이트 중 30 ㎕ 용해물에 첨가한다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 350 rpm으로 교반하면서, 플레이트 진탕기 상에서 실온하에 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 7.5 ㎕ 공여자 비드를 첨가하고, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 350 rpm으로 교반하면서, 플레이트 진탕기 상에서 실온하에 2시간 동안, 또는 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨다 (판독 전 2 h 동안 실온에서 플레이트를 가온시킨다). 인비젼(Envision) 장치 (알파 테크놀러지(Alpha Technology)-호환 플레이트 판독기)에서 알파 신호 데이터를 수득한다. 공여자 비드 및 수용자 비드는 검정 프로토콜에 따라 제조한다. 제시된 데이터는 알파스크린 슈퍼파이어 p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) 검정 키트 (카탈로그 번호 TGRES50k) 또는 알파리사® 슈어파이어® 울트라™ p-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) 검정용 키트 (퍼킨 엘머 카탈로그 번호 ALSU-PERK-A10K)를 이용하여 작성된 것이다. 2가지 유형의 검정에서 모두 NRG1 펩티드의 활성은 유사하였다. 인비젼 장치로부터 수득한 원시 데이터를 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버전 7)에 임포트한다. 가변 기울기-4 파라미터 용량 반응 곡선에 의해 EC50 값을 생성한다. 플레이트당 천연 인간 NRG1에 대한 평균 최대 원시 데이터 대비 NRG4 화합물에 대한 평균 최대 원시 데이터를 구하고, 그에 100을 곱함으로써 최대 NRG1 활성 데이터(%)를 생성한다. 데이터는 하기 표 7-9에 제공되어 있다. N 값은 독립 검정 실행 회수를 반영한 것이다.

표 7. 인간 HER2/HER4 검정.

표 8. 래트 HER2/HER4 검정.

표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 야생형 인간 NRG1 펩티드는 인간 HER4 및 HER2 수용체에서 강력한 활성을 보인 반면, 야생형 인간 NRG4 펩티드는 약한 부분 효능제로서 거동한다. 실시예 9-11은 강력한 활성을 보이는데, 여기서 EC50 값은 야생형 인간 NRG1보다 약간 더 강력하고, 최대 활성(%)은 야생형 인간 NRG4 펩티드보다 더 크고 인간 NRG1의 것에 근접한 활성을 갖는다. 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 래트 HER4 HER2 수용체에서 유사한 결과를 수득하였고, 여기서 효력은 인간 NRG1 대비 약간 증가하였고, 인간 NRG1의 것에 근접한 최대 활성을 보인다. 결론적으로, NRG4 화합물들 중 제시된 실시예는 인간 및 래트 HER4 HER2 수용체 둘 모두에서 천연 인간 NRG4 대비 더 크고 천연 인간 NRG1의 것에 근접한 포스포-ERK1/2 활성을 나타낸다.

표 9. 인간 및 래트 HER2/HER3 검정

표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 야생형 인간 NRG1 펩티드는 인간 HER3 HER2 수용체에서 강력한 활성을 보인 반면, 야생형 인간 NRG4 펩티드 및 모든 실시예는 상기 수용체 쌍에서 어떤 활성도 보이지 않았고, 이는 HER4 HER2 수용체 쌍에 대한 차별적인 선택성을 입증하는 것이다. 결론적으로, NRG4 화합물의 실시예는 HER3 HER2 수용체에서 포스포-ERK1/2 활성이 없음을 입증하며, 이에 따라 야생형 NRG4 펩티드의 HER4 및 HER2 수용체 선택성을 유지함을 나타낸다.

생체내 연구

래트 MI 모델에서 실시예 9가 심장 기능 및 구조에 미치는 효과

실시예 9에 대한 혈장 농도 및 노출 기간을 연구하기 위해 박출률이 감소한 심부전 (HFrEF)을 앓는 래트 모델에서 2개의 비임상적 효능 약리학 연구를 수행한다. 두 연구 모두 외과적으로 유도된 심근경색을 앓는 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트에서 심장 기능 및 구조에 미치는 효과를 측정한다.

두 연구 모두에 대해 유사한 방법을 이용한다. 외과적으로 유도된 심근경색을 앓는 수컷 스프라그 돌리 래트를 구입하고, 마취하고, 절차 내내 양압 환기를 제공한다(positively ventilated). 4번째와 5번째 갈비뼈 사이를 절개하여 심장을 드러낸다. 왼쪽 관상 동맥을 영구적으로 결찰시킨다. 모의 수술 동물에도 동일한 절차를 수행하되, 단, 묶지 않고 그대로 실크 봉합사를 왼쪽 관상 동맥 주위에 배치한다. 모든 래트를 개별적으로 온도 및 습도가 제어되는 실내에 하우징하고, 12시간 명기/암기 사이클로 유지시킨다. 수술 후 2 내지 3주 경과하였을 때, 래트는 박출률 (EF%) 및 좌심실 치수 (LVD) 측정을 위해 베보(Vevo) 2100 초음파 시스템을 사용하여 경흉부 심장 초음파 검사를 받는다. 래트는 EF% 및 LVD에 따라 처리군 간에 걸쳐 무작위화된다.

EF% 및 LVD 측정값은 평균값 ± 표준 오차 (SE)로 표시된다. JMP® 13 소프트웨어 (SAS 인스티튜트, 인크.(SAS Institute, Inc.; 미국 노스캐롤라이나주 캐리))를 사용하여 통계적 분석을 수행하고, 처리군들 간의 통계적 비교를 위해 던넷 검정(Dunnett's Test)을 이용한다. P<0.05의 통계적 유의도가 허용된다.

비임상적 효능을 위한 실시예 9 혈장 농도 측정을 위한 연구 디자인. 10 ㎕/h의 주입 속도로, 실시예 9 또는 비히클 (1X 둘베코스 포스페이트-완충처리된 염수 [DPBS])을 알제트(Alzet)® 펌프 (모델 2ML1; 알제트® 오스모틱 펌프즈(Alzet® Osmotic Pumps); 미국 캘리포니아주)를 통해 4일 동안 연속하여 피하로 (SC) 투여한다. 실시예 9에 대해 투여된 용량 수준은 펌프 주입을 사용하여 0.22, 0.73, 2.18 및 7.28 mg/kg/일이다. 4일째, 혈액 샘플을 수집하여 혈장 농도를 측정하고, 주입 펌프를 제거한다. 투여 시작 후 7일째, 모든 동물에 대해 심장 기능 (EF%) 및 구조 (LVD)를 평가한다. 투여 시작 14일 후, 비히클 처리군 및 2개의 최고 용량군에 대해 EF% 및 LVD를 평가한다.

결과. 실시예 9 처리는 삼투 펌프를 사용하여 96시간 동안 투여되었을 때, 심장 기능 (EF%)이 용량에 의존하는 방식으로 개선된 것을 입증한다 (표 10). 2.18 및 7.28 mg/kg/일을 투여받은 고용량 군은 주입 시작 후 2주 동안 개선된 심장 기능을 보인다 (표 10). 상기 용량은 각각 29.62 및 72.24 nM의 정상 상태 혈장 농도를 달성한다 (표 11). 처리된 MI 동물은 모두 비히클 군과 비교하여 더 적은 LVD 확장을 나타낸다 (표 10).

표 10. HFrEF를 앓는 래트 모델에서 96시간 주입이 EF에 미치는 효과. 약어: N = 동물 마리수; ND = 비측정; SE = 표준 오차. *p<0.05 (비히클 대비).

표 11. 96시간 주입 후 래트 혈장 중 노출

비임상적 효능을 위한 주입 기간의 결정을 위한 연구 디자인. 10 ㎕/h의 주입 속도로 2.18 mg/kg/일의 실시예 9 또는 비히클 (DPBS)을 알제트^® 펌프를 통해 48, 72 또는 96h 동안 SC 투여한다. 지정된 주입기 종료시, 혈액 샘플을 수집하여 혈장 농도를 측정하고, 주입 펌프를 제거한다. 투여 시작 7일 후, 모든 동물에 대해 심장 기능 (EF%) 및 구조 (LVD)를 평가한다.

결과. 표 12에서 알 수 있는 바와 같이, 본 연구에서 실시예 9 처리는 알제트^® 펌프를 통해 48 내지 96h 동안 투여되었을 때, 심장 기능이 주입 지속 기간에 의존하는 방식으로 개선된 것을 입증한다. 72h 및 96h 동안 실시예 9 주입은 투여 시작 후 7일째 EF를 유의하게 개선시킨다. 처리된 MI 동물은 모두 비히클 군과 비교하여 더 적은 LVD 확장을 나타낸다.

표 12. 다중 지속 기간 동안의 실시예 9 주입이 심장 기능에 미치는 효과. 약어: N = 동물 마리수; ND = 비측정; SE = 표준 오차. *p<0.05 (비히클 대비).

표 13. 실시예 9 주입 후 심근경색을 앓는 래트 모델 혈장 중 노출.

비임상적 데이터는 실시예 9의 혈장 농도가 72 내지 96시간의 기간 동안 3 내지 100 nM로 유지되었을 때 HFrEF의 래트 모델에서 LVEF가 개선되었음을 보여주었다.

래트 MI 모델에서 실시예 10이 심장 기능 및 구조에 미치는 효과

캅토프릴 처리, 실시예 10 처리 또는 조합 처리 후의 심장 기능 및 구조 변화를 평가하기 위해 박출률이 감소한 심부전 (HFrEF)을 앓는 래트 모델에서 비임상적 효능 약리학 연구를 수행한다.

방법. 외과적으로 유도된 심근경색을 앓는 수컷 스프라그 돌리 래트를 구입하고, 마취하고, 절차 내내 양압 환기를 제공한다. 4번째와 5번째 갈비뼈 사이를 절개하여 심장을 드러낸다. 왼쪽 관상 동맥을 영구적으로 결찰시킨다. 모든 래트를 개별적으로 온도 및 습도가 제어되는 실내에 하우징하고, 12시간 명기/암기 사이클로 유지시킨다. 수술 후 2 내지 3주 경과하였을 때, 래트는 박출률 (EF%) 및 좌심실 치수 (LVD) 측정을 위해 베보 2100 초음파 시스템을 사용하여 경흉부 심장 초음파 검사를 받는다. 래트는 EF% 및 LVD에 따라 처리군 간에 걸쳐 무작위화된다.

EF% 및 LVD 측정값은 평균값 ± 표준 오차 (SE)로 표시된다. JMP® 13 소프트웨어 (SAS 인스티튜트, 인크.; 미국 노스캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 통계적 분석을 수행하고, 처리군들 간의 통계적 비교를 위해 던넷 검정(Dunnett's Test)을 이용한다. P<0.05의 통계적 유의도가 허용된다.

연구 디자인. MI 수술 후 3주째, 동물을 EF% 및 LVD에 따라 2개 처리군으로 (위약 또는 캅토프릴, 식수 중 2 g/L, 임의대로) 무작위화한다. 투여 시작 후 3주 및 4주째, 심장 기능 (EF%) 및 구조 (LVD)를 경흉부 심장 초음파 검사에 의해 평가한다. 동물을 심장 기능 (EF%) 및 구조 (LVD)에 기초하여 하기 군: 위약, 실시예 10, 캅토프릴 및 실시예 10+캅토프릴의 추가 군으로 추가로 무작위화한다. 실시예 10 군 중의 동물은 2차 무작위화 후 4주째에 단일 주사를 맞는다. 5 및 6주째에 심장 기능 (EF%) 및 구조 (LVD)를 평가한다.

결과. 결과는 표 14에 제공되어 있다.

표 14. 박출률이 감소한 심부전을 앓는 래트 모델에서 캅토프릴, 실시예 10의 단일 주사 또는 조합 요법이 EF에 미치는 효과. 약어: AVG = 평균. s.e. = 표준 오차. *p<0.05 (비히클 대비).

표 14에서 알 수 있는 바와 같이, 캅토프릴 처리는 6주 동안 처리 과정 동안 심장 기능 쇠퇴를 저속화시켰지만 (통계상 유의적이지 않음), 실시예 10 처리는 단일 처리 후 심장 기능 (EF%)을 유의하게 개선시켰고, LV 확장을 감소시켰다.

래트 MI 모델에서 실시예 11이 심장 기능 및 구조에 미치는 효과

실시예 11에 대한 용량-반응 관계를 확인하기 위해 박출률이 감소한 심부전 (HFrEF)을 앓는 래트 모델에서 비임상적 효능 약리학 연구를 수행한다.

방법. 외과적으로 유도된 심근경색을 앓는 수컷 스프라그 돌리 래트를 찰스 리버(Charles River)로부터 구입한다. 간략하면, 래트를 마취하고, 절차 내내 양압 환기를 제공한다. 4번째와 5번째 갈비뼈 사이를 절개하여 심장을 드러낸다. 왼쪽 관상 동맥을 영구적으로 결찰시킨다. 모의 수술 동물에도 동일한 절차를 수행하되, 단, 묶지 않고 그대로 실크 봉합사를 왼쪽 관상 동맥 주위에 배치한다. 모든 래트를 개별적으로 온도 및 습도가 제어되는 실내에 하우징하고, 12시간 명기/암기 사이클로 유지시킨다. 수술 후 3주 경과하였을 때, 래트는 박출률 (EF%) 및 좌심실 치수 (LVD) 측정을 위해 베보 2100 초음파 시스템을 사용하여 경흉부 심장 초음파 검사를 받는다. 래트는 EF% 및 LVD에 따라 처리군 간에 걸쳐 무작위화된다.

EF% 및 LVD 측정값은 평균값 ± 표준 오차 (SE)로 표시된다. JMP® 13 소프트웨어 (SAS 인스티튜트, 인크.; 미국 노스캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 통계적 분석을 수행하고, 처리군들 간의 통계적 비교를 위해 던넷 검정을 이용한다. P<0.05의 통계적 유의도가 허용된다.

연구 디자인. MI 수술 후 2 내지 3주 후, 동물을 처리군으로 배정하고, 비히클 (DPBS) 또는 3개 용량 수준 (0.3, 1, 3 mg/kg) 중 하나의 실시예 11의 단일 주사로 처리한다. 투여 후 7일, 14일, 및 21일째, 모든 동물에 대해 심장 기능 (EF%) 및 구조 (LVD)를 평가한다.

결과. 결과는 표 15에 제공되어 있다.

표 15. 박출률이 감소한 심부전을 앓는 래트 모델에서 실시예 11이 EF에 미치는 효과. 약어: N = 동물 마리수; s.e. = 표준 오차. *p<0.05 (비히클 대비).

표 15에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 11 처리는 심장 기능 (EF%)이 용량에 의존하는 방식으로 개선된 것을 입증한다. 고용량 군은 처리 후 2주 동안 개선된 심장 기능을 보인다. LVD 확장에서는 연구 과정 동안 군들 간에 어떤 차이도 관찰되지 않는다 (데이터는 나타내지 않음).

실시예 9-11이 심장 독성에 미치는 효과

래트 및/또는 시노몰구스 원숭이에서 실시예 9-11에 대한 독성 연구를 수행한다. 실시예 10을 0.3 mg/kg의 단일 SC 주사로 래트에게 투여하였고, 이는 168시간 이상 동안 검출가능한 혈장 농도를 초래한다. 래트를 희생시키고, 조직을 검사한 결과, 심장 퇴행 및 괴사가 나타났다. 실시예 11을 30 mg/kg의 단일 SC 주사로 래트에게 투여하였고; 혈장 농도가 96시간째에는 검출되지 않았다. 래트를 희생시키고, 조직을 검사한 결과, 심장 퇴행 및/또는 괴사의 증거는 없었다. 실시예 11을 단일 3 mg/kg 용량으로 SC 볼루스 주사에 의해 수컷 및 암컷 원숭이에게 투여한다. 래트에서의 그의 약동학적 성질과 달리, 원숭이에서의 단일 주사는 제거되는 데 168시간보다 장시간 소요되는 검출가능한 혈장 농도를 초래한다. 원숭이를 희생시키고, 조직을 검사한 결과, 심장 퇴행 및 괴사가 나타났다. 래트에서 SC 투여 후 1시간 미만의 반감기를 나타내는 실시예 9는 피하 (SC) 이식된 펌프에 의해 96-168시간 동안 3-300 nM 범위의 혈장 농도를 초래하는 용량으로 투여된다. 래트를 희생시키고, 조직을 검사한 결과, 심장 퇴행 및/또는 괴사의 증거는 없었다. 원숭이에서 SC 투여 후 반감기가 5시간 미만인 실시예 9는 외과적으로 배치된 SC 또는 정맥내 (IV) 카테터에 의해 수컷 및 암컷 원숭이에게 96시간 동안 30-1000 nM 범위의 혈장 농도를 초래하는 용량으로 투여된다. 원숭이를 희생시키고, 조직을 검사한 결과, 심장 독성 및/또는 괴사의 증거는 없었다. 상기 데이터는 NRG4 화합물에 대한 노출 기간을 제한함으로써 심장 독성을 유발하지 않고 NRG4 화합물을 투여할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.

서열

서열식별번호 1 - 인간 NRG4

서열식별번호 2 - NRG4 화합물

상기 식에서:

X₀은 T, PT, MPT, S, GS, GGS, GGGS, 및 (GGGGX_λ)_n으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 X_λ는 Q, A, E 또는 S이고, n=1-5이거나 (서열식별번호 5), 또는 존재하지 않고;

X₈은 E 또는 P이고;

X₂₂는 Q 또는 V이고;

X₂₆은 F 또는 I이고;

X₃₅는 E 또는 A이고;

X₄₄는 H, K 또는 E이다.

서열식별번호 3 발현되는 인간 NRG4 전체 서열

서열식별번호 4 - NRG4 화합물

서열식별번호 5 - 글리신이 풍부한 펩티드 또는 링커

상기 식에서:

X_λ는 Q, A, E 또는 S이고;

n은 1-5이다.

서열식별번호 6 - IgG Fc 영역

서열식별번호 7 - IgG Fc 영역

서열식별번호 8 - IgG Fc 영역

서열식별번호 9 - IgG Fc 영역

서열식별번호 10 - NRG4 화합물

서열식별번호 11 - NRG4 화합물

서열식별번호 12 - NRG4 화합물

서열식별번호 13 - NRG4 화합물

서열식별번호 14 - NRG4 화합물

서열식별번호 15 - NRG4 화합물

서열식별번호 16 - NRG4 화합물

서열식별번호 17 - NRG4 화합물

서열식별번호 18 - NRG4 화합물

서열식별번호 19 - NRG4 화합물

서열식별번호 20

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> Neuregulin-4 Compounds and Methods of Use <130> X22153 <150> US 62/827,386 <151> 2019-04-01 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp His Glu Glu Pro Cys Gly Pro Ser His Lys Ser Phe Cys Leu Asn 1 5 10 15 Gly Gly Leu Cys Tyr Val Ile Pro Thr Ile Pro Ser Pro Phe Cys Arg 20 25 30 Cys Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Glu Val Phe Leu 35 40 45 <210> 2 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is selected from the group consisting of T, PT, MPT, S, GS, GGS, GGGS, and (GGGGXlambda)n wherein Xlambda is Q, A, E or S and n=1-5 (SEQ ID NO:5), or is absent <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is E or P <220> <221> VARIANT <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is Q or V <220> <221> VARIANT <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is F or I <220> <221> VARIANT <222> (36)..(36) <223> Xaa at position 36 or E or A <220> <221> VARIANT <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is H, K or E <400> 2 Xaa Gly His Glu Glu Pro Cys Gly Xaa Ser His Lys Ser Phe Cys Leu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Leu Cys Tyr Xaa Ile Pro Thr Xaa Pro Ser Pro Phe Cys 20 25 30 Arg Cys Val Xaa Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Xaa Val Phe Leu 35 40 45 <210> 3 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Met Pro Thr Asp His Glu Glu Pro Cys Gly Pro Ser His Lys Ser Phe 1 5 10 15 Cys Leu Asn Gly Gly Leu Cys Tyr Val Ile Pro Thr Ile Pro Ser Pro 20 25 30 Phe Cys Arg Cys Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Glu Val 35 40 45 Phe Leu Pro Gly Ser Ser Ile Gln Thr Lys Ser Asn Leu Phe Glu Ala 50 55 60 Phe Val Ala Leu Ala Val Leu Val Thr Leu Ile Ile Gly Ala Phe Tyr 65 70 75 80 Phe Leu Cys Arg Lys Gly His Phe Gln Arg Ala Ser Ser Val Gln Tyr 85 90 95 Asp Ile Asn Leu Val Glu Thr Ser Ser Thr Ser Ala His His Ser His 100 105 110 Glu Gln His 115 <210> 4 <211> 47 <212> 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Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 7 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 9 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 10 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 His Glu Glu Pro Cys Gly Pro Ser His Lys Ser Phe Cys Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Leu Cys Tyr Val Ile Pro Thr Ile Pro Ser Pro Phe Cys Arg Cys 35 40 45 Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Glu Val Phe Leu 50 55 60 <210> 11 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 His Glu Glu Pro Cys Gly Glu Ser His Lys Ser Phe Cys Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Leu Cys Tyr Val Ile Pro Thr Ile Pro Ser Pro Phe Cys Arg Cys 35 40 45 Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Glu Val Phe Leu 50 55 60 <210> 12 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 His Glu Glu Pro Cys Gly Pro Ser His Lys Ser Phe Cys Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Leu Cys Tyr Gln Ile Pro Thr Ile Pro Ser Pro Phe Cys Arg Cys 35 40 45 Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Glu Val Phe Leu 50 55 60 <210> 13 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 His Glu Glu Pro Cys Gly Pro Ser His Lys Ser Phe Cys Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Leu Cys Tyr Val Ile Pro Thr Phe Pro Ser Pro Phe Cys Arg Cys 35 40 45 Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Glu Val Phe Leu 50 55 60 <210> 14 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 His Glu Glu Pro Cys Gly Pro Ser His Lys Ser Phe Cys Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Leu Cys Tyr Val Ile Pro Thr Ile Pro Ser Pro Phe Cys Arg Cys 35 40 45 Val Ala Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Glu Val Phe Leu 50 55 60 <210> 15 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 His Glu Glu Pro Cys Gly Pro Ser His Lys Ser Phe Cys Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Leu Cys Tyr Val Ile Pro Thr Phe Pro Ser Pro Phe Cys Arg Cys 35 40 45 Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Lys Val Phe Leu 50 55 60 <210> 16 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 His Glu Glu Pro Cys Gly Pro Ser His Lys Ser Phe Cys Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Leu Cys Tyr Val Ile Pro Thr Phe Pro Ser Pro Phe Cys Arg Cys 35 40 45 Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu His Val Phe Leu 50 55 60 <210> 17 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 His Glu Glu Pro Cys Gly Glu Ser His Lys Ser Phe Cys Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Leu Cys Tyr Val Ile Pro Thr Phe Pro Ser Pro Phe Cys Arg Cys 35 40 45 Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Glu Val Phe Leu 50 55 60 <210> 18 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Gly Gly Gly Gly Ser Gly His Glu Glu Pro Cys Gly Pro Ser His Lys 1 5 10 15 Ser Phe Cys Leu Asn Gly Gly Leu Cys Tyr Gln Ile Pro Thr Ile Pro 20 25 30 Ser Pro Phe Cys Arg Cys Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu 35 40 45 Lys Val Phe Leu 50 <210> 19 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 His Glu Glu Pro Cys Gly Pro Ser His Lys Ser Phe Cys Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Leu Cys Tyr Gln Ile Pro Thr Ile Pro Ser Pro Phe Cys Arg Cys 35 40 45 Val Glu Asn Tyr Thr Gly Ala Arg Cys Glu Lys Val Phe Leu 50 55 60 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Gly Gly Gly Ser 1

Claims

인간 NRG4의 아미노산 서열 (서열식별번호(SEQ ID NO:) 1)과 비교하여
1번 위치의 D 잔기의 G 잔기로의 변형 및
최대 5개의 추가 변형
을 포함하는 NRG4 화합물.
하기 식을 포함하는 화합물:

상기 식에서:
X₀은 T, PT, MPT, S, GS, GGS, GGGS, 및 (GGGGX_λ)_n으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 X_λ는 Q, A, E 또는 S이고, n=1-5이거나 (서열식별번호 5), 또는 존재하지 않고;
X₈은 E 또는 P이고;
X₂₂는 Q 또는 V이고;
X₂₆은 F 또는 I이고;
X₃₅는 E 또는 A이고;
X₄₄는 H, K 또는 E이다 (서열식별번호 2).
제2항에 있어서, X₈이 P이고; X₂₂가 V이고; X₂₆이 I이고; X₃₅가 E이고; X₄₄가 E인 화합물.
제2항에 있어서, X₈이 E이고; X₂₂가 V이고; X₂₆이 I이고; X₃₅가 E이고; X₄₄가 E인 화합물.
제2항에 있어서, X₈이 P이고; X₂₂가 Q이고; X₂₆이 I이고; X₃₅가 E이고; X₄₄가 E인 화합물.
제2항에 있어서, X₈이 P이고; X₂₂가 V이고; X₂₆이 F이고; X₃₅가 E이고; X₄₄가 E인 화합물.
제2항에 있어서, X₈이 P이고; X₂₂가 V이고; X₂₆이 I이고; X₃₅가 A이고; X₄₄가 H 또는 E인 화합물.
제2항에 있어서, X₈이 P이고_; X₂₂가 V이고; X₂₆이 F이고; X₃₅가 E이고; X₄₄가 K인 화합물.
제2항에 있어서, X₈이 P이고_; X₂₂가 V이고; X₂₆이 F이고; X₃₅가 E이고; X₄₄가 H인 화합물.
제2항에 있어서, X₈이 E이고; X₂₂가 V이고; X₂₆이 F이고; X₃₅가 E이고; X₄₄가 E인 화합물.
제2항에 있어서, X₈이 P이고_; X₂₂가 Q이고; X₂₆이 I이고; X₃₅가 E이고; X₄₄가 K인 화합물.
제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, IgG Fc 영역을 추가로 포함하는 화합물.
제12항에 있어서,
X₀이 서열식별번호 5이고, 여기서 X_λ는 S이고, n=3이고,
IgG Fc 영역이 서열식별번호 6과 서열식별번호 7의 이량체를 포함하고,
X₀의 N 말단 아미노산이 서열식별번호 7의 C-말단 아미노산에 융합되어 있는 것인
화합물.
제12항에 있어서,
X₀이 서열식별번호 5이고, 여기서 X_λ는 S이고, n=3이고,
IgG Fc 영역이 서열식별번호 8과 서열식별번호 9의 이량체를 포함하고,
X₀의 N 말단 아미노산이 서열식별번호 9의 C-말단 아미노산에 융합되어 있는 것인
화합물.
제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X₀이 서열식별번호 5이고, 여기서 X_λ는 S이고, n=1인 화합물.
제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 서열식별번호 4, 서열식별번호 10, 서열식별번호 11, 서열식별번호 12, 서열식별번호 13, 서열식별번호 14, 서열식별번호 15, 서열식별번호 16, 서열식별번호 17, 서열식별번호 18 및 서열식별번호 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 화합물.
서열식별번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 화합물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
천연 인간 NRG4의 HER4 결합 관련 활성보다 더 큰 HER4 결합 관련 활성을 갖고,
천연 인간 NRG1의 최대 활성의 적어도 70%인 천연 인간 NRG1의 최대 활성을 갖는
화합물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, HER3 결합 관련 활성이 없는 것인 화합물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물, 및
제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제
를 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 펌프 장치.
HFrEF 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 NRG4 화합물을 상기 NRG4 화합물의 치료상 효과적인 혈청 농도를 제공하기에 충분한 양으로 24-96시간 동안 투여하는 단계를 포함하는, HFrEF 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 HFrEF를 치료 또는 예방하는 방법.
제22항에 있어서, 효능:투여 비가 약 2 내지 약 50 범위인 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 NRG4 화합물을 24-96시간 동안 연속 피하 주입에 의해 Q3M으로 투여하는 것인 방법.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRG4 화합물을 패치 펌프에 의해 투여하는 것인 방법.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 적어도 1년 동안 계속 진행되는 것인 방법.
제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, LVEF를 유의하게 증가시키는 방법.
제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, GLS를 유의하게 감소시키는 방법.
제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, LVEDV를 유의하게 개선시키는 방법.
제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, CV 사망 위험을 유의하게 감소시키는 방법.
제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, HF 관련 입원 위험을 유의하게 감소시키는 방법.
제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 NYHA II 또는 III 심부전을 앓는 것인 방법.
제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRG4 화합물이 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 NRG4 화합물인 방법.
HFrEF를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 NRG4 화합물.
제34항에 있어서, 24-96시간 동안 연속 피하 주입에 의해 Q3M으로 투여되는 NRG4 화합물.
제34항 또는 제35항에 있어서, 효능:투여 비가 약 2 내지 약 50 범위인 NRG4 화합물.
제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 패치 펌프에 의해 투여되는 NRG4 화합물.
제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 NYHA II 또는 III 심부전을 앓는 것인 NRG4 화합물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, HFrEF를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 NRG4 화합물이며, 48-96시간 동안 투여되는 NRG4 화합물.