KR20230042291A - Fgfr1/klb 표적화 효능작용 항원-결합 단백질 및 그와 glp-1r 효능작용 펩티드의 접합체 - Google Patents

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Abstract

개선된 물리화학적 특성을 갖는 FGFR1/KLB 표적화 효능적 항원 결합 단백질 또는 이의 단편이 본원에서 제공된다. 또한 FGFR1/KLB 표적화 효능적 항원 결합 단백질 또는 이의 단편, 및 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드를 포함하는 접합체가 본원에서 제공된다. 본원에 제공된 항체(또는 이의 단편) 또는 접합체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 의약에서의 항체(또는 이의 단편)의 용도, 또는 접합체의 용도가 추가로 제공된다.

Description

FGFR1/KLB 표적화 효능작용 항원-결합 단백질 및 그와 GLP-1R 효능작용 펩티드의 접합체
개선된 물리화학적 특성을 갖는 FGFR1/KLB 표적화 효능적 항원 결합 단백질 또는 이의 단편이 본원에서 제공된다. 또한 FGFR1/KLB 표적화 효능적 항원 결합 단백질 또는 이의 단편, 및 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드를 포함하는 접합체가 본원에서 제공된다. 본원에 제공된 항체(또는 이의 단편) 또는 접합체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 의약에서의 항체(또는 이의 단편)의 용도, 또는 접합체의 용도가 추가로 제공된다.
FGF21 리간드 활성을 모방하는 섬유아세포 성장 인자-21(FGF21) 유사체 및 FGF21 수용체 효능제(FGF21RA)는, 인슐린 감수성을 개선하고 간지방증을 완화하며 체중 감소를 촉진하는 항비만 및 항당뇨 분자의 새로운 "FGF21 계열"을 구성한다. FGF21 유사체, 및 FGFR1/KLB 수용체 복합체(KLB: 베타-Klotho)를 직접 활성화하는 다른 형태의 효능제가 테스트된 바 있으며, 비만 및 비만 관련 합병증 완화 가능성이 있는 것으로 나타났다.
예를 들어, 당뇨병 마우스 및 비인간 영장류에서, 재조합 FGF21의 투여는 인슐린 감수성을 강력하게 향상시키고, 혈장 포도당 및 트리글리세리드 수치를 감소시키며, 체중을 감소시킨다(Zhang and Li, Drug Discov Today, 19 (5), 579-89 May 2014). 이러한 기대되는 전임상 결과는 최초의 개념 증명 임상 시험에서 인간에 적용될 수 있으며(Gaich et al., Cell Metab 18(3): 333-340. 2013, Dong et al., Br J Clin Pharmacol 80(5): 1051-1063. 2015, Talukdar et al., Cell Metab 23(3): 427-440. 2016, Charles et al., Obesity (Silver Spring) 27(1): 41-49. 2019, Sanyal et al., Lancet 392(10165): 2705-2717. 2019), 당뇨병, 비만, 및 비알코올성 지방간염(NASH) 치료를 위한 잠재적인 치료제로서 FGF21에 대한 상당한 기대를 높이고 있다.
지난 10년 동안, FGF21 유사 신호전달을 유도하는 효능적 결합제로 작용하는 항체가 확인되었다. 예를 들어, WO 2011/071783 A1은 인간 FGFR1/KLB 수용체 복합체에 결합하고 FGF21 유사 신호전달을 유도하는 단일클론 항체(mAb), 예를 들어 16H7로 표기되는 항체의 고처리량 스크리닝을 개시한다. 도 1은 16H7의 중쇄 및 경쇄 서열을 나타낸다.
실시예 섹션에 기술된 연구에서, 16H7의 안정성과 같은 물리화학적 특성을 분석하였다(실시예 섹션 참조). 16H7로 표기되는 항체는 항체에 열 스트레스를 가한 후 감소된 활성 및 친화도를 보이는 것으로 나타났다(도 2 참조).
인간 FGFR1c/KLB 수용체 복합체와 같은 FGFR1/KLB 수용체 복합체에 결합하는 효능적 단일클론 항체가 필요하다. 구체적으로, FGFR1/KLB 수용체 복합체에 대한 결합을 유지하면서 개선된 안정성을 갖는 효능적 단일클론 항체가 필요하다. 특히, 이러한 항체는 항체 16H7의 바람직한 활성 및 특이성을 유지해야 한다.
GIP 및 GLP-1은 경구 포도당 유발검사에 대한 인슐린 반응의 70%를 넘게 차지하는 인크레틴 효과를 설명하는 두 가지 장 내분비 세포-유래 호르몬이다(Baggio et al., Gastroenterology 2007, 132, 2131). GLP-1(글루카곤 유사 펩티드 1)은 음식 섭취에 반응하여 장 상피 내분비 L-세포에서 생성되는 30-아미노산 펩티드이다. 글루카곤 유사 펩티드-1 수용체(GLP-1R) 효능제는 인간에게 효과적인 포도당과 체중 감소를 제공한다.
WO 2011/089203 A1, WO 2014/037373 A1, 및 WO 2018/115401 A1은 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH), 및/또는 죽상동맥경화증과 같은 질환/장애의 치료 결과가 우수한, FGF21 및 GLP-1R 효능제, 또는 FGF21 화합물 및 GLP-1R 효능제를 포함하는 융합 분자의 병용 투여를 개시한다.
GLP-1 수용체 및 FGFR1/KLB 수용체 복합체에 효능작용을 결합하는 하이브리드 분자 설계는 시판 GLP-1R 효능제(리라글루티드 및 세마글루티드) 또는 FGF21 유사체 및 FGF1R 효능제 단독과 비교하여, 훨씬 더 나은 혈당 수치 감소, 향상된 인슐린 감수성, 및 훨씬 더 뚜렷한 체중 감소 효과를 달성할 수 있는 치료 가능성을 제공한다.
GLP-1R 효능적 펩티드를 단독으로 사용하거나 다른 활성 약제학적 성분과 함께 사용하면 단점이 있을 수 있다.
GLP-1R 효능적 펩티드는 매우 낮은 혈장 수준에서 이미 약제학적으로 효과적이다. 더 높은 혈장 수준에서, 본래의 GLP-1(내인성 GLP-1R 효능제)은 오심과 구토를 유발하는 등 부정적인 위장관 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 대조적으로, GLP-1R 효능적 펩티드와 조합될 수 있는 다른 활성 약제학적 성분, 예를 들어 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21) 화합물의 약리적 효과는 대개, 약리적 효과를 발휘하는 GLP-1의 혈장 수준보다 더 높은 혈장 수준에서 관찰된다. 종합하면, 이것은 GLP-1R 효능적 펩티드를 단독으로 투여하거나 다른 활성 약제학적 성분과 조합하여, 예를 들어 FGF21 화합물 및 GLP-1R 효능적 펩티드를 투여할 때 GLP-1 매개 역효과의 위험을 나타낸다.
따라서, 이상적인 방식으로 두 약리학적 표적을 다루기 위해 다른 활성 화합물과 융합하기 위해서는 최적화된(감소된) 효능 활성을 갖는 GLP-1 수용체 효능제가 필요하다. 또한, GLP-1 유사 구조는 예를 들어 디펩티딜 펩티다제-4(DPP4)에 의해 분해되기 쉽기 때문에, 생체내 반감기가 상당히 더 긴 항체 또는 항체의 Fc 부분에 대한 GLP-1 유사 펩티드의 공유 융합은 더 이상 이상적 비율이 아닌 GLP-1R 및 FGFR1/KLB 수용체 복합체를 다루는 종의 혈장 수준의 불균형을 유발할 수 있다.
따라서, 두 효능 활성이 균형을 이루는 mAb 융합의 긴 반감기를 보장하기 위해 혈장 프로테아제에 내성이 있는 GLP-1R 효능적 펩티드 서열이 필요하다.
FGFR1/KLB 효능적 항원 결합 단백질 및 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드를 포함하는 접합체가 필요하다. 특히, 항체에 융합되었을 때 충분한 활성을 유지하고, FGFR1/KLB 수용체 복합체에 대한 FGFR1/KLB 효능적 항원 결합 단백질의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으며, 혈장 프로테아제, 예를 들어 DPP4에 의한 효소적 분해에 대해 잠재적으로 안정화되는, GLP-1 수용체 펩티드 효능제를 포함하는 접합체가 필요하다. 또한, 이러한 접합체에 사용될 수 있는 개선된 안정성을 갖는 효능적 단일클론 항체가 필요하다.
전술한 바와 같이,
A) 인간 FGFR1c/KLB 수용체 복합체와 같은 FGFR1/KLB 수용체 복합체에 결합하는 효능적 단일클론 항체로서, FGFR1/KLB 수용체 복합체에 대한 결합을 유지하면서 개선된 안정성을 갖는 항체에 대한 필요성, 및
B) FGFR1/KLB 효능적 항원 결합 단백질 및 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드를 포함하는 접합체에 대한 필요성이 있다.
FGFR1/KLB 수용체 복합체에 결합하고 개선된 안정성을 갖는 효능적 단일클론 항체가 본원에 제공된다. 제공된 항체는 아래 섹션 A에 더 자세히 설명되어 있다. 항원 결합 단백질에 대한 추가 정보는 "본 발명의 상세한 설명"에서 또한 확인할 수 있다(섹션 A를 다시 참조).
FGFR1/KLB 효능적 항원 결합 단백질 및 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드를 포함하는 접합체가 본원에 추가로 제공된다. 제공된 접합체는 아래 섹션 B에 더 자세히 설명되어 있다. 접합체에 대한 추가 정보는 "본 발명의 상세한 설명"에서 확인할 수 있다(섹션 B를 다시 참조).
섹션 A) FGFR1/KLB 수용체 복합체에 결합하고 개선된 안정성을 갖는 효능적 단일클론 항체
실시예 섹션에 기술된 연구에서, 16H7의 안정성에 영향을 미치는 16H7 내의 아미노산 잔기를 확인하였다. 또한, 16H7에 비해 개선된 안정성을 갖는 재설계된 항체를 생성하였다. 유리하게는, 재설계된 항체는 16H7의 바람직한 활성 및 특이성을 유지하였다. 따라서, 재설계된 항체는 안정적이고 FGFR1c/KLB 수용체 복합체를 표적화하는 효능적 단일클론 항체에 대한 당업계의 요구를 해결한다.
구체적으로, 감소된 안정성과 관련된 16H7의 경쇄 및/또는 중쇄의 CDR 내의 아미노산 잔기가 확인하였다. 16H7의 아미노산 서열은 도 1에 표시되어 있다. 16H7의 중쇄는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 16H7의 경쇄는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
예를 들어, 16H7의 중쇄(서열번호 1로 표시)에 존재하는 아미노산 잔기 M34 및 D109(표 C 참조)는 감소된 안정성과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. M34는 16H7의 중쇄 CDR1에 존재하는 아미노산이다. D109는 16H7의 중쇄 CDR3에 존재하는 아미노산이다.
예를 들어, 16H7의 경쇄(서열번호 2로 표시)에 존재하는 아미노산 잔기 N25 D49, D50, D91, 및 N93(표 C 참조)은 감소된 안정성과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. N25는 16H7의 경쇄 CDR1에 존재하는 아미노산이다. D49 및 D50은 16H7의 경쇄 CDR2에 존재하는 아미노산이다. N93은 16H7의 경쇄 CDR3에 존재하는 아미노산이다.
이에 따라, 단일클론 항체 16H7과 비교하여 개선된 안정성을 갖는 항원 결합 단백질이 본원에 제공된다. 항원 결합 단백질은 16H7과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함해야 한다. 유리하게는, 중쇄의 M34, 중쇄의 D109, 경쇄의 N25, 경쇄의 D49, 경쇄의 D50, 경쇄의 D91, 및 경쇄의 N93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 16H7의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 치환된다. 일부 구현예에서, 상기 아미노산 잔기 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 전부가 돌연변이된다.
상기 아미노산 잔기 외에도, 16H7의 추가 아미노산 잔기가 또한 치환될 수 있다. 경쇄 및 중쇄에서 16H7의 CDR의 모든 아미노산을 확인하였다. 16H7의 모든 CDR 위치를 20개의 모든 천연 아미노산을 사용하여 단일 점 돌연변이에 의해 변경하였다. 생성된 항체를 재조합적으로 발현시켰다. 16H7 야생형(변이되지 않음)으로 정규화된 상대 발현 값, EC50 값, 및 Emax 값을 측정하였다(도 4, 표 D1 및 D2 참조). 16H7 아미노산 잔기의 많은 위치에서, 돌연변이 항체의 활성에 영향을 미치지 않으면서 자연 발생 아미노산 잔기와 같은 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있는 것으로 나타났다(즉, 이러한 위치에 치환된 아미노산 잔기를 갖는 항체는 16H7과 본질적으로 동일한 활성을 가짐). 일부 치환은 발현 수준과 같은 선택된 특징의 개선을 가능하게 했다(표 D1 및 D2 참조).
그러나, 16H7의 CDR 내의 일부 아미노산 잔기의 치환은 16H7의 중쇄의 아미노산 잔기 G35, F54, E58, S60, G104 및 Y108의 치환(표 D2), 및 경쇄의 D95의 치환(표 D1)과 같이, 16H7과 비교하여 조절된 활성, 예컨대 감소된 활성을 갖는 항체를 생성하였다. 이에 따라, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 16H7의 중쇄의 아미노산 잔기 G35, F54, E58, S60, G104 및 Y108, 및 경쇄의 아미노산 잔기 D95에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 고려된다. 따라서, 상기 아미노산 잔기는 돌연변이되어서는 안 된다. 즉 치환 또는 결실되어서는 안 된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 3개의 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 및 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은
a) 하기 a1) 또는 a2)를 포함하는 중쇄 CDR1:
a1) NARXHC34XHC35VS(서열번호 3)(XHC34는 M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T이고, XHC35는 G임), 또는
a2) 상기 중쇄 CDR1과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC34 및 XHC35 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), a1)의 중쇄 CDR1의 변이체,
b) 하기 b1) 또는 b2)를 포함하는 중쇄 CDR2:
b1) HIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKS(서열번호 6)(XHC54는 F이고, XHC58은 E이고, XHC60은 S임), 또는
b2) 상기 중쇄 CDR2와 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC54, XHC58, 및 XHC60 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), b1)의 중쇄 CDR2의 변이체,
c) 하기 c1) 또는 c2)를 포함하는 중쇄 CDR3:
c1) SVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 8)(XHC109는 D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H이고, XHC102는 V이고, XHC104는 G이고, XHC108은 Y임), 또는
c2) 상기 중쇄 CDR3과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), c1)의 중쇄 CDR3의 변이체,
d) 하기 d1) 또는 d2)를 포함하는 경쇄 CDR1:
d1) GGXLC25NIGSESVH(서열번호 11)(XLC25는 N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M임), 또는
d2) 상기 경쇄 CDR1과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC25 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), d1)의 경쇄 CDR1의 변이체,
e) 하기 e1) 또는 e2)를 포함하는 경쇄 CDR2:
e1) XLC49XLC50SDRPS(서열번호 14)(XLC49는 D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I이고, XLC50은 D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y임), 또는
e2) 상기 경쇄 CDR2와 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC49 및 XLC50 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), e1)의 경쇄 CDR2의 변이체,
및/또는
f) 하기 f1) 또는 f2)를 포함하는 경쇄 CDR3:
f1) QVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 19)(XLC91은 D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K이고, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F이고, XLC95는 D임), 또는
f2) 상기 경쇄 CDR3과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), f1)의 경쇄 CDR3의 변이체,
을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은
a) NARXHC34XHC35VS(서열번호 3)(XHC34는 M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T이고, XHC35는 G임)를 포함하는 중쇄 CDR1,
b) HIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKS(서열번호 6)(XHC54는 F이고, XHC58은 E이고, XHC60은 S임)를 포함하는 중쇄 CDR2,
c) SVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 8)(XHC109는 D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H이고, XHC102는 V이고, XHC104는 G이고, XHC108은 Y임)를 포함하는 중쇄 CDR3,
d) GGXLC25NIGSESVH(서열번호 11)(XLC25는 N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M임)를 포함하는 경쇄 CDR1,
e) XLC49XLC50SDRPS(서열번호 14)(XLC49는 D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I이고, XLC50은 D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y임)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는
f) QVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 19)(XLC91은 D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K이고, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F이고, XLC95는 D임)를 포함하는 경쇄 CDR3
을 포함한다.
일부 구현예에서, XHC34는 V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T, 예컨대 V이다.
일부 구현예에서, XHC109는 E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H, 예컨대 E이다.
일부 구현예에서, XLC25는 S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M, 예컨대 S이다.
일부 구현예에서, XLC49는 S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I, 예컨대 S 또는 E이다. 예를 들어, XLC49는 S일 수 있다.
일부 구현예에서, XLC50은 E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y, 예컨대 E 또는 A이다. 예를 들어, XLC50은 E일 수 있다.
일부 구현예에서, XLC91은 E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K, 예컨대 E이다.
일부 구현예에서, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F, 예컨대 E이다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질의 일부 구현예에서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S 또는 E이고, XLC50은 E 또는 A이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E이다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질의 일부 구현예에서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S이고, XLC50은 E이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E이다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, SESDRPS(서열번호 15)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, SASDRPS(서열번호 16)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, EESDRPS(서열번호 17)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은
i) 하기 i1) 또는 i2)를 포함하는 중쇄 가변 영역:
i1) GFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 21)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 22, 23, 또는 24로 표시되는 아미노산 서열, 또는
i2) i1)에 따른 서열의 변이체로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) 하기 ii1) 또는 ii2)를 포함하는 경쇄 가변 영역:
ii1) GGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 25)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 26, 27, 또는 28로 표시되는 아미노산 서열, 또는
ii2) ii1)에 따른 서열의 변이체로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은
i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 29)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 예컨대 서열번호 30, 31, 또는 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는
상기 중쇄 가변 영역의 변이체로서, 상기 중쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV FGGGTKLTVL(서열번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 예컨대 34, 35, 또는 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
상기 경쇄 가변 영역의 변이체로서, 상기 경쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음)
를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은
i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(서열번호 37)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 38, 39, 40, 41, 42, 또는 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는
상기 중쇄의 변이체로서, 상기 중쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호 44)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 상기 경쇄의 변이체로서, 상기 경쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음)
를 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 제공된 항원 결합 단백질은 β-Klotho에, 또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에, 또는 β-Klotho와 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체 둘 다에 결합한다. 일부 구현예에서, 제공된 항원 결합 단백질은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합한다.
일 구현예에서, 제공된 항원 결합 단백질은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체를 활성화한다.
유리하게는, 제공된 항원 결합 단백질은 단일클론 항체와 같은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일 구현예에서, 항체는 2가 항체이다. 또한, 항원 결합 단편은 2가 항원 결합 단편인 것으로 고려된다.
섹션 B) FGFR1/KLB 효능적 항원 결합 단백질 및 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드를 포함하는 접합체.
전술한 바와 같이, 본 발명의 목적은 GLP-1R 효능적 펩티드 및 항-FGFR1/KLB 효능적 단일클론 항체의 접합체를 제공하는 것이다. 이러한 접합체는 잠재적인 역효과(예를 들어, 오심 및/또는 구토 등)를 피하면서 두 활성제의 (예를 들어, 체중, 지질, 및/또는 혈당 조절 등의 측면에서) 유익한 효과를 달성하기 위해 FGFR1/KLB 항원 결합 단백질의 효능 활성에 대한 GLP-1R 효능제의 효능 활성의 균형 잡힌 비율을 가져야 한다. 또한, 이러한 접합체는 안정해야 한다.
이에 따라, GLP-1R 효능적 펩티드 및 항-FGFR1/KLB 효능적 항원 결합 단백질의 접합체가 본원에 제공된다. 접합체는 β-Klotho에 및/또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합하는 항원 결합 단백질로서 적어도 하나의 GLP-1 펩티드에 접합된 항원 결합 단백질을 포함해야 한다.
본원에 제공된 접합체에 포함될 수 있는 GLP-1R 효능적 펩티드는 섹션 "GLP-1R 효능적 펩티드"(섹션 B1)에 개시되어 있다. 본원에 제공된 접합체에 포함될 수 있는 항원 결합 단백질은 섹션 "항원 결합 단백질"(섹션 B2)에 기술되어 있다. 접합체에 대한 더 자세한 내용은 섹션 B3에서 확인할 수 있다.
섹션 B1: GLP-1R 효능적 펩티드
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
X1-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-X12-X13-X14X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-X24W-L-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X40-X41-X42(서열번호 59)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X1은 H, Y, 또는 F이고,
X10은 K 또는 L이고,
X12는 K, I, Q, 또는 E이고,
X13은 Q 또는 L이고,
X14는 L 또는 C이고,
X15는 E, A, 또는 D이고,
X16은 E, K, 또는 S이고,
X17은 E, R, 또는 Q이고,
X18은 L, A, 또는 R이고,
X19는 V, A, F, 또는 Q이고,
X20은 R, H, Q, K, 또는 I이고,
X21은 L, E, H, 또는 R이고,
X23은 I, Y, 또는 F이고,
X24는 E, A, L, 또는 Y이고,
X27은 I, L, K, V, 또는 E이고,
X28은 A, K, N, 또는 E이고,
X29는 G, T, K, V, 또는 부재이고,
X30은 G, R, 또는 부재이고,
X31은 P, H, 또는 부재이고,
X32는 S, K, V, 또는 부재이고,
X33은 S, K, 또는 부재이고,
X34는 G, I, Q, 또는 부재이고,
X35는 A, K, R, E, 또는 부재이고,
X36은 P, L, Y, 또는 부재이고,
X37은 P, S, 또는 부재이고,
X38은 P 또는 부재이고,
X39는 S, E, K, 또는 부재이고,
X40은 P, S, G, 또는 부재이고,
X41은 G 또는 부재이고,
X42는 C 또는 부재이고;
임의로, 아미노산 서열은 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 추가로 포함한다.
상기 서열에서, 아미노산 잔기 X29 내지 X42는 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 아미노산 잔기 X29 내지 X42는 모두 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 아미노산 잔기 X31 내지 X42는 모두 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 아미노산 잔기 X38 내지 X42는 모두 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 아미노산 잔기 X40 내지 X42는 모두 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 아미노산 잔기 X41 내지 X42는 모두 존재하지 않는다.
상기 서열에서, X14 및 X42가 Cys인 경우, 두 시스테인의 측쇄는 결합되지 않은 상태이거나 다른 시스테인 측쇄와 이황화 가교를 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, X14 및 X42 위치의 두 시스테인 잔기의 측쇄는 분자내 이황화 가교를 형성한다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
H-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-X12-Q-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-I-X24-W-L-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X40-X41-X42(서열번호 60)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X10은 K 또는 L이고,
X12는 K 또는 I이고,
X14는 L 또는 C이고,
X15는 E 또는 D이고,
X16은 E 또는 K이고,
X17은 E 또는 R이고,
X18은 L, A, 또는 R이고,
X19는 V 또는 Q이고,
X20은 R, H, 또는 Q이고,
X21은 L 또는 E이고,
X23은 I, Y, 또는 F이고,
X24는 E, A, 또는 Y이고,
X27은 I, L, K, V, 또는 E이고,
X28은 A 또는 K이고,
X29는 G, T, 또는 부재이고,
X30은 G, R, 또는 부재이고,
X31은 P, H, 또는 부재이고,
X32는 S, K, V, 또는 부재이고,
X33은 S, K, 또는 부재이고,
X34는 G, I, Q, 또는 부재이고,
X35는 A, K, R, E, 또는 부재이고,
X36은 P, L, Y, 또는 부재이고,
X37은 P, S, 또는 부재이고,
X38은 P 또는 부재이고,
X39는 S, E, K, 또는 부재이고,
X40은 P, S, G, 또는 부재이고,
X41은 G 또는 부재이고,
X42는 C 또는 부재이고;
임의로, 아미노산 서열은 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 추가로 포함한다.
상기 서열에서, 아미노산 잔기 X29 내지 X42는 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 아미노산 잔기 X29 내지 X42는 모두 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 아미노산 잔기 X31 내지 X42는 모두 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 아미노산 잔기 X38 내지 X42는 모두 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 아미노산 잔기 X40 내지 X42는 모두 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 아미노산 잔기 X41 내지 X42는 모두 존재하지 않는다.
상기 서열에서, X14 및 X42가 Cys인 경우, 두 시스테인의 측쇄는 결합되지 않은 상태이거나 다른 시스테인 측쇄와 이황화 가교를 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, X14 및 X42 위치의 두 시스테인 잔기의 측쇄는 분자내 이황화 가교를 형성한다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
H-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-K-Q-L-E-E-E-A-V-X20-L-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-K-K-I-R-Y-S(서열번호 51)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X10은 K 또는 L이고,
X20은 Q 또는 R이고,
아미노산 서열은 N-말단에 추가 아미노산 잔기로서 글리신을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
H-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-K-Q-L-E-E-E-A-V-X20-L-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S(서열번호 52)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X10은 K 또는 L이고,
X20은 Q 또는 R이고,
아미노산 서열은 N-말단에 추가 아미노산 잔기로서 글리신을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
H-G-E-G-T-F-T-S-D-K-S-K-Q-L-E-K-R-L-V-R-L-F-I-X24-W-L-I-A-G-G-H-S-S-G-K-P-P-P-K(서열번호 53)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X24는 Y 또는 L이다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-X12-X13-C-E-X16-X17-X18-V-X20-X21-F-I-E-W-L-X27-A-X29-G-P-S-S-G-K-P-P-P-K-P-G-C(서열번호 54)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X12는 K 또는 I이고,
X13은 Q 또는 L이고,
X16은 E 또는 K이고,
X17은 E 또는 R이고,
X18은 R 또는 A이고,
X20은 Q 또는 H이고,
X21은 L 또는 E이고,
X27은 K 또는 I이고,
X29는 T 또는 G이고,
X14 및 X42의 두 시스테인의 측쇄는 분자내 이황화 가교를 형성한다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
H-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-K-Q-L-E-E-E-A-V-X20-L-F-I-A-W-L-V-K(서열번호 55)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X10은 K 또는 L이고,
X20은 Q 또는 R이고,
아미노산 서열은 N-말단에 추가 아미노산 잔기로서 글리신을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
X1-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-X12-X13-L-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-E-W-L-X27-X28-X29-G(서열번호 61)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X1은 H, Y, 또는 F이고,
X10은 K 또는 L이고,
X12는 K, I, 또는 Q이고,
X13은 Q 또는 L이고,
X15는 E, A, 또는 D이고,
X16은 E, K, 또는 S이고,
X17은 E, R, 또는 Q이고,
X18은 L, A, 또는 R이고,
X19는 V, A, 또는 F이고,
X20은 R, H, Q, K, 또는 I이고,
X21은 L, E, H, 또는 R이고,
X23은 I, Y, 또는 F이고,
X27은 I, L, K, 또는 E이고,
X28은 A, K, N, 또는 E이고,
X29는 G, T, K, 또는 V이고;
임의로, 아미노산 서열은 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 추가로 포함하고;
임의로, 아미노산 서열은 C-말단에 최대 약 12개, 약 11개, 또는 약 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연장을 추가로 포함한다. 일 구현예서, 펩티드 연장은 아미노산 서열 PSSGAPPPS(서열번호 63) 또는 PKKIRYS(서열번호 64)를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
H-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-K-Q-L-E-E-E-X18-V-X20-L-F-I-E-W-L-K-A-X29-G(서열번호 62)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X10은 K 또는 L이고,
X18은 A 또는 R이고,
X20은 R 또는 Q이고,
X29는 G 또는 T이고;
임의로, 아미노산 서열은 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 추가로 포함하고;
임의로, 아미노산 서열은 C-말단에 최대 약 12개, 약 11개, 또는 약 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연장을 추가로 포함한다. 일 구현예서, 펩티드 연장은 아미노산 서열 PSSGAPPPS(서열번호 63) 또는 PKKIRYS(서열번호 64)를 포함하거나 이로 이루어진다.
상기 펩티드의 일 구현예에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 G 또는 A이다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 단일 아미노산 잔기이다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 G이다.
본원에 제공된 접합체에 사용될 수 있는 적합한 펩티드는 실시예 섹션의 표 A3에 개시되어 있다. 일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 실시예 섹션(예를 들어, 표 A3 참조)에 개시된 펩티드 ID P001 내지 P041로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 실시예 섹션(예를 들어, 표 A3 참조)에 개시된 펩티드 ID P005 내지 P041로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 실시예 섹션(예를 들어, 표 A3 참조)에 개시된 펩티드 ID P005 내지 P022, P024 및 P026, 및 P35 내지 P041로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 실시예 섹션(예를 들어, 표 A3 참조)에 개시된 펩티드 ID P005 내지 P017, P019 내지 P022, P027, P029, 및 P038로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P005, P010, P019, P020, P026, P028 내지 P032, 및 P036 내지 P038로부터 선택된 펩티드의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P001의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P002의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P003의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P004의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P005의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P006의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P007의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P008의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P009의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P010의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P011의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P012의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P013의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P014의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P015의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P016의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P017의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P018의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P019의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P020의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P021의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P022의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P023의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P024의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P025의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P026의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P027의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P028의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P029의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P030의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P031의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P032의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P033의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P034의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P035의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P036의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P037의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P038의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P039의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P040의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 펩티드 ID P041의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
섹션 B1: 본원에 제공된 접합체에 포함된 항원 결합 단백질
본원에 제공된 접합체는 β-Klotho에 및/또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합하는 항원 결합 단백질 또는 이의 단편을 포함해야 한다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 β-Klotho에 및/또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다.
항원 결합 단백질은 효능적 항원 결합 단백질이어야 한다. 이에 따라, 항원 결합 단백질은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체를 활성화시켜야 한다. 즉 FCF21 수용체 FGFR1c를 활성화한다.
따라서, 항원 결합 단백질은 i) β-Klotho에 및/또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합하고, ii) β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체를 활성화하는 임의의 항원 결합 단백질일 수 있다.
이러한 항원 결합 단백질은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 WO 2011/071783 A1에 개시되어 있고, 이는 전체 개시 내용과 관련하여 본원에 참조로 포함된다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 접합체에 포함된 항원 결합 단백질은 WO 2011/071783 A1에 개시된 16H7, 17C3, 22H5, 39F7, 24H11, 18G1, 17D8, 26H11, 12E4, 12C11, 21H2, 21B4, 18B11.1, 18B11.2, 20D4, 46D11, 40D2, 37D3, 39F1, 또는 39G5로 이루어진 항체의 군으로부터 선택되는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 16H7, 17C3, 또는 39F7, 이의 항원 결합 단편이다.
일 구현예에서, 접합체는 항원 결합 단백질을 포함하고, 항원 결합 단백질은 16H7에 비해 안정성이 향상된 16H7의 변이체이다. 실시예 섹션에 기술된 연구에서, 16H7의 안정성에 영향을 미치는 16H7 내의 아미노산 잔기를 확인하였다. 또한, 16H7에 비해 개선된 안정성을 갖는 재설계된 항체를 생성하였다. 유리하게는, 재설계된 항체는 16H7의 바람직한 활성 및 특이성을 유지하였으므로, GLP-1R 효능적 펩티드, 예컨대 실시예 섹션에 기재된 GLP-1R 효능적 펩티드에 융합될 수 있다.
개선된 안정성을 갖는 단일클론 항체와 같은 항원 결합 단백질은 섹션 A)에 "FGFR1/KLB 수용체 복합체에 결합하고 개선된 안정성을 갖는 효능적 단일클론 항체"라는 제목으로 기술되어 있다. 일 구현예에서, 접합체는 섹션 A에 제공된 항원 결합 단백질을 포함한다. 따라서, 본원에 제공된 접합체는 섹션 A에 정의된 항원 결합 단백질로서 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합된 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에 제공된 접합체는 3개의 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은
a) 하기 a1) 또는 a2)를 포함하는 중쇄 CDR1:
a1) NARXHC34XHC35VS(서열번호 3)(XHC34는 M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T이고, XHC35는 G임), 또는
a2) 상기 중쇄 CDR1과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC34 및 XHC35 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), a1)의 중쇄 CDR1의 변이체,
b) 하기 b1) 또는 b2)를 포함하는 중쇄 CDR2:
b1) HIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKS(서열번호 6)(XHC54는 F이고, XHC58은 E이고, XHC60은 S임), 또는
b2) 상기 중쇄 CDR2와 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC54, XHC58, 및 XHC60 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), b1)의 중쇄 CDR2의 변이체,
c) 하기 c1) 또는 c2)를 포함하는 중쇄 CDR3:
c1) SVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 8)(XHC109는 D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H이고, XHC102는 V이고, XHC104는 G이고, XHC108은 Y임), 또는
c2) 상기 중쇄 CDR3과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), c1)의 중쇄 CDR3의 변이체,
d) 하기 d1) 또는 d2)를 포함하는 경쇄 CDR1:
d1) GGXLC25NIGSESVH(서열번호 11)(XLC25는 N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M임), 또는
d2) 상기 경쇄 CDR1과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC25 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), d1)의 경쇄 CDR1의 변이체,
e) 하기 e1) 또는 e2)를 포함하는 경쇄 CDR2:
e1) XLC49XLC50SDRPS(서열번호 14)(XLC49는 D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I이고, XLC50은 D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y임), 또는
e2) 상기 경쇄 CDR2와 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC49 및 XLC50 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), e1)의 경쇄 CDR2의 변이체,
및/또는
f) 하기 f1) 또는 f2)를 포함하는 경쇄 CDR3:
f1) QVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 19)(XLC91은 D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K이고, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F이고, XLC95는 D임), 또는
f2) 상기 경쇄 CDR3과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), f1)의 경쇄 CDR3의 변이체,
을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은
a) NARXHC34XHC35VS(서열번호 3)(XHC34는 M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T이고, XHC35는 G임)를 포함하는 중쇄 CDR1,
b) HIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKS(서열번호 6)(XHC54는 F이고, XHC58은 E이고, XHC60은 S임)를 포함하는 중쇄 CDR2,
c) SVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 8)(XHC109는 D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H이고, XHC102는 V이고, XHC104는 G이고, XHC108은 Y임)를 포함하는 중쇄 CDR3,
d) GGXLC25NIGSESVH(서열번호 11)(XLC25는 N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M임)를 포함하는 경쇄 CDR1,
e) XLC49XLC50SDRPS(서열번호 14)(XLC49는 D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I이고, XLC50은 D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y임)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는
f) QVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 19)(XLC91은 D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K이고, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F이고, XLC95는 D임)를 포함하는 경쇄 CDR3
을 포함한다.
일부 구현예에서, XHC34는 V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T, 예컨대 V이다.
일부 구현예에서, XHC109는 E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H, 예컨대 E이다.
일부 구현예에서, XLC25는 S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M, 예컨대 S이다.
일부 구현예에서, XLC49는 S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I, 예컨대 S 또는 E이다. 예를 들어, XLC49는 S일 수 있다.
일부 구현예에서, XLC50은 E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y, 예컨대 E 또는 A이다. 예를 들어, XLC50은 E일 수 있다.
일부 구현예에서, XLC91은 E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K, 예컨대 E이다.
일부 구현예에서, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F, 예컨대 E이다.
항원 결합 단백질의 일부 구현예에서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S 또는 E이고, XLC50은 E 또는 A이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E이다.
항원 결합 단백질의 일부 구현예에서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S이고, XLC50은 E이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E이다.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, SESDRPS(서열번호 15)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
다른 구현예에서, 항원 결합 단백질은 NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, SASDRPS(서열번호 16)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
다른 구현예에서, 항원 결합 단백질은 NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, EESDRPS(서열번호 17)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은
i) 하기 i1) 또는 i2)를 포함하는 중쇄 가변 영역:
i1) GFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 21)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 22, 23, 또는 24로 표시되는 아미노산 서열, 또는
i2) i1)에 따른 서열의 변이체로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) 하기 ii1) 또는 ii2)를 포함하는 경쇄 가변 영역:
ii1) GGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 25)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 26, 27, 또는 28로 표시되는 아미노산 서열, 또는
ii2) ii1)에 따른 서열의 변이체로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은
i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 29)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 예컨대 서열번호 30, 31, 또는 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는
상기 중쇄 가변 영역의 변이체로서, 상기 중쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV FGGGTKLTVL(서열번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 예컨대 34, 35, 또는 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
상기 경쇄 가변 영역의 변이체로서, 상기 경쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음)
를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은
i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(서열번호 37)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 38, 39, 40, 41, 42, 또는 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는
상기 중쇄의 변이체로서, 상기 중쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호 44)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 상기 경쇄의 변이체로서, 상기 경쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음)
를 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 β-Klotho에, 또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에, 또는 β-Klotho와 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체 둘 다에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합한다.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체를 활성화한다.
유리하게는, 항원 결합 단백질은 단일클론 항체와 같은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일 구현예에서, 항체는 2가 항체이다. 또한, 항원 결합 단편은 2가 항원 결합 단편인 것으로 고려된다.
섹션 B3: 접합체
본원에 제공된 접합체에서, β-Klotho에 및/또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합하는 항원 결합 단백질, 예컨대 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 GLP-1 펩티드, 즉 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합되어야 한다. 따라서, 접합체는 항원 결합 단백질(예를 들어, 섹션 B2 또는 섹션 A 참조) 및 적어도 하나의 GLP-1 펩티드(예를 들어, 섹션 B1 참조)를 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질, 예컨대 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 1개, 2개, 3개, 또는 4개 이상의 GLP-1 펩티드, 예컨대 2개 또는 4개의 GLP-1 펩티드에 접합된다.
일 구현예에서, 접합체는 2개의 GLP-1 펩티드에 접합된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 접합체는 4개의 GLP-1 펩티드에 접합된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 접합체는 각각의 중쇄 가변 영역이 적어도 하나의 GLP-1 펩티드에 접합된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
대안적 구현예에서, 접합체는 각각의 경쇄 가변 영역이 적어도 하나의 GLP-1 펩티드에 접합된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
대안적 구현예에서, 접합체는 각각의 중쇄 가변 영역 및 각각의 경쇄 가변 영역이 적어도 하나의 GLP-1 펩티드에 접합된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 접합체는 항원 결합 단백질과 적어도 하나의 GLP-1 펩티드의 융합체이다(즉, 분자들이 펩티드 결합을 통해 연결됨). 이러한 형태의 접합체는 "융합 항체" 또는 "융합 항원 결합 단백질"이라고도 한다. 융합 항체 또는 융합 항원 결합 단백질은 숙주 세포에서 발현에 의해 생성될 수 있다.
본원에 제공된 접합체의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질과 적어도 하나의 GLP-1 펩티드는 링커를 통해, 예컨대 링커 펩티드, 예를 들어 적어도 2개 아미노산의 길이를 갖는 링커 펩티드를 통해 연결된다.
일 구현예에서, 링커 펩티드는 서열번호 65(GGGGGGGSGGGGSGGGGSA)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구현예에서, 링커 펩티드는 서열번호 66(GGGGGGGGSGGGGSGGGGSA)으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
적어도 하나의 GLP-1 펩티드는 적절한 것으로 간주되는 임의의 위치에서 항원 결합 단백질에, 예컨대 항원 결합 단백질의 적어도 하나의 경쇄 및/또는 적어도 하나의 중쇄의 N-말단에 접합될 수 있다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 GLP-1 펩티드의 C-말단은 항원 결합 단백질, 예컨대 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 접합된다.
일 구현예에서, GLP-1 펩티드는 두 경쇄의 N-말단에 접합된다.
대안적 구현예에서, GLP-1 펩티드는 두 중쇄의 N-말단에 접합된다.
다른 구현예에서, GLP-1 펩티드는 두 중쇄 및 두 경쇄의 N-말단에 접합된다.
일 구현예에서, 접합체는 표 A4에 나타낸 융합 항체로부터 선택되는 접합체이다.
일 구현예에서, 접합체는 Fu0017, Fu0018, Fu0022, Fu0028, Fu0033, Fu0034, Fu0036 내지 Fu0038, Fu0049, Fu0050, Fu0054, Fu0060, Fu0065, Fu0068 내지 Fu0070, Fu0081, Fu0082, Fu0092, Fu0097, Fu0098, Fu0100 내지 Fu0102, Fu0240, Fu0242, Fu0243, Fu0253, 및 Fu0254로 표기되는 융합 항체로부터 선택된 접합체이다.
본 발명은 다음의 요지를 추가로 제공한다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질(예를 들어, 섹션 A 참조) 또는 본원에 제공된 접합체(예를 들어, 섹션 B 참조)를 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 추가로 제공된다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 추가로 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 추가로 제공된다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오티드, 본원에 제공된 벡터 폴리뉴클레오티드, 및/또는 본원에 제공된 접합체를 포함하는 숙주 세포가 추가로 제공된다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 접합체를 생성하는 방법으로서, 상기 항원 결합 단백질의 발현이 가능한 조건에서 본원에 제공된 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법이 추가로 제공된다.
본 발명은 또한, 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공된 접합체, 또는 본원에 제공된 약제학적 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 제공된 접합체, 또는 본원에 제공된 약제학적 조성물은 예를 들어 과체중 또는 비만 대상체에서 만성 체중 관리에 사용될 수 있다.
인간과 같은 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 예를 들어 질환 또는 장애를 치료하기 위해, 상기 대상체에게 본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공된 접합체, 또는 본원에 제공된 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
추가 양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공된 접합체, 또는 본원에 제공된 약제학적 조성물은 질환 또는 장애의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 비만, 과체중, 대사 증후군, 제2형 진성 당뇨병과 같은 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH), 및/또는 죽상동맥경화증으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 비만이 치료된다.
일부 구현예에서, 대상체는 포유동물, 예컨대 영장류, 예컨대 인간이다.
도 1: Kabat에 의한 경쇄 및 중쇄의 CDR에 밑줄로 표시한, WO 2011/071783에 개시된 항-FGFR1c/KLB 단일클론 항체 16H7의 아미노산 서열(중쇄의 아미노산 서열: 서열번호 1; 경쇄의 아미노산 서열: 서열번호 2).
도 2: pH 6에서 28일 동안 40℃의 열 스트레스 후 16H7의 감소된 활성 및 친화도를 보여주는 시험관내 데이터. 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통해 측정된 (A) EC50 값 및 (B) Emax 값(데이터는 평균 ± SEM, n=6~10; *P < 0.05 vs. 0일차). (C) CM5 칩 및 Biacore 8K에서 SPR 상호작용 분석을 통해 평가된 mAb 16H7의 인간 KLB의 상호작용의 해리율(off-rate)(데이터는 평균 ± SD, n=3; *P < 0.05 vs. 0일차). (D) 루시퍼라제 유전자 리포터 분석으로 얻은 대표적인 용량-반응 곡선.
도 3: 확인된 문제 아미노산을 강조 표시한 16H7 Fab의 결정 구조.
도 4: 재조합 발현 및 생물학적 활성에 대한 단일클론 항체 16H7의 CDR 돌연변이의 영향. 16H7 경쇄 및 중쇄의 CDR에 단일 점 돌연변이를 도입하고, 항체를 현탁액에 적응된 HEK293-F 세포에서 재조합적으로 발현시켰다. (A) 발현된 항체 구성체를 포함하는 세포 상청액을 형질감염 7일 후 원심분리로 채취하고, 단백질 A 바이오센서를 사용하여 바이오-레이어 간섭법(BLI)으로 항체 발현을 정량화하였다. 16H7 야생형에 대한 상대 발현 값을 표시하였다. 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통해 단일 점 돌연변이 16H7 변이체의 세포 활성을 측정하고, 16H7 야생형으로 정규화된 (B) EC50 및 (C) Emax 값을 표시하였다.
도 5: 경쇄 및 중쇄에 다중 돌연변이가 있는 16H7 변이체의 세포 활성 및 결합 활성의 분석. FGF21 유사 신호전달을 평가하는 루시퍼라제 유전자 리포터 분석으로 단일클론 항체의 세포 활성을 분석하고, (A) 평균 EC50 값 및 (B) 평균 Emax 값을 표시하였다(평균 ± SEM, n=3~7). 인간 KLB에 대한 항체의 결합을 SPR을 통해 평가하고, (C) 해리 속도 상수(koff) 및 (D) 측정된 친화도(KD)를 표시하였다(평균 ± SEM, n=3).
도 6: 열 스트레스 후 다중 돌연변이를 갖는 최적화된 16H7 변이체의 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통한 세포 활성의 분석. 열거된 항체를 투석에 의해 교환된 5, 6, 및 8의 pH 값의 버퍼를 사용하여 1 mg/mL로 조정하고 40℃ 인큐베이터에서 최대 21일 동안 인큐베이션하였다. 대조군 샘플은 -80℃에 보관하였고, 스트레스 후 샘플도 추가 분석 전에 -80℃로 동결시켰다. 이후, FGF21 유사 신호전달을 평가하는 루시퍼라제 유전자 리포터 분석으로 샘플의 생물학적 활성을 분석하였다. 평균 EC50 값 ± SEM(n=3~4)을 표시하였다.
도 7: Biacore 8K 기기(GE Healthcare)에서의 SPR을 통한 인간 KLB에 대한 16H7 및 안정화된 16H7 변이체의 결합 분석. 상호작용 분석을 위해, 시리즈 S CM5 센서 칩(인간 항체 캡쳐 키트, GE Healthcare)에 고정된 항-인간 Fc 항체를 통해 mAb를 캡쳐하였다. 10% 비특이적 결합 감소제(GE Healthcare)를 포함한 HBS-EP+ 버퍼에 희석된 인간 KLB(R&D Systems)를 60 μL/분의 유량으로 0.78 nmol/L 내지 12.5 nmol/L의 1:2 희석 시리즈에 주입하였다. Biacore 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1.1.7442(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 결합 모델로 결합 동역학을 평가하였다. 인간 KLB와 (A) 16H7 야생형, (B) Ab0331, (C) Ab0335, (D) Ab0351, (E) Ab0428, (F) Ab0429, 및 (G) Ab0430의 상호작용에 대한 예시적인 센서그램.
도 8: Biacore 8K 기기(GE Healthcare)에서의 SPR을 통한 원숭이 KLB에 대한 16H7 및 안정화된 16H7 변이체의 결합 분석. 상호작용 분석을 위해, 시리즈 S CM5 센서 칩(인간 항체 캡쳐 키트, GE Healthcare)에 고정된 항-인간 Fc 항체를 통해 mAb를 캡쳐하였다. 10% 비특이적 결합 감소제(GE Healthcare)를 포함한 HBS-EP+ 버퍼에 희석된 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스) KLB(R&D Systems)를 60 μL/분의 유량으로 0.78 nmol/L 내지 12.5 nmol/L의 1:2 희석 시리즈에 주입하였다. Biacore 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1.1.7442(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 결합 모델로 결합 동역학을 평가하였다. 원숭이 KLB와 (A) 16H7 야생형, (B) Ab0331, (C) Ab0335, (D) Ab0351, (E) Ab0428, (F) Ab0429, 및 (G) Ab0430의 상호작용에 대한 예시적인 센서그램.
도 9: 1차 인간 내장 및 피하 지방세포에서의 16H7 및 최적화된 변이체의 세포 활성을 In-Cell Western pERK를 통해 분석하였다. (A) 1차 인간 내장 지방세포 및 (B) 피하 지방세포에서 FGF21, 16H7, 또는 변이체로 5분간 자극한 후의 ERK 인산화의 용량-반응 곡선. (C) 계산된 EC50 값을 EC50 값 평균 ± SEM(n=7)으로 표시하였다.
도 10: 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통해 평가된 다양한 Fc 백본을 갖는 16H7의 세포 활성 분석. EC50 값(평균 ± SEM, n=10)을 표시하였다.
도 11: 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통해 평가된 단일클론 항체 16H7, 이의 1가 Fab 단편(항원 결합 단편), 및 인간 FGF21의 세포 활성의 분석. 예시적인 용량-반응 곡선을 표시하였다(값은 평균 ± SEM, n=4). 이 세포 분석에서, 16H7-Fab는 비활성이며, FGF21 유사 활성을 나타내기 위해서는 전체 단일클론 및 2가 항체가 필요하다.
도 12: 유전자이식 인간화 FcRn 마우스에서 항-FGFR1c/KLB 효능적 항체의 약동학 분석. (A) 인간 IgG4 Fc 백본(Ab0314, Ab0331, Ab0335, Ab0351) 또는 (B) 인간 IgG1 Fc 백본(Ab0428, Ab0429, Ab0430)을 갖는 PBS 용액 중 항체 0.3 mg/kg을 암컷 Tg32-h-FcRn 마우스에게 정맥내(IV) 투여하고, 순환기의 혈장 농도를 시간 경과에 따라 평가하였다. 평균 ± SD 혈장 농도 값을 표시하였다.
도 13: 시노몰구스 원숭이에서 다양한 용량 수준의 16H7의 PK 분석. PBS 용액 중 0.1, 0.3, 및 1 mg/kg을 암컷 시노몰구스 원숭이에게 단회 정맥내(IV) 투여한 후, 16H7의 혈장 농도 및 약동학 파라미터를 조사하였다. 평균 ± SD 혈장 농도 값을 표시하였다.
도 14: 시노몰구스 원숭이에서 16H7 변이체의 PK 분석. PBS 용액 중 3 mg/kg을 암컷 시노몰구스 원숭이에게 단회 정맥내(IV) 투여한 후, 16H7 변이체의 혈장 농도 및 약동학 파라미터를 조사하였다. (A) Ab0331, (B) Ab0335, 및 (C) Ab0429의 평균 ± SD 혈장 농도 값.
도 15: 16H7의 3회 피하 투여 후 시노몰구스 원숭이의 체중 감소(Obs BW = 관찰된 체중, Pred. BW = 예측된 체중, Conc = 순환기에서의 16H7의 농도).
도 16: 시노몰구스 원숭이에서 1 mg/kg의 16H7, 1 mg/kg(저용량)의 Ab0335, 및 3 mg/kg(고용량)의 Ab0335가 일일 음식 섭취량에 미치는 영향(80일차에 DEXA 스캔을 수행하였으며, 음식 섭취량의 급격한 감소는 절차 때문임).
도 17: 시노몰구스 원숭이에서 1 mg/kg의 16H7, 1 mg/kg(저용량)의 Ab0335, 및 3 mg/kg(고용량)의 Ab0335가 일일 총 에너지 섭취량에 미치는 영향(80일차에 DEXA 스캔을 수행하였으며, 총 에너지 섭취량의 급격한 감소는 절차 때문임).
도 18: 시노몰구스 원숭이에서 1 mg/kg의 16H7, 1 mg/kg(저용량)의 Ab0335, 및 3 mg/kg(고용량)의 Ab0335가 체중 및 상대적 체중 변화에 미치는 영향(80일차에 DEXA 스캔을 수행하였으며, 체중/상대적 체중 변화의 급격한 감소는 절차 때문임).
도 19: 시노몰구스 원숭이에서 1 mg/kg의 16H7, 1 mg/kg(저용량)의 Ab0335, 및 3 mg/kg(고용량)의 Ab0335가 혈장 트리글리세리드 수치에 미치는 영향.
도 20: 예시적인 융합 항체("Fu0077"로 표기, 표 A4): Fu0077은 링커 펩티드를 통해 "Ab0001"로 표기된 항체(표 A1)의 각각의 경쇄 및 각각의 중쇄의 N-말단에 융합된 GLP-펩티드 화합물로서 "P014"로 표기된 GLP-펩티드(표 A3)를 포함한다. Ab0001은 항체 16H7의 경쇄(도 1 참조) 및 IgG2 백본이 IgG1 LALA 백본으로 대체된(표 A2) 16H7의 중쇄를 포함한다. GLP-펩티드의 서열은 밑줄 및 이탤릭체 로 표시되어 있다. 링커 펩티드의 서열은 볼드체로 표시되어 있다. 중쇄의 IgG1 LALA 백본 서열은 이탤릭체로 표시되어 있다. Fu0077은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 그러나, 하나만 표시하였다(경쇄의 서열: 서열번호 67 참조, 중쇄의 서열: 서열번호 68 참조). 따라서 Fu0077은 융합 분자당 4개의 GLP-펩티드 모이어티를 나타낸다.
도 21: GLP-1 항-FGFR1/KLB 단일클론 항체 융합 단백질의 개략도. 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단에 GLP-1 수용체 효능적 펩티드 서열을 클로닝하여 이중 효능작용을 갖는 융합 단백질을 생성하였다. 항체 융합 단백질은 2개 또는 4개의 GLP-펩티드 화합물을 나타낸다.
도 22: 도면은 인간 FGFR1c + KLB을 과발현하는 HEK293 세포에서 시험관내 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 사용하여 16H7 및 GLP-1-16H7 융합 단백질의 세포 FGF21 유사 활성을 분석한 결과를 보여준다. (A) 16H7 또는 GLP-1-16H7 융합 단백질로 5시간 동안 자극한 후 루시퍼라제 유전자 리포터 분석으로 얻은 예시적인 용량-반응 곡선. 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통해 측정된 (B) 평균 EC50 값 및 (C) Emax 값(평균 ± SEM, n=25~136).
도 23: 도 23의 A는 16H7의 경쇄 또는 중쇄 또는 둘 다의 N-말단에 GLP-1 수용체 효능제가 융합된 GLP-1-16H7 융합 단백질의 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통해 측정된 세포 FGF21 유사 활성의 평균 EC50 값을 나타낸다(평균 ± SEM, n=34~37). (B) 각각의 N-말단에서의 GLP-1 부분의 위치를 보여주는 개략도.
도 24: 도 24는 루시퍼라제 리포터 유전자 분석을 통해 측정된 FGF21 유사 활성에 대한 GLP-1-mAb 융합 단백질의 Fc 부분 변화의 영향을 보여준다. (A) 평균 EC50 값(평균 ± SEM, n=8~34)을 표시하였다. (B) 상이한 IgG 백본 및 각각의 N-말단에서의 GLP-1 부분의 위치를 보여주는 개략도.
도 25: 도 25는 인간 GLP-1R을 과발현하는 HEK293 세포를 사용한 HTRF cAMP 분석을 통해 측정된 혼합 IgG 백본 상에서의, 16H7의 중쇄의 N-말단, 또는 16H7의 경쇄의 N-말단, 또는 둘 다에 융합된 선택된 GLP-1RA 서열의 세포 GLP-1 수용체 효능제 활성을 분석한 결과를 보여준다. 천연 펩티드 리간드 GLP-1(7~36)에 대한 결과를 포함한다. 평균 EC50 값을 박스 앤 위스커 플롯(n=5~73)으로 표시하였다.
도 26: 비인간 영장류(마카카 파시쿨라리스)에 대한 연구 설계. 연구를 위해 선택된 동물은 NAS 점수가 4보다 높은, 비만 및 당뇨병이 있었다.
도 27: 시노몰구스 원숭이에서 비히클, 3일마다 투약된 SAR10(둘라글루티드), 1주, 3주, 및 6주차에 투약된 SAR16(Ab0004, 16H7), 및 조합이 일일 총 에너지 섭취량에 미치는 영향. 검은색 화살표는 SAR16 투약을 나타낸다.
도 28: 아침, 점심, 및 저녁으로 나누어 시노몰구스 원숭이에서 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 및 조합이 일일 음식 섭취량에 미치는 영향.
도 29: 아침, 점심, 및 저녁으로 나누어 시노몰구스 원숭이에서 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 및 조합이 일일 음식 섭취량에 미치는 영향. 더 나은 시각화를 위해 오차 막대는 생략했다.
도 30: 시노몰구스 원숭이의 체중 및 상대적 체중 변화에 대한 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 및 조합의 영향.
도 31: 도 31은 이중 에너지 X-선 흡광계(DEXA)를 통해 평가된 체지방량 변화를 보여준다. 시노몰구스 원숭이의 전신 구성에 대한 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 및 조합의 영향을 나타냈다(기준선 대 처치 후 92일차, 평균 값 ± SEM).
도 32: 도 32는 기준선 대 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 또는 조합을 사용한 처치 후 92일차에서 iv 포도당 내성 검사(GTT) 중의 시노몰구스 원숭이에서 시간 경과에 따른 혈장 포도당 수치를 나타낸다.
도 33: 도 33은 기준선 대 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 또는 조합을 사용한 처치 후 92일차에서 iv 포도당 내성 검사(GTT) 중의 시노몰구스 원숭이에서 시간 경과에 따른 혈장 포도당 수치를 나타낸다.
도 34: 도 34는 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 또는 조합을 사용한 처치 후 92일차의 시노몰구스 원숭이에서 ivGTT의 곡선 아래 면적(AUC)을 나타낸다.
도 35: 도 35는 시간 경과에 따른 시노몰구스 원숭이의 공복 혈장 포도당 수치에 대한 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 및 조합의 영향을 보여준다.
도 36: 도 36은 시간 경과에 따른 시노몰구스 원숭이의 공복 트리글리세리드 수치에 대한 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 및 조합의 영향을 보여준다.
도 37: 도 37은 시간 경과에 따른 시노몰구스 원숭이의 공복 LDL-콜레스테롤 수치에 대한 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 및 조합의 영향을 보여준다.
도 38: 도 38은 시간 경과에 따른 시노몰구스 원숭이의 공복 VLDL-콜레스테롤 수치에 대한 비히클, SAR10(둘라글루티드), SAR16(Ab0004), 및 조합의 영향을 보여준다.
정의
이하 본원에 제공된 정의는 본원에 제공된 항원 결합 단백질(예를 들어, 섹션 A 또는 섹션 B2 참조) 또는 본원에 제공된 접합체(예를 들어, 섹션 B 참조)에 적용된다.
용어 "GLP-1R 효능적 펩티드", "GLP-1R 효능제", "GLP-1 펩티드", 및 "GLP 펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 (1차 GLP-1R 효능제로서) GLP-1과 같은 GLP-1 수용체에 결합하고 이를 활성화하는 펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 약 25 내지 45개 아미노산의 길이를 갖는다. GLP-1R 효능적 펩티드는 서열번호 51, 52, 53, 54, 55, 59, 60, 61, 또는 62의 일반 서열에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
화합물이 GLP-1 수용체를 활성화하는지 여부를 평가하는 분석은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 실시예 섹션, 예를 들어 섹션 "GLP-1, 글루카곤, 및 GIP 수용체 효능에 대한 시험관내 세포 분석"에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다.
"항원 결합 단백질"은 본원에 언급된 항원에 결합하는 부분을 포함하는 단백질이다. 선택적으로, 항원 결합 단백질은 항원 결합 부분이 항원에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 촉진하는 형태를 채택할 수 있도록 하는 스캐폴드 또는 프레임워크 부분을 포함한다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질은 단리된 항원 결합 단백질일 수 있다. "단리된" 항원 결합 단백질은 일부 구현예에서, 정제된 항원 결합 단백질이다. 항원 결합 단백질의 정제는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 같은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 이에 따라, 항원 결합 단백질은 항원 결합 단백질이 생성된 세포로부터 단리되어 있어야 한다. 일부 구현예에서, 단리된 항원 결합 단백질은 예를 들어 Lowry 방법으로 측정시 항원 결합 단백질의 70 중량% 초과까지, 일부 구현예에서는, 80 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 초과까지 정제된다. 일부 구현예에서, 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 대체로 없는 항체를 지칭한다.
"항체"는 2개의 중쇄가 이황화 결합에 의해 서로 연결되고, 각각의 중쇄가 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된 천연 또는 통상적인 항체일 수 있다. 포유동물에서, 항체는 5개의 주요 클래스 또는 이소형, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로 분류된다. 이들은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 또는 뮤를 포함하는 중쇄에 따라 분류된다. 이들은 불변 도메인의 서열 및 수, 힌지 구조, 및 항체의 결합가가 다르다. 람다(l) 및 카파(k)의 2가지 유형의 경쇄가 존재하며, 둘 중 카파 경쇄가 보다 일반적이다. 이들은 단백질 서열이 상대적으로 다르지만, 유사한 구조와 기능을 공유한다.
5가지의 주요 중쇄 클래스(또는 이소형) IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE는 항체 분자의 기능적 활성을 결정한다. 중쇄는 임의의 이소형일 수 있다. 일부 구현예에서, 중쇄는 IgG 중쇄이다. 각각의 사슬은 별개의 서열 도메인을 포함한다. IgG는 정상적인 인간 혈청에서 가장 풍부한 항체로서, 전체 면역글로불린 풀의 70~85%를 차지한다. 이는 약 150 kDa의 분자량을 갖는 단량체이고, 2차 면역 반응의 주요 항체이며, 5가지 면역글로불린 클래스 중 가장 긴 반감기를 가지고 있다. IgG는 4가지 인간 서브클래스(lgG1, lgG2, lgG3, 및 lgG4)로 구성되며, 각각은 상이한 중쇄를 포함한다. 이들은 매우 동종이며 주로 숙주 면역 체계를 활성화하는 정도와 힌지 영역이 다르다. lgG1 및 lgG4는 힌지 영역에 2개의 쇄간 이황화 결합을 포함하고, IgG2는 4개, IgG3은 1개를 갖는다.
중쇄는 상이한 Fc 백본을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 백본은 실시예 섹션의 표 A2에 제공된 백본으로부터 선택되는 백본이다. 따라서, Fc 백본은 표 A2에 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, Fc 백본은 IgG4 PE이다. 다른구현예에서, Fc 백본은 IgG1 NNAS이다.
경쇄는 2개의 도메인 또는 영역, 즉 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 포함한다. 중쇄는 4개의 도메인, 즉 1개의 가변 도메인(VH)과 3개의 불변 도메인(CH로 총칭되는 CH1, CH2, 및 CH3)을 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 둘 다의 가변 영역은 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(CH)의 불변 영역 도메인은 항체 사슬 회합, 분비, 경태반 이동성, 보체 결합, 및 Fc 수용체(FcR)에 대한 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이고, 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변부로 이루어진다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위와 항원 결정기 사이의 구조적인 상보성에 있다. 항체 결합 부위는 주로 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 유래하는 잔기로 이루어진다. 때때로, 비초가변 영역 또는 프레임워크 영역(FR)으로부터의 잔기는 전체 도메인 구조에 영향을 미치므로 결합 부위에 영향을 미친다. 용어 "상보성 결정 영역"(CDR로 약칭)은 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 규정하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 각각은 CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L(경쇄 상보성 결정 영역의 경우) 또는 CDRL1, CDRL2, CDRL3, 및 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H(중쇄 상보성 결정 영역의 경우) 또는 CDRH1, CDRH2, CDRH3으로 각각 표기되는 3개의 CDR을 가지고 있다. 따라서, 통상적인 항체 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다.
"프레임워크 영역"(FR)은 CDR들 사이에 개재된 아미노산 서열, 즉, 단일 종에서 상이한 면역글로불린들 중에서 상대적으로 보존된 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 부분을 지칭한다. 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄 각각은 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, 및 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H로 각각 표기되는 4개의 FR을 갖는다.
N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 둘 다 일반적으로 요소 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4의 순서를 갖는다.
상기 도메인 각각에서 위치를 차지하는 아미노산에 번호를 할당하기 위한 넘버링 체계가 확립되어 있다. 주어진 항체의 상보성 결정 영역 및 프레임워크 영역은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991]에 기술된 시스템을 사용하여 확인될 수 있다. 일 구현예에서, CDR 및 FR 서열은 Kabat에 의해 기술된 시스템에 따라 본원에서 제공된다. 그러나, CDR은 IMGT 정의에 기반한 대체 명명 체계에 따라 재정의될 수도 있다(Lefranc, M.P. et al., 2003, Dev Comp Immunol. 27(1): 55-77).
본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 프레임워크 영역"은 자연 발생 인간 항체의 프레임워크 영역과 실질적으로 동일한(약 85% 이상, 구체적으로는 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 프레임워크 영역이다.
일부 구현예에서, 용어 "항체"는 통상적인 또는 전장 항체(즉, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체)를 지칭한다.
항원 결합 단백질은 본원에 언급된 6가지 CDR의 변이체를 포함할 수 있다. 중쇄 CDR1과 같이, "상기 CDR과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른"이라는 용어는 변이체가 상기 CDR과 최대 3개의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다름, 즉 단지 1개, 2개, 또는 3개의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다름을 의미한다.
용어 "항원"은 본원에 제공된 항원 결합 단백질에 결합될 수 있는 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 항원은 (i) 베타-Klotho(KLB) 및/또는 (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, 및 FGFR4 중 하나와 베타-Klotho를 포함하는 복합체이다. 따라서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 (i) 베타-Klotho 및/또는 (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, 및 FGFR4 중 하나와 베타-Klotho를 포함하는 복합체에 결합할 것이다. 따라서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 (i) 베타-Klotho 및/또는 (ii) FGFR1c와 베타-Klotho를 포함하는 복합체에 결합할 것이다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 베타-Klotho(KLB)의 세포외 도메인에 결합한다.
용어 "베타-Klotho", "ß-Klotho", 및 KLB는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 베타-Klotho, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, 및 FGFR4 단백질은 인간 단백질이다. 인간 단백질의 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 인간 베타-Klotho 및 FGFR1c의 아미노산 서열은 GenBank를 통해 액세스할 수 있다(베타-Klotho의 경우 NP_783864.1 참조; FGFR1c의 경우 NP_001167534.1 참조).
일부 구현예에서, 베타-Klotho, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, 및 FGFR4 단백질은 비인간 영장류 단백질, 예컨대 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)의 단백질이다.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 2가 항원 결합 단백질, 예컨대 2가 항체, 또는 상기 항체의 2가 항원 결합 단편이다. "2가 항원 결합 단백질", "2가 항체", 또는 "2가 항원 결합 단편"은 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 가질 수 있고, 따라서 단일특이적 항원 결합 단백질(또는 이의 단편)일 수 있다. 이에 따라, 2개의 결합 부위는 동일한 항원에, 즉 (i) 베타-Klotho(KLB) 및/또는 (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, 및 FGFR4 중 하나와 베타-Klotho를 포함하는 복합체에 결합할 것이다. 일 구현예에서, 이들은 베타-Klotho에 결합한다.
일 구현예에서, 2개의 항원 결합 부위는 항원 내의 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에서, 2개의 항원 결합 부위는 항원 내의 상이한에피토프에 결합한다.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질 또는 이의 단편은 동일한 CDR을 갖는 2개의 경쇄 가변 영역, 및 동일한 CDR을 갖는 2개의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 항원 결합 단백질 또는 이의 단편은 2개의 동일한 경쇄 가변 영역 및 2개의 동일한 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 2가 항원 결합 단편은 2개의 Fab 단편을 포함한다. 2개의 단편 각각은 항원에 결합할 것이다. 또한, 단편은 서로 연결되어야 한다. 구현예에서, 단편은 F(ab')2 단편이다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 갖는 2가 단편이다.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 디아바디이다. 디아바디는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 2가 항체이다. 각각의 폴리펩티드 사슬은 링커에 의해 결합된 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 디아바디의 2개의 폴리펩티드 사슬은 동일하다. 대안적 구현예에서, 2개의 폴리펩티드 사슬은 상이한 아미노산 서열을 가지며, 단 2개의 사슬은 동일한 항원(동일한 항원 내의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프)에 결합한다.
항원 결합 단백질 또는 이의 단편은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체를 활성화시켜야 한다. 따라서, 이는 효능제로 작용할 것이다. 항원 결합 단백질 또는 이의 단편이 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체를 활성화하는지 여부는 잘 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 물질 및 방법 섹션 "루시퍼라제 리포터 유전자 분석"에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 일 구현예에서, β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체의 활성화는 본원에 제공된 항원 결합 단백질과 시험관내 접촉시 MAPK ERK1/2의 인산화 및/또는 FGF21 수용체 자가인산화를 측정하여 결정된다.
아미노산 잔기, 예컨대 감소된 안정성과 관련된 아미노산 잔기의 "치환"은 상기 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기, 예컨대 다른 자연 발생 아미노산 잔기로 대체하는 것을 의미한다. 아미노산과의 연결에 사용되는 경우, "자연 발생"이라는 용어는 20개의 통상적인 아미노산(즉, 알라닌(Ala 또는 A), 시스테인(Cys 또는 C), 아스파트산(Asp 또는 D), 글루탐산(Glu 또는 E), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소류신(Ile 또는 I), 라이신(Lys 또는 K), 류신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 아스파라긴(Asn 또는 N), 프롤린(Pro 또는 P), 글루타민(Gln 또는 Q), 아르기닌(Arg 또는 R), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 발린(Val 또는 V), 트립토판(Trp 또는 W), 및 티로신(Tyr 또는 Y))을 의미한다.
일부 구현예에서, 본원에 언급된 아미노산 잔기, 예컨대 감소된 안정성과 관련된 아미노산 잔기는 아미노산 시스테인(Cys 또는 C), 아스파트산(Asp 또는 D), 메티오닌(Met 또는 M), 및 아스파라긴(Asn 또는 N)으로 치환되지 않는다.
일 구현예에서, 치환(또는 치환들)은 보존적 아미노산 치환(보존적 아미노산 치환들)이다. 이러한 치환은 아미노산을 동일한 계열의 아미노산, 즉 (예를 들어, 전하 및/또는 크기 관점에서) 측쇄 관련이 있는 아미노산으로 치환하는 것이다. 자연 발생 아미노산은 일반적으로 4가지 계열, 즉 산성(아스파테이트, 글루타메이트); 염기성(리신, 아르기닌, 히스티딘); 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 및 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신)으로 분류된다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때로는 함께 방향족 아미노산으로 분류된다.
항원 결합 단백질과 관련하여, 아미노산의 위치는 사슬, 즉 중쇄 또는 경쇄, 및 중쇄 또는 경쇄 내 아미노산 잔기의 위치를 참조하여 본원에 표시된다. 항체 16H7을 기준 항체로서 사용한다. 16H7의 아미노산 서열은 도 1에 표시되어 있다. 16H7의 중쇄는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 16H7의 경쇄는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 따라서, 주어진 아미노산 잔기의 위치는 각각 16H7의 중쇄(서열번호 1로 표시) 및 16H7의 경쇄(서열번호 2로 표시)에서의 위치에 해당한다. 일 구현예에서, 위치 번호 앞의 대문자는 16H7에서 이 위치에 존재하는 아미노산을 나타낸다. 한 글자 코드가 적용된다. 예를 들어, "경쇄의 D91"은 16H7이 이 위치에서 아스파트산을 포함함을 의미한다. 위치 번호 뒤의 대문자는 치환에 사용된 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, 경쇄의 D91E는 경쇄의 91번 위치의 아미노산 잔기 D가 E로 치환되었음을 의미한다.
대안적으로, 아미노산 잔기는 다음의 명명법을 사용하여 정의된다:
XLC - 번호(예컨대 XLC93), 및
XHC-번호(예컨대 XHC34),
여기서 아래첨자 "LC-번호"는 16H7의 경쇄에서의 해당 위치를 나타내고, 아래첨자 "HC-번호"는 16H7의 중쇄에서의 해당 위치를 나타낸다. 정의된 아미노산 잔기는 돌연변이된 항원 결합 단백질 내에서 다른 위치를 가질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
"X"로 표시된 아미노산 잔기에 대해 명세서 및 서열 목록에 제공된 정의, 예컨대 XHC34, XHC35, XHC54, XHC58, XHC60, XHC102, XHC104, XHC108, XHC109, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95에 대한 정의는 일 구현예에서, 이들 아미노산 잔기를 포함하는 모든 CDR, 경쇄 가변 도메인, 중쇄 가변 도메인, 전체 경쇄, 및 전체 중쇄에 적용된다.
GLP-1R 효능적 펩티드와 관련하여, 아미노산의 위치는 펩티드 내 아미노산 잔기의 위치를 참조하여 본원에 표시된다(예: X1, X10, 또는 X12). GLP-1R 효능적 펩티드 내의 아미노산은 아래첨자 LC 및 HC를 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "접합체"는 β-Klotho에 및/또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합하는 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 화합물로서, 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편이 적합한 결합에 의해 적어도 하나의 효능적 GLP-1 펩티드에 연결(즉, 접합)된, 화합물을 지칭한다. 일 구현예에서, 적합한 결합은 공유 결합이다.
항원 결합 단백질 및 적어도 하나의 효능적 GLP-1 펩티드는 하나 이상의 적합한 링커 분자, 예를 들어 링커 펩티드 또는 비펩티드 중합체, 예컨대 PEG를 통해 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 접합체는 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편과 적어도 하나의 효능적 GLP-1 펩티드의 융합체이다. 따라서, 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합 발현이 가능한 펩티드 결합에 의해 적어도 하나의 GLP-1 펩티드에 연결된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편은 링커를 통해 적어도 하나의 GLP-1 펩티드에 접합된다. 일 구현예에서, 링커는 링커 펩티드이다.
링커 펩티드는 일반적으로 2개 이상의 아미노산의 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 이는 5개 이상의 아미노산의 길이를 갖는다. 다른 구현예에서, 이는 10개 이상의 아미노산의 길이를 갖는다. 다른 구현예에서, 이는 15개 이상의 아미노산의 길이를 갖는다. 다른 구현예에서, 이는 20개 이상의 아미노산의 길이를 갖는다. 예를 들어, 링커는 2개 내지 50개 아미노산, 또는 약 5개 내지 약 30개 아미노산, 또는 10개 내지 25개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
링커 펩티드는 글리신-세린-풍부 링커일 수 있다. 예를 들어, 아미노산의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%는 각각 글리신 또는 세린 잔기이다. 다른 구현예에서, 아미노산은 글리신 및 세린으로부터 선택된다. 즉, 펩티드 링커는 글리신 및 세린으로만 구성된다(글리신-세린 링커라고 함). 일 구현예에서, 펩티드 링커는 C-말단에 알라닌 잔기를 추가로 포함한다.
항원 결합 단백질 또는 이의 단편은 적어도 GLP-1R(글루카곤 유사 펩티드-1 수용체) 효능적 펩티드에 접합, 융합될 수 있다. 이에 따라, 본원에 제공된 접합체는 하나 이상의 GLP-1R 효능적 펩티드, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 GLP-1R 효능적 펩티드를 포함할 수 있다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 일 구현예에서, 두 서열의 서열 동일성 정도를 결정하기 위해 표준 파라미터가 적용된다. 일부 구현예에서, 서열 동일성 정도는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산된다. 일부 구현예에서, 동일성 정도는 비교 창에서 최적으로 정렬된 두 서열을 비교하여 결정되어야 하며, 비교 창에서 아미노산 서열의 단편은 최적의 정렬을 위해 기준 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 추가 또는 결실(예를 들어, 갭 또는 오버행)을 포함할 수 있다. 동일한 아미노산 잔기가 두 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭 위치의 수를 산출하고, 매칭 위치의 수를 비교 창 내 총 위치 수로 나누고 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 문헌[Smith and Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988)]의 유사성 방법의 검색, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현(Wisconsin Genetics 소프트웨어 패키지(Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)의 GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 육안 검사에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 2개의 서열이 확인된 경우, 일반적으로 GAP 및 BESTFIT를 사용하여 최적의 정렬 및 이에 따른 동일성 정도를 결정한다. 일 구현예에서, 갭 가중치의 경우 5.00 및 갭 가중치 길이의 경우 0.30의 기본값이 사용된다. 일 구현예에서, 두 아미노산 서열 간의 백분율 동일성은 EMBOSS 소프트웨어 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I., and Bleasby, A., Trends in Genetics 16(6), 276-277, 2000)의 needle 프로그램에 통합된 Needleman and Wunsch 알고리즘(Needleman 1970, J. Mol. Biol. (48):444-453), BLOSUM62 채점 행렬, 10의 갭 오프닝 패널티, 및 0.5의 갭 확장 패널티를 사용하여 결정된다. needle 프로그램을 사용하여 두 아미노산 서열을 정렬하는 데 사용되는 파라미터의 바람직한 비제한적 예는 BLOSUM62 채점 행렬, 10의 갭 오프닝 패널티, 및 0.5의 갭 확장 패널티를 포함하는 기본 파라미터이다.
두 서열에 대해 "적어도 80% 동일한"이라는 용어는 두 서열이 80% 이상의 서열 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 서열은 적어도 85% 또는 87% 동일하다. 일부 구현예에서, 서열은 적어도 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 서열은 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 구현예에서, 서열은 동일, 100% 동일하다.
본원에서 사용되는 용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 온전한 세포, 즉 효소, 소기관, 또는 유전 물질과 같은 정상적인 세포내 성분을 방출하지 않은 온전한 막을 가진 세포와 관련된다. 특정 예시적인 구현예에서, 온전한 세포는 생존가능 세포, 즉 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 특정 예시적인 구현예에서, 세포 또는 숙주 세포는 외인성 핵산으로 형질감염 또는 형질전환될 수 있는 임의의 세포이다. 특정 예시적인 구현예에서, 세포는 외인성 핵산으로 형질감염 또는 형질전환되어 수여체에게 전달되면 수여체에서 상기 핵산을 발현할 수 있다.
용어 "세포"는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포, 및 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 진균류 세포 또는 포유류 세포를 포함한다. 적합한 박테리아 세포는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 프로테우스(Proteus), 및 슈도모나스(Pseudomonas) 균주와 같은 그람-음성 박테리아 균주, 및 바실루스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스타필로코커스(Staphylococcus), 및 락토코커스(Lactococcus) 균주와 같은 그람-양성 박테리아 균주로부터의 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적합한 진균류 세포는 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 및 아스페르길루스(Aspergillus)의 종으로부터의 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적합한 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces) 종(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 종(예를 들어, 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 피키아(Pichia) 종(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica)), 및 한세눌라(Hansenula) 종으로부터의 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적합한 포유류 세포는 예를 들어 CHO(중국 햄스터 난소) 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, HEK-293 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, HEK-293 세포가 사용된다. 다른 구현예에서, CHO 세포가 사용된다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종 단백질의 발현을 위해 당업계에서 사용되는 임의의 다른 세포가 또한 사용될 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 포유류 세포(예를 들어, 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소, 또는 영장류의 세포)가 입양 이식에 사용된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 제공된 항원 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
세포 또는 숙주 세포는 단리되거나, 조직 또는 유기체, 예컨대 "비인간 유기체"의 일부일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비인간 유기체"는 비인간 영장류 또는 기타 동물, 예를 들어 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼와 같은 포유류 또는 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그, 및 햄스터)를 포함하는 의미이다. 일부 구현예에서, 비인간 유기체는 시노몰구스 원숭이이다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 일반적으로, 본원에 제공된 항원 결합 단백질을 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함한다. 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용가능한"이라는 용어는 특정 예시적인 구현예에서 약제학적 조성물의 활성제, 즉 항원 결합 단백질의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 비독성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "담체"는 활성 성분이 적용을 용이하게 하거나, 강화하거나 가능하게 하기 위해 조합되는 천연 또는 합성 성질의 유기 또는 무기 성분을 나타낸다. 일 구현예에서, 용어 "담체"는 또한 대상체에 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 또는 캡슐화 물질을 포함한다.
비경구 투여용으로 적합한 담체 물질은 멸균수, 링거액, 락테이트 함유 링거액, 생리식염수, 정균 식염수(예를 들어, 0.9% 벤질 알코올을 함유하는 식염수), 인산염 완충 식염수(PBS), 행크 용액(Hank's solution), 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌, 특히 생체적합성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 공중합체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "부형제"는 약제학적 조성물에 존재할 수 있고 활성 성분이 아닌 모든 물질, 예컨대 염, 결합제(예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 만니톨), 충전제, 활택제, 증점제, 표면활성제, 보존제, 유화제, 버퍼 물질, 착향제, 또는 착색제를 포함하는 의미이다.
약제학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량, 및 요법은 당연히 치료할 병태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중, 및 성별 등에 따라 다르다.
약제학적 조성물은 국소용, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하, 또는 안구내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 피하 투여용으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 비경구, 예컨대 정맥내 또는 피하 투여될 수 있는 제형에 대해 약제학적으로 허용가능한 비히클을 함유한다. 이들은 특히, 등장성, 멸균, 식염수 용액(인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물)이거나, 경우에 따라 멸균수 또는 생리식염수의 첨가시 주사 용액의 구성을 허용하는 건조, 특히 동결건조 조성물일 수 있다.
본원에 기재된 항원 결합 단백질 및 조성물은 임의의 통상적인 경로를 통해, 예를 들어 경구 투여, 폐 투여, 흡입 투여, 또는 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 비경구 투여, 예컨대 정맥내, 동맥내, 피하, 피내, 또는 근육내 투여가 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 조성물은 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질 및 조성물은 정맥내 투여된다.
본원에 기재된 항원 결합 단백질 및 조성물은 일반적으로 치료 유효량으로 투여된다. "치료 유효량"은 당업자가 이해하는 용어이다. 일부 구현예에서, 이 용어는 단독으로 또는 추가 용량과 함께, 경우에 따라서는 허용할 수 없는 또는 원치 않는 부작용을 일으키지 않거나 최소한으로만 일으키면서, 원하는 치료 반응 또는 원하는 치료 효과를 달성하는 양을 의미한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "대상체" 또는 "환자"는 척추동물일 수 있다. 이 용어는 인간 및 기타 동물, 특히 포유류 및 기타 유기체를 포함한다. 따라서, 본원에서 대상체는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 기니피그, 흰담비, 고양이, 개, 닭, 양, 소 종, 말, 낙타, 또는 영장류와 같은 동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 영장류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 16세 이상이다.
일부 구현예에서, 대상체는 본원에 언급된 질환 또는 장애를 앓고 있다. 예를 들어, 대상체는 비만 대상체일 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 본원에 언급된 질환 또는 장애를 앓을 위험이 있다.
일 구현예에서, 용어 "질환 또는 장애"는 본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있는 임의의 병리학적 또는 건강하지 못한 상태를 나타낸다. 특히, 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, NASH, 및/또는 죽상동맥경화증.
본원에서 사용되는 용어 "비만"은 건강에 부정적인 영향을 미칠 정도로 과도한 체지방이 축적된 의학적 상태를 나타낸다. 인간(성인) 대상체의 관점에서, 비만은 30 kg/m2 이상의 체질량 지수(BMI)(BMI ≥ 30 kg/m2)로 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, 비만은 35 kg/m2 이상의 체질량 지수(BMI)로 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, 비만은 40 kg/m2 이상의 체질량 지수(BMI)로 정의될 수 있다. 따라서, 대상체는 30 kg/m2 이상, 예컨대 kg/m2 이상, 예컨대 40 kg/m2 이상의 BMI를 가질 수 있다.
BMI는 성인의 과체중 및 비만을 분류하는 데 일반적으로 사용되는 신장 대비 체중의 간단한 지수이다. 이는 사람의 체중(kg)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 값(kg/m2)으로 정의된다.
본원에서 사용되는 "과체중"이라는 어구는 체지방량이 최적의 건강 상태보다 높은 의학적 상태를 나타낸다. 인간(성인) 대상체의 관점에서, "과체중"은 25 kg/m2 이상의 체질량 지수(BMI)(예를 들어, 25 kg/m2 ≤ BMI < 30 kg/m2)로 정의될 수 있다. 일 구현예에서, 이 용어는 27 kg/m2 이상의 체질량 지수(BMI)(예를 들어, 27 kg/m2 ≤ BMI < 30 kg/m2)로 정의될 수 있다.
일 구현예에서, 과체중/비만인 환자는 고혈압, 제2형 진성 당뇨병, 또는 이상지질혈증과 같은 적어도 하나의 체중 관련 동반 병태를 앓고 있다.
본원에서 사용되는 "대사 증후군"이라는 용어는 전형적으로 다음 의학적 상태 중 적어도 3개의 클러스터링을 나타낸다: 복부(중심성) 비만(예를 들어, 유럽계 남성의 경우 94 cm 이상의 허리 둘레 및 유럽계 여성의 경우 80 이상의 허리 둘레로서 정의되며, 다른 그룹의 경우 민족 특이적 값을 가짐), 고혈압(예를 들어, 130/85 mmHg 이상), 높은 공복 혈장 포도당(예를 들어, 100 mg/dL 이상), 높은 혈청 트리글리세리드(예를 들어, 150 mg/dL 이상), 및 낮은 고밀도 리포단백질(HDL) 수치(예를 들어, 남성의 경우 40 mg/dL 미만 및 여성의 경우 50 mg/dL 미만).
본원에서 사용되는 "진성 당뇨병"(간단히 "당뇨병"이라고도 함)은 인슐린 생성, 인슐린 작용, 또는 둘 다의 결함으로 인한 높은 혈당 수치를 특징으로 하는 대사성 질환 그룹을 나타낸다. 일 구현예에서, 진성 당뇨병은 제1형 진성 당뇨병, 제2형 진성 당뇨병, 임신성 진성 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 진성 당뇨병에 대한 현재 WHO 진단 기준은 다음과 같다: 공복 혈장 포도당 ≥ 7.0 mmol/l(126 mg/dL) 또는 2시간 혈장 포도당 ≥ 11.1 mmol/l(200 mg/dL).
일부 구현예에서, 당뇨병은 제1형 진성 당뇨병이다. 본원에서 사용되는 "제1형 진성 당뇨병"은 인슐린의 완전한 부족으로 인한 높은 혈당 수치를 특징으로 하는 병태이다. 이것은 신체 면역계가 췌장에서 인슐린-생성 베타 세포를 공격하여 파괴할 때 발생한다. 그러면 췌장은 인슐린을 거의 또는 전혀 생성하지 않는다. 췌장의 제거 또는 질환은 또한 인슐린-생성 베타 세포의 손실을 초래할 수 있다. 제1형 진성 당뇨병은 당뇨병 사례의 5% 내지 10%를 차지한다.
일부 구현예에서, 당뇨병은 제2형 진성 당뇨병이다. 본원에서 사용되는 "제2형 진성 당뇨병"은 인슐린 이용가능성에도 불구하고 과도한 포도당이 생성되는 것을 특징으로 하는 병태이며, 부적절한 포도당 제거(인슐린 작용)의 결과로 순환 포도당 수치가 과도하게 높게 유지된다.
일부 구현예에서, 당뇨병은 임신성 당뇨병이다. 본원에서 사용되는 "임신성 당뇨병"은 이전에 당뇨병 진단을 받지 않은 여성이 임신 중에(특히 임신 3기 동안) 높은 혈당 수치를 나타내는 병태이다. 임신성 당뇨병은 연구되는 집단에 따라 임신의 3~10%에 영향을 미친다.
본원에서 사용되는 "당뇨병성 망막병증"은 당뇨병 환자에서 발생하는 대사 장애에 의해 유발되는 안구 질환이며 진행성 시력 상실을 초래한다.
본원에서 사용되는 용어 "고혈당증"은 혈액 중의 과도한 당(포도당)을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "이상지질혈증"은 리포단백질 과다생성("고지혈증") 또는 결핍("저지혈증")을 포함하는 리포단백질 대사의 장애를 나타낸다. 이상지질혈증은 혈중 총 콜레스테롤, 저밀도 리포단백질(LDL) 콜레스테롤, 및/또는 트리글리세리드 농도의 상승, 및/또는 고밀도 리포단백질(HDL) 콜레스테롤 농도의 감소로 나타날 수 있다.
본원에서 사용되는 비알코올성 지방간염(NASH)은 간세포의 염증 및 변성과 함께 지방(지질 방울)의 축적을 특징으로 하는 간 질환이다. 일단 시작되면 이 질환은 간 기능이 변경되어 간 기능 부전으로 진행될 수 있는 상태인 고위험 간경화를 동반한다. 이후 NASH는 종종 간암으로 진행된다.
본원에서 사용되는 "죽상동맥경화증"은 동맥 내강의 협착을 일으키고 섬유화 및 석회화로 진행될 수 있는, 대형 및 중형 동맥의 내막에 불규칙하게 분포된 경화반이라고 하는 지질 침착물을 특징으로 하는 혈관 질환이다. 병변은 대개 국소적이며, 천천히 그리고 간헐적으로 진행된다. 경우에 따라 경화반 파열이 발생하여 혈류 폐색으로 이어지고 결과적으로 폐색 원위부 조직 괴사를 초래한다. 혈류 제한이 대부분의 임상 증상을 차지하며, 이는 폐색의 분포 및 중증도에 따라 다르다.
본원에서 사용되는 용어 "치료"는 대상체에서 비만과 같은 본원에 언급된 질환 및/또는 장애를 예방, 완화, 또는 제거하기 위해 대상체에게 화합물 또는 조성물 또는 화합물 조합 또는 조성물 조합을 투여하는 것을 의미한다. 따라서, 이 용어는 본원에 언급된 기존 질환 또는 장애의 치료, 또는 질환 또는 장애의 방지, 즉 예방을 포함한다. 따라서 본원에 언급된 치료는 일부 구현예에서 예방적일 수 있음이 인식될 것이다. 일부 구현예에서, 이 용어는 본원에 언급된 기존 질환 또는 장애의 치료를 의미한다. 따라서, 대상체는 상기 질환 또는 장애를 앓고 있다.
본 발명의 상세한 설명
FGFR1/KLB 수용체 복합체에 결합하고 개선된 안정성을 갖는 효능적 단일클론 항체가 본원에 제공된다. 제공된 항체는 섹션 A에서 설명한다.
FGFR1/KLB 효능적 항원 결합 단백질 및 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드를 포함하는 접합체가 본원에 추가로 제공된다. 제공된 접합체는 섹션 B에서 설명한다.
섹션 A에서 설명되는 제공된 항체는 섹션 B에서 설명되는 접합체에 포함될 수도 있다(FGFR1/KLB 효능적 항원 결합 단백질).
섹션 A) FGFR1/KLB 수용체 복합체에 결합하고 개선된 안정성을 갖는 효능적 단일클론 항체
단일클론 항체 16H7에 비해 개선된 물리화학적 특성, 예컨대 증가된 안정성을 갖는 항원 결합 단백질이 본원에 제공된다. 항원 결합 단백질은 i) 본원에 정의된 경쇄 CDR 1, 2, 및 3, 및 중쇄 CDR 1, 2, 및 3, 본원에 정의된 경쇄 및 중쇄 가변 영역, 및/또는 본원에 정의된 경쇄 및 중쇄를 포함해야 한다.
구체적으로, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 16H7과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함해야 한다. 일 구현예에서, 감소된 안정성과 관련된 16H7의 적어도 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 자연 발생 아미노산 잔기로 대체된다. 일부 구현예에서, 감소된 안정성과 관련된 16H7의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 16H7의 중쇄의 M34, 중쇄의 D109, 경쇄의 N25, 경쇄의 D49, 경쇄의 D50, 경쇄의 D91, 및 경쇄의 N93으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 상기 아미노산 잔기가 치환된다. 일부 구현예에서, 상기 아미노산 잔기 모두가 치환된다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질은 또한 각각의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3, 및 중쇄 CDR 1, 2, 및 3의 변이체 CDR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 각각의 CDR과 총 5개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다르다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 각각의 CDR과 총 4개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다르다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 각각의 CDR과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다르다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 각각의 CDR과 총 2개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다르다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 각각의 CDR과 총 1개의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다르다.
일부 구현예에서, 돌연변이는 치환이다. 따라서, 변이체는 각각의 CDR과 총 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 치환이 다르다. 실시예 섹션의 표 D1 및 D2에 나타낸 결과에 기초하여, 당업자는 적합한 치환을 선택할 수 있다.
그러나, 16H7의 중쇄의 아미노산 잔기 G35, F54, E58, S60, G104, 및 Y108, 및 경쇄의 D95는 돌연변이되지 않는 것으로 고려된다. 이에 따라, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 16H7의 중쇄의 아미노산 잔기 G35, F54, E58, S60, G104 및 Y108, 및 경쇄의 아미노산 잔기 D95에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 고려된다. 따라서, 상기 아미노산 잔기는 돌연변이되어서는 안 된다. 즉 치환 또는 결실되어서는 안 된다.
일부 구현예에서, 16H7의 중쇄에 존재하는 아미노산 잔기 I83은 다른 아미노산, 예컨대 T로 치환된다(I83T 치환).
일 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은
a) 중쇄 CDR1,
b) 중쇄 CDR2,
c) 중쇄 CDR3,
d) 경쇄 CDR1,
e) 경쇄 CDR2, 및
f) 경쇄 CDR3
을 포함한다.
CDR은 상기 "발명의 내용" 섹션 및 아래에서 정의된다.
일 구현예에서, 중쇄 CDR1은
a1) NARXHC34XHC35VS(서열번호 3)(XHC34는 M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T이고, XHC35는 G임), 또는
a2) 상기 중쇄 CDR1과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC34 및 XHC35 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), a1)의 중쇄 CDR1의 변이체
를 포함한다.
일 구현예에서, 중쇄 CDR2는
b1) HIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKS(서열번호 6)(XHC54는 F이고, XHC58은 E이고, XHC60은 S임), 또는
b2) 상기 중쇄 CDR2와 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC54, XHC58, 및 XHC60 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), b1)의 중쇄 CDR2의 변이체
를 포함한다.
일 구현예에서, 중쇄 CDR3은
c1) SVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 8)(XHC109는 D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H이고, XHC102는 V이고, XHC104는 G이고, XHC108은 Y임), 또는
c2) 상기 중쇄 CDR3과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), c1)의 중쇄 CDR3의 변이체
를 포함한다.
일 구현예에서, 경쇄 CDR1은
d1) GGXLC25NIGSESVH(서열번호 11)(XLC25는 N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M임), 또는
d2) 상기 경쇄 CDR1과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC25 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), d1)의 경쇄 CDR1의 변이체
를 포함한다.
일 구현예에서, 경쇄 CDR2는
e1) XLC49XLC50SDRPS(서열번호 14)(XLC49는 D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I이고, XLC50은 D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y임), 또는
e2) 상기 경쇄 CDR2와 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC49 및 XLC50 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), e1)의 경쇄 CDR2의 변이체
를 포함한다.
일 구현예에서, 경쇄 CDR3은
f1) QVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 19)(XLC91은 D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K이고, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F이고, XLC95는 D임), 또는
f2) 상기 경쇄 CDR3과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), f1)의 경쇄 CDR3의 변이체
를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은
a) NARXHC34XHC35VS(서열번호 3)(XHC34는 M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T이고, XHC35는 G임)를 포함하는 중쇄 CDR1,
b) HIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKS(서열번호 6)(XHC54는 F이고, XHC58은 E이고, XHC60은 S임)를 포함하는 중쇄 CDR2,
c) SVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 8)(XHC109는 D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H이고, XHC102는 V이고, XHC104는 G이고, XHC108은 Y임)를 포함하는 중쇄 CDR3,
d) GGXLC25NIGSESVH(서열번호 11)(XLC25는 N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M임)를 포함하는 경쇄 CDR1,
e) XLC49XLC50SDRPS(서열번호 14)(XLC49는 D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I이고, XLC50은 D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y임)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는
f) QVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 19)(XLC91은 D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K이고, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F이고, XLC95는 D임)를 포함하는 경쇄 CDR3
을 포함한다.
일부 구현예에서, XHC34는 V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T, 예컨대 V이다. 일부 구현예에서, XHC109는 E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H, 예컨대 E이다. 일부 구현예에서, XLC25는 S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M, 예컨대 S이다. 일부 구현예에서, XLC49는 S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I, 예컨대 S 또는 E이다. 예를 들어, XLC49는 S일 수 있다. 일부 구현예에서, XLC50은 D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y, 예컨대 E 또는 A이다. 예를 들어, XLC50은 E일 수 있다. 일부 구현예에서, XLC91은 D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K, 예컨대 E이다. 일부 구현예에서, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F, 예컨대 E이다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질의 일부 구현예에서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S 또는 E이고, XLC50은 E 또는 A이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E이다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질의 일부 구현예에서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S이고, XLC50은 E이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 본 연구에서 확인된 Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, Ab0430으로 표기되는 항체의 CDR을 포함한다. 이들 항체의 CDR(Kabat에 따름)은 표 1에 표시되어 있다.
IMGT 명명법에 따른 Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, Ab0430의 CDR은 표 2에 표시되어 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은
i) 하기 i1) 또는 i2)를 포함하는 중쇄 가변 영역:
i1) GFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 21)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 22, 23, 또는 24로 표시되는 아미노산 서열, 또는
i2) i1)에 따른 서열의 변이체로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) 하기 ii1) 또는 ii2)를 포함하는 경쇄 가변 영역:
ii1) GGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 25)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 26, 27, 또는 28로 표시되는 아미노산 서열, 또는
ii2) ii1)에 따른 서열의 변이체로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
을 포함한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 다음과 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 29)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 예컨대 서열번호 30, 31, 또는 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는
상기 중쇄 가변 영역의 변이체로서, 상기 중쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV FGGGTKLTVL(서열번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 예컨대 34, 35, 또는 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
상기 경쇄 가변 영역의 변이체로서, 상기 경쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음).
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, Ab0430으로 표기되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 또는 상기 영역의 변이체(상기 기준을 충족)를 포함한다. 표 3은 이들 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열을 나타낸다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Ab0331 및 Ab0428의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이에 따라, 항원 결합 단백질은 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Ab0335 및 Ab0429의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이에 따라, 항원 결합 단백질은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Ab0351 및 Ab430의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 다음과 같은 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(서열번호 37)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 38, 39, 40, 41, 42, 또는 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는
상기 중쇄의 변이체로서, 상기 중쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호 44)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 상기 경쇄의 변이체로서, 상기 경쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음).
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질은 Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, Ab0430으로 표기되는 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄의 변이체(상기 기준을 충족)를 포함한다. 표 4는 이들 항체의 전체 경쇄 및 중쇄의 서열을 나타낸다. CDR은 볼드체로 표시되어 있다. 가변 도메인은 밑줄로 표시되어 있다. 중쇄의 Fc 백본은 이중밑줄로 표시되어 있다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 제공된 항원 결합 단백질은 β-Klotho에, 또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에, 또는 β-Klotho와 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체 둘 다에 결합한다. 일부 구현예에서, 제공된 항원 결합 단백질은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합한다.
일 구현예에서, 제공된 항원 결합 단백질은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체를 활성화한다.
유리하게는, 제공된 항원 결합 단백질은 단일클론 항체와 같은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일 구현예에서, 항체는 2가 항체이다. 또한, 항원 결합 단편은 2가 항원 결합 단편인 것으로 고려된다.
섹션 B) FGFR1/KLB 효능적 항원 결합 단백질 및 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드를 포함하는 접합체.
전술한 바와 같이, FGFR1/KLB 표적화 효능적 항원 결합 단백질 또는 이의 단편, 및 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드를 포함하는 접합체가 본원에서 제공된다. 구체적으로, 접합체는 β-Klotho에 및/또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합하는 항원 결합 단백질로서 적어도 하나의 GLP-1 펩티드에 접합된 항원 결합 단백질을 포함한다.
일반적으로, 본원에 제공된 접합체에 포함된 항원 결합 단백질은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체를 활성화한다(상기 참조, 예를 들어 상기 섹션 B "발명의 내용" 참조).
유리하게는, 본원에 제공된 접합체에 포함된 항원 결합 단백질은 단일클론 항체와 같은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다. 예를 들어, 항체는 상기 섹션 A("발명의 내용" 및 "본 발명의 상세한 설명")에 기재된 항체일 수 있다. 전형적으로, 항체는 2가 항체이다. 또한, 항원 결합 단편은 2가 항원 결합 단편인 것으로 고려된다.
일 구현예에서, 접합체는 단일클론 항체 16H7에 비해 개선된 물리화학적 특성, 예컨대 증가된 안정성을 갖는 항원 결합 단백질을 포함한다. 항원 결합 단백질은 i) 본원에 정의된 경쇄 CDR 1, 2, 및 3, 및 중쇄 CDR 1, 2, 및 3, 본원에 정의된 경쇄 및 중쇄 가변 영역, 및/또는 본원에 정의된 경쇄 및 중쇄를 포함해야 한다.
구체적으로, 항원 결합 단백질은 16H7과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함해야 한다. 일 구현예에서, 감소된 안정성과 관련된 16H7의 적어도 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 자연 발생 아미노산 잔기로 대체된다. 일부 구현예에서, 감소된 안정성과 관련된 16H7의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 16H7의 중쇄의 M34, 중쇄의 D109, 경쇄의 N25, 경쇄의 D49, 경쇄의 D50, 경쇄의 D91, 및 경쇄의 N93으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 상기 아미노산 잔기가 치환된다. 일부 구현예에서, 상기 아미노산 잔기 모두가 치환된다.
항원 결합 단백질은 또한 각각의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3, 및 중쇄 CDR 1, 2, 및 3의 변이체 CDR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 각각의 CDR과 총 5개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다르다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 각각의 CDR과 총 4개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다르다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 각각의 CDR과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다르다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 각각의 CDR과 총 2개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다르다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 각각의 CDR과 총 1개의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다르다.
일부 구현예에서, 돌연변이는 치환이다. 따라서, 변이체는 각각의 CDR과 총 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 치환이 다르다. 실시예 섹션의 표 D1 및 D2에 나타낸 결과에 기초하여, 당업자는 적합한 치환을 선택할 수 있다.
그러나, 16H7의 중쇄의 아미노산 잔기 G35, F54, E58, S60, G104, 및 Y108, 및 경쇄의 D95는 돌연변이되지 않는 것으로 고려된다. 이에 따라, 항원 결합 단백질은 16H7의 중쇄의 아미노산 잔기 G35, F54, E58, S60, G104 및 Y108, 및 경쇄의 아미노산 잔기 D95에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 고려된다. 따라서, 상기 아미노산 잔기는 돌연변이되어서는 안 된다. 즉 치환 또는 결실되어서는 안 된다.
일부 구현예에서, 16H7의 중쇄에 존재하는 아미노산 잔기 I83은 다른 아미노산, 예컨대 T로 치환된다(I83T 치환).
일 구현예에서, 항원 결합 단백질은
a) 중쇄 CDR1,
b) 중쇄 CDR2,
c) 중쇄 CDR3,
d) 경쇄 CDR1,
e) 경쇄 CDR2, 및
f) 경쇄 CDR3
을 포함한다.
CDR은 상기 "발명의 내용" 섹션 및 아래에서 정의된다.
일 구현예에서, 중쇄 CDR1은
a1) NARXHC34XHC35VS(서열번호 3)(XHC34는 M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T이고, XHC35는 G임), 또는
a2) 상기 중쇄 CDR1과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC34 및 XHC35 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), a1)의 중쇄 CDR1의 변이체
를 포함한다.
일 구현예에서, 중쇄 CDR2는
b1) HIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKS(서열번호 6)(XHC54는 F이고, XHC58은 E이고, XHC60은 S임), 또는
b2) 상기 중쇄 CDR2와 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC54, XHC58, 및 XHC60 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), b1)의 중쇄 CDR2의 변이체
를 포함한다.
일 구현예에서, 중쇄 CDR3은
c1) SVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 8)(XHC109는 D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H이고, XHC102는 V이고, XHC104는 G이고, XHC108은 Y임), 또는
c2) 상기 중쇄 CDR3과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), c1)의 중쇄 CDR3의 변이체
를 포함한다.
일 구현예에서, 경쇄 CDR1은
d1) GGXLC25NIGSESVH(서열번호 11)(XLC25는 N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M임), 또는
d2) 상기 경쇄 CDR1과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC25 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), d1)의 경쇄 CDR1의 변이체
를 포함한다.
일 구현예에서, 경쇄 CDR2는
e1) XLC49XLC50SDRPS(서열번호 14)(XLC49는 D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I이고, XLC50은 D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y임), 또는
e2) 상기 경쇄 CDR2와 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC49 및 XLC50 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), e1)의 경쇄 CDR2의 변이체
를 포함한다.
일 구현예에서, 경쇄 CDR3은
f1) QVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 19)(XLC91은 D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K이고, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F이고, XLC95는 D임), 또는
f2) 상기 경쇄 CDR3과 총 5개, 4개, 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), f1)의 경쇄 CDR3의 변이체
를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은
g) NARXHC34XHC35VS(서열번호 3)(XHC34는 M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T이고, XHC35는 G임)를 포함하는 중쇄 CDR1,
h) HIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKS(서열번호 6)(XHC54는 F이고, XHC58은 E이고, XHC60은 S임)를 포함하는 중쇄 CDR2,
i) SVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 8)(XHC109는 D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H이고, XHC102는 V이고, XHC104는 G이고, XHC108은 Y임)를 포함하는 중쇄 CDR3,
j) GGXLC25NIGSESVH(서열번호 11)(XLC25는 N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M임)를 포함하는 경쇄 CDR1,
k) XLC49XLC50SDRPS(서열번호 14)(XLC49는 D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I이고, XLC50은 D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y임)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는
l) QVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 19)(XLC91은 D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K이고, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F이고, XLC95는 D임)를 포함하는 경쇄 CDR3
을 포함한다.
일부 구현예에서, XHC34는 V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T, 예컨대 V이다. 일부 구현예에서, XHC109는 E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H, 예컨대 E이다. 일부 구현예에서, XLC25는 S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M, 예컨대 S이다. 일부 구현예에서, XLC49는 S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I, 예컨대 S 또는 E이다. 예를 들어, XLC49는 S일 수 있다. 일부 구현예에서, XLC50은 D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y, 예컨대 E 또는 A이다. 예를 들어, XLC50은 E일 수 있다. 일부 구현예에서, XLC91은 D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K, 예컨대 E이다. 일부 구현예에서, XLC93은 N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F, 예컨대 E이다.
항원 결합 단백질의 일부 구현예에서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S 또는 E이고, XLC50은 E 또는 A이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E이다.
항원 결합 단백질의 일부 구현예에서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S이고, XLC50은 E이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 본 연구에서 확인된 Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, Ab0430으로 표기되는 항체의 CDR을 포함한다. 이들 항체의 CDR(Kabat에 따름)은 표 1에 표시되어 있다.
IMGT 명명법에 따른 Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, Ab0430의 CDR은 표 2에 표시되어 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 항원 결합 단백질은
i) 하기 i1) 또는 i2)를 포함하는 중쇄 가변 영역:
i1) GFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 21)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 22, 23, 또는 24로 표시되는 아미노산 서열, 또는
i2) i1)에 따른 서열의 변이체로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) 하기 ii1) 또는 ii2)를 포함하는 경쇄 가변 영역:
ii1) GGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 25)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 26, 27, 또는 28로 표시되는 아미노산 서열, 또는
ii2) ii1)에 따른 서열의 변이체로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
을 포함한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 항원 결합 단백질은 다음과 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 29)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 예컨대 서열번호 30, 31, 또는 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는
상기 중쇄 가변 영역의 변이체로서, 상기 중쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV FGGGTKLTVL(서열번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 예컨대 34, 35, 또는 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
상기 경쇄 가변 영역의 변이체로서, 상기 경쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음).
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, Ab0430으로 표기되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 또는 상기 영역의 변이체(상기 기준을 충족)를 포함한다. 표 3은 이들 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열을 나타낸다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Ab0331 및 Ab0428의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이에 따라, 항원 결합 단백질은 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Ab335 및 Ab429의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이에 따라, 항원 결합 단백질은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Ab351 및 Ab430의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 항원 결합 단백질은 다음과 같은 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(서열번호 37)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 38, 39, 40, 41, 42, 또는 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는
상기 중쇄의 변이체로서, 상기 중쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호 44)의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 상기 경쇄의 변이체로서, 상기 경쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음).
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, Ab0430으로 표기되는 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄의 변이체(상기 기준을 충족)를 포함한다. 표 4는 이들 항체의 전체 경쇄 및 중쇄의 서열을 나타낸다. CDR은 볼드체로 표시되어 있다. 가변 도메인은 밑줄로 표시되어 있다. 중쇄의 Fc 백본은 이중밑줄로 표시되어 있다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 β-Klotho에, 또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에, 또는 β-Klotho와 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체 둘 다에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합한다.
본원에 제공된 접합체에서, 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합된다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 서열번호 59, 60, 61, 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 정의는 위에서 제공되었다.
예를 들어, X1은 H, Y, 또는 F일 수 있다. 일 구현예에서, X1은 H이다.
예를 들어, X10은 K 또는 L일 수 있다. 일 구현예에서, X10은 K이다. 다른 구현예에서, X10은 L이다.
예를 들어, X12는 K, I, Q, 또는 E, 예컨대 K, I, 또는 Q일 수 있다. 일 구현예에서, X12는 K이다. 다른 구현예에서, X12는 I이다.
예를 들어, X13은 Q 또는 L일 수 있다. 일 구현예에서, X13은 Q이다. 다른 구현예에서, X13은 L이다.
예를 들어, X14는 L 또는 C일 수 있다. 일 구현예에서, X14는 C이다. 다른 구현예에서, X14는 L이다.
예를 들어, X15는 E, A, 또는 D, 예컨대 E 또는 D이다. 일 구현예에서, X15는 E이다. 다른 구현예에서, X15는 D이다.
예를 들어, X16은 E, K, 또는 S, 예컨대 E 또는 K이다. 일 구현예에서, X16은 E이다. 다른 구현예에서, X16은 K이다.
예를 들어, X17은 E, R, 또는 Q, 예컨대 E 또는 R이다. 일 구현예에서, X17은 E이다. 다른 구현예에서, X17은 R이다.
예를 들어, X18은 L, A, 또는 R, 예컨대 A 또는 R이다. 일 구현예에서, X18은 A이다. 다른 구현예에서, X18은 R이다.
예를 들어, X19는 V, A, F, 또는 Q, 예컨대 V, A, 또는 F, 또는, 예를 들어 V 또는 Q이다.
예를 들어, X20은 R, H, Q, K, 또는 I, 예컨대 R, H, 또는 Q, 예컨대 R 또는 Q이다. 일 구현예에서, X20은 Q이다. 다른 구현예에서, X20은 R이다.
예를 들어, X21은 L, E, H, 또는 R이다. 일 구현예에서, X21은 L이다. 다른 구현예에서, X21은 E이다.
예를 들어, X23은 I, Y, 또는 F이다. 일 구현예에서, X23은 I이다.
예를 들어, X24는 E, A, L, 또는 Y이다. 일 구현예에서, X24는 E이다. 다른 구현예에서, X24는 Y이다. 예를 들어, X27은 I, L, K, V, 또는 E이다.
예를 들어, X28은 A, K, N, 또는 E이다. 일 구현예에서, X28은 A이다.
예를 들어, X29는 G, T, K, V, 또는 부재, 예컨대 G 또는 T이다. 일 구현예에서, X29는 G이다. 다른 구현예에서, X29는 T이다.
예를 들어, X30은 G, R, 또는 부재이다. 일부 구현예에서, X30은 G이다.
X31 내지 X42는 위에서 정의되었다. 일 구현예에서, X14 및 X42는 둘 다 C이다.
일 구현예에서, 상기 GLP-1R 효능적 펩티드는 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 단일 아미노산 잔기이다. 일 구현예에서, 적어도 단일의 아미노산 잔기는 G이다.
아미노산 서열 서열번호 61 및 62를 포함하거나 이로 이루어진 GLP-1R 효능적 펩티드는 임의로, C-말단에 최대 12개, 11개, 또는 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연장을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 펩티드 연장의 서열은 서열번호 59의 X31 내지 X 42의 서열에 상응한다. 일 구현예에서, 펩티드 연장은 단일 아미노산 잔기, 예를 들어 P이다. 일 구현예에서, 펩티드 연장은 아미노산 서열 PSSGAPPPS(서열번호 63)를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 구현예에서, 펩티드 연장은 아미노산 서열 PKKIRYS(서열번호 64)를 포함하거나 이로 이루어진다. 또한, 서열번호 59 및 60의 펩티드는 서열번호 63 또는 64의 펩티드 연장을 포함하는 것으로 고려된다.
펩티드 연장에 대한, 또는 서열번호 60 또는 61의 아미노산 영역 X30 내지 X42에 대한 예시적인 아미노산 서열은 표 A3에 볼드체로 강조 표시되어 있다.
일 구현예에서, GLP-1R 효능적 펩티드는 서열번호 51, 52, 53, 54, 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 정의는 위에서 제공되었다.
접합체의 일 구현예에서, 항원 결합 단편은 1개, 2개, 3개, 또는 4개 이상의 GLP-1 펩티드, 예컨대 2개 또는 4개의 GLP-1 펩티드에 접합된다.
접합체의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질의 각각의 중쇄 가변 영역 및/또는 각각의 경쇄 가변 영역은 적어도 하나의 GLP-1 펩티드에 접합된다.
접합체의 일 구현예에서, 적어도 하나의 GLP-1 펩티드의 C-말단은 항원 결합 단백질에 접합된다.
접합체의 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커, 예컨대 전술한 바와 같은 펩티드 링커를 통해 적어도 하나의 GLP-1 펩티드에 접합된다.
본 발명은 또한 다음의 요지에 관한 것이다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질(예를 들어, 섹션 A 참조) 또는 본원에 제공된 접합체(예를 들어, 섹션 B 참조)를 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 추가로 제공된다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 추가로 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 추가로 제공된다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오티드, 본원에 제공된 벡터 폴리뉴클레오티드, 및/또는 본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공된 접합체를 포함하는 숙주 세포가 추가로 제공된다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공된 접합체를 생성하는 방법으로서, 상기 항원 결합 단백질의 발현이 가능한 조건에서 본원에 제공된 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법이 추가로 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질, 본원에 제공된 접합체, 또는 본원에 제공된 약제학적 조성물은 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.
적용/치료
본원에 제공된 항원 결합 단백질, 본원에 제공된 접합체 또는 약제학적 조성물은 연구, 치료, 또는 예방에 사용될 수 있다.
본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공된 접합체 또는 본원에 제공된 약제학적 조성물을 유효량으로 상기 숙주 세포에 투여하는 단계를 포함하는 생체내 또는 시험관내 방법이 본 발명에 포함된다.
인간과 같은 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 예를 들어 질환 또는 장애를 치료하기 위해, 상기 대상체에게 본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공된 접합체, 또는 본원에 제공된 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
추가 양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공된 접합체, 또는 본원에 제공된 약제학적 조성물은 질환 또는 장애의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 비만, 과체중, 대사 증후군, 제2형 진성 당뇨병과 같은 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH), 및/또는 죽상동맥경화증으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 비만이 치료된다.
일부 구현예에서, 비만인 대상체가 치료된다.
일부 구현예에서, 제2형 진성 당뇨병과 같은 당뇨병이 치료된다.
일부 구현예에서, 당뇨병성 망막병증이 치료된다.
일부 구현예에서, 고혈당증이 치료된다.
일부 구현예에서, 이상지질혈증이 치료된다.
일부 구현예에서, NASH가 치료된다.
일부 구현예에서, 이상지질혈증이 치료된다.
일부 구현예에서, 죽상동맥경화증이 치료된다.
서열
[표 1]
Figure pct00001
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
[표 4]
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명은 하기 항목을 추가로 포함한다. 상기 본원에 제공된 정의는 필요한 부분을 준용하여 적용된다.
1. 접합체로서,
a) 하기 a1) 또는 a2)를 포함하는 중쇄 CDR1:
a1) NARXHC34XHC35VS(서열번호 3)(XHC34는 V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T이고, XHC35는 G임), 또는
a2) 상기 중쇄 CDR1과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC34 및 XHC35 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), a1)의 중쇄 CDR1의 변이체,
b) 하기 b1) 또는 b2)를 포함하는 중쇄 CDR2:
b1) HIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKS(서열번호 6)(XHC54는 F이고, XHC58은 E이고, XHC60은 S임), 또는
b2) 상기 중쇄 CDR2와 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC54, XHC58, 및 XHC60 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), b1)의 중쇄 CDR2의 변이체,
c) 하기 c1) 또는 c2)를 포함하는 중쇄 CDR3:
c1) SVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 8)(XHC109는 E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H이고, XHC102는 V이고, XHC104는 G이고, XHC108은 Y임), 또는
c2) 상기 중쇄 CDR3과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), c1)의 중쇄 CDR3의 변이체,
d) 하기 d1) 또는 d2)를 포함하는 경쇄 CDR1:
d1) GGXLC25NIGSESVH(서열번호 11)(XLC25는 S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M임), 또는
d2) 상기 경쇄 CDR1과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC25 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), d1)의 경쇄 CDR1의 변이체,
e) 하기 e1) 또는 e2)를 포함하는 경쇄 CDR2:
e1) XLC49XLC50SDRPS(서열번호 14)(XLC49는 S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I이고, XLC50은 E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y임), 또는
e2) 상기 경쇄 CDR2와 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC49 및 XLC50 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), e1)의 경쇄 CDR2의 변이체,
및/또는
f) 하기 f1) 또는 f2)를 포함하는 경쇄 CDR3:
f1) QVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 19)(XLC91은 E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K이고, XLC93은 E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F이고, XLC95는 D임), 또는
f2) 상기 경쇄 CDR3과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), f1)의 경쇄 CDR3의 변이체,
을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함하고,
항원 결합 단백질은 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합되고, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
X1-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-X12-X13-L-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-E-W-L-X27-X28-X29-G(서열번호 61)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X1은 H, Y, 또는 F이고,
X10은 K 또는 L이고,
X12는 K, I, 또는 Q이고,
X13은 Q 또는 L이고,
X15는 E, A, 또는 D이고,
X16은 E, K, 또는 S이고,
X17은 E, R, 또는 Q이고,
X18은 L, A, 또는 R이고,
X19는 V, A, 또는 F이고,
X20은 R, H, Q, K, 또는 I이고,
X21은 L, E, H, 또는 R이고,
X23은 I, Y, 또는 F이고,
X27은 I, L, K, 또는 E이고,
X28은 A, K, N, 또는 E이고,
X29는 G, T, K, 또는 V이고;
임의로, 아미노산 서열은 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 추가로 포함하고;
임의로, 아미노산 서열은 C-말단에 최대 약 12개, 약 11개, 또는 약 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연장을 추가로 포함하는, 접합체.
2. 항목 1에 있어서, 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
H-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-K-Q-L-E-E-E-X18-V-X20-L-F-I-E-W-L-K-A-X29-G(서열번호 62)를 포함하거나 이로 이루어지며,
X10은 K 또는 L이고,
X18은 A 또는 R이고,
X20은 R 또는 Q이고,
X29는 G 또는 T이고;
임의로, 아미노산 서열은 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 추가로 포함하고;
임의로, 아미노산 서열은 C-말단에 최대 약 12개, 약 11개, 또는 약 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연장을 추가로 포함하는, 접합체.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 펩티드 연장은 아미노산 서열 PSSGAPPPS(서열번호 63) 또는 PKKIRYS(서열번호 64)를 포함하거나 이로 이루어진, 접합체.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고/이거나, 항원 결합 단백질은 1, 2, 3, 4개 이상의 GLP-1R 효능적 펩티드, 예컨대 2개 또는 4개의 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합되는, 접합체.
5. 항목 4에 있어서, 각각의 중쇄 가변 영역 및/또는 각각의 경쇄 가변 영역은 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합되는, 접합체.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 결합 단백질은 링커, 예컨대 적어도 2개 아미노산의 길이를 갖는 링커 펩티드를 통해 적어도 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합되는, 접합체.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S 또는 E이고, XLC50은 E 또는 A이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E이고,
예를 들어, 항원 결합 단백질은
i. NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, SESDRPS(서열번호 15)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3,
ii. NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, SASDRPS(서열번호 16)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3, 또는
iii. NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, EESDRPS(서열번호 17)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3
을 포함하는, 접합체.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 결합 단백질은
i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 29)의 중쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역의 변이체로서 상기 중쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, HC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV FGGGTKLTVL(서열번호 33)의 경쇄 가변 영역, 또는 상기 경쇄 가변 영역의 변이체로서 상기 경쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음)
를 포함하는, 접합체.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목에 있어서,
a) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARVGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVVTGGYYYEGMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 30)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGSNIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYSESDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWEGESDHVVFGGGTKLTVL(서열번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
b) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARVGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVVTGGYYYEGMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGSNIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYSASDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWEGESDHVVFGGGTKLTVL(서열번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
c) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARVGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVVTGGYYYEGMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGSNIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYEESDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWEGESDHVVFGGGTKLTVL(서열번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항원 결합 단백질.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 결합 단백질은
i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
또는 상기 중쇄의 변이체로서, 상기 중쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
및
ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
또는 상기 경쇄의 변이체로서, 상기 경쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음)
를 포함하고,
예를 들어, 항원 결합 단백질은
a) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
c) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
d) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
e) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
또는
f) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 접합체.
11. 항목 1 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 결합 단백질은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 2가 항체 및/또는 2가 항원 결합 단편인, 접합체.
12. 항목 1 내지 11 중 어느 항목의 접합체를 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
13. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 접합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및/또는 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 접합체를 포함하는 숙주 세포.
14. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 접합체를 생성하는 방법으로서, 상기 접합체의 발현이 가능한 조건에서 항목 13의 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
15. 비만, 과체중, 대사 증후군, 제2형 진성 당뇨병과 같은 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH), 및/또는 죽상동맥경화증의 치료에 사용하기 위한, 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 접합체, 또는 항목 12의 약제학적 조성물.
이하, 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 추가로 설명하며, 이는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라 예시하기 위함이다.
실시예
물질 및 방법
본원에 기재된 연구에서, 항체, GLP-펩티드, 및 항체/GLP-펩티드 융합체를 생성하였다. 생성된 각 화합물에는 문자와 숫자로 구성된 고유 식별자를 할당하였다. 문자는 화합물의 유형을 나타낸다: "Ab"는 항체, "P"는 펩티드, "Fu"는 항체/GLP-펩티드 융합체이다.
[표 A1]
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
[표 A2]
Figure pct00012
[표 A3]
Figure pct00013
Figure pct00014
[표 A4]
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
사용된 약어는 다음과 같다:
AA 아미노산
ACN 아세토니트릴
AUC 곡선 아래 면적
cAMP 환형 아데노신 모노포스페이트
Boc tert-부틸옥시카보닐
BOP (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트
BSA 소 혈청 알부민
BW 체중
tBu 3차 부틸
CV 컬럼 부피
DCM 디클로로메탄
DIC N,N'-디이소프로필카보디이미드
DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민
dl 데시리터
DMEM 둘베코 변형 이글 배지
DMF 디메틸 포름아미드
DMS 디메틸설파이드
DPBS 둘베코 인산염 완충 식염수
EDT 에탄디티올
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
eq 당량
FA 포름산
FBS 소태아 혈청
Fmoc 플루오레닐메틸옥시카보닐
g 그램
GIP 포도당 의존성 인슐린 분비자극 폴리펩티드
GIPR GIP 수용체
GLP-1 글루카곤 유사 펩티드 1
GLP-1R GLP-1 수용체
GCG 글루카곤
GCGR 글루카곤 수용체
HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HBSS 행크스 평형염 용액
HBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트
HEPES 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄설폰산
HOAt 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸
HOBt 1-하이드록시벤조트리아졸
HOSu N-하이드록시석신이미드
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
HSA 인간 혈청 알부민
HTRF 균일 시간차 형광
kg 킬로그램
l 리터
LC/MS 액체 크로마토그래피/질량분석법
M 몰
MBHA 4-메틸벤즈하이드릴아민
min 분
ml 밀리리터
mm 밀리미터
μm 마이크로미터
mM 밀리몰
mmol 밀리몰
n.a. 사용 불가
n.d. 측정 불가
nM 나노몰
nm 나노미터
nmol 나노몰
μmol 마이크로몰
NMP N-메틸 피롤리돈
Pbf 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로-벤조푸란-5-설포닐
PBS 인산염 완충 식염수
PEG 폴리에틸렌 글리콜
pM 피코몰
RCF 상대 원심 가속도
RP-HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피
rpm 분당 회전수
s.c. 피하
SD 표준 편차
sec 초
SEM 평균의 표준 오차
TFA 트리플루오로아세트산
TIS/TIPS 트리이소프로필실란
Trt 트리틸/트리페닐메틸
TSTU N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트
UHPLC 초고성능 액체 크로마토그래피/초고압 액체 크로마토그래피
UV 자외선
v 부피
A) 생물리학적 특성에 대한 심층 분석, 방법에 대한 자세한 설명
크기 배제 크로마토그래피(SEC)
분석용 SEC는 AdvanceBio 300 컬럼(4.6 mm x 300 mm) 및 AdvanceBio 300 가드 컬럼(Agilent Technologies)이 장착된 BioSECcurity 기기(PSS Polymer)를 사용하여 실온에서 수행하였다. 분석은 280 nm에서 검출하면서 2x 농축 D-PBS 버퍼(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 0.5 mL/분의 유량으로 실행하였다. 10 μl의 단백질 샘플(1 mg/ml)을 컬럼 상에 적용하였다. WinGPC 소프트웨어 v8.1(PSS Polymer)을 사용하여 데이터 평가를 수행하였다. 분자량 추정을 위해 SEC 컬럼을 AdvanceBio SEC 300Å Protein Standard(Agilent Technologies)로 보정하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
분석용 HIC는 TSKgel Butyl-NPR 컬럼(2.5 μm, 4.6 x 35 mm)(Tosoh Bioscience)이 장착된 LC10 HPLC 기기(Shimadzu) 또는 Vanquish HPLC 기기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 실온에서 수행하였다. 분석은 280 nm에서 검출하면서 1 mL/분의 유량으로 실행하였다. 5 μg의 희석되지 않은 단백질 샘플을 컬럼 상에 적용하였다. 구배 용리는 7분 내에 15% B에서 85% B까지, 이어서 1분 내에 100% B까지, 그 후 1분 내에 15% B까지, 그 후 15% B에서 3분의 평형화였다. 버퍼 A는 1.5 mol/L 황산암모늄, 25 mmol/L 인산나트륨 pH 7.0으로 구성되었다. 버퍼 B는 25 mmol/L 인산나트륨 pH 7.0으로 구성되었다. LabSolutions 소프트웨어 v5.85(Shimadzu) 또는 Chromeleon 7 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 데이터 평가를 수행하였다.
나노 시차 주사 형광측정법(nanoDSF)
단백질 변성의 개시 온도(Tonset) 및 융점(Tm)은 나노 시차 주사 형광측정법(nanoDSF)을 사용하여 측정하였다. 샘플을 제형 버퍼에서 0.5 mg/mL의 최종 농도까지 희석하고, 이중으로 nanoDSF 모세관(Nanotemper Technologies)에 로딩하였다. 모든 측정은 Prometheus NT.plex nanoDSF 장치(Nanotemper Technologies)를 사용하여 수행하였다. 가열 속도는 20℃에서 95℃까지 분당 1℃였다. 데이터를 PR.ThermControl 소프트웨어 v2.3.1(Nanotemper Technologies)을 사용하여 기록하고 PR.Stability Analysis 소프트웨어 v1.0.3(Nanotemper Technologies)을 사용하여 분석하였다.
동적 광 산란(DLS)
동적 광 산란(DLS)은 DynaPro Plate Reader(Wyatt Technology)를 사용하여 수행하였다. 샘플을 25℃, 384웰 분석 플레이트(Corning)에서 측정하였다. Dynamics 소프트웨어 버전 7.7.0.125(Wyatt Technology)를 사용하여 누적 피팅으로 데이터를 평가하였다.
DynaPro Plate Reader(Wyatt Technology)를 사용하여 20℃에서 확산 상호작용 파라미터(kD)를 측정하여 샘플의 콜로이드 안정성을 평가하였다. 측정 전에, 샘플을 3.5~5 kDa 컷오프를 갖는 1 mL Float-A-Lyzer G2 장치(Spectrum Labs)를 사용하여 1회 버퍼 교환으로 20시간 동안 투석에 의해 5 L의 10 mmol/L 히스티딘 pH 6.0에 대해 버퍼 교환하였다. 0.5 mg/mL 증분으로 1~4.5 mg/mL의 일련의 희석을 10 mmol/L 히스티딘 pH 6.0에서 준비하고 384웰 분석 플레이트(Corning)에서 측정하였다.
모세관 등전 집속(ciEF)
항체 샘플의 전하 비균질성은 Maurice C 장치(Protein Simple)를 사용하여 모세관 등전 집속(ciEF)으로 측정하였다. 양성전해질 믹스 3-10(Protein Simple)과 5.85 및 9.0의 펩티드 pI 마커(Protein Simple)를 사용하여 제조사에서 제공한 cIEF 프로토콜에 따라 샘플을 준비하였다. Compass 소프트웨어 v2.1.0(Protein Simple)을 사용하여 cIEF 실행을 분석하였다.
모세관 겔 전기영동(cGE)
샘플의 순도 및 크기 비균질성은 사전 조립된 용융 실리카 모세관(50 μm x 300 mm, SCIEX)이 장착된 CESI8000 기기(SCIEX)를 사용하여 모세관 겔 전기영동(cGE)으로 측정하였다. 제조사의 사양에 따라 비환원 조건에서 IgG 순도 비균질성 키트(SCIEX)를 사용하여 1 mg/ml의 단백질 샘플을 준비하였다. 샘플을 25℃에서 35분 동안 전기영동으로 분리하고, 220 nm에서의 흡광도를 포토다이오드 어레이(PDA) 검출기로 기록하였다. 32 Karat 소프트웨어(SCIEX)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
가속 스트레스 안정성
항체 샘플의 화학적 안정성 변화를 모니터링하기 위해 가속 스트레스 안정성 연구를 수행하였다. 항체 변이체의 화학적 안정성을 스크리닝하기 위해, 최대 28일 동안 40℃, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L 히스티딘 버퍼 pH 6.0에서 가속 스트레스 안정성을 수행하였다. 대조군 샘플은 -80℃에 보관하였고, 스트레스 후 샘플도 분석 전에 -80℃로 동결시켰다. 이어서, 스트레스를 받은 샘플과 대조군 샘플을 인간 KLB에 대한 해리율(KD) 측정을 위한 SPR 및 세포 분석으로 분석하였다. 최적화된 항체 변이체 및 16H7 항체를 사용한 가속 스트레스 안정성의 경우, 샘플을 1회 버퍼 교환으로 5 L의 각 스트레스 버퍼(10 mmol/L 아세트산 나트륨 또는 시트르산 나트륨 버퍼 pH 5.0, 10 mmol/L 히스티딘 버퍼 pH 6.0, 10 mmol/L 인산나트륨 버퍼 pH 8.0)에 대해 3.5~5 kDa 컷오프를 갖는 1 mL Float-A-Lyzer G2 장치(Spectrum Labs)를 사용하여 20시간 동안 투석에 의해 버퍼 교환하였다. 버퍼 교환된 샘플의 농도를 각각의 버퍼를 사용하여 1 mg/mL로 조정하고, 샘플을 인큐베이터에서 40℃로 최대 21일 동안 인큐베이션하였다. 비교를 위해, 16H7 항체에도 28일 동안 40℃, 제형 버퍼에서 스트레스를 가하였다. 대조군 샘플 및 각각의 버퍼에서 스트레스를 받은 샘플을 분석 전에 -80℃에서 동결시켰다.
원형 질량 분석법(IMS)
단백질 무결성은 LC-MS로 분석하였다. 항체 샘플을 PNGaseF(1:50 (v/v))(글리세롤 비함유, NewEnglandBiolabs)로 처리된 ddH2O에서 0.5 mg/mL로 희석된 12.5 μg의 단백질을 사용하여 37℃에서 15시간 동안 탈글리코실화하였다. LC-MS 분석은 ESI 인터페이스 및 Agilent 1290/1260 Infinity LC가 장착된 Agilent 6540 UHD(Ultra High Definition) Q-TOF를 사용하여 수행하였다. 역상(RP) 크로마토그래피는 가드 컬럼(PLRP-S 300A 5 μm, 3 x 5 mm(Agilent), 200 μL/분, 80℃ 컬럼 온도)이 장착된 PLRP-S 1000A 5 μm, 50 x 2.1 mm(Agilent)를 사용하여 수행하였다. 용리액은 LC 물 및 0.1% 포름산을 함유하는 버퍼 A, 및 90% 아세토니트릴, 10% LC 물, 및 0.1% 포름산을 함유하는 버퍼 B였다. 1 μg의 단백질을 컬럼에 주입하고 아세토니트릴 농도를 증가시키면서 0분에서 17분까지의 선형 구배를 사용하여 용리시켰다. MassHunter Bioconfirm B.06(Agilent)을 사용하여 데이터를 분석하였다. GPMAW 소프트웨어 버전 10(Lighthouse data)을 사용하여 단백질의 아미노산 서열을 기반으로 분자 질량을 계산하였다.
B) 펩티드 매핑(PM)
트립신 펩티드 매핑 실험을 위한 mAb 샘플 준비
100 μg의 기준 mAb 및 스트레스를 받은 샘플을 37℃에서 0.2 mol/L 히스티딘 클로라이드, 5.6 mmol/L 구아니디늄 하이드로클로라이드, 및 10 mmol/L TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀, Thermo Fisher Scientific) pH 6을 사용하여 변성시켰다. 0.5 mL Zeba 스핀 탈염 컬럼(Thermo Fisher Scientific)에서 20 mmol/L 히스티딘 클로라이드, 0.5 mmol/L TCEP, pH 6으로 버퍼를 교환하였다. mAbs를 1:20의 효소 대 기질 비율로 37℃에서 밤새 분해하였다. 10% 포름산 용액 7 μL를 첨가하여 분해를 중단시키고, 샘플을 추가 분석할 때까지 -80℃에서 동결시켰다.
액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법에 의한 변형된 펩티드의 검출
EASY-ETD 이온 소스(Thermo Fisher Scientific)가 장착된 orbitrap FusionTM LumosTM TribridTM 질량분석기에 결합된 VanquishTM Flex UHPLC 시스템을 사용하여 펩티드를 분석하였다.
펩티드 분리를 위해 2원 용매 시스템: (A) 0.1% 포름산 (B) 90% 아세토니트릴, 0.1% 포름산을 사용하였다. Hypersil GOLDTM C18 LC-컬럼(1.9 μm 입자 크기를 갖는 150 mm x 2.1 mm, Thermo Fisher Scientific)에서 50분 동안 선형적으로 증가하는 농도의 용매 B에 이어 5분간 95% B 세척 및 5분간 5% 용매 B로 재평형화하는 1시간 구배로 0.5 μg의 트립신 분해 샘플을 분리하였다. 컬럼에서 분리된 펩티드는 다음과 같은 중요한 설정으로 검출하였다: 전체 MS 스펙트럼은 375~1,500으로 설정된 질량 범위, 4.0e5의 자동 게인 제어(AGC) 타겟, 50 ms의 최대 주입 시간, 및 1 μscan을 사용하여 120,000의 분해능(200 m/z에서 정의)으로 수집하였다. 데이터 종속(MS/MS) 스펙트럼은 200 ms의 주입 시간 내에 5.0e4 AGC 타겟을 축적한 후 15,000의 분해능(200 m/z에서 정의)을 사용하여 상위 5개 데이터 종속 모드에서 수집하였다. 이온은 1.6 Th 분리 창에서 분리되었고 HCD/EThcD 및 EtciD 셀에서 30% 정규화된 충돌 에너지로 단편화되었다. 동적 제외는 10초로 설정하였다.
원시 데이터 처리
수집된 MS 데이터는 Expressionist 소프트웨어(GeneData 버전 11/12/12.5)를 사용하여 처리하고, 올바른 할당 및 상대적 정량 정확도를 보장하기 위해 수동으로 검사하였다. 질량 스펙트럼을 샘플 분자의 아미노산 서열에 대해 검색하였다. 중요한 설정은 각각 10 ppm으로 설정된 MS 및 MS/MS 스펙트럼의 질량 허용오차이다. 검색 파라미터 내에서 고려된 번역후 변형은 아스파라긴에 대한 탈아미드화 및 석신이미드 형성, 아스파트산에 대한 이성체화 및 석신이미드 형성, 피로-글루타메이트 변형, 메티오닌에 대한 산화, 및 Expressionist의 IgG N-글리칸 라이브러리를 사용한 일반적인 N-말단 글리코실화였다.
C) BLI 및 SPR을 통한 결합 친화도 분석
바이오-레이어 간섭법(BLI)
Octet HTX 시스템(Molecular Devices ForteBio, #30-5102)은 바이오-레이어 간섭법(BLI) 기술을 기반으로 하며, 미정제 상청액 내 발현된 항체의 인간 및 원숭이(마카카 파시쿨라리스) KLB 해리율 스크리닝에 사용하였다. 상청액을 6 mmol/L 글루타민을 함유하는 Freestyle F17 발현 배지(Gibco, #A1383502)를 사용하여 25 μg/mL로 희석하였다. 10 μL의 희석된 샘플을 분석 플레이트(Greiner microplates 384웰, PP, 블랙, #781209)로 옮기고 90 μL의 D-PBS(Gibco, #14190-094) + 0.1% BSA(Miltenyi Biotec, #130-091-376)를 사용하여 1:10으로 추가 희석하여 2.5 μg/mL의 최종 농도를 만들었다. 희석된 샘플 내 발현된 항체를 300초 동안 항-hIgG Fc 캡쳐 항체 바이오센서(AHC, Pall ForteBio, #18-5064)에 로딩하였다(로딩 단계). D-PBS + 0.1% BSA에서 60초의 기준선 단계 후, 바이오센서를 5 nmol/L의 인간 KLB(Biotechne R&D Systems, #5889-KB) 또는 5 nmol/L의 원숭이 KLB(Biotechne R&D Systems, #CUST0701 DLWG01 맞춤형 제품) 분석물에 300초 동안 침지시켜 결합 동역학을 기록했다. 이어서, 바이오센서를 D-PBS + 0.1% BSA에 1800초 동안 침지시켜 해리 동역학을 기록했다.
10 mmol/L 글리신/HCl, pH 1.7 및 D-PBS로 각각 5초 동안 바이오센서를 재생하고 중화시키고, 첫 번째 측정 전과 이후의 모든 측정 사이에 3회 사이클을 사용하였다. 각 분석은 3 mm로 설정된 센서 오프셋으로 30℃ 및 1000 rpm 진탕에서 수행하였고 600초의 지연 후 시작하여 10분 동안 플레이트를 평형화하였다.
모든 샘플은 이중 기준 방식으로 측정하였다:
(i) 기준 센서: 분석물로 인간 KLB 또는 원숭이 KLB 대신 D-PBS + 10% 모의 SN + 0.1% BSA를 사용, 및
(ii) 기준 웰: 리간드로 샘플 대신 D-PBS + 10% 모의 SN + 0.1% BSA를 사용.
단일 치환을 갖는 항체 변이체의 모든 측정은 단일 측정으로 수행하였다.
해리율 스크리닝 실험의 데이터 분석은 ForteBio Data Analysis HT 11.0.0.50 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 모든 샘플 데이터 포인트는 다음과 같이 계산하였다:
(i) 이중 기준을 사용하여 비특이적 결합 및 리간드 해리를 보정하고,
(ii) 단계간 보정을 사용하여 두 측정 단계 사이의 오정렬을 방지함.
생성된 결합 곡선을 로컬 전체 1:1 모델로 피팅하고, 해리 상수 koff 및 반응을 소프트웨어로 계산하였다.
표면 플라스몬 공명(SPR)
결합 친화도 및 동역학은 Biacore 8K 기기(GE Healthcare)에서 측정하였다. 희석된 mAb 샘플의 친화도 캡쳐를 위해, 항-인간 Fc 항체(인간 항체 캡쳐 키트, GE Healthcare)를 시리즈 S CM5 센서 칩(GE Healthcare)의 8개 채널 모두에 약 10.000 RU로 고정화하였다. 항-베타-Klotho 항체를 HBS-EP+ 분석 버퍼(GE Healthcare)에 0.04 μg/mL로 희석하였다. 샘플 구획에 항체를 주입한 반면, 기준 구획은 캡쳐된 항체 없이 사용했다. 10 μL/분으로 120초 동안 항체를 주입한 결과 일반적으로 200 RU의 캡쳐 수준이 나타났다. Fc 친화도 캡쳐 후, 10% 비특이적 결합 감소제(GE Healthcare)를 포함한 HBS-EP+ 버퍼에 희석된 항원 인간 베타-Klotho(R&D Systems) 또는 시노몰구스 원숭이 베타-Klotho(R&D Systems)를 0.78 nmol/L 내지 50 nmol/L의 1:1 희석 시리즈로 기준 및 샘플 유동 세포에 주입하였다. 항원 주입의 경우, 180초의 결합 시간 및 1800초의 해리 시간으로 유량을 60 μL/분으로 조정하였다. 베타-Klotho의 최대 결합 신호는 30 RU 범위였다. 각 사이클의 마지막에, 10% 비특이적 결합 감소제(GE Healthcare)가 보충된 인간 항체 캡쳐 키트(GE Healthcare)와 함께 제공된 재생 용액을 30 μL/분으로 1분 동안 주입하여 항체와 항원을 제거하였다. Biacore 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1.1.7442(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 결합 모델로 결합 동역학을 평가하였다.
인간 베타-Klotho 결합에 대한 항체 돌연변이체의 스크리닝은 다른 SPR 분석 설정에서 측정하였다. 인간 베타-Klotho는 전술한 바와 같이 아민 반응성 커플링에 의해 시리즈 S CM5 칩(GE Healthcare)에 고정된 항-His 항체(His 캡쳐 키트, GE Healthcare)에 의해 친화도가 캡쳐되었다. 항체 샘플은 50 nmol/L 농도에서 분석물로 사용하였다. 결합 시간은 240초였고 해리 시간은 300초였다. 칩 표면은 HIs 캡쳐 키트와 함께 제공된 재생 용액을 사용하여 재생하였다. 해리율(kd)은 Biacore 8K Evaluation 소프트웨어 버전 1.1.1.7442(GE Healthcare)에서 단일 지수 피팅을 사용하여 결정하였다.
스트레스를 받은 항체의 활성 분율 분석은 친화도 측정에 대해 전술한 것과 동일한 Fc 캡쳐 분석 설정을 사용하여 SPR로 수행하였다. 이 경우, 인간 베타-Klotho에 대한 결합 및 해리 시간은 각각 240초 및 300초로 설정하였다. 샘플의 활성 분율은 인간 베타-Klotho에 대한 결합 신호와 항체의 Fc 캡쳐 신호의 비를 스트레스를 받지 않은 대조군 샘플의 활성 분율로 정규화하여 계산하였다. 3회 실험의 평균 값을 계산하였다.
D) 펩티드 합성 및 분석
펩티드 화합물의 일반 합성
융합 단백질은 재조합 방법(아래 참조)에 의해 생성된 반면, 펩티드 GLP-1R 효능제는 화학적으로 합성하였다.
물질
다양한 Rink-아미드 수지(예를 들어, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지, Merck Biosciences; 4-[(2,4-디메톡시페닐)(Fmoc-아미노)메틸]페녹시 아세트아미도 메틸 수지, Agilent Technologies)를 0.2~0.7 mmol/g 범위의 로딩으로 펩티드 아미드의 합성에 사용하였다.
Fmoc 보호 천연 아미노산은 예를 들어 Protein Technologies Inc., Senn Chemicals, Merck Biosciences, Novabiochem, Iris Biotech, Bachem, Chem-Impex International, 또는 MATRIX Innovation에서 구입하였다. 합성 전반에 걸쳐 다음과 같은 표준 아미노산을 사용하였다: Fmoc-L-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-L-Asn(Trt)-OH, Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Gln(Trt)-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Boc-Gly-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Boc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Ile-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-Met-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Pro-OH, Fmoc-L-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-L-Val-OH.
고상 펩티드 합성은 예를 들어 표준 Fmoc 화학 및 HBTU/DIPEA 활성화를 사용하여 Prelude 펩티드 합성기(Mesa Laboratories/Gyros Protein Technologies) 또는 유사한 자동 합성기에서 수행하였다. DMF를 용매로 사용하였다.
탈보호: 20% 피페리딘/DMF, 2 x 2.5분.
세척: 7 x DMF.
커플링: DMF 중 2:5:10의 200 mM AA/500 mM HBTU/2 M DIPEA, 2 x 20분. 세척: 5 x DMF.
자동 합성기에서 합성된 펩티드를 82.5% TFA, 5% 페놀, 5% 물, 5% 티오아니솔, 및 2.5% EDT로 구성된 King 절단 칵테일, 또는 95% TFA, 2.5% 물, 및 2.5 % TIS로 구성된 변형된 절단 칵테일을 사용하여 수지로부터 절단하였다. 이어서, 미정제 펩티드를 디에틸 또는 디이소프로필 에테르에 침전시키고, 원심분리하고, 동결건조시켰다. 펩티드를 분석용 HPLC로 분석하고, ESI 질량분광법으로 확인하였다. 미정제 펩티드를 통상적인 분취용 RP-HPLC 정제 절차에 따라 정제하였다.
대안적으로, 펩티드를 수동 합성 절차에 따라 합성하였다.
고상 합성(수동 합성 절차)
건조된 Rink 아미드 MBHA 수지(0.5~0.8 mmol/g) 0.3 g을 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣었다. 수지를 DCM(15 ml)에서 1시간 동안, 그리고 DMF(15 ml)에서 1시간 동안 팽윤시켰다. 수지 상의 Fmoc 기를 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 5분 및 15분 동안 2회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세척하였다(각각 6/6/6회). Kaiser 테스트(정량적 방법)를 사용하여 고체 지지체로부터의 Fmoc의 제거를 확인하였다. 건조 DMF 중 C-말단 Fmoc-아미노산(수지 로딩에 상응하는 5 당량 과량)을 탈보호된 수지에 첨가하고, 5 당량 과량의 DMF 중 DIC 및 HOBT로 Fmoc-아미노산의 커플링을 개시하였다. 반응 혼합물 중 각각의 반응물의 농도는 대략 0.4 M이었다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 로터에서 회전시켰다. 수지를 여과하고 DMF/DCM/DMF로 세척하였다(각각 6/6/6회). 커플링 완료시 펩티드 수지 분취액에서의 Kaiser 테스트는 음성이었다(수지에서 무색). 첫 번째 아미노산 부착 후, 수지에 미반응 아미노기가 존재하는 경우, 아세트산 무수물/피리딘/DCM(1/8/8)을 사용하여 20분 동안 캡핑하여 임의의 서열 결실을 방지하였다. 캡핑 후, 수지를 DCM/DMF/DCM/DMF로 세척하였다(각각 6/6/6/6회). 펩티딜 수지에 부착된 C-말단 아미노산 상의 Fmoc 기를 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 5분 및 15분 동안 2회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세척하였다(각각 6/6/6회). Fmoc-탈보호 완료시 펩티드 수지 분취액에서의 Kaiser 테스트는 양성이었다.
Rink 아미드 MBHA 수지 상의 표적 서열 내의 나머지 아미노산을 DMF 중 수지 로딩에 상응하는 5 당량 과량을 사용하는 Fmoc AA/DIC/HOBt 방법을 사용하여 순차적으로 커플링시켰다. 반응 혼합물 중 각각의 반응물의 농도는 대략 0.4 M이었다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 로터에서 회전시켰다. 수지를 여과하고 DMF/DCM/DMF로 세척하였다(각각 6/6/6회). 각 커플링 단계 및 Fmoc 탈보호 단계 후, Kaiser 테스트를 수행하여 반응 완료를 확인하였다.
수지로부터 펩티드의 최종 절단(수동 합성 절차)
수동 합성에 의해 합성된 펩티딜 수지를 DCM(6x10 ml), MeOH(6x10 ml), 및 에테르(6x10 ml)로 세척하고, 진공 데시케이터에서 밤새 건조시켰다. 펩티드 수지를 실온에서 3~4시간 동안 시약 칵테일(92% TFA, 2% 티오아니솔, 2% 페놀, 2% 물, 및 2% TIPS; 또는 80% TFA, 5% 티오아니솔, 5% 페놀, 2.5% EDT, 2.5% DMS, 및 5% DCM; 또는 95% TFA, 2.5% 물, 및 2.5% TIS)로 처리하여 고체 지지체로부터의 펩티드 절단을 달성하였다. 절단 혼합물을 여과로 수집하고 수지를 TFA(2 ml) 및 DCM(2 x 5 ml)으로 세척하였다. 과량의 TFA 및 DCM을 질소하에 적은 부피로 농축하고, 소량의 DCM(5~10 ml)을 잔류물에 첨가하고 질소하에 증발시켰다. 이 과정을 3~4회 반복하여 대부분의 휘발성 불순물을 제거하였다. 잔류물을 0℃까지 냉각하고, 무수 에테르를 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 원심분리하고, 상청액 에테르를 제거하고, 새로운 에테르를 펩티드에 첨가하고, 다시 원심분리하였다. 미정제 샘플을 분취용 HPLC로 정제하고, 동결건조시켰다. 펩티드의 동일성을 LCMS로 확인하였다.
이황화물 형성
펩티드 서열의 두 시스테인 사이에 분자내 이황화 가교를 형성하기 위해, 다음 두 가지 프로토콜 중 하나를 적용하였다:
정제된 펩티드를 다량의 50% 아세트산 수용액에 용해시켰다. 이어서, 6 당량의 요오드 수용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 HPLC/MS 분석에서 반응 완료가 나타낼 때까지 실온에서 교반하였다. 과량의 아스코브산을 첨가하여 반응을 ??칭하고, 동결건조하고, 분취용 HPLC로 정제하였다. 동결건조 후, 펩티드의 동일성을 LCMS로 확인하였다.
대안적으로, 펩티드를 트리플루오로에탄올(mg당 1 ml)에 용해시키고, 반응 혼합물의 황색이 지속될 때까지 5 ml 아세트산 및 50 ml 트리플루오로에탄올 중 80 mg 요오드의 용액으로 적가 처리하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반한 후, 0.1 N 아스코브산 수용액으로 탈색될 때까지 적가 처리하였다. 반응의 완료는 HPLCMS 분석으로 확인하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 물 및 소량의 ACN으로 희석한 후, 동결건조시켰다. 미정제 샘플을 분취용 HPLC를 통해 정제하고, 동결건조시켰다. 펩티드의 동일성을 LCMS로 확인하였다.
일반적인 분취용 HPLC 정제 절차
미정제 펩티드를 Akta Purifier 시스템, Jasco semiprep HPLC System, Agilent 1100 HPLC 시스템, 또는 유사한 HPLC 시스템에서 정제하였다. 정제될 미정제 펩티드의 양에 따라 다른 크기 및 다른 유량의 분취용 RP-C18-HPLC 컬럼을 사용하였다. 예를 들어 다음의 컬럼을 사용하였다: Waters XSelect CSH C18 OBD Prep 5 μm 30x250 mm, Waters SunFire C18 OBD Prep 5 μm 30x250 mm, Waters SunFire C18 OBD Prep 5 μm 50x150 mm, 및 Phenomenex Luna Prep C18 5 μm 21.2x250 mm. 아세토니트릴(B) 및 물 + 0.1% TFA(A), 또는 물 + 0.1% TFA(A)를 용리액으로 사용하였다. 생성물-함유 분획을 수집하고, 동결건조시켜, 정제된 생성물을 일반적으로 TFA 염으로서 수득하였다.
분석용 HPLC/UHPLC
방법 A: 220 nm에서 검출, 선택적으로 질량분석기 사용: 전기분무 양이온 모드
컬럼: Waters ACQUITY UPLC® BEH™ C18 1.7 μm (100 x 2.1 mm), 40℃
용매: H2O+0.1%FA : ACN+0.1%FA
구배: 98:02 (0분), 98:02 (2.0분), 30:70 (15.0분), 05:95 (20.0분)
방법 B: 214 nm에서 검출
컬럼: Waters ACQUITY UPLC® CSH™ C18 1.7 μm (150 x 2.1 mm), 50℃
용매: H2O+0.05%TFA : ACN+0.035%TFA (유량 0.5 ml/분)
구배: 80:20 (0분) → 80:20 (3분) → 25:75 (23분) → 2:98 (23.5분) → 2:98 (30.5분) → 80:20 (31분) → 80:20 (37분)
질량분석기: Agilent 6230 Accurate-Mass TOF 또는 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF; 둘 다 Dual Agilent Jet Stream ESI 이온 소스 장착.
펩티드 구성요소 P037(표 A3 참조)의 합성
방법 섹션에 설명된 고상 합성을 Novabiochem Rink-아미드 수지(4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지), 100~200 메쉬, 0.35 mmol/g의 로딩에서 수행하였다. 자동 Fmoc-합성 전략을 HBTU/DIPEA-활성화와 함께 적용하였다. 위치 1에서, Boc-Gly-OH를 고상 합성 프로토콜에 사용하였다. 펩티드를 King 칵테일(D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36, 255-266)을 사용하여 수지로부터 절단하였다. 미정제 생성물을 먼저 아세토니트릴/물 구배(0.1% TFA 함유 물)를 사용하는 Waters 컬럼(Waters SunFire C18 OBD Prep 5 μm 50x150 mm) 상의 분취용 HPLC를 통해, 이후 아세토니트릴/물 구배(0.1% TFA 함유 물)를 사용하는 Waters 컬럼(Waters Xselect CSH Prep C18 5 μm 50x150 mm) 상의 분취용 HPLC를 통해 정제하였다. 정제된 펩티드를 수집하고 동결건조시켰다.
정제된 펩티드를 LCMS(방법 B)로 분석하였다. 머무름 시간이 8.71분인 피크 아래에서 확인된 질량 신호의 디컨벌루션은 4288.16의 예상값과 일치하는 펩티드 질량 4288.18을 나타냈다.
펩티드 구성요소 P035(표 A3 참조)의 합성
Novabiochem사로부터 0.43 mmol/g의 로딩, 100~200 μm으로 Rink-수지에서 고상 합성을 수행하였다. Fmoc-합성 전략을 HBTU/DIPEA-활성화와 함께 적용하였다. 위치 1에서, Boc-His(Trt)-OH를 고상 합성 프로토콜에 사용하였다. 펩티드를 King 칵테일(D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 36, 1990, 255-266)을 사용하여 수지로부터 절단하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/물 구배(두 버퍼 모두 0.05% TFA 함유)를 사용하는 Waters 컬럼(XSelect CSH C18 OBD Prep 5 μM 30x250 mm) 상의 분취용 HPLC를 통해 정제하였다.
단리된 펩티드를 방법 섹션에 설명된 바와 같이 TFE에서 요오드를 사용한 산화를 이용하여 고리화하였다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/물 구배(두 버퍼 모두 0.1% TFA 함유)를 사용하는 Waters 컬럼(SunFire C18 OBD Prep 5 μm 50x150 mm) 상의 분취용 HPLC를 통해 정제하였다. 정제된 펩티드를 LCMS(방법 B)로 분석하였다. 머무름 시간이 6.61분인 피크 아래에서 확인된 질량 신호의 디컨벌루션은 4567.23의 예상값과 일치하는 펩티드 질량 4567.23을 나타냈다.
유사한 방식으로, 표 A3에 열거된 다른 펩티드 P005, P006, P008, P010, P013, P014, P015, P017, P019, P020 내지 P034, P035, P036, 및 P038 내지 P041을 합성하고 특성화하였다(표시하지 않음).
E) 고처리량 스크리닝
세포 배양 및 형질감염
현탁액에 적응된 HEK293-F 세포(Invitrogen, #51-002)를 6 mM 글루타민을 함유하는 Freestyle F17 발현 배지(Gibco, #A1383502)에서 배양하였다. 형질감염 전날, 세포를 배기 캡이 있는 3 L Fernbach Erlenmeyer 플라스크(Corning, #431252)에서 1.3x106개 세포/mL의 밀도로 시딩하고, 110 rpm 및 8% CO2에서 교반하면서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질감염 전날, 세포를 6 mM 글루타민을 함유하는 F17 발현 배지를 사용하여 2.1x106개 세포/mL로 조정하였다. 각각의 형질감염에 대해, 50 ng pXL4617_EBNA(EBNA1 발현 플라스미드)를 관심 발현 구성체(경쇄 및 중쇄 구성체의 1:1 혼합물)의 1 μg DNA와 혼합하고, PB 버퍼(Qiagen, #19066)를 사용하여 50 μL의 부피로 조정하였다. 2.8 μg의 PEI를 6 mM 글루타민(Polysciences, #23966-2)을 함유하는 200 μL Freestyle F17 발현 배지(Gibco, #A1383502)에서 희석하고, DNA 혼합물에 첨가하였다. 12분간 인큐베이션한 후, 950 μL의 세포(2.0x106)를 DNA/PEI 복합체에 첨가하였다. 모든 형질감염 실험은 1200 μL의 최종 작업 부피로 96-딥 웰 플레이트(Nunc, #10447181)에서 수행하였다. 플레이트를 DUETZ 시스템 덮개(Kuehner Technology)로 덮고, 37℃, 8% CO2, 및 3 mm orbit(Infors HT Multitron Pro)를 사용한 1,000 rpm 진탕에서 2일 동안 인큐베이션하였다.
Octet HTX를 이용한 발현 분석
형질감염 7일 후, 발현된 항체 구성체를 함유하는 세포 상청액을 원심분리(3,220 rcf, 2분)로 채취하였다. 이들 상청액을 단백질 A 바이오센서(Molecular Devices ForteBio, #18-5013)를 사용하는 Octet HTXe 시스템(Molecular Devices ForteBio, #30-5102)을 사용하여 바이오-레이어 간섭법(BLI)으로 정량화하였다. 바이오센서 재생을 통한 정량화는 다음과 같이 수행하였다: 10 μL의 세포 상청액을 분석 플레이트(Greiner microplates 384웰, PP, 블랙, #781209)로 옮기고 90 μL의 D-PBS(Gibco, #14190-094) + 0.1% BSA(Miltenyi Biotec, #130-091-376)를 사용하여 1:10으로 희석하였다. 정량화 시간을 120초로 설정하고, 10 mM 글리신/HCl, pH 1.5, 및 D-PBS로 바이오센서의 재생/중화를 5초까지 수행하고, 첫 번째 측정 전과 이후의 모든 측정 사이에 3회 사이클을 사용하였다. 분석은 30℃ 및 1,000 rpm의 진탕에서 수행하였다. 센서 오프셋은 3 mm로 설정하였다. 실험은 하기 위해 600초의 지연 후 시작하여 10분 동안 플레이트를 평형화하였다.
데이터 분석은 사전 검증된 Ab0003(16H7_LC x 16H7_HC_IgG4PE, 표 A1 참조) 표준 곡선(결합률 대 농도)과 함께 ForteBio Data Analysis 11.0.0.4를 사용하여 수행하였다.
루시퍼라제 리포터 유전자 분석
Svar Life Science(Malmoe, Sweden)에서 얻은 FGF21 반응성 리포터 세포주를 사용하여 성숙 인간 FGF21 및 FGF21 유사 작용 항-FGFR1c/KLB 단일클론 항체(예를 들어, 표 A1 참조) 및 융합 항체(예를 들어, 표 A4 참조)의 세포 시험관내 효능을 측정하였다. iLite FGF21 Assay Ready 세포(BM3071)는 FGF21 반응성 프로모터의 제어하에 반딧불이 루시퍼라제를 발현하도록 최적화된 조작된 세포이다. 티로신 키나제 수용체 FGFR1c 및 공동 수용체 베타-Klotho(KLB)로 구성된 세포 표면 수용체에 대한 FGF21의 결합은 FGF21 조절된 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자 구성체의 활성화를 일으킨다. 반딧불이 루시퍼라제 신호는 루시퍼라제 기질을 첨가하고 인큐베이션한 후 루미노미터에서 측정될 수 있다. 반딧불이 루시퍼라제 신호는 샘플에서 FGF21의 기능적 활성에 비례한다.
상세하게는, 동결 iLite FGF21 Assay Ready 세포를 가벼운 손 움직임으로 37℃ 수조에서 빠르게 해동하고, 예열된 세포 배양 배지(DMEM + GlutaMAX(31966021, Gibco), 10% SeraPlus(P30-3701, PAN), 1x AB/AM(15240-096, Gibco))로 희석하였다. Multidrop Combi 디스펜서(ThermoFisher)를 사용하여 웰당 4x104개 세포를 함유하는 10 μL의 상청액을 컬럼 1을 제외하고 바닥이 투명한 흰색면 384웰 마이크로플레이트(6007480, Perkin Elmer)에 분배하였다. Multidrop Combi(ThermoFisher)와 함께 Biomek i5(Beckman Coulter)에서 Corning 384 투명 평면 바닥 폴리스티렌 NBS 마이크로플레이트(#3640)를 사용하여 세포 배양 배지에서 FGF-시험 화합물의 연속 희석을 수행하였다. 시험 화합물을 1:5 단계로 10배 희석하였다.
Biomek i5를 사용하여 10 μL의 시험 화합물을 희석전 마이크로플레이트로부터 세포가 포함된 마이크로플레이트의 컬럼 3~24로 옮겨 세포 자극을 시작하고, 컬럼 1 및 2는 10 μL 배지(블랭크 및 기본)만 첨가하여 처리하지 않은 상태로 두었다. 세포를 공기 중 5% CO2의 가습 분위기에서 37℃로 5시간 동안 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성을 분석하는 데 사용된 시약은 공급사의 프로토콜에 따라 Dual-Glo Luciferase Assay System(E2940, Promega)에서 입수하였다. CLARIOstar 다중모드 판독기(BMG Labtech)를 루미노미터로 사용하여 반딧불이 루시퍼라제 및 레닐라 루시퍼라제 발광을 측정하였다. 레닐라 루시퍼라제를 고려하여 반딧불이 루시퍼라제의 발광 결과를 정규화하였다. 임의 단위(AU)로 데이터를 얻고, 용량-반응 곡선으로부터 EC50 값을 얻었다.
CHO 세포에서의 인간 FGF21 수용체 효능에 대한 시험관내 세포 분석
특이적이고 감도 높은 In-Cell Western(ICW) 분석을 사용하여 성숙 인간 FGF21 및 FGF21 유사 작용 항-FGFR1c/KLB 단일클론 항체의 세포 시험관내 효능을 측정하였다. ICW 분석은 통상 마이크로플레이트 형식으로 수행되는 면역조직화학적 분석이다(Aguilar H.N. et al. (2010) PLoS ONE 5(4): e9965).
인간 베타-Klotho(KLB)와 함께 인간 FGFR1c를 안정적으로 발현하는 CHO Flp-In 세포(Invitrogen, Darmstadt, Germany)를 MAP 키나제 ERK1/2 인산화 측정에 사용하였다. 효능적 화합물의 세포 활성을 분석하기 위해, Multidrop Combi를 사용하여 1.5x104개 세포가 포함된 50 μL의 현탁액을 컬럼 1을 제외한 384웰 플레이트(Corning #3764)의 모든 웰에 시딩하고 24시간 동안 성장시켰다. Multidrop Combi와 함께 Tecan HydroSpeed 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 1~2시간 동안 웰당 45 μL의 무혈청 Ham's F-12 Nutrient Mix 배지(Gibco, Darmstadt, Germany)로 세포에서 혈청을 고갈시켰다. 이어서, Biomek i5를 사용하여 세포가 포함된 마이크로플레이트의 컬럼 3~24에 웰당 5 μL를 첨가함으로써, 증가하는 농도의 성숙 인간 FGF21 또는 표시된 단일클론 항체로 37℃에서 5분 동안 세포를 처리하였고, 컬럼 1 및 2는 5 μL PBS(블랭크 및 기본)만 첨가하여 처리하지 않은 상태로 두었다. 시험 화합물을 1:5 단계로 10배 희석하였다. 인큐베이션 후, 배지를 버리고, 20분 동안 3.7%의 새로 제조한 파라-포름알데히드를 웰당 60 μL 첨가하여 세포를 고정시켰다. 세포에 PBS 중 0.1% Triton-X-100을 20분 동안 침투시켰다. 실온에서 2시간 동안 Odyssey 차단 버퍼(LICOR, Bad Homburg, Germany)로 차단을 수행하였다. 1차 항체로서 0.1% Tween20이 포함된 Odyssey 차단 버퍼 중 포스포-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204) 항체(Cell Signaling)를 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 PBS + 0.1% Tween20으로 세척하였다. 0.1% Tween20이 포함된 Odyssey 차단 버퍼 중 2차 항-토끼 800CW 항체(LICOR, Bad Homburg, Germany)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS + 0.1% Tween20으로 다시 세척하고, Odyssey 이미저(LICOR, Bad Homburg, Germany)로 700 및 800 nm에서 적외선 염료 신호를 정량화하였다.
1차 지방세포에서의 인간 FGF21 수용체 효능에 대한 시험관내 세포 분석
이 연구의 목적은 인간 FGFR1c/KLB 수용체 복합체 표적화를 통해 FGF21 활성을 모방하는 재조합 인간 단일클론 항체의 세포 시험관내 활성을 측정하는 것이었다. 이 연구에서, ERK1/2 인산화를 자극하는 능력을 측정함으로써 인간 1차 지방세포에서 이들 효능적 단일클론 항체 및 기준 화합물 인간 FGF21 및 16H7의 활성을 시험하였다. 미토겐-활성화 단백질(MAP) 키나제 ERK1/2는 FGF21에 의해 활성화되는 전형적인 FGFR 다운스트림 신호전달 경로 이펙터이다.
건강한 인간 비당뇨 공여자의 피하 또는 내장 지방 조직으로부터 분리된 지방전구세포를 성숙한 1차 지방세포로 완전히 분화시켰다. 고갈 후, 지방세포를 5분 동안 화합물로 처리한 다음, 이어서 특이적이고 감도 높은 In-Cell Western(ICW) 분석을 통해 ERK 인산화를 측정하였다. ICW 분석은 통상 마이크로플레이트 형식으로 수행되는 면역조직화학적 분석이다(Aguilar H.N. et al. (2010) PLoS ONE 5(4): e9965).
성숙한 지방세포로의 분화
내장 또는 피하 저장소의 인간 지방전구세포는 Lonza(Cologne, Germany)로부터 동결 분취량으로 얻었다. 세포 수 확장을 위해, 5% CO2를 함유하는 가습 분위기의 37℃에서 세포를 보충제 믹스가 보충된 내피 세포 성장 배지(PromoCell GmbH, Heidelberg, Germany)에서 배양하였다. 3차 계대 후, 확장된 세포 수는 지방세포로의 분화를 시작할 만큼 충분히 높았다. 분화를 위해, 웰당 4x104개의 탈착 및 재현탁된 지방전구세포를 마이크로타이터 플레이트(Corning #3764)에 시딩하였다. 세포 부착 후, 세포 배지를 제거하고 분화 배지(둘베코 변형 이글 배지/Ham's F-10 배지(1:1, 부피당 부피; PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany), 15 mmol/L HEPES 버퍼(pH 7.4), 33 μmol/L 비오틴, 17 μmol/L 판토테네이트, 1 μmol/L 덱사메타손, 0.2 mmol/L 이소부틸메틸잔틴, 10 nmol/L L-티록신(모두 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany), 3% (vol/vol) 소태아 혈청(FCS; PAN-Biotech GmbH), 100 nmol/L 인간 인슐린, 0.625× Antibiotic-Antimycotin(Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany), 0.1 μmol/L 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체 감마(PPARγ) 효능제)로 교체하였다.
3일 후, 분화 배지를 지방세포 배지로 교체하고(전술한 바와 같지만 이소부틸메틸잔틴 및 L-티록신은 포함하지 않음), 플레이트를 추가로 10일 이상 동안 인큐베이션하였고; 배지는 3-4-3일 주기로 교체하였다. 분화 시작 14~16일 후, 지방세포 배지를 제거하고, 인슐린 및 PPARγ 효능제가 없는 지방세포 배지로 교체하였다. 이어서 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
1차 지방세포에서의 In-Cell Western
피하 및 내장 기원의 1차 인간 지방세포를 MAP 키나제 ERK1/2 인산화 측정에 사용하였다. 효능적 화합물의 세포 활성을 분석하기 위해, 웰당 4x104개의 지방전구세포를 384웰 플레이트에 시딩하고 전술한 바와 같이 성숙한 지방세포로 분화시켰다. Multidrop Combi와 함께 Tecan HydroSpeed 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 1~2시간 동안 웰당 45 μL의 무혈청 배지 DMEM/Ham's F-10 배지 1:1 (PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany)로 세포에서 혈청을 고갈시켰다. 이어서, Biomek i5를 사용하여 세포가 포함된 마이크로플레이트의 컬럼 3~24에 웰당 5 μL를 첨가함으로써, 증가하는 농도의 성숙 인간 FGF21 또는 표시된 단일클론 항체로 37℃에서 5분 동안 세포를 처리하였고, 컬럼 1 및 2는 5 μL PBS(블랭크 및 기본)만 첨가하여 처리하지 않은 상태로 두었다. 시험 화합물을 1:5 단계로 10배 희석하였다.
인큐베이션 후, 배지를 버리고, 20분 동안 3.7%의 새로 제조한 파라-포름알데히드를 웰당 60 μL 첨가하여 세포를 고정시켰다. 세포에 PBS 중 0.1% Triton-X-100을 20분 동안 침투시켰다. 실온에서 2시간 동안 Odyssey 차단 버퍼(LICOR, Bad Homburg, Germany)로 차단을 수행하였다. 1차 항체로서 0.1% Tween20이 포함된 Odyssey 차단 버퍼 중 포스포-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204) 항체(Cell Signaling)를 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 PBS + 0.1% Tween20으로 세척하였다. 0.1% Tween20이 포함된 Odyssey 차단 버퍼 중 2차 항-토끼 800CW 항체(LICOR, Bad Homburg, Germany)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS + 0.1% Tween20으로 다시 세척하고, Odyssey 이미저(LICOR, Bad Homburg, Germany)로 700 및 800 nm에서 적외선 염료 신호를 정량화하였다.
GLP-1, 글루카곤, 및 GIP 수용체 효능에 대한 시험관내 세포 분석(HEK-293 세포주 과발현 수용체)
인간 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1), 글루카곤(GCG), 또는 포도당 의존성 인슐린 분비자극 폴리펩티드(GIP) 수용체에서의 화합물의 효능작용을 인간 GLP-1, GGG, 또는 GIP 수용체를 각각 안정적으로 발현하는 재조합 PSC-HEK-293 세포주의 cAMP 반응을 측정하는 기능 분석으로 측정하였다. 표 A3에 나타낸 펩티드 및 표 A4에 나타낸 융합 항체를 분석하였다.
세포를 배지(DMEM/10% FBS)에서 거의 컨플루언스까지 37℃의 T-175 배양 플라스크에서 성장시키고, 1천만 내지 5천만개 세포/ml 농도의 10% DMSO 함유 세포 배양 배지에서 2 ml 바이알에 수집하였다. 각각의 바이알에는 1.8 ml의 세포가 포함되었다. 바이알을 이소프로판올에서 -80℃까지 천천히 동결시킨 후, 보관을 위해 액체 질소로 옮겼다.
사용하기 전에, 동결된 세포를 37℃에서 빠르게 해동하고, 20 ml의 세포 버퍼(1x HBSS; 20 mM HEPES, 0.1% BSA)로 세척하였다(900 rpm으로 5분). 세포를 분석 버퍼(세포 버퍼 + 2 mM IBMX)에 재현탁하고 1백만개 세포/ml의 세포 밀도로 조정하였다.
cAMP 생성의 측정을 위해, 384웰 플레이트에 5 μl의 세포(최종 5000개 세포/웰) 및 5 μl의 시험 화합물을 첨가한 후, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
생성된 cAMP를 HTRF(균일 시간차 형광) 기반의 Cisbio Corp.의 키트를 사용하여 측정하였다. 제조사의 지침(Cisbio)에 따라 cAMP 분석을 수행하였다.
용해 버퍼에 희석된 HTRF 시약(키트 구성요소)을 첨가한 후, 플레이트를 1시간 동안 배양한 다음, 665/620 nm에서의 형광비를 측정하였다. 최대 반응의 50% 활성화를 야기하는 농도(EC50)를 측정함으로써 효능제의 시험관내 효능을 정량화하였다.
단백질 발현 및 정제
항체, 예컨대 표 A1에 나타낸 항체, 표 A4에 나타낸 융합 항체, 또는 CDR에 단일 치환이 있는 항체(표 D1 및 D2)를 일시적으로 형질감염된 HEK293 또는 CHO 세포에서 발현시켰다. 상이한 변이체를 암호화하는 DNA를 단백질을 배양 상청액으로 유도하는 리더 서열 및 CMV 프로모터 하에 발현 벡터에 클로닝하였다. HEK293 세포에서의 발현의 경우, 세포 서열 MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(서열번호 56)를 리더 서열로 사용하였다. 대규모 발현을 위해, 세포를 110 rpm, 37℃, 및 8% CO2에서 배플이 없는 진탕 플라스크(Corning)에서 성장시켰다. 형질감염시 세포 밀도는 대략 1.2 x 106개 세포/mL였다. 세포 밀도는 자동 세포 계수기(Nucleocounter NC-200, Chemometec, Allerod, Denmark)로 측정하였다. 형질감염 전, DNA를 Opti-MEM I-배지(Thermo Fisher Scientific)에서 선형 폴리에틸렌이민(PEI)과 1:3의 비로 혼합하였다. 형질감염 혼합물을 실온에서 추가로 20분간 인큐베이션한 후, 세포 배양물에 첨가하였다. 배양을 6일 동안 계속하였다. 대규모 정제를 위해, 세포를 원심분리에 의해 상청액으로부터 분리하고 세포 펠릿을 버렸다. 0.22 μm 여과된 상청액을 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco)로 평형화된 단백질 A 컬럼(MabSelect Sure resin, GE Healthcare)에 로딩하였다. 0.1 M 시트레이트 버퍼, pH 3.0으로 mAb를 용리하였다. 이어서, Sephadex G25 탈염 컬럼(GE Healthcare)에서 PBS로 버퍼를 교환하였다. PBS로 평형화된 Superdex 200 겔 여과 컬럼(GE healthcare)을 사용하여 추가 정제를 수행하였다. 상응하는 분획을 모아 농축하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
결정화 시험에 사용된 16H7, Ab0442, Ab0443, 및 Ab0444의 Fab를 HEK293 세포에서 발현시키고, 캡쳐 단계에 Lambda Select 재료(GE Healthcare)를 사용한 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 정제하였다.
전장 인간 FGF32의 발현은 E.coli에서 수행하였다. 발현된 인간 FGF21에는 N-말단 His-태그에 이어 Tev-프로테아제 절단 부위가 포함되어 있다.
FGF21 발현 구성체: His-Tev-인간 FGF21 H29-S209: 서열번호 57
MGHHHHHHHHGGGENLYFQGHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS
성숙 FGF21의 아미노산 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
발현은 봉입체에서 수행되었으며, FGF21은 정제된 봉입체로부터 회수되었다. 세포를 원심분리로 채취하고, 세포 펠릿을 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 0.2 mg/mL 리소자임, 25 μL 벤조나제/mL, pH 8.0에 재현탁하였다. Panda 2K(GEA) 균질화기를 사용하여 세포를 파쇄하고 세포 용해물을 27,500xg 및 4℃에서 60분 동안 원심분리하였다. 봉입체를 ultra-turrax 디스펜서(ika, Germany)로 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 mM DTT, 2 % Triton X-100, pH 8.0에 재현탁하여 세척하고, 27,500xg 및 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 두 번째 세척 단계를 위해 단백질을 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0에 재현탁하고, 전술한 바와 같이 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 봉입체를 4 M 구아니디늄 클로라이드, 25 mM Tris, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 8.0에 용해시켰다. 재현탁된 봉입체를 27,000xg 및 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 투명해진 단백질 용액을 Ni-컬럼(His complete, Roche)에 로딩하고, 버퍼를 25 mM Tris, 0.5 mM 아르기닌, 1 mM EDTA, 1 mM 환원 글루타티온, 1 mM 산화 글루타티온, pH 8.0으로 버퍼 교환하여 컬럼에서 단백질을 재폴딩하였다. 컬럼을 25 mM Tris, 0.5 M NaCl, pH 8.0으로 세척하고, 단백질을 25 mM Tris, 0.5 M NaCl, 0.5 M 이미다졸, pH 8.0으로 용리하였다. His-tag를 Tev-프로테아제로 절단하고 단백질 용액을 Ni-컬럼 위로 두 번째 통과시켜 관류를 수집하였다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계(Source 30 S, GE healthcare)에 이어, PBS로 평형화된 Fractogel BioSec 재료(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하는 겔 여과 단계를 사용하여 추가 정제를 수행하였다. 상응하는 분획을 수집하고 모아 농축하고, 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 최종 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 58로 표시된다:
GHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS
F) 생체내 방법 - NHP 연구
F1: Ab0335 조사 및 16H7과의 비교 연구
이 연구의 목적은 WO 2011/071783에 기술된 16H7(SAR16)과 비교하여, FGF21-모방 효능적 항-FGFR1c/KLB mAb인 Ab0335(SAR18)의 약리학적 효능을 조사하는 것이었다. 두 가지 모두, 의도된 인간 집단을 반영하는 가장 관련성 높은 동물 모델에서 단일 투여로 시험하였다. 원숭이는 인간과 비교하여 흡수, 분배, 대사, 및 배설 프로파일이 유사하기 때문에 약물 후보의 잠재적 효과를 조사하는 데 바람직한 종이다. 시노몰구스 원숭이는 계통발생학적으로나 생리학적으로 인간과 밀접하게 관련되어 있기 때문에 보다 의미 있고 적용가능한 결과를 위해 다른 하등 포유류 종보다 많이 선택되는 시험 종으로서 선택된다. 따라서, 고지방 식이로 인한 비만 및 인슐린 저항성 시노몰구스 원숭이 모델에서, 다양한 용량의 해당 화합물의 약동학 및 약력학을 조사하였다.
DIO 원숭이 - 동물 및 수용 조건
원숭이 연구는 중국 윈난성에 위치한 Kunming Biomed International(KBI)에서 수행되었다.
인간에 적용될 수 있는 보다 의미 있는 결과를 위해 선택된 시험 종으로서 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)를 선택하였다. 연구를 위한 40마리의 HFD로 인한 비만 원숭이를 식별하기 위해 50마리가 넘는 수컷 원숭이를 훈련시켰다.
이 원숭이들은 모두 다음의 대사 기준을 충족하였다:
체중 8 kg 이상, 연령 8세 이상, 공복 인슐린 >55 μU/mL(같은 연령대의 마른 원숭이 비교: 체중 5~8 kg, 공복 포도당 약 70 mg/dL, 및 공복 인슐린 약 25 mU/mL), HbA1c >4%, 트리글리세리드 >1.3 mmol/L, LDL >5 mmol/L.
물에 자유롭게 접근할 수 있고 18℃ 내지 29℃의 실내 온도, 30% 내지 70%의 상대 습도, 및 시간당 최소 10번의 환기로 통제된 환경 조건하에서 종 및 크기에 적합한 신진대사 스테인리스 스틸 케이지에 원숭이를 개별적으로 수용하였다. 시간 제어 조명 시스템으로 규칙적인 12시간 조명/12시간 어둠의 주간 주기를 제공하였다. 정기적으로 케이지를 청소하였다. 원숭이에게 약 680 kcal(약 2.85 MJ)의 일일 에너지 섭취량으로 하루에 3번 음식을 공급하였다. 모든 음식은 오후 5시에 빼내어 원숭이를 밤새 금식시켰다. 원숭이에게는 항상 강화 장난감이나 장치를 제공하였다. 하루 세 번의 음식은 아침(오전 9시~오전 10시)에 약 50 g의 표준 원숭이 배합사료[압출 펠릿, 3.1 kcal/g(12.98 kJ/g): 단백질 24%, 지방 15%, 탄수화물 61%], 점심(오후 2시~오후 3시)에 1개의 사과[150 g, ;80 kcal(33 kJ)], 그리고 저녁에 100 g의 KBI 독점 고지방 식이 사료[압출 펠릿, 3.47 kcal/g(14.5 kJ/g): 단백질 14%, 지방(돼지) 34%, 탄수화물 52%, 자당 35%, 오후 4시~오후 5시]로 구성되었다. 원숭이 먹이의 각 배치는 영양 성분과 특정 오염 물질(예: 중금속, 아플라톡신 및 살충제)의 수준을 자세히 설명하는 분석 증명서와 함께 배송되었다. 물 섭취량을 정량화하는 날에는 메인 시스템을 통한 물에 대한 자유 접근이 중단되었다.
처치
일주일에 한 번 원숭이에게 비히클을 피하 주사하는 런인(run-in) 기간이 있었다. 음식 섭취량(TEI로 계산) 및 물 섭취량은 주 1회 체중 평가, 및 대사 바이오마커, 안전 바이오마커, IV 포도당 내성 검사(IVGTT), 및 포도당, 인슐린, 및 혈장 지질 프로파일에 대한 1회 기준선 값 결정과 함께 매일 측정되었다.
투약 기간 동안 40마리의 훈련된 원숭이(그룹당 n = 10)를 선택하고, 4-아암 설계로 체중, 지방 구성, 및 트리글리세리드에 대해 계층화하였다. 비히클 처치 대조군을 포함한 모든 처치는 +1일, +19일, 및 +37일에 피하 투여하였고, 8주 동안 면밀히 모니터링한 후 4주간의 관찰 휴약 기간을 거쳤다. 투약 기간은 4-아암 연구로서 설계되었고, 원숭이는 비히클, SAR16, 또는 SAR18로 처치되었다.
SAR16-처치 원숭이는 +1일, +19일, 및 +37일에 1 mg/kg으로 투약하였다. SAR18-처치 원숭이는 저용량군에서 +1일, +19일, 및 +37일에 1 mg/kg으로 투약하였다. SAR18은 추가로 고용량군에서 +1일, +19일, 및 +37일에 3 mg/kg으로 투약하였다.
F2: DIO NASH 비인간 영장류에서 단독 치료제로서 및 GLP-1RA와 조합된 것으로서 SAR16(16H7)의 효능
이 연구의 목적은 시판 GLP-1R 효능제 둘라글루티드(본원에서는 "SAR10"이라고도 함)와 비교하여, FGF21-모방 효능적 mAb인 SAR16(16H7)의 약리학적 효능을 조사하는 것이었다. 두 가지 모두, 의도된 인간 집단을 반영하는 가장 관련성 높은 동물 모델에서 단일 투여 및 둘의 조합으로 시험하였다. 따라서, 성인 인간 NASH 인슐린 저항성 표현형을 모방한 비알코올성 지방간염(NASH) 진단이 있는, 고지방 식이로 인한 비만 및 인슐린 저항성 시노몰구스 원숭이 모델에서, 다양한 용량의 해당 화합물의 약동학 및 약력학을 조사하였다.
DIO NASH 원숭이 - 동물 및 수용 조건
원숭이 연구는 중국 윈난성에 위치한 Kunming Biomed International(KBI)에서 수행되었다.
인간에 적용될 수 있는 보다 의미 있는 결과를 위해 선택된 시험 종으로서 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)를 선택하였다. 연구를 위한 40마리의 HFD로 인한 비만 NASH 원숭이를 식별하기 위해 50마리가 넘는 수컷 원숭이를 훈련시켰다.
이 원숭이들은 모두 다음의 대사 기준을 충족하였다:
체중 7.5~15 kg 이상 및 체지방 함량 >25%, 높은 기준선 값의 TG(>1 mmol/l), LDL(>5 mmol/l), 간 효소 ALT <120 U/L, HbA1c <10%, NAS 점수 ≥5.
수용 조건과 같은 다른 조건은 Ab0335를 조사하기 위한 연구에 대해 전술한 바와 같다.
처치(또한 도 26 참조)
3일마다 원숭이에게 비히클을 피하 주사하는 런인(run-in) 기간이 있었다. 음식 섭취량(TEI로 계산) 및 물 섭취량은 주 2회 체중 평가, 및 대사 바이오마커, 안전 바이오마커, IV 포도당 내성 검사(IVGTT), 유전자 발현 분석을 위한 간 생검, 및 포도당, 인슐린, 및 혈장 지질 프로파일에 대한 기준선 값 결정과 함께 매일 측정되었다.
투약 기간 동안 40마리의 훈련된 원숭이(그룹당 n = 10)를 선택하고, 체중, 공복 혈장 포도당(FPG) 및 공복 혈장 인슐린(FPI) 및 IVGTT 동안 기준선으로부터의 인슐린 반응에 대해 계층화하였다. 모든 처치는 6주(4주 평가 + 2주 런아웃) 동안 피하 투여하였다. 투약 기간은 4-아암, 용량 증량 연구로서 설계되었고, 원숭이는 비히클, SAR10, SAR16, 또는 SAR10과 SAR16의 조합으로 처치되었다.
SAR10-처치 원숭이는 용량 증량으로 시작하여 3일마다 60 μg/kg으로 투약하였다(3개의 투약 단계, 1주차: 20 μg/kg, 2주차: 40 μg/kg, 3주차~런아웃: 60 μg/kg). SAR16-처치 원숭이는 +1일에 1 mg/kg, +16일에 3 mg/kg으로, 이후 +46일에 3 mg/kg의 반복 유지 용량을 투약하였다. 조합-처치 원숭이는 SAR10-처치 마우스 및 SAR16-처치 마우스와 동일한 패턴으로 SAR10 및 SAR16을 모두 투약하였다.
실시예 1: 16H7의 물리화학적 특성 분석
WO 2011/071783의 16H7로 표기되는 단일클론 항체(Ab0004)는 인간 FGFR1/KLB 수용체 복합체에 결합하고 FGF21 유사 신호전달을 유도한다. 도 1은 16H7의 중쇄 및 경쇄 서열을 나타낸다.
이 실시예에서, 16H7은 pH 6에서 28일 동안 40℃의 열 스트레스를 받았다. 기준선, 14일차, 및 28일차에 샘플을 채취하였다. EC50 값 및 Emax 값은 (물질 및 방법 섹션 "루시퍼라제 리포터 유전자 분석"에 설명된 바와 같이) 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통해 측정하였다. 또한, mAb 16H7와 인간 베타-Klotho의 상호작용의 해리율은 전술한 바와 같이 CM5 칩 및 Biacore 8K에서 SPR 상호작용 분석을 통해 평가하였다. 기준선, 14일차, 및 28일차에 상이한 양의 항체를 사용하여 루시퍼라제 유전자 리포터 분석에 의해 용량-반응 곡선을 확립하였다. 결과는 도 2에 도시되어 있다. 도 2에서 알 수 있듯이, 16H7은 안정성이 좋지 않다.
실시예 2: 16H7의 CDR에서 문제 아미노산 위치의 확인
항체 16H7(Ab0004) 및 IgG4 백본을 갖는 16H7(Ab0003, 표 A1 참조)을 지정된 세트의 인실리코 및 시험관내 방법을 사용하여 일반적이고 심각한 문제에 대해 분석하였다. 먼저, 인간의 생식성 및 문제 모티프를 평가하기 위해 인실리코 방법을 사용하여 CDR에 초점을 두고 16H7의 중쇄 및 경쇄 서열(도 1)을 분석하였다(Immunology Today, 18, 509 (1997) PMID: 9386342; Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) PMID: 12477501; Kabat, E.A. et al., In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication, 91-3242 (1991); Foote J, Winter G., J Mol Biol. 1992 Mar 20;224(2):487-99. PMID: 1560463; Vargas-Madrazo E, Paz-Garcia E., J Mol Recognit. 2003 May-Jun;16(3):113-20. Review. PMID: 12833565; IMGT, the international ImMunoGeneTics information system).
상동성 모델링 및 분자 역학 시뮬레이션을 기반으로 탈아미드화, 이소아스파테이트(isoAsp) 형성, 산화, 또는 산성 절단이 발생하기 쉬운 특정 부위를 확인하였다.
또한, 단일클론 항체에 최대 28일 동안 고온(40℃) 및 다양한 pH 값(pH 5.0, 6.0, 또는 8.0)에서 스트레스를 가하였다. 이어서, 물질 및 방법 섹션에 설명된 바와 같은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 동적 광 산란(DLS), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 모세관 등전 집속(ciEF), 동적 스캐닝 형광측정법(DSF), 및 질량분석법(MS)을 통해 샘플을 분석하였다.
표 B는 21일 동안 40℃ 및 다양한 pH 값에서 Ab0003(IgG4 백본을 갖는 16H7) 및 Ab0004(IgG2 백본을 갖는 16H7)를 강제 분해한 후의 펩티드 매핑 결과 개요를 제공한다. 0일차(비처치 대조군), 7일차, 14일차, 및 21일차에 16H7 변이체의 주어진 부위에서 평가된 변형 백분율이 표시되어 있다.
[표 B]
Figure pct00018
MS 분석 및 인실리코 분석을 통해 확인된 16H7의 감소된 안정성과 관련된 16H7의 아미노산 잔기(중요한 아미노산)가 표 C에 열거되어 있다.
[표 C]
Figure pct00019
16H7의 결정 구조를 파악하고 도 3에 도시하였다. 16H7의 중요한 아미노산 잔기는 강조 표시되어 있다.
실시예 3: 단일 점 돌연변이가 있는 16H7 변이체의 분석
이 실시예에서, 16H7의 경쇄 및 중쇄의 CDR에 있는 모든 아미노산을 무작위화하였다. IgG4 백본을 사용하였다. 모든 CDR 위치를 20개의 모든 천연 아미노산을 사용하여 단일 점 돌연변이에 의해 변경하고 활성에 대해 시험하였다. 생성된 라이브러리에서 확인된 경우, 항체를 암호화하는 구성체를 현탁액-적응된 HEK293-F 세포에서 발현시켰다. 발현된 항체 구성체를 포함하는 세포 상청액을 형질감염 7일 후 원심분리로 채취하고, 섹션 "바이오-레이어 간섭법(BLI)"에서와 같이 단백질 A 바이오센서를 사용하여 바이오-레이어 간섭법(BLI)으로 항체 발현을 정량화하였다. 또한, 섹션 "루시퍼라제 리포터 유전자 분석"에서 설명된 바와 같이 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통해 단일 점 돌연변이 16H7 변이체의 세포 활성을 측정하였다. 단일 아미노산 돌연변이체의 모든 측정은 단일 측정으로 수행하였다.
결과는 도 4 및 표 D1 및 D2에 표시되어 있다. 표 D1은 16H7의 경쇄 CDR에서의 단일 아미노산의 치환 결과를 나타낸다. 표 D2는 16H7의 중쇄 CDR에서의 단일 아미노산의 치환 결과를 나타낸다.
[표 D1]
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
[표 D2]
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
결과는 16H7의 많은 위치에서의 아미노산 잔기가 16H7 활성에 영향을 미치지 않으면서 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있음을 보여준다. 따라서, 이러한 위치에 치환을 갖는 항체의 EC50 값, Emax 값, 및 koff 값은 16H7에 대한 평균 값의 2 표준 편차 내에 있었다. 그러나, 특정 위치에서의 특정 아미노산, 특히 16H7의 중쇄의 G35, F54, E58, S60, G104, 및 Y108 및 경쇄의 D95의 치환은 16H7과 비교하여 조절된 활성을 갖는 항체를 생성하였다.
실시예 4: 경쇄 및 중쇄에 다중 돌연변이가 있는 16H7 변이체의 분석
단일 돌연변이가 있는 16H7 변이체 외에도, 다중 돌연변이가 있는 변이체가 생성되었다. 다중 돌연변이가 있는 생성된 변이체는 표 A1에 표시되어 있다. 주로, 실시예 2에서 확인된 경쇄 및 중쇄의 CDR 내에 중요한 아미노산의 다중 치환을 갖는 변이체를 분석하였다(상기 표 C 참조). 그러나, D95와 같은 추가 아미노산이 돌연변이되었다. 또한, 많은 시험된 변이체는 중쇄에 I83T 치환을 가졌다. 16H7의 경쇄 및 중쇄에서의 시험된 돌연변이에 대한 추가 정보는 상기 표 A1에서 확인할 수 있다(각각 "LC 변이체" 열 및 "HC 변이체" 열 참조).
FGF21 유사 신호전달을 평가하는 루시퍼라제 유전자 리포터 분석으로 단일클론 항체의 세포 활성을 분석하였다. 이에 따라 EC50 값 및 Emax 값이 결정되었다(평균 ± SEM, n=3~7). SPR을 통해 인간 KLB에 대한 항체의 결합을 평가하였다. 이에 따라 해리 반응 상수(koff) 및 친화도(KD)가 결정되었다(평균 ± SEM, n=3).
대조군으로서 16H7(Ab0004) 및 인간 FGF21(huFGF21, 서열번호 58)을 사용하였다. 결과는 도 5 및 표 E에 표시되어 있다. 표 E에서, 0.20 이하의 EC50 값을 갖는 항체의 항체 번호는 볼드체로 강조 표시되어 있다(16H7의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 Ab0001 내지 Ab0007은 예외).
[표 E]
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
16H7과 비교했을 때, 3개의 다중 돌연변이 변이체는 루시퍼라제 유전자 리포터 분석에서 유사한 세포 활성을 갖고 동시에 인간 KLB에 대한 유사한 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 화학적 안정성 실험에서 추가 특성화를 위해 선택되었다: Ab0331, Ab0335, Ab0351(모두 IgG4PE Fc 백본을 가짐). 이들 외에도, 16H7 변이체 Ab0428, Ab0429, Ab0430을 상기 항체의 IgG1-NNAS Fc 백본 변이체를 평가하기 위해 후속 화학적 안정성 실험에 포함시켰다.
실시예 5: 선택된 16H7 변이체의 화학적 안정성
이 실시예에서, 안정화된 16H7 변이체 Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, 및 Ab0430의 심층 특성화를 수행하였다. mAb에 21일 동안 40℃ 및 다양한 pH 값에서 스트레스를 가하였다. 스트레스를 받은 mAb 및 상응하는 비처치 대조군(d0)의 물리화학적 특성을 방법 설명에 설명된 바와 같이 광범위하게 분석하였다. 3가지 다른 pH 값을 시험하였고, 결과는 표 F1(pH 5), 표 F2(pH 6), 표 F3(pH8), 및 도 6에 표시되어 있다.
[표 F1]
Figure pct00037
[표 F2]
Figure pct00038
[표 F3]
Figure pct00039
실시예 6: 인간 및 원숭이 베타-klotho에 대한 16H7 및 선택된 변이체의 결합 분석
이 실시예에서, 인간 및 원숭이 베타-klotho에 대한 16H7 및 선택된 변이체의 결합을 분석하였다. 인간 베타-klotho와의 상호작용 분석을 위해, 시리즈 S CM5 센서 칩(인간 항체 캡쳐 키트, GE Healthcare)에 고정된 항-인간 Fc 항체를 통해 mAb를 캡쳐하였다. 10% 비특이적 결합 감소제(GE Healthcare)를 포함한 HBS-EP+ 버퍼에 희석된 인간 KLB(R&D Systems)를 60 μL/분의 유량으로 0.78 nmol/L 내지 12.5 nmol/L의 1:2 희석 시리즈에 주입하였다. Biacore 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1.1.7442(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 결합 모델로 결합 동역학을 평가하였다. 시노몰구스 원숭이 베타-klotho와의 상호작용 분석을 위해, 시리즈 S CM5 센서 칩(인간 항체 캡쳐 키트, GE Healthcare)에 고정된 항-인간 Fc 항체를 통해 mAb를 캡쳐하였다. 10% 비특이적 결합 감소제(GE Healthcare)를 포함한 HBS-EP+ 버퍼에 희석된 시노몰구스 원숭이 KLB(R&D Systems)를 60 μL/분의 유량으로 0.78 nmol/L 내지 12.5 nmol/L의 1:2 희석 시리즈에 주입하였다. Biacore 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1.1.7442(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 결합 모델로 결합 동역학을 평가하였다. 상호작용에 대한 예시적인 센서그램은 도 7(인간 KLB) 및 도 8(원숭이 KLB), 및 표 G에 표시되어 있다.
[표 G]
Figure pct00040
실시예 7: 1차 인간 내장 및 피하 지방세포에서의 16H7 및 최적화된 변이체의 세포 활성 분석
1차 인간 내장 및 피하 지방세포에서의 16H7 및 최적화된 변이체의 세포 활성을 "물질 및 방법" 섹션에 설명된 바와 같이 In-Cell Western pERK를 통해 분석하였다. 구체적으로, FGF21, 16H7, 또는 변이체로 5분간 자극한 후의 ERK 인산화의 용량-반응 곡선을 1차 인간 내장 지방세포 및 피하 지방세포에서 확립하였다. 또한, EC50 값을 계산하였다. 결과는 표 H 및 도 9에 표시되어 있다.
[표 H]
Figure pct00041
실시예 8: 다양한 Fc 백본을 갖는 16H7의 세포 활성 분석
이 실시예에서, 다양한 Fc 백본을 갖는 16H7의 세포 활성을 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통해 평가하였다(Ab0001 내지 Ab0004, Ab0006, 및 Ab0007, 표 A1 참조). 구체적으로, EC50 값을 측정하였다. 16H7에 존재하는 IgG2 백본 외에도, 5개의 Fc 백본을 시험하였다. 시험된 백본에 대한 정보는 상기 표 A1 및 A2에서 확인할 수 있다. 결과는 표 E 및 도 10에 표시되어 있다. IgG2 백본은 가장 낮은 세포 활성과 관련이 있다.
실시예 9: Fab 구조 파악
16H7의 Fab 구조(실시예 2 또는 도 3 참조) 외에도, 결정화 후 Ab0331, Ab0335, Ab0442, 및 Ab0443의 Fab 구조를 파악하였다. Ab0331, Ab0335, Ab0442, 및 Ab0443의 Fab 구조는 화학적으로 안정화된 항체와 16H7 사이에 약간의 차이만 나타냈다(표시하지 않음).
실시예 10: 16H7의 Fab 단편의 세포 활성 분석
단일클론 항체 16H7, 이의 1가 Fab 단편 및 인간 FGF21을 루시퍼라제 유전자 리포터 분석을 통해 평가하였다. 결과는 도 11에 도시되어 있다. 1가 16H7-Fab는 비활성이다. 그러나, 2가 항체는 FGF21 유사 활성을 나타낸다.
실시예 11: 안정화된 16H7 변이체의 심층 특성화
이 실시예에서, 안정화된 16H7 변이체 Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, 및 Ab0430의 심층 특성화를 수행하였다. 항체를 일시적으로 형질감염된 HEK293 또는 CHO 세포에서 발현시키고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 물리화학적 특성 및 생물학적 활성을 방법 설명에 설명된 바와 같이 광범위하게 분석하였다. 결과는 표 I에 표시되어 있다.
[표 I]
Figure pct00042
실시예 12: 생체내 연구
a) 마우스에서의 생체내 PK 연구
유전자이식 인간화 FcRn 마우스(Tg32)에서 생체내 PK 연구를 수행하였다. 이들 연구의 경우, GLP 준수가 주장되지 않았다. 나이브 유전자이식 인간화 FcRn 마우스(Tg32)에게 Ab0314, Ab0331, Ab0335, Ab0351, Ab0428, Ab0429, Ab0430, 및 16H7의 0.3 mg/kg을 단회 정맥내 투여하였다. 약동학적 분석 결과는 표 J 및 도 12에 표시되어 있다.
[표 J]
Figure pct00043
b) 시노몰구스 원숭이 대상 생체내 PK 연구
나이브 시노몰구스 원숭이에게 mAb를 하기 표에 따라 단회 정맥내 투약하였다.
Figure pct00044
모든 조사에서, 투약후 사망/빈사 상태에 대해 동물을 1일 2회 평가하고 각 연구 채혈 시간 후에 케이지측 임상 관찰을 수행하였다. 연구는 Non-GLP였지만, 이러한 연구는 GLP 원칙과 일치하는 표준 운영 절차에 자세히 설명된 관행을 사용하여 GLP 준수 시설에서 수행하였다(시험 시설: Sanofi 및 Charles River Laboratories). 시험된 항체의 혈장 농도 및 약동학 파라미터를 단회 정맥내 투여 후에 조사하였다.
결과는 표 K 및 도 13 및 14에 표시되어 있다. 도 13은 시노몰구스 원숭이에서 다양한 용량 수준의 16H7의 PK 분석 결과를 나타낸다. 도 14는 시노몰구스 원숭이에서 16H7 변이체 Ab0331, Ab0335, 및 Ab0429의 PK 분석 결과를 나타낸다.
[표 K]
Figure pct00045
c) 생체내 데이터/NHP(비인간 영장류) 연구
16H7(SAR16) 및 화학적으로 안정화된 Ab0335(SAR18)를 비만 시노몰구스 원숭이에서 시험하여 체중 변화를 분석하였다. 음식 섭취, 체지방, 혈장 케톤체뿐만 아니라 혈당 조절(포도당 프로파일, 식사, 공복 혈장 포도당, 및 ivGTT 동안)을 포함하여 연구 중에 다른 파라미터도 측정하였다. 한 그룹에는 비히클을 투여하였다. 화합물을 비만 수컷 시노몰구스 마카크(마카카 파시쿨라리스)에게 피하(SC)(12주 "평가 단계" + 런아웃) 투여하였다.
SAR16-처치 원숭이는 1 mg/kg으로 +1일, +19일, 및 +37일에 3회 투약하였다. SAR18-처치 원숭이는 저용량군에서 +1일, +19일, 및 +37일에 1 mg/kg으로 3회 투약하고, 고용량군에서 +1일, +19일, 및 +37일에 3 mg/kg으로 3회 투약하였다.
결과는 도 15 내지 19에 도시되어 있다.
비히클 처치군에서는 비정상적인 임상 징후가 관찰되지 않았다. 음식 섭취의 감소는 SAR16 및 SAR18 처치군에서, 특히 점심(사과)에 관찰되었고 저녁(HFD)에 더 적은 영향으로 관찰되었다. 총 에너지 섭취량(TEI)은 비히클 그룹을 제외한 모든 처치에서 감소하였다. 체중은 비히클 처치군에서 안정적이었다. 체중의 현저한 감소는 SAR16, SAR18 저용량 및 고용량 처치군에서 기록되었다. 비히클-처치 원숭이는 처치 시작 전 값의 98.3±1.6%로 체중을 유지했지만, 기준선 값과 비교하여 SAR16-처치 원숭이는 86.5±1.6%, SAR18 저용량은 94.5±1.8%, SAR18 고용량은 89.9±1.7%로 감소하였다.
혈장 프로파일은 트리글리세리드(TG) 수치가 비히클 처치군에서 연구 기간 동안 약간 증가했음을 보여주었다. TG 값은 SAR16 및 SAR18에서 전체 연구 기간에 걸쳐 동일한 정도로 매우 강력하게 감소하였다.
d) 추가 생체내 데이터/NHP(비인간 영장류) 연구
16H7 및 화학적으로 안정화된 Ab0335를 비만 시노몰구스 원숭이에서 추가로 시험하였다. 구체적으로, 수컷 비만 시노몰구스 원숭이에게 용액으로 1 및 3 mg/kg의 후속 피하 투여 3회를 처치하는 동안 혈장 농도 및 약동학적 파라미터를 분석하였다. 1 mg/kg IV의 피하 투약 후 시험된 두 항체에 대한 노출은 유사했다. 또한, 두 화합물의 혈장 농도는 샘플링이 끝날 때까지(즉, 2차 및 3차 투약 후 각각 336시간 및 504시간) 검출되었다. 따라서, 실험은 Ab0335가 16H7의 유리한 활성 및 특이성을 유지함을 추가로 보여준다.
실시예 1 내지 12의 요약: 실시예 1 내지 12에서, 16H7과 비교하여 개선된 안정성을 갖고 16H7의 유리한 활성 및 특이성을 유지하는 항체를 생성하였다. 따라서, FGFR1c/KLB 수용체 복합체를 표적화 하는 안정한 효능적 항체가 개발되었다.
실시예 13: DIO 비인간 영장류에서 단독 치료제로서 및 GLP-1 수용체 효능제와 조합된 것으로서 16H7의 평가
SAR16(16H7, Ab0004, FGFR1 mAb) 및 SAR10(둘라글루티드, GLP-1R 효능제)의 효과를 최우선적으로 연구하여 체중 변화에 따른 간 지방 분율 변화를 분석하였다. 음식 섭취, 체지방, 혈장 케톤체뿐만 아니라 혈당 조절(포도당 프로파일, 식사, 공복 혈장 포도당, 및 ivGTT 동안)을 포함하여 연구 중에 다른 파라미터도 측정하였다. 한 그룹에는 비히클을 투여하였다. 화합물을 비만 및 NASH 수컷 시노몰구스 마카크(마카카 파시쿨라리스)에게 피하(SC)(12주 "평가 단계" + 런아웃) 투여하였다.
SAR10-처치 원숭이는 용량 증량으로 시작하여 3일마다 60 μg/kg으로 투약하였다(3개의 투약 단계, 1주차: 20 μg/kg, 2주차: 40 μg/kg, 3주차~런아웃: 60 μg/kg). SAR16-처치 원숭이는 +1일에 1 mg/kg, +16일에 3 mg/kg으로, 이후 +46일에 3 mg/kg의 반복 유지 용량을 투약하였다. 조합-처치 원숭이는 SAR10-처치 마우스 및 SAR16-처치 마우스와 동일한 패턴으로 SAR10 및 SAR16을 모두 투약하였다.
비히클 처치군에서는 비정상적인 임상 징후가 관찰되지 않았다. 음식 섭취의 감소는 SAR10, SAR16, 및 조합 처치군에서 관찰되었다. 체중은 비히클 처치군에서 안정적이었다. 체중의 현저한 감소는 SAR10, SAR16, 및 조합 처치군에서 기록되었다. 또한, 체중 감소는 DEXA 기술로 측정한 모든 동물의 체지방량 감소에 주로 기반을 두었다.
MRI 측정 데이터는 기준선(-46일차~43일차) 간 지방 분율 값이 모든 그룹에서 비슷하다는 것을 보여주었다. 간 지방 분율은 연구 동안 비히클 처치군에 대해 안정적이었다(+4.8%). 비히클 처치군과 비교하여, SAR10(-25.2%), SAR16(-30.0%), 및 조합(-49.6%) 처치군에서 +81/+82/+83/+84일에 측정한 간 지방 분율의 상당한 감소가 관찰되었다.
NASH 분석은 더 많은 원숭이가 비히클 처치군에 비해 SAR10, SAR16, 및 조합 처치군에서 개선된 지방증 점수를 나타냄을 보여주었다. 모든 그룹에서 NASH 팽창, 염증, 및 섬유증에 대한 명백한 변화는 관찰되지 않았다.
비히클 처치군과 비교하여 SAR10, SAR16, 및 조합 처치군에서 공복 포도당 및 식후(시계 시간 12:30 및 18:30) 포도당 수치의 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
-27일(기준선) 및 +76일에 포도당과 인슐린에 대한 혈장 프로파일을 또한 측정하였다. 혈당은 두 연구일에 비히클 처치군에서 매우 안정적이었고, 급식 절차로 인해 낮 동안 증가함을 나타냈다. SAR10, SAR16, 및 조합 처치군의 경우, 기준선 수치(-27일)와 비교하여 +76일에 혈당 수치의 상당한 감소가 기록되었다. 비히클 처치군에서 인슐린은 기준선 수치(-27일)와 비교하여 +76일에 증가하였다. SAR10, SAR16, 및 조합 처치군에서 인슐린은 기준선 수치(-27일)와 비교하여 +76일에 감소하였다.
혈장 프로파일은 전체 기준선 T-케톤이 모든 그룹에서 생리학적으로 낮음(<100 μmol/L)을 보여주었다. T-케톤 수치는 두 연구일 동안 비히클 및 SAR10 그룹에서 상당히 안정적이었다. SAR16 및 조합 처치군의 경우, T-케톤 수치는 -27일(기준선)에 비슷했다. 그러나, SAR16 그룹에서 +76일에 증가된 T-케톤 수치가 관찰되었으며, 조합 처치군에서 +76일에 상당히 높은 수치가 기록되었다. H2O-부티레이트는 모든 연구 그룹에 대해 프로파일 기간 동안 T-케톤과 동일한 패턴의 변화를 나타냈다.
-27일(기준선) 및 +76일에 TC, LDL, HDL, 및 TG에 대한 혈장 프로파일을 또한 측정하였다. 기준선 TC, LDL, 및 HDL 수치는 모든 그룹에서 비슷했다. TC 및 LDL 수치는 두 연구일에 비히클 및 SAR16 그룹에서 상당히 안정적이었다. SAR10 및 조합 처치군의 경우, TC 및 LDL 수치가 +76일에 감소하였다. HDL 수치는 두 연구일에 비히클 처치군에서 상당히 안정적이었다. SAR10, SAR16, 및 조합 처치군의 경우, HDL 수치는 +76일에 약간 증가하였다. 비히클 처치군에서 TG 수치는 +76일에 약간 증가하였다. TG 값은 두 연구일에 SAR10 그룹에서 매우 안정적이었고, SAR16 및 조합 처치군에서는 +76일에 더 낮은 TG 값이 기록되었다. 비히클-처치 원숭이에서 ivGTT 포도당 및 인슐린 AUC 데이터는 연구 동안 안정적이었다. ivGTT 포도당 AUC 데이터는 비히클 처치군에 비해 SAR10, SAR16, 및 조합 처치군에서 유의하게 감소하였다. 또한, ivGTT 포도당 AUC 데이터는 SAR16 처치군에 비해 조합 처치군에서 유의하게 감소하였다. 비히클 처치군과 비교하여 SAR10 처치군에서 혈장 인슐린 AUC의 상당한 증가가 또한 관찰되었다.
결과는 도 27 내지 38에 또한 도시되어 있다.
실시예 14: GLP-1R 효능적 펩티드의 시험관내 세포 특성
인간 GLP-1 수용체에서 감소된 효능을 갖는 GLP-1R 효능적 펩티드:
이중 GLP-1 항-FGFR1/KLB 단일클론 항체 융합 단백질의 경우, hFGFR1c+KLB 복합체를 효율적으로 활성화하는 데 필요한 용량으로 오심을 관리하기 위해, GLP-1 수용체 효능제 펩티드는 일반적으로 인간 GLP-1과 비교하여 GLP-1R에서 감소된 효능을 갖는다.
GLP-1 유사 펩티드의 효능을 감소시키기 위해, 펩티드의 다양한 위치에 돌연변이를 도입하였다. 총 29개의 펩티드를 SPPS를 통해 단일 펩티드 효능제로서 합성하였고, 물질 및 방법 섹션에 설명된 바와 같이 인간 GLP-1 수용체, 인간 GIP 수용체, 및 인간 글루카곤(GCG) 수용체에서의 활성에 대해 시험하였다.
인간 GLP-1, GIP, 및 글루카곤 수용체에 대한 표 A3의 펩티드의 효능작용을 물질 및 방법 섹션에 설명된 바와 같이 인간 GLP-1, GIP, 또는 글루카곤 수용체를 안정적으로 과발현하는 HEK-293 세포주에서 cAMP 반응을 측정하는 기능적 분석으로 측정하였다. 이에 따라, EC50 값 및 Emax 값을 결정하였다(Emax 값은 표시하지 않음). 결과는 표 L에 요약되어 있다.
[표 L]
Figure pct00046
표 L에 예시된 펩티드는 모두 인간 GLP-1 수용체에 대한 높은 작용 효능을 나타내고, 일부는 낮은 피코몰 범위(E16K 및 E17R 변형이 있는 펩티드 번호 P023 내지 P034를 갖는 펩티드)이고, 일부는 높은 피코몰 범위(특히 천연 GLP-1과 비교하여 N-말단에 추가 아미노산이 있는 펩티드 P013 내지 P022 및 P036 내지 P041)이다. mAb 백본에 융합될 서열은 루시퍼라제 리포터 유전자 분석을 통해 측정된 FGF21 유사 활성과 비교한 이상적인 비율을 기준으로 선택될 수 있다. 펩티드는 관련 GPCR에 대한 충분한 분할을 나타낸다: 밀접하게 관련된 인간 GIP 수용체에 대한 활성 분할은 적어도 75이고, 밀접하게 관련된 인간 글루카곤 수용체에 대해서는 적어도 300이다.
이들 데이터는 GLP-1 유사 펩티드의 GLP-1R 효능 활성이 조절되어 원하는 효능 감소를 달성할 수 있음을 보여준다. 적합한 GLP-1R 효능 프로파일을 갖는 펩티드를 mAb와의 융합을 위해 선택하고 항체 융합 단백질로서 발현시켰다. 또한, 새로운 돌연변이를 전장 단백질로서 발현시켰다.
실시예 15: 융합 항체의 시험관내 세포 특성
이중 활성 단일클론 항체 융합 단백질을 GLP-1R 및 hFGFR1c+KLB 복합체에 대한 각각의 효능을 결정하기 위해 세포 기반 분석으로 시험하였다.
인간 GLP-1R, 인간 GIPR, 및 인간 글루카곤R(GCGR)에 대한 항체 융합 단백질의 효능작용을 HEK-293 세포에서 HTRF cAMP 분석을 통해 측정하였다. 이에 따라, EC50 값 및 Emax 값을 결정하였다(Emax 값은 표시하지 않음).
GLP-1 유사 펩티드 서열(단일 GLP-1R 효능적 펩티드의 합성 및 특성화(실시예 14 참조)에 의해 또는 공지된 GLP-1R 효능적 서열의 실험적 돌연변이에 의해 활성인 것으로 이전에 확인됨)을 hFGFR1c+KLB 복합체에 대한 활성이 확인된 mAb에 융합하였다.
FGF21 유사 신호전달을 평가하는 루시퍼라제 유전자 리포터 분석으로 hFGFR1c+KLB 복합체에 대한 단일클론 항체 융합 단백질의 세포 활성을 분석하였다. 이에 따라, EC50 값 및 Emax 값을 결정하였다.
대조군으로서, 항체 Ab0001, Ab0003, Ab0004, Ab0006, 및 Ab0505(표 A1 참조), 및 인간 GLP-1(7-36)(P003)을 사용하였다. 결과는 도 22 내지 25 및 표 M에 표시되어 있다.
[표 M]
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
FGF21 유사 활성 및 GLP-1R 효능작용은 융합 항체에서 유지되었다. 글루카곤 수용체에 대한 잔류 활성은 측정되지 않았다. 모든 융합 항체는 Fu0251을 제외하고 인간 GIPR에 대해 높은 분할(적어도 100배)을 나타냈다.
이 결과는 항-FGFR1/KLB 단일클론 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄와 중쇄 둘 다에 대한 GLP-1 유사 펩티드 서열의 융합 후 FGF21 유사 활성 또는 GLP-1R 효능 활성의 유의한 손실이 없음을 보여준다.
펩티드 서열 P005, P010, P019, P020, P026, P028 내지 P032, 및 P036 내지 P038의 융합은 융합 형식(LC, HC, 또는 LC+HC)에 관계없이 각각의 융합 항체에 대한 단일 펩티드의 GLP-1R 효능 활성을 매우 잘 보존하게 하였다(Fu0017, Fu0018, Fu0022, Fu0028, Fu0033, Fu0034, Fu0036 내지 Fu0038, Fu0049, Fu0050, Fu0054, Fu0060, Fu0065, Fu0068 내지 Fu0070, Fu0081, Fu0082, Fu0092, Fu0097, Fu0098, Fu0100 내지 Fu0102, Fu0240, Fu0242, Fu0243, Fu0253, 및 Fu0254 참조).
결론적으로, 인간 GLP-1 수용체를 활성화할 뿐만 아니라 hFGFR1c+KLB 복합체를 활성화할 수 있는 융합 단백질을 생성하였다. GLP-1 유사 펩티드 화합물 및 항-FGFR1/KLB 단일클론 항체 화합물로 구성된 융합 분자는 이중 활성을 나타내며 결합된 약리학을 제공하는 데 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Sanofi <120> FGFR1/KLB targeting agonistic antigen-binding proteins and conjugates thereof with GLP-1R agonistic peptides <130> PAT20174 <150> EP 20 315 336.6 <151> 2020-07-02 <150> EP 20 315 337.4 <151> 2020-07-02 <160> 117 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HC 16H7 <400> 1 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Ala 20 25 30 Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Ile Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Val Val Thr Gly Gly Tyr Tyr Tyr Asp Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg 210 215 220 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LC 16H7 <400> 2 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Asn Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is G <400> 3 Asn Ala Arg Xaa Xaa Val Ser 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 4 Asn Ala Arg Val Gly Val Ser 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 5 Asn Ala Arg Met Gly Val Ser 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is S <400> 6 His Ile Xaa Ser Asn Asp Xaa Lys Xaa Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 7 His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, H, or E <400> 8 Ser Val Xaa Thr Xaa Gly Tyr Tyr Xaa Xaa Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 9 Ser Val Val Thr Gly Gly Tyr Tyr Tyr Glu Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 10 Ser Val Val Thr Gly Gly Tyr Tyr Tyr Asp Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, or M <400> 11 Gly Gly Xaa Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val His 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 12 Gly Gly Ser Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val His 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 13 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val His 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, or Y <400> 14 Xaa Xaa Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 15 Ser Glu Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 16 Ser Ala Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 17 Glu Glu Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 18 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is is D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is D <400> 19 Gln Val Trp Xaa Gly Xaa Ser Xaa His Val Val 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Articial <400> 20 Gln Val Trp Glu Gly Glu Ser Asp His Val Val 1 5 10 <210> 21 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Portion heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa is V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa is V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Xaa is G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(83) <223> Xaa is Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84) <223> Xaa is D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, or H <400> 21 Gly Phe Ser Leu Asn Asn Ala Arg Xaa Xaa Val Ser Trp Ile Arg Gln 1 5 10 15 Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Xaa Ser Asn Asp 20 25 30 Xaa Lys Xaa Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro 50 55 60 Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Xaa Thr Xaa Gly 65 70 75 80 Tyr Tyr Xaa Xaa Gly Met Asp Val 85 <210> 22 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Portion HC variable region <400> 22 Gly Phe Ser Leu Asn Asn Ala Arg Val Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 1 5 10 15 Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp 20 25 30 Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro 50 55 60 Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Val Thr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Tyr Tyr Glu Gly Met Asp Val 85 <210> 23 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Portion Heavy Chain variable <400> 23 Gly Phe Ser Leu Asn Asn Ala Arg Val Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 1 5 10 15 Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp 20 25 30 Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro 50 55 60 Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Val Thr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Tyr Tyr Glu Gly Met Asp Val 85 <210> 24 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Portion HC variable <400> 24 Gly Phe Ser Leu Asn Asn Ala Arg Val Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 1 5 10 15 Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp 20 25 30 Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro 50 55 60 Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Val Thr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Tyr Tyr Glu Gly Met Asp Val 85 <210> 25 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Portion LC variable <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is is D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa is E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> Xaa is is N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> Xaa is D <400> 25 Gly Gly Xaa Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys 1 5 10 15 Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Xaa Xaa Ser Asp Arg Pro 20 25 30 Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala 35 40 45 Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 50 55 60 Cys Gln Val Trp Xaa Gly Xaa Ser Xaa His Val Val 65 70 75 <210> 26 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment of LC variable region <400> 26 Gly Gly Ser Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys 1 5 10 15 Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Ser Glu Ser Asp Arg Pro 20 25 30 Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala 35 40 45 Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 50 55 60 Cys Gln Val Trp Glu Gly Glu Ser Asp His Val Val 65 70 75 <210> 27 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment of LC variable region <400> 27 Gly Gly Ser Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys 1 5 10 15 Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Ser Ala Ser Asp Arg Pro 20 25 30 Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala 35 40 45 Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 50 55 60 Cys Gln Val Trp Glu Gly Glu Ser Asp His Val Val 65 70 75 <210> 28 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment of LC variable region <400> 28 Gly Gly Ser Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys 1 5 10 15 Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Glu Glu Ser Asp Arg Pro 20 25 30 Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala 35 40 45 Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 50 55 60 Cys Gln Val Trp Glu Gly Glu Ser Asp His Val Val 65 70 75 <210> 29 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is M, V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa is F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Xaa is E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Xaa is S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> Xaa is V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104) <223> Xaa is G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa is Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa is D, E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, H, or E, <400> 29 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Ala 20 25 30 Arg Xaa Xaa Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Xaa Ser Asn Asp Xaa Lys Xaa Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Val Xaa Thr Xaa Gly Tyr Tyr Xaa Xaa Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain variable region <400> 30 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Ala 20 25 30 Arg Val Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Val Val Thr Gly Gly Tyr Tyr Tyr Glu Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain variable region <400> 31 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Ala 20 25 30 Arg Val Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Val Val Thr Gly Gly Tyr Tyr Tyr Glu Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 32 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Ala 20 25 30 Arg Val Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Val Val Thr Gly Gly Tyr Tyr Tyr Glu Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is is N, S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is D, S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, or I, <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is D, E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, or Y, <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa is D, E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa is N, E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Xaa is D <400> 33 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Xaa Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Xaa Xaa Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Xaa Gly Xaa Ser Xaa His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain variable region <400> 34 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Ser Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Ser Glu Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Glu Gly Glu Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 35 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain variable region <400> 35 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Ser Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Ser Ala Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Glu Gly Glu Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 36 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain variable region <400> 36 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Ser Asn Ile Gly Ser Glu Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Glu Glu Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Glu Gly Glu Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 37 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (102)..(102) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (104)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(109) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 37 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys 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(20)..(20) <223> Xaa is Q or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is L or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is K or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is T or G <400> 54 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Xaa Xaa Cys Glu Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Val Xaa Xaa Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Xaa Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Lys Pro Pro Pro Lys Pro Gly Cys 35 40 <210> 55 <211> 28 <212> PRT <213> artificial <220> <223> GLP-1R agonistic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is K or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Q or R <400> 55 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Xaa Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys 20 25 <210> 56 <211> 22 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Signal peptide <400> 56 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys 20 <210> 57 <211> 201 <212> PRT <213> artificial <220> 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<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is H, V, or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is K or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X is K, I, Q or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X is Q or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X is L or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X is E, A or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X is E, K or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X is E, R or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X is L, A or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> X is V, A, F or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> X is R, H, Q, K or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X is L, E, H or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> X is I, Y or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is E, A, L or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> X is I, L, K, V or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X is A, K, N or E, <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is G, T, K, V or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> X is G, R, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> X is P, H, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> X is S, K, V, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> X is S, K, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> X is G, I, Q, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> X is A, K, R, E or absent, <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> X is P, L, Y, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> X is P, S, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> X is P or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> X is S, E, K, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> X is S, E, K, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> X is P, S, G, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> X is G, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> X is C, or absent <400> 59 Xaa Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 <210> 60 <211> 42 <212> PRT <213> artificial <220> <223> GLP-1R agonistic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is K or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is K or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is L or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is E or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is E or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is L, A or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is V or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is R, H, or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is L or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is I, Y or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is E, A or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is I, L, K, V or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is A or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is G, T, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is G, R, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is P, H, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is S, K, V, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is S, K, or absentt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is G, I, Q, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is A, K, R, E or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa is P, L, Y, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa is P, S, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa is P or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa is S, E, K, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa is P, S, G, or absent, <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa is G or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa is C or absent <400> 60 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 <210> 61 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> GLP-1R agonistic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is H, Y or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is K or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is K, I or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Q or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is E, A or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is E, K or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is E, R or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is L, A or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is V, A or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is R, H, Q, K or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is L, E, H or R, <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is I, Y or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is I, L, K or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is A, K, N or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is G, T, K or V <400> 61 Xaa Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Glu Trp Leu Xaa Xaa Xaa Gly 20 25 30 <210> 62 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> GLP-1R agonistic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is K or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is A or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is R or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is G 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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230 <210> 112 <211> 228 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IgG4 PE <400> 112 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 113 <211> 228 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IgG2 <400> 113 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 114 <211> 231 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IgG1 LALA_NNAS <400> 114 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230 <210> 115 <211> 231 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IgG1 LALA_GASS <400> 115 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230 <210> 116 <211> 228 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IgG4 PAA <400> 116 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 117 <211> 231 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IgG1 NNAS <400> 117 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230

Claims (22)

  1. 항원 결합 단백질로서,
    a) 하기 a1) 또는 a2)를 포함하는 중쇄 CDR1:
    a1) NARXHC34XHC35VS(서열번호 3)(XHC34는 V, F, N, Y, P, S, Q, H, G, D, I, L, R, W, 또는 T이고, XHC35는 G임), 또는
    a2) 상기 중쇄 CDR1과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC34 및 XHC35 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), a1)의 중쇄 CDR1의 변이체,
    b) 하기 b1) 또는 b2)를 포함하는 중쇄 CDR2:
    b1) HIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKS(서열번호 6)(XHC54는 F이고, XHC58은 E이고, XHC60은 S임), 또는
    b2) 상기 중쇄 CDR2와 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC54, XHC58, 및 XHC60 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), b1)의 중쇄 CDR2의 변이체,
    c) 하기 c1) 또는 c2)를 포함하는 중쇄 CDR3:
    c1) SVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 8)(XHC109는 E, V, Y, T, F, N, W, L, Q, G, I, M, R, K, 또는 H이고, XHC102는 V이고, XHC104는 G이고, XHC108은 Y임), 또는
    c2) 상기 중쇄 CDR3과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), c1)의 중쇄 CDR3의 변이체,
    d) 하기 d1) 또는 d2)를 포함하는 경쇄 CDR1:
    d1) GGXLC25NIGSESVH(서열번호 11)(XLC25는 S, E, G, K, R, T, Y, F, I, A, L, V, H, Q, W, P, 또는 M임), 또는
    d2) 상기 경쇄 CDR1과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC25 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), d1)의 경쇄 CDR1의 변이체,
    e) 하기 e1) 또는 e2)를 포함하는 경쇄 CDR2:
    e1) XLC49XLC50SDRPS(서열번호 14)(XLC49는 S, E, H, N, Y, T, A, F, V, K, L, M, G, R, W, P, 또는 I이고, XLC50은 E, A, S, Q, G, P, V, W, L, T, I, M, H, R, K, F, 또는 Y임), 또는
    e2) 상기 경쇄 CDR2와 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC49 및 XLC50 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), e1)의 경쇄 CDR2의 변이체,
    및/또는
    f) 하기 f1) 또는 f2)를 포함하는 경쇄 CDR3:
    f1) QVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 19)(XLC91은 E, Q, W, M, R, G, L, H, N, T, F, I, V, S, A, 또는 K이고, XLC93은 E, I, L, M, G, W, P, R, D, Y, A, S, V, T, 또는 F이고, XLC95는 D임), 또는
    f2) 상기 경쇄 CDR3과 총 3개 이하의 아미노산 추가, 치환, 및/또는 결실이 다른(단, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치의 아미노산 잔기는 치환 또는 결실되지 않는), f1)의 경쇄 CDR3의 변이체,
    을 포함하는 항원 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S 또는 E이고, XLC50은 E 또는 A이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E인, 항원 결합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, XHC34는 V이고, XHC109는 E이고, XLC25는 S이고, XLC49는 S이고, XLC50은 E이고, XLC91은 E이고, XLC93은 E인, 항원 결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    i. NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, SESDRPS(서열번호 15)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3,
    ii. NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, SASDRPS(서열번호 16)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3, 또는
    iii. NARVGVS(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1, HIFSNDEKSYSTSLKS(서열번호 7)를 포함하는 중쇄 CDR2, SVVTGGYYYEGMDV(서열번호 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, GGSNIGSESVH(서열번호 12)를 포함하는 경쇄 CDR1, EESDRPS(서열번호 17)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QVWEGESDHVV(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 항원 결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 하기 i1) 또는 i2)를 포함하는 중쇄 가변 영역:
    i1) GFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDV(서열번호 21), 또는
    i2) i1)에 따른 서열의 변이체로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
    및
    ii) 하기 ii1) 또는 ii2)를 포함하는 경쇄 가변 영역:
    ii1) GGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV(서열번호 25), 또는
    ii2) ii1)에 따른 서열의 변이체로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
    을 포함하는 항원 결합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 29)의 중쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역의 변이체로서 상기 중쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, HC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
    및
    ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVV FGGGTKLTVL(서열번호 33)의 경쇄 가변 영역, 또는 상기 경쇄 가변 영역의 변이체로서 상기 경쇄 가변 영역과 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음)
    를 포함하는 항원 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARVGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVVTGGYYYEGMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 30)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGSNIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYSESDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWEGESDHVVFGGGTKLTVL(서열번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    b) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARVGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVVTGGYYYEGMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGSNIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYSASDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWEGESDHVVFGGGTKLTVL(서열번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
    c) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARVGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVVTGGYYYEGMDVWGQGTTVTVSS(서열번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGSNIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYEESDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWEGESDHVVFGGGTKLTVL(서열번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항원 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARXHC34XHC35VSWIRQPPGKALEWLAHIXHC54SNDXHC58KXHC60YSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSVXHC102TXHC104GYYXHC108XHC109GMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    또는 상기 중쇄의 변이체로서, 상기 중쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XHC34, XHC35 XHC54, XHC58, XHC60, XHC109, XHC102, XHC104, 및 XHC108 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음),
    및
    ii) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGXLC25NIGSESVHWYQQKPGQAPVLVVYXLC49XLC50SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWXLC91GXLC93SXLC95HVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
    또는 상기 경쇄의 변이체로서, 상기 경쇄와 적어도 80% 동일한 변이체(단, XLC25, XLC49, XLC50, XLC91, XLC93, 및 XLC95 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 상기 변이체에서 치환 또는 결실되지 않음)
    를 포함하는 항원 결합 단백질,
    예를 들어,
    a) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
    b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
    c) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
    d) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
    e) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
    또는
    f) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 항원 결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질은 β-Klotho에 및/또는 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 복합체에 결합하고/하거나, 항원 결합 단백질은 β-Klotho 및 FGFR1c를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체를 활성화시키는, 항원 결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 2가 항체 및/또는 2가 항원 결합 단편인 항원 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 포함하는 접합체로서, 항원 결합 단백질이 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합되는, 접합체.
  12. 제11항에 있어서, GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
    X1-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-X12-X13-L-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-E-W-L-X27-X28-X29-G(서열번호 61)를 포함하거나 이로 이루어지며,
    X1은 H, Y, 또는 F이고,
    X10은 K 또는 L이고,
    X12는 K, I, 또는 Q이고,
    X13은 Q 또는 L이고,
    X15는 E, A, 또는 D이고,
    X16은 E, K, 또는 S이고,
    X17은 E, R, 또는 Q이고,
    X18은 L, A, 또는 R이고,
    X19는 V, A, 또는 F이고,
    X20은 R, H, Q, K, 또는 I이고,
    X21은 L, E, H, 또는 R이고,
    X23은 I, Y, 또는 F이고,
    X27은 I, L, K, 또는 E이고,
    X28은 A, K, N, 또는 E이고,
    X29는 G, T, K, 또는 V이고;
    임의로, 아미노산 서열은 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 추가로 포함하고;
    임의로, 아미노산 서열은 C-말단에 최대 약 12개, 약 11개, 또는 약 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연장을 추가로 포함하는, 접합체.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드는 아미노산 서열
    H-G-E-G-T-F-T-S-D-X10-S-K-Q-L-E-E-E-X18-V-X20-L-F-I-E-W-L-K-A-X29-G(서열번호 62)를 포함하거나 이로 이루어지며,
    X10은 K 또는 L이고,
    X18은 A 또는 R이고,
    X20은 R 또는 Q이고,
    X29는 G 또는 T이고;
    임의로, 아미노산 서열은 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 추가로 포함하고;
    임의로, 아미노산 서열은 C-말단에 최대 약 12개, 약 11개, 또는 약 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연장을 추가로 포함하는, 접합체.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 연장은 아미노산 서열 PSSGAPPPS(서열번호 63) 또는 PKKIRYS(서열번호 64)를 포함하거나 이로 이루어진, 접합체.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고/이거나, 항원 결합 단백질은 1, 2, 3, 4개 이상의 GLP-1R 효능적 펩티드, 예컨대 2개 또는 4개의 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합되는, 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 각각의 중쇄 가변 영역 및/또는 각각의 경쇄 가변 영역은 적어도 하나의 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합되는, 접합체.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질은 링커, 예컨대 적어도 2개 아미노산의 길이를 갖는 링커 펩티드를 통해 적어도 GLP-1R 효능적 펩티드에 접합되는, 접합체.
  18. 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 함께, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질, 또는 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질, 또는 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 접합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  20. 제12항의 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및/또는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질, 또는 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질, 또는 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 접합체를 생성하는 방법으로서, 상기 항원 결합 단백질의 발현이 가능한 조건에서 제13항의 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 비만, 과체중, 대사 증후군, 제2형 진성 당뇨병과 같은 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH), 및/또는 죽상동맥경화증의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질, 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 접합체, 또는 제18항의 약제학적 조성물.
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