JP6705608B2 - ゴナドトロピンの生理活性を増強するリガンド - Google Patents

Description

本発明は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）に対するものであり、且つ、ゴナドトロピンの生理活性を増強することができる抗体に関する。

本発明は、メスの哺乳類動物において排卵を誘導するための主に人間医学および獣医学におけるその抗体の用途を有する。

下の記述において、括弧の間にある参照番号は本文書の末尾に提示されている参照文献のリストを指す。

ゴナドトロピン（またはゴナドトロフィン）は、生殖腺（卵巣および精巣）の機能に作用することにより脊椎動物における生殖の制御に中心的な役割を果たす複雑な糖タンパク質ホルモンである。これらのホルモンのうちの２つ、すなわち黄体形成ホルモン（ＬＨ）と卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は全ての脊椎動物において分泌されている。哺乳類動物のうちの２つのグループであるウマ科と霊長類のメンバーには胎盤によって分泌される絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）であるヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）とウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）も存在し、両者ともＬＨ受容体を介して作用する。

黄体形成ホルモン（ＬＨ）は、視床下部によって産生されるＧｎＲＨの刺激の下で脳下垂体前葉の性腺刺激細胞によって産生される。ＬＨはオスではテストステロン生産を刺激し、一方でメスでは卵巣周期の調節に関与し、最終局面の卵胞成長と排卵およびその後の排卵された破裂卵胞の黄体への変換に関係する。月経周期の黄体期の間にＬＨは、胚の初期発生と着床に必須である、黄体によるプロゲステロン分泌を刺激する。ＬＨは全く同一の種の全ての糖タンパク質ホルモン（ＦＳＨ、ＣＧ、および甲状腺刺激ホルモンであるＴＳＨなど）に共通のαサブユニットとそのホルモン活性の特異性の原因となるβサブユニットからなり、そのホルモンの活性はそれらの２つのサブユニットが二量体として非共有結合によって結合している場合にのみ存在する。

卵胞刺激ホルモン（またはＦＳＨ）は、視床下部によって産生されるＧｎＲＨの刺激の下で脳下垂体前葉によって産生される。オスではそのホルモンは精子形成に必須であるセルトリ細胞を刺激する。メスではそのホルモンは顆粒膜細胞のＦＳＨ受容体を刺激することにより未成熟原始卵胞の動員、原始卵胞の成長、および原始卵胞の排卵前卵胞への分化に関係する。ＦＳＨはαとβの２つのサブユニットからなり、且つ、ＬＨの構造と類似の構造を有する。二量体だけがＦＳＨ受容体を刺激することができる。

メスではＬＨとＦＳＨのレベルは周期的であり、発情休止期または排卵期以外の間では非常に低く、排卵前の時期に分泌がピークに達する。

ゴナドトロピンはメスの哺乳類動物において排卵を誘導するために獣医学および人間医学において使用されている。有効ではあるが、生体液（血液、尿）または組織（脳下垂体）から抽出されたホルモンを使用するため、これらの処置には健康上のリスクが特に獣医学分野において提示されている。このことは妊娠した雌馬の血液から抽出されたウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）とブタ脳下垂体から抽出されたブタＬＨおよびＦＳＨに当てはまる。獣医学分野では妊婦の尿から抽出されたｈＣＧであるコルロン（登録商標）（ＭＳＤラボラトリー）も使用されている。

ヒトの臨床分野、特に生殖補助医療（すなわちＡＲＴ）の分野では、精製ＦＳＨであるフォスティモン（登録商標）（ラボラトワール・ジェニエーブル(Laboratoire Genevrier)）、およびｈＭＧ（ヒト閉経期ゴナドトロピン）であるメノピュール（登録商標）（フェリング・ファーマ・ラボラトリー）、ＦＳＨとＬＨの混合物、および精製ｈＣＧである絨毛性ゴナドトロピンＥｎｄｏ５０００（シェリングプラウ・ラボラトリー）などの閉経した女性の尿から抽出されたホルモンが使用されている。ゴナールＦ（登録商標）（メルクセローノ・ラボラトリー）およびピュレゴン（登録商標）（メルクシェリングプラウ・ラボラトリー）などの組換えヒトＦＳＨ、ならびにオビドレル（登録商標）およびルベリス（登録商標）（メルクセローノ・ラボラトリー）などの組換えｈＣＧおよびＬＨも使用されている。

加えて、これらのホルモンの反復使用はそれらのホルモンの効果を中和する免疫反応をたいてい引き起こし、そうして治療効力を減少させることになる。しかしながら、共投与されるとそのホルモンの活性を増強することができる抗体がその免疫反応によって産生され得ることもいくつかの事例において示されている（欧州特許第１５１８８６３号明細書）［１］。その後、ＬＨの作用を増強することができる３種類の抗ＬＨモノクローナル抗体も明らかにされており、それらの抗体のうちの２種類についてはＦＳＨの作用も増強することができることも明らかにされている（国際出願公開ＷＯ２０１２／０６６５１９号パンフレット）［２］。

本発明者らは今ではＦＳＨのβサブユニットに対して作製されたモノクローナル抗体であって、ＦＳＨの作用を増強することができ、且つ、ＬＨとｈＣＧの作用も増強することができるモノクローナル抗体を得ている。

これらのモノクローナル抗体はＣＦ１２と呼ばれる。

ＣＦ１２抗体を産生するハイブリドーマはブダペスト条約に準拠して２０１３年１０月３日にＣＮＣＭ（フランス、７５７２４、パリ１５区、ドクター・ルー通り２５番のパスツール研究所内のフランス微生物培養物保存機関）にＣＮＣＭ Ｉ−４８０３の番号の下で預託された。

ＣＦ１２抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のヌクレオチド配列が決定されており、対応するペプチド配列が推定されている。それらが下の表１に示されている。

上のＣＦ１２抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ−ＣＤＲ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ−ＣＤＲ）の配列からＣＤＲ（相補性決定領域）をコードする配列が決定されている。対応するペプチド配列が推定されており、下の表２にそれぞれ示されている。

本発明の対象は、抗ＦＳＨ βサブユニット抗体のパラトープを含むことを特徴とする、ＦＳＨの生理活性、黄体形成ホルモン（ＬＨ）の生理活性、および絨毛性ゴナドトロピ
ン（ＣＧ）の生理活性を増強する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）リガンドである。

本発明の目的のため、「抗ＦＳＨ βサブユニット抗体」という用語は、ＦＳＨの初回注射とそれに続くＦＳＨ βサブユニットの注射による数回のブースターに基づく動物の免疫によって得られたあらゆる抗体を意味するものとする。様々な哺乳類動物のＦＳＨ、例えばヒツジ、ヒト、ウシ、ヤギまたはブタ、ウマ、イヌ、マウス等のＦＳＨ、および同種起源または異種起源のＦＳＨのβ−サブユニットを使用してそれらの注射を行うことができる。そうしてＣＦ１２モノクローナル抗体はヒトＦＳＨおよびヒトＦＳＨ βサブユニットを使用する免疫の後に得られた。

したがって、具体的には本発明の対象は本発明に従うリガンドであって、
重鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含み、
‐配列ＧＦＴＦＳＳＳＹ（配列番号５）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ１、
‐配列ＩＹＡＧＴＧＧＴ（配列番号６）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ２、
‐配列ＡＲＨＧＳＹＦＤＹ（配列番号７）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ３、且つ
軽鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含む
‐配列ＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹ（配列番号８）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ１、
‐配列ＡＡＳによって規定されるＶＬ−ＣＤＲ２、
‐配列ＱＱＳＮＥＤＰＹＴ（配列番号９）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ３
ことを特徴とするリガンドである。

本発明の目的のため、「ＣＤＲ」という用語は、前記パラトープの要素を構成し、且つ、抗原のエピトープとの抗体の相補性の決定を可能にする前記抗体の重鎖と軽鎖の可変領域の３か所の超可変領域を意味するものとする。これらの３か所の超可変領域は、「フレームワーク」領域（ＦＲ）を構成し、且つ、安定した立体配置を可変ドメインに提供する４か所の定常領域によって縁どられている。

本発明に従うリガンドは、例えば、以下の通りである。
‐ＣＮＣＭ Ｉ−４８０３ハイブリドーマにより産生されるＣＦ１２モノクローナル抗体、
‐単独または混合物として使用される上の抗体のＶＨ断片またはＶＬ断片、
‐上の抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖまたはｓｃＦｖ断片またはナノボディ。好ましくは、それはＦａｂ断片またはｓｃＦｖ断片である、
‐それぞれ２つ、３つ、または４つのｓｃＦｖ断片からなる二価体、三価体、または四価体（ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、
‐上の抗体のパラトープ、および意中の動物またはヒトに対する免疫原性を最小限にするように改変されている定常領域を含む組換え抗体。例えば、それはキメラ（ヒト化、ヒツジ化、ヤギ化、ウシ化、ブタ化等）抗体または完全ヒト化、ヒツジ化、ヤギ化、ウシ化、ブタ化抗体である。

非限定的な例として、ＣＦ１２抗体に由来するｓｃＦｖのヌクレオチド配列が決定されており、対応するペプチド配列が推定されており、下の表３にそれぞれ示されている。

本発明の対象は本発明に従うリガンドをコードするヌクレオチド配列でもある。

本発明の対象は本発明に従うヌクレオチド配列を含む組換えベクター、特に発現ベクターでもある。

本発明の対象は本発明に従うヌクレオチド配列または本発明に従う組換えベクターを含む宿主細胞でもある。例えば、その細胞はＣＮＣＭ Ｉ−４８０３ハイブリドーマ、または本発明に従うヌクレオチド配列もしくは組換えベクターで形質転換された細胞である。

本発明の対象は、本発明に従うリガンドを作製するための方法であって、本発明に従う宿主細胞を適切な培地中で培養すること、および前記培養物から前記リガンドを回収することを含むことを特徴とする前記方法でもある。

発明者らは、ＣＦ１２抗体によって強力に増強されるヒトＦＳＨとは対照的に、有意ではあるがわずかにしかブタ、ヒツジ、およびウシのＦＳＨが増強されないことを示した。加えて、発明者らはＣＦ１２抗体から得られたｓｃＦｖが、それが由来とする抗体と同じ結合特性および増強特性を有することを示した。

本発明の対象は医薬品として使用するための本発明に従うリガンド、特にメスの哺乳類動物において排卵を誘導するために、およびオスまたはメスの哺乳類動物におけるホルモ
ン依存的不妊問題または低受胎問題を軽減するためにＦＳＨの生理活性、ＬＨの生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強するための本発明に従うリガンドでもある。

本発明の対象はリガンドとゴナドトロピンから形成される複合体、またはリガンドと前記リガンドに結合することができ、且つ、前記リガンドによって活性が増強されるゴナドトロピンの活性ペプチドから形成される複合体でもある。例えば、それは生体組織または生体液から抽出されたものであるＬＨ、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）ホルモン、またはＦＳＨとリガンドの複合体、または前記リガンドに結合することができ、且つ、前記リガンドによって活性が増強される前記ホルモンの組換えペプチドまたは活性ペプチドであるＬＨ、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）ホルモン、またはＦＳＨと前記リガンドとの複合体である。

本発明の対象は医薬品として使用するための本発明に従うリガンドまたは複合体、特にメスの哺乳類動物において排卵を、または多排卵をも誘導するために、またはオスもしくはメスの哺乳類動物におけるホルモン依存的不妊問題または低受胎問題を軽減するためにＦＳＨの生理活性、ＬＨの生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強するための本発明に従うリガンドまたは複合体でもある。前記医薬品は、メスの哺乳類動物において１つ以上の黄体によって分泌される循環内在性プロゲステロンのレベルを上げ、それによって初期胚発生を促進し、且つ、流産のリスクを低減することも可能にする。

本発明の対象は、食肉生産のための方法であって、メスの非ヒト哺乳類動物への本発明のリガンドおよび／または複合体の投与を含む前記方法でもある。

本発明の対象は哺乳類動物におけるホルモン依存的不妊性または低受胎性の治療に使用するための本発明のリガンドおよび／または複合体でもある。不妊性または低受胎性に悩まされているメスの哺乳類動物の場合では、本発明のリガンドまたは複合体の投与によって自然生殖、医学補助生殖、または人工生殖を促進することが可能になる。健康なメスの哺乳類動物への本発明のリガンドまたは複合体の投与によって自然生殖または人工生殖の環境で排卵を引き起こすことも可能になることが留意されるべきである。

本発明の目的のため、「ホルモン依存的不妊性／低受胎性」という用語は、例えば外的原因（例えば、農薬）または内的原因（例えば、脳下垂体または視床下部の不全、またはＬＨ、ＦＳＨ、もしくはＣＧといったゴナドトロピンの受容体の異常、例えば受容体の変異または多型が原因の生殖腺によるＬＨおよび／またはＦＳＨの受容についての問題）により生じるホルモン不足、例えばＦＳＨおよびＬＨの低循環濃度、またはこれらのホルモンの不在に起因する不妊性／低受胎性を意味するものとする。

本発明のリガンドおよび複合体はヒトまたは動物、特にヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ラクダ等において使用可能である。

本発明に従うリガンド、ホルモン、または複合体は、それらの増強作用が変更されることなく、注射、例えば筋肉内注射、静脈内注射、腹膜内注射、皮下注射、経皮注射、皮内注射、眼窩内注射、眼内注射、または眼部注射によって、または経眼的経路を介して別々に、連続的に、または一緒に投与され得る。

本発明の対象は本発明のリガンドまたは複合体および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物でもある。前記医薬組成物はＦＳＨおよび／またはＬＨおよび／または絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）ホルモンを含むこともできる。

例として提供されており、添付図面によって例示される以下の実施例を読むことで当業者はさらに他の利点を思いつくことができる。

ウシ顆粒膜細胞上でのヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）の生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のインビトロ増強作用を示す図である。 ヒトＦＳＨ受容体が安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）の生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のインビトロ増強作用を表す図である。 ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）ベクターが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）の生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のインビトロ増強作用を表す図である。 図３−１の続き。 ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）ベクターが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）の生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体およびＣＦ１２ ｓｃＦｖのインビトロ増強作用を表す図である。 ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）ベクターが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）の生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のインビトロ増強作用を表す図である。 図５−１の続き。 ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）ベクターが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ）の生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のインビトロ増強作用を表す図である。 図６−１の続き。 ヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるゴナールＦ（登録商標）（Ｂ）とフォスティモン（登録商標）（Ｃ）の生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のヒト顆粒膜細胞上でのインビトロ増強作用を表す図である。 ヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるゴナールＦ（登録商標）の生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のヒト顆粒膜細胞上でのインビトロ増強作用を表す図である。 図８−１の続き。 ヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるゴナールＦ（登録商標）、ピュレゴン（登録商標）およびフォスティモン（登録商標）（Ａ）の生理活性、およびヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）（Ｂ）の生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のメスのラットにおけるインビボ増強作用を表す図である。 ヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるゴナールＦ（登録商標）（ＡおよびＢ）、ピュレゴン（登録商標）およびフォスティモン（登録商標）（Ａ）の生理活性に対するＣＦ１２ ｓｃＦｖのメスのラットにおけるインビボ増強作用、およびヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるゴナールＦの生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のメスのラットにおける様々な投与方法（Ｃ）に応じたインビボ増強作用を表す図である。 ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）であるコルロン（登録商標）およびＥｎｄｏ５０００（登録商標）の生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のオスのラットにおけるインビボ増強作用を表す図である。 内在性ゴナドトロピンの生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体の発情期の雌羊におけるインビボ増強作用を表す図である。 卵胞刺激に対する２５ＩＵのｈＦＳＨの後に単独で注射されたＣＦ１２モノクローナル抗体のメスのサルにおけるインビボ増強作用を表す図である。 卵胞刺激に対する３７．５ＩＵのｈＦＳＨの後に単独で注射されたＣＦ１２モノクローナル抗体のメスのサルにおけるインビボ増強作用を表す図である。 エストラジオールおよびプロゲステロンの分泌に対する３７．５ＩＵのｈＦＳＨの後に単独で注射されたＣＦ１２モノクローナル抗体のメスのサルにおけるインビボ増強作用を表す図である。 ｈＦＳＨ、ｈＣＧ、ｈＬＨ、ｏＬＨ、ｐＬＨ、ｏＦＳＨおよびｐＦＳＨといったホルモンおよびヒトＦＳＨ受容体上のＣＦ１２リガンド立体構造エピトープを表す図である。 ｈＦＳＨの生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体の様々な断片のインビトロ増強作用を表す図である。 ｈＦＳＨの生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体の様々な断片のメスのラットにおけるインビボ増強作用を表す図である。

実施例１：本発明のリガンドの獲得、およびそのリガンドの特徴解析

（１）マウス免疫ストラテジー
注射は全て腹膜内注射でマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に行われた。５匹のマウスを使用した。

ＣＦ１２抗体向けのマウス免疫ストラテジー
組換えヒトＦＳＨ（ｒｈＦＳＨ）の数回の注射によって免疫を行った。完全フロイントアジュバントと共に５０μｇのｒｈＦＳＨを使用して１回目の注射（０日目）を行った。その後、次の順序で数回のブースター注射を行った。
‐２１日目および３５日目：不完全フロイントアジュバントと５０μｇのｒｈＦＳＨのブースター注射、
‐５５日目、５６日目および５７日目：アジュバント無しの３０μｇのｒｈＦＳＨ βサブユニットの注射、
‐５８日目：融合。

（２）アイソタイピング
ＲＤ Ｂｉｏｔｅｃｈが販売するＦａｓｔＥｌｙｓａアイソタイピングキット（参照番号ＲＤＢ３２５５）を製造業者の推奨に従って使用してＣＦ１２抗体のアイソタイピングを行った。

ＣＦ１２抗体はＩｇＭクラスおよびκアイソタイプの免疫グロブリンである。得られた光学密度（ＯＤ）値はそれぞれ０．６３９および０．６であった。

（３）シーケンシング
ＣＮＣＭ Ｉ−４８０３ハイブリドーマによって分泌されるＣＦ１２抗体の重鎖可変部分（ＶＨ）と軽鎖可変部分（ＶＬ）のヌクレオチド配列を以下のプロトコルに従ってそれらのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から決定した。

Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡキット（マッハライ・ナーゲル、ドイツ）を製造業者の推奨に従って使用して細胞からＲＮＡを抽出した。２６０ｎｍでの吸光度（Ａ）を測定することによって精製ＲＮＡの濃度を推定し、Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比によって、およびアガロースゲルでの電気泳動後に視覚的にそれらのＲＮＡの品質を推定した。

その後、製造業者の推奨に従ってＭ−ＭＬＶ酵素（参照番号Ｍ１７０１、プロメガ、米国）を使用する逆転写反応によってｏｌｉｇｏ−ｄＴ_１８を使用してそれらのｍＲＮＡの
相補性ＤＮＡを合成した。

次のプロトコルに従うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって第２ＤＮＡ鎖の合成を行った。次のもの、すなわち反応緩衝液（１×最終濃度）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、３００ｎＭのフォワードプライマーとリバースプライマー、１．２５ＵのＧｏＴａｑポリメラーゼ（参照番号Ｍ３１７５、プロメガ、米国）を４μｌの逆転写反応に加えて５０μｌの最終体積にする。

軽鎖の可変部分の増幅のために５種類の異なるプライマーペア（ＭＫＲｅｖ２から８＋ＭＫＣ５Ｆｏｒ）を使用し、重鎖の可変部分には２種類のペア（ＶＨＲｅｖ１またはＶＨＲｅｖ２＋ＭμＣＦｏｒ）を使用した。

使用したＰＣＲプログラムは、９５℃で２分間の初期変性に続く３０サイクルの９５℃で３０秒間の変性、４７℃で３０秒間のハイブリダイゼーションと７２℃で１分間の増幅、および最後に７２℃で５分間の最終増幅から構成される。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（参照番号２８７０４、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ドイツ）で脱塩し、その後、細菌に形質転換されるようにｐＧＥＭＴイージー・ベクタープラスミド（参照番号Ａ１３６０、プロメガ、米国）とライゲーションした。様々な細菌クローンから抽出されたプラスミドＤＮＡをシークエンス解析に送った（マクロジェン・ヨーロッパ、オランダ）。

その後、ＣＦ１２抗体のＶＨおよびＶＬの５’末端ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡのリーダー配列内に特異的なアンカープライマー（Ｆｗプライマー）を設計することを介して決定された。これらのプライマーは、それまでに得られたＶＬ配列およびＶＨ配列とＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴソフトウェアのデータベースとの間のアラインメントによる相同性の特定(Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36: W503-508, 2008; Giudicelli et al., Cold Spring Harb Protoc., 2011(6): 695-715, 2011)［３、４］、およびＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢからの目的のリーダー配列の抽出 (Giudicelli et al., Nucl. Acids Res., 33: D256-261, 2005)［５］の後に設計された。リバース（Ｒｅｖ）プライマーは、前記抗体の各々のそれまでに決定されたＶＨ配列とＶＬ配列のそれぞれの中に設計された。５’部分を得るために使用されたプロトコルは前段落において記載されたプロトコルと同じである。

ＭｕｌｔＡｌｉｎソフトウェア(Corpet, Nucl. Acids Res., 16(22): 10881-10890, 1988) ［６］を使用して配列のアラインメントからコンセンサスヌクレオチド配列を推定した。ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴソフトウェアを使用してポリペプチド配列への書き換えとＣＤＲのアノテーションを行った。結果が表６および表７に示されている。

（４）ｓｃＦｖの構築、作製、および特徴解析
（ａ）ｓｃＦｖ抗体断片の構築
ＣＦ１２抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の合成遺伝子がＡＴＧ：バイオシンセティクスＧｍｂＨ（ドイツ）によって合成された。

タンパク質の機能性を確保するペプチド（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３をコードする配列によって連結されており、且つ、ｓｃＦｖの精製を可能にするＨｉｓ_６ペプチド（Ｈｉｓタグペプチド）をコードする配列で終わる重鎖可変部分と軽鎖可変部分（配列番号１／配列番号
３）の融合体から各配列を設計した。発現プラスミドへのそれらの挿入を可能にするため、それらの配列の両脇にＰｓｔＩとＳａｌＩの制限酵素部位が付加された。所望によりＨｉｓ_６ペプチドの除去を可能にする追加の配列をＶＬの３’末端とＳａｌＩ部位との間に付加した。大腸菌での発現向けにコドンを最適化した。ｓｃＦｖ合成遺伝子の構築を図によって表現したものが下に詳述されている。

組換え抗体断片の遺伝子と読み枠に合わせて融合されると合成されたタンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を可能にするＰｅｌＢシグナル配列をＬａｃＺ誘導性プロモーターの制御下で含むＥ．Ｓ． Ｗａｒｄら(Ward et al., Nature, 341: 544-546, 1989) ［７］によるｐＳＷ１発現プラスミド（ＡＴＧ：バイオシンセティクスＧｍｂＨ、ドイツ）のＰｓｔＩとＸｈｏＩの酵素部位の間に前記抗体断片を挿入した。ペリプラズム内でこのシグナル配列はペプチダーゼによって除去される。

それらの構築物の品質のシーケンシングによる検証の後、コンピテントセルにした(Li et al., Afr. J. Biotechnol., 9(50): 8549-8554, 2010) ［８］ＨＢ２１５１細菌（Ｔ５３０４０、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）をヒートショックにより形質転換するためにｐＳＷ１−ＣＡ５プラスミド、ｐＳＷ１−ＣＨ１０プラスミドおよびｐＳＷ１−ＣＦ１２プラスミドを使用した。

（ｂ）組換え抗体断片の作製
細菌培養物
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌの２×ＹＴ培地に前培養物を３７℃で一晩にわたって調製した。翌日、５００μｌのこの前培養物を５００ｍｌの同じ培地に接種し、１．４のＯＤ_{６００ｎｍ}が得られるまで１５０ＲＰＭ、３７℃で培養した。０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加することでｓｃＦｖの合成を１５０ＲＰＭ、１６℃で１６時間にわったって誘導した。

抽出
その培養培地を４５００ｇ、４℃で３０分間にわたって遠心分離した。調製の後の部分は４℃で実施した。細菌のペリプラズムを抽出するため、沈殿物を１０ｍｌのＴＥＳ（０．２Ｍトリス、ｐＨ８、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、０．５Ｍショ糖）に再懸濁し、３０分間にわたってインキュベートし、その後で４分の１に希釈された１５ｍｌのＴＥＳをそれに添加し、続いて３０分間にわたってさらにインキュベートした。その細菌抽出物を１００００ｇで３０分間にわたって遠心分離した。上清をＰＢＳに対して一晩にわたって透析した。その透析された上清をｓｃＦｖの精製のためにすぐに処理するか、または使用するまで−２０℃で貯蔵した。

抗ＨｉｓタグＨＲＰ抗体（参照番号Ｒ９３１２５、ライフテクノロジーズ、フランス）を製造業者の使用推奨に従って使用するウエスタンブロッティングによりペリプラズム内にあるｓｃＦｖの生産量を分析した。

精製
前記ペリプラズムを５０００ｇ、４℃で２０分間にわたって遠心分離した。その上清をＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ニッケルアフィニティーゲル（シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州、米国）と共に４℃で１時間にわたって撹拌しながらインキュベートした。０に近いＯＤ_{２８０ｎｍ}が得られるまで、０．３ＭのＮａＣｌを含むｐＨ８の０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液でそのゲルを洗浄し、その次にそのゲルに添加された２０ｍＭのイミダゾールを含む同じ緩衝液で洗浄した。その後で０．３ＭのＮａＣｌと２５０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ８の０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液でｓｃＦｖを溶出した。その溶離液をＰＢＳに対して一晩にわたって透析した。その溶離液は−２０℃で貯蔵されている。

品質管理
その精製されたｓｃＦｖを１５％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によってクマシーブルーによる染色後に分析し、且つ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）７５ １０／３００
ＧＬカラム（参照番号１７−５１７４−０１、ＧＥヘルスケア、ドイツ）上での排除クロマトグラフィーによって分析した。

（５）特異性
ＣＦ１２抗体の特異性およびその抗体のｓｃＦｖの特異性をＥＬＩＳＡ法により検討した。評価される各ホルモンはｐＨ９．６の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの濃度で調製され、ＥＬＩＳＡプレート上でウェル当たり１００μｌの割合で分配された。吸着時間は＋４℃で１８時間であった。洗浄を５回行った後に０．１％ツイーンおよび１％ＢＳＡを添加した１００μｌのＰＢＳでウェルを３７℃で４５分間にわたって処理し、その後、各抗体またはｓｃＦｖを１００μｌ／ウェルの割合で分配し、３７℃で１時間にわたってインキュベートした。評価される各ホルモンに対して、抗体については１０〜２５０μｇ／ｍｌの範囲、ｓｃＦｖについては１０〜１５０または２００μｇ／ｍｌの範囲に応じた様々な濃度でその抗体およびｓｃＦｖを分配した。

洗浄を５回行った後にペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した二次抗体を１００μｌ／ウェルの割合で分配し、３７℃で１時間にわたってインキュベートした。その二次抗体は検討するモノクローナル抗体のアイソタイプに応じて抗ＩｇＧ１ ＨＲＰ（参照番号１１５−０３５−２０５、ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社）、抗ＩｇＧ２ａ ＨＲＰ（参照番号１１５−０３５−２０６、ジャクソンラボラトリーズ）または抗ＩｇＭ ＨＲＰ（参照番号１１５−０３５−０７５、ジャクソンラボラトリーズ）であった。ｓｃＦｖについては抗ＨｉｓタグＨＲＰ（参照番号Ｒ９３１２５、ライフテクノロジーズ、フランス）を使用した。洗浄を５回行った後に１００μｌ／ウェルの割合で分配されたＴＭＢによって酵素活性を発現させた。発現時間は反応速度に応じて外観温度において５分から３０分までであった。その反応を１ＭのＨ_２ＳＯ_４（５０μｌ／ウェル）によって停止させた後、ＥＬＩＳＡプレート用の分光光度計を使用してその発色反応の強度（光学密度）を測定した。

ＣＦ１２ ｓｃＦｖの特異性
吸着されている様々なホルモンへの濃度を上げて（飽和状態（Ｂｍａｘ）まで）、用意された抗体の結合の発現に基づき、ＣＦ１２ ｓｃＦｖによってＥＬＩＳＡ法で定量可能な結合を得ることができた。発現後に得られた光学密度単位として結果が表されている。

表９は、ブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ）とヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）、および様々なヒトＦＳＨに対して２００μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートされたＣＦ１２ ｓｃＦｖで得られた光学密度値を表している。

ＣＦ１２ ｓｃＦｖは吸着されているｐＦＳＨおよびｏＦＳＨに対して強い結合を示し、ｈＦＳＨとｈＭＧ（メノピュール）に対してはそれより弱い結合を示している。

表１０はブタＬＨ（ｐＬＨ）、ヒツジＬＨ（ｏＬＨ）、ウシＬＨ（ｂＬＨ）、ｅＣＧ、およびｈＣＧであるコルロンとＥｎｄｏ５０００に対して２００μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートされたＣＦ１２ ｓｃＦｖで得られた光学密度値を表している。

ＣＦ１２ ｓｃＦｖの動物のＬＨへの結合は、吸着されているｈＣＧおよびｅＣＧへの結合と異なってかなりのものであり、後者のものへの結合はＬＨへの結合よりも弱い。

したがって、ＣＦ１２の結合とＣＦ１２ ｓｃＦｖの結合、特にヒトホルモンへの結合はエピトープの立体構造よって非常に制限されるようである。ヒトＦＳＨの活性およびｈＣＧであるコルロンとＥｎｄｏ５０００の活性に対してＣＦ１２およびそのｓｃＦｖによってインビトロおよびインビボで得られる顕著な生物学的作用を考慮すると（実施例２および実施例３の結果を参照されたい）、ＣＦ１２ ｓｃＦｖの結合はちょうど完全抗体の結合のように前記ホルモンの立体構造に完全に依存すると思われる。ＣＦ１２の結合とＣＦ１２ ｓｃＦｖの結合の減損はＥＬＩＳＡプレートのプラスチックに吸着されている前記ホルモンの立体構造の変化に起因するという仮説によってこれらの結果を説明することができ、且つ、ＣＦ１２およびそのｓｃＦｖは非常に立体構造的なエピトープに特異的であるという仮説を補強することができる。

検討した様々なＦＳＨ、ＬＨおよびＣＧに対するｓｃＦｖの解離定数Ｋｄの推定値が、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）上で飽和結合モデル（「飽和結合実験モデル」、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェア）内の「１サイト特異的結合」機能を使用して計算された。得られた様々な値が表１１および表１２に示されている。

このように推定された解離定数Ｋｄの比較により、ヒツジのＦＳＨ、ブタのＦＳＨおよびヒトのＦＳＨ（ゴナールＦおよびフォスティモン）に対する前記ｓｃＦｖのより強い親和性が示されており、Ｋｄ値はｐＦＳＨとｈＦＳＨであるフォスティモンに対する２．６μＭからｏＦＳＨに対する３．７７μＭおよびｈＦＳＨであるゴナールＦに対する４．８７μＭまでにわたる。

動物のＬＨ、ｅＣＧおよびｈＣＧであるコルロンとＥｎｄｏ５０００に対するＫｄ値は比較的に一様であり、４．７２μＭと６．２３μＭの間で変化し、上のＦＳＨと比較してわずかに弱いこれらのホルモンに対するＣＦ１２ ｓｃＦｖの親和性を証明する。

ｈＦＳＨであるピュレゴンとｈＭＧであるメノピュールに対してＣＦ１２ ｓｃＦｖはさらに弱い親和性を示し、数十μＭのＫｄ、すなわち、それぞれ１４μＭと２５．２２μＭのＫｄである。

実施例２：ＦＳＨの生理活性に対する本発明のリガンドの増強作用のインビトロ測定
ＦＳＨの生理活性に対する本発明のリガンドの増強作用の証明が、ＦＳＨ単独か、またはＦＳＨ／モノクローナル抗体（ＭＡｂ）複合体のどちらかで刺激された様々な細胞種または細胞株を用いて得られた生物学的応答を比較することにより行われた。

それらの事例の各々において、得られた用量応答曲線の比較により、複合体化されたＦＳＨの生物活性に対する前記ＭＡｂのインビトロ増強作用を定量することが可能になった。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）を使用してそれらの結果の統計分析を行った。

（１）ウシ顆粒膜細胞の初代培養物について
最初にヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）に対するＣＦ１２ ＭＡｂの増強作用の特徴がウシＦＳＨ受容体を内在的に発現するウシ顆粒膜細胞上で解析された。

ＣＦ１２抗体の最終濃度が０．１μｇ／ｍｌであるハイブリドーマ上清を３ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌまでの範囲のヒトＦＳＨと３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。

Ｃｈｏｐｉｎｅａｕら(Mol. Cell Endocrinol., 92(2): 229-39, 1993)［８］およびＷｅｈｂｉら(Endocrinology, 151(6): 2788-2799, 2010)［９］に記載のプロトコルに従ってウシ卵巣に対する卵巣穿刺により２〜６ｍｍまでの範囲の直径を有する卵胞からウシ顆粒膜細胞を採取した。ＭｃＣｏｙの５Ａ培地（Ｌｏｎｚａ、ベルギー、参照番号ＢＥ１２−６８８Ｆ）に懸濁状態の０．５ｍｌ当たり８００００細胞の割合で調製したウシ顆粒膜細胞を３ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌまでの範囲のＦＳＨ単独か、または上のプロトコルに従ってモノクローナル抗体と予め複合体化されたものによって４８μｇ／ｍｌのＩＢＭＸ（シグマ・アルドリッチ、フランス、参照番号Ｉ５８７９）の存在下で３７℃において３時間にわたって撹拌しながら刺激した。測定された生物学的応答はｃＡＭＰ分泌であった。

遠心分離後、ＥＬＩＳＡキット（バイオメディカルテクノロジーズ社、マサチューセッツ州、米国、ＢＴ−７３０）を使用して、産生したｃＡＭＰを培養上清中にアッセイした。

結果が図１に示されている。

それらの結果はヒトＦＳＨの活性に対するＣＦ１２の２．５倍の増強を示している。二元配置分散分析（二元配置ＡＮＯＶＡ、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェア）による統計分析によってＣＦ１２についてのｐ＜０．０１（^＊＊）からｐ＜０．００１（^＊＊＊）までの範囲の有意な効果が示されている。ＣＦ１２抗体は検査されたｈＦＳＨ濃度の全てに対して有意な効果を有している。

（２）ヒトＦＳＨ受容体が安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株について
様々な種のＦＳＨに対する前記ＭＡｂの増強作用がヒトＦＳＨ受容体を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞上で測定された。この系により、３７℃で１時間にわたるＦＳＨ単独か、またはＦＳＨ／ＭＡｂ複合体による刺激の後のＦＳＨ受容体の活性化に続くｃＡＭＰ産生を測定することが可能になった。

このために６００００個の細胞を９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン、ニュージャージー州、米国、参照番号３５３０７２）のウェルに分配し、１０％のＳＶＦ（Ｌｏｎｚａ、ベルギー、参照番号ＤＥ１４−８０１Ｆ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ・アルドリッチ、フランス、参照番号Ｐ−４３３３）および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ・アルドリッチ、フランス、参照番号Ａ１７２０）を含む１００μｌのＭＥＭ培地（Ｏｚｙｍｅ、フランス、参照番号ＢＥ１２−６１１Ｆ）の中において湿潤環境中、５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間にわたってそれらの細胞を培養した。ＭＥＭ培地中で２時間の休止の後、それらの細胞を３７℃で１時間にわたって刺激した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（バイオメディカルテクノロジーズ社、マサチューセッツ州、米国、ＢＴ−７３０）を使用してアッセイした。結果はエンドポイントにおけるｃＡＭＰの分泌量を表している。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）を使用してそれらの結果を分析した。

図２はヒトＦＳＨ受容体が安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞上でのヒトＦＳＨの生理活性に対するＣＦ１２モノクローナル抗体のインビトロでの増強作用を表している。このためにそれらの細胞を０．３ｎｇ／ｍｌから３ｎｇ／ｍｌまでの範囲のヒトＦＳＨ（ゴナールＦ、セローノ・ラボラトリー）か、またはそれらの細胞の刺激の前に前記モノクローナル抗体（０．１μｇ／ｍｌの最終濃度）と３７℃で３０分間にわたって予めインキュベートされた同じレンジポイントのＦＳＨのどちらかで刺激した。二元配置分散分析（二元配置ＡＮＯＶＡ、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェア）により、ＦＳＨ単
独か、またはＦＳＨ／モノクローナル抗体複合体を用いて得られた用量応答曲線を比較することが可能になった。組換えヒトＦＳＨ（ゴナールＦ、セローノ・ラボラトリー）を用いて得られた結果は、ＣＦ１２抗体が０．５ｎｇ／ｍｌで１４０％、および１ｎｇ／ｍｌと３ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ１６０％のホルモン活性増強作用を有していることを示している。この作用は対応のあるｔ検定（ウィルコクソン検定）によって３ｎｇ／ｍｌのヒトＦＳＨのポイントで有意（ｐ＜０．０１）である。

（３）ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）システムが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株について
様々な種のＦＳＨに対する前記ＭＡｂの増強作用がヒトＦＳＨ受容体およびＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）ベクター（プロメガ、フランス）を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞上でリアルタイムに測定された。この細胞系により、アゴニスト（ＦＳＨのみ、またはＦＳＨ／モノクローナル抗体複合体）でのＦＳＨ受容体の刺激の後のｃＡＭＰ産生をリアルタイムでモニターすることが可能になった。ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）タンパク質へのｃＡＭＰの結合の後、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）基質（プロメガ、フランス、参照番号Ｅ１２９１）が加水分解され、それによりＰｏｌａｒＳｔａｒ Ｏｐｔｉｍａリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）によって測定され、且つ、ＲＬＵ（相対発光単位）で表される発光が放射された。この安定株はフランス、３７３８０、ヌジリー、ヴァル・ド・ロワールにあるＩＮＲＡ（フランス国立農学研究所）センターのシグナル伝達システムのバイオロジーおよびバイオインフォマティクスチームによって開発され、これらのアッセイのために利用可能とさせてもらった。

このためにＨＥＫ２９３細胞を透明底白色９６ウェルマイクロプレート（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、フランス、参照番号６５５９０３）のウェル当たり８００００細胞の割合で、１０％のＳＶＦ（Ｌｏｎｚａ、ベルギー、参照番号ＤＥ１４−８０１Ｆ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ・アルドリッチ、フランス、参照番号Ｐ−４３３３）、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（ライフテクノロジーズ（商標）、フランス、参照番号１０６８７０１０）および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ・アルドリッチ、フランス、参照番号Ａ１７２０）を添加された１００μｌのＭＥＭ培地（Ｏｚｙｍｅ、フランス、参照番号ＢＥ１２−６１１Ｆ）の中で一晩にわたって培養した。暗所での外界温度において２時間にわたる１％のＢＳＡ（ＰＡＡ、フランス、参照番号Ｋ４５０１２）が添加されており、且つ、４％のＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）基質を含む１００μｌのＭＥＭ培地の中での２時間の休止の後に細胞を含むそのプレートをＰｏｌａｒＳｔａｒ Ｏｐｔｉｍａリーダーに配置し、基底レベルの発光を測定するために５分間にわたって最初の読取りを行った。その後、そのプレートをそのリーダーから取り出し、表示されている濃度を得るために１１μｌのリガンド（ＦＳＨのみ、またはＦＳＨ／モノクローナル抗体複合体）をそのプレートに添加した。その後、放射される発光を約１時間３０分にわたって測定した。

Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）を使用して、得られた結果を分析した。非線形関数「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答」を使用してＦＳＨ濃度の関数としての応答をプロットした。これによってＦＳＨ単独、および前記モノクローナル抗体と複合体化されたＦＳＨのＥＣ５０を特徴解析し、且つ、比較することが可能になった。各例について、二本の曲線をそれらの全体にわたって比較することにより、ＦＳＨ／増強抗体複合体の有意な効果を二元配置分散分析（二元配置ＡＮＯＶＡ、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェア）によって評価した。

ＣＦ１２モノクローナル抗体
ＣＦ１２モノクローナル抗体の増強作用をヒト、ヒツジおよびブタのＦＳＨの生理活性
に対して特徴解析した。

図３はヒトＦＳＨ（ゴナールＦ、セローノ・ラボラトリー）の生理活性に対するＣＦ１２の顕著な増強作用を示している。この顕著な作用は、前記細胞系にとって飽和濃度ではないｈＦＳＨの０．０１ｎＭおよび０．０３ｎＭという低い濃度のときに完全に定量可能である（曲線ＡおよびＢ）。非常に有意（ｐ＜０．００１）であるそれぞれ２８０％および３４１％という発光シグナルの増加が観察されている。より高い濃度（０．１ｎＭ、０．３ｎＭおよび１ｎＭ）について、細胞応答の増加は、おそらく最大で４６０００ＲＬＵまでの発光シグナルの漸進的な飽和に起因して、それぞれ１８１％、１４７％および１２０％である（曲線Ｃ、ＤおよびＥ）。曲線Ｃ、ＤおよびＥについて、その増加は依然として非常に有意なままである（ｐ＜０．００１）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって測定されたＥＣ５０値はｈＦＳＨについては４．２５×１０^−１０Ｍであり、且つ、ｈＦＳＨ／ＣＦ１２複合体については９．３８×１０^−１１Ｍであり、前記ホルモンが増強抗体ＣＦ１２と複合体化したときの前記ホルモンの生理活性の０．７単位のＬｏｇＥＣ５０の増加（それぞれ１０^{−９．３７}から１０^{−１０。０３}まで）を反映している（曲線Ｆ）。

ＣＦ１２ ｓｃＦｖ（４０ｎＭ）の増強作用も０．０１ｎＭの濃度で調製されたヒトＦＳＨ（ゴナールＦ、セローノ・ラボラトリー）の活性に対して測定した（図４）。ＣＦ１２完全抗体（６ｎＭ）の作用を比較のために並行して測定した。ｈＦＳＨ／ＣＦ１２ ｓｃＦｖまたは複合体ｈＦＳＨ／ＣＦ１２抗体複合体を用いて得られた曲線が相互に完全に重なり合い、その一価抗体断片と同一の作用を示している。

ＣＦ１２が及ぼす増強作用は図５に示されているようにヒツジＦＳＨに対しても非常に有意であり、０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭおよび０．１ｎＭのホルモン濃度について、ＣＦ１２／ｏＦＳＨ複合体を用いる刺激の間に細胞応答の２４０％、３００％および３５０％の増加が観察されている（曲線Ａ、Ｂ、Ｃ）。ＣＦ１２は１０ｎＭで調製された。ｈＦＳＨと同様に、０．３ｎＭおよび１ｎＭというより高い濃度について（曲線ＤおよびＥ）、細胞応答の増加は、最大で４００００ＲＬＵまでの発光シグナルの漸進的な飽和に起因して、それぞれ２００％および１３０％である。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって測定されたＥＣ５０値はｏＦＳＨについては２．２９×１０^−９Ｍであり、且つ、ｏＦＳＨ／ＣＦ１２複合体については１．９８×１０^−１０Ｍであり、前記ホルモンが増強抗体ＣＦ１２と複合体化したときの前記ホルモンの生理活性の１．０６のＬｏｇＥＣ５０の増加（それぞれ８．６４から９．７まで）を反映している（曲線Ｆ）。細胞応答について観察されたそれらの増強作用は全ての事例において非常に有意である（ｐ＜０．００１）。

図６の曲線は０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭおよび１ｎＭの濃度で調製されたブタＦＳＨに対するＣＦ１２（１０ｎＭ）の増強作用を示している。この作用は、前記細胞系にとって飽和濃度ではないｐＦＳＨの０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭおよび０．１ｎＭという非常に低い濃度のときに完全に定量可能である（曲線Ａ、Ｂ、Ｃ）。そうしてそれぞれ２２０％、３５０％および３３０％という発光シグナルの非常に有意で大幅な増加が観察されている。より高い濃度（０．３ｎＭおよび１ｎＭ）について、細胞応答の増加は小さく、最大でも４００００ＲＬＵという限度までの発光シグナルの漸進的な飽和に起因して、それぞれ１７５％および１１４％である（曲線ＤおよびＥ）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって測定されたＥＣ５０値はｐＦＳＨについては１．９２×１０^−９Ｍであり、且つ、ｐＦＳＨ／ＣＦ１２複合体については３．６９×１０^−１０Ｍであり、前記ホルモンが増強抗体ＣＦ１２と複合体化したときの前記ホルモンの生理活性の０．７１７のＬｏｇＥＣ５０の増加（それぞれ１０^{−８．７１５}から１０^{−９．４３２}まで）を反映している（曲線Ｆ）。

（４）ヒト顆粒膜細胞の初代培養物について
ヒト顆粒膜細胞がＲｅｖｅｒｃｈｏｎら (Reverchon et al., Human Reprod., 27(6): 1790-1800, 2012)［１１］に記載されているように回収され、培養された。

生殖補助医療（ＡＲＴ）の背景で体外受精（ＩＶＦ）のために処置された女性における卵母細胞穿刺後に収集された卵胞液からこれらの細胞を回収した。これらの細胞を４０％パーコール密度勾配上での遠心分離により単離し、ＭｃＣｏｙの完全５Ａ培地（Ｌｏｎｚａ、ベルギー、参照番号ＢＥ１２−６８８Ｆ）に再懸濁し、その後で５００μｌの最終体積の中にウェル当たり３００００細胞の割合で２４ウェルプレート（ベクトンディッキンソン、ニュージャージー州、米国、参照番号３５３０４７）に播種し、そして４８時間にわたって培養した。その後、それらの細胞をヒトＦＳＨ単独か、またはヒトＦＳＨ／ＭＡｂ複合体のどちらかで４８時間にわたって刺激した。使用したヒトＦＳＨは主に製薬研究企業であるセローノ（セローノ・ヨーロッパ社）によって販売されている組換えホルモンであるゴナールＦと製薬研究企業であるジェニエーブル（フランス）によって販売されている閉経期の女性の尿から抽出されたＦＳＨであるフォスティモンである。刺激後に上清を回収し、遠心分離した。ＥＬＩＳＡキット（バイオメディカルテクノロジーズ社、マサチューセッツ州、米国、ＢＴ−７３０）を使用して、各培養上清中の産生されたｃＡＭＰをアッセイした。

上記の方法に従って２３人の患者の細胞を別々に調製し、別々に培養した。一人の患者に由来する各細胞培養物を２つのバッチに分けた。一方のバッチを１０^−１１Ｍから１０^−８Ｍまでの範囲のＦＳＨで刺激し、他方のバッチをその範囲の様々な濃度のＣＦ１２モノクローナル抗体／ｈＦＳＨ複合体で刺激した。前記抗体を０．１ｎＭまたは４ｎＭの最終濃度で調製した。各患者について、使用した前記ヒトホルモンの生理活性に対する前記抗体の増強作用を評価するためにそれらの２つの条件下で得られた用量応答曲線を比較した。

前記２３人の患者の細胞培養物は、ｈＦＳＨおよび／またはｈＦＳＨ／抗体複合体を用いた刺激に対して非常に異なる応答を示した。総計で２３人のうちの１２人の患者の細胞だけが、使用したｈＦＳＨと無関係にＦＳＨ単独による刺激とＦＳＨ／抗体複合体による刺激に応答した（図７、曲線Ａ、Ｂ、Ｃ）。これらの結果が図７に示されている。曲線ＡはゴナールＦによる刺激とフォスティモンによる刺激に対する患者の細胞応答を表している。測定されたＥＣ５０値はそれぞれ７×１０^−１１および１×１０^−９であった。曲線Ｂおよび曲線Ｃは、ｈＦＳＨ単独による刺激（曲線ＢについてはゴナールＦ、および曲線Ｃについてはフォスティモン）とＣＦ１２／ｈＦＳＨ複合体による刺激の両方に応答した顆粒膜細胞を有する患者を表す２つの事例を示している。曲線Ｂの場合、前記複合体を用いて得られた用量応答曲線のＥＣ５０値は前記ホルモンだけを用いて得られた用量応答曲線の値よりも大きい（２．４２×１０^−９Ｍに対する７．５２×１０^−１０Ｍ）。曲線Ｃの場合、ＥＣ５０値は似ている（３．６１×１０^−９Ｍに対する２．２８×１０^−９Ｍ）。

１１人の残りの患者のうち、そのうちの４人の細胞がＦＳＨによる刺激にもＦＳＨ／ＣＦ１２複合体による刺激にも応答しなかった。逆に、および驚くべきことに、他の７人の細胞がＦＳＨ／増強抗体複合体による刺激にのみ応答し、同じ濃度範囲にあるｈＦＳＨ単独による刺激の後にｃＡＭＰ分泌の増加が観察されなかった。これらの顕著な結果が、各曲線が異なる患者の顆粒膜細胞の応答を表す図８の曲線Ａから曲線Ｆによって示されている。それらの事例の各々においてＣＦ１２抗体を０．１ｎＭで使用した。２人の患者が曲線Ｄによって表される同じ用量応答曲線を生じた。これらの結果は、これらの患者では、ｈＦＳＨＲ受容体を活性化しないＦＳＨ単独の場合と異なり、ｈＦＳＨ／ＣＦ１２抗体複合体だけがｈＦＳＨＲ受容体の機能的刺激を誘導することができることを非常に明確に示
している。ｈＦＳＨ／ＣＦ１２抗体複合体を用いる刺激の下で得られた最大ｃＡＭＰ分泌レベルは、ｈＦＳＨに対して正常に応答した細胞培養物を用いて得られた最大分泌レベルと等しい６ｐｍｏｌ／ｍｌと１５ｐｍｏｌ／ｍｌの間にある（図１２）。前記用量応答曲線の各々についてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって測定されたＥＣ５０値が表１３に示されている。

ｈＦＳＨ／ＣＦ１２抗体複合体はこのように新規のリガンドとして挙動し、組換型または抽出型のｈＦＳＨによる従来の刺激が元々無効である患者においてｈＦＳＨＲを活性化することができる新規のアゴニストとして挙動する。ｈＦＳＨ／増強抗体混合物を使用することにより、ヒト生殖生物学において使用されている従来のホルモン療法に応答しない患者において排卵（単排卵または多排卵）を誘導するためのホルモン治療の新規代替法をこのように提供することができる。

実施例３：ラットモデルにおけるＦＳＨおよびＬＨ／ＣＧの生理活性に対する本発明のリガンドの増強作用のインビボ測定
インビトロで特徴解析された後、前記モノクローナル抗体の増強作用をＦＳＨの生理活性に対するその抗体の作用についてはメスのラットにおいて、およびそれらが同じく認識するＬＨ／ＣＧの生理活性に対するその抗体の作用についてはオスのラットにおいてインビボで特徴解析した。

ＦＳＨ生理活性を測定するため、使用したプロトコルはＳｔｅｅｌｍａｎとＰｏｈｌｅｙ(Steelman SL, Pohley FM. Endocrinology, 53: 604-616. 1953) ［１２］によって記載された生物学的アッセイのプロトコルであった。ＬＨ生理活性を測定するため、使用したプロトコルはＳｃｏｂｅｙら(Scobey et al., Reprod. Biol. Endocr. 3: 61, 2005) ［１３］によって記載されたアッセイのプロトコルであった。

ヒトＦＳＨを使用してＦＳＨ活性に対するそれらの抗体の作用を評価した。ＬＨ活性に対するそれらの抗体の作用をｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）の２種類の調製物に対して評価した。

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）を使用して統計分析を行った。結果は５匹の動物からなるバッチに対して行われた実験に関連するものであったので、Ｄｕｎｎ補正付きのノンパラメトリック一元分散分析（クラスカル・ウォリス検定）、またはノンパラメトリックｔ検定（マン・ホイットニー検定）を適用した。数回のバイオアッセイをまとめたことによって数が大きくなった（ｎ＞３０）ものに関する結果についてはボンフェローニ補正付きのパラメトリック検定（対応のないスチューデントのｔ検定）を適用した。

（１）メスのラットにおけるＦＳＨの生理活性に対する抗体の増強作用
ＣＦ１２抗体およびそのｓｃＦｖの増強作用を生殖補助医療治療の背景でヒトの生殖において使用されているヒトＦＳＨの様々な調製物、すなわちゴナールＦとピュレゴン（そ
れぞれメルクセローノ・ラボラトリーとメルクシェリングプラウ・ラボラトリーに由来する組換えＦＳＨ）、およびフォスティモンとメノピュール（それぞれラボラトワール・ジェニエーブルとメルクシェリングプラウによって販売されている抽出型ＦＳＨ）に対して検討した。

ＳｔｅｅｌｍａｎとＰｏｈｌｅｙのプロトコルに記載されているように、２１日齢の未成熟なメスのラットが、一定量のｈＣＧ（３．５ＩＵ）を含み、ヒトＦＳＨ（ゴナールＦ、ピュレゴン、フォスティモン、メノピュール）については０．５〜１．５ＩＵまでの範囲で変えることができる量のＦＳＨを添加された１００μｌのｈＣＧとＦＳＨの混合物からなる注射を連続３日間にわたって朝と晩に２回受けた。うなじに皮下注射を行った。各実験は最小でも４つのバッチから構成された。１つのバッチは生理食塩水（血清Φ）で処置され、１つのバッチは抗体またはｓｃＦｖ単独で処置され、１つのバッチはｈＣＧ＋ＦＳＨ混合物で処置され、１つのバッチは２μｇの精製されたｓｃＦｖまたは抗体を添加したｈＣＧ＋ＦＳＨ混合物で処置された。

ホルモン／抗体またはｓｃＦｖの複合体を用いる処置の場合、区別なく注射の前にそのＦＳＨ＋抗体混合物を３７℃または外界温度で２０分間にわたってプレインキュベートし、その後でｈＣＧに添加した。そのｈＣＧを前記複合体の保温時に区別なくＦＳＨと混合することができる。

４日目にそれらのメスのラットの体重を測定し、それらの卵巣を取り出し、解剖し、そしてそれらの重量を量った。結果が体重１００グラム当たりのミリグラム単位の卵巣として表されている。卵巣重量の増加は注射した生理活性ＦＳＨの量に比例している。これにより、単独で、または抗体との複合体として注射された同量のホルモンの生理活性を定量し、比較することができる。

単独で、または前記抗体もしくはｓｃＦｖと複合体化されて注射されたＦＳＨの生理活性の比較により、応答の差異を測定し、そうして前記抗体またはそのｓｃＦｖの増強作用を定量することが可能になる。

ＣＦ１２抗体およびそのｓｃＦｖの増強作用
ヒトＦＳＨに対して作製されたＣＦ１２抗体のインビボ作用をヒトＦＳＨの様々な調製物の生理活性とヒツジＦＳＨの生理活性に対して評価した。

図９ＡはヒトＦＳＨの３種類の異なる調製物に対してＣＦ１２抗体が及ぼす顕著な増強作用を示している。それらの結果は５匹のメスからなるバッチより構成される代表的なバイオアッセイの結果である。ノンパラメトリックｔ検定（マン・ホイットニー検定）を用いてバッチ間の統計分析を行った。ｈＦＳＨであるゴナールＦの活性について、卵巣の平均重量の２１０％の増加（１００ｇの体重当たり７４ｍｇに対して１５５ｍｇ、ｐ＜０．００１）を含むかなりの有意な増強作用が記録された。同様に、ピュレゴンについて１９０％の増加が得られ（１４１ｍｇに対して２２４ｍｇ、ｐ＜０．０５）、フォスティモンについても卵巣の平均重量の１６０％の増加が記録された（８５ｍｇに対して１６１ｍｇ、ｐ＜０．０５）。

これらの実験を５回から７回繰り返し、それらの結果をまとめた（バッチｈＣＧ＋ｈＦＳＨ ゴナールＦおよびバッチｈＣＧ＋ｈＦＳＨ ゴナールＦ＋ＣＦ１２についてｎ＝４０と４７のメスのラット）。ボンフェローニ補正付きのパラメトリック検定（対応のないスチューデントのｔ検定）を適用した。表１４に示されているように、ｈＣＧ＋ｈＦＳＨ（ゴナールＦ）混合物で従来通りに処置されたメスの卵巣の平均重量とｈＦＳＨ ゴナールＦ／ＣＦ１２複合体で処置されたメスにおいて測定された卵巣の平均重量との間に非常
に有意な１７０％の増加が示されており、平均重量がそれらのメスにおいて１００ｇの体重当たり７９．５１±２．１７８ｍｇの卵巣から１００ｇの体重当たり１３４．８±４．９８５ｍｇの卵巣まで増加している（^＊＊＊、ｐ＜０．００１）。

ヒツジ起源のＦＳＨに対するＣＦ１２抗体の増強作用を評価および定量するために同じアプローチを行った。

図９Ｂは、０．５μｇのヒツジＦＳＨ＋ｈＣＧまたはｈＣＧ＋ＣＦ１２と予め複合体化された０．５μｇのヒツジＦＳＨでメスのラットを処置することによって得られたバイオアッセイ（５匹のメスからなるバッチ）の代表例を示している。ＣＦ１２を含まない処置を受けたメスと比較してｏＦＳＨ／ＣＦ１２複合体＋ｈＣＧで処置されたメスにおいて卵巣の平均重量の１７０％の増加が得られ、卵巣の平均重量が１００ｇの体重当たり１０７ｍｇから１８３ｍｇへ推移した（^＊＊、ｐ＜０．０１）。

この試験をより多く（ｎ＝１０）に対して反復することによってｏＦＳＨの生理活性に対するＣＦ１２の増強作用が非常に有意に確認され（表１５）、平均重量が従来の処置の場合の１１５．５±７．４５ｍｇからｏＦＳＨ／ＣＦ１２複合体＋ｈＣＧで処置された場合の１６６．４±９．５４ｍｇまで増加した（^＊＊＊、ｐ＜０．００１）。

前記抗体のＶ_Ｈ可変領域およびＶ_Ｌ可変領域の配列から開発されたＣＦ１２ ｓｃＦｖをヒトＦＳＨの生理活性に対して同様に評価した。前もって、完全抗体の同じ注射量に相当する一回の注射につき０．０６μｇ（２．５×１０^−９ｍｏｌの完全抗体と等モルの量に相当する）から２μｇまでの数種類の用量のｓｃＦｖを評価した。そのバイオアッセイにおける様々な用量のｓｃＦｖの比較より、一回の注射につき２μｇ、すなわち８×１０^−８ｍｏｌのｓｃＦｖの注射によって最適な増強作用が得られることが示された。

ヒトＦＳＨの様々な調製物について得られた結果が図１０Ａに示されている。それらの結果は、前記ｓｃＦｖによって記録された作用が前記３種類のヒトＦＳＨ調製物に対して完全抗体を用いて測定された作用と非常に近いことを示している。卵巣の平均重量は、ｈＦＳＨ＋ｈＣＧで従来通りに処置されたメスのラットと比較してｈＦＳＨ／ｓｃＦｖ／ＣＦ１２複合体＋ｈＣＧで処置されたメスのラットにおいて一貫して高かった。したがって、１９０％の増加がｈＦＳＨであるゴナールＦについて記録され（ＣＦ１２ ｓｃＦｖを
含まないバッチにおける８９ｍｇの平均重量に対してＣＦ１２ ｓｃＦｖを含むバッチにおける１７０ｍｇの平均重量、ｐ＜０．０１）、１５１％の増加がｈＦＳＨであるピュレゴンについて記録され（ｓｃＦｖを含まないバッチにおける８６ｍｇの平均重量に対してＣＦ１２ ｓｃＦｖを含むバッチにおける１３０ｍｇの平均重量、ｐ＜０．０５）、そして１４８％の増加がｈＦＳＨであるフォスティモンについて記録された（ｓｃＦｖを含まないバッチにおける７７ｍｇの平均重量に対してＣＦ１２ ｓｃＦｖを含むバッチにおける１１４ｍｇの平均重量、Ｐ＜０．０５）。ノンパラメトリックｔ検定（マン・ホイットニー検定）を用いて分析を行った。卵巣応答の増加の程度がＣＦ１２完全抗体を用いて得られた増加の程度と等しい（同じ倍率）ことが留意されるべきである。この有意で重要な結果は、ｓｃＦｖによるにしても、または完全抗体によるにしても循環ゴナドトロピンの全く同一の増強作用をインビボで得ることができ、器官における生理学的応答を確実に増強することができることを示している。

前記ホルモン／抗体またはｓｃＦｖの混合物の注射の様々な方法をＣＦ１２の場合についても従来のプロトコル（皮下注射）と評価および比較した。したがって、前記ホルモン混合物の腹膜内注射を前記ホルモン混合物の腹膜内注射とそれに続き１５分後に行った２つ目のＣＦ１２ ｓｃＦｖの注射と比較することを目的としたバイオアッセイを実施した。結果が図１０Ｂに示されており、それらの結果は２ステップで腹膜内注射された、すなわち１）ｈＣＧ＋ｈＦＳＨ混合物を注射され、その後で２）１５分後に行った注射によりｓｃＦｖを注射されたメスにおける卵巣重量の１２２％の増加、すなわちｈＣＧ＋ｈＦＳＨ ゴナールＦバッチにおける１００ｇの体重当たり５８．８ｍｇの卵巣に対するｈＣＧ＋ｈＦＳＨ ゴナールＦとそれに続くｓｃＦｖバッチにおける１００ｇの体重当たり７２ｍｇの卵巣という増加を示している。その差はそれらの２つのバッチの間で数の少なさから有意ではないが、それらの結果は前記ホルモンと前記ｓｃＦｖを２ステップで、且つ、２つの異なる注射部位に注射することによるＦＳＨの増強傾向を示している。したがって、増強されるべきホルモンを注射し、その後で時間と様々な注射部位に関して独立して抗体またはｓｃＦｖを注射することを後の適用のために考えることができる。

別の注射方式をホルモン／抗体複合体で処置された動物において評価した。一方の注射方式はｈＣＧ＋ＦＳＨ＋ＣＦ１２の単回皮下注射を有し、他方の注射方式は最初のＦＳＨ＋ＣＦ１２の皮下注射とその後の１５分後のこれも皮下注射のｈＣＧの注射を有した。図１９Ｃに示されている結果はそれらの２つの事例において観察された増強作用が似ていることを示しており、抗体を用いずに処置されたバッチの８３ｍｇという卵巣の平均重量に対して、ＣＦ１２抗体で処置されたメスでは１００ｇの体重当たり１６０ｍｇの卵巣に対して１５９ｍｇの卵巣である。

ラットにおけるＬＨ／ＣＧの生理活性に対する抗体の増強作用
ヒツジＬＨは非常に高価であるため、これらの生物学的アッセイは、容易に入手でき、非常に純粋であり、且つ、安価な形態であるｈＣＧを用いて実施された。前記抗体の作用を抽出型ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）の２種類の調製物、すなわち一方の生殖補助医療処置の背景でのヒトの生殖に使用されるＥＮＤＯ５０００（シェリングプラウ・ラボラトリー）と他方の獣医学で使用されるコルロン（ＭＳＤラボラトリー）に対して検討した。

Ｓｃｏｂｅｙら［１３］のプロトコルにしたがって、アンドロゲン依存的に発生する精嚢の重量増に関してＬＨまたはｈＣＧの生理活性を定量した。その重量はｈＣＧの活性と比例して変化し、したがってそれにより、単独で、または試験抗体と複合体化されて注射されたホルモンの生物活性を定量および比較することが可能になる。１．５ＩＵのｈＣＧ、または３７℃で２０分間にわたってプレインキュベートされた１．５ＩＵのｈＣＧと２μｇの抗体の混合物の１００μｌを４日間にわたって一日一回皮下注射した２５日齢の若
いラットを使用して前記プロトコルを実施した。５日目にそれらのラットの体重を測定し、その後で殺処理した。それらのラットの精嚢（ＳＶ）を取り出し、解剖し、そしてそれらの重量を量った。様々なバッチを用いて得られた結果を比較し、まとめるために精嚢重量が１００ｇの体重当たりのｍｇとして表されている。各実験において、５匹のラットからなるバッチに対して前記条件の各々を検査した。同じ実験を数回繰り返した。

図１１Ａ、ＢおよびＣは、ｈＣＧであるコルロンとの複合体およびｈＣＧであるＥｎｄｏ５０００との複合体の状態であるＣＦ１２抗体で処置されたラットを用いて得られた結果を示している。図１１Ａは５匹のラットからなる６つのバッチに対して行われたバイオアッセイの代表的結果を示している。ｈＣＧ単独で処置されたバッチと比較した精嚢重量の２２０％の増加を含む非常に有意な増強作用（ｐ＜０．０００１、クラスタル・ウォリス検定）が、ｈＣＧ コルロン／ＣＦ１２複合体を用いて得られた。ｈＣＧ Ｅｎｄｏ５０００／ＣＡ５複合体で処置されたバッチについても１８９％の重量増加を含む有意効果が得られた（ｐ＜０．０００１）。ＣＦ１２抗体単独で処置されたバッチは生理食塩水で処置された対照動物と比較して精嚢重量の変化を示していないことが観察されている。したがって、前記ホルモンに複合体化していないＣＦ１２は標的器官に対して特異的作用を持たない。

ＣＦ１２を用いて行われた様々なバイオアッセイの結果をまとめたものが図１１のヒストグラムＢおよびＣに表されている。前記ホルモン／ＣＦ１２複合体の非常に有意な増強作用（ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定）がｈＣＧであるコルロンとｈＣＧであるＥｎｄｏ５０００を用いて測定され、
−それぞれ３３匹と３６匹という数の動物において、ＳＶの平均重量はｈＣＧであるコルロンで処置されたラットでは２９．３６ｍｇ／１００ｇであったのに対して前記複合体で処置されたラットでは５１．４０ｍｇ／１００ｇ（１７５％の増加）であり（図１１Ｂ）、
−それぞれ１８匹と２０匹という数の動物において、ＳＶの平均重量はｈＣＧであるＥｎｄｏ５０００で処置されたラットでは２５．３５ｍｇ／１００ｇであり、前記複合体で処置されたラットでは５０．５４ｍｇ／１００ｇであった（２０８％の増加）（図１１Ｃ）。

実施例４：雌羊における内在性ゴナドトロピンの生理活性に対する本発明のリガンドの増強作用のインビボ測定
げっ歯類動物（小動物）においてＣＦ１２モノクローナル抗体の増強作用をインビボで実証し、特徴解析した後、多産でより大型の家畜、すなわち雌羊においてＦＳＨの活性に対する各抗体の作用を研究することを目的とした。

このため、処置される雌羊自身のホルモン（内在性ホルモン）に対する前記抗体の増強作用を評価することを目的として全て同じ年齢の思春期のイル・ド・フランス種の雌羊に対して試験を行った。特異性試験によりＣＦ１２抗体のヒツジＦＳＨへの強い結合とヒツジＬＨへのより可変的な結合が示された。この目的のため、抗体だけの注射のみを含む処置がその処置の有効性を評価するために開発された。

雌羊に設定されたそれらのプロトコルでは、したがって前記抗体は単独で注射され、メスのラットでの試験で行われたように外因性のＦＳＨとプレインキュベートされることがなかった。さらに、各抗体はそれ以前にどのような卵巣刺激も受けていない雌羊に、すなわち、ゴナドトロピンを用いる排卵刺激のためのホルモン処理をその抗体の注射の前に受けていない動物に注射された。

抗ＦＳＨ ＣＦ１２抗体の増強作用を発情期のちょうど真ん中（１月）または発情期の
最後（３月末）に行われたプロトコルの間に評価した。それらのプロトコルは全て、プロゲストゲン（４５ｍｇの酢酸フルロゲストン（ＦＧＡ）；ＭＳＤ）を染み込ませた膣内スポンジを１４日間にわたって差し込むことにより排卵周期を予め同期させた雌羊に対して行われた。対照雌羊（生理食塩水バッチ）、ブタＦＳＨ処理で刺激された雌羊（ＦＳＨバッチ）、および抗体だけを用いて刺激された雌羊（抗体バッチ）において排卵応答（排卵回数）および高品質の１つ以上の機能的黄体の樹立（プロゲステロン分泌の程度）を比較することにより増強作用を分析した。

各プロトコルではＬＨの排卵前のピークを検出し、その日付をつけるためにＥＬＩＳＡ法によって血漿中ＬＨアッセイを行った。排卵応答を評価するため、膣内スポンジの撤去から８日後に黄体の数を計数し、且つ、それらの黄体の外観を観察するために麻酔下で腹腔鏡検査法により卵巣の内視鏡観察を行った。

その黄体の機能性と品質を評価するため、前記スポンジの撤去後の１日目から２１日目までの毎日の血液試料を使用して定量的プロゲステロンＥＬＩＳＡアッセイを行った。

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して全ての統計分析を行った。

ＣＦ１２抗体およびそのｓｃＦｖ
排卵の測定パラメーターおよび樹立された黄体の機能的品質の測定パラメーターを使用してＣＦ１２（ＩｇＭ）およびそのｓｃＦｖの増強作用を検討および比較した。注射用量は１ｍｇを２回であった。

発情期において実施されたプロトコルは次の４つのバッチから構成された。
−ＣＦ１２抗体バッチ（ｎ＝７）は前記スポンジの撤去の２４時間前に１ｍｇの抗体の筋肉内注射を受け、そのスポンジが撤去されるときに２回目の１ｍｇの注射を受けた。
−ＣＦ１２ ｓｃＦｖバッチ（ｎ＝５）は前記スポンジの撤去の２４時間前に１ｍｇのｓｃＦｖの筋肉内注射を受け、そのスポンジが撤去されるときに２回目の１ｍｇの注射を受けた。
−「対照」バッチ（ｎ＝９）は前記スポンジの撤去の２４時間前とその撤去時に生理食塩水の筋肉内注射を受けた。
−「ＦＳＨ」バッチ（ｎ＝１１）は前記スポンジの撤去の２４時間前に１００μｇのブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ）の筋肉内注射を受け、そのスポンジの撤去の１２時間前に９０μｇの筋肉内注射を受けた。

前記スポンジの撤去から８日後に卵巣の内視鏡検査を行った。

血漿中プロゲステロンをＥＬＩＳＡアッセイによってアッセイするために前記スポンジの撤去後の１日目から２１日目までの毎日の血液試料を採取した。

排卵応答の分析によって下の表１６に示されている結果が得られた。フィッシャーの正確検定によって統計分析を行った。

対照バッチおよびＦＳＨバッチと比較して、ＣＦ１２バッチおよびＣＦ１２ ｓｃＦｖバッチにおいて得られた結果は単独で注射された前記抗体またはそのｓｃＦｖの排卵応答に対する非常に有意な効果を示している。実際に、血清ΦバッチおよびＦＳＨバッチのそれぞれ４４％および３６％と比較して、２回の１ｍｇの抗体またはｓｃＦｖの注射を受けたメスの１００％（ＣＦ１２については７匹／７匹、およびＣＦ１２ ｓｃＦｖについては５匹／５匹）が排卵した（ｐ＜０．０００１、フィッシャーの正確検定）。バッチの総数についてメス当たり得られた黄体の数は、ＦＳＨバッチおよび血清Φバッチと比較してＣＦ１２ ｓｃＦｖバッチにおいて有意に大きく（ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定）、それぞれ０．９個（ＦＳＨ）および０．６７個（血清Φ）の黄体に対して２．２個の黄体である。ＣＦ１２ ｓｃＦｖバッチとＣＦ１２バッチの間には有意差が無い。

ＬＨピークが現れる平均時間には前記３種類のバッチの間で有意差が無い。それでも、ＬＨピークに到達する時間（およびしたがって排卵の時間）がＦＳＨバッチおよび特に血清Φバッチと比較してわずかに変化する傾向がＣＦ１２バッチおよびＣＦ１２ ｓｃＦｖバッチにおいて観察されている。この仮説ではこのことは前記抗体またはそのｓｃＦｖを受領した雌羊におけるより良好な排卵同期化を示していることになる。

様々なバッチにおける排卵後の黄体期におけるプロゲステロン分泌プロファイルが図１２Ａに示されている。それぞれのバッチについて黄体の数に対してプロゲステロン濃度値（ｎｇ／ｍｌ）を正規化した。その図の各曲線は各バッチのメスにおいて各サンプリングポイントで測定されたプロゲステロン値の平均を表している。ＣＦ１２バッチおよびＣＦ１２ ｓｃＦｖバッチについて得られた分泌曲線は非常に明白にＦＳＨバッチおよび血清Φバッチの上である。得られた結果はＣＦ１２ ｓｃＦｖバッチ、ＣＦ１２バッチ、ＦＳＨバッチおよび血清Φバッチについてそれぞれ前記スポンジの撤去から１０日後に１．４６ｎｇ／ｍｌ、１．４ｎｇ／ｍｌ、１．１ｎｇ／ｍｌおよび０．６ｎｇ／ｍｌの平均プロゲステロン値、および１５日後に１．９３ｎｇ／ｍｌ、１．７８ｎｇ／ｍｌ、１．２２ｎｇ／ｍｌおよび１ｎｇ／ｍｌの平均プロゲステロン値を示している。

対応のあるノンパラメトリックｔ検定（ウィルコクソン検定）によってそれらの４本の曲線の比較を行った。ＣＦ１２バッチおよびＣＦ１２ ｓｃＦｖバッチの曲線は血清Φバッチの曲線と有意に異なっている（ｐ＜０．０１）。同様に、ＦＳＨバッチの曲線は対照バッチの曲線と有意に異なっている（ｐ＜０．００１）。ＣＦ１２およびＣＦ１２ ｓｃ
Ｆｖで処置された雌羊の曲線とＦＳＨで処置された雌羊の曲線との間の差は有意ではなく、したがって傾向を表している。

プロゲステロン分泌曲線間の差を定量するためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア・バージョン５．０を用いて曲線下面積（ＡＵＣ）の分析を行った。結果が図１２Ｂに示されており、それらの結果はＣＦ１２ ｓｃＦｖ曲線のＡＵＣ（１６．９８ユニット）が血清Φ曲線のＡＵＣ（８ユニット）よりも１．５５倍有意に高いことを示している（ｐ＜０．０１、ノンパラメトリックマン・ホイットニーｔ検定）。同様に、ＣＦ１２曲線のＡＵＣ（１６．７８ユニット）と血清Φ曲線のＡＵＣ（８ユニット）は有意に異なっている（ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーノンパラメトリックｔ検定）。他方、ＦＳＨ曲線のＡＵＣ（１０．８２ユニット）と血清Φ曲線のＡＵＣの間に有意差は無く、この実験の環境ではＣＦ１２またはＣＦ１２ ｓｃＦｖを用いる処置がＦＳＨを用いる処置よりも有効であることを示している。

結論として、それらの結果の全てより、ＣＦ１２の一価断片が二価ＣＦ１２抗体と同じ増強作用を有することが示されている。それらの２つのバッチに含まれた雌羊の応答の間には有意差がこれまで観察されなかった。それらの２種類の分子のどちらかを用いる２回の１ｍｇずつの筋肉内注射の形態の処置は、非常に有意なことにＦＳＨを用いる従来の処置よりも
−排卵誘導に対する有効性に関して（１００％の雌羊が排卵し、且つ、総数について雌羊当たり１．３個および０．８個追加の黄体が得られる）、
−黄体期を通してより多くのプロゲステロン分泌を有する樹立された黄体の品質に関して良好な結果を生じた。

それらの結果の全てより、雌羊にインビボで注射されたＣＦ１２増強抗体は動物の内在性性腺刺激ホルモンと複合体化することができ、且つ、動物自身のホルモンの生物活性を増強することができることが示されている。

雌羊におけるＣＦ１２抗体の増強作用は従来のＦＳＨホルモン処理より強い卵巣刺激を誘導することができる。排卵誘導は発情期において１００％であり、且つ、全ての事例において循環プロゲステロン濃度の大幅な増加が黄体期を通して維持される。この追加的作用はプロゲストゲン依存性胚発生不全率および流産のリスクの低下にとって重要である。

ＣＦ１２の一価ｓｃＦｖ断片が雌羊における排卵の誘導についても黄体の品質とプロゲステロン分泌の増加についても完全抗体と同じ増強作用を誘導することが示された。さらに、我々のプロトコルにおけるＣＦ１２ ｓｃＦｖの注射により、処置された雌羊において抗ＣＦ１２ ｓｃＦｖ抗体の分泌が誘導されないことが分かった。したがって、一価断片の将来の使用によってある特定の雌羊において誘導され得る液性免疫応答のリスクが低下する。

実施例５：メスのサルにおけるＦＳＨの生理活性に対する本発明のＣＦ１２リガンドの増強作用のインビボ測定
ラット、メスのラットおよび雌羊においてＣＦ１２モノクローナル抗体の増強作用をインビボで実証し、且つ、特徴解析した後、そのモノクローナル抗体の増強作用をヒトに近い種、すなわちカニクイザル（Macaca fascicularis）において検討した。このため、ヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）に対する前記抗体の増強作用を評価することを目的として少なくとも３６か月齢の思春期のメスのサルに対して試験を行った。

確立されたプロトコルにおいて、前記抗体はｈＦＳＨとの複合体（前記抗体が外因性のＦＳＨとプレインキュベートされた）として注射されるか、またはｈＦＳＨの注射から２
０分後に単独で注射された。

月経期の１日目にメスのサルが１．５ｍｇの持続放出性ＧｎＲＨ調製（デカペプチル（登録商標）ＬＰ、３ｍｇ、ＩＰＳＥＮファーマ）の筋肉内注射を受けた。ＧｎＲＨの注射から１５日後にそれらのメスのサルを様々なプロトコルに従って処置した。プロトコルにつき一匹のメスのサルを処置した。

ｈＦＳＨの最後の注射から３６時間後に１０００ＩＵのｈＣＧ（絨毛性ゴナドトロピンＥｎｄｏ５０００、ＭＳＤ）をそれらの動物に注射した。ｈＣＧの注射から３６時間後に開腹術によって穿刺により卵母細胞を取り出し、それらの卵母細胞の成熟の程度を評価するために顕微鏡下でそれらを観察した。

卵胞成長の誘導（卵胞の表面積とエストラジオール分泌の程度）および良好な品質の黄体の樹立（プロゲステロン分泌の程度）を比較することによって増強作用を分析した。このため、卵胞を計数し、且つ、それらの表面積（ｍｍ^２で表される）を測定するために経腹卵巣超音波検査を４８時間毎に行った。処置の１日目から卵胞穿刺より最大で３０日後まで４８時間毎に採取された血液試料により、定量的エストラジオールＥＬＩＳＡアッセイ（ｐｇ／ｍｌで表される）および定量的プロゲステロンＥＬＩＳＡアッセイ（ｎｇ／ｍｌで表される）を行うことができた。

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して全ての統計分析を行った。

（１）２５ＩＵのｈＦＳＨの注射後に単独で投与されたＣＦ１２リガンドの作用
ＣＦ１２の増強作用を最初にｈＦＳＨについて評価した。このため、１〜３と表示された３つのプロトコルを実施した。
（１）２５ＩＵのｈＦＳＨの単回注射で処置される動物：処置の１日目における２５ＩＵのヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）プレフィルドペン、メルクセローノ）の皮下注射（「ｈＦＳＨ ２５ＩＵ Ｘ１」）、
（２）ＣＦ１２＋ｈＦＳＨで処置される動物：処置の１日目と５日目に２５ＩＵのヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）プレフィルドペン、メルクセローノ）の２０分間にわたる注射から２０分後にＣＦ１２抗体（４００μｇ）の皮下注射を行った（「ｈＦＳＨ ２５ＩＵ＋ＣＦ１２ Ｘ２」）、
（３）８日間にわたって２５ＩＵのｈＦＳＨで処置される動物：８日間にわたる２５ＩＵのヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）プレフィルドペン、メルクセローノ）の毎日の皮下注射（「ｈＦＳＨ ２５ＩＵ Ｘ８」）。

卵胞成長の誘導（卵胞の表面積）を超音波検査により測定することによってそれらの３種類の処置の効果をモニターした。処置開始から９日後（９日目）に得られた結果が図１３Ａに示されている。それらの結果は、２５ＩＵのｈＦＳＨの単回注射で処置されたメスのサルがＦＳＨ処置の開始から９日目において被刺激卵胞を示さなかった（曲線下面積がゼロ）ことを示している。逆に、処置の１日目と５日目に４００μｇのＣＦ１２＋２５ＩＵのｈＦＳＨの混合物で二回処置されたメスのサルは２８ｍｍ^２という被刺激卵胞の総面積を示した。８回のｈＦＳＨの注射を受けたメスのサルでは被刺激卵胞の総面積は３５ｍｍ^２であった。

処置開始から１１日後（１１日目）に得られた結果が図１３Ｂに示されている。それらの結果は、ＣＦ１２＋ｈＦＳＨで二回処置されたメスのサルが６個の被刺激卵胞で２９ｍｍ^２という卵胞総面積を示したことを示している。対照的に、８回のｈＦＳＨの注射を受けたメスのサルにおいて測定された卵胞の面積は１１個の被刺激卵胞で２２．６ｍｍ^２で
あった。したがって、４００μｇのＣＦ１２＋２５ＩＵのｈＦＳＨの２回の注射によって２５ＩＵのｈＦＳＨの８回の注射よりも良好な卵胞の成長が誘導され、それぞれ４．８３ｍｍ^２／卵胞に対して２．０５ｍｍ^２／卵胞であった。卵胞の成長に対するその複合体の効果は、被刺激卵胞の面積の減少が顕著であるＦＳＨの８回の注射を含む処置と対照的に１１日目まで一定であった。この結果は、循環ＦＳＨが内在性のものであるか、または外因性のものであるかに関係なく、メスのサルにおけるその循環ＦＳＨに対するＣＦ１２のインビボでの増強作用を示している。実際には、ＦＳＨの半減期は１時間未満なので、処置の１日目と５日目にＣＦ１２が２５ＩＵのｈＦＳＨと共に注射されたときに観察された効果は共注射されたＦＳＨの効果だけによるものとすることができず、前記メスのサルの内在性ＦＳＨの効果も反映している。

（２）３７．５ＩＵのｈＦＳＨの注射後に単独で投与されたＣＦ１２リガンドの作用
次に３７．５ＩＵのｈＦＳＨの注射後に後から単独で注射されたＣＦ１２の増強作用を検討した。このため、ＧｎＲＨの注射から１５日後に１から４と表示された４つのプロトコルに着手した。プロトコルにつき１匹のメスのサルを処置した。
（１）１２日間にわたって３７．５ＩＵのｈＦＳＨで処置される動物：１２日間にわたる３７．５ＩＵのヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）プレフィルドペン、メルクセローノ）の毎日の皮下注射（「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２」）、
（２）毎日３７．５ＩＵのｈＦＳＨで処置され、且つ、２日毎に４００μｇのＣＦ１２で処置される動物：１２日間の３７．５ＩＵのヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）プレフィルドペン、メルクセローノ）の毎日の皮下注射とｈＦＳＨの注射から２０分後における４００μｇの用量のＣＦ１２抗体の２日毎の注射（「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２＋４００μｇ ＣＦ１２ Ｘ６」）、
（３）毎日３７．５ＩＵのＦＳＨで処置され、且つ、２日毎に７０μｇのＣＦ１２で処置される動物：１２日間の３７．５ＩＵのヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）プレフィルドペン、メルクセローノ）の毎日の皮下注射とｈＦＳＨの注射から２０分後における７０μｇの用量のＣＦ１２抗体の２日毎の注射（「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２＋７０μｇ ＣＦ１２ Ｘ６」）、
（４）８日間にわたって７５ＩＵのＦＳＨで処置される動物：８日間にわたる７５ＩＵのヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）プレフィルドペン、メルクセローノ）の毎日の皮下注射（「ｈＦＳＨ ７５ＩＵ Ｘ８」）。

卵胞成長の誘導（ｍｍ^２単位の卵胞の表面積）を超音波検査により測定することによってそれらの４種類の処置の効果をモニターした。図１４は卵胞穿刺の日（１５日目）に各処置の後に得られた被刺激卵胞の表面積を表している。卵胞刺激の強度は処置に応じて変化する。その刺激の強度は「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２＋７０μｇ ＣＦ１２ Ｘ６」処置を受けたメスのサルにおいて最大であり、且つ、非常に大きなものであり、それらのサルについて３８７．５ｍｍ^２という表面積が測定された。それはメスの対照サル「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２」において測定された１１２．３ｍｍ^２であった表面積よりも３．５倍大きく、且つ、「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２＋４００μｇ ＣＦ１２ Ｘ６」で処置されたメスのサルにおいて得られた１２４．２ｍｍ^２という表面積よりも３．２倍大きい。最小の面積（８７．２ｍｍ^２）の卵胞が７５ＩＵのｈＦＳＨで８日間にわたって処置されたメスのサルにおいて得られた。

穿刺日に得られた卵胞の総数は「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２＋４００μｇ ＣＦ１２ Ｘ６」と「ｈＦＳＨ ７５ＩＵ Ｘ８」については７であり、「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２」と「３７．５ＩＵ Ｘ１２＋７０μｇ ＣＦ１２ Ｘ６」については１０である（表１７）。

最大の卵胞のサイズは処置間でかなり変化することが強調されるべきである。こうして、直径が７ｍｍよりも大きい５個の卵胞（最大のものは９．１５ｍｍの直径を有する）の形成が「３７．５ＩＵ Ｘ１２＋７０μｇ ＣＦ１２ Ｘ６」処置によって誘導され、一方で他の全ての処置は７ｍｍ未満の卵胞しか誘導しなかった。

穿刺により採取された卵母細胞の数は「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２＋４００μｇ
ＣＦ１２ Ｘ６」と「ｈＦＳＨ ７５ＩＵ Ｘ８」については１１個の卵母細胞であり、ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２については８個の卵母細胞であった。ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２＋７０μｇ ＣＦ１２ Ｘ６で処置されたメスのサルは、穿刺の日の前に自然に排卵が起きたことを示す若い黄体を卵巣に示した。

これらの結果は、ＦＳＨ単独によって誘導される卵胞成長よりもずっと大きな卵胞成長を引き起こし、且つ、高度に刺激され、前進した排卵応答を引き起こす、７０μｇの用量で投与されたＣＦ１２の非常に大きな増強作用を示している。「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ
Ｘ１２＋４００μｇ ＣＦ１２ Ｘ６」処置と「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２＋７０μｇ ＣＦ１２ Ｘ６」処置との間で観察された応答の差も、ＣＦ１２が及ぼす増強作用が用量依存的であり、７０μｇの用量が卵巣に対して最も強い刺激を誘導することを示している。

処置の１日目から卵胞穿刺より最大で３０日後まで４８時間毎にエストラジオールとプロゲステロンの分泌を測定することによっても前記４つの処置の効果を分析および比較した。

結果が図１５に示されており、各処置が前記周期を通して各メスザルについて得られたエストラジオールとプロゲステロンの分泌プロファイルを示すグラフ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）によって示されている。

３７．５ＩＵのｈＦＳＨ単独で（図１５Ａ）、または４００μｇ（図１５Ｂ）および７０μｇ（図１５Ｃ）のＣＦ１２の処置と組み合わせて処置されたメスのサルが相互に有意に異なるエストラジオール分泌プロファイルを示している（^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置ＡＮＯＶＡ）。９日目では濃度はそれぞれ１５７ｐｇ／ｍｌ、３２３ｐｇ／ｍｌおよび２２０ｐｇ／ｍｌであり、ＣＦ１２を組み合わせる処置でより良好なエストロゲン応答を示している。卵胞穿刺の２日前である１３日目ではエストラジオール濃度はそれぞれ７０ｐｇ／ｍｌ（図１５Ａ）、２００ｐｇ／ｍｌ（図１５Ｂ）および１９５０ｐｇ／ｍｌ（図１５Ｃ）である。対照的に、卵胞穿刺の２日前にｈＦＳＨ ７５ＩＵ Ｘ８で処置されたメスのサル（図１５Ｄ）では濃度は３９５ｎｇ／ｍｌである。これらの結果は、エストラジオールピークが、ＦＳＨだけを用いる対照処置と比較して４００μｇの用量のＣＦ１２については３倍増加し、７０μｇの用量のＣＦ１２については２８倍増加することになる、エストロゲン応答に対するＣＦ１２の非常に大きな増強作用を示している。「ｈＦＳＨ ３７．５ＩＵ Ｘ１２＋７０μｇ ＣＦ１２ Ｘ６」の場合に１３日目に観察された大きなエストラジオールピークは卵胞穿刺の前に起きた早期排卵の誘導を説明し得る。

良好な品質の黄体の樹立を反映するプロゲステロン分泌プロファイルを測定した。図１５Ａ、図１５Ｂおよび図１５Ｃの比較から、ＦＳＨ単独で処置されたメスのサルと比較したＣＦ１２とＦＳＨで処置されたメスのサルにおけるプロゲステロンレベルの用量依存的増加が非常に明確に示されている。したがって、卵胞穿刺から４日後である１９日目においてプロゲステロン濃度はＦＳＨ単独については２．４ｎｇ／ｍｌであり（図１５Ａ）、４００μｇのＣＦ１２については１４．５ｎｇ／ｍｌ（６倍）であり（図１５Ｂ）、７０μｇのＣＦ１２については３７ｎｇ／ｍｌ（１５倍）に達する（図１５Ｃ）。対照的に、７５ＩＵのＦＳＨ単独で８回処置されたメスのサルにおける卵胞穿刺から４日後に測定されたプロゲステロンレベルは１．５ｎｇ／ｍｌであり（図１５Ｄ）、３７．５ＩＵで１２回の処置と統計的に異ならない。逆に、４００μｇと７０μｇのＣＦ１２での処置によってＦＳＨ単独での処置と統計的に異なるプロゲステロンレベルが誘導されている（^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置ＡＮＯＶＡ）。

これらの結果は、ＣＦ１２を受領したメスのサルにおける黄体のより良好な品質を反映する血中プロゲステロンレベルに対するその抗体の増強作用を非常に明確に示している。子宮内膜の形成、胚の着床、および胚の初期発生におけるプロゲステロンの重要な役割のため、前記抗体は動物種において、且つ、女性における適用にとって重要な存在となっている。

ＦＳＨの非常に短い半減期（１時間未満）を考慮すると、（２５または３７．５ＩＵのｈＦＳＨを用いた）結果の全てによって、循環ＦＳＨが内在性のものでも、または外因性のものでも、ＣＦ１２抗体はその循環ＦＳＨに対して増強作用をインビボで及ぼすことができることが確認されている。７０μｇの抗体で処置されたメスのサルにおいて観察された非常に大きな効果は、実際は前記メスのサルの内在性ホルモンに対する前期抗体の「長期」作用と関連している。

これらの結果より、人工受精の状況下で単排卵を誘導するためであれ、または体外受精（ＩＶＦ）の状況下で多排卵を誘導するためであれ、適切な投与量を規定することによりヒトにおいて臨床的に、特にＡＲＴ治療において排卵を誘導するための新規治療法を確立する手掛かりがＣＦ１２抗体によって与えられる可能性があることも示されている。

実施例６：本発明のＣＦ１２リガンドが認識するエピトープの予測、およびそのパラトープの予測
ＣＦ１２抗体のエピトープが、天然型立体構造と非天然型立体構造を区別することを可能にするボロノイ図と様々なスコア関数進化的学習法による最適化を用いるタンパク質構造モデリングに基づくプロテインドッキングアルゴリズム(Bernauer et al., Bioinformatics 2007, 5:555, [14]; Bernauer et al., Bioinformatics 2008, 24:652, [15]; Bourquard et al., PLoS One 2011, 6:e18541, [16] および Bourquard et al., Sci. Reports 2015, 5:10760 [17])を用いて様々な種の性腺刺激ホルモンに対して決定された。

各抗体がヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）、ヒトＬＨ（ｈＬＨ）、ヒトＣＧ（ｈＣＧ）、ヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）およびヒツジＬＨ（ｏＬＨ）、ブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ）およびブタＬＨ（ｐＬＨ）とドッキングされた。ｈＦＳＨおよびｈＣＧの結晶構造がそれぞれ４ＭＱＷおよび１ＱＦＷとしてプロテインデータバンク（ＰＤＢ）において入手可能である。ヒトＦＳＨ受容体の細胞外ドメインと複合体化されたヒトＦＳＨの構造 (Fan and Hendrickson, Nature 2005, 433:269) ［１８］が使用された。他のホルモン（ｈＬＨ、ｏＦＳＨ、ｏＬＨ、ｐＦＳＨおよびｐＬＨ）については相同モデルを作製し、そしてドッキングのために使用した。

ＣＦ１２抗体の３Ｄ構造は入手できないのでＣＦ１２の一価ＶＨ断片と一価ＶＬ断片の配列を使用して検討を行った。このために可変部分の相同モデルを作製した。ＶＨモデルとＶＬモデルを異なる構造から別々に作製し、ＶＨモデリングを支援するものとして働いたその構造からそれらのモデルの配向を決定した。相同モデルとして使用される構造であるＣＦ１２のＶＨ用の１ＰＬＶとＣＦ１２のＶＬ用の３ＴＴ１はプロテインデータバンク（ＰＤＢ）において入手可能である。

そのドッキングの結果が図１６に示されている。ＣＦ１２リガンドは前記の７種類の標的ホルモンに同様にドッキングするようである。そのエピトープは検討されたゴナドトロピンのαサブユニットとβサブユニット上に断続的に局在する幾つかの領域によって規定されている。そのエピトープにはヒトＦＳＨ受容体のエクトドメインのＨｉｓ７−Ｃｙｓ８−Ｓｅｒ９−Ａｓｎ１０配列も含まれている。したがって、ＣＦ１２リガンドのそのエピトープは非常に立体構造的である。すなわち、そのエピトープは前記ホルモンのαサブユニットとβサブユニットの幾つかの領域と前記受容体の配列の両方から構成されている。これらの断続的な領域の全てが前記ホルモンとそのホルモンの活性化型受容体の天然の立体構造において空間的に近傍にある。

ＣＦ１２リガンドとの接触面に含まれる前記ホルモンと前記受容体の様々な残基が図１６中の長方形によって囲まれている。ｈＦＳＨのαサブユニット上の斜線部分によって表示されている２つの残基は主要な相互作用に関与し、したがって抗体／抗原認識に主要な役割を有する。すなわち、これらの残基はｈＦＳＨのαサブユニットの位置９のグルタミン酸（Ｇｌｕ９）と位置３３のフェニルアラニン（Ｐｈｅ３３）である。これらの２つの残基は他の標的ホルモンの配列において同一であり、認識される。前記接触面に含まれるαサブユニットの他の残基の中ではＧｌｕ９をはじめとする９つの残基を含む領域が留意されている。その領域はＧｌｎ５−Ａｓｐ６−Ｃｙｓ７−Ｐｒｏ８−Ｇｌｕ９−Ｃｙｓ１０−Ｔｈｒ１１−Ｌｅｕ１２−Ｇｌｎ１３モチーフである。

前記天然ホルモンにおいて空間的に近傍にある位置３５のアルギニン残基（Ａｒｇ３５）と位置５６のグルタミン酸残基（Ｇｌｕ５６）の存在も前記エピトープにおいて留意されている。これらの２つの残基によってβサブユニットのＣ末端が固定され、そうして「シートベルト」がαサブユニットの周りに固定される。これらの２つの残基は全ての標的ホルモンにおいて常に存在し、且つ、認識される。それらの残基は前記ホルモンの安定性と生理活性に重要な役割を果たす。この機構により、これらの残基に前記抗体が結合することでＦＳＨ二量体の安定性を高めることが可能になる。

ＣＦ１２リガンドは前記シートベルトを構成するβサブユニットのＣ末端の残基１００〜１０２および残基１０８〜１０９も認識する。このシートベルトの役割は前記ホルモンのα／β二量体の結合を安定化することであるので、これらの２つの残基へのＣＦ１２リガンドの結合はシートベルトを確実に締めることに役立ち、そうして前記ホルモンの生理活性に必須である前記二量体のより良好な安定性をもたらすとも考えられている。

ＣＦ１２リガンドのエピトープの別の特徴はＣＦ１２によって認識される接触面にヒトＦＳＨ受容体のＮ末端領域の残基７〜１０（Ｈｉｓ７−Ｃｙｓ８−Ｓｅｒ９−Ａｓｎ１０）が含まれることである。ＣＦ１２リガンドの結合は、前記ホルモンの受容体上でのそのホルモンの相互作用をこの機構を介して促進し、それによって「増強」作用を確立することに役立つとも考えられている。

表１８はＣＦ１２リガンドのパラトープの様々な領域を提示している。使用されている付番は配列番号２および配列番号４の配列の付番である。

２本のＶＨ鎖とＶＬ鎖がそれらの３か所のＣＤＲとそれらのフレームワークの幾つかの残基を介して前記ホルモンの認識に関与している。

主な相互作用について、ｈＦＳＨのαサブユニットのＧｌｕ９残基はＶＨ鎖のＣＤＲ３のＴｙｒ１０２残基とＡｓｐ１０４残基およびＶＬ鎖のＬｅｕ５０残基によってそれぞれ認識される。そのαサブユニットのＰｈｅ３３残基はＶＨ鎖のＣＤＲ１のＳｅｒ３１残基とＴｙｒ３３残基およびＶＨ鎖のＣＤＲ２のＴｙｒ５２残基によって認識される。

表１８：ＣＦ１２リガンドのエピトープを構成する様々な領域とそのリガンドのパラトープを構成する様々な領域。主な相互作用に関与する残基が斜線によって示されている。

αサブユニットのＡｒｇ３５残基とＧｌｕ５６残基に対する相互作用にはＶＨ鎖の幾つかの残基が関与する。ＣＤＲ１のＳｅｒ３０残基とＣＤＲ２のＴｙｒ５２残基およびＧｌｙ５４−Ｔｈｒ５５残基がＡｒｇ３５と相互作用する。ＣＤＲ２のＴｙｒ５２残基はαサブユニットのＧｌｕ５６とも相互作用する。

β鎖（シートベルト）のＣ末端に対する相互作用にはＶＨ鎖の幾つかの残基、すなわちＣＤＲ１のＳｅｒ３０残基、ＣＤＲ２のＧｌｙ５４残基およびフレームワーク３のＡｓｐ７３−Ｔｈｒ７４−Ｓｅｒ７５残基が関与する。

そのＶＨ鎖だけがＦＳＨ受容体のエクトドメインの認識にも関与し、特に位置２６のグリシン（Ｇｌｙ２６）を含むその鎖のＣＤＲ１、およびフレームワーク１のある特定の残基（Ｇｌｎ１−Ｇｌｙ２−Ｇｌｎ３、Ｌｙｓ２３−Ｔｈｒ２４−Ｓｅｒ２５）、およびフレームワーク３のある特定の残基（Ｓｅｒ７５）が関与する。

結論として、ＣＦ１２リガンドは、ｈＦＳＨのαサブユニット、βサブユニットおよび特にシートベルトを形成するそのサブユニットのＣ末端に関係し、且つ、ＦＳＨ受容体のエクトドメインにも関係する高度の立体構造エピトープを認識することを特徴とする。ＶＨ鎖は基本的に前記受容体との相互作用に関与し、ＶＬ鎖は前記ホルモンとの相互作用に関与する。このエピトープによってＣＦ１２リガンドは一方で前記ホルモン二量体の結合を安定化することができ、他方で前記ホルモンのその受容体への結合を安定化することができる。これらの２つの機構は前記ホルモンの受容体上でのそのホルモンのより良好な相互作用の形成について相補的であり、且つ、ゴナドトロピンに対するＣＦ１２リガンドの増強作用の基礎を構成する可能性がある。

実施例７：本発明のＣＦ１２リガンドの様々な断片の構築、作製、および特性解析
ヒツジＦＳＨおよびヒトＦＳＨの生物活性を増強する能力を評価するためにＣＦ１２抗体の様々な断片を構築した。「ＣＦ１２ ＶＬ」と呼ばれる軽可変鎖だけを含む断片、「ＣＦ１２ ＶＨ」と呼ばれる重可変鎖だけを含む断片、および本発明の実施例１第４段落に記載されている基準のＣＦ１２ ｓｃＦｖのＶＨ−ＶＬ配列（配列番号１０および配列番号１１）と比較して逆のＶＬ−ＶＨ順で構築された「リバースＣＦ１２ ｓｃＦｖ」を作製した。

（１）抗体断片の構築と作製
ＣＦ１２抗体から得られたＣＦ１２ ＶＬ断片とリバースＣＦ１２ ｓｃＦｖ断片をコードする合成遺伝子がＡＴＧ：バイオシンセティクスＧｍｂＨ（ドイツ）によって合成された。リバースＣＦ１２ ｓｃＦｖはＣＦ１２ ｓｃＦｖのＣＦ１２ ＶＬ−リンカー−ＣＦ１２ ｓｃＦｖのＣＦ１２ ＶＨという融合体から構成される。各合成遺伝子はｐＳＷ１プラスミド［７］の配列を融合することにより設計されており、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＰｅｌＢタンパク質をコードする配列の末端との間に含まれ、そして合成予定の目的のタンパク質の配列（配列番号２７および配列番号３１）の横にＸｈｏＩ制限部位が付加される。それらの配列はｐＳＷ１プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に挿入されている。大腸菌での発現向けにコドンを最適化した。

ｐＳＷ１ＣＦ１２ ＶＨ発現プラスミドは、ｐＳＷ１リバースＣＦ１２ ｓｃＦｖプラスミドの次の酵素による消化から生じた断片のｐＳＷ１プラスミド［７］ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位への挿入により得られた。

それらの構築物の品質のシーケンシングによる検証の後、ｐＳＷ１−ＣＦ１２ ＶＬプラスミド、ｐＳＷ１−ＣＦ１２ ＶＨプラスミドおよびｐＳＷ１リバースＣＦ１２ ｓｃＦｖプラスミドを使用して、コンピテントセルになった［８］ＨＢ２１５１細菌（Ｔ５３０４０、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）のヒートショックによる形質転換を行った。

本発明の実施例１において先に記載された方法に従って断片の作製を行った。

（２）ＦＳＨの生理活性に対するＣＦ１２ ＶＬ断片、ＣＦ１２ ＶＨ断片およびリバースＣＦ１２ ｓｃＦｖ断片の作用のインビトロ測定
本発明の実施例２において先に記載されたプロトコルに従い、ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）システムが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株を用いてヒトＦＳＨの生理活性に対する「ＣＦ１２ ＶＬ」断片、「ＣＦ１２ ＶＨ」断片および「リバースＣＦ１２ ｓｃＦｖ」断片のインビトロ作用を検討した。単独の、または混合物としての「ＣＦ１２ ＶＬ」断片および「ＣＦ１２ ＶＨ」断片をそれぞれ４０ｎＭで検査した。リバースＣＦ１２ ｓｃＦｖをちょうど基準ＣＦ１２ ｓｃＦｖのように８０ｎＭの濃度で検査した。ヒトＦＳＨを０．１ｎＭで検査した。

図１７は、０．１ｎＭのヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）が単独で、または様々なＣＦ１２断片と複合体化されて存在する中で得られた、時間（分）の関数として相対発光単位で表されるｃＡＭＰ産生カイネティクス曲線を示している。４つの条件、すなわちｈＦＳＨ＋ＣＦ１２ ＶＬ複合体（図１７Ａ）、ｈＦＳＨ＋ＣＦ１２ ＶＨ複合体（図１７Ｂ）、ｈＦＳＨ＋リバースＣＦ１２ ｓｃＦｖ複合体（図１７Ｃ）、および４０ｎＭのＣＦ１２ ＶＬと４０ｎＭのＣＦ１２ ＶＨからなる等モルの混合物とｈＦＳＨの複合体（図１７Ｄ）をｈＦＳＨ単独の条件と比較した。発光応答のレベルを刺激から４０分の時点で比較する。

０．１ｎＭのｈＦＳＨと複合体化された４０ｎＭの濃度の「ＣＦ１２ ＶＬ」断片が非常に有意な増強作用（ｐ＜０．００１）を及ぼし、その作用はｈＦＳＨ単独による刺激と比較して、ＣＦ１２ ｓｃＦｖ（１８０％の増加）に匹敵するように、細胞応答を２１８％増加させる（図１７Ａ）ことが観察されている。０．１ｎＭのｈＦＳＨと複合体化された４０ｎＭの濃度の「ＣＦ１２ ＶＨ」断片は非常に有意な増強作用（ｐ＜０．００１）を及ぼし、その作用はｈＦＳＨ単独による刺激と比較して、ＣＦ１２ ｓｃＦｖ（１８０％の増加）よりも大幅に、細胞応答を２５０％増加させる（図１７Ｂ）。

リバースＣＦ１２ ｓｃＦｖ（図１７Ｃ）は基準ＣＦ１２ ｓｃＦｖと同様にＦＳＨの作用を増強し、両方ともＦＳＨに対する応答と比較して１８０％の発光シグナルの増加を提示しており、この作用は有意である（ｐ＜０．００１）。

最後に、ｈＦＳＨと複合体化されたＣＦ１２ ＶＨとＣＦ１２ ＶＬの２種類の断片の混合物（図１７Ｄ）は２７８％という有意な細胞応答の増加（ｐ＜０．００１）を誘導し、その増加は基準ＣＦ１２ ｓｃＦｖ（１８０％の増加）よりも大きい。

これらの結果の全てから、単離されたＶＬ断片またはＶＨ断片がＦＳＨの生理活性に対して増強作用を及ぼすことができることが示されている。これに関し、それらの２本の可変鎖のＦＳＨ／受容体複合体上での相互作用への関与を示す本発明の実施例６に記載されている相互作用モデルの予測が検証されている。そのＶＬとＶＨの２つの断片の混合物はこのアッセイにおいて最も大きな増強作用を及ぼしている。

（３）メスのラットにおけるＦＳＨの生理活性に対するＣＦ１２ ＶＬ断片、ＣＦ１２
ＶＨ断片およびリバースＣＦ１２ ｓｃＦｖ断片の増強作用のインビボ測定
インビトロで特徴解析された後、ｈＦＳＨの生理活性に対する様々なＣＦ１２断片の増強作用がメスのラットにおいてインビボで検討された。

ＦＳＨの生理活性を測定するため、使用したプロトコルは本発明の実施例において記載されたＳｔｅｅｌｍａｎとＰｏｈｌｅｙの生物学的アッセイ (Steelman SL, Pohley FM. Endocrinology, 53:604-616. 1953) ［１２］のプロトコルであった。各バッチは５匹のメスのラットから構成された。

結果が図１８に示されている。リバースＣＦ１２ ｓｃＦｖと複合体化されたｈＦＳＨで処置されたバッチは、基準ｈＦＳＨ／ＣＦ１２ ｓｃＦｖ複合体で処置されたバッチの（１６０±５ｍｇ）を有する１００ｇ当たりの卵巣平均重量よりもわずかに多い１００ｇの体重当たり１９５±１５ｍｇという卵巣平均重量、すなわちホルモン処置のみを受けたバッチと比較した１７５％の増加（ｐ＜０．０１）を生じた。ｈＦＳＨと複合体化されたＣＦ１２ ＶＬ断片およびＣＦ１２ ＶＨ断片で処置されたバッチはそれぞれ１８６±２４ｍｇおよび２３７±１５ｍｇという卵巣平均重量、すなわちホルモン処置のみを受けたバッチと比較した１６７％および２１３％の増加（ｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１）を有した。

これらの結果は、ｈＦＳＨと複合体化されるｓｃＦｖの構築の順序（ＶＬ−ＶＨ対ＶＨ−ＶＬ）がＦＳＨの生理活性に対するそのｓｃＦｖの増強特性に影響しないことを示している。それらの結果は、ＣＦ１２の可変鎖、特にＶＬ断片が前記ホルモンの生理活性をインビボおよびインビトロで増強することができることも非常に顕著に示している。このことは、本発明の実施例７に記載されている相互作用モデルによって予測されるように、それらの２本の鎖のこの作用へのそれぞれの関与を反映している。

参照文献のリスト
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2- International application WO 2012/066519
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15- Bernauer et al., Bioinformatics, 24: 652, 2008
16- Bourquard et al., PLoS One, 6:e18541, 2011
17- Bourquard et al., Sci. Reports, 5:10760, 2015
18- Fan and Hendrickson, Nature, 433: 269, 2005.

Claims (14)

1. ＦＳＨの生理活性、黄体形成ホルモン（ＬＨ）の生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）リガンドであって、前記リガンドが抗体または抗体断片であり、
   重鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含み、
   ‐配列ＧＦＴＦＳＳＳＹ（配列番号５）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ１、
   ‐配列ＩＹＡＧＴＧＧＴ（配列番号６）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ２、
   ‐配列ＡＲＨＧＳＹＦＤＹ（配列番号７）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ３、且つ
   軽鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含む
   ‐配列ＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹ（配列番号８）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ１、
   ‐配列ＡＡＳによって規定されるＶＬ−ＣＤＲ２、
   ‐配列ＱＱＳＮＥＤＰＹＴ（配列番号９）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ３
   ことを特徴とする前記リガンド。
2. ＦＳＨの生理活性、黄体形成ホルモン（ＬＨ）の生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）リガンドであって、前記リガンドが抗体または抗体断片であり、
   重鎖可変ドメインが配列番号２または３０の配列を含み、および／または、
   軽鎖可変ドメインが配列番号４または２８の配列を含むことを特徴とする前記リガンド。
3. 前記リガンドがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ナノボディ（登録商標）、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のリガンド。
4. 前記リガンドがＣＮＣＭ Ｉ−４８０３ハイブリドーマにより産生されるＣＦ１２モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１に記載のリガンド。
5. 前記ｓｃＦｖのペプチド配列が配列番号１１の配列であることを特徴とする、請求項３に記載のリガンド。
6. 請求項１から５の何れか一項に記載のリガンドとＦＳＨとの複合体、
   請求項１から５の何れか一項に記載のリガンドとＬＨまたは絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）ホルモンとの複合体
   から選択されるリガンド−ゴナドトロピン複合体。
7. 請求項１から５の何れか一項に記載のリガンドを含む医薬品。
8. 請求項６に記載の複合体を含む医薬品。
9. メスの哺乳類動物において排卵または多排卵を誘導するための、請求項７または８に記載の医薬品。
10. メスの哺乳類動物において循環内在性プロゲステロンレベルを上昇させるための、請求項７から９の何れか一項に記載の医薬品。
11. メスの哺乳類動物において排卵または多排卵を誘導するための医薬組成物であって、請求項１から５の何れか一項に記載のリガンドおよび／または請求項６に記載の複合体および薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする前記医薬組成物。
12. ＦＳＨ、ＬＨおよび／またはＣＧをさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 哺乳類動物の不妊性または低受胎性の治療および／または予防のための、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
14. メスの哺乳類動物における生殖を刺激するための請求項１１から１３の何れか一項に記載の医薬組成物。
    
    

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