ES2845674T3 - Ligandos que potencian la bioactividad de las gonadotrofinas - Google Patents

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Abstract

Ligando de la hormona foliculoestimulante (FSH) que potencia la bioactividad de la FSH, de la hormona luteinizante (LH) y de la gonadotropina coriónica (CG), caracterizado por que dicho ligando es un anticuerpo o un fragmento del mismo y por que: el dominio variable de la cadena pesada contiene las siguientes CDR: - VH-CDR1, definida por la secuencia GFTFSSSY (SEQ ID NO: 5); - VH-CDR2, definida por la secuencia IYAGTGGT (SEQ ID NO: 6); - VH-CDR3, definida por la secuencia ARHGSYFDY (SEQ ID NO: 7); y el dominio variable de la cadena ligera contiene las siguientes CDR: - VL-CDR1, definida por la secuencia QSVDYDGDSY (SEQ ID NO: 8); - VL-CDR2, definida por la secuencia AAS; - VL-CDR3, definida por la secuencia QQSNEDPYT (SEQ ID NO: 9).

Description

DESCRIPCIÓN
Ligandos que potencian la bioactividad de las gonadotrofinas
Campo técnico
La presente invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra la hormona foliculoestimulante (FSH) capaces de potenciar la bioactividad de las gonadotrofinas.
La presente invención encuentra sus aplicaciones principalmente en medicina humana y veterinaria, para inducir la ovulación en un mamífero hembra.
En la descripción a continuación, las referencias entre corchetes ([ ]) se refieren al listado de referencias presentado al final del texto.
Estado de la técnica
Las gonadotrofinas (o gonadotropinas) son hormonas glicoproteicas complejas que desempeñan un papel fundamental en la regulación de la reproducción en vertebrados al actuar en las funciones de las gónadas (ovarios y testículos). Dos de estas hormonas se secretan en todos los vertebrados: la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculoestimulante (FSH). En dos grupos de mamíferos, equinos y primates, existe además una gonadotrofina coriónica (CG) secretada por la placenta: la coriogonadotropina humana (hCG) y la coriogonadotropina equina (eCG) que actúan a través de los receptores de LH.
La hormona luteinizante (LH) es producida por células gonadotrópicas del lóbulo anterior de la glándula pituitaria bajo estimulación de GnRH, producida por el hipotálamo. La LH estimula la producción de testosterona en individuos macho, mientras que interviene en las modificaciones del ciclo ovárico en las mujeres, donde es responsable del crecimiento folicular terminal y de la ovulación después de la transformación del folículo ovulatorio roto en el cuerpo lúteo. Durante la fase lútea del ciclo menstrual, la LH estimula la secreción de progesterona por el cuerpo lúteo, indispensable para desarrollo precoz e implantación del embrión. La LH consiste en una subunidad a común a todas las hormonas glicoproteicas de una misma especie (como la FSH, CG y hormona estimulante tiroidea, TSH) y una subunidad p responsable de la especificidad de la actividad hormonal; actividad que existe solo si las dos subunidades están asociadas de manera no covalente en forma de dímero.
La hormona foliculoestimulante (o FSH) es producida por la glándula pituitaria anterior bajo estimulación de GnRH producida por el hipotálamo. En individuos macho, estimula las células de Sertoli indispensables para la espermatogénesis. En individuos hembra, es responsable del reclutamiento de los folículos primordiales, inmaduros, su crecimiento y diferenciación en folículos preovulatorios estimulando los receptores de FSH de las células de la granulosa. La FSH consiste en dos subunidades a y p, y tiene una estructura similar a la de LH. Solo el dímero es capaz de estimular los receptores de FSH.
En individuos hembra, los niveles de LH y FSH son cíclicos: muy bajos durante el periodo de descanso sexual o fuera del periodo ovulatorio, con un pico de secreción en el periodo preovulatorio.
Las gonadotrofinas se usan en medicina veterinaria y humana, para inducir la ovulación en mamíferos hembra. Aunque son eficaces, estos tratamientos presentan un riesgo para la salud debido al uso de hormonas extraídas de fluidos biológicos (sangre, orina) o tejido (pituitaria), particularmente en el campo veterinario. Este es el caso de la gonadotropina coriónica equina (eCG) extraída de la sangre de yeguas preñadas, y de la LH y FSH porcinas extraídas de las glándulas pituitarias de cerdo. En el campo veterinario, también se usa una hCG extraída de la orina de mujeres embarazadas, Chorulon® (Laboratorio MSD).
En el campo de la clínica humana, y particularmente de la Procreación Médicamente Asistida (o PMA), se usan hormonas extraídas de la orina de mujeres menopáusicas como Fostimon® (Laboratorio Genévrier) que es una FSH purificada y Menopur® (Laboratorio Ferring Pharmaceuticals) que es una hMG (gonadotropina menopáusica humana), mezcla de FSH y de LH y de la Gonadotropina Coriónica Endo5000 que es una hCG purificada (Laboratorio Schering-Plough). También se usan FSH humanas recombinantes, como Gonal-F® (Laboratorio Merck Serono) y Puregon® (Laboratorio Merck Shering-Plough); hCG y LH recombinantes como Ovidrel® y Luveris® (Laboratorio Merck Serono). Además, el uso repetido de estas hormonas induce con mayor frecuencia una reacción inmunitaria que neutraliza el efecto de las hormonas, conduciendo a una disminución de la eficacia terapéutica. Sin embargo, en algunos casos también se ha destacado que la reacción inmunitaria podía producir anticuerpos capaces de potenciar la actividad de la hormona cuando se coadministraba (Patente EP 1518863) [1]. Después, también se han destacado tres anticuerpos monoclonales anti-LH capaces de potenciar su acción, así como la de FSH, para dos de ellos (Solicitud Internacional WO 2012/066519) [2].
Descripción de la invención
Los inventores han obtenido ahora anticuerpos monoclonales producidos contra la subunidad p de la FSH, capaces de potenciar su acción así como la de la LH y la hCG.
Estos anticuerpos monoclonales se denominan CF12.
El hibridoma que produjo el anticuerpo CF12 se depositó según el Tratado de Budapest, el 03/10/2013 en la CNCM (Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, Francia), con el número CNCM I-4803.
Las secuencias nucleotídicas de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo CF12, se determinaron, las secuencias peptídicas correspondientes se dedujeron. Estas secuencias se presentan en la tabla 1 a continuación.
Tabla 1
Figure imgf000003_0001
Las secuencias que codifican las CDR (regiones determinantes de la complementariedad) se determinaron a partir de las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesadas (VH-CDr ) y ligeras (VL-CDR) del anticuerpo CF12 anterior.
Las secuencias peptídicas correspondientes se dedujeron, y se presentan respectivamente en la tabla 2 a continuación.
Tabla 2
Figure imgf000004_0001
Se describe un ligando de la hormona foliculoestimulante (FSH) que potencia la bioactividad de la FSH, de la hormona luteinizante (LH) y de la gonadotropina coriónica (CG), caracterizado por que comprende el parátopo de un anticuerpo anti-subunidad p de la FSH.
En el sentido de la presente invención, por "anticuerpo anti-subunidad p de la FSH" se entiende, cualquier anticuerpo obtenido por inmunización de un animal a partir de las primeras inyecciones de FSH seguido de varios refuerzos con inyección de la subunidad p de la FSH. Las inyecciones pueden realizarse a partir de FSH de diferentes mamíferos, por ejemplo de FSH ovina, humana, bovina, caprina o porcina, equina, canina, murina, etc... y de subunidades p de la FSH de origen homólogo o heterólogo. Por tanto, el anticuerpo monoclonal CF12 se obtuvo después de una inmunización a partir de la FSH humana y de la subunidad p de la FSH humana.
El objeto de la presente invención es, por tanto, un ligando de la hormona foliculoestimulante (FSH) que potencia la bioactividad de la FSH, de la hormona luteinizante (LH) y de la gonadotropina coriónica (CG), caracterizado por que el ligando es un anticuerpo o un fragmento del mismo y por que:
el dominio variable de la cadena pesada contiene las siguientes CDR:
- VH-CDR1, definida por la secuencia GFTFSSSY (SEQ ID NO: 5);
- VH-CDR2, definida por la secuencia IYAGTGGT (SEQ ID NO: 6);
- VH-CDR3, definida por la secuencia ARHGSYFDY (SEQ ID NO: 7); y
el dominio variable de la cadena ligera contiene las siguientes CDR:
- VL-CDR1, definida por la secuencia QSVDYDGDSY (SEQ ID NO: 8);
- VL-CDR2, definida por la secuencia AAS;
- VL-CDR3, definida por la secuencia QQSNEDPYT (SEQ ID NO: 9).
En el sentido de la presente invención por "CDR" se entiende, las tres regiones hipervariables de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo que constituyen los elementos del parátopo y que permiten determinar la complementariedad del anticuerpo con el epítopo del antígeno. Estas tres regiones hipervariables están limitadas por cuatro regiones constantes que constituyen el "armazón" (FR o framework regions, regiones marco) y dan una configuración estable al dominio variable.
En particular, la presente invención tiene por tanto como objeto, un ligando según la reivindicación 2.
Un ligando según la presente invención es, por ejemplo:
- el anticuerpo monoclonal CF12 producido por el hibridoma CNCM I-4803;
- un fragmento VH o VL de un anticuerpo anterior usado solo o en mezcla;
- un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv o scFv, de un anticuerpo anterior. Preferentemente, se trata de un fragmento Fab o un fragmento scFv, por ejemplo, un fragmento scFv de secuencia peptídica SEQ ID NO: 11; - una forma bi-, tri- o tetravalente (diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos) de dos, tres o cuatro fragmentos de scFv, respectivamente.
- Se describe un anticuerpo recombinante que comprende el parátopo de un anticuerpo anterior y cuyas regiones constantes se han modificado para minimizar la inmunogenicidad frente al animal o al hombre al que está destinado. Por ejemplo, se trata de un anticuerpo quimérico (humanizado, ovinizado, caprinizado, bovinizado, porcinizado, etc...) o totalmente humanizado, ovinizado, caprinizado, bovinizado, porcinizado
A modo de ejemplo no limitante, las secuencias nucleotídicas de scFv derivadas del anticuerpo CF12 se determinaron, las secuencias peptídicas correspondientes se dedujeron, y se presentan respectivamente en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3
Figure imgf000005_0001
Se describe una secuencia nucleotídica que codifica un ligando según la invención.
Se describe un vector recombinante, en particular, un vector de expresión, que comprende una secuencia nucleotídica tal como ha descrito anteriormente.
Se describe una célula hospedadora que comprende una secuencia nucleotídica tal como se ha descrito anteriormente o un vector recombinante tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, se trata del hibridoma CNCM I-4803 o una de célula transformada por una secuencia nucleotídica o un vector recombinante según la invención.
Se describe un método de producción de un ligando según la invención, caracterizado por que comprende, cultivar en un medio adecuado, células hospedadoras como las descritas anteriormente y recuperar dicho ligando de dicho cultivo.
Los inventores han demostrado que el anticuerpo CF12 potencia sólo ligeramente pero de forma significativa, la FSH porcina, ovina y bovina, a diferencia de la FSH humana a la que potencia fuertemente. Además, los inventores han demostrado que el scFv derivado del anticuerpo CF12, tiene las mismas propiedades de unión y potenciación que las de los anticuerpos de los que derivan.
El objeto de la presente invención es también un complejo formado por un ligando y una gonadotrofina, o un péptido activo de la misma, capaz de unirse a dicho ligando y cuya actividad potencia dicho ligando. Por ejemplo, se trata del complejo de un ligando con la LH, con la hormona gonadotropina coriónica (CG) o con la FSH extraídas de tejidos o fluidos biológicos, o recombinantes, o de un péptido activo de las mismas, capaz de unirse a dicho ligando y cuya actividad potencia dicho ligando.
El objeto de la presente invención es también un ligando o complejo según la invención para su uso como medicamento, en particular, para potenciar la bioactividad de la FSH, de la LH y de la gonadotropina coriónica (CG), para inducir una ovulación o incluso una poliovulación en un mamífero hembra o para reducir los problemas de infertilidad o de hipofertilidad dependiente de hormonas en un mamífero macho o hembra. Dicho medicamento también permite aumentar el nivel de progesterona circulante endógena secretada por uno o más cuerpos lúteos en un mamífero hembra, favoreciendo por tanto el desarrollo embrionario precoz y disminuyendo el riesgo de aborto. Se describe un método de producción cárnico, en donde dicho método comprende la administración del ligando y/o del complejo de la invención, a un animal mamífero hembra no humano.
El objeto de la presente invención es también un ligando y/o complejo de la invención para su uso en el tratamiento de la infertilidad o de la hipofertilidad dependiente de hormonas en un mamífero. En el caso de un mamífero hembra con infertilidad o hipofertilidad, la administración del ligando o complejo de la invención, permitirá estimular una procreación natural, médicamente asistida o artificial. Cabe señalar, que la administración del ligando o complejo de la invención a un mamífero hembra que está sana, también permitirá activar la ovulación en el contexto de una procreación natural o artificial.
En el sentido de la presente invención por "infertilidad/hipofertilidad dependiente de hormonas" se entiende, una infertilidad/hipofertilidad debida a una insuficiencia hormonal, por ejemplo, bajas concentraciones circulantes de FSH y LH, o a una ausencia de estas hormonas, a causa de, ejemplo, factores externos (por ejemplo, plaguicidas) o internos (por ejemplo, insuficiencia pituitaria o hipotalámica, o a un problema de receptividad de las gónadas en la LH y/o la FSH debido a una anomalía de los receptores o de las gonadotropinas LH, f Sh , CG, por ejemplo, una mutación o un polimorfismo de los receptores).
Los ligandos y complejos de la invención pueden usarse en seres humanos o en animales, especialmente ovinos, bovinos, caprinos, equinos, porcinos, murinos, caninos, camellos, etc...
Los ligandos, las hormonas o los complejos según la invención, pueden administrarse por separado, ya sea secuencialmente, ya sea conjuntamente, por inyección, por ejemplo intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, transcutánea, intradérmica, intraorbital, intraocular, oftálmica, o por vía transocular, sin alterar su efecto potenciador.
El objeto de la presente invención es también una composición farmacéutica que comprende un ligando o complejo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicha composición farmacéutica puede comprender además una FSH y/o una LH y/o una hormona gonadotropina coriónica (CG).
Para un experto en la materia todavía podrán aparecer otras ventajas al leer los siguientes ejemplos, ilustrados por las figuras adjuntas, que se ofrecen con fines ilustrativos.
Breve descripción de las figuras
- La figura 1 ilustra el efecto potenciador in vitro del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de la FSH humana (hFSH) en células de la granulosa bovina.
- La figura 2 representa el efecto potenciador in vitro del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de la FSH ovina (oFSH) en una línea celular HEK 293 transfectada de manera estable con el receptor de FSH humano. - La figura 3 representa el efecto potenciador in vitro del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de la FSH humana (hFSH) en una línea celular HEK 293 transfectada de manera estable con el receptor de FSH humano y el vector Glosensor®.
- La figura 4 representa el efecto potenciador in vitro del anticuerpo monoclonal CF12 y de scFv CF12 sobre la bioactividad de la FSH humana (hFSH) en una línea celular HEK 293 transfectada de manera estable con el receptor de FSH humano y el vector Glosensor®.
- La figura 5 representa el efecto potenciador in vitro del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de la FSH ovina (oFSH) en una línea celular HEK 293 transfectada de manera estable con el receptor de FSH humano y el vector Glosensor®.
- La figura 6 representa el efecto potenciador in vitro del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de la FSH porcina (pFSH) en una línea celular HEK 293 transfectada de manera estable con el receptor de FSH humano y el vector Glosensor®.
- La figura 7 representa el efecto potenciador in vitro del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de las FSH humanas (hFSH) Gonal-F® (B) y Fostimon® (C), en células de la granulosa humana.
- La figura 8 representa el efecto potenciador in vitro del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de la FSH humana (hFSH) Gonal-F®, en células de la granulosa humana.
- La figura 9 representa el efecto potenciador in vivo del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de las FSH humanas (hFSH) Gonal-F®, Puregon® y Fostimon® (A) y de la FSH ovina (oFSH) (B) en ratas hembra. - La figura 10 representa el efecto potenciador in vivo de scFv CF12 sobre la bioactividad de las FSH humanas (hFSH) Gonal-F® (A y B), Puregon® y Fostimon® (A) y del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de la FSH humana (hFSH) Gonal-F según diferentes modos de administración (C) en ratas hembra.
- La figura 11 representa el efecto potenciador in vivo del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de coriogonadotropinas humanas (hCG) Chorulon® y Endo 5000® en ratas macho.
- La figura 12 representa el efecto potenciador in vivo del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de gonadotropinas endógenas en ovejas durante el periodo de la temporada sexual.
- La figura 13 representa el efecto potenciador in vivo del anticuerpo monoclonal CF12 inyectado solo después de 25 UI de hFSH, sobre la estimulación folicular en monas.
- La figura 14 representa el efecto potenciador in vivo del anticuerpo monoclonal CF12 inyectado solo después de 37.5 UI de hFSH, sobre la estimulación folicular en monas
- La figura 15 representa el efecto potenciador in vivo del anticuerpo monoclonal CF12 inyectado solo después de 37.5 UI de hFSH, sobre la secreción de estradiol y progesterona en monas
- La figura 16 representa el epítopo conformacional del ligando CF12, sobre las hormonas hFSH, hCG, hLH, oLH, pLH, oFSH, pFSH y el receptor de FSH humano.
- La figura 17 representa el efecto potenciador in vitro de diferentes fragmentos del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de la hFSH
- La figura 18 representa el efecto potenciador in vivo en ratas de diferentes fragmentos del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de la hFSH
Ejemplos
EJEMPLO 1: OBTENCIÓN DE LIGANDOS DE LA INVENCIÓN, Y SU CARACTERIZACIÓN
1/ Estrategia de inmunización de ratones
Todas las inyecciones se realizaron por vía intraperitoneal en ratones (Balb/C). Se utilizaron cinco ratones.
Estrategia de inmunización de ratones para el anticuerpo CF12
La inmunización se realizó con varias inyecciones de FSH humana recombinante (hFSHr). Una primera inyección (D0) se realizó con 50 |jg de hFSHr con adyuvante completo de Freund. Después se realizaron varias inyecciones de refuerzo en la siguiente secuencia:
- D21 y D35: inyección de refuerzo de 50 |jg de hFSHr con adyuvante incompleto de Freund;
- D55, D56 y d 57: inyección de 30 jg de subunidad beta de hFSHr sin adyuvante;
- D58: fusión.
2/ Isotipado
El isotipado del anticuerpo CF12 se realizó con el kit de isotipado FastElysa comercializado por RD Biotech (referencia RDB 3255) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
El anticuerpo CF12 es una inmunoglobina de clase IgM y de isotipo Kappa. Los valores de densidad óptica (DO) obtenidos fueron 0,639 y 0,6 respectivamente.
3/ Secuenciación
Las secuencias nucleotídicas de la parte variable de las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) del anticuerpo CF12, secretadas por el hibridoma CNCM I-4803, se determinaron a partir de su ARN mensajero (ARNm) según el siguiente protocolo.
Los ARN se extrajeron de las células usando el kit de ARN Nucleospin® (Macherey Nagel, Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las concentraciones de ARN purificado se calcularon midiendo la absorbancia (A) a 260 nm y su calidad en la relación A260nm/280nm y visualmente después de migración electroforética en gel de agarosa.
Después, los ADN complementarios de los ARNm se sintetizaron usando, como cebador, un oligo-dT-is mediante una reacción de retrotranscripción con la enzima M-MLV (Ref. M1701, Promega, Promega, EE. UU.) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
La síntesis de la segunda cadena de ADN se realizó mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según el siguiente protocolo: se añaden a 4 j l de la reacción de retrotranscripción en un volumen final de 50 jl; el tampón de reacción (1X final), 200 jM de cada dNTP, 300 nM de cebadores sentido y antisentido, 1,25 U de GoTaq polimerasa (Ref. M3175, Promega, EE. UU.).
Para la amplificación de la parte variable de las cadenas ligeras, se utilizaron 5 pares de cebadores diferentes (MKRev2 a 8 MKC5For) y para la de las cadenas pesadas se utilizaron 2 pares (VHRev1 o VHRev2 MjCFor).
Tabla 4: Secuencias nucleotídicas de los cebadores utilizados para secuenciar las cadenas pesadas (VH) y ligeras VL del anticuer o CF12.
Figure imgf000008_0001
Tabla 5: Secuencias nucleotídicas de los cebadores utilizados para secuenciar la parte 5' de las cadenas pesadas VH li eras VL del anticuer o CF12.
Figure imgf000008_0002
El programa de PCR utilizado se compone de una desnaturalización inicial de 2 minutos a 95 °C, seguido de 30 ciclos de desnaturalización de 30 segundos a 95 °C, hibridación durante 30 segundos a 47 °C y amplificación durante 1 minuto a 72 °C y finalmente una amplificación final durante 5 minutos a 72 °C. Los productos de PCR obtenidos se desalinizaron con el kit de extracción QIAquick®Gel (Ref. 28704, Qiagen GmbH, Alemania) después se ligaron con el vector plasmídico pGEMT easy (Ref. A1360, Promega, EE. UU.) para transformarse en bacterias. El ADN plasmídico extraído de diferentes clones bacterianos se envió para realizar un análisis de secuenciación (Macrogen Europe, Países Bajos).
Después, las secuencias nucleotídicas del extremo 5' de las VH y VL del anticuerpo CF12, se determinaron mediante el diseño de cebadores específicos anclados en las secuencias líder de los ADNc (cebador Fw). Estos cebadores se diseñaron después de la identificación de la homología mediante la alineación entre las secuencias VL y VH obtenidas anteriormente y de la base de datos del programa informático IMGT/V-QUEST (Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36: W503-508, 2008; Giudicelli et al., Cold Spring Harb Protoc., 2011(6): 695-715, 2011) [3, 4] y la extracción de las secuencias líder de interés de IMGT/GENE-DB (Giudicelli et al., Nucl. Acids Res., 33: D256-261,2005) [5]. Los cebadores antisentido (Rev) se diseñaron en las respectivas secuencias VH y VL anteriormente determinadas de cada uno de los anticuerpos. El protocolo utilizado para obtener la parte 5' es el mismo que el descrito en el párrafo anterior. Las secuencias nucleotídicas consenso se dedujeron de la alineación de secuencias usando el programa informático MultAlin (Corpet, Nucl. Acids Res., 16(22): 10881-10890, 1988) [6]. La transcripción en secuencias polipeptídicas y la anotación de las CDR, se realizaron utilizando el programa informático IMGT/V-QUEST. Los resultados se presentan en las tablas 6 y 7.
Tabla 6: Secuencias nucleotídicas y peptídicas de las partes variables pesadas (VH) y ligeras (VL) del anticuerpo
CF12.
Figure imgf000009_0001
T l 7: DR l r v ri l VH li r VL l ni r
Figure imgf000009_0002
4/ Construcción, producción y caracterización de los scFv
a/ Construcción de los fragmentos de anticuerpo scFv
ATG Biosynthetics GmbH (Alemania) sintetizó los genes de síntesis de los fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) derivados del anticuerpo CF12.
Cada secuencia se diseñó a partir de la fusión de las partes variables pesadas y ligeras (SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 3) unidas por una secuencia que codifica el péptido (Gly4Ser)3 que garantiza la funcionalidad de la proteína y que finalizan en una secuencia que codifica el péptido His6 (etiqueta peptídica de HIS) que autorizará la purificación de los scFv. Para permitir su inserción en el plásmido de expresión, las secuencias se flanquearon con los sitios enzimáticos de restricción Pstl y Sall. Entre el extremo 3' de VL y el sitio SalI, se añadió una secuencia adicional, permitiendo, si se desea, la supresión del péptido His6. Los codones se optimizaron para la expresión en E. coli. A continuación se detalla una representación esquemática de la construcción de los genes de síntesis de los scFv:
VH Lieur VL
Figure imgf000010_0002
Pstl .. Xhol Xhol Salí
Los fragmentos de anticuerpo se insertaron entre los sitios enzimáticos PstI y Xhol del plásmido de expresión pSW1 (ATG:Biosynthetics GmbH, Alemania) según E. S. Ward y colaboradores (Ward et al., Nature, 341: 544-546, 1989) [7] que contiene, bajo el control de un promotor inducible LacZ, una secuencia señal PelB que se fusionó en fase de lectura con el gen del fragmento de anticuerpo recombinante, permite el direccionamiento de la proteína sintetizada hacia el periplasma bacteriano. En el periplasma, esta secuencia señal es eliminada por una peptidasa.
Después de un control de la calidad de secuenciación de las construcciones, los plásmidos pSW1-CA5, pSW1-CH10 y pSW1-CF12, se transformaron por choque térmico en bacterias HB2151 (T53040, Interchim, Francia) que se volvieron competentes (Li et al., Afr. J. Biotechnol., 9(50): 8549-8554, 2010) [8].
Tabla 8: Secuencias nucleotídica e tídica de scFv CF12.
Figure imgf000010_0001
b/ Producción de los fragmentos de anticuerpo recombinantes
- Cultivo bacteriano
Un precultivo se realizó en 5 ml de medio 2xYT que contenía 50 pg/ml de ampicilina durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se sembraron 500 |jl de este precultivo en 500 ml del mismo medio y se dejaron crecer a 37 °C a 150 RPM hasta obtener una DO600nm de 1,4. La síntesis del scFv se indujo por la adición de 0,1 mM de IPTG 16 h a 16 °C a 150 RPM.
- Extracción
El medio de cultivo se centrifugó durante 30 minutos a 4500 g a 4 °C. El resto de la preparación se realizó a 4 °C. Para extraer el periplasma bacteriano, el sedimento se resuspendió y se incubó durante 30 minutos en 10 ml de TES (Tris 0,2 M pH8, EDTA 0,5 M, sacarosa 0,5 M) a los que después se añadieron 15 ml de TES diluido a % para incubar nuevamente durante 30 minutos. El extracto bacteriano se centrifugó durante 30 minutos a 10.000 g. El sobrenadante se dializó contra PBS durante la noche. El sobrenadante dializado se trató inmediatamente para purificar el scFv o se conservó a -20 °C hasta su uso.
La producción de scFv en el periplasma se analizó mediante transferencia de Western usando un anticuerpo anti-His-Tag HRP (Ref. R93125 Life technologies, Francia) según las recomendaciones de uso del fabricante.
- Purificación
El periplasma se centrifugó durante 20 minutos a 5000 g a 4° C. El sobrenadante se incubó con Gel de Afinidad por Níquel HIS-Select® (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) con agitación durante 1h a 4 °C. El gel se lavó con un tampón fosfato sódico 0,05 M, NaCl 0,3 M a un pH de 8, después el mismo tampón suplementado con imidazol 20 mM hasta obtener una DO280nm de aproximadamente 0. El scFv se eluyó después con un tampón fosfato sódico 0,05 M, NaCl 0,3 M, imidazol 250 mM pH 8. El eluído se dializó contra PBS durante la noche. Se conservó a -20°°C.
- Control de calidad
El scFv purificado se analizó por electroforesis en gel de poliacrilamida al 15 % después de tinción con azul de Coomassie y por cromatografía de exclusión en una columna Sephadex™ 75 10/300 GL (Ref. 17-5174-01 GE Healthcare, Alemania).
5/ Especificidad
La especificidad del anticuerpo CF12 y de su scFv se estudió mediante la técnica ELISA. Cada hormona evaluada se preparó a una concentración de 10 pg/ml en tampón carbonato sódico 0,1 M pH 9,6 y se distribuyó a razón de 100 pl por pocillo en una placa ELISA. El tiempo de adsorción fue de 18 horas a 4 °C. Después de cinco lavados, los pocillos se trataron con 100 pl de PBS suplementado con Tween al 0,1 % y BSA al 1 % durante 45 minutos a 37 °C, después, cada anticuerpo o scFv, se distribuyó a razón de 100 pl/pocillo y se incubó durante 1 hora a 37 °C. En cada hormona evaluada, los anticuerpos y los scFv se distribuyeron a diferentes concentraciones en un intervalo de 10 a 250 jg/m l para los anticuerpos y de 10 a 150 o 200 jg/m l para el scFv.
Después de cinco lavados, un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa (HRP) se distribuyó a razón de 100 pl/pocillo y se incubó durante 1 hora a 37 °C. Dependiendo del isotipo del anticuerpo monoclonal estudiado, el anticuerpo secundario era un anti-IgG1 conjugado con HRP (Ref. 115-035-205, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc), un HRP anti-IgG2a (Ref. 115-035-206, Jackson Laboratories) o un anti-IgM conjugado con HRP (Ref. 115-035-075, Jackson Laboratories). Para los scFv, se usó un anticuerpo anti-etiqueta de His conjugado con HRP (Ref. R93125 Life technologies, Francia). Después de cinco lavados, la actividad enzimática se reveló con TMB distribuido a razón de 100 pl/pocillo. El tiempo de revelado fue de 5 a 30 minutos a temperatura ambiente dependiendo de la velocidad de la reacción. Después de detener la reacción con H2SO41 M (50 jl/pocillo) se midió la intensidad de la reacción de color (densidad óptica) usando un espectrofotómetro de placas ELISA.
- Especificidad de scFv CF12
El scFv CF12 permitió obtener una unión cuantificable mediante un método ELISA, basado en el revelado de la unión del anticuerpo preparado a concentraciones crecientes sobre diferentes hormonas adsorbidas (unión hasta la saturación, Bmáx). Los resultados se expresan en unidades de densidad óptica obtenidas después del revelado. La tabla 9 representa los valores de densidad óptica obtenidos con el scFv CF12 incubado a la concentración de 200 pg/ml en la FSH porcina (pFSH), ovina (oFSH) y en diferentes FSH humanas.
Tabla 9
Figure imgf000011_0001
El scFv CF12 presenta una fuerte unión sobre la pFSH y la oFSH adsorbidas, y una unión más débil sobre la hFSH y la hMG (Menopur).
La tabla 10 representa los valores de densidad óptica obtenidos con el scFv CF12 incubado a la concentración de 200 |jg/ml sobre la LH porcina (pLH), ovina (oLH), bovina (bLH), la eCG y las hCG Chorulon y Endo 5000.
Tabla 10
Figure imgf000012_0003
La unión de scFv CF12 sobre las LH animales es sustancial, a diferencia de la hCG y de la eCG adsorbidas para las que la unión es más débil.
Por tanto, la unión de CF12 y la de scFv CF12, parecen estar extremadamente limitadas por la conformación del epítopo, en particular para las hormonas humanas. Dados los notables efectos biológicos obtenidos con CF12 y su scFv, sobre la actividad in vitro e in vivo de las FSH humanas y la de las hCG Chorulon y Endo 5000 (véanse los resultados en los Ejemplos 2 y 3), es probable que la unión de scFv CF12 así como la del anticuerpo completo, dependa totalmente de la conformación de la hormona. La hipótesis de una unión alterada de CF12 y de scFv CF12 debido a un cambio en la conformación de las hormonas adsorbidas en el plástico de la placa ELISA, puede explicar estos resultados y refuerza la hipótesis de que CF12 y su scFv son específicos de un epítopo extremadamente conformacional.
Una estimación de la constante de disociación Kd del scFv, frente a diferentes FSH, LH y CG estudiadas, se calculó en GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE.UU., versión 5) usando la función "Un sitio - Unión específica" en un modelo de enlace de saturación ("saturation binding experiment model", programa informático GraphPad PRISM). En las tablas 11 y 12 se indican los diferentes valores obtenidos.
Tabla 11
Figure imgf000012_0001
Tabla 12
Figure imgf000012_0002
La comparación de las constantes de disociación Kd calculadas de esta manera, indica una mayor afinidad de scFv por la FSH ovina, porcina y humana (Gonal-F y Fostimon) con un valor de Kd que varía de 2,6 pM para pFSH y hFSH Fostimon a 3,77 pM para oFSH y 4,87 pM para hFSH Gonal-F.
Los valores de Kd para las LH animales, eCG y las hCG Chorulon y Endo 5000, son relativamente homogéneos y varían entre 4,72 y 6,23 pM, lo que indica una afinidad ligeramente menor de scFv CF12 por estas hormonas en comparación con la de las FSH anteriores.
Con respecto a la hFSH Puregon y a la hMG Menopur, el scFv CF12 presenta una afinidad aún menor con una Kd del orden de diez pM: 14 y 25,22 pM respectivamente.
EJEMPLO 2: MEDICIÓN IN VITRO DEL EFECTO POTENCIADOR DE LIGANDOS DE LA INVENCIÓN EN LA BIOACTIVIDAD DE FSH
El efecto potenciador de los ligandos de la invención en la bioactividad de FSH se demostró mediante la comparación de la respuesta biológica obtenida con diferentes tipos o líneas celulares estimuladas con FSH sola o con el complejo FSH/anticuerpo monoclonal (AcM).
En cada caso, la comparación de las curvas de respuesta a la dosis obtenida, permitió cuantificar el efecto potenciador in vitro del AcM sobre la actividad biológica de la FSH en complejo. El análisis estadístico de los resultados se realizó con el programa informático Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE.UU., versión 5).
1/ En cultivos primarios de células de granulosa bovina
El efecto potenciador del AcM CF12 sobre la FSH humana (hFSH), se caracterizó por primera vez en células de granulosa bovina que expresan de manera endógena el receptor de FSH bovino.
Se incubaron sobrenadantes de hibridomas a la concentración final de 0,1 jg/m l de anticuerpo CF12 con un intervalo de FSH humana que variaba de 3 ng/ml a 25 ng/ml, 30 min a 37 °C.
Las células de granulosa bovina se pincharon en los ovarios de las vacas a partir de folículos con diámetros que variaban de 2 a 6 mm, según el protocolo descrito por Chopineau et al. (Mol. Cell Endocrinol., 92(2): 229-39, 1993) [8] y Wehbi et al. (Endocrinology, 151(6): 2788-2799, 2010) [9]. Las células de granulosa bovina suspendidas en medio 5A de McCoy (Lonza, Bélgica, referencia BE12-688F), preparadas a razón de 80000 células por 0,5 ml, se estimularon durante 3 horas a 37°°C, con agitación, en presencia de iBMX 48 pg/ml (Sigma Aldrich, Francia, referencia I5879), en un intervalo de FSH que variaba de 3 ng/ml a 25 ng/ml, sola o previamente en complejo con un anticuerpo monoclonal según el protocolo anterior. La respuesta biológica medida fue la secreción de AMPc.
Tras la centrifugación, el AMPc producido se analizó en el sobrenadante de cultivo usando un kit ELISA (Biomedical Technologies Inc., MA, EE.UU., BT-730).
Los resultados se muestran en la figura 1.
Los resultados muestran una amplificación de 2,5 veces para CF12 sobre la actividad de la FSH humana. El análisis estadístico mediante análisis de varianza de dos variables (ANOVA bidireccional, programa informático GraphPad PRISM), muestra un efecto significativo que varía de p<0,01 (**) a p<0,001 (***) para CF12. El anticuerpo CF12 tiene un efecto significativo en todas las concentraciones de hFSH analizadas.
2/ Sobre la línea celular de células HEK293 transfectadas de manera estable con el receptor de FSH humano El efecto potenciador de los AcM sobre la FSH de diferentes especies, se midió en células HEK 293 que expresan de manera estable el receptor de FSH humano. Este sistema permitió medir la producción de AMPc después de la activación del receptor de FSH después de una estimulación con FSH sola o por el complejo FSH/ACM durante 1 hora a 37 °C.
Para ello, 60000 células se repartieron en pocillos de placas de 96 pocillos (Becton Dickinson, NJ, EE.UU., referencia 353072) y se cultivaron durante 24 horas a 37 °C, CO2 al 5 % en atmósfera húmeda, en 100 pl de medio MEM (Ozyme, Francia, BE12-611F) que contenía SVF 10 % (Lonza, Bélgica, referencia DE14-801F), penicilina/estreptomicina al 1 % (Sigma Aldrich, Francia, P-4333) y G418 400 pg/ml (Sigma Aldrich, Francia, referencia A1720). Después de 2 horas de abstinencia en medio MEM, las células se estimularon durante 1h a 37 °C. El sobrenadante de cultivo se recolectó y analizó usando un kit ELISA (Biomedical Technologies Inc., MA, EE.UU., BT-730). Los resultados expresan la cantidad de AMPc secretada en el punto final. Se analizaron utilizando el programa informático Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE.u U., versión 5).
La figura 2 representa el efecto potenciador del anticuerpo monoclonal CF12 sobre la bioactividad de la FSH humana in vitro en células HEK 293 transfectadas de manera estable con el receptor de FSH humano. Para ello, las células se estimularon con un intervalo de concentración que variaba de 0,3 a 3 ng/ml para la FSH humana (Gonal-F, Laboratorio Serono), o con los mismos puntos de intervalo de FSH previamente incubados, 30 minutos a 37°°C, con el anticuerpo monoclonal (concentración final 0,1 pg/ml) antes de la estimulación de las células. Un análisis de varianza de dos variables (ANOVA bidireccional, GraphPad PRISM software), permitió comparar las curvas de respuesta a la dosis obtenidas con la FSH sola o con el complejo FSH/anticuerpo monoclonal. Los resultados obtenidos con la FSH humana recombinante (Gonal-F, laboratorio Serono), muestran que el anticuerpo CF12 tiene un efecto potenciador de la actividad hormonal de 140 % a 0,5 ng/ml y de 160 % para las concentraciones de 1 y 3 ng/ml respectivamente. Este efecto es significativo para el punto de 3 ng/ml de FSH humana (p <0,01) mediante una prueba de la t para muestras emparejadas (prueba de Wilcoxon).
3/ Sobre la línea celular de células HEK293 transfectadas de manera estable con el receptor de FSH humano y con el sistema Glosensor®
El efecto potenciador de los AcM en las FSH de diferentes especies se midió en tiempo real en células HEK 293 que expresan de manera estable el receptor de FSH humano y el vector GloSensor™ (Promega, Francia). Este sistema celular permitió controlar la producción de AMPc después de estimulación del receptor de FSH por el agonista (FSH sola o complejo FSH/anticuerpo monoclonal) en tiempo real. Después de la unión del AMPc a la proteína GloSensor™, el sustrato GloSensor™ (Promega, Francia, referencia E1291) se hidrolizó y conduce a una emisión de luminiscencia medida con un lector PolarStar Optima (BMG Labtech, Alemania) y expresado en ULR (Unidad de luminiscencia relativa). Esta línea estable fue desarrollada por el equipo de Biología y Bioinformática de Sistemas de Señalización del centro INRA de Val de Loire, 37380 Nouzilly, Francia) y se puso a disposición de forma gratuita para estos ensayos. Para ello, las células HEK 293 se pusieron en cultivo a razón de 80000 células por pocillo, en una microplaca blanca, con fondo transparente, de 96 pocillos (Dominique Dutscher, Francia, referencia 655903) y se cultivaron en 100 pl de medio MEM (Ozyme, Francia, BE12-611F) complementado con SVF al 10 % (Lonza, Bélgica, referencia DE14-801F), penicilina/estreptomicina al 1 % (Sigma Aldrich, Francia, referencia P-4333), Higromicina B 200 pg/ml (Life Technologies™, Francia, 10687010) y G418400 pg/ml (Sigma Aldrich, Francia, referencia A1720) durante la noche. Después de 2 horas de abstinencia en 100 pl de medio MEM complementado con BSA al 1 % (PAA, Francia, referencia K45012) y que contenía 4 % de sustrato GloSensor™ durante 2 h a temperatura ambiente protegido de la luz, la placa celular se colocó en el lector PolarStar Optima y se realizó una primera lectura durante 5 minutos para medir el nivel basal de luminiscencia. Después, la placa se retiró del lector y para obtener las concentraciones indicadas, se añadieron a la misma 11 pl de ligando (FSH sola o complejo FSH/anticuerpo monoclonal). La luminiscencia emitida se midió después durante aproximadamente 1h30.
Los resultados obtenidos se analizaron utilizando el programa informático Prism (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, EE.UU., versión 5). La función no lineal "log (agonista) frente a respuesta" se usó para trazar la respuesta en función de la concentración de FSH. Esto permitió caracterizar y comparar la CE50 con la FSH sola y la FSH en complejo con el anticuerpo monoclonal. Para cada ejemplo, el efecto significativo del complejo FSH/anticuerpo potenciador se midió mediante análisis de varianza de dos variables (ANOVA bidireccional, GraphPad PRISM software) comparando las dos curvas en su totalidad.
- Anticuerpo monoclonal CF12
El efecto potenciador del anticuerpo monoclonal CF12 se caracterizó sobre la bioactividad de la FSH humana, ovina y porcina.
La figura 3 ilustra el notable efecto potenciador de CF12 sobre la bioactividad de la FSH humana (Gonal-F, Laboratorio SERONO). Este notable efecto es perfectamente cuantificable a bajas concentraciones de 0,01 nM y 0,03 nM de hFSH, para las cuales el sistema celular no está saturado (curvas A y B). Por tanto, se observa un aumento de la señal de luminiscencia de 280 % y 341 % respectivamente, lo cual es muy significativo (p<0,001). Para concentraciones más altas (0,1 - 0,3 y 1 nM), el aumento de la respuesta celular es de 181 %, 147 % y 120 % respectivamente, probablemente debido a una saturación progresiva de la señal luminiscente hasta 46000 ULR (curvas C, D y E). Para las curvas C, D y E, el aumento continuó siendo muy significativo (p<0,001). El valor de CE50 medido por GraphPad Prism es de 4,25.10'10 M para la hFSH y de 9,38.10'11 M para el complejo hFSH/CF12, lo que se traduce en un aumento de la bioactividad de la hormona de 0,7 unidades de LogCE50 (de 10'97 a 10'1003 respectivamente) cuando forma un complejo con el anticuerpo potenciador CF12 (curva F).
El efecto potenciador de scFv CF12 (40 nM) también se midió sobre la actividad de la FSH humana (Gonal F, Laboratorio Serono) preparada a la concentración de 0,01 nM (figura 4). El efecto del anticuerpo CF12 completo (6 nM) se midió en paralelo para comparar. Las curvas obtenidas con el complejo hFSH / scFv CF12 o hFSH / anticuerpo CF12 se superponen perfectamente, lo que indica un efecto idéntico del fragmento de anticuerpo monovalente. El efecto potenciador que ejerce el anticuerpo CF12, también es muy significativo sobre la FSH ovina, como se ilustra en la figura 5, donde se observa un aumento de la respuesta celular de 240 %, 300 % y 350 % durante una estimulación con el complejo CF12 / oFSH para las concentraciones 0,01 nM - 0,03 nM y 0,1 nM de hormona (curvas A, B, C). El anticuerpo CF12 se preparó a una concentración de 10 nM. Al igual que con la hFSH, para las concentraciones más altas de 0,3 nM y 1 nM (curvas D y E), el aumento de la respuesta celular es de 200 % y 130 % respectivamente, debido a una saturación progresiva de la señal luminiscente hasta 40000 ULR. El valor de CE50 medido por GraphPad Prism es de 2,29.10'9 M para la oFSH y de 1,96.10'1° M para el complejo oFSH / CF12, lo que se traduce en un aumento de la bioactividad de la hormona de 1,06 LogCE50 (de 8,64 a 9,7 respectivamente) cuando forma un complejo con el anticuerpo potenciador CF12 (curva F). Los efectos potenciadores observados sobre la respuesta celular son, en todos los casos, muy significativos (p<0,001).
Las curvas de la figura 6 ilustran el efecto potenciador de CF12 (10 nM) sobre la FSH porcina preparada a las concentraciones de 0,01 - 0,03 - 0,1 - 0,3 y 1 nM. Este efecto es perfectamente cuantificable a las concentraciones más bajas 0,01 nM - 0,03 nM y 0,1 nM de pFSH, para las cuales el sistema celular no está saturado (curvas A, B, C). Se observa así un aumento muy significativo y sustancial de la señal de luminiscencia de 220 %, 350% y 330% respectivamente. Para concentraciones más altas (0,3 y 1 nM), el aumento de la respuesta celular es más bajo, 175 % y 114 % respectivamente, debido a una saturación progresiva de la señal luminiscente hasta el límite de 40000 ULR (curvas D y E). El valor de CE50 medido por GraphPad Prism es de 1,92.10-9 M para la pFSH y de 3,69.10'10 M para el complejo pFSH / CF12, lo que se traduce en un aumento de la bioactividad de la hormona de 0,717 LogCE50 (de 10-8,715 a 10"9,432 respectivamente) cuando forma un complejo con el anticuerpo potenciador CF12 (curva F).
4/ En cultivos primarios de células de granulosa humanas
Las células de granulosa humanas se recuperaron y se cultivaron como se describe en Reverchon y colaboradores al (Reverchon et al., Human Reprod., 27(6): 1790-1800, 2012) [11].
Estas células se recuperaron de fluidos foliculares recogidos de punciones de ovocitos de mujeres tratadas para una fecundación in vitro (FlV) en el contexto de una procreación médicamente asistida (PMA). Estas células se aislaron por centrifugación en un gradiente de Percoll al 40 %, se resuspendieron en medio completo 5A de McCoy (Lonza, Bélgica, referencia BE12-688F) y después se sembraron en placas de 24 pocillos (Becton Dickinson, NJ, EE.UU., referencia 353047) a razón de 30000 células por pocillo en un volumen final de 500 pl y se cultivaron durante 48 horas. Después, se estimularon durante 48 horas con la FSH humana sola o con el complejo FSH humana / AcM. Las FSH humanas utilizadas fueron principalmente Gonal-F, hormona recombinante comercializada por el laboratorio farmacéutico SERONO, (SERONO, Europa, Limited) y Fostimon, FSH extraída de la orina de mujeres menopáusicas, comercializada por el laboratorio farmacéutico GENEVRIER (Francia). Después de la estimulación, los sobrenadantes se recuperaron y se centrifugaron. El AMPc producido se midió en cada sobrenadante de cultivo usando un kit ELISA (Biomedical Technologies Inc., MA, EE.UU., BT-730).
Las células de 23 pacientes se prepararon por separado y se cultivaron por separado según el método descrito anteriormente. Cada cultivo celular de un paciente se dividió en dos lotes: uno estimulado con un intervalo de FSH que variaba entre 10-11 M a 10-8 M, y el otro estimulado con el complejo de anticuerpo monoclonal CF12 / hFSH a las diferentes concentraciones del intervalo. El anticuerpo se preparó a la concentración final de 0,1 nM o 4 nM. Para cada paciente, para evaluar el efecto potenciador del anticuerpo sobre la bioactividad de la hormona humana utilizada, se compararon las curvas de respuesta a la dosis obtenida en las dos condiciones.
Los cultivos celulares de 23 pacientes mostraron respuestas muy diferentes a la estimulación por hFSH y / o por el complejo hFSH / anticuerpo. Solo las células de 12 pacientes, de un total de 23, respondieron a la estimulación con FSH sola, independientemente de la hFSH utilizada, y a la estimulación por el complejo FSH / anticuerpo (figura 7, curvas A, B, C). Los resultados se ilustran en la figura 7. La curva A representa la respuesta celular de una paciente a una estimulación por Gonal F y por Fostimon; las CE50 medidas fueron 7,10-11 y 1,10-9 respectivamente. Las curvas B y C ilustran dos casos representativos de pacientes cuyas células de la granulosa respondieron tanto a la estimulación por la hFSH sola (Gonal-F para la curva B y Fostimon para la curva C) como por el complejo CF12 / hFSH. En el caso de la curva B, la CE50 de la curva de respuesta a la dosis obtenida con el complejo es mayor que la obtenida con la hormona sola (7,52.10-10 M frente a 2,42.10-9 M). En el caso de la curva C, las CE50 no son diferentes (2,28.10-9 M frente a 3,61.10-9 M).
De los 11 pacientes restantes, las células de cuatro de ellos, no respondieron ni a la estimulación por la FSH ni a la estimulación por el complejo FSH / CF12. Por el contrario, y sorprendentemente, las células de los 7 pacientes restantes, respondieron únicamente a la estimulación por el complejo de FSH / anticuerpo potenciador, mientras que no se observó ningún aumento en la secreción de AMPc después de la estimulación con la hFSH sola en el mismo intervalo de concentraciones. Estos notables resultados se ilustran en la figura 8, curvas A a F, representando cada curva la respuesta de las células de la granulosa de una paciente diferente. En cada caso, el anticuerpo CF12 se utilizó a 0,1 nM. Dos pacientes dieron la misma curva de respuesta a la dosis ilustrada por la curva D. Estos resultados demuestran muy claramente que en estas pacientes, sólo el complejo hFSH / anticuerpo CF12 es capaz de inducir una estimulación funcional del receptor hFSHR, a diferencia de la f Sh sola, que no provoca ninguna activación del receptor hFSHR. El nivel máximo de secreción de AMPc obtenido a través de la estimulación con el complejo hFSH / anticuerpo CF12, está comprendido entre 6 y 15 pmol/ml, equivalente al nivel máximo de secreción obtenido con cultivos celulares que normalmente han respondido a la hFSH (figura 12). En la Tabla 13 se ilustran las CE50 medidas por GraphPad Prism de cada una de las curvas de respuesta a la dosis:
Tabla 13
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Por tanto, el complejo hFSH / anticuerpo CF12 se comporta como un nuevo ligando, como un nuevo agonista capaz de activar el hFSHR en pacientes naturalmente resistentes a la estimulación convencional con hFSH recombinante o extraída. Por tanto, el uso de una mezcla de hFSH / anticuerpos potenciadores, puede proporcionar una nueva alternativa en los tratamientos hormonales para inducir la ovulación (mono o poliovulación) en pacientes que no responden a los tratamientos hormonales convencionales utilizados en biología reproductiva humana.
EJEMPLO 3: MEDICIÓN IN VIVO DEL EFECTO POTENCIADOR DE LIGANDOS DE LA INVENCIÓN EN LA BIOACTIVIDAD DE FSH Y LH/CG EN MODELO DE RATA
Después de su caracterización in vitro, el efecto potenciador de cada anticuerpo monoclonal se caracterizó in vivo, en ratas hembra para determinar su efecto sobre la bioactividad de la FSH y en ratas macho para determinar su efecto sobre la bioactividad de la LH/CG, que también reconocen.
Para medir la bioactividad de FSH, el protocolo utilizado fue el del ensayo biológico descrito por Steelman y Pohley (Steelman SL, Pohley FM. Endocrinology, 53:604-616. 1953) [12]. Para medir la bioactividad de LH, el protocolo utilizado fue el del ensayo descrito por Scobey y colaboradores (Scobey et al, Reprod. Biol. Endocr. 3:61, 2005) [13]. El efecto de los anticuerpos sobre la actividad de la FSH se evaluó utilizando FSH humanas. El efecto de los anticuerpos sobre la actividad de LH se evaluó en dos preparaciones de hCG (gonadotropina coriónica humana). El análisis estadístico se realizó con el programa informático GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE.UU., versión 5). Los resultados relacionados con experimentos realizados en lotes de 5 animales, se aplicó un análisis de varianza de una variable, no paramétrico (prueba de Kruskal Wallis), seguido de una corrección de Dunns o una prueba de la t no paramétrica (prueba de Mann-Whitney). Para los resultados relacionados con cifras más sustanciales (n> 30) obtenidas de la compilación de varios bioensayos, se aplicó una prueba paramétrica (prueba de la t de Student para muestras no emparejadas) seguido de una corrección de Bonferroni.
1/ Efecto potenciador de los anticuerpos sobre la bioactividad de la FSH en Ratas
Se estudió el efecto potenciador del anticuerpo CF12 y de su scFv en diferentes preparaciones de FSH humana utilizadas en reproducción humana en el contexto de tratamientos de procreación médicamente asistida: Gonal-F y Puregon (FSH recombinantes de los laboratorios Merck Serono y Merck Schering-Plough, respectivamente), Fostimon y Menopur (FSH extraídas, comercializadas por los laboratorios Genevrier y Merck Schering-Plough, respectivamente).
Como se describe en el protocolo de Steelman y Pohley, ratas inmaduras de 21 días de vida recibieron 2 inyecciones por la mañana y por la noche durante tres días consecutivos, 100 pl de una mezcla de hCG y FSH que comprendía una cantidad constante de hCG (3,5 UI) suplementada con una cantidad variable de FSH que variaba de 0,5 a 1,5 UI para la FSH humana (Gonal F, Puregon, Fostimon, Menopur). Las inyecciones se realizaron por vía subcutánea en la nuca. Cada experimento comprendía al menos 4 lotes: un lote tratado con solución salina fisiológica (suero O), un lote tratado con el anticuerpo o scFv solo, un lote tratado con la mezcla hCG+FSH, un lote tratado con la mezcla de hCG/FSH suplementada con 2 |jg de anticuerpo o scFv purificado.
En el caso de un tratamiento con el complejo hormona/anticuerpo o scFv, antes de la inyección, la mezcla FSH anticuerpo se incubó previamente durante 20 minutos a 37 °C o a temperatura ambiente, después se añadió a hCG. La hCG puede mezclarse indiferentemente con FSH durante la incubación del complejo.
El cuarto día, las ratas se pesaron y sus ovarios extrajeron, se disecaron y después se pesaron. Los resultados se expresan en miligramos de ovario/100 gramos de peso corporal. El aumento del peso de los ovarios es proporcional a la cantidad de FSH bioactiva inyectada. Esto permite cuantificar y comparar la bioactividad de la misma cantidad de hormona inyectada sola o en complejo con un anticuerpo.
La comparación de la bioactividad de la FSH inyectada sola o en complejo con el anticuerpo o con scFv, permite medir el diferencial de la respuesta y cuantificar así el efecto potenciador del anticuerpo o de su scFv.
Efecto potenciador del anticuerpo CF12 y de su scFv.
El efecto in vivo del anticuerpo CF12, producto contra la FSH humana, se evaluó sobre la bioactividad de diferentes preparaciones de FSH humana y sobre la bioactividad de la FSH ovina.
La figura 9A ilustra el notable efecto potenciador ejercido por el anticuerpo CF12 sobre tres preparaciones diferentes de FSH humana. Los resultados son los de bioensayos representativos que comprenden lotes de 5 hembras. El análisis estadístico entre lotes se realizó mediante una prueba de la t no paramétrica (prueba de Mann-Whitney). Se registró un efecto potenciador sustancial y significativo sobre la actividad de la hFSH Gonal-F con un aumento de 210 % del peso medio de los ovarios (74 frente a 155 mg/100 g de peso corporal, p<0,001). Asimismo, con Puregon se obtuvo un aumento de 190 % (141 frente a 224 mg, p<0,05) así como con Fostimon, con la que se registró un aumento de 160 % del peso medio de los ovarios (85 frente a 161 mg, p<0,05).
Estos experimentos se repitieron entre 5 y 7 veces y los resultados se recopilaron (n = 40 y 47 ratas para los lotes de hCG hFSH Gonal F y hCG hFSH Gonal F CF12). Se aplicó una prueba paramétrica (prueba de la t de Student para muestras no emparejadas) seguido de una corrección de Bonferroni. Como se ilustra en la tabla 14, se muestra un aumento muy significativo de 170 % entre el peso medio de los ovarios en las mujeres tratadas convencionalmente con la mezcla hCG hFSH (Gonal F) y el medido en las mujeres tratadas con el complejo hFSH Gonal F/CF12: aumentando el peso medio de 79,51 ± 2,178 mg de ovario/100 g de peso corporal a 134,8 ± 4,985 mg de ovario/100 g de peso corporal en las mujeres (***, p<0001).
Tabla 14
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Para evaluar y cuantificar el efecto potenciador del anticuerpo CF12 sobre la FSH de origen ovino se llevó a cabo el mismo enfoque.
La figura 9B ilustra un ejemplo representativo de un bioensayo obtenido (lotes de 5 hembras) tratando las ratas con 0,5 |jg de FSH ovina hCG o con hCG+0,5 |jg de FSH ovina previamente en complejo con CF12. Se obtuvo un aumento de 170 % del peso medio de los ovarios en las mujeres tratadas con el complejo oFSH/CF12 hCG en comparación con las que recibieron un tratamiento sin CF12: aumentando el peso medio de los ovarios de 107 mg a 183 mg/100 g de peso corporal (**, p<0,01).
La repetición de este estudio con un mayor número (n=10) confirmó, de manera muy significativa, el efecto potenciador de CF12 sobre la bioactividad de la oFSH (Tabla 15), aumentando el peso medio de 115,5 ± 7,45 mg en el caso del tratamiento convencional a 166,4 ± 9,54 mg en las pacientes tratadas con el complejo oFSH/CF12+ hCG (***, p<0,001).
Tabla 15
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El scFv de CF12 desarrollado a partir de la secuencia de las regiones variables Vh y Vl del anticuerpo, se evaluó de la misma manera sobre la bioactividad de la FSH humana. Previamente, se evaluaron varias dosis de scFv de 0,06 jg por inyección (correspondiente a una cantidad equimolar con el anticuerpo completo de 2,5.10-9 mol) a 2 jg por inyección correspondiente a la misma cantidad inyectada que el anticuerpo completo. La comparación de diferentes dosis de scFv en el bioensayo, puso de manifiesto que al inyectar 2 |jg de scFv por inyección, se obtenía un efecto potenciador óptimo, es decir, 8,10-8 moles.
En la figura 10A se ilustran los resultados obtenidos en las diferentes preparaciones de FSH humanas. Muestran que los efectos registrados con scFv son muy parecidos a los medidos con el anticuerpo completo en las tres preparaciones de FSH humanas. El peso medio de los ovarios fue sistemáticamente mayor en las ratas tratadas con el complejo hFSH/scFv/CF12 hCG en comparación con las tratadas convencionalmente con hFSH+hCG. De este modo, se registró un aumento de 190 % sobre la hFSH Gonal F (con un peso medio de 170 mg en el lote scFv CF12 frente a 89 mg en el lote sin scFv CF12, p<0,01), un aumento de 151 % sobre la hFSH Puregon (con un peso medio de 130 mg en el lote scFv CF12 frente a 86 mg en el lote sin scFv, p<0,05) y un aumento de 148 % sobre la hFSH Fostimon (peso medio de 114 mg en el lote scFv CF12 frente a 77 mg en el lote sin scFv, p<0,05). El análisis se realizó mediante una prueba de la t no paramétrica (prueba de Mann-Whitney). Cabe señalar que la amplitud del aumento de la respuesta ovárica es equivalente a la obtenida con el anticuerpo CF12 completo (mismo factor multiplicador). Este resultado significativo y sustancial indica que se puede obtener el mismo efecto potenciador de las gonadotropinas circulantes. in vivo ya sea a través de un scFv o de un anticuerpo completo, produciendo la amplificación de una respuesta fisiológica tangible a nivel de un órgano.
Se evaluaron diferentes métodos de inyección de las mezclas hormona / anticuerpo o scFv y se compararon con el protocolo convencional (inyección por vía subcutánea) también en el caso de CF12. Por tanto, un bioensayo tuvo como objeto comparar una inyección de la mezcla hormonal por vía intraperitoneal con una inyección de la mezcla hormonal por vía intraperitoneal seguida de una segunda inyección retardada del scFv CF1215 minutos después. Los resultados se presentan en la figura 10B, e indican un aumento de 122 % del peso de los ovarios en mujeres que recibieron inyecciones por vía intraperitoneal en dos momentos: 1) con la mezcla de hCG+hFSH y después 2) con scFv en inyección retardada 15 minutos más tarde: 58,8 mg de ovario por 100 g de peso corporal en el lote de hCG+hFSH Gonal F frente a 72 mg de ovario por 100 g de peso corporal en el lote de hCG+hFSH Gonal F seguido de scFv. La diferencia no es significativa entre los dos lotes debido al pequeño número, pero los resultados indican una tendencia hacia una potenciación de la FSH inyectando la hormona y el scFv en dos momentos y en dos puntos de inyección diferentes. Por tanto, es factible, en aplicaciones posteriores, inyectar la hormona que se va a potenciar y después el anticuerpo o el scFv independientemente en diferentes momentos y puntos de inyección.
En animales tratados con el complejo hormona/anticuerpo, se evaluó otra modalidad de inyección: una con una sola inyección subcutánea de hCG+FSH+CF12 y la otra con una primera inyección subcutánea de FSH+CF12 tras 15 minutos después de la hCG también por vía subcutánea. Los resultados ilustrados en la figura 19C muestran que el efecto potenciador observado en los dos casos no es diferente: 160 mg frente a 159 mg de ovario/100 g de peso corporal en las mujeres tratadas con el anticuerpo CF12 para un peso medio de 83 mg de ovario para el lote tratado sin anticuerpo.
Efecto potenciador de los anticuerpos sobre la bioactividad de la LH/CG en Ratas
Debido al alto coste de la LH ovina, estos ensayos biológicos se realizaron con la hCG, fácilmente disponible, en una forma muy pura y económica. El efecto de los anticuerpos se estudió en dos preparaciones de hCG humana (gonadotropina coriónica humana) extraídas, una utilizada en reproducción humana en el contexto de tratamientos de procreación médicamente asistida: ENDO 5000 (laboratorio Schering-Plough) y la otra utilizada en medicina veterinaria: Chorulon (laboratorio MSD).
Según el protocolo de Scobey y colaboradores [13], la bioactividad de LH o hCG se cuantificó en relación con el aumento del peso de las vesículas seminales cuyo desarrollo es andrógeno-dependiente. El peso varía proporcionalmente a la actividad de la hCG y, por tanto, permite cuantificar y comparar la actividad biológica de la hormona inyectada sola o en complejo con el anticuerpo estudiado. El protocolo se realizó con ratones de 25 días inyectados por vía subcutánea, una vez al día durante cuatro días con 100 pl de 1,5 UI de hCG o de una mezcla de 1,5 UI de hCG 2 pg de anticuerpo previamente incubado durante 20 minutos a 37 °C. El quinto día, las ratas se pesaron y después se sacrificaron. Sus vesículas seminales (VS) se extrajeron, se disecaron y se pesaron. El peso de las vesículas seminales se expresa en mg/100 g de peso corporal para poder comparar y combinar los resultados obtenidos con diferentes lotes. En cada experimento, cada una de las condiciones se probó en un lote de 5 ratas. El mismo experimento se repitió varias veces.
Las figuras 11A, B, C ilustran los resultados obtenidos en ratas tratadas con el anticuerpo CF12 en complejo con hCG Chorulon y la hCG ENDO 5000. La figura 11A ilustra un caso representativo de un bioensayo realizado en 6 lotes de 5 ratas. Con el complejo hCG Chorulon/CF12 se obtuvo un efecto potenciador muy significativo (p<0,0001, prueba de Krustal y Wallis) con un aumento de 220 % en el peso de las vesículas seminales en comparación con el lote tratado con hCG sola. También se obtuvo un efecto significativo en el lote tratado con el complejo hCG ENDO 5000/CA5 con un aumento de peso de 189 % (p<0,0001). Se observa que el lote tratado con el anticuerpo CF12 solo, no presenta ningún cambio en el peso de las vesículas seminales en comparación con el de los animales de control tratados con solución salina fisiológica. Por tanto, el anticuerpo CF12 no en complejo con la hormona, no tiene ningún efecto específico sobre el órgano diana.
La recopilación de los resultados de los distintos bioensayos realizados con CF12 se representa en los histogramas B y C de la figura 11. Un efecto potenciador muy significativo (p<0,0001, prueba de la t para muestras no emparejadas) del complejo hormona / CF12, se midió con hCG Chorulon y hCG ENDO 5000:
- en un número de 33 y 36 animales respectivamente, el peso medio de las VS fue de 29,36 mg/100 g en ratas tratadas con hCG Chorulon frente a 51,40 mg/100 g en ratas tratadas con el complejo (aumento de 175 %) (figura IIB )
- en un número de 18 y 20 animales respectivamente, el peso medio de las VS fue de 25,35 mg/100 g en ratas tratadas con hCG ENDo 5000 y de 50,54 mg/100 g en ratas tratadas con el complejo (aumento de 208 %) (figura I IC ) .
EJEMPLO 4: MEDICIÓN IN VIVO DEL EFECTO POTENCIADOR DE LOS LIGANDOS DE LA INVENCIÓN EN LA BIOACTIVIDAD DE LAS GONADOTROPINAS ENDÓGENAS EN OVEJA
Después de haber demostrado y caracterizado el efecto potenciador in vivo, del anticuerpo monoclonal CF12, en un roedor (animal de tamaño pequeño), el objeto era estudiar el efecto de cada anticuerpo sobre la actividad de la FSH en un animal de producción, de mayor dimensión: la oveja.
Para ello, se realizó un estudio en ovejas púberas de la Isla de Francia, todas de la misma edad, para evaluar el efecto potenciador de los anticuerpos sobre las hormonas específicas de las ovejas tratadas (hormonas endógenas). El estudio de especificidad demostró una fuerte unión del anticuerpo CF12 con la FSH ovina y una unión más variable con la LH ovina. Para este fin, se ha desarrollado un tratamiento que consiste únicamente en la inyección de un anticuerpo solo para evaluar su eficacia.
Por tanto, en los protocolos implementados en ovejas, el anticuerpo se inyectó solo y no se incubó previamente con la FSH exógena, como se hizo en los estudios realizados en ratas. Además, cada anticuerpo se inyectó en ovejas libres de cualquier estimulación previa del ovario: los animales no recibieron ningún tratamiento hormonal para estimular la ovulación con una gonadotropina antes de la inyección del anticuerpo.
El efecto potenciador del anticuerpo CF12, anti-FSH, se evaluó durante los protocolos realizados en plena temporada sexual (enero) o al final de la temporada sexual (finales de marzo). Todos los protocolos se realizaron en ovejas cuyo ciclo ovulatorio se sincronizó previamente depositando, durante 14 días, una esponja vaginal impregnada con un progestágeno (45 mg de acetato de fluorogestona (FGA) - MSD). El efecto potenciador se analizó comparando la respuesta ovulatoria (número de ovulaciones) y la colocación de uno o más cuerpos lúteos funcionales de buena calidad (amplitud de la secreción de progesterona) en ovejas de control (lote de solución salina fisiológica), de ovejas estimuladas con un tratamiento de FSH porcina (lote de FSH) y ovejas estimuladas con un anticuerpo solo (lote de anticuerpo).
En cada protocolo, para detectar y datar el pico preovulatorio de LH, se realizó un análisis de la LH plasmática mediante el método ELISA. Para evaluar la respuesta ovulatoria, se realizó una observación endoscópica de los ovarios por laparoscopia, con anestesia, ocho días después de la extracción de la esponja vaginal, para contar la cantidad de cuerpos lúteos y observar su aspecto.
Para evaluar la funcionalidad y la calidad del cuerpo o cuerpos lúteos, después de extraer la esponja, se realizó un ensayo ELISA cuantitativo de progesterona de extracciones diarias de sangre desde el primer día al día 21.
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa informático GraphPad Prism Versión 5.0 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.).
Anticuerpo CF12 y su scFv
El efecto potenciador de CF12 (IgM) y de su scFv se estudió y se comparó utilizando los parámetros de medición de la ovulación y de la calidad funcional del cuerpo lúteo en su lugar. Las dosis inyectadas fueron 2 veces 1 mg.
El protocolo realizado durante la temporada sexual incluyó cuatro lotes:
- el lote de anticuerpo CF12 (n=7) recibió una inyección intramuscular de 1 mg de anticuerpo 24 horas antes de extraer la esponja y una segunda inyección de 1 mg en el momento de extraer la esponja
- el Iote de scFv c F12 (n=5) recibió una inyección intramuscular de 1 mg de scFv 24 horas antes de extraer la esponja y una segunda inyección de 1 mg en el momento de extraer la esponja
- el lote de "control" (n=9) recibió una inyección de solución salina fisiológica, por vía intramuscular, 24 horas antes de extraer la esponja y en el momento de la extracción
- el lote de "FSH" (n=11) recibió una inyección por vía intramuscular de 100 |jg de FSH porcina (pFSH) 24 horas antes de extraer la esponja y de 90 jg 12 horas antes de extraer la esponja.
Las endoscopias de los ovarios se realizaron 8 días después de extraer la esponja.
Para medir la progesterona plasmática mediante ensayo ELISA y después de retirar la esponja, se realizaron extracciones diarias de sangre desde el día 1 al 21.
El análisis de la respuesta ovulatoria dio los resultados presentados en siguiente tabla 16. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba exacta de Fisher.
Tabla 16
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En comparación con los lotes de control y de FSH, los resultados obtenidos en el lote de CF12 y de scFv CF12, muestran un efecto muy significativo del anticuerpo o de su scFv inyectado solo, sobre la respuesta ovulatoria. En efecto, el 100 % de las mujeres (7/7 para CF12 y 5/5 para scFv CF12) que recibieron dos inyecciones de 1 mg de anticuerpo o de scFv, ovularon frente al 44 % y 36 % respectivamente para el lote de suero O y el lote de FSH (p<0,0001, prueba exacta de Fisher). La cantidad de cuerpos lúteos obtenidos por mujer sobre el número total de lote es significativamente mayor en el lote de scFv CF12 (p<0,05, prueba de Kruskall Wallis) en comparación con los lotes de FSH y de suero O: 2,2 cuerpos lúteos frente a 0,9 (FSH) y 0,67 (suero O) respectivamente. No hubo ninguna diferencia significativa entre el lote scFv CF12 y CF12.
El tiempo medio de aparición del pico de LH no es significativamente diferente entre los tres lotes. Sin embargo se observa una tendencia a una menor variabilidad en la aparición del pico de LH (es decir, en el momento de la ovulación) en los lotes de CF12 y scFv CF12 en comparación con los lotes de FSH y especialmente con el suero O. En esta hipótesis, esto indicaría una mejor sincronización de las ovulaciones en las ovejas que recibieron el anticuerpo o su scFv.
El perfil de secreción de progesterona durante la fase lútea después de la ovulación, en los diferentes lotes se ilustra en la figura 12A. Para cada individuo, los valores de concentración de progesterona (ng/ml) se normalizaron por número de cuerpos lúteos. Cada curva de la figura representa la media de los valores de progesterona medidos en cada muestra de mujeres de cada lote. Las curvas de secreción obtenidas con los lotes de CF12 y scFv CF12 están muy claramente por encima de las de los lotes de FSH y suero O. Los resultados obtenidos indican valores medios de progesterona de 1,46 - 1,4 - 1,1 y 0,6 ng/ml respectivamente, para los lotes de scFv CF12, CF12, FSH y suero O el D10 después de extraer la esponja y de 1,93 - 1,78 - 1,22 y 1 ng/ml el D15.
La comparación de las cuatro curvas se realizó mediante una prueba de la t no paramétrica para muestras emparejadas (prueba de Wilcoxon). Las curvas de los lotes de CF12 y scFv CF12, son significativamente diferentes de la curva del lote de suero O (p <0,01). Asimismo, la curva del lote de FSH es significativamente diferente de la del lote de control (p <0,001). La diferencia entre las curvas de las ovejas tratadas con CF12 y scFv CF12 con la curva de las ovejas tratadas con FSH, no es significativa y por tanto representa una tendencia.
Para cuantificar las diferencias entre las curvas de secreción de la progesterona, se realizó un análisis del área bajo la curva (ABC) con el programa informático GraphPad Prism versión 5.0. Los resultados se ilustran en la figura 12B e indican que el ABC de la curva de scFv CF12 (16,98 unidades) es significativamente mayor de un factor de 1,55 del ABC de la curva de suero O (8) (p<0,01, prueba de la t no paramétrica de Mann-Whitney). Asimismo, el ABC de las curvas de CF12 (16,78 unidades) y de suero O (8 unidades) son significativamente diferentes (p<0,05, prueba de la t no paramétrica de Mann-Whitney). Por el contrario, no hay ninguna diferencia significativa entre el ABC de la curva de FSH (10,82 unidades) y el de la curva de suero O, lo que indica que, en el contexto de este experimento, el tratamiento con CF12 o con scFv CF12 es más eficaz que el tratamiento con FSH.
En conclusión, todos los resultados indican que el fragmento monovalente de CF12 tiene los mismos efectos potenciadores que los del anticuerpo bivalente CF12. Nunca se observaron diferencias significativas entre las respuestas de los dos lotes de ovejas en cuestión. El tratamiento con cualquiera de las dos moléculas en forma de dos inyecciones intramusculares de 1 mg cada una, dio resultados muy significativamente mejores, en comparación con los de un tratamiento convencional con FSH:
- en términos de eficacia sobre la inducción de la ovulación (el 100 % de las ovejas han ovulado y se obtienen 1,3 y 0,8 cuerpos lúteos adicionales por oveja del número total)
- en términos de calidad de los cuerpos lúteos implementados con una mayor secreción de progesterona a lo largo de la fase lútea.
Todos los resultados indican que el anticuerpo potenciador CF12, inyectado in vivo en la oveja, es capaz de formar complejos con las hormonas gonadotrópicas endógenas del animal y de potenciar la actividad biológica de las hormonas específicas del animal.
El efecto potenciador del anticuerpo CF12 en ovejas es capaz de inducir una estimulación más fuerte del ovario que el tratamiento convencional con la hormona FSH: la inducción de las ovulaciones es de 100 % en la temporada sexual y, en todos los casos, se mantiene un aumento sustancial de la concentración circulante de la progesterona a lo largo de la fase lútea. Este efecto adicional es importante para disminuir el índice de fracaso del desarrollo embrionario dependiente de progestágeno y los riesgos de aborto.
Se ha demostrado que el fragmento monovalente scFv de CF12, induce los mismos efectos potenciadores que los del anticuerpo completo, tanto sobre la inducción de la ovulación como sobre la calidad del cuerpo lúteo y el aumento de la secreción de progesterona en la oveja. Además, los autores de la invención han constatado que la inyección de scFv CF12 en su protocolo no indujo la secreción de anticuerpos anti-scFv CF12 en las ovejas tratadas. Por tanto, la perspectiva de utilizar un fragmento monovalente disminuye los riesgos de que se produzca una respuesta inmunitaria humoral que puede inducirse en determinadas ovejas.
EJEMPLO 5: MEDICIÓN IN VIVO DEL EFECTO POTENCIADOR DEL LIGANDO CF12 DE LA INVENCIÓN, SOBRE LA BIOACTIVIDAD DE LA FSH EN MONAS
Después de haber demostrado y caracterizado el efecto potenciador del anticuerpo monoclonal CF12 in vivo en ratas y ovejas, su efecto potenciador se estudió en una especie parecida a la humana: el mono Cinomolgo (Macaca fascicularis). Para ello, se realizó un estudio en monas púberas durante 36 meses, para evaluar el efecto potenciador del anticuerpo sobre la FSH humana (hFSH).
En los protocolos establecidos, el anticuerpo se inyectó en complejo con la hFSH (el anticuerpo se había incubado previamente con la FSH exógena), o se inyectó solo, 20 minutos después de una inyección de hFSH.
El primer día de la menstruación, las monas recibieron una inyección de 1,5 mg de preparación de GnRH de liberación prolongada (Décapeptyl® L.P. 3 mg - IPSEN Pharma) por vía intramuscular. Quince días después de la inyección de GnRH, las monas se trataron de acuerdo con diferentes protocolos. Solo se trató a una mona por protocolo.
Treinta y seis horas después de la última inyección de hFSH, se inyectaron 1000 UI de hCG (gonadotropina coriónica ENDO 5000 - MSD) en los animales. Los ovocitos se sometieron a punción mediante laparotomía 36 horas después de la inyección de hCG y se observaron al microscopio para evaluar su grado de madurez.
El efecto potenciador se analizó comparando el crecimiento folicular inducido (superficie de los folículos y amplitud de la secreción de estradiol) y el establecimiento de cuerpos lúteos de buena calidad (amplitud de la secreción de progesterona). Para ello, se realizaron ecografías de ovario transabdominales cada 48 horas para contar los folículos y medir su superficie (expresada en mm2). Las extracciones de sangre realizadas cada 48 horas desde el primer día de tratamiento hasta 30 días después de las punciones foliculares, permitieron realizar ensayos ELISA cuantitativos de estradiol (expresados en pg/ml) y progesterona (expresados en ng/ml).
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa informático GraphPad Prism Versión 5.0 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.).
1/ Efecto del ligando CF12 administrado solo después de la inyección de 25 UI de hFSH
El efecto potenciador de CF12 se evaluó primero sobre la hFSH. Para ello, se realizaron 3 protocolos clasificados de 1 a 3:
1- el animal se trató con una sola inyección de 25 UI de hFSH: una inyección de 25 UI de FSH humana (pluma precargada Gonal-f® - Merck Serono) por vía subcutánea, el primer día de tratamiento ("hFSH 25 UI X1").
2- el animal se trató con CF12 hFSH: una inyección de anticuerpo CF12 (400 |jg) 20 minutos después de una inyección de 25 UI de FSH humana (pluma precargada Gonal-f® - Merck Serono) durante 20 minutos, por vía subcutánea, el primer y quinto día de tratamiento ("hFSH 25 UI+CF12 X2")
3- el animal se trató con 25 UI de hFSH durante 8 días: una inyección diaria de 25 UI de FSH humana (pluma precargada Gonal-f® - Merck Serono) por vía subcutánea, durante 8 días ("hFSH 25 UI X8").
El efecto de los tres tratamientos se controló midiendo, mediante ecografía, el crecimiento folicular inducido (superficie de los folículos). En la figura 13A se ilustran los resultados obtenidos nueve días (D9) después de iniciar el tratamiento. En ellos se observa que, el día 9 después de iniciar el tratamiento con FSH, la mona tratada con una sola inyección de 25 UI de hFSH, no presentaba ningún folículo estimulado (área bajo la curva nula). En cambio, la mona tratada dos veces con la mezcla de CF12 400 jg+hFSH 25 UI, los días 1 y 5 de tratamiento, presentaba un área total de los folículos estimulados de 28 mm2 En las monas que recibieron 8 inyecciones de hFSH, el área total de los folículos estimulados fue de 35 mm2.
En la figura 13B se ilustran los resultados obtenidos once días (D11) después de iniciar el tratamiento. En ellos se observa que, la mona tratada dos veces con CF12+hFSH, presentaba un área folicular total de 29 mm2 con 6 folículos estimulados. Comparativamente, el área folicular medida en la mona que recibió 8 inyecciones de hFSH fue de 22,6 mm2 con 11 folículos estimulados. Por tanto, dos inyecciones de CF12400 jg+hFSH 25 UI, indujeron un mejor crecimiento folicular que 8 inyecciones de 25 UI de hFSH: 4,83 mm2/folículo frente a 2,05 mm2/folículo respectivamente. El efecto del complejo sobre el crecimiento folicular fue constante hasta el D11, a diferencia del tratamiento que comprendía 8 inyecciones de FSH para el cual se observó una disminución del área de los folículos estimulados. Este resultado pone de manifiesto un efecto potenciador de CF12 in vivo en monas, sobre la FSH circulante, ya sea endógena o exógena. En efecto, la semivida de la FSH es inferior a 1 hora, los efectos observados cuando se inyecta CF12 con 25 UI de hFSH los días 1 y 5 de tratamiento, no pueden atribuirse únicamente a un efecto sobre la FSH inyectada conjuntamente, sino que también reflejan un efecto sobre la FSH endógena de la mona. 2/ Efecto del ligando CF12 administrado solo después de la inyección de 37,5 UI de hFSH
A continuación, se estudió el efecto potenciador de CF12 inyectado solo de manera retardada después de la inyección de 37,5 UI de hFSH. Para ello, quince días después de la inyección de GnRH, se implementaron 4 protocolos clasificados de 1 a 4. Se trató una mona por protocolo:
1- el animal se trató con 37,5 UI de hFSH durante 12 días: una inyección diaria de 37,5 UI de FSH humana (pluma precargada Gonal-f® - Merck Serono) por vía subcutánea, durante 12 días ("hFSH 37,5 UI X12").
2- el animal se trató con 37,5 UI de hFSH todos los días y con 400 jg de CF12 cada 2 días: una inyección diaria de 37,5 UI de FSH humana (pluma precargada Gonal-f® - Merck Serono) por vía subcutánea, durante 12 días, y una inyección del anticuerpo CF12 a una dosis de 400 jg , cada 2 días, 20 minutos después de la inyección de hFSH ("hFSH 37,5 UI X12 400 jg de CF12 X6").
3- el animal se trató con 37,5 UI de FSH todos los días y con 70 jg de CF12 cada 2 días: una inyección diaria de 37,5 UI de FSH humana (pluma precargada Gonal-f® - Merck Serono) por vía subcutánea, durante 12 días, y una inyección del anticuerpo CF12 a una dosis de 70 jg , cada 2 días, 20 minutos después de la inyección de hFSH ("hFSH 37,5 UI X12 70 jg de CF12 X6").
4- el animal se trató con 75 UI de FSH durante 8 días: una inyección diaria de 75 UI de FSH humana (pluma precargada Gonal-f® - Merck Serono) por vía subcutánea, durante 8 días ("hFSH 75 UI X8").
El efecto de los cuatro tratamientos se controló midiendo, mediante ecografía, el crecimiento folicular inducido (superficie de los folículos de mm2). La figura 14 representa las superficies de los folículos estimulados obtenidas al final de cada tratamiento, el día de la punción folicular (D15). La intensidad de la estimulación folicular varió según el tratamiento. Fue máxima y muy sustancial en la mona que había recibido el tratamiento "hFSH 37,5 UI X12 70 jg de CF12 X6", para el que se midió una superficie de 387,5 mm2. Era 3,5 veces mayor que la superficie medida en la mona de control "hFSH 37,5 UI X12" que fue de 112,3 mm2 y 3,2 veces mayor que la superficie de 124,2 mm2 obtenida en la mona tratada con "hFSH 37,5 UI X12 400 jg de c F12 X6". El área más pequeña de los folículos (87,2 mm2) se obtuvo en la mona tratada durante 8 días con hFSH 75 UI.
La cantidad total de folículos obtenidos el día de la punción fue de 7 con "hFSH 37,5 UI X12 400 jg de CF12 X6" y "hFSH 75 UI X8" y de 10 con "hFSH 37,5 UI X12" y "37,5 UI X12 70 jg de CF12 X6" (Tabla 17).
Tabla 17: Variación del número de folículos estimulados de su tamaño tras los distintos tratamientos.
Figure imgf000022_0001
Cabe señalar que el tamaño del folículo más grande varía considerablemente entre los tratamientos. Por tanto, el tratamiento "37,5 UI X12 70 |jg de CF12 X6", indujo la formación de 5 folículos de más de 7 mm de diámetro (el mayor de los cuales tenía un diámetro de 9,15 mm), mientras que los restantes tratamientos solo indujeron folículos de menos de 7 mm.
La cantidad de ovocitos sometidos a punción fue de 11 ovocitos con "hFSH 37,5 UI X12 400 |jg de CF12 X6" y "hFSH 75 UI X8" y de 8 ovocitos con hFSH 37,5 UI X12. La mona tratada con hFSH 37,5 UI X12 70 jg de CF12 X6, mostró cuerpos lúteos jóvenes en los ovarios, lo que indica que ovuló espontáneamente antes del día de la punción.
Estos resultados demuestran un efecto potenciador muy sustancial de CF12 administrado a la dosis de 70 jg , lo que se traduce al mismo tiempo en un crecimiento folicular mucho mayor que el inducido por la FSH sola y en una respuesta ovulatoria muy estimulada y avanzada. La diferencia de la respuesta observada entre los tratamientos "hFSH 37,5 UI X12 400 jg de CF12 X6" y "hFSH 37,5 UI X12 70 jg de CF12 X6", también indica que el efecto potenciador ejercido por CF12 es dependiente de la dosis, induciendo la dosis de 70 jg la estimulación más fuerte de los ovarios.
El efecto de los cuatro tratamientos también se analizó y comparó midiendo la secreción de estradiol y progesterona cada 48 horas desde el primer día de tratamiento hasta 30 días después de las punciones foliculares.
Los resultados se ilustran en la figura 15, presentándose cada tratamiento mediante un gráfico (A-B-C-D) que muestra los perfiles de secreción de estradiol y progesterona obtenidos en cada mona a lo largo del ciclo.
Las monas tratadas con 37,5 UI de hFSH sola (figura 15A) o en combinación con un tratamiento de CF12 a 400 (figura 15B) y 70 jg (figura 15C), muestran perfiles de secreción de estradiol, todos ellos significativamente diferentes entre sí (**** p<0,0001, ANOVA bidireccional). El D9, la concentración es respectivamente de 157 pg/ml, 323 pg/ml y de 220 pg/ml, indicándose una mejor respuesta estrogénica con los tratamientos que se asocian a CF12. El D13, dos días antes de la punción de los folículos, la concentración de estradiol era respectivamente de 70 pg/ml (Fig.15A), 200 pg/ml (Figura 15B) y 1950 pg/ml (Figura 15C). Comparativamente, dos días antes de la punción folicular, en la mona tratada con hFSH 75 UI X8 (figura 15D), la concentración era de 395 ng/ml. Estos resultados demuestran un efecto potenciador muy significativo de CF12 sobre la respuesta estrogénica, lo que se traduce en un aumento del pico de estradiol en un factor de 3 con la dosis de 400 jg de CF12 y en un factor de 28 con la dosis de 70 jg de CF12, en comparación con el tratamiento de control con FSH sola. El pico de estradiol significativo observado el D13 en el caso del tratamiento "hFSH 37,5 UI X12 70 jg de CF12 X6" puede explicar la inducción de una ovulación temprana producida antes de la punción folicular.
Los perfiles de secreción de progesterona medidos, se tradujeron en un establecimiento de cuerpos lúteos de buena calidad. La comparación de las figuras 15A, 15B y 15C, muestran muy claramente el aumento dependiente de la dosis del nivel de progesterona en las monas tratadas con CF12 y FSH en comparación con la mona tratada solo con FSH. De tal manera que el D19, cuatro días después de la punción folicular, la concentración de progesterona era de 2,4 ng/ml solo con FSH (fig. 15A), de 14,5 ng/ml (X6) con CF12400 jg (Fig. 15B) para alcanzar 37 ng/ml (X15) con CF1270 jg (Fig. 15C). Por comparación, el nivel de progesterona medido 4 días después de la punción folicular en la mona tratada solo con FSH a 75 UI X8 era de 1,5 ng/ml (Fig. 15D) y, desde el punto de vista estadístico, era diferente al del tratamiento con 37,5 UI X12. Por el contrario, los tratamientos con CF12 400 jg y 70 jg indujeron niveles de progesterona diferentes desde el punto de vista estadístico a los de los tratamientos solo con FSH (**** p<0,0001, ANOVA bidireccional).
Estos resultados demuestran muy claramente un efecto potenciador de CF12 sobre la progesteronemia, lo que se traduce en una mejor calidad de los cuerpos lúteos en las monas que han recibido el anticuerpo. El importante papel de la progesterona en la preparación del endometrio, la implantación y el desarrollo temprano del embrión, la convierte en un activo importante en las especies animales y para su aplicación en las mujeres.
Dada la muy corta semivida de la FSH (inferior a una hora), todos los resultados (con 25 o 37,5 UI de hFSH) confirman que el anticuerpo CF12 es capaz de ejercer un efecto potenciador in vivo sobre la FSH circulante, ya sea endógena o exógena. Los efectos más significativos observados en la mona tratada con 70 jg de anticuerpo, están de hecho asociados a una acción "prolongada" del anticuerpo sobre la hormona endógena de la mona.
Con estos resultados, los autores de la invención también demostraron que el anticuerpo CF12 podría conducir a la implementación un nuevo tratamiento de inducción de la ovulación en el ámbito clínico humano, particularmente en tratamientos de PMA, si inducir la monoovulación en el contexto de la inseminación artificial o la poliovulación en el contexto de la fecundación in vitro (FIV) definiendo una dosis adecuada.
EJEMPLO 6: PREDICCIÓN DEL EPÍTOPO RECONOCIDO POR EL LIGANDO CF12 DE LA INVENCIÓN Y PREDICCIÓN DE SU PARÁTOPO.
El epítopo del anticuerpo CF12 se determinó en hormonas gonadotrópicas de diferentes especies utilizando un algoritmo de acoplamiento de proteínas basado en un modelo de la estructura de proteínas mediante un diagrama de Voronoí y una optimización mediante diferentes métodos de aprendizaje evolutivo de las funciones de puntuación para diferenciar entre conformaciones nativas y no nativas (Bernauer et al., Bioinformatics 2007, 5:555) [14], (Bernauer et al., Bioinformatics 2008, 24:652) [15], (Bourquard et al., PLoS One 2011,6:e18541) [16] y (Bourquard et al., Sci. Reports 2015, 5: 10760) [17].
Cada anticuerpo se acopló con FSH humana (hFSH), LH humana (hLH), CG humana (hCG), FSH ovina (oFSH) y LH ovina (oLH), FSH porcina (pFSH) y LH porcina (pLH). Las estructuras cristalográficas de hFSH y hCG están disponibles en Protein Data Bank (PDB): 4MQW y 1QFW respectivamente. Se utilizó la estructura de la f Sh humana en complejo con el dominio extracelular del receptor de FSH humano (Fan y Hendrickson, Nature 2005, 433:269) [18]. Para otras hormonas (hLH, oFSH, oLH, pFSH y pLH), se produjeron modelos de homología y después se usaron para acoplamiento.
Al no disponer de la estructura 3D del anticuerpo CF12, el estudio se realizó a partir de secuencias de los fragmentos monovalentes VH y VL de CF12. Para ello, se realizaron modelos por homología de las partes variables. Los modelos de VH y VL se realizaron por separado, a partir de diferentes estructuras, y su orientación relativa se determinó a partir de la estructura que sirvió de soporte para el modelado de VH. Las estructuras utilizadas para los modelos de homología están disponibles en Protein Data Bank (PDB): 1PLV para VH de CF12 y 3TT1 para VL de CF12.
Los resultados del acoplamiento se ilustran en la figura 16. Parece que el ligando CF12 se acopla de manera similar a las siete hormonas diana. El epítopo está definido por varias regiones ubicadas de manera discontinua en las subunidades alfa y beta de las gonadotropinas estudiadas. El epítopo también se refiere a la secuencia His7-Cys8-Ser9-Asn10 del ectodominio del receptor de FSH humano. Por tanto, el epítopo del ligando CF12 es muy conformacional y está constituido al mismo tiempo por varias regiones de subunidades alfa y beta de la hormona y por una secuencia del receptor. Todas estas regiones discontinuas están espacialmente próximas en la conformación nativa de la hormona y de su receptor activado.
Los diferentes restos de la hormona y del receptor, implicados en la interfaz con el ligando CF12, se incluyen en los rectángulos de la Figura 16. Los dos restos señalados en gris en la subunidad alfa de hFSH están implicados en la interacción principal y, por tanto, tienen un papel importante en el reconocimiento de anticuerpo/antígeno: se trata del ácido glutámico en la posición 9 (Glu9) y de la fenilalanina en la posición 33 (Phe33) de la subunidad alfa de hFSH. Estos dos restos son idénticos y se reconocen en la secuencia de otras hormonas diana. Entre los otros restos de la subunidad alfa, implicados en la interfaz, se observa una región que comprende 9 restos incluyendo Glu9. Se trata del motivo Gln5-Asp6-Cys7-Pro8-Glu9-Cys10-Thr11-Leu12-Gln13.
En el epítopo también se observa la presencia de restos de arginina en la posición 35 (Arg35) y de ácido glutámico en la posición 56 (Glu56) espacialmente próximos en la hormona nativa. Estos dos restos fijan el extremo C-terminal de la subunidad beta, inmovilizando así el "cinturón de seguridad" alrededor de la subunidad alfa. Estos dos restos están presentes y se reconocen sistemáticamente en todas las hormonas diana. Desempeñan un papel importante en la estabilidad y bioactividad de la hormona. Por tanto, gracias a este mecanismo, la unión del anticuerpo sobre estos restos permitiría aumentar la estabilidad del dímero de FSH.
El ligando CF12 también reconoce los restos 100 a 102 y 108-109 del extremo C-terminal de la subunidad beta que constituye el cinturón de seguridad. El papel de este cinturón de seguridad ("seat belt") es estabilizar la asociación del dímero alfa/beta de la hormona, la unión del ligando CF12 sobre estos dos restos también ayudaría a asegurar el cierre del cinturón de seguridad, permitiendo así una mejor estabilidad del dímero, indispensable para la bioactividad de la hormona.
Otra característica del epítopo del ligando CF12 es la implicación de los restos 7 a 10 (His7-Cys8-Ser9-Asn10) de la región N-terminal del receptor de FSH humano en la interfaz reconocida por CF12. A través de este mecanismo, la unión del ligando CF12 también ayudaría a favorecer la interacción de la hormona sobre su receptor y provocaría el establecimiento de un efecto "potenciador".
La tabla 18, ilustra las diferentes regiones del parátopo del ligando CF12. La numeración utilizada es la de las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4.
Las dos cadenas VH y VL están implicadas en el reconocimiento de la hormona, por sus tres CDR y algunos restos de sus frameworks.
Para la interacción principal, el resto Glu9 de la subunidad alfa de hFSH es reconocido respectivamente por los restos Tyr102, Asp104 de la c Dr 3 de la cadena VH y por el resto Leu50 de la cadena VL. El resto Phe33 de la subunidad alfa es reconocido por los restos Ser31 y Tyr33 de la CDR1 de la cadena VH y por el resto Tyr52 de la CDR2 de la cadena VH.
T l 1 : E í P r l li n F12.
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Tabla 18: Diferentes regiones que constituyen el epítopo del ligando CF12 y las que constituyen su parátopo. Los restos implicados en la interacción principal se muestran en gris.
La interacción en los restos Arg35 y Glu56 de la subunidad alfa implica varios restos de la cadena VH. Los restos Ser30 de la CDR1 y Tyr52, Gly54-Thr55 de la CDR2, interaccionan con Arg35. El resto Tyr52 de la CDR2 también interacciona con Glu56 de la subunidad alfa.
La interacción en el extremo C-terminal de la cadena beta (cinturón de seguridad) implica varios restos de la cadena VH: los restos Ser30 de la CDR1, Gly54 de la CDR2 y Asp73-Thr74-Ser75 de la framework 3.
Solo la cadena VH también está implicada en el reconocimiento del ectodominio del receptor de FSH, particularmente su CDR1 con la Glicina en la posición 26 (Gly26), y, algunos restos del framework 1 (Gln1-Gly2-Gln3, Lys23-Thr24-Ser25) y del framework 3 (Ser75).
En conclusión, el ligando CF12 se caracteriza por el hecho de que reconoce un epítopo muy conformacional que implica a la subunidad alfa de la hFSH, formando la subunidad beta y particularmente su extremo C-terminal, el cinturón de seguridad, así como el ectodominio del receptor de FSH. La cadena VH está esencialmente involucrada en la interacción con el receptor y la cadena VL en la interacción con la hormona. Este epítopo permite al ligando CF12, por una parte, estabilizar la asociación del dímero de la hormona y, por otra parte, estabilizar la unión de la hormona a su receptor. Estos dos mecanismos son complementarios para dar lugar a una mejor interacción de la hormona sobre su receptor y podrían constituir las bases del efecto potenciador del ligando CF12 sobre las gonadotropinas.
EJEMPLO 7: CONSTRUCCIÓN, PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DIFERENTES FRAGMENTOS DEL LIGANDO CF12 DE LA INVENCIÓN.
Para evaluar su capacidad para potenciar la actividad biológica de la FSH ovina y humana, se construyeron diferentes fragmentos del anticuerpo CF12. Se produjo un fragmento que comprendía solo la cadena variable ligera denominado "VL CF12", un fragmento que comprendía solo la cadena variable pesada denominado "VH CF12" y un "scFv CF12 inverso" construido en un orden v L-VH inverso con respecto a la secuencia VH-VL de scFv CF12 (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11) de referencia descrita en el ejemplo 1, párrafo 4 de la presente invención.
1/ Construcción y producción de fragmentos de anticuerpo
ATG:Biosynthetics GmbH (Alemania) sintetizó los genes sintéticos que codifican los fragmentos VL CF12 y scFv CF12 inverso derivados del anticuerpo CF12. El scFv CF12 inverso está constituido por la fusión VL CF12 del scfv CF12-conector-VH CF12 del scFv CF12. Cada gen sintético se consigue mediante la fusión de la secuencia del plásmido pSW1 [7], comprendida entre el sitio HindIII y el final de la secuencia que codifica la proteína PelB y la secuencia de la proteína de interés a sintetizar (SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 31), flanqueada por el sitio de restricción Xhol. Las secuencias se insertan entre los sitios HindIII y XhoI del plásmido pSW1. Los codones se optimizaron para la expresión en E. coli.
El plásmido de expresión pSWIVH- CF12 se obtuvo por inserción, en el plásmido pSW1 [7] en los sitios Pstl-Xhol, del fragmento resultante de la digestión por estas mismas enzimas del plásmido pSW1 scFv CF12 inverso.
Después de un control de la calidad de secuenciación de las construcciones, los plásmidos pSW1-VL CF12, pSW1-VH CF12 y pSW1 scFv CF12 inverso, se transformaron por choque térmico en bacterias HB2151 (T53040, Interchim, Francia) que se volvieron competentes [8].
Tabla 19: Secuencias nucleotídica e tídica de VL CF12
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Tabla 20: Secuencias nucleotídica e tídica de VH CF12
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Tabla 21: Secuencias nucleotídica y peptídica de scFv CF12 inverso
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La producción de los fragmentos se realizó según el método descrito anteriormente en el ejemplo 1 de la presente invención.
2/ Medición in vitro del efecto de los fragmentos VL CF12, VH CF12 y scFv CF12 inverso sobre la bioactividad de la FSH
El efecto in vitro de los fragmentos "VL CF12", "VH CF12" y "scFv CF12 inverso", sobre la bioactividad de la FSH humana, se estudió con la línea celular HEK293 transfectada de manera estable con el receptor de FSH humano y el sistema Glosensor® según el protocolo descrito anteriormente en el ejemplo 2 de la presente invención. Cada uno de los fragmentos "VL CF12" y "VH CF12", se analizó solo o en mezcla a una concentración de 40 nM. El scFv CF12 inverso se analizó a la concentración de 80 nM al igual que el scFv CF12 de referencia. La FSH humana se analizó a 0,1 nM.
La figura 17 ilustra las curvas de cinética de producción de AMPc expresadas en unidades relativas de luminiscencia en función del tiempo (en minutos) obtenidas en presencia de 0,1 nM de FSH humana (hFSH) sola o en complejo con diferentes fragmentos de CF12. Se compararon cuatro condiciones con la hFSH sola: el complejo hFSH+ VL CF12 (figura 17A), el complejo hFSH+VH CF12 (figura 17B), el complejo hFSH+scFv CF12 inverso (figura 17C) y el complejo de la hFSH, con una mezcla equimolar de 40 nM de VL CF12 y 40 nM de VH CF12 (figura 17D). Los niveles de respuesta luminiscente se compararon con 40 mn de estimulación.
Se observa que el fragmento "VL CF12", a la concentración de 40 nM en complejo con hFSH 0,1 nM, ejerce un efecto potenciador muy significativo (p<0,001) que aumenta la respuesta celular en un 218 % comparable al scFv CF12 (aumento de 180 %) en comparación con la estimulación con la hFSH sola (figura 17A). El fragmento "VH CF12", a la concentración de 40 nM en complejo con hFSH 0,1 nM, ejerce un efecto potenciador muy significativo (p<0,001) aumentando la respuesta celular un 250 % de manera más sustancial que el scFv CF12 (aumento de 180 %) en comparación con la estimulación con la hFSH sola(figura 17B).
El scFvCF12 inverso (figura 17C) potencia la acción de la FSH de la misma manera de la que lo hace el scFv CF12 de referencia, dando ambos un aumento de 180 % en la señal de luminiscencia, en comparación con la respuesta de la FSH; este efecto es significativo (p<0,001).
Finalmente, la mezcla de dos fragmentos VH CF12 VL CF12 (figura 17D) en complejo con la hFSH, induce un aumento significativo (p<0,001) de 278 % de la respuesta celular, más sustancial que el de scFv CF12 de referencia (aumento del 180%).
Todos estos resultados indican que los fragmentos VL o VH aislados son capaces de ejercer un efecto potenciador sobre la bioactividad de la FSH. Por esta razón validan la predicción del modelo de interacción, descrito en el ejemplo 6 de la presente invención, mostrando la implicación de las dos cadenas variables en la interacción sobre el complejo FSH/receptor. En este ensayo, la mezcla de los dos fragmentos, VL y VH, ejerce el efecto potenciador más sustancial.
3/ Medición in vivo del efecto potenciador de los fragmentos VL CF12, VH CF12 y scFv CF12 inverso, sobre la bioactividad de FSH en ratas
Después de su caracterización in vitro, se estudió el efecto potenciador in vivo de los diferentes fragmentos de CF12 sobre la bioactividad de la hFSH, en ratas hembra.
Para medir la bioactividad de FSH, el protocolo utilizado fue el del ensayo biológico de Steelman y Pohley (Steelman SL, Pohley FM. Endocrinology, 53:604-616. 1953) [12] como se describe en el ejemplo 3 de la presente invención. Cada lote comprendía 5 ratas.
Los resultados se ilustran en la figura 18. El lote tratado con la hFSH en complejo con scFv CF12 inverso, dio un peso medio de los ovarios de 195 ± 15 mg/100 g de peso corporal, ligeramente superior a la del lote tratado con el complejo hFSH/scFv CF12 de referencia (160 ± 5 mg), es decir, un aumento de 175 % en comparación con el lote que recibió el tratamiento hormonal solo (p<0,01). Los lotes tratados con los fragmentos VL CF12 o VH CF12 en complejo con la hFSH, tuvieron un peso medio de los ovarios de 186 ± 24 mg y de 237 ± 15 mg, respectivamente, es decir, un aumento de 167 % y 213 % en comparación con el lote que recibió el tratamiento hormonal solo (p<0,05 y p<0,001).
Estos resultados demuestran que el orden de construcción de scFv (VL-VH frente a VH-VL) en complejo con la hFSH, no afecta a las propiedades potenciadoras de scFv sobre la bioactividad de la FSH. Los resultados también demuestran de manera muy significativa que las cadenas variables de CF12, particularmente el fragmento VL, son capaces de potenciar, tanto in vivo como in vitro, la bioactividad de la hormona. Esto refleja la implicación respectiva de las dos cadenas en este efecto según lo predicho por el modelo de interacción descrito en el ejemplo 7 de la presente invención.
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15- Bernauer et al., Bioinformatics, 24:652, 2008
16- Bourquard et al., PLoS One, 6:e18541, 2011
17- Bourquard et al., Sci. Reports, 5:10760, 2015
18- Fan y Hendrickson, Nature, 433:269, 2005.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Ligando de la hormona foliculoestimulante (FSH) que potencia la bioactividad de la FSH, de la hormona luteinizante (LH) y de la gonadotropina coriónica (CG), caracterizado por que dicho ligando es un anticuerpo o un fragmento del mismo y por que:
el dominio variable de la cadena pesada contiene las siguientes CDR:
- VH-CDR1, definida por la secuencia GFTFSSSY (SEQ ID NO: 5);
- VH-CDR2, definida por la secuencia IYAGTGGT (SEQ ID NO: 6);
- VH-CDR3, definida por la secuencia ARHGSYFDY (SEQ ID NO: 7); y
el dominio variable de la cadena ligera contiene las siguientes CDR:
- VL-CDR1, definida por la secuencia QSVDYDGDSY (SEQ ID NO: 8);
- VL-CDR2, definida por la secuencia AAS;
- VL-CDR3, definida por la secuencia QQSNEDPYT (SEQ ID NO: 9).
2. Ligando de la hormona foliculoestimulante (FSH) que potencia la bioactividad de la FSH, de la hormona luteinizante (LH) y de la gonadotropina coriónica (CG), caracterizado por que dicho ligando es un anticuerpo o un fragmento del mismo y por que:
el dominio variable de la cadena pesada contiene la secuencia SEQ ID NO: 2 o 30; y/o
el dominio variable de la cadena ligera contiene la secuencia SEQ ID NO: 4 o 28.
3. Ligando según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que el ligando se elige del grupo constituido por: Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, dominio variable de la cadena pesada y dominio variable de la cadena ligera.
4. Ligando según la reivindicación 1, caracterizado por que el ligando es el anticuerpo monoclonal CF12 producido por el hibridoma CNCM I-4803.
5. Ligando según la reivindicación 1, caracterizado por que la secuencia peptídica del scFv es la secuencia SEQ ID NO: 11.
6. Ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso como medicamento.
7. Complejo ligando-gonadotrofina elegido entre:
un complejo de un ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con la FSH o un péptido activo de la misma;
un complejo de un ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con la LH o la hormona gonadotropina coriónica (CG) o un péptido activo de las mismas.
8. Complejo según la reivindicación 7, para su uso como medicamento.
9. Ligando para su uso según la reivindicación 6 o complejo para su uso según la reivindicación 8, en donde dicho medicamento está destinado a inducir la ovulación o una poliovulación en un mamífero hembra.
10. Ligando para su uso según la reivindicación 6 o complejo para su uso según la reivindicación 8, en donde dicho medicamento está destinado a aumentar el nivel de progesterona endógena circulante en un mamífero hembra.
11. Composición farmacéutica destinada a su uso para la inducción de la ovulación o de una poliovulación en un mamífero hembra, caracterizada por que comprende un ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y/o un complejo según la reivindicación 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada por que comprende además una FSH y/o una LH y/o una CG.
13. Ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o complejo según la reivindicación 7, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la infertilidad o de la hipofertilidad en un mamífero.
14. Ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o complejo según la reivindicación 7, para su uso para estimular la procreación en un mamífero hembra.
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