CN107108732A

CN107108732A - 增强促性腺素的生物活性的配体

Info

Publication number: CN107108732A
Application number: CN201580061187.9A
Authority: CN
Inventors: 埃洛迭·卡拉; 杰里米·德库尔蒂耶; 索菲·卡斯特雷; 马里-克里斯蒂内·莫雷尔
Original assignee: Repropharm SA
Current assignee: Ruipuao pharmaceutical company VET
Priority date: 2014-09-10
Filing date: 2015-09-10
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2035-09-10
Also published as: AU2015314029C1; HUE053100T2; CA2960120A1; EP3191514A1; IL250978B2; BR112017004739B1; EP3191514B1; US20170190773A1; KR102072650B1; LT3191514T; WO2016038308A1; SI3191514T1; PT3191515T; HRP20200969T1; FR3025517A1; JP6705608B2; CA2960132C; RS61358B1; JP6649385B2; ES2845674T3

Abstract

本发明涉及针对促卵泡激素(FSH)并且能够增强促性腺素的生物活性的抗体。

Description

增强促性腺素的生物活性的配体

技术领域

本发明具有其主要在人和兽医学中的应用，用于在雌性哺乳动物中诱导排卵。

在下面的描述中，方括号([])之间的引用是指在文本末尾出现的参考文献列表。

背景技术

促性腺素(或促性腺素)是复杂的糖蛋白激素，其通过对性腺(卵巢和睾丸)的功能起作用而在脊椎动物繁殖的调节中发挥中心作用。这些激素中的以下两种在所有脊椎动物中均分泌：促黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)。在两组哺乳动物中，马科和灵长类的成员还存在由胎盘分泌的绒毛膜促性腺素(CG)：人类绒毛膜促性腺素(hCG)和马绒毛膜促性腺素(eCG)，两者均通过LH受体发挥作用。

促黄体生成素(LH)由垂体前叶的促性腺细胞在GnRH刺激下产生，GnRH本身由下丘脑产生。LH刺激雄性中的睾酮产生，并且LH参与雌性卵巢周期的变更，其中LH负责终末卵泡生长和排卵，并由此负责将破裂的排卵卵泡转化为黄体。在月经周期的黄体期期间，LH通过黄体刺激孕酮分泌，这对于胚胎的早期发育和着床是必需的。LH由一种或相同种的所有糖蛋白激素共有的α亚基(如FSH、CG和促甲状腺激素TSH)以及负责激素活性的特异性的β亚基组成；只有当两个亚基非共价地连接为二聚体形式时才存在活性。

促卵泡激素(或FSH)是由前垂体在下丘脑产生的GnRH的刺激下产生的。在雄性中，促卵泡激素刺激对精子发生至关重要的塞尔托利细胞(Sertoli cell)。在雌性中，促卵泡激素通过刺激颗粒细胞的FSH受体而负责招募未成熟的原始卵泡、负责它们的生长并且负责它们向排卵前卵泡的分化。FSH由两个亚基α和β组成并且具有类似于LH的结构。仅有二聚体能够刺激FSH受体。

在雌性中，LH和FSH水平是周期性的：在休情期(sexual rest)或排卵期外非常低，在排卵前期具有分泌峰。

促性腺素用于兽医和人类药物中以诱导雌性哺乳动物排卵。虽然有效，这些治疗因为使用从生物流体(血液、尿)或从组织(垂体腺)提取的激素而存在健康风险，特别是在兽医领域。从妊娠母马的血液提取的马绒毛膜促性腺素(eCG)以及从猪垂体腺提取的猪LH和FSH即为这种情况。在兽医领域，还使用从怀孕妇女的尿液中提取的hCG(MSD实验室)。

在人类临床领域且特别是辅助生殖技术(或ART)领域，使用从绝经妇女的尿液中提取的激素，如(Laboratoire Genévrier)(为纯化的FSH)和(Ferring Pharmaceuticals实验室)(为hMG(人绝经促性腺素))、FSH和LH的混合物以及绒毛膜促性腺素Endo5000(为纯化的hCG)(Schering-Plough实验室)。还使用重组人FSH，如(Merck Serono实验室)和(Merck Schering-Plough实验室)；以及重组hCG和LH，如和(Merck Serono实验室)。

此外，重复使用这些激素通常引起中和激素作用的免疫反应，由此导致治疗功效降低。然而，在某些情况下已证明，当共同给予时，免疫反应可以产生能够增强激素活性的抗体(专利EP 1 518 863)[1]。自此，还已经证明了能够增强其作用的三种抗LH的单克隆抗体，并且它们中的两者能够增强FSH的作用(国际申请WO 2012/066519)[2]。

发明内容

本发明人现在已经获得了针对FSH的β亚基产生的单克隆抗体，其能够增强FSH的作用并且还能够增强LH以及hCG的作用。

这些单克隆抗体被分别称为CA5和CH10。

根据布达佩斯条约，将产生的CA5抗体的杂交瘤于2013年10月3日保藏于CNCM(国家微生物保藏中心，巴斯德研究院，法国巴黎15区鲁大夫25街75724)，保藏号为CNCM I-4801。

根据布达佩斯条约，产生CH10抗体的杂交瘤于2013年10月3日保藏于CNCM(国家微生物保藏中心，巴斯德研究院，法国巴黎15区鲁大夫25街75724)，保藏号为CNCM I-4802。

已经确定了抗体CA5和CH10中的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列，并且推导出了相应的肽序列。它们分别呈现于下表1和表2中。

表1

表2

从上述CA5和CH10抗体的重链(VH-CDR)和轻链(VL-CDR)的可变区的序列，确定编码CDR(互补性决定区)的序列。已经推导出了相应的肽序列并且分别呈现于下表3和表4中。

表3

表4

本发明的主题是促卵泡激素(FSH)配体，该配体增强FSH、促黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺素(CG)的生物活性，特征在于其包含抗-FSHβ-亚基抗体的互补位。

对于本发明的目的，术语“抗-FSHβ-亚基抗体”旨在表示通过基于FSH的初次注射后，再通过注射FSHβ-亚基的多次加强来对动物进行免疫而获得的任何抗体。所述注射可以使用来自各种哺乳动物(例如绵羊、人、牛、山羊或猪、马、犬、鼠等)的FSH、同源或异源起源的FSH、以及同源或异源起源的FSH的β-亚基来进行。因此，CA5和CH10单克隆抗体是按照使用绵羊FSH和绵羊FSHβ-亚基的免疫法获得的。

特别地，本发明的主题由此是根据本发明的配体，其特征在于，：

重链可变结构域(可变区，variable domain)含有下列CDR：

-由序列GFTFSDFY(SEQ ID NO:9)限定的VH-CDR1；

-由序列SRNKAKDYTT(SEQ ID NO:10)限定的VH-CDR2；

-由序列ARDARFAY(SEQ ID NO:11)限定的VH-CDR3；并且

轻链可变结构域含有下列CDR：

-由序列QSLLYSSNQKNY(SEQ ID NO:12)限定的VL-CDR1；

-由序列WAS限定的VL-CDR2；

-由序列QQYYSYPRT(SEQ ID NO:13)限定的VL-CDR3。

特别地，本发明的主题由此是根据本发明的配体，其特征在于：

重链可变结构域含有下列CDR：

-由序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:14)限定的VH-CDR1；

-由序列IRSKSNNYAT(SEQ ID NO:15)限定的VH-CDR2；

-由序列VRQDYYGSSYFDY(SEQ ID NO:16)限定的VH-CDR3；并且

轻链可变结构域含有下列CDR：

-由序列QSISDY(SEQ ID NO:17)限定的VL-CDR1；

-由序列YAS限定的VL-CDR2；

-由序列QNGHSFPYT(SEQ ID NO:18)限定的VL-CDR3。

对于本发明的目的，术语“CDR”意指抗体的重链和轻链可变区的三个高变区，它们构成互补位的元素并且使得可以确定抗体与抗原表位的互补性。这三个高变区由构成“框架”区(FR)的四个恒定区构成并且给予可变结构域以稳定的构型。

例如，根据本发明的配体是：

-由CNCM I-4801杂交瘤产生的CA5单克隆抗体；

-由CNCM I-4802杂交瘤产生的CH10单克隆抗体；

-Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dsFv或scFv片段或上述抗体的纳米体。优选地，其为Fab片段或scFv片段；

-分别为两个、三个或四个scFv片段的二价、三价或四价形式(双抗体、三抗体、四抗体)；

-重组抗体，其包含上述抗体的互补位，并且其该抗体恒定区已被修饰以使针对其使用的动物或人的免疫原性最小化。例如，其是嵌合的(人源化的、绵羊源化的、山羊源化的、牛源化的、猪源化的等)或完全人源化的、绵羊源化的、山羊源化的、牛源化的、猪源化的抗体。

作为非限制性的实例，已经确定了来源于CA5和CH10抗体的scFv的核苷酸序列，并且推导出了相应的肽序列，它们分别呈现于下表5和表6中。

表5

表6

本发明的还一个主题是编码根据本发明的配体的核苷酸序列。

本发明的还一个主题是重组载体，特别是表达载体，其包含根据本发明的核苷酸序列。

本发明的还一个主题是宿主细胞，其包含根据本发明的核苷酸序列或根据本发明的重组载体。例如，其是CNCM I-4801杂交瘤和CNCM I-4802杂交瘤，或者是使用本发明的核苷酸序列或重组载体转化的细胞。

本发明的还一个主题是一种用于产生根据本发明的配体的方法，其特征在于，包含在适合的培养基中培养本发明的宿主细胞，以及从培养物中回收配体。

本发明人已经证明，CA5抗体强烈地增强猪的、绵羊的和牛的FSH，并且虽然显著但在较小程度上增强人FSH。此外，本发明人已经证明，来源于CA5和CH10抗体的scFv与scFv所来源的抗体具有相同的结合和增强性质。

本发明的还一个主题是根据本发明的抗体，其被用作药物，特别是用于增强FSH、LH和绒毛膜促性腺素(CG)的生物活性，以在雌性哺乳动物中诱导排卵并且在雄性或雌性哺乳动物中减少激素依赖性不育或低生育力问题。

本发明的还一个主题是由配体和促性腺素或其活性肽形成的复合物，活性肽能够结合配体，并且其活性能够被配体增强。例如，其是配体与LH、绒毛膜促性腺素(CG)或FSH或所述激素的活性肽形成的复合物，所述FSH提取自生物组织或流体或是重组体，所述激素的活性肽能够结合配体并且其活性能够被配体增强。

本发明的还一个主题是根据本发明的配体或复合物，其被用作药物，特别是用于增强FSH、LH和绒毛膜促性腺素(CG)的生物活性，以在雌性哺乳动物中诱导排卵或甚至多排卵，或者在雄性或雌性哺乳动物中减少激素依赖性不育或低生育力问题。药物使得可以增加雌性哺乳动物中由一种或多种黄体分泌的循环内源性孕酮的水平，由此促进早期胚胎发育和降低堕胎的风险。

本发明的还一个主题是生产肉类的方法，其中所述方法包含将本发明的配体和/或复合物给予至非人类的雌性哺乳动物。

本发明的还一个主题是本发明的配体和/或复合物用于治疗哺乳动物中的激素依赖性不育或低生育力。在雌性哺乳动物患有不育或低生育力的情况下，本发明的配体或复合物的给予交使得能够刺激自然的、医疗辅助生殖或人工生殖。应当注意的是，向健康雌性哺乳动物给予本发明的配体或复合物还使得在自然或人工生殖的背景下能够引发排卵。

对于本发明的目的，术语“激素依赖性不育/低生育力”意指由于激素不足引起的不育/低生育力，例如，由于外部原因(例如，杀虫剂)或内部原因(例如，垂体或下丘脑功能不全，或者由于LH、FSH或CG受体或促性腺素的异常导致的对LH和/或FSH的性腺接受的问题，例如受体突变或多态性)引起的低循环浓度的FSH和LH或这些激素的缺乏。

本发明的配体和复合物可用于人或动物，特别是绵羊、牛、山羊、马、猪、鼠、犬、骆驼等科的成员。

根据本发明的配体、激素或复合物可以通过注射(例如，肌内、静脉内、腹膜内、皮下、经皮、皮内、眶内、眼内或眼部注射)或通过经眼途径单独给予、依次给予或联合给予，而不会改变它们的增强作用。

本发明的还一个主题是一种药物组合物，其包含本发明的配体或复合物以及药学上可接受的载体。药物组合物还可以包含FSH和/或LH和/或绒毛膜促性腺素(CG)激素。

通过阅读由作为说明而给出的附图所示的以下实施例，本领域技术人员还可以想到其它优点。

附图说明

图1示出了在牛颗粒细胞上，CA5(A)和CH10(B)单克隆抗体对绵羊FSH(oFSH)的生物活性的体外增强作用。

图2示出了在使用人FSH受体稳定转染的HEK 293细胞系上，CA5(A)和CH10(B)单克隆抗体对绵羊FSH(oFSH)的生物活性的体外增强作用。

图3示出了在使用人类FSH受体和载体稳定转移的HEK 293细胞系上，CA5单克隆抗体对绵羊FSH(oFSH)的生物活性的体外增强作用。

图4示出了在使用人类FSH受体和载体稳定转染的HEK 293细胞系上，CA5单克隆抗体对猪FSH(pFSH)的生物活性的增强作用。

图5示出了在使用人类FSH受体和载体稳定转染的HEK 293细胞系上，CA5单克隆抗体(A至E)以及CA5 scFv(F)对人类FSH(hFSH)的生物活性的体外增强作用。

图6示出了在使用人FSH受体和载体稳定转染的HEK 293细胞系上，CH10单克隆抗体对绵羊FSH(oFSH)的生物活性的体外增强作用。

图7示出了在使用人FSH受体和载体稳定转染的HEK 293细胞系上，CH10单克隆抗体在体外对人FSH(hFSH)的生物活性的增强作用。

图8示出了在雌性大鼠中，CA5单克隆抗体对绵羊FSH(oFSH)的生物活性(A)和对人FSH(hFSH)及的生物活性(B)的体内增强作用。

图9示出了在雌性大鼠中，CA5单克隆抗体对人FSH(hFSH)的生物活性的体内增强作用(A)以及CA5 scFv对人FSH(hFSH)(A)、和(B)的生物活性的增强作用。

图10示出了在雌性大鼠中，CH10单克隆抗体对绵羊FSH(oFSH)的生物活性(A)以及对人FSH(hFSH)的生物活性(B)的体内增强作用。

图11示出了在雌性大鼠中，CH10单克隆抗体对人FSH(hFSH)和的生物活性的体内增强作用(A)以及CH10scFv对人FSH(hFSH)的生物活性的增强作用(B)。

图12示出了在雄性大鼠中，CA5单克隆抗体对人绒毛膜促性腺素(hCG)和Endo 5000的生物活性的体内增强作用。

图13示出了在雄性大鼠中，CH10单克隆抗体对人绒毛膜促性腺素(hCG)和Endo的生物活性的体内增强作用。

图14示出了在母羊中，在发情期结束时，CA5单克隆抗体对内源性促性腺素的生物活性的体内增强作用。

图15示出了在母羊中，在发情期期间，CA5单克隆抗体对内源性促性腺素的生物活性的体内增强作用。

图16示出了在小母牛中，单独注射的CA5单克隆抗体对内源性促性腺素的体内增强作用：对雌二醇分泌的影响。

图17示出了在小母牛中，单独注射的CA5单克隆抗体对内源性促性腺素的体内增强作用：对预排卵LH峰的特征的影响。

图18示出了在小母牛中，单独注射的CA5单克隆抗体对内源性促性腺素的体内增强作用：对孕酮分泌的影响。

图19示出了在雌性猴子中，在25IU的hFSH之后的单独注射的CA5单克隆抗体对卵泡生长的体内增强作用。

图20示出了CA5配体在hFSH、hCG、hLH、oLH、pLH、oFSH和pFSH激素上以及在人FSH受体上的构象表位。

图21示出了CH10配体在hFSH、hCG、hLH、oLH、pLH、oFSH和pFSH激素上以及在人FSH受体上的构象表位。

图22示出了CA5单克隆抗体的各种片段对绵羊FSH和人FSH的生物活性的体外增强作用。

图23示出了在雌性大鼠中，CA5单克隆抗体的各种片段对人FSH的生物活性的体内增强作用。

具体实施方式

实施例1：获得本发明的配体及其表征

1/小鼠免疫策略

注射全部在小鼠(Balb/C)的腹膜内进行。每种免疫策略使用五只小鼠。

对于CA5抗体和CH10抗体的小鼠免疫策略

使用100μg纯化的绵羊FSH与完全弗氏佐剂进行第一注射(D0)。然后根据以下顺序进行数次加强注射：

-D21和D44：100μg纯化的绵羊FSH与不完全弗氏佐剂；

-D134和D204：50μg绵羊FSHβ亚基与不完全弗氏佐剂；

-D217、D218和D219：30μg绵羊FSHβ亚基，不使用佐剂；

-D220：融合(fusion)。

2/分型

使用RD Biotech(参考号RDB 3255)出售的FastElysa分型试剂盒根据制造商的建议进行CA5和CH10抗体的分型。

CA5抗体是IgG2a类和Kappa同种型的免疫球蛋白。所获得的光密度(OD)值分别为0.335和0.371。

CH10抗体是IgM类和Kappa同种型的免疫球蛋白。所获得的光密度(OD)分别为0.2和0.124。

3/测序

由CNCM I-4801和CNCM I-4802杂交瘤分泌的CA5和CH10抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变部分的核苷酸序列，根据以下方案分别由它们的信使RNA(mRNA)确定。

使用RNA试剂盒(Macherey Nagel，德国)根据制造商的建议从细胞中提取RNA。通过在260nm下测量吸光度来估算纯化的RNA浓度，并且通过A260nm/280nm比率估算它们的品质，并且在琼脂糖凝胶上电泳迁移后目测。

然后，使用M-MLV酶(参考号M1701,Promega,USA)根据制造商的建议，使用低聚-dT₁₈作为引物，通过逆转录反应合成mRNA的互补DNA。

通过聚合酶链反应(PCR)根据以下方案进行第二条DNA链的合成：将下列物质加入到4μl的逆转录反应中，最终体积为50μl：反应缓冲液(1X最终浓度)、200μM每种dNTP、300nM正向和反向引物、1.25U的GoTaq聚合酶(参考号M3175,Promega,USA)。

对于轻链可变部分的扩增，使用了九种不同的引物对(MKRev2至8+MKC5For)，而对于重链可变部分的扩增，使用了三种不同的引物对(CA5:VHRev1+VHFor，CH10:VHRev1+MμCFor)。

表7：用于对CA5抗体的重链(VH)和轻链(VL)进行测序的引物的核苷酸序列

表8：用于对CA5抗体的重链(VH)和轻链(VL)的5’部分进行测序的引物的核苷酸序列

表9：用于对CH10抗体的重链(VH)和轻链(VL)进行测序的引物的核苷酸序列

表10：用于对CH10抗体的重链(VH)和轻链(VL)的5'部分进行测序的引物的核苷酸序列

所使用的PCR程序由以下组成：在95℃进行2分钟的初始变性，随后是30个循环以下各项：在95℃下变性30秒、在47℃下杂交30秒和在72℃下扩增1分钟，最后是在72℃进行5分钟的最后扩增。使用凝胶提取试剂盒(参考号28704，Qiagen GmbH，德国)对获得的PCR产物进行脱盐，然后使用pGEMT易载体(easy vector)质粒(参考号A1360,Promega,USA)进行连接以便用于转化细菌。将从各种细菌克隆提取的质粒DNA用于测序分析(Macrogen Europe，荷兰)。

随后，通过设计锚定在cDNA的前导序列中的特异性引物(Fw引物)来测定两种抗体的VH和VL的5’-末端核苷酸序列。通过先前获得的VL和VH序列之间的比对，以及IMGT/V-QUEST软件的数据库(Brochet et al.,Nucl.Acids Res.,36:W503-508,2008；Giudicelliet al.,Cold Spring Harb Protoc.,2011(6):695-715,2011)[3,4]，以及从IMGT/GENE-DB提取的目标前导序列(Giudicelli et al.,Nucl.Acids Res.,33:D256-261,2005)[5]，遵循同源性鉴定来设计这些引物。反向(Rev)引物是在先前测定的每种抗体的相应VH和VL序列中设计的。用于获得5’部分的方案与前面段落中描述的相同。

使用MultAlin软件从序列比对中推导出共有核苷酸序列(Corpet,Nucl.AcidsRes.,16(22):10881-10890,1988)[6]。使用IMGT/V-QUEST软件进行向多肽序列的转录和CDR的注释。结果呈现于表11至表14中。

表11：CA5抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变部分的核苷酸序列和肽序列

表12：CH10抗体的重(VH)和轻(VL)可变部分的核苷酸序列和肽序列

表13：CA5抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变部分的CDR

VH-CDR1(SEQ ID NO:9)	GFTFSDFY
		VH-CDR2(SEQ ID NO:10)	SRNKAKDYTT
VH-CDR3(SEQ ID NO:11)	ARDARFAY
		VL-CDR1(SEQ ID NO:12)	QSLLYSSNQKNY
VL-CDR2	WAS
		VL-CDR3(SEQ ID NO:13)	QQYYSYPRT

表14：CH10抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变部分的CDR

VH-CDR1(SEQ ID NO:14)	GFTFNTYA
		VH-CDR2(SEQ ID NO:15)	IRSKSNNYAT
VH-CDR3(SEQ ID NO:16)	VRQDYYGSSYFDY
		VL-CDR1(SEQ ID NO:17)	QSISDY
VL-CDR2	YAS
		VL-CDR3(SEQ ID NO:18)	QNGHSFPYT

4/scFv的构建、产生和表征

a/scFv抗体片段的构建

由ATG:Biosynthetics GmbH(德国)合成源自CA5和CH10的单链可变片段(scFv)的合成基因。

由重链可变部分和轻链可变部分(SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:3对于CA5；SEQ IDNO:5/SEQ ID NO:7对于CH10)的融合来设计各个序列，所述重链可变部分和轻链可变部分通过编码用于确保蛋白质功能的肽((Gly₄Ser)₃)的序列连接，并且其以编码His₆肽(HIS-标签肽)的序列结尾，His₆肽允许纯化scFv。为了使它们能够插入表达质粒，序列侧翼有PstI和SalI限制酶位点。根据需要，在VL的3’末端和SalI位点之间添加额外的序列以允许消除His₆肽。密码子被优化以用于在大肠杆菌中表达。下面详细地给出scFv合成基因的构建的图示：

在LacZ诱导型启动子的控制下，根据E.S.Ward et al.(Ward et al.,Nature,341:544-546,1989)[7]将抗体片段插入在pSW1表达质粒(ATG:Biosynthetics GmbH，德国)的PstI和XhoI酶促位点之间，pSW1表达质粒含有在阅读框中与重组抗体片段的基因相融合的PelB信号序列，该PelB信号序列允许合成的蛋白质运输到细菌周质。在周质中，该信号序列被肽酶消除。

在通过测序证实该构建体的质量后，将pSW1-CA5和pSW1-CH10质粒通过热冲击转化处于感受态的HB2151细菌(T53040,Interchim,France)(Li et al.,Afr.J.Biotechnol.,9(50):8549-8554,2010)[8]。

表15：CA5 scFv的核苷酸序列和肽序列

表16：CH10scFv的核苷酸序列和肽序列

b/重组抗体片段的产生

-细菌培养

在5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中制备预培养物，在37℃下过夜。第二天，将500μl该预培养物接种到500ml相同的培养基中，并在37℃下在150RPM下生长直到获得1.4的OD_600nm。通过加入0.1mM IPTG，在16℃在150RPM下历经16小时诱导scFv的合成。

-提取

在4℃下以4500g将培养基离心30分钟。制备物的其余部分在4℃下进行。为了提取细菌周质，将团粒再悬浮于10ml TES(0.2M Tris,pH 8,0.5M EDTA,0.5M蔗糖)中并且培育30分钟，然后向其中加入15ml稀释至1/4的TES，随后再培育30分钟。将细菌提取物在10000g下离心30分钟。将上清液相对于PBS透析过夜。立即处理经透析的上清液以纯化scFv或将其储存在-20℃下直至使用。

根据制造商的使用建议，使用抗-His-标签HRP抗体(参考号R93125LifeTechnologies，法国)通过蛋白质印迹分析周质中scFv的产生。

-纯化

在4℃下在5000g下将周质离心20分钟。在搅拌的同时，使用镍亲和凝胶(Sigma-Aldrich,MO,USA)在4℃将上清液培育1小时。使用0.05M pH8的含有0.3M NaCl的磷酸钠缓冲液洗涤凝胶，然后使用添加有20mM咪唑的同一缓冲液洗涤直到获得接近0的OD_280nm。然后使用0.05M pH8的含有0.3M NaCl和250mM咪唑的磷酸钠缓冲液洗脱scFv。将洗脱液相对于PBS透析过夜。将其存储在-20℃下。

-质量控制

在使用考马斯蓝染色之后，通过在15％的聚丙烯酰胺凝胶的电泳和在Sephadex^TM75 10/300GL柱(参考号17-5174-01GE Healthcare，德国)上的排阻色谱来分析纯化的scFv。

5/特异性

通过ELISA技术研究抗体及其scFv的特异性。所评估的每种激素是在0.1M碳酸钠缓冲液(pH 9.6)中以10μg/ml的浓度制备的，并且以100μl/孔的比例分布在ELISA板上。在+4℃下的吸附时间为18小时。洗涤5次后，在37℃下，用100μl补充有0.1％吐温和1％BSA的PBS将孔处理45分钟，然后将每种抗体或scFv以100μl/孔的比例进行分布，并且在37℃下培育1小时。在评估的每个激素上，抗体和scFv以各种浓度分布，对于抗体为10至250μg/ml，对于scFv为10至150μg/ml或200μg/ml。

洗涤5次后，偶联至过氧化物酶(HRP)的第二抗体以100μl/孔的比例分布，并在37℃下培育1小时。根据研究的单克隆抗体的同种型，第二抗体是抗-IgG1HRP(参考号115-035-205,Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc)、抗-IgG2a HRP(参考号115-035-206,Jackson Laboratories)或抗-IgM HRP(参考号115-035-075,JacksonLaboratories)。对于scFv，使用抗-His标签HRP(参考号R93125Life Technologies，法国)。洗涤五次后，通过以100μl/孔的比例分布的TMB显示酶活性。在环境温度下，显示时间为5至30分钟，这取决于反应速率。在使用1M H₂SO₄(50μl/孔)停止反应之后，使用用于ELISA板的分光光度计测量着色反应的强度(光密度)。

对于CA5和CH10抗体及其scFv，相对于利用绵羊FSH(oFSH)获得的值(认为是100％参考值)来计算交叉反应的百分比。通常通过比较利用抗体或scFv的浓度范围获得的剂量-响应曲线来计算交叉反应的百分比。在利用参考激素获得的曲线的基础上：

-令A为产生50％最大光密度(ED 50)的浓度。

在用另一种激素获得的曲线的基础上，

-令B为对应于与用于定义A的光密度值相同的光密度值的浓度。

交叉反应的百分比等于A除以B并乘以100：[(A/B)×100]。

-CA5抗体及其scFv的特异性

表17示出了CA5抗体与绵羊FSH的α-和β-亚基(s.u.)和人FSH的β-亚基的交叉反应的百分比：

表17

CA5	oFSH	α-s.u.oFSH	β-s.u.oFSH	β-s.u.hFSH
					交叉反应	100％	6％	80％	50％

CA5抗体几乎不识别绵羊α-亚基，但强烈地识别绵羊FSH的β亚基(80％)；它也与人FSH的β-亚基交叉反应，但不太强烈(50％)。其特异性是抗-FSHβ-亚基。

表18示出了CA5及CA5 scFv与猪FSH(pFSH)和各种人FSH的交叉反应的百分比：

表18

CA5抗体表现出对猪FSH和人FSH Gonal-F的强烈识别。它也显著地在61％至76％之间与其他人FSH交叉反应。CA5抗体识别在二聚体形式时能更好地测试的FSH，这倾向于指示针对构象表位的特异性。

CA5 scFv显著地识别pFSH(61％)且更弱地识别hFSH(Fostimon)和hMG(Menopur)。因为结合太弱，不能测量到(ND)另外两种人FSH上的交叉反应。如同整个抗体的结合，因此CA5 scFv的结合似乎依赖于激素的构象，构象可能在吸附到ELISA板的塑料上时被改变。

相对于猪LH(pLH)、绵羊LH(oLH)、牛LH(bLH)、eCG和hCG Chorulon和Endo 5000，评价了CA5 scFv的特异性。结果示于表19中：

表19

oLH

pLH

bLH

eCG

Chorulon

Endo 5000

CA5 scFv

25％

29％

33％

ND

10％

ND

CA5 scFv相对于动物LH的结合是显著的，具有处于35％至40％之间的交叉反应。相反，只有hCG Chorulon被微弱地识别(10％)。在吸附的另外两种hCG上的结合太弱，使得交叉反应不能被定量。考虑到体外和体内获得的CA5及其scFv对hCG活性的生物学作用，这些结果强化了对构象表位的特异性的假说(参见实施例2和3中的结果)。

通过在变性或非变性条件下，在5％聚丙烯酰胺凝胶上迁移的oFSH上培育CA5抗体，通过蛋白质印迹获得的结果加强了该假说。在非变性条件下仅识别了β-oFSH条带并产生了显著的信号。在变性条件下，在迁移的oFSH上没有观察到信号。

在饱和结合模型(“饱和结合实验模型”，GraphPad PRISM软件)中，使用“一个位点-特异性结合”函数计算scFv相对于所研究的各种FSH、LH和CG的解离常数Kd的估算值。获得的各种值示出在表20和21中。

表20

表21

由此估算的解离常数Kd的比较表明，CA5 scFv对绵羊和猪FSH具有更大的亲和力，其值分别为0.54和1.24μM。除了重组人FSH Gonal F(Kd 1.43μM)之外，CA5 scFv对人FSH表现出较低的亲和力(Kd为2.03至2.67μM)。与oFSH和pFSH相比，CA5scFv表现出对绵羊LH和猪LH的中等亲和力(Kd分别为1.95和2.47μM)。相对于hCG和eCG估算的Kd(Kd为3.14至4.07μM)表明，CA5 scFv对这些激素的亲和力较低。

-CH10抗体及其scFv的特异性

表22示出了CH10抗体与绵羊FSH的α-和β-亚基(s.u.)以及人FSH的β-亚基的交叉反应的百分比：

表22

CH10	oFSH	α-s.u.oFSH	β-s.u.oFSH	β-s.u.hFSH
					交叉反应	100％	43％	88％	40％

CH10抗体优先识别绵羊FSH的β亚基(88％)并且对人FSH的β亚基和绵羊α-亚基的识别为二分之一(40％和43％)。根据这些结果，CH10的特异性是抗-FSHβ-亚基，优选是抗-oFSHβ-亚基。其较低程度但并不是不显著地识别绵羊α-亚基，这与CA5抗体不同。所有这些结果可导向在两个亚基的连接区域上主要包括β和α的表位的假设。

表23示出了用猪FSH(pFSH)和各种人FSH获得的CH10和CH10 scFv的交叉反应的百分比：

表23

CH10抗体及其scFv表现出对动物FSH的强烈的识别且对人FSH的交叉反应为30至100％。

评价了CH10 scFv相对于猪LH(pLH)、绵羊LH(oLH)、牛LH(bLH)、eCG和hCGChorulon及Endo 5000的特异性。结果示于表24：

表24

oLH

pLH

bLH

eCG

Chorulon

Endo 5000

CH10 scFv

68％

63％

52％

ND

CH10 scFv与动物LH的结合是显著的，交叉反应为52％至68％。相反，在吸附的hCG和eCG上的结合太弱而不能对交叉反应定量。鉴于在体外和体内获得的CH10及其scFv在hCGChorulon和Endo 5000上的生物效应，这些结果强化了针对构象表位的特异性的假设(参见实施例2和3中的结果)。

在GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA,第5版)上，使用在饱和结合模型("饱和结合实验模型",GraphPad PRISM软件)中的“一个位点-特异性结合”函数计算CH10 scFv相对于所研究的各种FSH、LH和CG的解离常数Kd的估算值。所获得的值示于表25和26中。

表25

表26

由此估算的解离常数Kd表明了CH10 scFv对绵羊和猪FSH的亲和力(Kd为7.51和5.22μM)以及对人FSH Gonal F和Fostimon及hMG Menopur的亲和力(Kd分别为1.82、1.59和7.36μM)。所估算的相对于hCG和eCG的Kd(Kd为1.47至2.09μM)表明，与FSH相比，CH10scFv对于这些激素具有良好的亲和力。

实施例2：本发明的配体对FSH的生物活性的增强作用的体外测量

本发明的配体对FSH的生物活性的增强作用，通过比较用单独的FSH或用FSH/单克隆抗体(MAb)复合物刺激的各种细胞类型或细胞系所获得的生物学反应进行证明。

在每种情况下，获得的剂量-响应曲线的比较使得能够量化MAb对复合的FSH的生物活性的体外增强作用。使用Prism软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA,第5版)来进行结果的统计分析。

1/在牛颗粒细胞的原代培养物上

首先，在内源性表达牛FSH受体的牛颗粒细胞上表征CA5和CH10 MAb对绵羊FSH(oFSH)的生物活性的增强作用。

将CA5或CH10抗体的最终浓度为0.1μg/ml的杂交瘤上清液与范围在3ng/ml至25ng/ml的一系列绵羊或人FSH，在37℃下培育30分钟。

根据Chopineau et al.(Mol.Cell Endocrinol.,92(2):229-39,1993)[8]和Wehbi et al.(Endocrinology,151(6):2788-2799,2010)[9]描述的方案，通过在牛卵巢上卵巢穿刺直径范围为2至6mm的卵泡获取牛颗粒细胞。在存在48μg/ml IBMX(SigmaAldrich,France,参考号I5879)的条件下，根据上述方案，在37℃下通过搅拌，将悬浮在McCoy’s 5A培养基(Lonza,比利时,参考号BE12-688F)中的牛颗粒细胞(制备为每0.5ml有80 000个细胞)刺激3小时，其中单独的FSH或与单克隆抗体预复合的FSH的范围为3ng/ml至25ng/ml。测量的生物反应是cAMP分泌。

在离心后，使用ELISA试剂盒(Biomedical Technologies Inc.,MA,USA,BT-730)在培养物上清液中检测所产生的cAMP。

结果示于图1中。

结果显示，在绵羊FSH的活性上，cAMP分泌的放大，对于CA5为1.3倍，而对于CH10对于为5.5倍。通过双因素方差分析(双因素ANOVA,GraphPad PRISM软件)进行统计分析显示了显著的效果，对CA5为p<0.05(*)至p<0.01(**)，且对CH10为p<0.001(***)。

2/在用人FSH受体稳定转染的HEK 293细胞系上

在稳定表达人FSH受体的HEC 293细胞上测量MAb对各个物种的FSH的增强作用。该系统使得在单独用FSH或用FSH/MAb复合物在37℃下刺激1小时后可以测量FSH受体活化后的cAMP的产生。

对此，将60 000个细胞分布在96孔板(Becton Dickinson,NJ,USA,参考号353072)的孔中，并且在湿气氛中，在37℃、5％CO₂的条件下，在100μl含有10％FCS(Lonza,比利时,参考号DE14-801F)、1％青霉素/链霉素(Sigma Aldrich,France,参考号P-4333)和400μg/ml G418(Sigma Aldrich,France,参考号A1720)的MEM培养基(Ozyme,France,参考号BE12-611F)中培养24小时。在MEM培养基中历经2小时后，在37℃将细胞刺激1小时。回收培养物上清液并使用ELISA试剂盒(Biomedical Technologies Inc.,MA,USA,BT-730)进行测定。结果表示在终点处分泌的cAMP的量。使用Prism软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA,第5版)对它们进行分析。

图2示出了在使用人FSH受体稳定转染的HEK 293细胞上，CA5和CH10单克隆抗体对绵羊FSH(oFSH)的生物活性的体外增强作用。为此，使用范围为3ng/ml至32.5ng/ml的绵羊FSH来刺激细胞，或者在刺激细胞之前，使用在37℃下与单克隆抗体(最终浓度0.1μg/ml)预先培育30分钟的同样的FSH范围点来刺激细胞。双因素方差分析(双因素ANOVA,GraphPadPRISM软件)使得能够比较利用单独的FSH或以FSH/单克隆抗体复合物获得的剂量-响应曲线。CA5抗体对oFSH活性显示出在160％至200％范围内的增强作用；这种效果对于32.5ng/ml浓度的oFSH是显著的(p<0.05)。对于所有所测试的浓度，CH10抗体均发挥了对oFSH较大的增强作用，从3ng/ml点的225％(p<0.01)到10ng/ml点和33ng/ml点分别为260％(p<0.001)。

3/在使用人FSH受体和使用系统稳定转染的HEK 293细胞系上

在稳定表达人FSH受体和GloSensor^TM载体(Promega,France)的HEK 293细胞上实时测量了MAb对各种物种的FSH的增强作用。这种细胞系统使得在使用拮抗剂(单独的FSH或FSH/单克隆抗体复合物)刺激FSH受体后能够实时检测cAMP的产生。在cAMP结合在GloSensorTM蛋白质上之后，将GloSensor^TM底物(Promega,France,参考号E1291)水解，并且产生通过PolarStar Optima读出器(BMG Labtech,德国)测量的发光，表示为RLU(相对发光单位)。这一稳定系(stableline)是由INRA([法国国家农业研究所]中心,Val de Loire，37380Nouzilly，法国)的生物学和生物信息学的信号系统团队开发的，并且友好地提供用于这些测定。

为此，将HEK 293细胞以每孔80000个细胞的比例在透明底部白色96孔微量培养板(Dominique Dutscher，法国，参考号655903)上进行培养，并且在补充有10％FCS(Lonza，比利时，参考号DE14-801F)、1％青霉素/链霉素(Sigma Aldrich，法国，参考号P-4333)、200μg/ml潮霉素B(Life TechnologiesTM，法国，参考号10687010)和400μg/ml G418(SigmaAldrich，法国，参考号A1720)的MEM培养基(Ozyme，法国，参考号BE12-611F)中培养过夜。在100μl补充有1％BSA(PAA，法国，参考号K45012)并且含有4％GloSensor^TM底物的MEM培养基中，在环境温度下在黑暗中历经2小时后，将孔板放置在PolarStar Optima读出器中并且首先进行5分钟的读取以测量基础发光水平。然后将反从读出器中取出，向其中加入11μl配体(单独的FSH或FSH/单克隆抗体复合物)，以便获得指示的浓度。然后测量发射的发光约1小时30分钟。

使用Prism软件(GraphPad Prism Software Inc.,San Diego,CA,USA,第5版)分析所获得的结果。使用非线性函数"log(拮抗剂)相对于响应"绘制作为FSH浓度函数的响应曲线。这使得能够表征并且比较单独的FSH及与单克隆抗体复合的FSH的EC50。对于每个实例，通过双因素方差分析(双因素ANOVA,GraphPad PRISM软件)比较两条曲线的整体来测量FSH/增强抗体复合物的显著效果。

-CA5单克隆抗体

图3示出了在浓度为0-0.1-0.3-1和3nM的单独的绵羊FSH或与CA5抗体复合的FSH下，获得的作为时间(分钟)函数的以发光单位表示的cAMP产生动力学曲线。观察到在不具有FSH时，用单独的抗体“刺激的”细胞未显示出响应：发光信号保持在其基础水平(曲线3A)。单独的CA5抗体未发挥出对由HEK 293细胞表达的人FSH受体的激动剂或拮抗剂作用。相反，与oFSH复合的CA5单克隆抗体(最终浓度为6nM)非常显著地放大了激素的刺激活性。由此，在浓度为0.1和0.3nM的oFSH下观察到分别为350％和330％的最大细胞响应增加(曲线B和C)，以及在浓度为1和3nM的oFSH下观察到分别为230％和140％的最大细胞响应增加(曲线D和E)。因为细胞响应的饱和以及在这一情形下11000RLU的发光信号的饱和，随着oFSH浓度的升高(1和3nM)，增强作用的幅度降低。通过GraphPad Prism测量的EC50值，对于oFSH为2.36×10^-9M，并且对于oFSH/CA5复合物为2.83×10^-10M，反映出当FSH与CA5抗体复合时增加了一个单位的LogEC50(从10^-8.6到10^-9.54)。对于所有测试的oFSH剂量，oFSH与oFSH/CA5相比，两条曲线之间的差异是高度显著的(p<0.001)。

图4示出了在猪FSH上测量的CA5抗体的增强作用。当pFSH与CA5抗体(最终浓度为6nM)复合时，在0.03nM的pFSH下观察到了190％的最大响应增加，但是这种增加不显著。增强作用在0.1nM浓度的pFSH下达到了250％的增强作用(曲线B)并且是显著的(p<0.01)。使用0.03nM的与CA5复合的pFSH获得的响应水平相当于使用0.1nM单独的pFSH获得的响应水平(分别为500RLU和585RLU)，这意味着0.03nM pFSH/CA5复合物诱导了与3.3倍浓度(0.1nM；即0.5Log)的单独的pFSH相同的响应幅度。

最后，研究了CA5对重组人FSH(Gonal-F,Serono实验室)的活性的增强作用。图5示出了在使用浓度为0.03-0.1-0.2-0.3nM的单独的FSH或与CA5抗体(6nM)复合的FSH刺激期间获得的作为时间(分钟)函数的、表示为相对发光单位的cAMP产生动力学曲线。使用0.03nM hFSH浓度观察到了235％的增强作用，使用0.1和0.2nM的hFSH观察到了200％的增强作用，然后由于细胞体系的饱和(最大10530RLU)，以0.3nM的最高hFSH浓度观察到了170％的增强作用。通过GraphPad Prism计算的EC50显示，hFSH的值为5.86×10^-10M且hFSH/CA5复合物的值为1.36×10^-10M，反映出当FSH与CA5抗体复合时，LogEC50增加了0.63(从10^-9.23到10^-9.86)。还研究了CA5 scFv对0.01nM下的hFSH的生物活性的增强作用。在36nM的scFv浓度下，获得了160％的显著增加(p<0.01)(图5)。这种增加类似于二价整体CA5抗体的增加。该结果意味着单价片段具有与CA5抗体相同的FSH活性增强性质。

尽管显著(p<001)，但CA5抗体对人FSH生物活性的增强作用忍让小于对绵羊FSH生物活性的增强作用，对于绵羊FSH，在oFSH的EC50及oFSH/CA5复合物的EC50之间获得了一个Log单位的增加。

-CH10单克隆抗体

在绵羊FSH(oFSH)和人FSH(hFSH)(Gonal F,Serono实验室)上研究了CH10抗体的调节效果。

图6示出了CH10抗体(10nM)对制备为0.01-0.03和0.1nM浓度的oFSH生物活性的放大效应。在低浓度(0.01和0.03nM)时，使用oFSH/CH10复合物获得了细胞响应的185％的增加(曲线A和B)。在0.1nM的oFSH浓度下，使用oFSH/CH10复合物获得了312％的增加(曲线C)。这些增加是非常显著的(p<0.001)。

在制备为0.1nM至3nM的人FSH上测量了CH10(1.3nM)的增强作用(图7A和图7B)。观察到了从140％至150％范围内的适中但显著的增加(p<0.001)。通过GraphPad Prism测量的EC50值对于hFSH为2.85×10^-10M且对于hFSH/CH10复合物为3.17×10^-10M(图7C)。

更具体地，CH10对绵羊动物FSH发挥了增强作用。在人FSH上观察到的CH10抗体的效果较弱。

实施例3：在大鼠模型中，体内测量本发明配体对FSH和LH/CG的生物活性的增强作用

体外表征后，在雌性大鼠体内表征了每个单克隆抗体对FSH生物活性的增强作用，并且在雄性大鼠体内表征了它们对LH/CG生物活性的增强作用，它们也识别LH/CG。

为了测量FSH生物活性，所使用的方案是Steelman和Pohley(Steelman SL,PohleyFM.Endocrinology,53:604-616.1953)[12]描述的生物测定的方案。为了测量LH生物活性，所使用的方案是Scobey et al.(Scobey et al.,Reprod.Biol.Endocr.3:61,2005)[13]描述的测定的方案。

使用绵羊FSH和人FSH评估了抗体对FSH活性的影响。在两种hCG(人类绒毛膜促性腺素)制剂上评估了抗体对LH活性的影响。

使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA,第5版)进行统计分析。因为结果涉及对五只动物的批次进行的实验，所以应用非参数的单因素差分析(Kruskal Wallis检验)，随后进行Dunn校正，或应用非参数t检验(Mann-Whitney检验)。对于由汇编多个生物测定得到的较大数目(n>30)的结果，应用参数检验(非配对学生t检验)，随后进行Bonferroni校正。

1/在雌性大鼠中，抗体对FSH生物活性的增强作用

在绵羊FSH上以及在人类繁殖中使用的人FSH的各种制剂上研究了CA5和CH10抗体及其scFv的增强作用，制剂为Gonal-F和Puregon(分别是来自Merck Serono和MerckSchering-Plough实验室的重组FSH)以及Fostimon和Menopur(分别由实验室Genevrier和Merck Schering-Plough销售的提取FSH)。

如Steelman和Pohley的方案中所描述的，21天龄未成熟雌性大鼠连续三天在早晨和晚上各注射一次100μl hCG和FSH的混合物，该混合物包含添加有可变量的FSH的恒定量的hCG(3.5IU)，对于人FSH(Gonal F、Puregon、Fostimon、Menopur)，FSH的量为0.5至1.5IU，而对于绵羊FSH(提取激素)，FSH的量为0.5至2μg。皮下注射到颈部颈背中。每个实验包括最少四个批次：一个批次使用生理盐水(血清Φ)治疗，一个批次使用单独的抗体或scFv治疗，一个批次使用hCG+FSH混合物治疗，并且一个批次使用补充有2μg纯化的scFv抗体的hCG/FSH混合物治疗。

在用激素/抗体或scFv复合物治疗的情况下，在注射之前，将FSH+抗体混合物在37℃或环境温度下无差别地预孵育20分钟，然后加入到hCG中。在复合物的温育期间，hCG可以无差别地与FSH混合。

在第四天，对雌性大鼠称重，取卵巢、解剖，然后称重。结果表示为卵巢(毫克)/100克体重。卵巢重量的增加与注射的生物活性FSH的量成正比。这使得能够量化和比较单独注射激素或作为与抗体的复合物注射的相同量的激素的生物活性。

单独注射的FSH或与抗体或与scFv复合的FSH的生物活性的比较使得能够测量响应的差异，并因此定量抗体或其scFv的增强作用。

CA5抗体及其scFv的作用

图8A示出了CA5抗体对绵羊FSH生物活性的影响的代表性实例。每个批次包括五只雌性。使用单独注射CA5抗体治疗的批次表现出与已接受生理盐水的对照批次的雌性相同的卵巢平均重量(分别为25.6mg和29.15mg)。已经接受常规激素治疗(3.5IU hCG+0.5μgoFSH)的批次得到了平均重量为85.7mg的卵巢，其显著高于对照批次(p<0.05)。使用与CA5抗体预复合的绵羊FSH治疗的批次表现出198mg的平均重量，即与已经收受常规激素治疗的批次相比，FSH生物活性的增加非常显著，为231％(p<0.0001)。在多个实验中分析了CA5对绵羊FSH的体内增强作用，所有这些结果都示于表27中。在使用激素/CA5复合物刺激后，在三个实验中记录的卵巢平均重量的增加非常显著(p<0.0001)。

表27

在多个实验过程中也分析了大量的CA5对人FSH的影响。结果示于下表28中。

表28

在用hFSH Gonal F/CA5复合物治疗的雌性中记录的平均卵巢重量的增加为173％：卵巢的平均重量从接受常规治疗的雌性中的73.93mg升高到了使用激素/CA5复合物治疗的雌性中的128.3mg。这种差是是高度显著的(p<0.0001，非配对t检验)。

最后，在人FSH的其它两种制剂(Puregon和Fostimon)上研究了增强作用。图8B所示的结果是代表性示例。记录了人FSH Puregon活性153％的显著增加(p<0.05)和人FSHFostimon活性142％的显著增加(NS)。相比之下，在该实验中，记录的人FSH Gonal F活性的增加为179％(p<0.05)。

总之，CA5抗体对绵羊FSH发挥主要的增强作用，并且对来源于各种药物制剂的人FSH的活性也具有相当大的增强作用。

在与完整的抗体相同的方案中，研究了CA5 scFv的作用。图9A显示了所获得的结果。使用完整的抗体或其scFv获得了对人FSH Gonal F活性相同的增强作用，效果是显著的(p<0.05)。

评估了注射激素/scFv混合物的各种方法并且将其与常规方案(皮下注射)比较。因此，为比较腹膜内注射激素混合物与腹膜内注射激素混合物15分钟后第二次延迟注射CA5 scFv，进行了生物测定(图9A)。在这种情况下，在使用激素/scFv复合物治疗的雌性中获得了146％的增加，卵巢的平均重量从61mg(batch hCG+hFSH Gonal F)增加到了89mg(批次scFv，然后hCG+hFSH Gonal F)。这些结果是显著的，因为它们证明了可以在体内建立CA5scFv的增强作用，即使单独注射scFv也如此，而不取决于激素及在更晚的时间。在治疗的动物中，可以在体内形成激素/scFv复合物。

还研究了CA5 scFv对人类FSHs Fostimon和Puregon的增强作用(图9B)。获得了FSH Puregon活性140％的显著增加(p<0.05)和FSH Fostimon活性126％的非显著增加(NS)。

CH10抗体及其scFv的作用

在多个实施过程中分析了CH10对绵羊FSH的体内增强作用，结果均示于图10A中。使用hCG+oFSH混合物治疗的雌性大鼠和使用激素/CH10复合物治疗的雌性大鼠之间的响应的三个实验的比较显示了145％的显著增加(p<0.01)。所记录的卵巢的平均重量在使用hCG+oFSH混合物治疗的雌性中为87.55±3.724mg/100g体重(n＝12)，在使用激素/CH10复合物治疗的雌性大鼠中的为126.6±9.6mg/100g体重(n＝13)。没有观察到单独的CH10抗体对卵巢响应的影响。

在多个实验过程中还对大量分析了CH10对人FSH Gonal-F的增强作用。结果示于下表29和以及图10B中。

表29

在使用Gonal F/CH10复合物治疗的雌性中记录到卵巢的平均重量增加了170％。这种差异非常显著的(p<0.0001,非配对t检验)。

还研究了CH10对人FSH Puregon和Fostimon的增强作用(图11A)。分别获得了145％和174％的显著增加(p<0.05)。图11B显示了通过常规皮下注射和通过时间延迟的腹膜内注射的hFSH Gonal F/CH10scFv复合物的效果。通过常规注射获得了160％的显著增加(p<0.05)，并且通过独立腹膜内注射CH10 scFv和hFSH获得了150％的增加，但不显著。因此，无论是单独注射还是用激素预培育，可以在体内建立CH10 scFv的增强作用。

在大鼠中抗体对LH/CG生物活性的增强作用

由于绵羊LH的成本非常高，所以这些生物学测定使用能容易以非常纯的且便宜的形式获得的hCG进行。研究了抗体对两个提取的人类hCG(人类绒毛膜促性腺素)制剂的作用，其中一个被用在辅助生殖技术治疗的背景下的人类繁殖中：ENDO 5000(Schering-Plough实验室)，而另一个被用在兽医中：Chorulon(MSD实验室)。

根据Scobey et al.[13]的方案，相对于精囊重量的增加，量化LH或hCG的生物活性(精囊的发育是雄激素依赖性的)。重量与hCG的活性成正比地变化，因此使得可以定量和比较所研究的单独注射的或与抗体复合的激素的生物活性。使用持续4天每天一次皮下注射100μl在37℃预温育了20分钟的1.5IU hCG或1.5IU hCG+2μg抗体混合物的25日龄幼鼠进行方案。在第五天，将大鼠称重，然后处死。取出它们的精囊(SV)，解剖并称重。精囊的重量以mg/100g体重表示，以便能够比较和组合利用各批次获得的结果。在每次实验中，在一批五只大鼠上测试每种条件。相同的实验重复多次。

图12中显示了CA5对两种hCG制剂(Chorulon和Endo 5000)的影响。直方图A是对六个批次的五只大鼠进行的生物测定的代表性实例。使用hCG Chorulon/CA5复合物获得了非常显著的增强作用(p<0.0001,Krustal和Wallis检验)，与使用单独的hCG治疗的批次相比，精囊重量增加了196％。使用hCG ENDO 5000/CA5复合物获得了显著效果，重量增加了193％(p<0.01)。观察到，与使用生理盐水治疗的对照动物相比，使用CA5抗体治疗的批次未显示出精囊重量的变化：与复合物相反，单独的抗体未对靶器官产生作用。

在用两种hCG重复该生物测定期间获得的结果的总和确定了激素/CA5复合物的高度显著的增强作用(p<0.0001,非配对t检验)：

-在分别为53只动物和56只动物的数量上，使用hCG Chorulon治疗的大鼠中的SV的平均重量为28.8mg/100g，而使用复合物治疗的大鼠中的SV平均重量为46.7mg/100g(增加了162％)(图12B)；

-在分别为26和30只动物的数量上，在使用hCG ENDO 5000治疗的大鼠中的SV平均重量为24.64mg/100g，而使用复合物治疗的大鼠中的SV平均重量为48.13mg/100g(增加了195％)(图12C)。

CH10抗体在大鼠体内中还表现出对hCG Chorulon和hCG ENDO 5000的显著增强作用。

图13A示出了在六个批次的五只大鼠上进行的生物测定的代表性实例。使用hCGChorulon/CH10复合物获得了非常显著的增强作用(p<0.0001,Krustal和Wallis检验)，与使用单独的hCG治疗的批次相比，精囊重量增加了193％。在使用hCG ENDO 5000/CH10复合物治疗的批次上也获得了显著效果，重量增加了199％(p<0.0001)。观察到与使用生理盐水治疗的对照动物相比，使用单独的CH10抗体治疗的批次未显示出精囊重量的变化。因此，未复合至激素的CH10对靶器官不具有特异性影响。

在用两种hCG重复该生物测定期间获得的结果的汇编确认了激素/CH10复合物的高度显著的增强作用(p<0.0001,非配对t检验)：

-在分别为34只动物和35只动物的数量上，使用hCG Chorulon治疗的大鼠中的SV的平均重量为29.6mg/100g，与此相比，使用复合物治疗的大鼠中的SV的平均重量为50.04mg/100g(增加了169％)(图13B)；

-在分别为13只动物和15只动物的数量上，使用hCG ENDO 5000治疗的大鼠中的SV的平均重量为24.64mg/100g，而使用复合物治疗的大鼠中的SV的平均重量为51.39mg/100g(增加了208％)(图13C)。

实施例4：本发明的配体对母羊中内源性促性腺素的生物活性的增强作用的体内测量

在啮齿动物(小动物)中已经证明和表征了CA5和CH10单克隆抗体的体内增强作用之后，目的是研究每种抗体在以下更大的生产用畜(农用牲畜)中对FSH活性的影响：母羊。

为此，对均为相同年龄的短毛、法兰西岛母羊进行了研究，目的是评估抗体对治疗的母羊自身激素(内源性激素)的增强作用。特异性的研究显示出CA5和CH10抗体对绵羊FSH的强结合和对绵羊LH的更可变的结合。为此目的，开发了仅包含单独注射抗体的治疗以评价其功效。

因此，在母羊中建立的方案中，如在雌性大鼠中，单独注射每种抗体，并且不使用外源FSH预培育。另外，将每种抗体注射到事先没有任何卵巢刺激的母羊中：在注射抗体之前，动物没有接受用促性腺素刺激排卵的激素治疗。

在进行方案的过程(发情期中间(1月)或在发情期结束时(3月底))中，评价抗-FSH抗体CA5和CH10的增强作用。所有的方案均在母羊上进行，其中通过植入用孕激素(45mg醋酸氟孕酮(FGA)-MSD)浸渍的阴道海绵14天来使卵巢周期预同步。通过比较对照母羊(生理盐水批次)、用猪FSH治疗刺激的母羊(FSH批次)和用单独的抗体刺激的母羊(抗体批次)中的排卵响应(排卵数)和一个或多个功能性优质黄体(孕酮分泌的大小)的建立，分析增强作用。

在每个方案中，通过ELISA方法进行血浆LH测定，以检测和记录LH的排卵前峰值。为了评估排卵响应，取出阴道海绵8天后，在麻醉下，通过腹腔镜检查进行卵巢的内窥镜观察，以计数黄体的数量并观察它们的外观。

为了评价黄体的功能和质量，使用取出海绵后的第1天至第21天的每日血液样品进行定量孕酮ELISA测定。

所有统计分析均用GraphPad Prism第5.0版软件(GraphPad,San Diego,CA,USA)进行。

CA5抗体

在发情期期间和发情期结束时，在两种方案(1和2)中评价CA5抗体(IgG)的增强作用。

在发情期结束时进行的方案1中：

-接受三次肌内注射纯化的CA5的“CA5抗体”批次(n＝6)：在取出海绵的4天之前为2mg，在取出之前为1mg和在取出海绵时为1mg；

-“对照”批次(n＝5)，在取出海绵的24小时之前，接受肌内注射生理盐水；

-“FSH”批次(n＝5)，在取出海绵的24小时之前，接受肌内注射100μg猪FSH(pFSH)，并且在取出海绵的12小时之前接受肌肉注射90μg。排卵响应的分析给出了下表30所示的结果。

表30

	血清Φ批次	FSH批次	单独的CA5批次	统计
					每批次的母羊数	5	5	6
每批次已排卵的母羊数	2/5(40％)	2/5(40％)	2/6(35％)	NS
					每个已排卵的母羊的黄体数	1.5±0.7	3±2.8	1.5±0.7	NS
LH峰的时刻(取出之后的小时)	72±17	60±0	78±25	NS

通过Fisher精确检验进行统计分析。

与对照批次和FSH批次比较，在CA5批次中获得的结果未显示出对排卵响应的任何显著影响。所测量的参数都没有显示趋势。

在三个批次中获得的黄体期期间的孕酮分泌谱示于图14中。对于每个个体，相对于黄体的数量来标准化孕酮的浓度值(ng/ml)。每条曲线代表了在时间t时在每个批次的雌性中获得的孕酮值的平均值。

观察到CA5抗体对每个黄体的孕酮分泌强度及对孕酮分泌的初始建立的显著影响(图14A)。与FSH和血清Φ批次的曲线相比，观察到了对CA5曲线的影响，早在D4开始孕酮分泌，随后是分泌的显著增加，这在整个黄体期保持直到周期结束。对于CA5、FSH和血清Φ批次，在D10时的平均孕酮值分别为1.38 ng/ml-0.92和0.52 ng/ml，并且在D15为2.58-1.7和1.18 ng/ml。使用配对的非参数t检验(Wilcoxon检验)进行三条曲线的比较。因此，CA5批次的曲线高于FSH批次的曲线，并且显著不同(p<0.01)，同样地，对照批次的曲线也如此(p<0.001)。FSH批次的曲线高于对照批次的曲线并且显著不同(p<0.001)。

在CA5刺激下的母羊中，为了量化孕酮分泌水平的这种显著且不断的直到周期结束的增加，使用GraphPad Prism第5.0版软件计算了曲线下的面积(AUC)。结果示出于图14B中并且显示，CA5曲线的AUC(23.61个任意单位)倾向于高于血清Φ曲线的AUC(8个单位)，但是这种差异并不显著。同样地，FSH曲线的AUC(12个单位)与对照曲线相比没有显著差异。

总之，在排卵诱导方面，在母羊中注射CA5给出了与常规治疗相同的结果，但是使得能够更快地建立孕酮分泌，并以更高的循环孕酮水平维持更有效的功能性黄体，保证了更为成功的早期胚胎发育和妊娠维持(降低了堕胎风险)。

在发情期进行的方案2中：

-“CA5抗体”批次(n＝7)，在取出海绵24小时后，接受单次肌内注射2mg CA5抗体；

-“对照”批次(n＝9)，在取出中海绵24小时之前，接受肌内注射生理盐水；

-“FSH”批次(n＝11)，在取出海绵24小时之前，接受肌内注射100μg猪FSH(pFSH)，并且在取出海绵12小时之前肌内注射90μg。

排卵响应的分析给出了下表31中所示的结果。通过Fisher精确检验进行统计分析。

表31

与对照和FSH批次相比，在CA5批次中获得的结果显示，单独注射的抗体对排卵响应具有非常显著的影响。事实上，100％的接受了2mg抗体注射的雌性(7/7)排卵，与此相比，血清Φ批次和FSH批次分别为44％和36％(p<0.0001,Fisher精确检验)。在批次的总数上，每个雌性获得的黄体数在“CA5”批次中同样更大，几乎是显著的(p＝0.06,Mann-Whitney t检验)：1.5个黄体，与0.9(FSH)和0.67(血清Φ)分别形成对比。在三个批次之间，每只已排卵的雌性中的黄体平均数没有显著差异。

在三个批次之间，LH峰的平均出现时刻没有显著差异。不论如何，与FSH批次且特别是血清Φ批次相比，在CA5批次中观察到在LH峰到来时趋向于更小的变异性。

在排卵后的黄体期期间的孕酮分泌谱显示在图15A中。对于每个个体，相对于黄体的数量来标准化孕酮浓度值(ng/ml)。该图的每条曲线表示在每个批次的雌性中获得的孕酮值的平均值。在孕酮分泌的强度上观察到CA5抗体的显著效果：与FSH批次和血清Φ批次的曲线相比，在整个黄体期中观察到，每黄体的孕酮分泌的相当大且非常显著的增加。对于CA5、FSH和血清Φ批次，在D10时的平均值分别为2.44ng/ml、1.3和0.62ng/ml，并且在D15为2.88-1.42和1.18ng/ml。通过配对的非参数t检验(Wilcoxon检验)进行三条曲线的比较。CA5批次的曲线显著高于且不同于FSH批次的曲线(p<0.01)，与对照批次的曲线相比也同样如此(p<0.001)。FSH批次的曲线显著不同于对照批次的曲线(p<0.001)。

为了在CA5刺激下母羊周期的整个黄体期中，量化每黄体的孕酮分泌水平的这种显著且恒定的增加，使用GraphPad Prism第5.0版软件计算曲线下面积(AUC)。结果示于图15B中并且显示，CA5曲线的AUC(24.20单位)为3倍显著高于血清Φ曲线的AUC(8.1)(p<0.05,非参数Mann-Whitney t检验)。相反，FSH曲线的AUC与对照曲线没有显著差异。

总之，以单次肌内注射2mg的形式使用CA5抗体，非常显著地产生了比使用FSH的常规治疗更好的结果，使得：

1-在刺激的雌性中100％诱导排卵，

2-黄体的发展具有更好的质量，其中孕酮分泌比在FSH治疗后观察到的更高，并且早在D4即非常快速地建立。需要强调的是，与FSH治疗相比，CA5对这种额外性质的影响是非常重要的。这是因为血浆孕酮浓度是胚胎发育的关键因素，特别是在其早期。

更快地建立孕酮分泌且以更高循环的孕酮水平维持更有效的功能性黄体，是早期胚胎发育和保持妊娠的更好成功、降低堕胎的风险的保证。

所有的结果表明，注射体内的增强抗体(特别是CA5)在母羊中能够复合动物的内源性促性腺素和增强动物自身激素的生物活性。

CA5抗体的增强作用在母羊中能够诱导比常规FSH激素治疗更强的卵巢刺激：排卵诱导在发情期为100％，并且在所有情况下，在整个黄体期中维持200％至300％的循环孕酮浓度的显著增加。这种额外的效果主要是降低孕激素依赖性胚胎发育失败率和堕胎的风险。

实施例5：本发明的CA5配体在小母牛中对内源性促性腺素的生物活性的增强作用的体内测量

在已经证明和表征了CA5单克隆抗体在大鼠和母羊中的增强作用之后，目的是研究其在更大的动物(小母牛)中对内源性促性腺素的活性的影响。为此，在Prim'Holstein小母牛中开发了仅包含单独注射抗体的治疗，以评价其功效。这些小母牛没有任何先前的卵巢刺激，动物在注射抗体之前未接受促性腺素的排卵刺激激素治疗。

旨在评估CA5抗体的增强作用的方案在20至22个月龄的Prim'Holstein小母牛中进行，通过植入孕激素植入物(3.3mg诺孕美特,–MSD)7天以预先同步其排卵周期。在植入植入物的当天进行GnRH(0.004mg醋酸布舍瑞林,Pack-MSD)的注射，随后，在取出植入物之前的24小时注射前列腺素(-Virbac)。

将动物分成两批：

-“CA5”批次(n＝4)接受两次肌内注射11mg纯化的CA5抗体：在植入物植入24小时之后第一次给予，并且在取出中孕激素植入物24小时之前第二次给予；

-“对照”批次(n＝3)接受两次肌内注射生理盐水，在植入物植入24小时之后第一次给予，并且在取出孕激素植入物24小时之前第二次使用。

通过比较对照小母牛(生理盐水批次)和用单独的抗体治疗的小母牛(CA5批次)中排卵响应(排卵或无排卵)和良好质量的功能性黄体的建立(黄体的大小和孕酮分泌的大小)，来分析增强作用。

通过ELISA方法进行血浆LH和雌二醇测定，以检测和记录排卵前LH峰，并且监测雌二醇分泌。为了评估排卵响应和黄体的大小，每天进行卵巢超声。最后，为了评价黄体的功能和质量，对从植入物植入当天到取出植入物后的第21天的每日血液样品进行定量孕酮ELISA测定。

使小母牛受精，并且在授精35天后通过超声进行妊娠诊断。

所有统计分析均用GraphPad Prism第5.0版软件进行(GraphPad,San Diego,CA,USA)。

首先通过测量循环的雌二醇水平在两个批次的小母牛中比较排卵响应。图16A中呈现的结果显示了代表每个批次的两只小母牛中的雌二醇分泌概况。与D0时对照中的6.6pg/ml相比，在D0处观察到的雌二醇峰在治疗的动物中的幅度更大，浓度为9.2pg/ml，并且与在D1.5处对照中的8.8pg/ml相比，治疗动物中的为10.5pg/ml(不显著)。每个批次的小母牛的结果平均值，表示为当植入物被植入时所测量的基础雌二醇浓度的百分比(图16B)。发现了相同的倾向，其中与对照批次的小母牛相比，用CA5抗体治疗的批次中的雌二醇峰的幅度倾向于更大：在取出植入物时(D0)，149±16％相比于133±7％，并且在取出植入物之后的D1.5，161±6％相比于144±8％(不显著)。D3和D8之间的雌二醇水平在两个批次中显示了第二个较小的分泌峰，这反映了第二个卵泡波。在CA5批次中，雌二醇浓度的增加倾向于早于对照批次：在D6，在用CA5治疗的小母牛中为113±3％，而在对照中为104±0.5％。

两个批次小母牛中的雌二醇峰的曲线下面积分析(图16C)还显示了这样的趋势：在用CA5治疗的批次(面积129.5±20单位)中获得了比对照批次(面积97.5±18单位)更高的雌二醇峰，尽管这不显著。

总体上，结果显示了在用CA5抗体治疗的小母牛中具有更好的雌二醇分泌的倾向，尽管不显著，但这可能反映了更好质量的卵泡期。

关于排卵前LH峰的结果显示在图17中。关于LH峰出现的时刻，它们未显示出差异(图17A)：在对照批次中，在取出植入物之后44h±8h出现LH峰，与此相比，使用CA5抗体治疗的批次中为40.5h±5.1h。对照批次中，LH峰的最大浓度为4.8±1.8ng/ml LH，与此相比，使用CA5抗体治疗的小母牛中为9.8±1.2ng/ml(图17B)。在用抗体治疗的批次中，在排卵前峰值期间的最大LH浓度倾向于更大，但这种倾向不显著。相对于排卵前LH峰的曲线下面积，也观察到了相同的倾向：与使用CA5抗体治疗的小母牛中的98±4.8相比，对照小母牛中为64.5±5.8任意单位(图17C)。然而，在用CA5治疗的小母牛中，这种趋向于更大LH峰的趋势并不显著。

排卵后的超声分析表明，两个批次的所有小母牛都有单个排卵。

随后通过超声定期测量黄体的尺寸以监测黄体的发育，从而分析黄体期的质量。图18A所示的结果表明，用CA5治疗的小母牛的批次(直径26±2mm)倾向于具有比对照小母牛批次(直径22±1mm)更大的黄体。尽管如此，这种差异并不显著。

整个黄体期的血浆孕酮浓度的测量示于图18B中。它揭示了两个批次之间的非常显著的差异(p<0.001)。循环孕酮水平表示为取出植入物时测量的基础浓度的百分比。在取出后的D9，对照批次中为668±85％，与此相比，使用抗体治疗的批次中为1266±254％，也就是说，与对照批次相比增加了1.9倍。在取出后的D20，对照批次中为646±74％，与此相比，使用抗体治疗的批次中为1598±327％，也就是说，与对照批次相比增加了2.47倍。这些结果反映了用CA5抗体治疗的小母牛中的更好质量的黄体，其具有更大的直径且尤其是更高的孕酮分泌的倾向。需要强调的是，在黄体期期间，更好功能质量的黄体在胚胎的植入及其早期发育的成功中是主要的。这降低了早期堕胎的风险。

在人工授精35天后进行的妊娠诊断表明，每个批次中的所有小母牛都是妊娠的。

总之，这些结果显示，用CA5抗体治疗的小母牛在卵泡期期间倾向于具有更好的雌激素响应(虽然这不显著)，并且在黄体期期间具有显著更高的孕酮分泌。

实施例6：本发明的CA5配体在雌性猴中对内源性促性腺素的生物活性的增强作用的体内测量

在已经证明和表征了CA5单克隆抗体在大鼠、母羊和小母牛中的增强作用之后，还在接近人类的物种中研究了其增强作用：食蟹猴(食蟹猕猴)。为此，在至少36个月龄的短毛猕猴进行研究，目的在于评价抗体对人FSH和治疗的猕猴的内源性激素的增强作用。

为此，在4只至少36个月龄的短毛猕猴中进行研究。在注射外源FSH20分钟后注射CA5抗体或单独注射CA5抗体。在月经的第一天，猕猴接受肌内注射1.5mg缓释GnRH制剂(L.P.3mg-IPSEN Pharma)。十五天之后，四只雌性猴接受不同的治疗：

-使用25IU对动物治疗8天("25IU×8"批次)：每天皮下注射25IU的人FSH(注射笔-Merck Serono)，持续8天；

-在一天用24IU对动物进行治疗("25IU×1"批次)：在治疗的第一天，单次皮下注射25IU人FSH(注射笔-Merck Serono)；

-使用CA5+hFSH对动物进行治疗("CA5+hFSH”批次)：仅在治疗的第一天，在皮下注射25IU人FSH(注射笔-Merck Serono)，20分钟之后，单次皮下注射CA5抗体(80μg)；

-使用单独的CA5对动物进行治疗("CA5"批次)：仅在治疗的第一天，单次皮下注射单独的CA5抗体(88.5μg)，不注射外源性激素。

通过比较由治疗诱导的卵泡生长来分析增强作用。为此，每48小时进行经腹腔卵巢超声，以计数卵泡并测量其表面积(表达为mm²)。

将在注射25IU hFSH 20分钟后注射CA5抗体("CA5+hFSH"批次)获得的效果与注射25IU hFSH("25IU×1"批次)获得的效果及八天每日注射25IU hFSH("25IU×8"批次)获得的效果进行比较。图19A中的结果显示，在开始FSH治疗后的第9天，使用单次注射25IU hFSH治疗的雌性猴未表现出刺激的卵泡(曲线下面积为零)。相反，在治疗的第一天使用"CA5+hFSH"治疗一次的雌性猴示出了八个成长的卵泡，卵泡的总面积为37mm²，等于在接受了八次注射hFSH("25IU×8")的雌性猴中测量的面积，后者有11个刺激的卵泡，面积为35mm²。因此，单次注射CA5+25IU hFSH复合物与八次注射25IU hFSH一样有效地刺激卵巢。这一结果证明，CA5在雌性猴中的体内增强作用导致了卵泡刺激。事实上，由于FSH的半衰期小于1小时，因此用CA5观察到的效果不能仅仅归因于对注射的hFSH的影响，而且还反映了对雌性猴的内源性FSH的影响。

然后研究了单独注射的CA5抗体("CA5")的效果并且与注射25IU hFSH("25IU×1")的效果以及与三天每日注射25IU hFSH("25IU×3"批次)的效果进行比较。在其注射三天后，最佳地观察到单独注射的抗体的刺激效果。图19B中所示的结果显示，在治疗的第3天，已经接受单独单次注射抗体的雌性猴(“CA5”)表现出卵巢刺激，五个生长的卵泡呈现出的面积为32.6mm²。相比之下，已经接受三次注射25IU hFSH的雌性猴("25IU×3")仅表现出非常弱的刺激，只有一个生长的卵泡，其面积是1.6mm²。超过治疗的第3天，由单独的CA5诱导的卵巢刺激未得到维持，并且刺激的卵泡消失。进一步注射抗体或调整在D1注射的剂量可能是必要的，以便维持对卵巢的刺激效果。尽管如此，该结果表明，单独注射的CA5抗体能够复合雌性猴的内源性FSH，并且能够充分地增强其生物活性以诱导卵巢刺激的开始。

实施例7：本发明的CA5和CH10配体所识别的表位的预测及它们的互补位的预测

使用图，使用基于蛋白质结构建模的蛋白质对接算法，在各种物种的促性腺素上测定CA5和CH10抗体的各自表位，并且通过各种得分函数进化学习方法进行优化，使得能够区分天然和非天然构象(Bernauer et al.,Bioinformatics 2007,5:555)[14]、(Bernauer et al.,Bioinformatics 2008,24:652)[15]、(Bourquard et al.,PLoS One2011,6:e18541)[16]和(Bourquard et al.,Sci.Reports 2015,5:10760)[17]。

将每种抗体与人FSH(hFSH)、人LH(hLH)、人CG(hCG)、绵羊FSH(oFSH)和绵羊LH(oLH)、猪FSH(pFSH)和猪LH(pLH)对接。hFSH和hCG的晶体结构可在蛋白质数据库(PDB)中获得：分别为4MQW和1QFW。使用与人FSH受体的胞外结构域复合的人FSH的结构(Fan和Hendrickson,Nature 2005,433:269)[18]。对于其它激素(hLH、oFSH、oLH、pFSH和pLH)，产生同源模型，然后用于对接。

1/CA5配体的表位和互补位

由于不能得到CA5抗体的3D结构，所以使用CA5的单价VH和VL片段的序列进行研究。为此，产生了可变部分同源模型。从不同结构分别产生VH和VL模型，并且从用作VH建模支持的结构确定它们的相对取向。用于同源模型的结构在蛋白质数据库(PDB)中可获得：3OKK用于CA5 VH且3MBX用于CA5 VL。

对接结果示于图20中。看起来CA5配体类似地对接在七种靶激素上。表位由不连续地基本定位在所研究的促性腺素的β亚基上和(对于两个残基)α-亚基上的多个区域限定。表位还包括人FSH受体的胞外域的10个残基。因此，CA5配体的表位是高度构象的：其由激素和受体序列的多个连续区域组成，其在激素和激活受体的天然构象上空间接近。

在图20中，涉及CA5配体的界面的激素和受体的各种残基被矩形包围。hFSH的β亚基上由阴影区域指示的五个残基参与主要的相互作用并且在抗体/抗原识别中具有主要作用：这些残基是hFSH的β亚基上22位的丝氨酸(Ser22)、65位上的甘氨酸(Gly65)、66位上的半胱氨酸(Cys66)、精氨酸97(Arg97)和甘氨酸98(Gly98)。Gly65和Cys66残基存在于所有其它靶激素的序列中。

CA5配体还识别FSHβ-亚基的C末端中的残基97至100和102至109。构成安全带的该区域在稳定激素的α/β二聚体的连接中起主要作用。因此，CA5配体与激素的结合表现为使安全带的闭合变得安全，并因此有助于二聚体的稳定性，这对于激素的生物活性是必需的(仅有二聚体具有活性)。

CA5抗体基本针对hFSH的β亚基。

在界面中仅涉及α-亚基的两个残基：它们是在天然激素中空间上接近的35位上的精氨酸残基(Arg35)和56位上的谷氨酸残基(Glu56)。它们的作用是固定β亚基的C末端，从而保持围绕α-亚基的“安全带”。这两个残基不断存在于所有靶激素中并且被识别。它们在激素的生物活性中起非常重要的作用。

CA5抗体的表位的另一个特征是，CA5抗体识别的界面中涉及人FSH受体N-末端区域的His2-His3-Arg4-Ile5、His7、Leu14、Gln16-Glu17、Lys19和Arg35残基。

表32：CA5配体的表位和互补位。灰色阴影的残基参与了主要的相互作用区

32显示了构成CA5配体的表位的各种区域和构成其互补位的区域。

两条VH和VL链通过它们的三个CDR和其框架的一些残基参与激素的识别。

参与主要相互作用的五个残基由VH CDR2的Asn53，VH CDR1的残基Asp31、Phe27和Thr28以及VL CDR1的残基Ser33和Asn34识别。

只有VL链参与识别FSH受体的胞外域，特别是其CDR1的残基Gln35和Lys36，其CDR2的残基Ser58和框架3的多个残基。

总之，CA5配体识别涉及hFSH的α-亚基和β亚基及其形成安全带的C末端的构象表位，以及FSH受体的胞外结构域。VL链是唯一涉及与受体的胞外域相互作用的。两条VH和VL链参与了与激素亚基的相互作用。CA5配体的构象表位，一方面使其能够稳定激素二聚体连接，另一方面能够稳定激素与其受体的结合。这两种机制是互补的，并且对于导致激素与其受体更好的相互作用是基本的，从而获得更好的功效。因此，它们表现为构成CA5配体对促性腺素的增强作用的机制基础。

2/CH10配体的表位和互补位

由于不能获得CH10抗体的3D结构，使用CH10的单价VH和VL片段的序列进行研究。为此，产生了可变部分的同源模型。分别从不同结构产生VH和VL模型，并且从作为VH建模的支持的结构确定它们的相对取向。用于同源模型的结构可在蛋白质数据库(PDB)中获得：4QNP用于CH10VH，以及3D85用于CH10VL。

对接结果示于图21中。CH10配体表现为类似地对接在七种靶激素上。表位由在FSH的α-和β-亚基上不连续定位的几个区域限定，并且还包括人FSH受体的N-末端的8个残基。因此，CH10配体的表位是构象的：其由激素的多个连续区域和FSH受体的N-末端中的序列组成。所有这些区域在激素和激活受体的天然构象中空间上接近。

在图21中，涉及到与CH10配体的界面中的激素和受体的各种残基被矩形包围。由α亚基上的阴影区域标示的四个残基(hFSH上的Asp6-Cys7-Pro8和Glu56)和由β亚基上的阴影区域标示的两个残基(hFSH上的Ser2-Cys3)参与了主要相互作用并且在抗体/抗原识别中具有主要作用。在涉及界面的其它残基中，位于β亚基的C-末端部分上的那些残基包括在称为“安全带”的区域中，其作用是稳定激素的α/β二聚体的连接。因此，CH10配体与激素的结合表现为使安全带的闭合安全并因此有助于二聚体的稳定性，这对于激素的生物活性是必需的。此外，CH10配体显示出对α-亚基上残基Glu56的主要识别，其涉及将“安全带”固定在α-亚基上。

CH10抗体的表位的另一个特征是在抗体识别的界面中涉及人FSH受体N-末端区域的Cys1-His2、His7-Cys8-Ser9、Lys14、Gln16和Arg35残基。

表33：CH10配体的表位和互补位。灰色阴影的残基都参与了主相互作用区

表33显示了构成CH10配体的表位的各个区域和构成其互补位的那些区域。

VH链的CDR2和CDR3以及VL链的CDR1、CDR2和CDR3参与了激素的识别，VH链的框架3的一些残基以及VL链的框架1和2的一些残基也是如此。

参与主要相互作用的残基被CDR2的残基Thr60，VH链的框架3的Tyr61-Tyr62-Asp64-Lys67，以及VL链的CDR3的残基His92和Ser93所识别。

只有VL链通过其CDR1及其框架1和2参与受体胞外域上的相互作用。

实施例8：本发明的CA5配体的各种片段的构建、产生和表征

构建了CA5抗体的各种片段以评价它们增强绵羊FSH和人FSH(MerckSerono)的生物活性的能力。产生了包含单独的轻可变链的片段(称为“CA5 VL”)、仅包含重可变链的片段(称为“CA5 VH”)、以及与本发明实施例1第4段中描述的CA5 scFv的VH-VL序列(SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20)相比以反向VL-VH顺序构建的“反向CA5 scFv”。

1/抗体片段的构建和产生

由ATG:Biosynthetics GmbH(德国)合成了编码CA5 VL和反向CA5 scFv片段(来源于CA5抗体)的合成基因。反向CA5scFv由CA5scFv融合物的CA5 scFv-连接子-CA5 VH的CA5VL组成(SEQ ID N°19)。每种合成基因通过融合pSW1质粒[7]的序列(包括在HindIII位点和编码PelB蛋白的序列的末端之间)和待合成的目的蛋白质的序列(SEQ ID N°44和SEQ IDN°48)来设计，侧翼为XhoI限制性位点。将序列插入到pSW1质粒的HindIII和XhoI位点之间。优化密码子以用于在大肠杆菌中表达。

通过在PstI-XhoI位点在pSW1质粒[7]中插入由这些相同酶消化pSW1反向CA5scFv质粒产生的片段，来获得pSW1-CA5 VH表达质粒。

通过对构建体的质量进行测序验证后，将pSW1-CA5 VL、pSW1-CA5 VH和pSW1反向CA5 scFv质粒通过热冲击转化处于感受态的HB2151细菌(T53040，Interchim，法国)[8]。

表34：CA5 VL的核苷酸序列和肽序列

表35：CA5 VH的核苷酸序列和肽序列

表36：反向CA5 scFv核苷酸序列和肽序列

根据本发明先前实施例1中的方法进行片段的产生。

2/CA5 VL、CA5 VH和反向CA5 scFv片段对FSH生物活性的效果的体外测量

根据本发明先前实施例2中的方案，使用利用人FSH受体和系统稳定转染的HEK 293细胞系，研究了"CA5 VL"、"CA5 VH"和"反向CA5 scFv"片段对绵羊FSH和人FSH的生物活性的体外影响。各自以40nM测试了单独的“CA5 VL”和“CA5 VH”片段以及混合物。在80nM的浓度下测试了反向CA5 scFv，如同参考CA5 scFv。在0.1nM下测试了绵羊FSH和人FSH(Gonal)。

图22示出了在单独的0.1nM绵羊FSH(oFSH)或与各种CA5片段复合的绵羊FSH的存在下，获得的表达为相对发光单位的、作为时间(按分钟计)函数的cAMP产生动力学曲线。将四种条件与单独的oFSH进行比较：oFSH+CA5 VL复合物(图22A)、oFSH+CA5 VH复合物(图22B)、oFSH+反向CA5 scFv复合物(图22C)和最后的oFSH与等摩尔的40nM CA5 VL和40nMCA5 VH的混合物的复合物(图22D)。观察到在所有的情况下均获得了非常显著的增强作用(p<0.001)，与由单独的FSH诱导的细胞响应相比，将细胞对30分钟刺激的响应增加了2.1至2.4倍。这些结果表明，单独的VH和VL片段能够以与整个scFv相同的方式对oFSH的生物活性施加增强作用。它们验证了两个可变链参与了本发明实施例7的模型中描述的增强作用。CA5 VH+CA5 VL的混合物，如反向CA5 scFv(VL-VH)，发挥了与原始(VH-VL)的CA5 scFv相同的增强作用。

还在0.01nM浓度下以单独的或与各种CA5片段复合的人FSH(Gonal )进行了同样的研究。将四种条件与单独的hFSH进行比较：hFSH+CA5 VL复合物(图22E)、hFSH+CA5 VH复合物(图22F)、hFSH+反向CA5 scFv复合物(图22G)和最后hFSH与等摩尔的40nM CA5 VL与40nM CA5 VH的混合物的复合物(图22H)。

观察到40nM浓度与hFSH复合的“CA5 VL”片段未发挥显著的增强作用，这与“CA5VH”片段相反，后者与单独的hFSH的刺激相比，以与CA5 scFv(275％增加)相当的方式非常显著地(p<0.001)将最大细胞反应扩大了225％(图22E和22F)。同样地，与hFSH复合的反向CA5 scFv"CA5 VL-VH"(图22G)和两种VH+VL链的混合物(图22H)分别诱导了细胞响应225％和230％的显著增加(p<0.001)，接近使用与hFSH复合的CA5 scFv获得的细胞响应增加(增加了250％至260％)。这些结果表明，CA5 VL+CA5 VH混合物如同反向CA5 scFv，与hFSH复合诱导了显著的增强作用，接近由参考CA5 scFv诱导的增强作用。与CA5 VL不同，在该测试中只有VH片段对hFSH发挥显著的增强作用。

3/雌性大鼠中，CA5 VL、CA5 VH和反向CA5 scFv片段对FSH生物活性的增强作用的体内测量

体外表征后，在雌性大鼠体内表征了各种CA5片段的增强作用，从而表征它们对FSH生物活性的影响。

为了测量FSH生物活性，使用的方案是如本发明实施例3中描述的Steelman和Pohley的生物学测定(Steelman SL,Pohley FM.Endocrinology,53:604-616.1953)[12]。

图23示出了各种片段对hFSH生物活性的影响。每个批次包含五只雌性大鼠。使用与反向CA5 scFv复合的hFSH治疗的批次得到了210mg的卵巢平均重量，与使用与hFSH复合的CA5 scFv治疗的批次(200mg)相同，也就是说，与接受单独的激素治疗的批次相比，增加了190％(p<0.05)。使用与hFSH复合的CA5 VL或CA5 VH片段治疗的批次分别具有240mg和230mg的卵巢平均重量，即与接受单独的激素治疗的批次相比，分别增加了218％和209％(分别为p<0.001和p<0.01)。

这些结果显著地表明，与hFSH复合的scFv(VL-VH对VH-VL)的构建顺序不影响scFv对FSH生物活性的增强特性。这些结果还非常显著地表明，与激素复合的CA5 VH或CA5 VL链本身也能够增强激素的生物活性。这反映了两条链各自参与了这种作用，如通过本发明实施例7中描述的相互作用模型所预测的。

参考文献列表

1-专利EP 1518863

2-国际申请WO 2012/066519

3-Brochet et al.,Nucl.Acids Res.,36:W503-508,2008

4-Giudicelli et al.,Cold Spring Harb Protoc.,2011(6):695-715,2011

5-Giudicelli et al.,Nucl.Acids Res.,33:D256-261,2005

6-Corpet,Nucl.Acids Res.,16(22):10881-10890,1988

7-Ward et al.Nature,341:544-546,1989

8-Li et al.,Afr.J.Biotechnol.,9(50):8549-8554,2010

9-Chopineau et al.,Mol.Cell Endocrinol.,92(2):229-239,1993

10-Wehbi et al.,Endocrinology,151(6):2788–2799,2010

11-Reverchon et al.,Human Reprod.,27(6):1790-1800,2012

12-Steelman SL,Pohley FM.,Endocrinology,53:604-616,1953

13-Scobey et al,Reprod.Biol.Endocr.3:61,2005

14-Bernauer et al.,Bioinformatics,5:555,2007

15-Bernauer et al.,Bioinformatics,24:652,2008

16-Bourquard et al.,PLoS One,6:e18541,2011

17-Bourquard et al.,Sci.Reports,5:10760,2015

18-Fan and Hendrickson,Nature,433:269,2005。

序列表

<110> 瑞普罗制药公司

埃洛迭·卡拉

杰里米·德库尔蒂耶

索菲·卡斯特雷

马里-克里斯蒂内·莫雷尔

<120> 增强促性腺素的生物活性的配体

<130> BNT213486PC01

<150> FR1558078

<151> 2014-09-10

<160> 70

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CA5

<400> 1

gaggtgaagc tggtggaatc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60

tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcagt gatttctaca tggagtgggt ccgccagcct 120

ccagggaaga gactggagtg gattgctgca agtagaaaca aagctaagga ttatacaaca 180

gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc atcgtctcca gagacacttc ccaaagcatc 240

ctctaccttc agatgaatgc cctgagagct gaggacactg ccatttattt ctgtgcaaga 300

gatgcaaggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CA5

<400> 2

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Lys Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr

85 90 95

Phe Cys Ala Arg Asp Ala Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CA5

<400> 3

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaagattact 60

atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300

cctcggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaa 339

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CA5

<400> 4

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ile Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 5

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CH10

<400> 5

gaggtgcagc ttgttgagtc tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60

tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat acctacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaataa ttatgcaaca 180

tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240

ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaact gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgaga 300

caggattact acggtagtag ctactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360

tcctca 366

<210> 6

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CH10

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg Gln Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CH10

<400> 7

gacattgtga tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60

ctttcctgca gggccagcca gagtattagc gactacttac actggtatca acaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccaat ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca gtatcaacag tgtggaacct 240

gaagatgttg gagtgtatta ctgtcaaaat ggtcacagct ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa a 321

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CH10

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR1 CA5

<400> 9

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR2 CA5

<400> 10

Ser Arg Asn Lys Ala Lys Asp Tyr Thr Thr

1 5 10

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR3 CA5

<400> 11

Ala Arg Asp Ala Arg Phe Ala Tyr

1 5

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL-CDR1 CA5

<400> 12

Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL-CDR3 CA5

<400> 13

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR1 CH10

<400> 14

Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR2 CH10

<400> 15

Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR3 CH10

<400> 16

Val Arg Gln Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL-CDR1 CH10

<400> 17

Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL-CDR3 CH10

<400> 18

Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 19

<211> 771

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv CA5

<400> 19

caggtgcagc tgcagcagtc aggcggcggc ctggtacaac ctggtggctc actgcgcctg 60

agctgcgcaa ccagcggttt tacctttagc gatttctaca tggaatgggt tcgccaaccg 120

ccgggtaagc gtctggaatg gatcgcggcg agccgtaaca aggcgaaaga ttataccact 180

gaatatagcg cgtcggtgaa aggtcgcttc attgtctcgc gcgataccag ccagtcgatt 240

ctgtatctgc aaatgaatgc cctgcgtgcc gaagacacgg ccatctactt ctgtgcgcgt 300

gatgcacgct ttgcctattg gggccaaggc accctggtga ccgttagcgc cggtggtggc 360

ggttcaggtg gtggcggtag cggtggcggt ggctcagata ttcagatgac ccagaccccg 420

tcaagcctgg cggtgtcagt cggcgaagag attactatga gctgtaaaag ctcgcagagc 480

ctgctgtact catcgaacca gaaaaattac ctggcatggt atcaacagaa gccgggtcag 540

tcgccgaaac tgctgatcta ctgggcctca acccgtgaga gcggcgtacc ggatcgcttt 600

actggcagcg gcagcggcac ggactttacg ctgacgatta gctcggtgaa ggccgaagac 660

ctggcggttt attattgcca acagtactat agctaccctc gtaccttcgg cggcggcacg 720

aaactcgaga ttaaacatca ccatcaccat cactaactcg agatcaagta a 771

<210> 20

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv CA5

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Lys Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr

85 90 95

Phe Cys Ala Arg Asp Ala Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala

130 135 140

Val Ser Val Gly Glu Glu Ile Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

180 185 190

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

195 200 205

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

210 215 220

Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Glu Ile Lys His His His His His His

245 250

<210> 21

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv CH10

<400> 21

caggtgcagc tgcagcaatc aggcggcggc ctggtccaac cgaaaggtag cctgaaactg 60

tcgtgcgccg ccagcggctt tacgttcaac acttacgcga tgaattgggt gcgtcaggcg 120

cctggtaaag gcctggaatg ggtggcacgc atccgttcaa aaagcaacaa ttacgcgacg 180

tattatgcag acagcgtaaa agatcgcttt accatcagcc gtgatgattc acagtcaatg 240

ctgtacctgc aaatgaataa cctgaaaact gaagacactg cgatgtatta ttgtgttcgc 300

caggactatt acggtagctc gtatttcgat tactggggcc aaggcaccac cctgacggtg 360

agctcgggtg gcggtggctc aggtggtggt ggtagcggcg gtggcggtag cgatatccag 420

atgacccaga ccccggcaac cctgagcgtt acccctggtg accgcgtttc gctgagctgc 480

cgtgcctcgc agagcatttc ggactatctg cactggtatc agcaaaaatc acacgaatca 540

ccgcgtctgc tgattaagta cgccagccaa tcgattagcg gtattccgag ccgcttttcg 600

ggctcgggtt cgggctcgga ttttaccctg tcaattaata gcgtagagcc ggaagatgta 660

ggcgtctact attgtcagaa cggccattca ttcccgtaca cgtttggcgg cggcaccaag 720

ctcgagatta agcatcacca tcatcaccat taactcgaga tcaagtaa 768

<210> 22

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv CH10

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg Gln Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr

130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile

180 185 190

Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe

195 200 205

Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys His His His His His His

245 250

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VHRev1

<400> 23

cgggatcctc tagaggtcca actgcaggag tcagg 35

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VHFor

<400> 24

caggggccag tggatagac 19

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev5

<400> 25

gacattgtga tgacccagtc t 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKC5For

<400> 26

ggatacagtt ggtgcagcat c 21

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CA5VH_Fw

<400> 27

cacttttaca tggtatccag tg 22

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CA5VH_Rev

<400> 28

gtttctactt gcagcaatcc act 23

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CA5VL_Fw

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> W = A或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> R = G或A

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> Y = T或C

<400> 29

gawtcacagr cccaggtyc 19

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CA5VL_Rev

<400> 30

cccagtaaat cagcagttta gga 23

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MuCFor

<400> 31

ggggaagaca tttgggaagg 20

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev2

<400> 32

gatattgtga tgacgcaggc t 21

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev3

<400> 33

gatattgtga taacccag 18

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev4

<400> 34

gacattgtgc tgacccaatc t 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev6

<400> 35

gatattgtgc taactcagtc t 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev8

<400> 36

gacatccagc tgactcagtc t 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKC5for

<400> 37

ggatacagtt ggtgcagcat c 21

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CH10VH_Fw

<400> 38

atggtgttgg ggctgaagtg 20

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CH10VH_Rev

<400> 39

cagttcatgg cgtaggtatt ga 22

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CH10VL_Fw

<400> 40

ttctggaytt cagcctccag 20

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CH10VL_Rev

<400> 41

gattgggaag catatttgat gag 23

<210> 42

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子

<400> 42

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 43

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv的VL片段

<400> 43

Leu Glu Ile Lys His His His His His His Leu Glu Ile Lys Val Asp

1 5 10 15

<210> 44

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CA5

<400> 44

gatattcaga tgacccagac cccgtcaagc ctggcggtgt cagtcggcga agagattact 60

atgagctgta aaagctcgca gagcctgctg tactcatcga accagaaaaa ttacctggca 120

tggtatcaac agaagccggg tcagtcgccg aaactgctga tctactgggc ctcaacccgt 180

gagagcggcg taccggatcg ctttactggc agcggcagcg gcacggactt tacgctgacg 240

attagctcgg tgaaggccga agacctggcg gtttattatt gccaacagta ctatagctac 300

cctcgtacct tcggcggcgg cacgaaactt gagattaaac atcaccatca ccatcactaa 360

<210> 45

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CA5

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Glu Ile Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys His His His His His His

115

<210> 46

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CA5

<400> 46

caggtgcagc tgcagcagtc aggcggcggc ctggtacaac ctggtggctc actgcgcctg 60

agctgcgcaa ccagcggttt tacctttagc gatttctaca tggaatgggt tcgccaaccg 120

ccgggtaagc gtctggaatg gatcgcggcg agccgtaaca aggcgaaaga ttataccact 180

gaatatagcg cgtcggtgaa aggtcgcttc attgtctcgc gcgataccag ccagtcgatt 240

ctgtatctgc aaatgaatgc cctgcgtgcc gaagacacgg ccatctactt ctgtgcgcgt 300

gatgcacgct ttgcctattg gggccaaggc accctggtga ccgttagcgc ccatcaccat 360

caccatcact aa 372

<210> 47

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CA5

<400> 47

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Lys Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr

85 90 95

Phe Cys Ala Arg Asp Ala Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala His His His His His His

115 120

<210> 48

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScFv CA5 反向

<400> 48

gatattcaga tgacccagac cccgtcaagc ctggcggtgt cagtcggcga agagattact 60

atgagctgta aaagctcgca gagcctgctg tactcatcga accagaaaaa ttacctggca 120

tggtatcaac agaagccggg tcagtcgccg aaactgctga tctactgggc ctcaacccgt 180

gagagcggcg taccggatcg ctttactggc agcggcagcg gcacggactt tacgctgacg 240

attagctcgg tgaaggccga agacctggcg gtttattatt gccaacagta ctatagctac 300

cctcgtacct tcggcggcgg cacgaaactt gagattaaag gtggtggcgg ttcaggtggt 360

ggcggtagcg gtggcggtgg ctcacaggtg cagctgcagc agtcaggcgg cggcctggta 420

caacctggtg gctcactgcg cctgagctgc gcaaccagcg gttttacctt tagcgatttc 480

tacatggaat gggttcgcca accgccgggt aagcgtctgg aatggatcgc ggcgagccgt 540

aacaaggcga aagattatac cactgaatat agcgcgtcgg tgaaaggtcg cttcattgtc 600

tcgcgcgata ccagccagtc gattctgtat ctgcaaatga atgccctgcg tgccgaagac 660

acggccatct acttctgtgc gcgtgatgca cgctttgcct attggggcca aggcaccctg 720

gtgaccgtta gcgcccatca ccatcaccat cactaa 756

<210> 49

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ScFv CA5 反向

<400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Glu Ile Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

145 150 155 160

Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Lys Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser Ile

195 200 205

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr

210 215 220

Phe Cys Ala Arg Asp Ala Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ala His His His His His His

245 250

<210> 50

<211> 92

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<221> misc_feature

<223> hFSH, hCG和hLH的α亚基

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> Xaa = Leu或Phe

<400> 50

Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro

1 5 10 15

Xaa Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys

20 25 30

Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu

35 40 45

Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser

50 55 60

Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr

65 70 75 80

Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser

85 90

<210> 51

<211> 96

<212> PRT

<213> 绵羊

<220>

<221> misc_feature

<223> oLH和oFSH 的α亚基

<400> 51

Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu

1 5 10 15

Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Pro Ile Tyr Gln Cys

20 25 30

Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys

35 40 45

Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys

50 55 60

Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val

65 70 75 80

Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser

85 90 95

<210> 52

<211> 96

<212> PRT

<213> 野猪

<220>

<221> misc_feature

<223> pLH和pFSH的α亚基

<400> 52

Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu

1 5 10 15

Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Leu Gly Ala Pro Ile Tyr Gln Cys

20 25 30

Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys

35 40 45

Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys

50 55 60

Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Ala Arg Val

65 70 75 80

Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser

85 90 95

<210> 53

<211> 111

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<221> misc_feature

<223> hFSH的β亚基

<400> 53

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu

1 5 10 15

Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys

20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln

35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro

50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr

65 70 75 80

Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val

85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu

100 105 110

<210> 54

<211> 132

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<221> misc_feature

<223> hCG的β亚基

<400> 54

Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu

1 5 10 15

Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr

20 25 30

Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val

35 40 45

Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe

50 55 60

Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val

65 70 75 80

Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser

85 90 95

Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp

100 105 110

Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu

115 120 125

Pro Ser Pro Ser

130

<210> 55

<211> 123

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<221> misc_feature

<223> hLH 的β亚基

<400> 55

Ser Arg Glu Pro Leu Arg Pro Arg Pro Trp Cys His Pro Ile Asn Ala

1 5 10 15

Ile Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn

20 25 30

Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Met Arg Val Leu Gln

35 40 45

Ala Val Leu Pro Pro Leu Pro Gln Val Val Cys Thr Tyr Arg Asp Val

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asp Pro

65 70 75 80

Val Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys Arg Cys Gly Pro Cys Arg

85 90 95

Arg Ser Thr Ser Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys

100 105 110

Asp His Pro Gln Leu Ser Gly Leu Leu Phe Leu

115 120

<210> 56

<211> 121

<212> PRT

<213> 绵羊

<220>

<221> misc_feature

<223> oLH的β亚基

<400> 56

Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Gln Pro Ile Asn Ala Thr Leu

1 5 10 15

Ala Ala Glu Lys Glu Ala Cys Pro Val Cys Ile Thr Phe Thr Thr Ser

20 25 30

Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Leu Ser Met Lys Arg Val Leu Pro Val Ile

35 40 45

Leu Pro Pro Met Pro Gln Arg Val Cys Thr Tyr His Glu Leu Arg Phe

50 55 60

Ala Ser Val Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val Asp Pro Met Val

65 70 75 80

Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys His Cys Gly Pro Cys Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Thr Asp Cys Gly Gly Pro Arg Thr Gln Pro Leu Ala Cys Asp His

100 105 110

Pro Pro Leu Pro Asp Ile Leu Phe Leu

115 120

<210> 57

<211> 121

<212> PRT

<213> 野猪

<220>

<221> misc_feature

<223> pLH的β亚基

<400> 57

Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu

1 5 10 15

Ala Ala Glu Asn Glu Ala Cys Pro Val Cys Ile Thr Phe Thr Thr Ser

20 25 30

Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Ser Met Val Arg Val Leu Pro Ala Ala

35 40 45

Leu Pro Pro Val Pro Gln Pro Val Cys Thr Tyr Arg Glu Leu Ser Phe

50 55 60

Ala Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val Asp Pro Thr Val

65 70 75 80

Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys His Cys Gly Pro Cys Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Ser Asp Cys Gly Gly Pro Arg Ala Gln Pro Leu Ala Cys Asp Arg

100 105 110

Pro Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu

115 120

<210> 58

<211> 110

<212> PRT

<213> 绵羊

<220>

<221> misc_feature

<223> oFSH的β亚基

<400> 58

Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu Cys

1 5 10 15

Ser Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr

20 25 30

Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln Lys

35 40 45

Ala Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro Gly

50 55 60

Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Glu

65 70 75 80

Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Arg Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg

85 90 95

Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Asp Ile Arg Glu

100 105 110

<210> 59

<211> 109

<212> PRT

<213> 野猪

<220>

<221> misc_feature

<223> pFSH的β亚基

<400> 59

Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu Cys Gly

1 5 10 15

Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr

20 25 30

Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln Lys Thr

35 40 45

Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro Gly Cys

50 55 60

Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Glu Cys

65 70 75 80

His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly

85 90 95

Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Glu Met Lys Glu

100 105

<210> 60

<211> 49

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<221> misc_feature

<223> hFSH受体的N末端区域

<400> 60

Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu Cys Gln

1 5 10 15

Glu Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu Pro Arg Asn Ala Ile

20 25 30

Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Gln Lys Gly Ala

35 40 45

Phe

<210> 61

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> βFSh上CA5的表位区域

<400> 61

Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn

1 5

<210> 62

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> βFSh上CA5的表位区域

<400> 62

Arg Val Pro Gly Cys Ala

1 5

<210> 63

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> βFSh上CA5的表位区域

<400> 63

Arg Gly Leu Gly Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met

1 5 10

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hFSh受体上CA5的表位区域

<400> 64

His His Arg Ile His

1 5

<210> 65

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hFSh受体上CA5的表位区域

<400> 65

Leu Gln Glu Lys

1

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> αFSH上CH10的表位区域

<400> 66

Gln Asp Cys Pro Glu

1 5

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> βFSH上CH10的表位区域

<400> 67

Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr

1 5

<210> 68

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> βFSH上CH10的表位区域

<400> 68

Ser Asn Trp Ala Gly Tyr

1 5

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> βFSH上CH10的表位区域

<400> 69

Leu Gly Pro Ser Tyr Gly Glu Met

1 5

<210> 70

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hFSH受体上CH10的表位区域

<400> 70

Cys His His Cys Ser

1 5

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种促卵泡激素(FSH)配体，所述配体增强FSH、促黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺素(CG)的生物活性，其特征在于，所述配体是抗体或其片段并且在于：

重链可变结构域含有下列CDR：

-由序列GFTFSDFY(SEQ ID NO:9)限定的VH-CDR1；

-由序列SRNKAKDYTT(SEQ ID NO:10)限定的VH-CDR2；

-由序列ARDARFAY(SEQ ID NO:11)限定的VH-CDR3；并且

轻链可变结构域含有下列CDR：

-由序列QSLLYSSNQKNY(SEQ ID NO:12)限定的VL-CDR1；

-由序列WAS限定的VL-CDR2；

-由序列QQYYSYPRT(SEQ ID NO:13)限定的VL-CDR3。

2.一种促卵泡激素(FSH)配体，所述配体增强FSH、促黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺素(CG)的生物活性，其特征在于，所述配体是抗体或其片段并且在于：

重链可变结构域含有下列CDR：

-由序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:14)限定的VH-CDR1；

-由序列IRSKSNNYAT(SEQ ID NO:15)限定的VH-CDR2；

-由序列VRQDYYGSSYFDY(SEQ ID NO:16)限定的VH-CDR3；并且

轻链可变结构域含有下列CDR：

-由序列QSISDY(SEQ ID NO:17)限定的VL-CDR1；

-由序列YAS限定的VL-CDR2；

-由序列QNGHSFPYT(SEQ ID NO:18)限定的VL-CDR3。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的配体，其特征在于，所述配体选自于由以下各项组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv、双抗体、三抗体、四抗体和纳米抗体。

4.根据权利要求1所述的配体，其特征在于，所述配体是由CNCM I-4801杂交瘤产生的CA5单克隆抗体。

5.根据权利要求2所述的配体，其特征在于，所述配体是由CNCM I-4802杂交瘤产生的CH10单克隆抗体。

6.根据权利要求3所述的配体，其特征在于，所述scFv的肽序列是序列SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的配体，用于作为药物的用途。

8.一种配体-促性腺素复合物，选自：

权利要求1至6中任一项所述的配体与FSH或其活性肽的复合物；

权利要求1至6中任一项所述的配体与LH或绒毛膜促性腺素(CG)激素或所述激素的活性肽的复合物。

9.根据权利要求8所述的复合物，用于作为药物的用途。

10.根据权利要求7所述的用于用途的配体或根据权利要求9所述的用于用途的复合物，其中所述药物旨在在雌性哺乳动物中诱导排卵或多排卵。

11.根据权利要求7所述的用于用途的配体或根据权利要求9所述的用于用途的复合物，其中，所述药物旨在增加雌性哺乳动物中的循环内源性孕酮水平。

12.一种药物组合物，旨在用于在雌性哺乳动物中诱导排卵或多排卵，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1至6中任一项所述的配体和/或权利要求8所述的复合物，以及药学上可接受的载体。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含FSH、LH和/或CG。

14.根据权利要求1至6中任一项所述的配体或根据权利要求8所述的复合物，用于在治疗和/或预防哺乳动物的不育或低生育力中的用途。

15.权利要求1至6中任一项所述的配体或权利要求8所述的复合物，用于在健康雌性哺乳动物中用于刺激生殖的用途。

Claims

1.一种促卵泡激素(FSH)配体，所述配体增强FSH、促黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺素(CG)的生物活性，其特征在于，所述配体包含抗-FSHβ-亚基抗体的互补位。

2.根据权利要求1所述的配体，其特征在于：

重链可变结构域含有下列CDR：

-由序列GFTFSDFY(SEQ ID NO:9)限定的VH-CDR1；

-由序列SRNKAKDYTT(SEQ ID NO:10)限定的VH-CDR2；

-由序列ARDARFAY(SEQ ID NO:11)限定的VH-CDR3；并且

轻链可变结构域含有下列CDR：

-由序列QSLLYSSNQKNY(SEQ ID NO:12)限定的VL-CDR1；

-由序列WAS限定的VL-CDR2；

-由序列QQYYSYPRT(SEQ ID NO:13)限定的VL-CDR3。

3.根据权利要求1所述的配体，其特征在于：

重链可变结构域含有下列CDR：

-由序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:14)限定的VH-CDR1；

-由序列IRSKSNNYAT(SEQ ID NO:15)限定的VH-CDR2；

-由序列VRQDYYGSSYFDY(SEQ ID NO:16)限定的VH-CDR3；并且

轻链可变结构域含有下列CDR：

-由序列QSISDY(SEQ ID NO:17)限定的VL-CDR1；

-由序列YAS限定的VL-CDR2；

-由序列QNGHSFPYT(SEQ ID NO:18)限定的VL-CDR3。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的配体，其特征在于，所述配体选自于由以下各项组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv、双抗体、三抗体、四抗体和纳米抗体。

5.根据权利要求2所述的配体，其特征在于，所述配体是由CNCM I-4801杂交瘤产生的CA5单克隆抗体。

6.根据权利要求3所述的配体，其特征在于，所述配体是由CNCM I-4802杂交瘤产生的CH10单克隆抗体。

7.根据权利要求4所述的配体，其特征在于，所述scFv的肽序列是序列SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的配体，用于作为药物的用途。

9.一种配体-促性腺素复合物，选自：

权利要求1至7中任一项所述的配体与FSH或其活性肽的复合物；

权利要求1至7中任一项所述的配体与LH或绒毛膜促性腺素(CG)激素或所述激素的活性肽的复合物。

10.根据权利要求9所述的复合物，用于作为药物的用途。

11.根据权利要求8所述的配体或根据权利要求10所述的复合物，其中所述药物旨在在雌性哺乳动物中诱导排卵或多排卵。

12.根据权利要求8所述的配体或根据权利要求10所述的复合物，其中，所述药物旨在增加雌性哺乳动物中的循环内源性孕酮水平。

13.一种药物组合物，旨在用于在雌性哺乳动物中诱导排卵或多排卵，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1至7中任一项所述的配体和/或权利要求9所述的复合物，以及药学上可接受的载体。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含FSH、LH和/或CG。

15.根据权利要求1至7中任一项所述的配体或根据权利要求9所述的复合物，用于在治疗和/或预防哺乳动物的不育或低生育力中的用途。

16.权利要求1至7中任一项所述的配体或权利要求9所述的复合物用于在健康雌性哺乳动物中刺激生殖的用途。