JPH1189569A - モノクローナル抗体産生細胞ライン及びその作製方法、並びにモノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体産生細胞ライン及びその作製方法、並びにモノクローナル抗体Info
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- JPH1189569A JPH1189569A JP9259528A JP25952897A JPH1189569A JP H1189569 A JPH1189569 A JP H1189569A JP 9259528 A JP9259528 A JP 9259528A JP 25952897 A JP25952897 A JP 25952897A JP H1189569 A JPH1189569 A JP H1189569A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト由来の絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）
を検出するのに有用なｈＣＧのβサブユニットに結合す
る抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体で、ｈＣＧに強く結
合する抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体を効率よく得
る。 【解決手段】 ｈＣＧ−βをマウスに免疫し、免疫した
マウスの脾臓細胞と骨髄腫由来の細胞ラインとを融合し
た後、クローニング以前に酵素免疫測定法を利用して、
ｈＣＧ、ｈＣＧのβサブユニット、黄体形成ホルモン、
ろ胞形成ホルモン及び甲状腺刺激ホルモンに対する結合
能を検定することにより目的の細胞を選別し、抗ｈＣＧ
−βモノクローナル抗体産生細胞ラインを作製する。細
胞ラインを培養し、その培養上清を精製することにより
抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体を得る。
を検出するのに有用なｈＣＧのβサブユニットに結合す
る抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体で、ｈＣＧに強く結
合する抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体を効率よく得
る。 【解決手段】 ｈＣＧ−βをマウスに免疫し、免疫した
マウスの脾臓細胞と骨髄腫由来の細胞ラインとを融合し
た後、クローニング以前に酵素免疫測定法を利用して、
ｈＣＧ、ｈＣＧのβサブユニット、黄体形成ホルモン、
ろ胞形成ホルモン及び甲状腺刺激ホルモンに対する結合
能を検定することにより目的の細胞を選別し、抗ｈＣＧ
−βモノクローナル抗体産生細胞ラインを作製する。細
胞ラインを培養し、その培養上清を精製することにより
抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体を得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト由来の絨毛性
性腺刺激ホルモンのβサブユニット（ｈＣＧ−β）に対
するモノクローナル抗体及びそれを作製するためのモノ
クローナル抗体産生ラインに関する。この抗ｈＣＧ−β
モノクローナル抗体は、妊娠時に体液中に分泌されるｈ
ＣＧの検出に利用することができ、特に医療の分野に有
効である。
性腺刺激ホルモンのβサブユニット（ｈＣＧ−β）に対
するモノクローナル抗体及びそれを作製するためのモノ
クローナル抗体産生ラインに関する。この抗ｈＣＧ−β
モノクローナル抗体は、妊娠時に体液中に分泌されるｈ
ＣＧの検出に利用することができ、特に医療の分野に有
効である。
【０００２】
【従来の技術】従来、ｈＣＧを免疫学的手法により高感
度で特異的に検出するために、ｈＣＧに対するモノクロ
ーナル抗体が作製されてきた。また、ｈＣＧを検出する
手段として、一般的に酵素免疫測定法におけるいわゆる
サンドイッチ方式が利用されている。このサンドイッチ
方式とは、まず抗ｈＣＧモノクローナル抗体を固相に固
定化し、抗体にｈＣＧを結合させ、先の抗ｈＣＧモノク
ローナル抗体とは別種類の、すなわちｈＣＧの別の部位
を認識するような、標識された抗ｈＣＧモノクローナル
抗体を添加することにより、２種類のモノクローナル抗
体がｈＣＧを介してサンドイッチ状に結合した状態にし
てｈＣＧを検出する方法であり、この状態は、ｈＣＧ存
在下のみで起こる。
度で特異的に検出するために、ｈＣＧに対するモノクロ
ーナル抗体が作製されてきた。また、ｈＣＧを検出する
手段として、一般的に酵素免疫測定法におけるいわゆる
サンドイッチ方式が利用されている。このサンドイッチ
方式とは、まず抗ｈＣＧモノクローナル抗体を固相に固
定化し、抗体にｈＣＧを結合させ、先の抗ｈＣＧモノク
ローナル抗体とは別種類の、すなわちｈＣＧの別の部位
を認識するような、標識された抗ｈＣＧモノクローナル
抗体を添加することにより、２種類のモノクローナル抗
体がｈＣＧを介してサンドイッチ状に結合した状態にし
てｈＣＧを検出する方法であり、この状態は、ｈＣＧ存
在下のみで起こる。
【０００３】ｈＣＧは、αサブユニット（ｈＣＧ−α）
及びβサブユニット（ｈＣＧ−β）のヘテロダイマーで
あり、各サブユニットを認識する抗体を作製することに
より上記のサンドイッチ方式に必要な一対の抗体を容易
に得ることができる。また、ｈＣＧのαサブユニット
は、ｈＣＧに類似のホルモンである黄体形成ホルモン
（ＬＨ）、ろ胞形成ホルモン（ＦＳＨ）、または甲状腺
刺激ホルモン（ＴＳＨ）と共通なサブユニットであり、
βサブユニットについては、一部のアミノ酸配列につい
ては同じ部分もあるが、基本的にｈＣＧに独特なサブユ
ニットである。サンドイッチ方式でｈＣＧを検出する場
合、どちらかの抗体がβサブユニットを認識するもので
あれば、ｈＣＧを特異的に検出する確率が高くなる。さ
らにこの特異性を決定的なものにするために、各抗体の
ＬＨ、ＦＳＨ、またはＴＳＨに対する結合能を確認する
ことが重要である。
及びβサブユニット（ｈＣＧ−β）のヘテロダイマーで
あり、各サブユニットを認識する抗体を作製することに
より上記のサンドイッチ方式に必要な一対の抗体を容易
に得ることができる。また、ｈＣＧのαサブユニット
は、ｈＣＧに類似のホルモンである黄体形成ホルモン
（ＬＨ）、ろ胞形成ホルモン（ＦＳＨ）、または甲状腺
刺激ホルモン（ＴＳＨ）と共通なサブユニットであり、
βサブユニットについては、一部のアミノ酸配列につい
ては同じ部分もあるが、基本的にｈＣＧに独特なサブユ
ニットである。サンドイッチ方式でｈＣＧを検出する場
合、どちらかの抗体がβサブユニットを認識するもので
あれば、ｈＣＧを特異的に検出する確率が高くなる。さ
らにこの特異性を決定的なものにするために、各抗体の
ＬＨ、ＦＳＨ、またはＴＳＨに対する結合能を確認する
ことが重要である。
【０００４】このような観点によりαサブユニットに結
合する抗体及びβサブユニットに結合する抗体を多くの
研究者が作製し、それらの抗体についてＬＨ、ＦＳＨ、
またはＴＳＨに対する結合能も調べられてきた。例え
ば、レインハード・コフラーらは（REINHARD KOFLER, e
t al.)、ｈＣＧを免疫して抗ｈＣＧモノクローナル抗体
産生細胞ラインを確立した後、放射線免疫測定法によ
り、得られたモノクローナル抗体のｈＣＧ−α、ｈＣＧ
−β、ＬＨ、ＦＳＨまたはＴＳＨに対する結合能を検定
し、α鎖に結合する抗体、β鎖に結合する抗体、ｈＣＧ
に結合する抗体の３種類に選別し、その評価を行ってい
る。（American Journal of Reproductive Immunology
2：212‐216（1982））。また、イアン-マイケル・ビダ
ートらは（EAN-MICHEL BIDART, et al.）、免疫原とし
てｈＣＧ−βをマウスに免疫することによりβサブユニ
ットに結合するモノクローナル抗体を得る方法を開示し
ている（Endocrinology l3l（4）l832‐l840（l99
2））。
合する抗体及びβサブユニットに結合する抗体を多くの
研究者が作製し、それらの抗体についてＬＨ、ＦＳＨ、
またはＴＳＨに対する結合能も調べられてきた。例え
ば、レインハード・コフラーらは（REINHARD KOFLER, e
t al.)、ｈＣＧを免疫して抗ｈＣＧモノクローナル抗体
産生細胞ラインを確立した後、放射線免疫測定法によ
り、得られたモノクローナル抗体のｈＣＧ−α、ｈＣＧ
−β、ＬＨ、ＦＳＨまたはＴＳＨに対する結合能を検定
し、α鎖に結合する抗体、β鎖に結合する抗体、ｈＣＧ
に結合する抗体の３種類に選別し、その評価を行ってい
る。（American Journal of Reproductive Immunology
2：212‐216（1982））。また、イアン-マイケル・ビダ
ートらは（EAN-MICHEL BIDART, et al.）、免疫原とし
てｈＣＧ−βをマウスに免疫することによりβサブユニ
ットに結合するモノクローナル抗体を得る方法を開示し
ている（Endocrinology l3l（4）l832‐l840（l99
2））。
【０００５】従来の抗ｈＣＧ−βモノクローナル作製法
では、ｈＣＧ−βを使用して細胞融合後初期の細胞選定
を行っており、ｈＣＧ−βに対する結合能を有する抗体
を産生する細胞群を得ることはできた。そして、ｈＣ
Ｇ、各サブユニットまたは類似ホルモンに対する結合能
を測定することにより最終的な細胞選定を行っていた。
では、ｈＣＧ−βを使用して細胞融合後初期の細胞選定
を行っており、ｈＣＧ−βに対する結合能を有する抗体
を産生する細胞群を得ることはできた。そして、ｈＣ
Ｇ、各サブユニットまたは類似ホルモンに対する結合能
を測定することにより最終的な細胞選定を行っていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】この方式では２段階方
式で細胞を選定しており、１段階目はｈＣＧ−βに対す
る親和性の高い抗体を産生する細胞を選定し、２段階目
でｈＣＧ、各サブユニットまたは類似ホルモンに対する
結合能を測定することにより細胞選定を行っている。す
なわち、βサブユニットに対する親和性の高い抗体を得
ることに重点を置いているため、αサブユニットとのダ
イマーの状態であるｈＣＧの状態では構造上内部に隠さ
れた構造に対しても検討していることになる。そのた
め、２段階目では、ｈＣＧに対して性能の良い抗体を出
すモノクローナル抗体産生細胞を得ることができない可
能性が高い。
式で細胞を選定しており、１段階目はｈＣＧ−βに対す
る親和性の高い抗体を産生する細胞を選定し、２段階目
でｈＣＧ、各サブユニットまたは類似ホルモンに対する
結合能を測定することにより細胞選定を行っている。す
なわち、βサブユニットに対する親和性の高い抗体を得
ることに重点を置いているため、αサブユニットとのダ
イマーの状態であるｈＣＧの状態では構造上内部に隠さ
れた構造に対しても検討していることになる。そのた
め、２段階目では、ｈＣＧに対して性能の良い抗体を出
すモノクローナル抗体産生細胞を得ることができない可
能性が高い。
【０００７】例えば、１段階目において、ｈＣＧの状態
では構造上内部に隠されるβサブユニットの構造に対し
ての抗体価が高かった場合、その細胞を選別してしま
い、βサブユニットには結合能を有するが、最終的に得
られるモノクローナル抗体がｈＣＧには低い結合能か、
または全く結合能を示さない可能性がある。
では構造上内部に隠されるβサブユニットの構造に対し
ての抗体価が高かった場合、その細胞を選別してしま
い、βサブユニットには結合能を有するが、最終的に得
られるモノクローナル抗体がｈＣＧには低い結合能か、
または全く結合能を示さない可能性がある。
【０００８】つまり、従来法は、ｈＣＧを検出する方法
であるサンドイッチ法に必須なｈＣＧ−β抗体を得るこ
とにおいては、低効率な細胞選定法を利用していた。
であるサンドイッチ法に必須なｈＣＧ−β抗体を得るこ
とにおいては、低効率な細胞選定法を利用していた。
【０００９】本発明は、上記の従来の問題点を解決する
ため、ｈＣＧ−βに対する高い特異性を達成しながら、
ｈＣＧに対する親和性も高い抗体及びその抗体を産生す
る細胞ラインを提供することを目的とする。
ため、ｈＣＧ−βに対する高い特異性を達成しながら、
ｈＣＧに対する親和性も高い抗体及びその抗体を産生す
る細胞ラインを提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明のモノクローナル
抗体産生細胞ライン作製方法は、ｈＣＧ−βで免疫した
哺乳動物の脾臓細胞と哺乳動物の骨髄由来の細胞ライン
とを融合し、クローニングするモノクローナル抗体産生
細胞ライン作製方法において、クローニング以前に免疫
測定法により融合細胞から産生される抗体のｈＣＧ、ｈ
ＣＧ−β、ＬＨ、ＦＳＨ及びＴＳＨに対する結合能を検
定することにより目的の細胞を選別することを特徴とす
る。
抗体産生細胞ライン作製方法は、ｈＣＧ−βで免疫した
哺乳動物の脾臓細胞と哺乳動物の骨髄由来の細胞ライン
とを融合し、クローニングするモノクローナル抗体産生
細胞ライン作製方法において、クローニング以前に免疫
測定法により融合細胞から産生される抗体のｈＣＧ、ｈ
ＣＧ−β、ＬＨ、ＦＳＨ及びＴＳＨに対する結合能を検
定することにより目的の細胞を選別することを特徴とす
る。
【００１１】また、前記構成においては、哺乳動物の骨
髄由来の細胞ラインが、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−
Ａｇ８．６５３であることが好ましい。
髄由来の細胞ラインが、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−
Ａｇ８．６５３であることが好ましい。
【００１２】また、前記構成においては、免疫測定法が
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）であることが好まし
い。
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）であることが好まし
い。
【００１３】また、本発明は、前記細胞ライン作製方法
により作製されたＭＨ−β１あるいはＭＨ−β２と命名
したモノクローナル抗体産生細胞ラインである。
により作製されたＭＨ−β１あるいはＭＨ−β２と命名
したモノクローナル抗体産生細胞ラインである。
【００１４】また、本発明は、、前記モノクローナル抗
体産生細胞ラインにより産生される抗ｈＣＧ−βモノク
ローナル抗体であって、ｈＣＧ、ｈＣＧ−βに結合能を
有し、ＬＨ、ＦＳＨ及びＴＳＨに結合能を有しないこと
を特徴とするモノクロ−ナル抗体である。
体産生細胞ラインにより産生される抗ｈＣＧ−βモノク
ローナル抗体であって、ｈＣＧ、ｈＣＧ−βに結合能を
有し、ＬＨ、ＦＳＨ及びＴＳＨに結合能を有しないこと
を特徴とするモノクロ−ナル抗体である。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て、具体的に説明する。ここで目的とする抗ｈＣＧ−β
抗体は、ｈＣＧのβサブユニットを検出するための材料
であるため免疫原も検出物質を使用することが最も望ま
しい。そこで、本発明では、ｈＣＧ−βを免疫原として
使用した。
て、具体的に説明する。ここで目的とする抗ｈＣＧ−β
抗体は、ｈＣＧのβサブユニットを検出するための材料
であるため免疫原も検出物質を使用することが最も望ま
しい。そこで、本発明では、ｈＣＧ−βを免疫原として
使用した。
【００１６】高規和性のモノクローナル抗体産生細胞を
得るためには、抗血清の時点で高い抗体力価を示してい
る必要がある。免疫応答は、感作動物の種類、系統によ
って異なる。感作動物の種類としては、マウス、ラッ
ト、ウシ、ウサギ、ヤギ等があげられるが、本発明では
各系統のマウス（Ａ／Ｊ、ＢＡＬＢ／Ｃ、ＤＢＡ／２、
Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）について調ぺたとこ
ろ、Ａ／Ｊ系統マウス及びＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスの血
清が高い抗体力価を示した。モノクローナル抗体産生細
胞ライン確立後の腹水による抗体大量培養においては、
ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることも考
慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを使用することにし
た。
得るためには、抗血清の時点で高い抗体力価を示してい
る必要がある。免疫応答は、感作動物の種類、系統によ
って異なる。感作動物の種類としては、マウス、ラッ
ト、ウシ、ウサギ、ヤギ等があげられるが、本発明では
各系統のマウス（Ａ／Ｊ、ＢＡＬＢ／Ｃ、ＤＢＡ／２、
Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）について調ぺたとこ
ろ、Ａ／Ｊ系統マウス及びＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスの血
清が高い抗体力価を示した。モノクローナル抗体産生細
胞ライン確立後の腹水による抗体大量培養においては、
ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることも考
慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを使用することにし
た。
【００１７】また、融合細胞の増殖能力は、細胞融合時
に用いられるマウス骨髄腫由来の細胞ラインの種類に依
存する。各種の細胞ラインを検定したところ、マウス骨
髄腫由来のＰ３Ｘ６３一Ａｇ８．６５３と融合した細胞
の増殖能力が高かった。
に用いられるマウス骨髄腫由来の細胞ラインの種類に依
存する。各種の細胞ラインを検定したところ、マウス骨
髄腫由来のＰ３Ｘ６３一Ａｇ８．６５３と融合した細胞
の増殖能力が高かった。
【００１８】以下、本発明の細胞ライン作製方法、及び
ｈＣＧ、ｈＣＧ−βに結合能を有し、ＬＨ、ＦＳＨ及び
ＴＳＨに結合能を有しないモノクローナル抗体を産生す
るモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製について具
体的に説明する。
ｈＣＧ、ｈＣＧ−βに結合能を有し、ＬＨ、ＦＳＨ及び
ＴＳＨに結合能を有しないモノクローナル抗体を産生す
るモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製について具
体的に説明する。
【００１９】（免疫）ｈＣＧ−β（recombinant、ロー
ト製薬）を生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用い
て２ｍｇ／ｍＬに調製し、これに同体積のアジュバント
（ヒト結核死菌合有完全フロイントアジュバント、和光
純薬製、Ｈ３７Ｒｖ）を添加し、よくホモジナイザ（１
０００ｒｐｍ）で乳化した。生後約８週の雌のマウス
（ＢＡＬＢ／Ｃ）２０匹に、免疫原を合むアジュバント
エマルジョンを１００μｌずつ注射した。２週間後、２
ｍｇ／ｍＬに調製した ｈＣＧ−β溶液と同体積の不完
全フロイントアジュバントをホモジナイザで乳化し、こ
のエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに１００μｌずつ
注射したその後、４、６、８週間後に再度 ｈＣＧ−β
を合む不完全フロイントアジュバントエマルジョンをマ
ウスに１００μｌずつ注射した。注射後、１週間目に採
血し、以下に示す抗体産生を確認した。
ト製薬）を生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用い
て２ｍｇ／ｍＬに調製し、これに同体積のアジュバント
（ヒト結核死菌合有完全フロイントアジュバント、和光
純薬製、Ｈ３７Ｒｖ）を添加し、よくホモジナイザ（１
０００ｒｐｍ）で乳化した。生後約８週の雌のマウス
（ＢＡＬＢ／Ｃ）２０匹に、免疫原を合むアジュバント
エマルジョンを１００μｌずつ注射した。２週間後、２
ｍｇ／ｍＬに調製した ｈＣＧ−β溶液と同体積の不完
全フロイントアジュバントをホモジナイザで乳化し、こ
のエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに１００μｌずつ
注射したその後、４、６、８週間後に再度 ｈＣＧ−β
を合む不完全フロイントアジュバントエマルジョンをマ
ウスに１００μｌずつ注射した。注射後、１週間目に採
血し、以下に示す抗体産生を確認した。
【００２０】（抗体産生の確認）採取した血清を、酵素
免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体産生の確認をし
た。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａ
ｚ（０．０４重量％ナトリウムアジドＰＢＳ溶液にウシ
血清アルブミン（以下ＢＳＡという）を０．１ｍｇ／ｍ
Ｌの濃度で溶解したもの）で調製した２．５μｇ／ｍＬ
・ｈＣＧを１００μｌ／ウェルずつ使用した。第二抗体
としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体または
ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。
その結果、すべてのマウスにおいて抗ｈＣＧ抗体（抗ｈ
ＣＧ−β抗体）の産生が認められるとともに、ＩｇＧ／
ＩｇＭ比が１００以上ありクラススイッチが起こってい
ることを確認した。
免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体産生の確認をし
た。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａ
ｚ（０．０４重量％ナトリウムアジドＰＢＳ溶液にウシ
血清アルブミン（以下ＢＳＡという）を０．１ｍｇ／ｍ
Ｌの濃度で溶解したもの）で調製した２．５μｇ／ｍＬ
・ｈＣＧを１００μｌ／ウェルずつ使用した。第二抗体
としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体または
ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。
その結果、すべてのマウスにおいて抗ｈＣＧ抗体（抗ｈ
ＣＧ−β抗体）の産生が認められるとともに、ＩｇＧ／
ＩｇＭ比が１００以上ありクラススイッチが起こってい
ることを確認した。
【００２１】（細胞融合）免疫したマウスの中で特に力
価の高かった４匹の脾臓を肥大させるために、ブースト
（弱い免疫原の注射）をした。免疫原は、１ｍｇ／ｍＬ
・ｈＣＧ−β溶液をアジュパントを加えずにそのまま用
いた。ブースト後３日を経過したマウスのうち２匹の脾
臓細胞を摘出し、平均分子量１、５００のポリエチレン
グリコールを用いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞
ライン（Ｐ３Ｘ６３一Ａｇ８．６５３）と融合した。フ
ィーダー（成長因子を供給する細胞）として同じマウス
の脾臓細胞を用い、９６ウェルプレート２枚の上で１５
重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を合むイシコフ
培地で１日間培養した後（１００μｌ／ウェル）、２倍
濃度のヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（Ｈ
ＡＴ）培地を１００μｌ／ウェル添加してＣＯ２インキ
ュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７度、湿
度：９５％）内で１週間培養した。その後、培養上清を
除いた後、１５重量％のＦＣＳを含むヒポキサンチン／
チミジン（ＨＴ）培地（２５０μｌ／ウェル）と交換し
た。
価の高かった４匹の脾臓を肥大させるために、ブースト
（弱い免疫原の注射）をした。免疫原は、１ｍｇ／ｍＬ
・ｈＣＧ−β溶液をアジュパントを加えずにそのまま用
いた。ブースト後３日を経過したマウスのうち２匹の脾
臓細胞を摘出し、平均分子量１、５００のポリエチレン
グリコールを用いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞
ライン（Ｐ３Ｘ６３一Ａｇ８．６５３）と融合した。フ
ィーダー（成長因子を供給する細胞）として同じマウス
の脾臓細胞を用い、９６ウェルプレート２枚の上で１５
重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を合むイシコフ
培地で１日間培養した後（１００μｌ／ウェル）、２倍
濃度のヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（Ｈ
ＡＴ）培地を１００μｌ／ウェル添加してＣＯ２インキ
ュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７度、湿
度：９５％）内で１週間培養した。その後、培養上清を
除いた後、１５重量％のＦＣＳを含むヒポキサンチン／
チミジン（ＨＴ）培地（２５０μｌ／ウェル）と交換し
た。
【００２２】（細胞選別）ＨＴ培地と交換１週間後、培
養上清を１５０μｌ／ウェルずつ取り出した。１５重量
％のＦＣＳを合むＨＴ培地（１５０μｌ／ウェル）を添
加し、３日間培養した後、培養上清を１５０μｌ／ウェ
ルずつ取り出した。合計で培養上清を３００μｌ／ウェ
ルを得ることができた。この培養上清を用いて以下に示
すＥＬＩＳＡ法によりｈＣＧに対する結合能を測定し
た。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａ
ｚで調製した２．５μｇ／ｍＬ・ｈＣＧを１００μｌ／
ウェルずつ使用した。抗体液として細胞培養上清を使用
した。この結果、ｈＣＧに対して結合能を示したものは
６１ウェルあり、第１段の選択としてこれらのウェルの
細胞を２４ウェルプレートに継代した。培地は１５重量
％のＦＣＳを含むＨＴ培地を４００μｌ／ウェルずつ加
えた。
養上清を１５０μｌ／ウェルずつ取り出した。１５重量
％のＦＣＳを合むＨＴ培地（１５０μｌ／ウェル）を添
加し、３日間培養した後、培養上清を１５０μｌ／ウェ
ルずつ取り出した。合計で培養上清を３００μｌ／ウェ
ルを得ることができた。この培養上清を用いて以下に示
すＥＬＩＳＡ法によりｈＣＧに対する結合能を測定し
た。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａ
ｚで調製した２．５μｇ／ｍＬ・ｈＣＧを１００μｌ／
ウェルずつ使用した。抗体液として細胞培養上清を使用
した。この結果、ｈＣＧに対して結合能を示したものは
６１ウェルあり、第１段の選択としてこれらのウェルの
細胞を２４ウェルプレートに継代した。培地は１５重量
％のＦＣＳを含むＨＴ培地を４００μｌ／ウェルずつ加
えた。
【００２３】第１段の継代３日後、培養上清を３００μ
ｌ／ウェルずつ取り出した。この培養上清を用いて以下
に示すＥＬＩＳＡ法によりｈＣＧ、ｈＣＧ−βに対する
結合能を測定した。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳ
Ａ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した２．５μｇ／ｍＬ・ｈＣ
Ｇ、ｈＣＧ−βを１００μｌ／ウェルずつ使用した。抗
体液として細胞培養上清を使用した。この結果、ｈＣＧ
及びｈＣＧ−βに対して結合能を示したものは３３ウェ
ルあり、第２段の選択としてこれらのウェルの細胞を６
ウェルプレートに継代した。培地は１５重量％のＦＣＳ
を含むＨＴ培地を８００μｌ／ウェルずつ加えた。
ｌ／ウェルずつ取り出した。この培養上清を用いて以下
に示すＥＬＩＳＡ法によりｈＣＧ、ｈＣＧ−βに対する
結合能を測定した。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳ
Ａ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した２．５μｇ／ｍＬ・ｈＣ
Ｇ、ｈＣＧ−βを１００μｌ／ウェルずつ使用した。抗
体液として細胞培養上清を使用した。この結果、ｈＣＧ
及びｈＣＧ−βに対して結合能を示したものは３３ウェ
ルあり、第２段の選択としてこれらのウェルの細胞を６
ウェルプレートに継代した。培地は１５重量％のＦＣＳ
を含むＨＴ培地を８００μｌ／ウェルずつ加えた。
【００２４】第２段の継代３日後、培養上清を４００μ
ｌ／ウェルずつ取り出した。この培養上清を用いて以下
に示すＥＬＩＳＡ法によりｈＣＧ、ｈＣＧ−β、ＬＨ、
ＦＳＨ及びＴＳＨに対する結合能を測定した。固相とし
て０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した
２．５μｇ／ｍＬ・ｈＣＧ、ｈＣＧ−β、ＬＨ、ＦＳＨ
及びＴＳＨを１００μｌ／ウェルずつ使用した。抗体液
として細胞培養上清を使用した。この結果、ｈＣＧ及び
ｈＣＧ−βに対してのみ結合能を示したものは６ウェル
あった。
ｌ／ウェルずつ取り出した。この培養上清を用いて以下
に示すＥＬＩＳＡ法によりｈＣＧ、ｈＣＧ−β、ＬＨ、
ＦＳＨ及びＴＳＨに対する結合能を測定した。固相とし
て０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した
２．５μｇ／ｍＬ・ｈＣＧ、ｈＣＧ−β、ＬＨ、ＦＳＨ
及びＴＳＨを１００μｌ／ウェルずつ使用した。抗体液
として細胞培養上清を使用した。この結果、ｈＣＧ及び
ｈＣＧ−βに対してのみ結合能を示したものは６ウェル
あった。
【００２５】（クローニング）上記６ウェルの細胞につ
いてウェルあたり１ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限
界希釈）し、９６ウェルのマイクロブレート６枚に分注
した。フィーダーとして生後５週の雌のマウス（ＢＡＬ
Ｂ／Ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレー
トのサイズを上げながら培養を進め、適時上清について
ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返し、ｈＣＧ
に対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している
細胞ラインを最終的に選別し、２００ｍＬ中で５×１０
５細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。最終的
に、ｈＣＧ、ｈＣＧ−βに対して結合能を示し、かつｈ
ＣＧに対して親和性の高かった２株を選定した。
いてウェルあたり１ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限
界希釈）し、９６ウェルのマイクロブレート６枚に分注
した。フィーダーとして生後５週の雌のマウス（ＢＡＬ
Ｂ／Ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレー
トのサイズを上げながら培養を進め、適時上清について
ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返し、ｈＣＧ
に対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している
細胞ラインを最終的に選別し、２００ｍＬ中で５×１０
５細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。最終的
に、ｈＣＧ、ｈＣＧ−βに対して結合能を示し、かつｈ
ＣＧに対して親和性の高かった２株を選定した。
【００２６】２株のうち、１株は細胞ライン名をＭＨ−
β１と命名し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に平成９年９月１７日に国際寄託した（受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−６１０６号）。もう一株は細胞ライン
名をＭＨ−β２と命名し、同様に平成９年９月１７日に
国際寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６１０７
号）。
β１と命名し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に平成９年９月１７日に国際寄託した（受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−６１０６号）。もう一株は細胞ライン
名をＭＨ−β２と命名し、同様に平成９年９月１７日に
国際寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６１０７
号）。
【００２７】（細胞の保存）最終的に選別された細胞ラ
インは、上清を遠心分離し、１×１０７細胞／ｍＬの濃
度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積
比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、一８０度で予備凍結した
後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
インは、上清を遠心分離し、１×１０７細胞／ｍＬの濃
度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積
比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、一８０度で予備凍結した
後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【００２８】（抗体の精製）選んだ２株を大量培養し、
その上清を遠心分離より単離した。各株の細胞培養上清
についてプロティンＡ結合ゲル（プロティンＡセファロ
ースＣＬ−４Ｂ、ファルマシア製）を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィにより、細胞培養上清から各モノ
クローナル抗体を精製した。このモノクローナル抗体は
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準蛋
白との比較から、精製抗体は分子量約５０，０００のＨ
鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを
確認した。
その上清を遠心分離より単離した。各株の細胞培養上清
についてプロティンＡ結合ゲル（プロティンＡセファロ
ースＣＬ−４Ｂ、ファルマシア製）を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィにより、細胞培養上清から各モノ
クローナル抗体を精製した。このモノクローナル抗体は
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準蛋
白との比較から、精製抗体は分子量約５０，０００のＨ
鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを
確認した。
【００２９】（抗体の評価）上記のアフィニティクロマ
トグラフィにより精製した２種類のモノクローナル抗体
について以下に示すＥＬＩＳＡ法で抗体評価を行った。
図１は、ＭＨ−β１についてｈＣＧに対する結合能力を
測定した結果を示すグラフである。図２は同様にＭＨ−
β２についてｈＣＧに対する結合能力を測定した結果を
示すグラフである。図１及び図２のグラフにおいて、縦
軸は吸光度、横軸はｈＣＧ濃度（mole／L以下Ｍ）の対
数値である。図１に示すようにＭＨ−β１では、１０-
１０Ｍより高い濃度のｈＣＧを検出することができた。
また、図２に示すようにＭＨ−β２でも、１０-１０Ｍ
より高い濃度のｈＣＧを検出することができた。
トグラフィにより精製した２種類のモノクローナル抗体
について以下に示すＥＬＩＳＡ法で抗体評価を行った。
図１は、ＭＨ−β１についてｈＣＧに対する結合能力を
測定した結果を示すグラフである。図２は同様にＭＨ−
β２についてｈＣＧに対する結合能力を測定した結果を
示すグラフである。図１及び図２のグラフにおいて、縦
軸は吸光度、横軸はｈＣＧ濃度（mole／L以下Ｍ）の対
数値である。図１に示すようにＭＨ−β１では、１０-
１０Ｍより高い濃度のｈＣＧを検出することができた。
また、図２に示すようにＭＨ−β２でも、１０-１０Ｍ
より高い濃度のｈＣＧを検出することができた。
【００３０】また、各細胞ラインについて再度各ホルモ
ンに対する結合能を測定したところ、ＭＨ−β１、ＭＨ
−β２共にｈＣＧ及びｈＣＧ−βに対してのみ結合能を
示した。
ンに対する結合能を測定したところ、ＭＨ−β１、ＭＨ
−β２共にｈＣＧ及びｈＣＧ−βに対してのみ結合能を
示した。
【００３１】（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法））得ら
れた抗血清、培養上清及びモノクローナル抗体の評価を
した。その操作法を以下に記載する。
れた抗血清、培養上清及びモノクローナル抗体の評価を
した。その操作法を以下に記載する。
【００３２】（Ａ）抗原のコーティング ２．５μｇ／ｍＬになるようにｈＣＧ、ｈＣＧ−β、Ｌ
Ｈ、ＦＳＨまたはＴＳＨを０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−
ＰＢＳ−Ａｚで調製した。マイクロプレート（塩化ビニ
ル製９６ウェルプレート コスター社製）に抗原溶液を
１００μｌ／ウェル注入し、２０度で一晩保存した。実
験直前に、アスピレータで抗原溶液を除去した。
Ｈ、ＦＳＨまたはＴＳＨを０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−
ＰＢＳ−Ａｚで調製した。マイクロプレート（塩化ビニ
ル製９６ウェルプレート コスター社製）に抗原溶液を
１００μｌ／ウェル注入し、２０度で一晩保存した。実
験直前に、アスピレータで抗原溶液を除去した。
【００３３】（Ｂ）ブロッキング ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを２００μｌ／ウェル注入し、３
０分間室温で放置した。その後、アスピレータでＢＳＡ
−ＰＢＳ−Ａｚを除去した。即日に以降の実験を行わな
いときは、この状態で、水で湿したろ紙と共に４度で保
存した。
０分間室温で放置した。その後、アスピレータでＢＳＡ
−ＰＢＳ−Ａｚを除去した。即日に以降の実験を行わな
いときは、この状態で、水で湿したろ紙と共に４度で保
存した。
【００３４】（Ｃ）抗体の反応 １重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで種々の濃度に希釈した
抗体溶液（抗血清、培養上清、精製抗体等）を５０μｌ
／ウェル、及び１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを５０μ
ｌ／ウェルで注入した。相対的な親和性を測定する目的
でインヒピションの実験を行うときはインヒピタ溶液
（ｈＣＧ、ｈＣＧ−β、ＬＨ、ＦＳＨまたはＴＳＨ）を
５０μｌ／ウェル注入し、振とうしながら抗体溶液５０
μｌ／ウェルをさらに加えた。常温で３時間保存した
後、アスピレータで抗体溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗
浄し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
抗体溶液（抗血清、培養上清、精製抗体等）を５０μｌ
／ウェル、及び１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを５０μ
ｌ／ウェルで注入した。相対的な親和性を測定する目的
でインヒピションの実験を行うときはインヒピタ溶液
（ｈＣＧ、ｈＣＧ−β、ＬＨ、ＦＳＨまたはＴＳＨ）を
５０μｌ／ウェル注入し、振とうしながら抗体溶液５０
μｌ／ウェルをさらに加えた。常温で３時間保存した
後、アスピレータで抗体溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗
浄し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【００３５】（Ｄ）第２抗体の反応 ０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ
Ｇ抗体ヤギ由来（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢ
Ｓ溶液に溶解したもの、または０．２μｇ／ｍＬのペル
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体ヤギ由来（ＫＰＬ
社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したものを
５０μｌ／ウェル注入し、常温で３０分放置した。アス
ピレータで除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピ
レータで残存するＰＢＳを除去した。
Ｇ抗体ヤギ由来（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢ
Ｓ溶液に溶解したもの、または０．２μｇ／ｍＬのペル
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体ヤギ由来（ＫＰＬ
社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したものを
５０μｌ／ウェル注入し、常温で３０分放置した。アス
ピレータで除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピ
レータで残存するＰＢＳを除去した。
【００３６】（Ｅ）基質の反応と停止 Ｏ−フェニレンジアミン（生化学用）４０ｍｇを１０ｍ
Ｌのクエン酸一リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し、
使用直前に３０重量％過酸化水素水４μＬを加えた溶液
（基質溶液）を１００μｌ／ウェル注入し、室温放置し
た。５分後、４Ｎ硫酸を２５μｌ／ウェル注入して反応
を停止した。
Ｌのクエン酸一リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し、
使用直前に３０重量％過酸化水素水４μＬを加えた溶液
（基質溶液）を１００μｌ／ウェル注入し、室温放置し
た。５分後、４Ｎ硫酸を２５μｌ／ウェル注入して反応
を停止した。
【００３７】（Ｆ）測定 東洋ソーダマイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍ
の吸光度を測定した。通常第１列は純水を注入して参照
値とし、適時（Ｃ）項のみを省いたブランク値を使用し
た。
の吸光度を測定した。通常第１列は純水を注入して参照
値とし、適時（Ｃ）項のみを省いたブランク値を使用し
た。
【００３８】なお、本実施例では免疫測定法として酵素
免疫測定法を用いたが、他にＲＩＡ法、蛍光抗体法等で
あってもよい。
免疫測定法を用いたが、他にＲＩＡ法、蛍光抗体法等で
あってもよい。
【００３９】
【発明の効果】以上説明した通り、本発明のモノクロー
ナル抗体産生細胞ライン作製方法によれば、細胞融合後
初期に存在する多くの細胞から効率よく有用な細胞を選
ぶことができ、ｈＣＧに対する高い親和性を達成しなが
ら特異性の高い抗体を産生する細胞ラインを作製でき
る。
ナル抗体産生細胞ライン作製方法によれば、細胞融合後
初期に存在する多くの細胞から効率よく有用な細胞を選
ぶことができ、ｈＣＧに対する高い親和性を達成しなが
ら特異性の高い抗体を産生する細胞ラインを作製でき
る。
【００４０】また、免疫測定法が酵素免疫測定法（ＥＬ
ＩＳＡ法）であると、簡便に感度よく検定することがで
きる。
ＩＳＡ法）であると、簡便に感度よく検定することがで
きる。
【００４１】また哺乳動物の骨髄腫由来の細胞ライン
が、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３であ
ると、融合細胞の増殖能力が優れているため短時間に多
くの細胞を検定することができる。
が、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３であ
ると、融合細胞の増殖能力が優れているため短時間に多
くの細胞を検定することができる。
【００４２】また免疫する哺乳動物がマウスまたはラッ
トであると、動物の取り扱い、免疫感作の点で都合がよ
い。また免疫する哺乳動物がＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスで
あると、ｈＣＧ−βとの親和性が極めて高いモノクロー
ナル抗体を得ることが可能となる。
トであると、動物の取り扱い、免疫感作の点で都合がよ
い。また免疫する哺乳動物がＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスで
あると、ｈＣＧ−βとの親和性が極めて高いモノクロー
ナル抗体を得ることが可能となる。
【００４３】また、本発明のモノクローナル抗体産生細
胞ラインによれば、それを培養することによりｈＣＧ及
びｈＣＧ−βに対する高い親和性を有し特異性の高い抗
ｈＣＧ−βモノクローナル抗体を永久的に提供できる。
したがって、本発明のモノクローナル抗体を、抗ｈＣＧ
−α抗体あるいは本発明の抗体と交叉反応しない抗ｈＣ
Ｇポリクローナルに対する抗体と組み合わせてサンドイ
ッチ法に使用すれば、ＬＨ、ＦＳＨ及びＴＳＨに反応し
ない高感度のｈＣＧ検出キットを提供することが可能と
なる。
胞ラインによれば、それを培養することによりｈＣＧ及
びｈＣＧ−βに対する高い親和性を有し特異性の高い抗
ｈＣＧ−βモノクローナル抗体を永久的に提供できる。
したがって、本発明のモノクローナル抗体を、抗ｈＣＧ
−α抗体あるいは本発明の抗体と交叉反応しない抗ｈＣ
Ｇポリクローナルに対する抗体と組み合わせてサンドイ
ッチ法に使用すれば、ＬＨ、ＦＳＨ及びＴＳＨに反応し
ない高感度のｈＣＧ検出キットを提供することが可能と
なる。
【図１】本発明の一実施例の抗ｈＣＧ−βモノクローナ
ル抗体（ＭＨ−β１）を用いたＥＬＩＳＡ法によるｈＣ
Ｇに対する結合能を示すグラフ
ル抗体（ＭＨ−β１）を用いたＥＬＩＳＡ法によるｈＣ
Ｇに対する結合能を示すグラフ
【図２】本発明の異なる実施例の抗ｈＣＧ−βモノクロ
ーナル抗体（ＭＨ−β２）を用いたＥＬＩＳＡ法による
ｈＣＧに対する結合能を示すグラフ
ーナル抗体（ＭＨ−β２）を用いたＥＬＩＳＡ法による
ｈＣＧに対する結合能を示すグラフ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】ヒト由来の絨毛性ゴナドトロピンのβサブ
ユニット（ｈＣＧ−β）で免疫した哺乳動物の脾臓細胞
と、前記哺乳動物の骨髄腫由来の細胞ラインとを細胞融
合し、その結果得られた融合細胞の中から必要とする抗
体を産生する細胞ラインをクローニングする以前に、免
疫測定法により融合細胞から産生される抗体のｈＣＧ、
ｈＣＧ−β、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ろ胞形成ホル
モン（ＦＳＨ）及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対
する結合能を検定することにより、目的の細胞を選別す
ることを特徴とするモノクローナル抗体産生細胞ライン
作製方法。 - 【請求項２】哺乳動物の骨髄腫由来の細胞ラインが、マ
ウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３である請求
項１記載のモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方
法。 - 【請求項３】免疫測定法が酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ
法）である請求項１記載のモノクローナル抗体産生細胞
ライン作製方法。 - 【請求項４】免疫する哺乳動物がＢＡＬＢ／Ｃ系統マウ
スである請求項１記載のモノクローナル抗体産生細胞ラ
イン作製方法。 - 【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載のモノクロ
ーナル抗体産生細胞ライン作製方法により作製され、前
記ｈＣＧ、前記ｈＣＧ−βに結合能を有し、前記ＬＨ、
前記ＦＳＨ及び前記ＴＳＨに結合能を有しないモノクロ
ーナル抗体を産生する工業技術院生命工学工業技術研究
所受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６１０６号または同受託番
号６１０７号のモノクローナル抗体産生細胞ライン。 - 【請求項６】請求項５に記載の細胞ラインにより産生さ
れるものであって、前記ｈＣＧ、前記ｈＣＧ−βに結合
能を有し、前記ＬＨ、前記ＦＳＨ及び前記ＴＳＨに結合
能を有しないことを特徴とする抗ｈＣＧモノクローナル
抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9259528A JPH1189569A (ja) | 1997-09-25 | 1997-09-25 | モノクローナル抗体産生細胞ライン及びその作製方法、並びにモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9259528A JPH1189569A (ja) | 1997-09-25 | 1997-09-25 | モノクローナル抗体産生細胞ライン及びその作製方法、並びにモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1189569A true JPH1189569A (ja) | 1999-04-06 |
Family
ID=17335367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9259528A Withdrawn JPH1189569A (ja) | 1997-09-25 | 1997-09-25 | モノクローナル抗体産生細胞ライン及びその作製方法、並びにモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1189569A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009504659A (ja) * | 2005-08-08 | 2009-02-05 | オンコノン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 抗体組成物、腫瘍性疾患の処置方法、および受胎能の調節方法 |
| CN107108731A (zh) * | 2014-09-10 | 2017-08-29 | 瑞普罗制药公司 | 增强促性腺素的生物活性的配体 |
-
1997
- 1997-09-25 JP JP9259528A patent/JPH1189569A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009504659A (ja) * | 2005-08-08 | 2009-02-05 | オンコノン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 抗体組成物、腫瘍性疾患の処置方法、および受胎能の調節方法 |
| CN107108731A (zh) * | 2014-09-10 | 2017-08-29 | 瑞普罗制药公司 | 增强促性腺素的生物活性的配体 |
| CN107108732A (zh) * | 2014-09-10 | 2017-08-29 | 瑞普罗制药公司 | 增强促性腺素的生物活性的配体 |
| CN107108731B (zh) * | 2014-09-10 | 2021-11-23 | 依格可奥斯公司 | 增强促性腺素的生物活性的配体 |
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