CN110279860A - Nrg4作为靶点在制备糖尿病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Nrg4作为靶点在制备糖尿病药物中的应用。本发明从离体和在体两个层面证明了肝脏Nrg4对于肝糖异生调控的重要作用，肝脏特异性沉默Nrg4有望成为2型糖尿病新的潜在治疗靶点。
Description
技术领域
本发明属于糖尿病药物领域，特别涉及一种Nrg4作为靶点在制备糖尿病药物中的应用。
背景技术
Nrg4是一种表皮生长因子样蛋白，是Neuregulins家族的成员之一，可以通过与细胞表面的酪氨酸激酶受体ErbB3和ErbB4结合，激活下游信号通路，在组织发育、表皮细胞的存活和神经突触的生长和分化等方面发挥着重要作用。
近年来越来越多的研究表明，Nrg4参与小鼠机体代谢，尤其是脂代谢方面。Nrg4在小鼠脂肪组织、肝脏和肺均有较高丰度的表达，有研究表明，脂肪组织Nrg4的表达量与肥胖呈正相关，Nrg4可以拮抗饮食诱导的胰岛素抵抗，通过抑制肝脏的脂质合成、刺激脂肪酸氧化和促进酮体合成，减少肝细胞脂肪变性。因此Nrg4被认为是调控肥胖相关代谢紊乱的有益因子，然而尚未有研究明确阐述Nrg4与机体糖代谢以及肝糖异生之间的关系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种Nrg4作为靶点在制备糖尿病药物中的应用，从离体和在体两个层面证明了肝脏Nrg4对于肝糖异生调控的重要作用，肝脏特异性沉默Nrg4有望成为2型糖尿病新的潜在治疗靶点。
本发明提供了一种Nrg4作为靶点在制备糖尿病药物中的应用。
所述药物以Nrg4作为靶点，配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。
所述制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
有益效果
本发明从离体和在体两个层面证明了肝脏Nrg4对于肝糖异生调控的重要作用，肝脏特异性沉默Nrg4有望成为2型糖尿病新的潜在治疗靶点。
附图说明
图1为Nrg4干扰或过表达小鼠肝原代细胞的MTT试验。
图2为对照腺病毒(sh-Ctrl)或Nrg4干扰腺病毒(sh-Nrg4)转染小鼠肝原代细胞后Nrg4 mRNA的表达水平。
图3为对照腺病毒(sh-Ctrl)或Nrg4干扰腺病毒(sh-Nrg4)转染小鼠肝原代细胞后PEPCK和G6Pase的表达水平；其中，A-B为实时荧光定量PCR，C为Western Blot检测。
图4A-B为对照腺病毒(sh-Ctrl)或Nrg4干扰腺病毒(sh-Nrg4)转染小鼠肝原代细胞后FBPase和PC mRNA的表达水平。
图5为对照腺病毒(sh-Ctrl)或Nrg4干扰腺病毒(sh-Nrg4)转染小鼠肝原代细胞后肝原代细胞培养基中葡萄糖的产生量。
图6为对照腺病毒(Ad-Ctrl)或Nrg4过表达病毒(Ad-Nrg4)转染小鼠肝原代细胞后Nrg4 mRNA的表达水平。
图7为对照腺病毒(Ad-Ctrl)或Nrg4过表达病毒(Ad-Nrg4)转染小鼠肝原代细胞后PEPCK和G6Pase的表达水平；其中，A-B为实时荧光定量PCR，C为Western Blot检测。
图8A-B为对照腺病毒(Ad-Ctrl)或Nrg4过表达病毒(Ad-Nrg4)转染小鼠肝原代细胞后FBPase和PC mRNA的表达水平。
图9为对照腺病毒(Ad-Ctrl)或Nrg4过表达病毒(Ad-Nrg4)转染小鼠肝原代细胞后肝原代细胞培养基中葡萄糖的产生量。
图10A为对照组(sh-Ctrl)与干扰病毒注射组(sh-Nrg4组)通过实时荧光定量PCR检测C57BL/6小鼠肝脏Nrg4 mRNA水平的表达情况；图10B-C为C57BL/6小鼠检测腓肠肌以及附睾白色脂肪组织Nrg4 mRNA水平的表达情况。
图11A为对照组(sh-Ctrl)与干扰病毒注射组(sh-Nrg4组)C57BL/6小鼠肝脏PEPCK、G6Pase和PGC-1α mRNA的表达水平；图11B为C57BL/6小鼠肝脏PEPCK、G6Pase蛋白的表达水平；图11C为C57BL/6小鼠肝脏FBPase mRNA的表达水平。
图12为对照组(sh-Ctrl)与干扰病毒注射组(sh-Nrg4组)C57BL/6小鼠肝脏PGC-1αmRNA。的表达水平。
图13为腺病毒注射C57BL/6小鼠的丙酮酸耐量试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、实验测试
利用小鼠肝原代细胞模型以及C57BL/6小鼠模型，从离体和在体两个层面，在干扰或过表达Nrg4的条件下，观察糖异生关键酶PEPCK、G6Pase及相关转录因子的表达情况，检测肝糖异生水平的变化。
二、测试结果
1.Nrg4在小鼠肝原代细胞中调控肝糖异生
①Nrg4的干扰或过表达不影响小鼠肝原代细胞的活力
为了确认Nrg4对肝糖异生的调控作用，在小鼠肝原代细胞中通过腺病毒转染的方法，改变了Nrg4的表达水平，观察了糖异生关键酶的表达以及葡萄糖产生量的变化。
此前有文献报道，Nrg4可能具有抗凋亡的活性，因此首先确认了Nrg4的干扰或过表达是否会影响小鼠肝脏原代细胞的细胞活力和细胞凋亡。分离的小鼠肝原代细胞铺于96孔板中，使用腺病毒转染24h后进行了MTT试验，结果提示，与对照组相比，Nrg4的干扰或过表达并不影响小鼠肝原代细胞的细胞活力(图1)。
②Nrg4的敲减抑制小鼠肝原代细胞的糖异生
使用对照腺病毒(sh-Ctrl)或Nrg4干扰腺病毒(sh-Nrg4)转染小鼠肝原代细胞24h后，100nM Dex预处理16h，之后再使用含有糖异生底物(10mM乳酸和1mM丙酮酸)的无糖DMEM培液和100μM cAMP处理8h以模拟肝糖异生环境。Trizol提取细胞总RNA，逆转录后通过实时荧光定量PCR检测了相关基因mRNA水平的表达情况。如图2所示，cAMP可以刺激Nrg4的表达，同时，与sh-Ctrl组相比，Nrg4干扰腺病毒显著下调了小鼠肝原代细胞中Nrg4的表达水平。在对照组(Control组)和cAMP处理组中，Nrg4 mRNA水平的表达均存在超过50％的下降。
为了确认Nrg4对肝糖异生的影响，选择肝糖异生的两个关键酶PEPCK和G6Pase作为靶基因，通过观察这两个基因的表达，判断Nrg4对肝糖异生的调控作用。如图3A-C所示，Nrg4表达的下降显著抑制了cAMP所刺激的糖异生关键酶PEPCK和G6Pase mRNA水平和蛋白水平的表达。
糖异生过程中存在三步不可逆反应，其中包括果糖-1，6-二磷酸在果糖-1，6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase，FBPase)的催化下水解生成果糖-6-磷酸这一过程，因此FBPase也是糖异生的限速酶之一。检测了Nrg4敲减的情况下肝脏原代细胞中FBPase的表达情况，如图4A所示，cAMP可以显著上调FBPase的表达，然而在sh-Nrg4组中Nrg4的表达抑制仅能轻度下调FBPase的表达水平，与sh-Ctrl组相比不存在统计学上的显著差异。糖异生的第一步反应为丙酮酸羧化生成草酰乙酸，该步反应由丙酮酸羧化酶(Pyruvatecarboxylase，PC)催化。有文献表明，肝组织特异性抑制PC可以降低肝糖异生水平，因此检测了Nrg4敲减的情况下肝原代细胞中PC的表达情况。如图4B所示，cAMP并不能刺激PC的表达，同时sh-Nrg4组中Nrg4的表达抑制也不能改变PC的表达水平。
为确定肝糖异生是否被抑制，使用葡萄糖氧化酶法检测了肝原代细胞培养基中葡萄糖的产生量。如图5所示，cAMP可以刺激肝原代细胞葡萄糖的产生，而Nrg4的敲减则显著抑制了这一过程。上述结果提示，Nrg4的敲减通过下调糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的表达，抑制了小鼠肝原代细胞的糖异生水平。
③Nrg4的过表达增加小鼠肝原代细胞的糖异生水平
上述实验已经证明Nrg4的敲减可以通过抑制PEPCK和G6Pase的表达抑制肝原代细胞的糖异生水平，为了进一步确认Nrg4在肝糖异生中的作用，使用了对照腺病毒(Ad-Ctrl)或Nrg4过表达病毒(Ad-Nrg4)转染了小鼠肝脏原代细胞，观察了Nrg4过表达对糖异生的影响。对照或过表达Nrg4腺病毒转染小鼠肝原代细胞24h后，提取了总蛋白和总RNA进行相关检测。实时荧光定量PCR的结果显示，与Ad-Ctrl组相比，Ad-Nrg4组小鼠肝原代细胞中Nrg4mRNA水平的表达显著增加(图6)，上调了3倍左右。同时Nrg4表达的增加刺激了糖异生关键酶PEPCK和G6Pase mRNA水平和蛋白的表达(图7A-C)。Nrg4的过表达轻度增加了FBPasemRNA水平的表达，但是对PC的表达无影响(图8A-B)。葡萄糖产生量检测试验的结果显示，过表达Nrg4显著增加了肝原代细胞葡萄糖的输出(图9)。综上所述，Nrg4的过表达能够通过上调糖异生限速酶PEPCK、G6Pase和FBPase的表达，增加小鼠肝原代细胞的糖异生能力。
上述实验结果从干扰和过表达两个方向证明，在离体水平，肝细胞所表达的Nrg4可以通过调节糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的表达，进而调控小鼠肝原代细胞的糖异生能力。
2.肝脏特异性敲减Nrg4抑制C57BL/6小鼠的肝糖异生
上述实验已经在离体水平证明了Nrg4对肝糖异生的调控作用，为了进一步明确Nrg4在在体水平对小鼠肝糖异生的影响，采取了尾静脉注射腺病毒的方法，将对照腺病毒(sh-Ctrl)或Nrg4干扰腺病毒(sh-Nrg4)注射至C57BL/6小鼠体内，特异性敲减其肝脏Nrg4的表达，观察了糖异生关键酶PEPCK、G6Pase的表达情况以及肝糖异生的水平。
①sh-Nrg4特异性抑制C57BL/6小鼠肝脏Nrg4表达
首先对小鼠肝组织Nrg4的表达情况进行了检测。与sh-Ctrl组相比，sh-Nrg4组小鼠肝脏Nrg4的表达水平呈现约50％的下降(图10A)，与此同时，在其他代谢旺盛的组织如腓肠肌以及附睾白色脂肪中，Nrg4的表达并没有产生显著的改变(图10B、C)，证明Nrg4干扰腺病毒的敲减作用具有肝组织特异性，能够特异性抑制C57BL/6小鼠肝脏Nrg4的表达。
②特异性敲减Nrg4抑制C57BL/6小鼠肝脏PEPCK、G6Pase和PGC-1α的表达
进一步检测了肝脏糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的表达，结果发现，腺病毒介导的肝脏Nrg4敲减导致了肝组织PEPCK、G6Pase mRNA和蛋白水平的显著下降(图11A-B)，FBPase的表达水平没有发生显著的变化(图11C)。过氧化物酶体增殖物激活受体γ协同刺激因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α)是一种重要的转录辅激活因子，可以在饥饿的条件下刺激PEPCK和G6Pase的表达。在本实验中，发现注射了Nrg4干扰腺病毒的小鼠，肝脏PGC-1α mRNA水平的表达同样被显著抑制(图12)。
③肝脏特异性敲减Nrg4增强C57BL/6小鼠的丙酮酸耐量
为确认肝脏Nrg4敲减对肝糖异生功能的影响，在连续注射腺病毒7天后，对禁食16h后的sh-Ctrl组和sh-Nrg4组小鼠进行了丙酮酸耐量试验。结果显示，sh-Nrg4组小鼠的空腹血糖以及在丙酮酸钠注射后的第30min和120min的血糖均低于sh-Ctrl组小鼠(图13)，说明在饥饿的条件下sh-Nrg4组小鼠的肝糖异生功能被下调。这一结果与肝脏糖异生关键酶表达水平的改变相吻合，证明Nrg4在在体水平确实存在调控肝糖异生的作用。
三、结论
通过实验首次从离体和在体两个层面证明了肝脏Nrg4对于肝糖异生调控的重要作用。小鼠肝原代细胞中Nrg4的干扰或过表达可以下调或上调PEPCK和G6Pase的表达及糖异生水平。尾静脉注射Nrg4干扰腺病毒后，C57BL/6小鼠肝脏Nrg4表达下降，肝糖异生降低，同时伴随PEPCK、G6Pas及PGC-1α的表达抑制。因此，Nrg4对小鼠肝糖异生的调控具有重要作用，肝脏特异性沉默Nrg4可能会成为2型糖尿病新的潜在治疗靶点。
Claims (3)
1.一种Nrg4作为靶点在制备糖尿病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物以Nrg4作为靶点，配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
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