CN114948928B - 咖啡豆醇在制备防治急性肺损伤药物中的应用 - Google Patents

咖啡豆醇在制备防治急性肺损伤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了咖啡豆醇在制备防治急性肺损伤药物中的应用，属于生物医药领域。所述的咖啡豆醇是作为唯一的活性成分应用于防治急性肺损伤的药物的制备中。本发明通过体内实验证实，咖啡豆醇能显著预防LPS诱导的小鼠急性肺损伤，恢复小鼠肺组织正常生理结构；抑制肺组织炎症因子的表达；降低肺组织氧化应激水平，且无明显的毒副作用；在体外实验中进一步证实，咖啡豆醇可以显著抑制巨噬细胞炎症因子表达和氧化应激，改善巨噬细胞活性。因此，咖啡豆醇可以应用于防治急性肺损伤药物的制备，这为防治急性肺损伤提供更多有针对性的治疗药物提供了可能。

Description

咖啡豆醇在制备防治急性肺损伤药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及咖啡豆醇在制备防治急性肺损伤药物中的应用。
背景技术
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种致死率高的严重呼吸系统疾病,目前尚无有效的治疗方法。ALI诱导的肺水肿、肺泡通透性增加、炎性细胞聚集和弥漫性肺泡损伤最终可导致急性呼吸窘迫综合征。脓毒症引起的ALI在众多原因中最为常见。当受到革兰氏阴性菌最重要的致病因子脂多糖(LPS)刺激时，浸润肺组织的巨噬细胞和中性粒细胞释放大量细胞因子(包括IL-6、IL-1β、Tnf-α等)并促进炎症反应，对肺泡上皮和内皮细胞产生快速和严重的损伤。同时，异常的氧化应激正在成为脓毒性肺损伤病理生理学的关键过程。
咖啡豆醇(Kahweol，KA)是从咖啡豆中提取的天然二萜类化合物，主要以脂肪酯形式存在于未经过滤的咖啡中。多项体外和体内实验研究结果表明，这种二萜类化合物具有多种潜在的药理作用，例如抗炎、护肝、抗癌、抗糖尿病和抗破骨细胞生成等。新近的研究表明，咖啡豆醇对急性肾损伤和肝损伤均具有保护作用，在另外一项研究中，则提供了其可抑制巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达的证据。目前尚未见到咖啡豆醇应用于防治ALI药物研究的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供咖啡豆醇在制备防治急性肺损伤药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，咖啡豆醇具有防治脂多糖诱导的急性肺损伤的作用，且效果显著、副作用小。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供咖啡豆醇在制备防治急性肺损伤药物中的应用。
本发明还提供咖啡豆醇在制备恢复肺组织正常生理结构的药物中的应用。
本发明还提供咖啡豆醇在制备抑制肺组织炎症因子表达的药物中的应用。
本发明还提供咖啡豆醇在制备降低肺组织氧化应激水平的药物中的应用。
优选的是，所述咖啡豆醇作为所述药物的唯一活性成分。
优选的是，所述药物还包括药学上可接受的载体或者助剂。
优选的是，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液、悬浮液或注射液。
上述咖啡豆醇分子式C20H26O3，分子量314.42，结构式如下所示：
Figure BDA0003673797690000021
本发明公开了以下技术效果：
本发明以脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤模型为实验对象，通过实验验证咖啡豆醇能显著预防LPS诱导的小鼠急性肺损伤，恢复小鼠肺组织正常生理结构；抑制肺组织炎症因子的表达；降低肺组织氧化应激水平；在体外实验中进一步证实，咖啡豆醇可以显著抑制巨噬细胞炎症因子表达和氧化应激，改善巨噬细胞活性。因此，咖啡豆醇可以预防急性肺损伤，对受损肺组织起保护作用，可用于制备防治急性肺损伤的药物。本发明为防治急性肺损伤提供更多有针对性的治疗药物提供了可能，并且咖啡豆醇用于防治急性肺损伤效果显著、副作用小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为小鼠肺组织病理结构和炎症水平检测结果；(A-B)小鼠肺组织的H&E染色和基于病理切片结果分析的损伤评分；(C)在称重并记录各组小鼠肺组织的湿重和干重后计算肺湿/干比；(D-F)小鼠肺组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA转录水平；
图2为小鼠肺组织氧化应激相关检测结果；(A-C)小鼠肺组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽氧化酶(GPX)活性；(D-F)小鼠肺组织活性氧(ROS)免疫荧光染色图及统计结果；
图3为咖啡豆醇灌胃治疗对小鼠重要脏器的毒性作用；(A)小鼠心脏、肝、肾的H&E染色；(B-D)小鼠血清中CK-MB、ALT、肌酐含量；
图4为咖啡豆醇预处理对LPS刺激的THP-1细胞活性及炎症因子检测结果；(A-B)CCK8检测不同干预措施后THP-1细胞活性；(C-E)THP-1细胞炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA转录水平；
图5为咖啡豆醇预处理对LPS刺激的THP-1细胞氧化应激检测结果；(A-C)THP-1细胞内MDA含量、SOD和GPX活性；(D-E)THP-1细胞内ROS水平免疫荧光染色图及统计结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
动物饲养：C57BL/6雄性小鼠(6-8周龄，体重：19.8±1.5g)由湖北省实验动物提供。按规定将小鼠置于武汉大学人民医院动物实验中心的小鼠饲养系统(SPF级)的隔离室进行检疫，在购入当天和次日称重、记录并用油性记号笔做标记，经过3-7天观察后移入饲养室，在1-2周的适应期后展开实验。每4-6只小鼠一笼，定期更换经严格灭菌操作的标准鼠饲料和常温饮用水。
动物造模：小鼠通过腹腔注射10mg/kg的LPS 12h建立了小鼠ALI模型。对照组注射等体积的无菌生理盐水。
细胞培养：THP-1人单核细胞用含10％胎牛血清的RPIM-1640培养基、在37℃恒温5％CO2无菌培养箱中培养。
细胞造模：THP-1人单核细胞在药物干预之前，在含有10％胎牛血清的RPIM-1640培养基中培养的THP-1细胞需要100ng/ml佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)以诱导12小时分化为贴壁巨噬细胞。为了在体外建立ALI模型，分化的THP-1细胞用1μg/ml LPS干预24小时。
给药方式：动物实验用玉米油稀释DMSO溶解后的咖啡豆醇溶液(DMSO含量<1％)，每天用咖啡豆醇溶液(按每只小鼠灌入0.2ml液体、咖啡豆醇20mg/kg或50mg/kg的体重的比例配制)或玉米油灌胃5天，取材；细胞实验在LPS刺激前12h加入咖啡豆醇溶液或DMSO溶液(DMSO<0.1％)，咖啡豆醇的终剂量为5μM、20μM。
实施例1咖啡豆醇对小鼠肺组织结构及炎症因子表达影响的检测
(1)小鼠肺组织病理学分析
C57雄性小鼠连续灌胃给予咖啡豆醇溶液5天，第6天腹腔注射10mg/kg LPS诱导ALI 12h。取小鼠左肺做H&E染色并对肺损伤程度进行半定量评分，结果如图1A-B所示。取小鼠右肺做肺湿/干比测定，结果如图1C所示。咖啡豆醇预处理有效的降低了LPS诱导的小鼠肺病理结构损伤，减少炎性细胞浸润，降低肺水肿程度和肺泡间隔厚度，恢复了肺泡结构完整性，且存在一定的剂量依赖性。(*p＜0.05vs Control组，#p＜0.05vs LPS组)。
(2)小鼠肺组织炎症因子水平检测
实时定量PCR检测评价炎症因子相关基因转录情况，扩增炎症因子基因的引物序列如下表1所示：
表1扩增引物
物种 基因 Forward Primer Reverse Primer
Mice Tnf-α ACTGAACTTCGGGGTGATCGGT TGGTTTGCTACGACGTGGGCTA
Mice Il-6 CCCCAATTTCCAATGCTCTCC CGCACTAGGTTTGCCGAGTA
Mice Il-1β AATGAAGGAACGGAGGAGCC CTCCAGCCAAGCTTCCTTGT
Mice Gapdh ACTCCACTCACGGCAAATTC TCTCCTATGGTGGTGACGACA
反应体系如表2所示：
表2反应体系
组分 用量
2×SYBR Green qPCR Master Mix(None ROX) 10μL
Forward Primer(10μM) 0.4μL
Reverse Primer(10μM) 0.4μL
模板 2μL
无酶水 补充到20μL
反应程序如表3所示：
表3反应程序
Figure BDA0003673797690000051
经上述条件实时荧光定量PCR扩增得到的相应的基因序列如SEQ ID NO:1-4所示。实时定量PCR检测结果如图1D-F所示，LPS诱导的小鼠ALI模型中，肺组织促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6mRNA转录水平显著升高，而咖啡豆醇灌胃预处理则显著降低了这些促炎因子mRNA转录水平，并呈现一定的剂量依赖性(*p＜0.05vs Control组，#p＜0.05vs LPS组)。
本实施例表明，咖啡豆醇预处理可以有效抑制LPS诱导的肺组织病理结构损伤，降低肺水肿程度及炎症因子转录水平，由此提供了咖啡豆醇在制作防治急性肺损伤药物中的用途。
Mice Tnf-α(SEQ ID NO:1):
atgagcacagaaagcatgatccgcgacgtggaactggcagaagaggcactcccccaaaagatggggggcttccagaactccaggcggtgcctatgtctcagcctcttctcattcctgcttgtggcaggggccaccacgctcttctgtctactgaacttcggggtgatcggtccccaaagggatgagaagttcccaaatggcctccctctcatcagttctatggcccagaccctcacactcagatcatcttctcaaaattcgagtgacaagcctgtagcccacgtcgtagcaaaccaccaagtggaggagcagctggagtggctgagccagcgcgccaacgccctcctggccaacggcatggatctcaaagacaaccaactagtggtgccagccgatgggttgtaccttgtctactcccaggttctcttcaagggacaaggctgccccgactacgtgctcctcacccacaccgtcagccgatttgctatctcataccaggagaaagtcaacctcctctctgccgtcaagagcccctgccccaaggacacccctgagggggctgagctcaaaccctggtatgagcccatatacctgggaggagtcttccagctggagaagggggaccaactcagcgctgaggtcaatctgcccaagtacttagactttgcggagtccgggcaggtctactttggagtcattgctctgtga。
Mice IL-6(SEQ ID NO:2):
atgaagttcctctctgcaagagacttccatccagttgccttcttgggactgatgctggtgacaaccacggccttccctacttcacaagtccggagaggagacttcacagaggataccactcccaacagacctgtctataccacttcacaagtcggaggcttaattacacatgttctctgggaaatcgtggaaatgagaaaagagttgtgcaatggcaattctgattgtatgaacaacgatgatgcacttgcagaaaacaatctgaaacttccagagatacaaagaaatgatggatgctaccaaactggatataatcaggaaatttgcctattgaaaatttcctctggtcttctggagtaccatagctacctggagtacatgaagaacaacttaaaagataacaagaaagacaaagccagagtccttcagagagatacagaaactctaattcatatcttcaaccaagagataagctggagtcacagaaggagtggctaa。
Mice IL-1β(SEQ ID NO:3):
atggcaactgttcctgaactcaactgtgaaatgccaccttttgacagtgatgagaatgacctgttctttgaagttgacggaccccaaaagatgaagggctgcttccaaacctttgacctgggctgtcctgatgagagcatccagcttcaaatctcgcagcagcacatcaacaagagcttcaggcaggcagtatcactcattgtggctgtggagaagctgtggcagctacctgtgtctttcccgtggaccttccaggatgaggacatgagcaccttcttttccttcatctttgaagaagagcccatcctctgtgactcatgggatgatgatgataacctgctggtgtgtgacgttcccattagacaactgcactacaggctccgagatgaacaacaaaaaagcctcgtgctgtcggacccatatgagctgaaagctctccacctcaatggacagaatatcaaccaacaagtgatattctccatgagctttgtacaaggagaaccaagcaacgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaaggaaagaatctatacctgtcctgtgtaatgaaagacggcacacccaccctgcagctggagagtgtggatcccaagcaatacccaaagaagaagatggaaaaacggtttgtcttcaacaagatagaagtcaagagcaaagtggagtttgagtctgcagagttccccaactggtacatcagcacctcacaagcagagcacaagcctgtcttcctgggaaacaacagtggtcaggacataattgacttcaccatggaatccgtgtcttcctaa。
Mice GAPDH(SEQ ID NO:4):
atgctgcccttaccccggggtcccagcttaggttcatcaggtaaactcaggagagtgtttcctcgtcccgtagacaaaatggtgaaggtcggtgtgaacggatttggccgtattgggcgcctggtcaccagggctgccatttgcagtggcaaagtggagattgttgccatcaacgaccccttcattgacctcaactacatggtctacatgttccagtatgactccactcacggcaaattcaacggcacagtcaaggccgagaatgggaagcttgtcatcaacgggaagcccatcaccatcttccaggagcgagaccccactaacatcaaatggggtgaggccggtgctgagtatgtcgtggagtctactggtgtcttcaccaccatggagaaggccggggcccacttgaagggtggagccaaaagggtcatcatctccgccccttctgccgatgcccccatgtttgtgatgggtgtgaaccacgagaaatatgacaactcactcaagattgtcagcaatgcatcctgcaccaccaactgcttagcccccctggccaaggtcatccatgacaactttggcattgtggaagggctcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactgtggatggcccctctggaaagctgtggcgtgatggccgtggggctgcccagaacatcatccctgcatccactggtgctgccaaggctgtgggcaaggtcatcccagagctgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgttcctacccccaatgtgtccgtcgtggatctgacgtgccgcctggagaaacctgccaagtatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcatctgagggcccactgaagggcatcttgggctacactgaggaccaggttgtctcctgcgacttcaacagcaactcccactcttccaccttcgatgccggggctggcattgctctcaatgacaactttgtcaagctcatttcctggtatgacaatgaatacggctacagcaacagggtggtggacctcatggcctacatggcctccaaggagtaa。
实施例2咖啡豆醇对小鼠肺组织氧化应激影响的检测
C57雄性小鼠连续灌胃给予咖啡豆醇溶液5天，第6天腹腔注射10mg/kg LPS诱导ALI 12h。相关试剂盒检测小鼠肺组织MDA含量(丙二醛(MDA)含量检测试剂盒，Solarbio(索莱宝)，货号：BC0025)、SOD和GPX活性(超氧化物岐化酶(SOD)活性检测试剂盒，Solarbio(索莱宝)，货号：BC0175；谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(NADPH法)，Beyotime(碧云天)，货号：S0056)。
ROS探针通过免疫荧光染色检测肺组织ROS水平(活性氧检测试剂盒，Beyotime(碧云天)，货号：S0033S)。
结果如图2所示，LPS诱导的ALI小鼠模型中，MDA含量、ROS水平显著上升，SOD和GPX活性则显著下降，而咖啡豆醇预处理逆转了上述变化，且呈一定的剂量依赖性(*p＜0.05vs Control组，#p＜0.05 vs LPS组)。
异常氧化应激是脓毒性肺损伤病理生理学的关键过程，不仅直接造成组织结构细胞的氧化应激损伤，而且存在于组织中先天免疫细胞的氧化应激会促进大量炎症因子释放，进一步加剧肺组织炎症和损伤，因此本实施例通过检测肺组织氧化还原系统的关键成分，表明咖啡豆醇具有促进肺组织抗氧化能力、抑制异常的氧化应激作用。
实施例3咖啡豆醇对小鼠重要脏器毒性作用的检测
取小鼠心、肝、肾组织做H&E染色评估组织病理结构损伤程度，并通过相关试剂盒对血清中CK-MB(肌酸激酶同工酶(CK-MB)测定试剂盒(速率法)，长春汇力，货号：C060)、ALT(谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒(速率法)，长春汇力货号：C052)、肌酐含量(肌酐(CR)测定试剂盒(终点法)，长春汇力，货号：C074)进行测定。
结果如图3所示，高剂量的咖啡豆醇(50mg/kg)连续5天灌胃处理，与对照组相比，小鼠心、肝、肾的H&E染色结果显示组结构无明显改变，血清中CK-MB、ALT、肌酐含量无明显差异(ns vs Control组)。
在体内，大约70％的咖啡豆醇被小肠吸收，经肝脏的生物转化作用代谢发挥作用。之前的多项研究将咖啡豆醇作为抗癌药物进行研究，其可以诱导癌细胞凋亡。因此，高剂量的咖啡豆醇也可能对组织器官造成损伤。本实施例对高剂量咖啡豆醇(50mg/kg)灌胃处理的小鼠的重要脏器病理结构和功能指标进行检测分析，表明该剂量下的咖啡豆醇对小鼠没有明显的毒性作用。
实施例4咖啡豆醇预处理对巨噬细胞发挥作用的检测结果
(1)咖啡豆醇干预对THP-1细胞活性影响检测
THP-1细胞经100ng/ml PMA干预12h诱导分化为巨噬细胞，咖啡豆醇预处理12h后1μg/ml LPS刺激24h。通过CCK8实验检测不同剂量咖啡豆醇干预经PMA诱导分化为巨噬细胞的THP-1细胞活性及咖啡豆醇预处理12h后接受LPS刺激后的细胞活性情况。
结果如图4所示，20μM及以下剂量的咖啡豆醇干预对细胞活性没有明显的影响，我们选取5μM和20μM剂量的KA对接受LPS刺激的细胞进行预处理12h，咖啡豆醇显著改善了THP-1细胞活性，且呈一定的剂量依赖性。(*p＜0.05 vs Control组，***p＜0.001 vsControl组，#p＜0.05 vs LPS组)。
(2)咖啡豆醇预处理对THP-1细胞炎症因子及氧化应激水平检测
THP-1细胞经100ng/ml PMA干预12h诱导分化为巨噬细胞，咖啡豆醇预处理12h后1μg/ml LPS刺激24h。之后实时定量PCR分别检测细胞内促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6mRNA转录情况，并用相关试剂盒(同小鼠肺组织检测试剂盒)检测细胞内MDA含量、SOD和DPX活性，最后使用DCFH-DA探针通过免疫荧光染色检测细胞内ROS水平，方法如下：
方法：原位装载探针：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除6孔板细胞培养液，加入1ml稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。用倒置荧光显微镜(激发波长488nm，发射波长525nm)即刻观察并拍照。
扩增炎症因子基因引物序列如下表4所示。
表4引物
物种 基因 Forward Primer Reverse Primer
Human Tnf-α TCCAGGCGGTGCTTGTTC GCTTGTCACTCGGGGTTC
Human Il-6 AGCCCTGAGAAAGGAGACA CCAAAAGACCAGTGATGAT
Human Il-1β CGGGACTCACAGCAAAAAA TTCAACACGCAGGACAGGT
Human Gapdh GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC TGATGACCCTTTTGGCTCCC
利用上述引物扩增，扩增条件同实施例1，得到相应的基因序列如SEQ ID NO：5-8所示。
Human Tnf-α(SEQ ID NO:5)：
atgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcagtcagatcatcttctcgaaccccgagtgacaagcctgtagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtga。
Human IL-6(SEQ ID NO:6):
atgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctggggctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtacccccaggagaagattccaaagatgtagccgccccacacagacagccactcacctcttcagaacgaattgacaaacaaattcggtacatcctcgacggcatctcagccctgagaaaggagacatgtaacaagagtaacatgtgtgaaagcagcaaagaggcactggcagaaaacaacctgaaccttccaaagatggctgaaaaagatggatgcttccaatctggattcaatgaggagacttgcctggtgaaaatcatcactggtcttttggagtttgaggtatacctagagtacctccagaacagatttgagagtagtgaggaacaagccagagctgtgcagatgagtacaaaagtcctgatccagttcctgcagaaaaaggcaaagaatctagatgcaataaccacccctgacccaaccacaaatgccagcctgctgacgaagctgcaggcacagaaccagtggctgcaggacatgacaactcatctcattctgcgcagctttaaggagttcctgcagtccagcctgagggctcttcggcaaatgtag。
Human IL-1β(SEQ ID NO:7)：
atggcagaagtacctgagctcgccagtgaaatgatggcttattacagtggcaatgaggatgacttgttctttgaagctgatggccctaaacagatgaagtgctccttccaggacctggacctctgccctctggatggcggcatccagctacgaatctccgaccaccactacagcaagggcttcaggcaggccgcgtcagttgttgtggccatggacaagctgaggaagatgctggttccctgcccacagaccttccaggagaatgacctgagcaccttctttcccttcatctttgaagaagaacctatcttcttcgacacatgggataacgaggcttatgtgcacgatgcacctgtacgatcactgaactgcacgctccgggactcacagcaaaaaagcttggtgatgtctggtccatatgaactgaaagctctccacctccagggacaggatatggagcaacaagtggtgttctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctggaatttgagtctgcccagttccccaactggtacatcagcacctctcaagcagaaaacatgcccgtcttcctgggagggaccaaaggcggccaggatataactgacttcaccatgcaatttgtgtcttcctaa。
Human GAPDH(SEQ ID NO:8):
atggtttacatgttccaatatgattccacccatggcaaattccatggcaccgtcaaggctgagaacgggaagcttgtcatcaatggaaatcccatcaccatcttccaggagcgagatccctccaaaatcaagtggggcgatgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtcttcaccaccatggagaaggctggggctcatttgcaggggggagccaaaagggtcatcatctctgccccctctgctgatgcccccatgttcgtcatgggtgtgaaccatgagaagtatgacaacagcctcaagatcatcagcaatgcctcctgcaccaccaactgcttagcacccctggccaaggtcatccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactgtggatggcccctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgccaaggctgtgggcaaggtcatccctgagctgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacgtgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcgtcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacacccactcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacgaccactttgtcaagctcatttcctggtatgacaacgaatttggctacagcaacagggtggtggacctcatggcccacatggcctccaaggagtaa。
实时定量PCR检测结果显示，LPS刺激24h后,THP-1细胞内促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6mRNA水平明显升高(图4C-E)，而细胞内的氧化应激程度也明显加重，表现为MDA含量、ROS水平显著上升，SOD和GPX活性显著下降(图5)。而咖啡豆醇预处理则有效的逆转了上述改变，降低了炎症因子转录水平和氧化应激程度，且呈一定的剂量依赖性。表明咖啡豆醇预处理对巨噬细胞具有抗炎和抗氧化应激作用。
本实施例检测咖啡豆醇预处理对于巨噬细胞的直接作用，表明咖啡豆醇预处理可以有效降低巨噬细胞促炎因子表达和氧化应激，并增强巨噬细胞活性，从而在ALI中发挥重要的抗炎作用，减少由LPS激活的巨噬细胞的大量炎症因子释放所导致的炎症损伤。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 咖啡豆醇在制备防治急性肺损伤药物中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcacag aaagcatgat ccgcgacgtg gaactggcag aagaggcact cccccaaaag 60
atggggggct tccagaactc caggcggtgc ctatgtctca gcctcttctc attcctgctt 120
gtggcagggg ccaccacgct cttctgtcta ctgaacttcg gggtgatcgg tccccaaagg 180
gatgagaagt tcccaaatgg cctccctctc atcagttcta tggcccagac cctcacactc 240
agatcatctt ctcaaaattc gagtgacaag cctgtagccc acgtcgtagc aaaccaccaa 300
gtggaggagc agctggagtg gctgagccag cgcgccaacg ccctcctggc caacggcatg 360
gatctcaaag acaaccaact agtggtgcca gccgatgggt tgtaccttgt ctactcccag 420
gttctcttca agggacaagg ctgccccgac tacgtgctcc tcacccacac cgtcagccga 480
tttgctatct cataccagga gaaagtcaac ctcctctctg ccgtcaagag cccctgcccc 540
aaggacaccc ctgagggggc tgagctcaaa ccctggtatg agcccatata cctgggagga 600
gtcttccagc tggagaaggg ggaccaactc agcgctgagg tcaatctgcc caagtactta 660
gactttgcgg agtccgggca ggtctacttt ggagtcattg ctctgtga 708
<210> 2
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaagttcc tctctgcaag agacttccat ccagttgcct tcttgggact gatgctggtg 60
acaaccacgg ccttccctac ttcacaagtc cggagaggag acttcacaga ggataccact 120
cccaacagac ctgtctatac cacttcacaa gtcggaggct taattacaca tgttctctgg 180
gaaatcgtgg aaatgagaaa agagttgtgc aatggcaatt ctgattgtat gaacaacgat 240
gatgcacttg cagaaaacaa tctgaaactt ccagagatac aaagaaatga tggatgctac 300
caaactggat ataatcagga aatttgccta ttgaaaattt cctctggtct tctggagtac 360
catagctacc tggagtacat gaagaacaac ttaaaagata acaagaaaga caaagccaga 420
gtccttcaga gagatacaga aactctaatt catatcttca accaagagat aagctggagt 480
cacagaagga gtggctaa 498
<210> 3
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcaactg ttcctgaact caactgtgaa atgccacctt ttgacagtga tgagaatgac 60
ctgttctttg aagttgacgg accccaaaag atgaagggct gcttccaaac ctttgacctg 120
ggctgtcctg atgagagcat ccagcttcaa atctcgcagc agcacatcaa caagagcttc 180
aggcaggcag tatcactcat tgtggctgtg gagaagctgt ggcagctacc tgtgtctttc 240
ccgtggacct tccaggatga ggacatgagc accttctttt ccttcatctt tgaagaagag 300
cccatcctct gtgactcatg ggatgatgat gataacctgc tggtgtgtga cgttcccatt 360
agacaactgc actacaggct ccgagatgaa caacaaaaaa gcctcgtgct gtcggaccca 420
tatgagctga aagctctcca cctcaatgga cagaatatca accaacaagt gatattctcc 480
atgagctttg tacaaggaga accaagcaac gacaaaatac ctgtggcctt gggcctcaaa 540
ggaaagaatc tatacctgtc ctgtgtaatg aaagacggca cacccaccct gcagctggag 600
agtgtggatc ccaagcaata cccaaagaag aagatggaaa aacggtttgt cttcaacaag 660
atagaagtca agagcaaagt ggagtttgag tctgcagagt tccccaactg gtacatcagc 720
acctcacaag cagagcacaa gcctgtcttc ctgggaaaca acagtggtca ggacataatt 780
gacttcacca tggaatccgt gtcttcctaa 810
<210> 4
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgctgccct taccccgggg tcccagctta ggttcatcag gtaaactcag gagagtgttt 60
cctcgtcccg tagacaaaat ggtgaaggtc ggtgtgaacg gatttggccg tattgggcgc 120
ctggtcacca gggctgccat ttgcagtggc aaagtggaga ttgttgccat caacgacccc 180
ttcattgacc tcaactacat ggtctacatg ttccagtatg actccactca cggcaaattc 240
aacggcacag tcaaggccga gaatgggaag cttgtcatca acgggaagcc catcaccatc 300
ttccaggagc gagaccccac taacatcaaa tggggtgagg ccggtgctga gtatgtcgtg 360
gagtctactg gtgtcttcac caccatggag aaggccgggg cccacttgaa gggtggagcc 420
aaaagggtca tcatctccgc cccttctgcc gatgccccca tgtttgtgat gggtgtgaac 480
cacgagaaat atgacaactc actcaagatt gtcagcaatg catcctgcac caccaactgc 540
ttagcccccc tggccaaggt catccatgac aactttggca ttgtggaagg gctcatgacc 600
acagtccatg ccatcactgc cacccagaag actgtggatg gcccctctgg aaagctgtgg 660
cgtgatggcc gtggggctgc ccagaacatc atccctgcat ccactggtgc tgccaaggct 720
gtgggcaagg tcatcccaga gctgaacggg aagctcactg gcatggcctt ccgtgttcct 780
acccccaatg tgtccgtcgt ggatctgacg tgccgcctgg agaaacctgc caagtatgat 840
gacatcaaga aggtggtgaa gcaggcatct gagggcccac tgaagggcat cttgggctac 900
actgaggacc aggttgtctc ctgcgacttc aacagcaact cccactcttc caccttcgat 960
gccggggctg gcattgctct caatgacaac tttgtcaagc tcatttcctg gtatgacaat 1020
gaatacggct acagcaacag ggtggtggac ctcatggcct acatggcctc caaggagtaa 1080
<210> 5
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180
gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct 240
tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300
cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360
gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420
aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480
gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540
accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600
cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660
gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt ga 702
<210> 6
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg gctgctcctg 60
gtgttgcctg ctgccttccc tgccccagta cccccaggag aagattccaa agatgtagcc 120
gccccacaca gacagccact cacctcttca gaacgaattg acaaacaaat tcggtacatc 180
ctcgacggca tctcagccct gagaaaggag acatgtaaca agagtaacat gtgtgaaagc 240
agcaaagagg cactggcaga aaacaacctg aaccttccaa agatggctga aaaagatgga 300
tgcttccaat ctggattcaa tgaggagact tgcctggtga aaatcatcac tggtcttttg 360
gagtttgagg tatacctaga gtacctccag aacagatttg agagtagtga ggaacaagcc 420
agagctgtgc agatgagtac aaaagtcctg atccagttcc tgcagaaaaa ggcaaagaat 480
ctagatgcaa taaccacccc tgacccaacc acaaatgcca gcctgctgac gaagctgcag 540
gcacagaacc agtggctgca ggacatgaca actcatctca ttctgcgcag ctttaaggag 600
ttcctgcagt ccagcctgag ggctcttcgg caaatgtag 639
<210> 7
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggcagaag tacctgagct cgccagtgaa atgatggctt attacagtgg caatgaggat 60
gacttgttct ttgaagctga tggccctaaa cagatgaagt gctccttcca ggacctggac 120
ctctgccctc tggatggcgg catccagcta cgaatctccg accaccacta cagcaagggc 180
ttcaggcagg ccgcgtcagt tgttgtggcc atggacaagc tgaggaagat gctggttccc 240
tgcccacaga ccttccagga gaatgacctg agcaccttct ttcccttcat ctttgaagaa 300
gaacctatct tcttcgacac atgggataac gaggcttatg tgcacgatgc acctgtacga 360
tcactgaact gcacgctccg ggactcacag caaaaaagct tggtgatgtc tggtccatat 420
gaactgaaag ctctccacct ccagggacag gatatggagc aacaagtggt gttctccatg 480
tcctttgtac aaggagaaga aagtaatgac aaaatacctg tggccttggg cctcaaggaa 540
aagaatctgt acctgtcctg cgtgttgaaa gatgataagc ccactctaca gctggagagt 600
gtagatccca aaaattaccc aaagaagaag atggaaaagc gatttgtctt caacaagata 660
gaaatcaata acaagctgga atttgagtct gcccagttcc ccaactggta catcagcacc 720
tctcaagcag aaaacatgcc cgtcttcctg ggagggacca aaggcggcca ggatataact 780
gacttcacca tgcaatttgt gtcttcctaa 810
<210> 8
<211> 882
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggtttaca tgttccaata tgattccacc catggcaaat tccatggcac cgtcaaggct 60
gagaacggga agcttgtcat caatggaaat cccatcacca tcttccagga gcgagatccc 120
tccaaaatca agtggggcga tgctggcgct gagtacgtcg tggagtccac tggcgtcttc 180
accaccatgg agaaggctgg ggctcatttg caggggggag ccaaaagggt catcatctct 240
gccccctctg ctgatgcccc catgttcgtc atgggtgtga accatgagaa gtatgacaac 300
agcctcaaga tcatcagcaa tgcctcctgc accaccaact gcttagcacc cctggccaag 360
gtcatccatg acaactttgg tatcgtggaa ggactcatga ccacagtcca tgccatcact 420
gccacccaga agactgtgga tggcccctcc gggaaactgt ggcgtgatgg ccgcggggct 480
ctccagaaca tcatccctgc ctctactggc gctgccaagg ctgtgggcaa ggtcatccct 540
gagctgaacg ggaagctcac tggcatggcc ttccgtgtcc ccactgccaa cgtgtcagtg 600
gtggacctga cctgccgtct agaaaaacct gccaaatatg atgacatcaa gaaggtggtg 660
aagcaggcgt cggagggccc cctcaagggc atcctgggct acactgagca ccaggtggtc 720
tcctctgact tcaacagcga cacccactcc tccacctttg acgctggggc tggcattgcc 780
ctcaacgacc actttgtcaa gctcatttcc tggtatgaca acgaatttgg ctacagcaac 840
agggtggtgg acctcatggc ccacatggcc tccaaggagt aa 882

Claims (4)

1.咖啡豆醇在制备防治急性肺损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述咖啡豆醇作为所述药物的唯一活性成分。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或者助剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液、悬浮液或注射液。
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