CN103393679A - 小檗碱在制备抑制脂肪细胞自噬药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药制备领域，特别涉及小檗碱在制备抑制皮下脂肪和内脏脂肪细胞自噬药物中的应用。本发明以高脂喂养的小鼠为实验对象，测试小檗碱是否抑制小鼠的皮下脂肪和内脏脂肪细胞的自噬。具体为，高脂喂养C57BL/6小鼠12周后，分为高脂组和小檗碱组，继续高脂饮食并用小檗碱灌胃，一天一次，持续4周。Western Blot检测自噬相关蛋白变化，Real-time PCR检测其相应mRNA水平变化。结果表明：高脂喂养下，小鼠的皮下及内脏脂肪组织自噬增加，而小檗碱能有效抑制高脂喂养小鼠的皮下脂肪和内脏脂肪的自噬，为临床上更合理的将小檗碱用于肥胖症的治疗提供了实验数据和理论依据。
Description
技术领域
本发明属于医药制备领域，特别涉及小檗碱在制备抑制皮下脂肪和内脏脂肪细胞自噬药物中的应用。
背景技术
肥胖症（obesity）指体内脂肪组织堆积过多和（或）分布异常、体重增加，是包括遗传和环境在内的多种因素相互作用所引起的慢性代谢性疾病，主要指脂肪细胞体积的增大、数量的增多或者同时出现体积的增大和数量的增多。超重和肥胖症在一些发达国家和地区人群中的发病率已达到流行程度。据统计，在西方国家成年人中，约有半数人超重和肥胖。我国肥胖症的患病率也迅速上升。肥胖症作为代谢综合征的主要组分之一，与多种疾病如2型糖尿病、血脂异常、高血压、冠心病、卒中和某些癌症密切相关。肥胖症及其相关疾病可损害身心健康，使生活质量下降，预期寿命缩短，成为重要的世界性健康问题之一，因此寻求治疗肥胖症的方法成为亟待解决的难题。
Kovsan对肥胖人群脂肪组织自噬的研究发现，肥胖病人脂肪组织尤其是网膜脂肪组织自噬增加，与肥胖程度、内脏脂肪分布及脂肪细胞肥大密切相关。自噬（autophagy）是真核细胞特有的生命现象，细胞通过形成双层膜的自噬体包裹自身受损或老化的细胞器和大分子，然后与溶酶体结合，实现对内容物的降解。近年来，自噬受到了相当大的重新关注，关于自噬的研究越来越多，随着对自噬的过程和分子机制的了解，更多的人开始关注自噬与脂质代谢的关系。自噬，在调节细胞代谢与能量平衡方面发挥重要的作用，自噬的改变与代谢综合症的进展密切相关。脂肪组织不仅是能量储存的主要场所，而且对调节全身脂质的动态平衡起着主要作用。脂肪组织包含两种不同类型的脂肪细胞：白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞。白色脂肪组织与棕色脂肪组织之间的平衡是决定肥胖的关键因素，白色脂肪细胞主要以甘油三酯的形式储存化学能量，而棕色脂肪细胞储存脂质的能力非常有限，主要以热能的形式释放化学能量。因而棕色脂肪通常被认为是对抗肥胖的器官，一般来说，棕色脂肪的减少与肥胖及代谢性疾病密切相关，反之，棕色脂肪功能的增强或者白色脂肪组织中棕色脂肪基因的表达增多可以增加能量消耗，抵制肥胖。然而人们一直以为棕色脂肪仅仅在小型哺乳动物如啮齿类具有重要作用，因为在人类出生后不久棕色脂肪就消失了。直到最近在健康成人发现大量的代谢活跃的棕色脂肪，人们才认识到棕色脂肪对能量代谢的重要性，从而提出能否将增加白色脂肪向棕色脂肪的转变作为治疗肥胖的潜在战略方法。
文献报道脂肪组织特异性敲除自噬相关基因Atg7的小鼠能够抵制高脂饮食诱导的肥胖，与野生型相比Atg7-/-小鼠白色脂肪的含量仅仅为野生型的20%，并且50%突变的白色脂肪细胞为多腔脂滴，含大量的胞质和线粒体，呈棕色脂肪细胞性状。而棕色脂肪几乎不含甘油三酯，主要作用是增强脂肪酸的β-氧化，产生热量，进而减轻体重，增加胰岛素敏感性。与此一致，肥胖病人的脂肪组织中，自噬显著增加，腹腔脂肪堆积和脂肪细胞肥大的程度与自噬基因的表达最相关，当与肥胖相关的胰岛素抵抗发生时，自噬急剧增加，与健康人相比，肥胖病人的皮下脂肪组织中自噬标志蛋白LC3Ⅱ明显增多，同样的，缺乏瘦素的肥胖小鼠与野生型相比也表现出LC3Ⅱ的显著增多，分析发现LC3Ⅱ的蛋白水平与BMI呈正相关，胰岛素的敏感性与自噬活动水平呈负相关。这些发现提示自噬对白色脂肪尤其独特的单腔脂滴的形成起着重要的作用，因而抑制脂肪细胞的自噬可能为治疗肥胖，改善胰岛素抵抗提供潜在靶点。
小檗碱是一种异喹啉类生物碱，是中药黄连的主要成分，以往研究已经证实小檗碱具有很多药理作用包括抗菌，抗肿瘤，能够抑制炎症因子TNF-α、IL-6等的表达尤其是在肥胖的个体有明显的抗炎症作用，最近的研究发现小檗碱能够降血糖，改善胰岛素抵抗作用。
小檗碱是否能抑制高脂饮食小鼠皮下及内脏脂肪组织自噬，还没有这方面的相关的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供小檗碱在制备治疗肥胖症药物中的应用。
本发明另一个目的是提供小檗碱在制备抑制皮下脂肪细胞和内脏脂肪细胞自噬药物中的应用。
肥胖主要由脂肪的过度堆积导致的，那么减少脂肪的过度生成与分化无疑成为治疗肥胖的关键环节。脂肪组织主要由白色脂肪细胞构成，脂肪的形成或脂肪细胞的分化过程涉及细胞内容物的重塑，导致组织高度优化，以满足其特定的功能，白色脂肪分化的一个独特方面就是除去大部分的细胞质内容物，尤其是过多的线粒体，形成一个单一的、大型脂滴，几乎占据整个细胞质空间。在脂肪细胞中，自噬可以降解线粒体及胞质，调节脂肪细胞分化。自噬在肝脏和脂肪组织的脂质代谢方面发挥重要作用，而脂肪是重要的能量代谢器官和内分泌器官，是全身能量平衡调节的一个重要组成部分，在该研究领域的进展为干预肥胖和肥胖相关的疾病提供了新的场地。
本发明以高脂喂养的小鼠为实验对象，测试小檗碱是否抑制小鼠的皮下脂肪和内脏脂肪细胞的自噬。具体为，高脂喂养C57BL/6小鼠12周后，分为高脂组和小檗碱组，继续高脂饮食并用小檗碱（50mg/kg）灌胃，一天一次，持续4周。Western Blot检测自噬相关蛋白变化，Real-time PCR检测其相应mRNA水平变化。检测结果表明：与正常饮食的小鼠相比，高脂饮食小鼠皮下脂肪组织中，自噬相关蛋白Beclin1,Atg5,Atg7和ULK2的mRNA水平均明显升高，Beclin1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平明显增高；与高脂饮食小鼠相比，小檗碱处理的高脂小鼠自噬相关基因Beclin1的蛋白水平和mRNA水平均明显降低，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平明显降低，说明高脂喂养下的小鼠的皮下脂肪自噬增加，小檗碱能有效抑制高脂小鼠的皮下脂肪组织自噬。与正常饮食的小鼠相比，高脂饮食小鼠内脏脂肪组织中，Beclin1的蛋白和mRNA水平均增高，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平明显增高；与高脂饮食小鼠相比，小檗碱处理的高脂小鼠自噬相关基因Beclin1的蛋白水平和mRNA水平均明显降低，LC3II/I蛋白水平明显降低，说明高脂喂养下的小鼠的内脏脂肪组织自噬增加，小檗碱能抑制高脂喂养小鼠内脏脂肪的自噬。
本发明具有以下优点：
1、根据本发明的实验结果，说明高脂喂养下，小鼠的皮下脂肪和内脏脂肪组织自噬增加，而小檗碱能有效地抑制该小鼠的皮下脂肪细胞及内脏脂肪细胞的自噬，为临床上更合理的将小檗碱用于肥胖症的治疗提供了实验数据和理论依据。2、小檗碱可用于制备抑制脂肪细胞自噬药物中，从而治疗肥胖症及由肥胖症引起的糖尿病、心脏病、高血压等疾病。
附图说明
图1是小檗碱对高脂喂养小鼠皮下脂肪组织自噬相关基因mRNA水平的影响对比图，其中，图1A为Beclin1基因图，图1B为Atg5基因图，图1C为Atg5基因图、图1D为Ulk2基因图。
图2是小檗碱对高脂喂养小鼠皮下脂肪组织自噬相关基因蛋白水平的影响对比图，其中，图2A为Beclin1蛋白表达图，图2B为LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达图。
图3是小檗碱对高脂喂养小鼠内脏脂肪组织自噬相关基因mRNA水平的影响对比图，其中，图3A为Beclin1基因图，图3B为Atg5基因图。
图4是小檗碱对高脂喂养小鼠内脏脂肪组织自噬相关基因蛋白水平的影响对比图，其中，图4A为Beclin1蛋白表达图，图4B为LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实验中用到的小檗碱（Berberine），购自上海市药品监督检验所；C57BL/6小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
将30只健康雄性、体重约15g左右的C57BL/6小鼠分为3组：对照组（CON,n=6）、模型组(HFD,n=12)和药物组（HFD+BBR，n=12），对照组给予普通饲料，模型组和药物组均给予高脂饲料，喂养12周后，继续按照之前饮食的基础上药物组开始用小檗碱(50mg/kg)灌胃，一天一次，连续4周。将小鼠处死，称取皮下脂肪和肾周脂肪重量，脂肪组织立即放于液氮保存，用于后续实验的检测。以下图中：*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001。
1、小檗碱对高脂喂养小鼠皮下脂肪组织自噬相关基因mRNA水平的影响：
取小鼠皮下脂肪组织，抽提总RNA，实时定量PCR监测自噬相关基因mRNA表达水平，具体结果如图1所示：与对照组相比，模型组自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg7、Ulk2mRNA表达均显著升高，说明高脂饮食小鼠中，皮下脂肪组织中自噬是增加的；与模型组相比，药物组自噬相关基因Beclin1mRNA水平显著降低，说明小檗碱能抑制高脂饮食小鼠中皮下脂肪组织中的自噬。
2、小檗碱对高脂喂养小鼠皮下脂肪组织自噬相关基因蛋白水平的影响：
取小鼠皮下脂肪组织，提取总蛋白，Western Blot分析自噬相关基因蛋白表达水平，具体如图2所示：与对照组相比，模型组自噬相关基因Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著增加；与模型组相比，药物组Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著降低，说明小檗碱能抑制高脂饮食小鼠中，皮下脂肪组织中的自噬
3、小檗碱对高脂喂养小鼠内脏脂肪组织自噬相关基因mRNA水平的影响
取小鼠内脏脂肪组织，抽提总RNA，实时定量PCR监测自噬相关基因mRNA表达水平，结果显示：与对照组相比，模型组自噬相关基因Beclin1、Atg5、mRNA表达均显著升高，说明高脂饮食小鼠中，皮内脏脂肪组织中自噬是增加的；与模型组相比，药物组自噬相关基因Beclin1mRNA水平显著降低，说明小檗碱能抑制高脂饮食小鼠中内脏脂肪组织中的自噬。
4、小檗碱对高脂喂养小鼠内脏脂肪组织自噬相关基因蛋白水平的影响
取小鼠内脏脂肪组织，提取总蛋白，Western Blot分析自噬相关基因蛋白表达水平，结果显示：与对照组相比，模型组自噬相关基因Beclin1、蛋白表达显著增加，而LC3Ⅱ/Ⅰ无明显变化；与模型组相比，药物组Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著降低，说明小檗碱能有效抑制高脂饮食小鼠中内脏脂肪组织中的自噬。
综上所述，通过对高脂饮食小鼠用小檗碱灌胃处理后发现：与高脂组相比，自噬相关基因的mRNA的表达和自噬标记物的蛋白质水平明显降低，证实了小檗碱能够有效抑制高脂饮食小鼠脂肪组织的自噬。
Claims (3)
1.小檗碱在制备治疗肥胖症药物中的应用。
2.小檗碱在制备抑制皮下脂肪细胞自噬药物中的应用。
3.小檗碱在制备抑制内脏脂肪细胞自噬药物中的应用。
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