CN104873500A - 化合物zln005的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了化合物ZLN005用于促进SIRT1基因的表达，以及在制备SIRT1激活剂中的用途。

Description

化合物ZLN005的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及化合物ZLN005的用途。

背景技术

沉默信息调节因子SIR2(silent information regulator 2)基因表达的Sirtuins蛋白家族在细胞中分布广泛，是一类NAD⁺依赖型去乙酰化酶。Sirtuins依赖NAD⁺作为辅酶，可以与染色质、转录因子及转录共调控因子相互作用，通过对组蛋白等去乙酰化从而调节机体相关基因表达、影响染色体稳定性和蛋白活性，参与调控细胞非常广泛的生理病理功能，已经证实的包括细胞代谢、细胞自噬凋亡、细胞周期、细胞分化、细胞应激、基因组稳定及表观遗传性状等方面。

目前已发现的哺乳动物Sirtuins蛋白家族包含Sirtuin1～7。作为其重要成员的Sirtuin1(SIRT1)对糖尿病、衰老、肥胖、肿瘤、心血管疾病等具有重要影响。

人类SIRT1基因定位于染色体10q21.3，为单基因位点，编码区全长33715bp。SIRT1的mRNA有9个外显子，编码747个氨基酸，翻译后蛋白质量为81.7kDa。SIRT1主要定位于细胞核，也表达于细胞质，其组织分布广泛，包括肝脏、心脏、骨骼肌、胰腺、脂肪、视网膜等组织器官。SIRT1作用的蛋白位点包括组蛋白、PGC-1α、p53、FOXO、NF-κB、PARP1、eNOS等。

SIRT1与细胞代谢关系密切。当细胞能量水平变化时，SIRT1调节糖脂代谢适应环境变化，促进能量稳态，例如SIRT1的激活能够抑制饮食引起的肥胖。研究发现SIRT1与解耦联蛋白(UCP2)启动基因相互结合，抑制UCP2表达，促进胰岛素分泌，间接调节糖脂代谢。SIRT1还激活PGC-1α和FOXO1及下游的PPARα抑制糖酵解基因表达，促进糖异生过程，并抑制脂肪合成、促进脂肪利用。AMPK在进化中高度保守，它可感受到细胞内AMP/ATP的比值,维持代谢和能量的平衡。而多项研究证实AMPK与SIRT1可相互调节，AMPK可通过升高细胞内NAD⁺的水平从而提高SIRT1的活性，SIRT1又促进AMPK激活并改善胰岛素抵抗。

热量限制可以增加动物寿命，SIRT1被认为在其中起到重要作用。在进行热量限制的动物体内SIRT1基因高水平表达，敲除SIRT1减少了部分热量限制的有益效果。过表达SIR2基因可以直接延长酵母、果蝇和线虫的寿命，在鼠脑过表达SIRT1也同样取得了延长寿命的效果。SIRT1被多项研究认为能够减少衰老相关疾病如心血管疾病、2型糖尿病、癌症、阿兹海默病的发生率，并提高线粒体活性、抑制衰老相关代谢衰退。

SIRT1在炎症反应和氧化应激时起到保护作用，并减少细胞凋亡。首先，SIRT1可发挥去乙酰化作用，活化与DNA修复相关的蛋白，促进碱基切除修复保护细胞。SIRT1还可作用于p53，减少依赖p53的细胞凋亡，增加细胞存活。在炎症反应时，SIRT1抑制NF-κB与核内炎性基因结合，减少炎性因子以及ROS的产生。

自噬是真核细胞内的蛋白质大分子、细胞器等在自噬溶酶体的作用下被降解的过程。生理情况下，自噬维持细胞内稳态，而在炎症反应、氧化应激等病理情况下，自噬过度激活导致细胞凋亡。SIRT1对FOXO的去乙酰化调节，在细胞自噬调控中具有重要地位，SIRT1-FOXO-自噬通路在多种病理生理过程包括糖尿病、肥胖、肿瘤、心血管疾病、衰老中都起到有益的调控作用。此外，SIRT1还可去乙酰化自噬相关基因Atg5、Atg7和Atg8的表达产物，直接影响自噬。

SIRT1在肿瘤发生发展中的作用存在比较大的争议。SIRT1在多种肿瘤中高表达，并可下调多种抑癌因子，提示其在肿瘤中扮演促进因子的角色。但有研究发现SIRT1对于部分肿瘤的发生存在着抑制性的作用，如SIRT1可以通过使c-myc去乙酰化来加速其分解，并以此诱导肿瘤细胞凋亡。SIRT1激动剂白藜芦醇可以促进肝癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞凋亡。

关于SIRT激动剂的研究，现在国际有多个报道，研究最多的是白藜芦醇，已经进入临床实验阶段。但多项研究表明白藜芦醇是通过变构激活SIRT1活性，而不提高SIRT1的表达。白藜芦醇从天然产物中提取，但成本较高，化学合成白藜芦醇的方法尚处于研究阶段，存在着诸如反应路线长、经济性差、操作复杂、反应选择性不高、脱甲基试剂成本过高等弊端。因此，当前需要一种能够促进SIRT1表达的药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供了化合物ZLN005的新的用途，能够促进SIRT1基因的表达。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，化合物ZLN005用于促进SIRT1基因的表达。

进一步地，化合物ZLN005在制备SIRT1激活剂中的用途。

进一步的，以化合物ZLN005为活性成分的SIRT1激活剂。

本发明化合物ZLN005的分子式为C₁₇H₁₈N₂，名称为2-(4-叔丁基苯基)苯并咪唑，分子量为250.34，分子结构为：

当前，ZLN005被用于提高糖尿病小鼠模型的骨骼肌中PGC-1α的mRNA水平，并通过PGC-1α提高细胞线粒体含量，减轻胰岛素抵抗，改善糖脂紊乱，以及提高PGC-1α基因下游的GLUT4,NRF1,ERR a,cox5b，AOX基因表达。此外，ZLN005在L6肌管细胞中提高了AMPK蛋白的磷酸化比率。

本发明给出了化合物ZLN005的新的用途，能够促进SIRT1基因的表达。

化合物ZLN005的衍生物及药学上可接受的盐也可用于制备SIRT1激活剂。

本发明中，SIRT1激活剂可呈任何形式，并以任何合宜的方式施用，包括全身及局部或区域性给药。

以制备适于口服投药的剂型为例，该药剂中可含有任何不会不利影响所含活性成分(即ZLN005及其衍生物及医药可接受盐)活性的医药可接受载剂，例如：粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、湿润剂。可利用任何合宜的方法，将该组合物制成适于口服投药的剂型，包括制备为片剂、锭剂或胶囊的形式。片剂可通过本领域已熟知的方法包衣。用于口服给药的液体制剂可采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或它们可制成干燥产物，在使用前以水或其他适宜载体配制。此类液体制剂可通过常规方法，用药学上可接受的添加剂例如悬浮剂、乳化剂、非水载体、油性酯类、乙醇或分级植物油、防腐剂制备。也可包含缓冲盐、调味剂、着色剂与甜味剂。

制备适于静脉注射或皮下注射的注射剂时可将化合物配制成液态溶液，优选生理学上可接受的缓冲液，也可将化合物配制成固体形式，并于使用前再溶解或悬浮。该药剂可包含等张溶液、助溶剂、乳化剂、以及其他载剂等成分，也可视需要含有调味剂、调色剂、着色剂等添加剂，以及适宜的保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。

此外，可于本发明所提供的药剂中并含一或多种不会不利影响所含SIRT1激活剂活性功效的其他活性成分，例如抗氧化剂、维生素等，以加强本发明药剂的功效或增加制剂配方的运用灵活性。

附图说明

图1是本发明实施例1中SIRT1表达促进效应的评价图；

图2是本发明实施例1中SIRT1表达促进效应的评价图；

图3是本发明实施例1中SIRT1表达促进效应的评价图；

图4是本发明实施例2中ZLN005对高糖导致内质网应激的保护作用对比图；

图5是本发明实施例3中ZLN005通过SIRT1途径对高糖导致细胞氧化应激的保护作用对比图；

图6是本发明实施例4中ZLN005通过SIRT1途径对H₂O₂导致细胞凋亡的保护作用对比图。

具体实施方式

试验例1

在心肌细胞、成纤维细胞以及肌细胞中，SIRT1表达促进效应的评价。

按下述实验评价在鼠心肌细胞、肝细胞以及骨骼肌细胞中，ZLN005对SIRT1基因表达的促进效应。

终末分化的鼠心肌细胞、肝细胞以及肌细胞在5％的CO₂培养箱中进行培养。所述细胞用溶解于DMSO的ZLN005，以1.25μM、2.5μM、5μM的浓度处理24小时，分别标记为1、2、3；对照组暴露于DMSO 24小时，标记为0。并重复三次上述实验。

使用PBS对处理后的细胞进行2次清洗，按照TIANGEN动物组织总RNA提取试剂盒提取RNA然后，使用Takara逆转录试剂盒从上述提取的RNA合成cDNA。利用合成的cDNA和预先设计好的引物和探针，通过Realtime-PCR检测SIRT1基因和GAPDH基因的表达。PCR反应和分析采用Bio-rad CFX Connect荧光定量PCR检测系统进行。三次的实验结果分别如图1、图2和图3。结果显示，与对照组0相比，处理组1、2和3中SIRT1基因表达明显增加，表明ZLN005对SIRT1基因表达具有促进效应，在选定的浓度范围内，ZLN005的浓度越高，对SIRT1基因表达的促进作用越明显。

试验例2

在心肌细胞中，ZLN005对高糖导致内质网应激的保护作用。

处理：终末分化的鼠心肌细胞在5％的CO₂培养箱中进行培养。给予所述细胞28mM葡萄糖处理24小时，实验组同时暴露于5μM ZLN005。

使用PBS对处理后的细胞进行2次清洗，按照TIANGEN动物组织总RNA提取试剂盒提取RNA然后，使用Takara逆转录试剂盒从上述提取的RNA合成cDNA。利用合成的cDNA和预先设计好的引物和探针，通过Realtime-PCR检测内质网应激基因GRP78、PDIA3和GAPDH基因的表达。PCR反应和分析采用Bio-rad CFX Connect荧光定量PCR检测系统进行。结果如图4所示。由图4可知，ZLN005降低了高糖导致的心肌细胞内质网应激。

试验例3

在心肌细胞中，ZLN005通过SIRT1途径对高糖导致细胞氧化应激的保护作用。

处理：终末分化的鼠心肌细胞在5％的CO₂培养箱中进行培养。细胞分为4组：对照组(0)、高糖组(1)、高糖+ZLN005组(2)、高糖+ZLN005+EX527组(4)。高糖即用28mM葡萄糖处理24小时，高糖+ZLN005组同时暴露于高糖和5μM ZLN005，而高糖+ZLN005+EX527组给予选择性的SIRT1抑制剂EX5271μM提前作用1h后再暴露于高糖和ZLN005。吸取培养细胞上清，用乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测LDH表达水平。其结果如图5所示，结果显示ZLN005降低了高糖导致的心肌细胞氧化应激，减少了活性氧产物的生成，而SIRT1抑制剂EX527能够部分抑制这一保护作用。

试验例4

在骨骼肌细胞中，ZLN005通过SIRT1途径对H₂O₂导致细胞凋亡的保护作用。

处理：将鼠骨骼肌细胞在5％的CO₂培养箱中进行贴壁培养。将细胞分为4组：对照组(a)、H₂O₂组(b)、H₂O₂+ZLN005组(c)、H₂O₂+ZLN005+EX527组(d)。将b、c和d组均给予800μMH₂O₂处理3小时，ZLN005和EX527浓度、处理方式同上例。将细胞按照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)处理，使用ACEA NovoCyte1040流式细胞仪检测细胞凋亡。其结果如图6所示，由图6知，ZLN005降低了H₂O₂导致的骨骼肌细胞损伤，减少了细胞凋亡，起到保护作用，而SIRT1抑制剂EX527能够部分抑制这一保护作用。

Claims (3)

1.化合物ZLN005用于促进SIRT1基因的表达。

2.按照权利要求1所述的化合物ZLN005在制备SIRT1激活剂中的用途。

3.按照权利要求2所述的以化合物ZLN005为活性成分的SIRT1激活剂。