CN109666645B - 一种诱导干细胞样细胞增殖的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种诱导干细胞样细胞增殖的方法。所述方法包含以下步骤：向包含或能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用PGC‑1α激活剂。所述方法能够快速、简便和/或稳定地诱导干细胞样细胞增殖。特别地，所述方法可用于诱导记忆性干细胞样T细胞扩增。

Description

一种诱导干细胞样细胞增殖的方法

技术领域

本申请涉及一种诱导干细胞样细胞增殖的方法。特别地，本申请的方法可以用于诱导记忆性干细胞样T细胞扩增，从而为患者提供更有效的预防和/或治疗手段。

背景技术

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，能够产生高度分化的功能细胞。

记忆性干细胞样T细胞(T memory stem cells，TSCM)是T细胞的一个亚群，具有记忆性T细胞和干细胞的特点。现有研究表明，TSCM细胞具有更强大的抗肿瘤能力，在机体内的生存能力也更加卓越，因此在肿瘤免疫治疗中具有很好的应用价值。由于TSCM细胞在人外周血T细胞中所占比例很少，约为2％-4％，因此如何诱导TSCM细胞大量扩增是治疗肿瘤的有效方法之一。然而目前缺乏较为简便、有效的诱导TSCM细胞扩增的方法。

发明内容

本申请提供了诱导干细胞样细胞增殖的方法。本申请提供的方法能够快速、简便和/或稳定地诱导干细胞样细胞增殖。本申请提供的方法可以在体外诱导记忆性干细胞样T细胞增殖。此外，本申请提供的方法能够被借鉴用以制备干细胞样细胞增殖诱导剂。本申请提供的方法还能够用于治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病或病毒感染疾病。此外，本申请的方法可被用于对受试者进行个性化诊断和治疗。例如，本申请的方法能用于诱导包含经T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)修饰的T细胞的记忆性干细胞样T细胞的增殖。

一方面，本申请提供了一种诱导干细胞样细胞增殖的方法，其包含以下步骤：向包含或能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用PGC-1α激活剂；其中所述干细胞样细胞包含表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的记忆性干细胞样T细胞(TSCM)。

在某些实施方式中，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：CD19、BCMA、GPC3和HER2。

在某些实施方式中，其中所述TSCM具有以下特征：A)CD45RO-或CD45RO⁺；B)CCR7⁺；和C)CD95⁺。

在某些实施方式中，其中所述TSCM还具有一种或多种选自下组的特征：CD45RA⁺、CD27⁺、CD62L⁺、CD28⁺、CD127⁺、CD122⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD3⁺。

在某些实施方式中，其还包含以下步骤：分离获得外周血单核细胞PBMC、CD3⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞或CD4⁺T淋巴细胞。

在某些实施方式中，所述方法还包含：向经分离的所述PBMC加入一种或多种T细胞激活因子；所述T细胞激活因子包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和离子霉素。

在某些实施方式中，所述方法还包含：向经分离的所述PBMC加入一种或多种细胞因子；所述细胞因子包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

在某些实施方式中，其中所述PGC-1α激活剂包含选自下组的一种或多种：具有化学式I的化合物、噻唑烷二酮、SIRT1去乙酰化酶、奥替普拉(oltipraz)和苯扎贝特(bezafibrate)，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

在某些实施方式中，其中所述PGC-1α激活剂包含化合物ZLN005。

在某些实施方式中，其中所述ZLN005的浓度为0.001μM-50μM。

在某些实施方式中，其中施用所述PGC-1α激活剂的时间为1-15天。

另一方面，本申请提供了一种干细胞样细胞增殖诱导组合物，其包含PGC-1α激活剂。

在某些实施方式中，所述组合物还包含干细胞培养基；其中所述干细胞培养基包含选自下组的一种或多种：DMEM培养基、1640培养基、MEM培养基和X-VIVO培养基。

在某些实施方式中，所述组合物还包含一种或多种T细胞激活因子；所述T细胞激活因子包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和离子霉素。

在某些实施方式中，所述组合物还包含一种或多种细胞因子；所述细胞因子包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

在某些实施方式中，在所述组合物中的所述PGC-1α激活剂包含化合物ZLN005。

在某些实施方式中，在所述组合物中选自下组的两种或更多种物质在使用前彼此不混合：PGC-1α激活剂、T细胞激活因子和细胞因子。

另一方面，本申请提供了PGC-1α激活剂在制备干细胞样细胞增殖诱导剂中的用途。

在某些实施方式中，在所述用途中的所述PGC-1α激活剂包含化合物ZLN005。

在某些实施方式中，所述干细胞样细胞包含表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的记忆性干细胞样T细胞(TSCM)。

另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含干细胞样细胞，所述干细胞样细胞经向包含或能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用PGC-1α激活剂而制备。

在某些实施方式中，在所述药物组合物中，所述PGC-1α激活剂包含化合物ZLN005。

在某些实施方式中，在所述药物组合物中，所述干细胞样细胞包含表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的记忆性干细胞样T细胞(TSCM)。

在某些实施方式中，所述药物组合物还包含一种或多种T细胞激活因子；所述T细胞激活因子包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和离子霉素。

在某些实施方式中，所述药物组合物还包含一种或多种细胞因子；所述细胞因子包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

图1为化合物ZLN005促进CD8⁺TSCM细胞体外增殖的结果。

图2为化合物ZLN005促进CD4⁺TSCM细胞体外增殖的结果。

图3为不同浓度的化合物ZLN005对TSCM细胞占T细胞的比例的影响。

图4为化合物ZLN005和化合物TWS119对T细胞抑制增殖效果的影响。

具体实施方式

以下由特定的具体实例说明本申请中发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。本申请提供的方法能够快速、简便和/或稳定地诱导干细胞样细胞增殖，能够用于制备干细胞样细胞增殖诱导剂，还能够用于治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病或病毒感染疾病，还能够被用于对受试者进行个性化诊断和治疗。以下对本申请做进一步描述：在本申请中，除非另有说明，否则本申请中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本申请中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

在本申请中，术语“干细胞样细胞”通常是指具有自我复制和多能性能力的细胞。通常，干细胞可以再生损伤的组织。本申请的干细胞可以是但不限于胚胎干细胞(ES)或组织干细胞(也称为组织特异性干细胞或体细胞干细胞)。也可以具有上述能力的任何人造产生的细胞(例如本文使用的融合细胞，重编程细胞等)。在本申请中，所述干细胞样细胞可以包含记忆性干细胞样T细胞(TSCM)、iPS细胞或间充质干细胞。

在本申请中，术语“iPS细胞”通常是指诱导性多能干细胞(induced pluripotentstem cells)。其可以为将四个转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面的特性都与胚胎干细胞极为相似。并且其可在适当诱导条件下定向分化，例如，被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞。iPS细胞可用于肿瘤、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症等疾病的治疗。

在本申请中，术语“间充质干细胞”通常是指来源于发育早期的中胚层，具有多向分化潜能、造血支持、促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点的多能干细胞(MSC，mesenchymal stemcells)。在本申请中，所述间充质干细胞可来源于骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺、羊水或脐带血。在本申请中，所述间充质干细胞可用于治疗放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病。

在本申请中，术语“记忆性干细胞样T细胞”通常是指处于记忆性T细胞早期分化阶段，具有干细胞特征，具有较强的多向分化潜能的细胞(T memory stem cells，TSCM)。TSCM细胞在应答抗原刺激后，能够分化为中央记忆性T细胞(central memory T cells，TCM)、效应记忆性T细胞(effector memory T cells，TEM)和效应性T细胞(effector T cells，TEF)，进而产生大量的IFN-γ等效应子，产生更为强大的杀伤力，在具有分化潜能的同时，具有较强的自我更新能力。研究表明，在体外使用糖原合成激酶-3β(GSK-3β)抑制剂能够有效促进TSCM细胞增殖(参见US20150299656A1，其全文并入本申请作为参考)，这是因为GSK-3β抑制剂引发了Wnt信号，该信号能够延迟或阻止T细胞分化。

在本申请中，术语“嵌合抗原受体”通常又称“CAR”，是指一组多肽，这一组多肽在免疫效应细胞中使得该免疫效应细胞对靶细胞(通常为癌细胞)具有特异性，并产生胞内信号。在本申请中，CAR可包含至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在本申请中，CAR的一组多肽可位于相同的多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)，也可以彼此不连续，例如，可位于不同的多肽链中。在本申请中，CAR可包含二聚转换开关(adimerization switch)，其在二聚化分子的存在下可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至细胞内结构域。在本申请中，刺激分子可以与T细胞受体复合物相关的zeta链。在本申请中，细胞内结构域可包含一个一级信号传导结合域(例如，CD3-zeta的主要信号结构域)。在一个方面，细胞质信号结构域还可包含一种或多种衍生自至少一种共刺激分子的共刺激结构域。例如，所述共刺激结构域可为4-1BB(即CD137)，CD27，ICOS和/或CD28。在本申请中，CAR可包含嵌合融合蛋白，例如，在氨基末端(N-ter)上含有任选的前导序列。其中，所述前导序列任选地在细胞加工过程中将抗原结合结构域(例如，scFv)切割并将CAR定位于细胞膜。

在本申请中，术语“一级信号传导结合域”通常是指选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcEpsilonR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP12的蛋白质的功能性信号传导结构域。在本申请中，所述一级信号传导结合域可选自下组：CD3ζ、CD3δ和CD3ε。

在本申请中，术语“共刺激结构域”通常是指选自以下一个或多个的蛋白质的功能性信号传导结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D。在本申请中，所述共刺激结构域可选自下组：CD27、CD28和4-1BB。

在本申请中，术语“4-1BB”通常是指TNFR超家族的成员。在本申请中，术语“4-1BB共刺激结构域”通常是指GenBank中4-1BB蛋白质的氨基酸序列中位点为214-255的氨基酸序列。

在本申请中，术语“T细胞受体”(T cell receptor，TCR)通常是指是T细胞特异性识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构。其一般与CD3分子呈复合物形式存在于T细胞表面。TCR是一个固定在细胞膜上的异源二聚体，多数由高度易变的α亚基和β亚基通过二硫键连接组成；少数由γ和δ肽链组成。TCR包含可变区和恒定区，恒定区靠近细胞膜，连接着跨膜区和胞内的末端，而可变区负责识别多肽/MHC复合体。

在本申请中，术语“可变区片段”通常是指TCR中的可变区片段，该可变区片段可以识别多肽/MHC复合体。每个亚基的可变区都包含三个高度易变的互补决定区(complementarity determining regions，CDR)。在本申请中，所述可变区片段可以包含TCRα可变区片段Vα、TCRα可变区片段Jα、TCRβ可变区片段Vβ、TCRβ可变区片段Dβ和TCRβ可变区片段Jβ。

在本申请中，术语“干细胞培养基”通常是指能够使干细胞正常生长的培养基。在某些实施方式中，所述干细胞培养基还使干细胞处于悬浮的状态。例如，本申请中，所述干细胞培养基可以包含DMEM培养基、1640培养基、MEM培养基和X-VIVO培养基。

在本申请中，术语“CD45RO^-”通常是指TSCM具有CD45RO阴性的特征，是TSCM的重要标志。CD45RO是CD45(例如，CD45RA、CD45RB、CD45Rc、CD45R0)的亚型之一。在本申请中，“-”表示该标志阴性的含义。

在本申请中，术语“CD45RO⁺”通常是指TSCM具有CD45RO阳性的特征，也是TSCM的重要标志。在本申请中，“+”表示该标志阳性的含义。

在本申请中，术语“CCR7⁺”通常是指TSCM具有CCR7阳性的特征，也是TSCM的重要标志。CCR7为趋化因子受体7。

在本申请中，术语“CD95⁺”通常是指TSCM具有CD95阳性的特征，也是TSCM的重要标志。CD95又称Fas，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导。FasL通常出现于活化的T细胞和NK细胞。

在本申请中，术语“肿瘤抗原”通常是指在肿瘤细胞内或由肿瘤细胞产生的抗原物质，其可能具有在宿主中触发免疫应答的能力。例如，肿瘤抗原可以是构成肿瘤细胞的一部分并且能够诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的蛋白质，多肽，肽或其片段。肿瘤抗原肽可以是由于肿瘤细胞中的肿瘤抗原降解而产生的肽，并且可以通过结合HLA分子在细胞表面上表达后诱导或激活肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞。在一些实施方案中，术语“肿瘤抗原”还可以指在癌细胞上专门或优先或差异表达和/或与癌细胞相关的生物分子(例如，蛋白质，碳水化合物，糖蛋白等)从而提供癌症优先或特异性的靶标。例如，与生物体中的任何其他细胞相比，优先表达可以为常规的优先表达，或者在生物体的特定区域内的优先表达(例如在特定器官或组织内)。例如，所述肿瘤抗原可以包含TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、TnAg、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2，IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R，CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、legumain、HPVE6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、ie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白和端粒酶、PCTA-1/Galectin 8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、muthsp702、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。

在本申请中，术语“B淋巴细胞表面抗原”通常是指B淋巴细胞在不同阶段产生的位于B淋巴细胞表面的抗原B淋巴细胞表面抗原可以包含CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD38、CD39和CD40等。在本申请中，B淋巴细胞表面抗原可以包含CD19。

在本申请中，术语“TNF家族成员”通常是指属于TNF(肿瘤坏死因子TumorNecrosis Factor)家族的成员。TNF家族成员可以包含CD40LG(TNFSF5)、CD70(TNFSF7)、EDA、FASLG(TNFSF6)、LTA(TNFSF1)、LTB(TNFSF3)、TNFSF4(OX40L)、TNFSF8(CD153)、TNFSF9(4-1BB)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(RANKL)、TNFSF12(TWEAK)、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF17(BCMA)和TNFSF18。在本申请中，所述TNF家族成员可以包含BCMA和4-1BB。

在本申请中，术语“HER家族成员”通常是指属于HER(人表皮生长因子humanepidermal growth factor receptor)家族的成员。HER家族成员可以包含EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)以及Her4(ErbB-4)。在本申请中，所述HER家族成员可以包含HER2。

在本申请中，术语“CD19”通常是指分化群19蛋白，其是可在白血病前体细胞上检测的抗原决定簇。人CD19在UniProt/Swiss-Prot的登录号为P15391，编码人CD19的核苷酸序列在GenBank的登录号为NM_001178098。在本申请中，CD19还可以包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD19的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。

在本申请中，术语“BCMA”通常是指B细胞成熟抗原(B Cell Maturation Antigen，BCMA，CD269)。BCMA是肿瘤坏死因子受体(TNF)超家族的成员，可结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)。BCMA常见于多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面。

在本申请中，术语“GPC3”通常是指由磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(NCBI数据库基因ID：2719)编码的蛋白质，其是肝癌的早期标志物。GPC3在肝细胞癌中高度表达，并在早期肝细胞癌患者组织中检测到。

在本申请中，术语“HER2”通常是指人类HER2蛋白，其属于HER家族成员。例如，参见Semba et al.，PNAS(USA)82：6497-6501(1985)和Yamamoto et al.，Nature 319：230-234(1986)，(HER2的GenBank登录号X03363)。

在本申请中，术语“MAGEA家族成员”通常是指黑色素瘤抗原A家族的成员，其在多种恶性肿瘤，如黑色素瘤、肺癌、胃癌中表达，目前已成为肿瘤特异性抗原检测的靶标之一。在本申请中，MAGEA家族成员可包含MAGEA3和MAGEA4。

在本申请中，术语“CTA家族成员”通常是指肿瘤-睾丸抗原(Cancer-testisAntigenCTA)家族中的成员，是具有特异性表达模式的肿瘤相关抗原。CTA家族成员可包含MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE-12、BAGE和NY-ESO-1等。在本申请中，CTA家族成员可包含NY-ESO-1。

在本申请中，术语“酪氨酸酶”通常是指分子量大小为75kD、来源于胚胎神经鞘细胞的酶，是黑色素代谢和儿茶酚胺的关键酶。在白癜风患者中常见酪氨酸酶(TYR)抗体。在本申请中，酪氨酸酶可包含黑素瘤抗原酪氨酸酶。

在本申请中，术语“NY-ESO-1”通常是指肿瘤-睾丸抗原家族成员，其从食管癌cDNA表达文库中筛选获得，存在于多种类型的肿瘤中，属于肿瘤免疫治疗的候选靶点。

在本申请中，术语“MART1”通常是指由自体细胞毒性T淋巴细胞识别的黑素细胞分化抗原。由自体细胞毒性T细胞识别的其他六种黑素瘤相关抗原包含MAGE-1、酪氨酸酶、gp100、gp75、BAGE-1和GAGE-1。亚细胞分馏显示MART-1存在于黑素体和内质网中。

在本申请中，术语“HPV病毒”通常是指人类乳头瘤病毒，其主要类型为HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等。HPV病毒的主要感染区域有人类表皮和粘膜鳞状上皮，其中HPV16和HPV18可能与女性宫颈癌有关。在本申请中，HPV病毒可包含HPV16-E6。

在本申请中，术语“外周血单核细胞”通常是指外周血中具有单个核的细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，包含淋巴细胞和单核细胞。在本申请中，分离所述外周血单核细胞可使用Ficoll-hypaque(葡聚糖-泛影葡胺)密度梯度离心法，根据血液中各成分的比重差异进行分离。

在本申请中，术语“T细胞激活因子”通常是指促进T细胞活化、增殖的物质。在本申请中，所述T细胞激活因子可以包含B淋巴细胞表面抗原抗体、TNF抗体、细胞内聚酯和抗生素。

在本申请中，术语“B淋巴细胞表面抗原抗体”通常是指与B淋巴细胞表面抗原特异性结合的抗体。在本申请中，B淋巴细胞表面抗原抗体可以包含CD3抗体、CD28抗体、CD80抗体和CD86抗体。

在本申请中，术语“TNF抗体”通常是指与TNF家族成员特异性结合的抗体。在本申请中，所述TNF抗体可以包含4-1BB抗体。

在本申请中，术语“细胞内聚酯”通常是指微生物合成的、在细胞内以包涵体形式存在的天然高分子生物材料。细胞内聚酯具有良好的生物学性能。在本申请中，细胞内聚酯可以包含聚羟基脂肪酸酯(PHA)。

在本申请中，术语“抗生素”通常是指由微生物或动植物所产生的具有抗病原体或其它活性的代谢产物，其能干扰其他生活细胞发育功能及发挥作用。一般，抗生素可以包含β-内酰胺类、氨基糖苷类、酰胺醇类、大内环酯类、多肽类、硝基咪唑类和四环素类等。例如，所述抗生素可以包含离子霉素。

在本申请中，术语“PHA”通常是指聚羟基脂肪酸酯，其属于由多种细菌合成的细胞内聚酯，在生物体内主要以细胞质内不连续的包涵体的形式而存在。PHA具有类似于合成塑料的物理、化学特性及合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多性能。

在本申请中，术语“PMA”通常是指丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate)，PMA在肝细胞中可以诱导iNOS的表达。同时，PMA是一种促瘤剂，可以促进小鼠皮肤的成瘤。

在本申请中，术语“CD3抗体”通常是指特异性结合CD3的抗原结合分子。例如，CD3抗体可以包含T3，I，eu4和HCHTl。CD3分子通过盐桥与T细胞抗原受体相连，参与T细胞的信号转导。

在本申请中，术语“CD28抗体”通常是指特异性结合CD28的抗原结合分子。人CD28定位于2q33，与CTLA4有相似的外显子和内含子，两者的配体是B7家族，包含B7-1(CD80)和B7-2(CD86)。CD28和CD80集合亲和力高，可与多种信号分子或激酶相互作用，如PI-3K，GRB-2/s以及酪氨酸激酶ITK。

在本申请中，术语“细胞因子”通常是指由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。所述细胞因子可具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。在本申请中，所述细胞因子可包含白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子和生长因子。例如，所述细胞因子为白细胞介素。

在本申请中，术语“白细胞介素”通常是指能够促进T和/或B淋巴细胞和/或造血细胞的发育和分化的分泌蛋白或信号分子。白介素可以由辅助CD4T淋巴细胞，以及通过单核细胞，巨噬细胞和内皮细胞合成。如本文所用，白介素(IL)可以选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36。如本文所用，术语“白细胞介素”可以包含全长白介素或片段(例如截短形式)或其变体，其基本上保持相应野生型白细胞介素的生物学活性(例如，具有生物活性至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或甚至至少100％的相应野生型白细胞介素的生物活性)。本文所用的白细胞介素可以来自任何哺乳动物物种。在一些实施方案中，白细胞介素来自选自人、马、牛、鼠、猪、兔、猫、狗、大鼠、山羊、绵羊和非人灵长类动物的物种。在一些实施方案中，白细胞介素可以是突变形式。例如，白细胞介素可以是超IL-2(也称为sIL2，参见Nature 484,529-533,2612)，其可以通过修饰IL-2以增加其对IL-2Rβ的结合亲和力而获得。sIL-2中的突变主要是细胞因子的核心，分子动力学模拟表明，进化型突变使IL-2稳定，将IL-2Rβ结合位点中螺旋的灵活性降低到类似于优化的受体结合构象当绑定到CD25。与IL-2相比，sIL-2诱导细胞毒性T细胞的优异扩增，导致体内抗肿瘤反应改善，引起T调节细胞扩张少，肺水肿减少。例如，在本申请中，所述细胞因子包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

在本申请中，术语“IL2”通常是指T细胞生长因子，TCGF。其由T细胞产生，以自分泌和旁分泌的方式发挥效益，能够活化T细胞，促进细胞因子的产生；刺激NK细胞增殖，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体，还能激活巨噬细胞。

在本申请中，术语“IL21”与IL-2、IL-4、IL-15空间结构同源，通常可以促进骨髓NK细胞的增殖与分化，与抗CD40抗体协同刺激B细胞的增殖，与抗CD3抗体协同刺激T细胞的增殖。

在本申请中，术语“IL7”通常是指由骨髓基质细胞分泌的糖蛋白，其基因位于第8号染色体。IL7的靶向包为淋巴细胞，尤其是能够促进来自人或小鼠骨髓的B祖细胞、胸腺细胞及外周成熟的T细胞的生长。在较高浓度时，IL-7还能增强巨噬细胞的细胞毒活性，诱导单核细胞分泌细胞因子。

在本申请中，术语“IL15”通常由活化的单核-巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生，与IL2有很多相似之处。IL15属于IL2家族成员，通过改变Bcl-1家族成员(如Bcl-2和Bcl-XL)的表达来调节T和NK细胞的激活和增殖，也可诱导B细胞增殖。

在本申请中，术语“PGC-1α激活剂”通常是指能够激活PGC-1α，提高其表达水平的物质。其中，PGC-1α为过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1α，PGC-1α的表达水平的改变与肥胖、糖尿病以及脂代谢紊乱密切相关。在本申请中，通过向包含或者能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用PGC-1α激活剂可诱导干细胞样细胞增殖。

在本申请中，术语“烷基”通常是指包含C_1-20，线性(即“直链”)、支链或环状饱和或至少部分且在某些情况下完全不饱和(即烯基和炔基)烃链，包含例如甲基、乙基、丙烯基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基和烯丙基。“支链”是指其中低级烷基如甲基，乙基或丙基与直链烷基链连接的烷基。“低级烷基”是指具有1至约6个碳原子的烷基(即C_1-6烷基)，例如含有1、2、3、4、5或6个碳原子。“高级烷基”是指具有约10至约20个碳原子的烷基，例如含有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子。在某些实施方案中，在本申请中，烷基可以为C_1-6烷基。在本申请中，烷基可以为叔丁基。

在本申请中，术语“噻唑烷二酮”通常是指噻唑烷二酮类似物(TZDs)，包含曲格列酮(troglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、环格列酮(ciglitazone)等。TZDs能明显增强机体组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛β细胞功能，因此可用于治疗糖尿病。TZDs的作用靶点包含PPARγ(过氧化物酶体增殖激活受体γ)、PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶)等。TZDs也可作为PGC-1α激活剂。

在本申请中，术语“SIRT1去乙酰化酶”通常是指依赖于NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamide adenine dinucleotide)的去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)，属于Sirtuins家族中的一员(SIRT1-SIRT7)。SIRT1去乙酰化酶在细胞内定位于细胞核，在不同细胞中可能存在核浆的穿梭，并以此参与细胞分化或细胞凋亡。SIRT1可与不同的组蛋白或非组蛋白相互作用，这些蛋白可包含：p53、Ku70、FOCOs、NF-κB、Smad7、AR、E2F1、Tat、PGC-1α、NcoR、p300、H1、H3和H4。SIRT1去乙酰化酶也可作为PGC-1α激活剂。SIRT1激活PGC-1α和FOX01以及下游的PPARα抑制糖酵解基因表达，促进糖异生过程，并抑制脂肪形成，促进脂肪利用。

在本申请中，术语“ZLN005”通常分子式为C₁₇H₁₈N₂，名称为2-(4-叔丁基苯基)苯并咪唑，分子量为250.34，化学式为：

化合物ZLN005可用于提高糖尿病小鼠模型的PGC-1α的mRNA水平，并通过PGC-1α提高细胞线粒体含量，改善糖脂紊乱。此外，研究表明ZLN005能过促进SIRT1基因的表达(参见CN104873500A，其全文并入本申请作为参考)。

在本申请中，术语“奥替普拉”通常是指吡噻硫酮(oltipraz)，分子式为C₈H₆N₂S₃，名称为4-甲基-5-吡嗪基-3H-1，2-二硫-3-硫酮，化学式为

奥替普拉用于治疗埃及血吸虫和曼氏血吸虫病。

在本申请中，术语“苯扎贝特”通常是指葡萄糖酸钠(bezafibrate)，分子式为C₁₉H₂₀ClNO₄，名称为N-(4-氯苯甲酰)-酪胺，化学式为

苯扎贝特作为降脂药，能够显著抑制HCG辅酶A还原酶，活化肝脏蛋白脂肪酶，增强VLDL的分解代谢，加速三酰甘油降解，从而降低三酰甘油。

在本申请中，术语“癌症”通常是指哺乳动物中以不受调节的细胞生长为特征的生理状态。在本申请中，癌症可以包含淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。例如，可以包含鳞状细胞癌、肺癌(包含小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(包含胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、头颈癌、B细胞淋巴瘤(包含低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡型NHL、中等级弥漫性NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴细胞性NHL、高级小型非切割细胞NHL、艾滋病相关淋巴瘤、Waldenstrom的巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病慢性成髓细胞白血病和移植后淋巴增生性疾病(PTLD))。

在本申请中，术语“自身免疫疾病”通常是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。自身免疫疾病可分为器官特异性自身免疫病和系统性自身免疫病。例如，所述自身免疫疾病可以包含慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征(goodpasture syndrome)、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、类风湿性关节炎、硬皮病(scleroderma)、结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)和Wegener肉芽肿病。

在本申请中，术语“病毒感染疾病”通常是指由于病毒通过多种途径侵入机体，并在易感的宿主细胞中增殖而导致的疾病。例如，所述病毒感染疾病可以包含上呼吸道感染、支气管炎、病毒性肺炎、病毒性肠炎、病毒性心肌炎、麻疹、水痘、风疹、幼儿急疹、手足口病、流行性腮腺炎、乙肝、非典(SARS)、HIV、艾滋病、禽流感和甲肝。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

在本申请中，术语“包含”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由......组成”的含义。

诱导干细胞样细胞增殖的方法

一方面，本申请提供了一种诱导干细胞样细胞增殖的方法，其可包含向包含或能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用PGC-1α激活剂。

在本申请中，所述干细胞样细胞可包含表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的记忆性干细胞样T细胞(TSCM)。在本申请中，本申请所述TSCM可包含经遗传修饰的T细胞。例如，所述经遗传修饰的T细胞可表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。

在本申请中，本申请所述CAR可对选自下组的靶标具有靶向特异性：CD19、BCMA、GPC3和HER2。在本申请中，所述CAR可对肿瘤抗原具有靶向特异性。例如，所述肿瘤抗原可以包含B淋巴细胞表面抗原、TNF家族成员、GPC和HER家族成员。例如，可以包含CD19、BCMA、GPC3和HER2。

在本申请中，所述TCR可对肿瘤抗原具有靶向特异性。例如，所述肿瘤抗原可以包含MAGEA家族成员、CTA家族成员和酪氨酸酶。例如，可以包含MAGEA3、MAGEA4、NY-ESO-1、MART1和黑素瘤抗原酪氨酸酶。

在本申请中，所述TSCM可具有以下特征：A)CD45RO-或CD45RO⁺；B)CCR7⁺；和C)CD95⁺。在本申请中，所述TSCM还可以具有一种或多种选自下组的特征：CD45RA⁺、CD27⁺、CD62L⁺、CD28⁺、CD127⁺、CD122⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD3⁺。

在本申请中，为获得所述TSCM，可先分离获得外周血单核细胞PBMC、CD3⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞或CD4⁺T淋巴细胞。在本申请中，为获得所述TSCM，还可先分离获得外周血、脐带血、骨髓、淋巴结、肝、胸腔积液、胸腔、腹腔、关节液、腹膜、腹膜后间隙和/或胸腺。

在本申请中，可以向分离的所述PBMC加入一种或多种T细胞激活因子。在本申请中，所述T细胞激活因子可包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和/或离子霉素。在本申请中，所述T细胞激活因子包含CD3抗体，且所述CD3抗体的浓度为1-10000ng/mL。例如，浓度可以为1-9000ng/mL、1-5000ng/mL、1-4000ng/mL、1-3000ng/mL、1-1000ng/mL、1-500ng/mL、1-400ng/mL、1-300ng/mL、1-200ng/mL、1-100ng/mL、1-50ng/mL、1-40ng/mL、1-30ng/mL、1-20ng/mL、1-10ng/mL或1-5ng/mL。在本申请中，所述T细胞激活因子包含CD28抗体，且所述CD28抗体的浓度为1-10000ng/mL。例如，浓度可以为1-9000ng/mL、1-5000ng/mL、1-4000ng/mL、1-3000ng/mL、1-1000ng/mL、1-500ng/mL、1-400ng/mL、1-300ng/mL、1-200ng/mL、1-100ng/mL、1-50ng/mL、1-40ng/mL、1-30ng/mL、1-20ng/mL、1-10ng/mL或1-5ng/mL。

在本申请中，可向经分离的所述PBMC加入一种或多种细胞因子。在本申请中，所述细胞因子可包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。在本申请中，所述细胞因子包含IL2，且所述IL2的浓度为5-2000U/mL。例如，浓度可以为5-2000U/mL、5-1500U/mL、5-1000U/mL、5-500U/mL、5-400U/mL、5-300U/mL、5-200U/mL、5-100U/mL、5-80U/mL、5-50U/mL或5-25U/mL。在本申请中，所述细胞因子包含IL21，且所述IL21的浓度为0.1-100ng/mL。例如，浓度可以为0.1-100ng/mL、0.1-90ng/mL、0.1-80ng/mL、0.1-70ng/mL、0.1-60ng/mL、0.1-50ng/mL、0.1-40ng/mL、0.1-30ng/mL、0.1-20ng/mL、0.1-10ng/mL、0.1-5ng/mL、0.1-1ng/mL或0.1-0.5ng/mL。在本申请中，所述细胞因子包含IL7，且所述IL7的浓度为0.1-100ng/mL。例如，浓度可以为0.1-100ng/mL、0.1-90ng/mL、0.1-80ng/mL、0.1-70ng/mL、0.1-60ng/mL、0.1-50ng/mL、0.1-40ng/mL、0.1-30ng/mL、0.1-20ng/mL、0.1-10ng/mL、0.1-5ng/mL、0.1-1ng/mL或0.1-0.5ng/mL。在本申请中，所述细胞因子包含IL15，且所述IL15的浓度为0.1-100ng/mL。例如，浓度可以为0.1-100ng/mL、0.1-90ng/mL、0.1-80ng/mL、0.1-70ng/mL、0.1-60ng/mL、0.1-50ng/mL、0.1-40ng/mL、0.1-30ng/mL、0.1-20ng/mL、0.1-10ng/mL、0.1-5ng/mL、0.1-1ng/mL或0.1-0.5ng/mL。

在本申请中，PGC-1α激活剂可包含选自下组的一种或多种：具有化学式I的化合物、噻唑烷二酮、SIRT1去乙酰化酶、奥替普拉(oltipraz)和苯扎贝特(bezafibrate)，

I，其中，R1和R2独立地选自H或C_1-6烷基。例如，PGC-1α激活剂可包含具有化学式I的化合物，

I，其中，R1和R2独立地选自H或C_1-6烷基。例如，PGC-1α激活剂可包含具有化学式I的化合物，

I，其中，R1选自H或C_1-6烷基；R2为H。例如，PGC-1α激活剂可以包含化合物ZLN005。

在本申请中，施用所述PGC-1α激活剂的时间可以为1-15天，例如，可以为1-5天、1-10天、1-15天、1-20天、1-25天、1-30天、1-35天、1-40天、1-45天或1-50天。例如，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。

组合物

另一方面，本申请提供了一种干细胞样细胞增殖诱导组合物，其可包含PGC-1α激活剂。本申请所述PGC-1α激活剂可包含化合物ZLN005。在本申请中，所述组合物还可包含干细胞培养基。本申请所述干细胞培养基可包含选自下组的一种或多种：DMEM培养基、1640培养基、MEM培养基和X-VIVO培养基。本申请所述组合物还可包含一种或多种T细胞激活因子。本申请所述T细胞激活因子可包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和离子霉素。本申请所述组合物还可包含一种或多种细胞因子；所述细胞因子可包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

在本申请中，所述组合物中选自下组的两种或更多种物质在使用前可彼此不混合：PGC-1α激活剂、T细胞激活因子和细胞因子。

PGC-1α激活剂的制备用途

另一方面，本申请提供了PGC-1α激活剂在制备干细胞样细胞增殖诱导剂中的用途。本申请中所述PGC-1α激活剂可包含化合物ZLN005，本申请所述干细胞样细胞可包含表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的记忆性干细胞样T细胞(TSCM)。

在本申请中，化合物ZLN005可以用于促进干细胞样细胞的体外增殖。例如，通过向分离获得的外周血单个核细胞(PBMC)施用化合物ZLN005可以提升CD45RO-、CCR7⁺、CD95⁺、CD62L⁺等细胞占CD8⁺细胞的比例。又例如，通过向分离获得的外周血单个核细胞(PBMC)施用化合物ZLN005可以提升CD45RO^-、CCR7⁺、CD95⁺、CD62L⁺等细胞占CD4⁺细胞的比例。化合物ZLN005的浓度可为0.001μM-50μM。在某些实施方式中，化合物ZLN005的浓度可为0.42μM。在本申请中，可以同时施用T细胞激活因子，例如，CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和/或离子霉素。在某些实施方式中，所述T细胞激活因子可以为CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例可为3∶1)。在本申请中，可以同时施用细胞因子，例如，IL2、IL21、IL7和IL15。在某些实施方式中，所述细胞因子可为IL2(200IU/mL)。在本申请中，施用所述化合物ZLN005的时间可以为1-15天。在某些实施方式中，施用所述化合物ZLN005的时间可以为12天。

在本申请中，低浓度化合物ZLN005可显著促进干细胞样细胞的体外增殖，例如，低浓度化合物ZLN005可以显著提升CD45RO^-、CCR7⁺、CD95⁺、CD62L⁺等细胞占CD3⁺细胞比例。在本申请中，所述ZLN005的浓度可以为0.001μM-50μM，例如，浓度可以为0.001μM-50μM、0.001μM-40μM、0.001μM-30μM、0.001μM-20μM、0.001μM-10μM、0.001μM-8μM、0.001μM-6μM、0.001μM-4μM、0.001μM-2μM、0.001μM-1.5μM、0.001μM-1μM、0.001μM-0.5μM或0.001μM-0.01μM。化合物ZLN005的浓度可为0.001μM-50μM。在某些实施方式中，化合物ZLN005的浓度可为0.42μM。在本申请中，可以同时施用T细胞激活因子，例如，CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和/或离子霉素。在某些实施方式中，所述T细胞激活因子可以为CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例可为3∶1)。在本申请中，可以同时施用细胞因子，例如，IL2、IL21、IL7和IL15。在某些实施方式中，所述细胞因子可为IL7(20ng/mL)。在某些实施方式中，所述细胞因子可为IL21(25ng/mL)。在某些实施方式中，所述细胞因子可为IL7(20ng/mL)。在本申请中，施用所述化合物ZLN005的时间可以为1-15天。在某些实施方式中，施用所述化合物ZLN005的时间可以为12天。

在本申请中，化合物ZLN005可具有低细胞毒性。例如，向分离获得的外周血单个核细胞(PBMC)施用化合物ZLN005可对T细胞的增殖效果具有较低的抑制作用。化合物ZLN005的浓度可为0.001μM-50μM。在某些实施方式中，化合物ZLN005的浓度可为0.42μM。在本申请中，可以同时施用T细胞激活因子，例如，CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA或离子霉素。在某些实施方式中，所述T细胞激活因子可以为CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例可为3∶1)。在本申请中，可以同时施用细胞因子，例如，IL2、IL21、IL7和IL15。在某些实施方式中，所述细胞因子可为IL2(200IU/mL)。

药物组合物、制药用途

另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含干细胞样细胞，所述干细胞样细胞可经向包含或能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用PGC-1α激活剂而制备。在本申请所述的药物组合物中，本申请所述PGC-1α激活剂可包含化合物ZLN005。在本申请所述的药物组合物中，本申请所述干细胞样细胞可包含表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的记忆性干细胞样T细胞(TSCM)。在本申请所述的药物组合物中，本申请所述组合物还可包含一种或多种T细胞激活因子；本申请所述T细胞激活因子可包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和/或离子霉素。本申请所述的药物组合物还可包含一种或多种细胞因子；所述细胞因子可包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

在本申请中，所述药物组合物可以包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以为本领域所熟知的，例如，包含磷酸盐缓冲盐溶液、水、脂质体、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。包含此种载体的组合物可以根据熟知的常规方法配制。这些药物组合物可以合适的剂量给予受试者。

在本申请中，所述的方法、用途、组合物、药物组合物可用于治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病、病毒感染疾病。在本申请中，本申请所述的方法、用途、组合物、药物组合物可包含PGC-1α激活剂。在本申请中，癌症可包含甲肝。在本申请中，自身免疫疾病可包含系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿性关节炎。在本申请中，病毒感染疾病可包含流感、甲肝和HIV。

另一方面，本申请提供了PGC-1α激活剂在制备用于治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病、病毒感染疾病中的应用。

另一方面，本申请提供了PGC-1α激活剂在治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病、病毒感染疾病中的应用。

另一方面，本申请提供了一种治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病、病毒感染疾病的方法，其包含PGC-1α激活剂。

在本申请中，将给予受试者治疗有效量的所述PGC-1α激活剂。其中所述治疗有效量表示对受试者产生效果，如对所述癌症、自身免疫疾病或病毒感染疾病产生改善和/或消除。所述治疗有效量的确切剂量依赖于治疗目的，并且可通过本领域技术人员利用已知技术确定。如医学领域中已知的和上面所述的，根据全身与局部递送，年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食状况、给药时间、药物相互作用和病况的严重性进行调整可能都是必要的，并可由本领域技术人员用常规实验确定。典型的剂量可以例如在本申请实施例陈述的范围内，然而，考虑前述因素，设想了低于或高于这个示例范围的剂量。

在本申请中，所述组合物或所述药物组合物的给药方式可以包含通过静脉内、肠胃外、皮下、经皮肤、腹膜内、肌内或肺给药。或者，可以作为联合治疗方案一部分的共同给予药剂。

本申请还包含以下的实施方式：

1.一种诱导干细胞样细胞增殖的方法，其包含以下步骤：向包含或能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用PGC-1α激活剂。

2.实施方式1所述的方法，其中所述干细胞样细胞选自下组：记忆性干细胞样T细胞(TSCM)、iPS细胞和间充质干细胞。

3.实施方式2所述的方法，其中所述TSCM包含经遗传修饰的T细胞。

4.实施方式3所述的方法，其中所述经遗传修饰的T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。

5.实施方式4所述的方法，其中所述CAR包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含一级信号传导结合域和/或共刺激结构域。

6.实施方式5所述的方法，其中所述一级信号传导结合域选自下组：CD3ζ、CD3δ和CD3ε。

7.实施方式5或6所述的方法，其中所述共刺激结构域选自下组：CD27、CD28、和4-1BB。

8.实施方式4-7中任一项所述的方法，其中所述CAR对肿瘤抗原具有靶向特异性。

9.实施方式4-8中任一项所述的方法，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：B淋巴细胞表面抗原、TNF家族成员、GPC和HER家族成员。

10.实施方式4-9中任一项所述的方法，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：CD19、BCMA、GPC3和HER2。

11.实施方式4-10中任一项所述的方法，其中所述TCR包含可变区片段，所述可变区片段选自下组：TCRα可变区片段Vα、TCRα可变区片段Jα、TCRβ可变区片段Vβ、TCRβ可变区片段Dβ和TCRβ可变区片段Jβ。

12.实施方式4-11中任一项所述的方法，其中所述TCR对肿瘤抗原和/或病毒具有靶向特异性。

13.实施方式4-12中任一项所述的方法，其中所述TCR对选自下组的靶标具有靶向特异性：MAGEA家族成员、CTA家族成员、HPV病毒和酪氨酸酶。

14.实施方式4-13中任一项所述的方法，其中所述TCR对选自下组的靶标具有靶向特异性：MAGEA3、MAGEA4、NY-ESO-1、MART1、HPV16-E6和黑素瘤抗原酪氨酸酶。

15.实施方式2-14中任一项所述的方法，其中所述TSCM具有以下特征：A)CD45RO^-或CD45RO⁺；B)CCR7⁺；和C)CD95⁺。

16.实施方式15所述的方法，其中所述TSCM还具有一种或多种选自下组的特征：CD45RA⁺、CD27⁺、CD62L⁺、CD28⁺、CD127⁺、CD122⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD3⁺。

17.实施方式2-16中任一项所述的方法，其中所述干细胞样细胞为TSCM，且所述方法还包含以下步骤：分离获得外周血单核细胞PBMC、CD3⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞或CD4⁺T淋巴细胞。

18.实施方式17所述的方法，所述方法还包含：向经分离的所述PBMC加入一种或多种T细胞激活因子。

19.实施方式18所述的方法，所述T细胞激活因子包含：B淋巴细胞表面抗原抗体、TNF抗体、细胞内聚酯和/或抗生素。

20.实施方式18或19所述的方法，所述T细胞激活因子包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和/或离子霉素。

21.实施方式18-20中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活因子包含CD3抗体，且所述CD3抗体的浓度为1ng/mL-10000ng/mL。

22.实施方式18-21中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活因子包含CD28抗体，且所述CD28抗体的浓度为1ng/mL-10000ng/mL。

23.实施方式17-22中任一项所述的方法，所述方法还包含：向经分离的所述PBMC加入一种或多种细胞因子。

24.实施方式23所述的方法，其中所述细胞因子包含白细胞介素。

25.实施方式23或24所述的方法，所述细胞因子包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

26.实施方式23-25中任一项所述的方法，所述细胞因子包含IL2，且所述IL2的浓度为5U/mL-2000U/mL。

27.实施方式23-26中任一项所述的方法，所述细胞因子包含IL21，且所述IL21的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

28.实施方式23-27中任一项所述的方法，所述细胞因子包含IL7，且所述IL7的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

29.实施方式23-28中任一项所述的方法，所述细胞因子包含IL15，且所述IL15的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

30.实施方式2-29中任一项所述的方法，其中所述干细胞样细胞包含iPS细胞。

31.实施方式2-29中任一项所述的方法，其中所述干细胞样细胞包含间充质干细胞。

32.实施方式1-31中任一项所述的方法，其中所述PGC-1α激活剂包含选自下组的一种或多种：具有化学式I的化合物、噻唑烷二酮、SIRT1去乙酰化酶、奥替普拉(oltipraz)和苯扎贝特(bezafibrate)，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

33.实施方式32所述的方法，其中所述PGC-1α激活剂包含具有化学式I的化合物，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

34.实施方式32或33所述的方法，其中所述PGC-1α激活剂包含具有化学式I的化合物，

其中，R1选自H或C1-6烷基；R2为H。

35.实施方式32-34中任一项所述的方法，其中所述PGC-1α激活剂包含化合物ZLN005。

36.实施方式35所述的方法，其中所述ZLN005的浓度为0.001μM-50μM。

37.实施方式35或36所述的方法，其中所述化合物ZLN005的浓度为0.05μM-1.5μM。

38.实施方式1-37中任一项所述的方法，其中施用所述PGC-1α激活剂的时间为1-15天。

39.一种干细胞样细胞增殖诱导组合物，其包含PGC-1α激活剂。

40.实施方式39所述的组合物，其中所述组合物还包含干细胞培养基。

41.实施方式40所述的组合物，其中所述干细胞培养基包含选自下组的一种或多种：DMEM培养基、1640培养基、MEM培养基和X-VIVO培养基。

42.实施方式39-41中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种T细胞激活因子。

43.实施方式42所述的组合物，所述T细胞激活因子选自：B淋巴细胞表面抗原抗体、TNF抗体、细胞内聚酯和/或抗生素。

44.实施方式42或43所述的组合物，所述T细胞激活因子包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和/或离子霉素。

45.实施方式42-44中任一项所述的组合物，其中所述T细胞激活因子包含CD3抗体，且所述CD3抗体的浓度为1ng/mL-10000ng/mL。

46.实施方式42-45中任一项所述的组合物，其中所述T细胞激活因子包含CD28抗体，且所述CD28抗体的浓度为1ng/mL-10000ng/mL。

47.实施方式39-46中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种细胞因子。

48.实施方式47所述的组合物，其中所述细胞因子包含白细胞介素。

49.实施方式48所述的组合物，所述细胞因子包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

50.实施方式47-49中任一项所述的组合物，所述细胞因子包含IL2，且所述IL2的浓度为5U/mL-2000U/mL。

51.实施方式47-50中任一项所述的组合物，所述细胞因子包含IL21，且所述IL21的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

52.实施方式47-51中任一项所述的组合物，所述细胞因子包含IL7，且所述IL7的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

53.实施方式47-52中任一项所述的组合物，所述细胞因子包含IL15，且所述IL15的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

54.实施方式39-53中任一项所述的组合物，其中所述PGC-1α激活剂包含选自下组的一种或多种：具有化学式I的化合物、噻唑烷二酮、SIRT1去乙酰化酶、奥替普拉(oltipraz)和苯扎贝特(bezafibrate)，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

55.实施方式54所述的组合物，其中所述PGC-1α激活剂包含具有化学式I的化合物，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

56.实施方式54或55所述的组合物，其中所述PGC-1α激活剂包含具有化学式I的化合物，

其中，R1选自H或C1-6烷基；R2为H。

57.实施方式54-56中任一项所述的组合物，其中所述PGC-1α激活剂包含化合物ZLN005。

58.实施方式57所述的组合物，其中所述ZLN005的浓度为0.001μM-50μM。

59.实施方式57或58所述的组合物，其中所述化合物ZLN005的浓度为0.05μM-1.5μM。

60.实施方式39-59中任一项所述的组合物，其中所述干细胞样细胞选自下组：记忆性干细胞样T细胞(TSCM)、iPS细胞和间充质干细胞。

61.实施方式60所述的组合物，其中所述TSCM包含经遗传修饰的T细胞。

62.实施方式61所述的组合物，其中所述经遗传修饰的T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。

63.实施方式62所述的组合物，其中所述CAR包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含一级信号传导结合域和/或共刺激结构域。

64.实施方式63所述的组合物，其中所述一级信号传导结合域选自下组：CD3ζ、CD3δ和CD3ε。

65.实施方式63或64所述的组合物，其中所述共刺激结构域选自下组：CD27、CD28、和4-1BB。

66.实施方式62-65中任一项所述的组合物，其中所述CAR对肿瘤抗原具有靶向特异性。

67.实施方式62-66中任一项所述的组合物，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：B淋巴细胞表面抗原、TNF家族成员、GPC和HER家族成员。

68.实施方式62-67中任一项所述的组合物，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：CD19、BCMA、GPC3和HER2。

69.实施方式62-68中任一项所述的组合物，其中所述TCR包含可变区片段，所述可变区片段选自下组：TCRα可变区片段Vα、TCRα可变区片段Jα、TCRβ可变区片段Vβ、TCRβ可变区片段Dβ和TCRβ可变区片段Jβ。

70.实施方式62-69中任一项所述的组合物，其中所述TCR对肿瘤抗原和/或病毒具有靶向特异性。

71.实施方式62-70中任一项所述的组合物，其中所述TCR对选自下组的靶标具有靶向特异性：MAGEA家族、CTA家族、HPV病毒和酪氨酸酶。

72.实施方式62-71中任一项所述的组合物，其中所述TCR对选自下组的靶标具有靶向特异性：MAGEA3、MAGEA4、NY-ESO-1、MART1、HPV16-E6和黑素瘤抗原酪氨酸酶。

73.实施方式60-72中任一项所述的组合物，其中所述TSCM具有以下特征：A)CD45RO^-或CD45RO⁺；B)CCR7⁺；和C)CD95⁺。

74.实施方式73所述的组合物，其中所述TSCM还具有一种或多种选自下组的特征：CD45RA⁺、CD27⁺、CD62L⁺、CD28⁺、CD127⁺、CD122⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD3⁺。

75.根据实施方式42-74中任一项所述的组合物，其中所述组合物中选自下组的两种或更多种物质在使用前彼此不混合：PGC-1α激活剂、T细胞激活因子和细胞因子。

76.PGC-1α激活剂在制备干细胞样细胞增殖诱导剂中的用途。

77.实施方式76所述的用途，其中所述PGC-1α激活剂包含选自下组的一种或多种：具有化学式I的化合物、噻唑烷二酮、SIRT1去乙酰化酶、奥替普拉(oltipraz)和苯扎贝特(bezafibrate)，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

78.实施方式77所述的用途，其中所述PGC-1α激活剂包含具有化学式I的化合物，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

79.实施方式77或78所述的方法，其中所述PGC-1α激活剂包含具有化学式I的化合物，

其中，R1选自H或C1-6烷基；R2为H。

80.实施方式77-79中任一项所述的用途，其中所述PGC-1α激活剂包含化合物ZLN005。

81.实施方式80所述的用途，其中所述ZLN005的浓度为0.001μM-50μM。

82.实施方式80或81所述的用途，其中所述化合物ZLN005的浓度为0.05μM-1.5μM。

83.实施方式76-82中任一项所述的用途，其中所述干细胞样细胞选自下组：记忆性干细胞样T细胞(TSCM)、iPS细胞和间充质干细胞。

84.实施方式83所述的用途，其中所述TSCM包含经遗传修饰的T细胞。

85.实施方式84所述的用途，其中所述经遗传修饰的T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。

86.实施方式85所述的用途，所述CAR包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含一级信号传导结合域和/或共刺激结构域。

87.实施方式86所述的用途，其中所述一级信号传导结合域选自下组：CD3ζ、CD3δ和CD3ε。

88.实施方式86或87所述的用途，其中所述共刺激结构域选自下组：CD27、CD28、和4-1BB。

89.实施方式85-88中任一项所述的用途，其中所述CAR对肿瘤抗原具有靶向特异性。

90.实施方式85-89中任一项所述的用途，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：B淋巴细胞表面抗原、TNF家族成员、GPC和HER家族成员。

91.实施方式85-90中任一项所述的用途，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：CD19、BCMA、GPC3和HER2。

92.实施方式85-91中任一项所述的用途，其中所述TCR包含可变区片段，所述可变区片段选自以下组：TCRα可变区片段Vα、TCRα可变区片段Jα、TCRβ可变区片段Vβ、TCRβ可变区片段Dβ和TCRβ可变区片段Jβ。

93.实施方式85-92中任一项所述的用途，其中所述TCR对肿瘤抗原和/或病毒具有靶向特异性。

94.实施方式85-93中任一项所述的用途，其中所述TCR对选自下组的靶标具有靶向特异性：MAGEA家族成员、CTA家族成员、HPV病毒和酪氨酸酶。

95.实施方式85-94中任一项所述的用途，其中所述TCR对选自下组的靶标有靶向特异性：MAGEA3、MAGEA4、NY-ESO-1、MART1、HPV16-E6和黑素瘤抗原酪氨酸酶。

96.实施方式85-95中任一项所述的用途，其中所述TSCM具有以下特征：A)CD45RO-或CD45RO⁺；B)CCR7⁺；和C)CD95⁺。

97.实施方式95所述的用途，其中所述TSCM还具有一种或多种选自下组的特征：CD45RA⁺、CD27⁺、CD62L⁺、CD28⁺、CD127⁺、CD122⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD3⁺。

98.PGC-1α激活剂在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病或病毒感染疾病。

99.实施方式98所述的用途，其中所述PGC-1α激活剂包含选自下组的一种或多种：具有化学式I的化合物、噻唑烷二酮、SIRT1去乙酰化酶、奥替普拉(oltipraz)和苯扎贝特(bezafibrate)，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

100.实施方式99所述的方法，其中所述PGC-1α激活剂包含具有化学式I的化合物，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

101.实施方式99或100所述的方法，其中所述PGC-1α激活剂包含具有化学式I的化合物，

其中，R1选自H或C1-6烷基；R2为H。

102.实施方式98-101中任一项所述的用途，其中所述PGC-1α激活剂包含化合物ZLN005。

103.实施方式102所述的用途，其中所述ZLN005的浓度为0.001μM-50μM。

104.实施方式102或103所述的用途，其中所述化合物ZLN005的浓度为0.05μM-1.5μM。

105.实施方式98-104中任一项所述的用途，其中所述药物包含干细胞样细胞。

106.实施方式105所述的用途，其中所述干细胞样细胞选自下组：记忆性干细胞样T细胞(TSCM)、iPS细胞和间充质干细胞。

107.实施方式106所述的用途，其中所述TSCM包含经遗传修饰的T细胞。

108.实施方式107所述的用途，其中所述经遗传修饰的T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。

109.实施方式108所述的用途，所述CAR包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含一级信号传导结合域和/或共刺激结构域。

110.实施方式109所述的用途，其中所述一级信号传导结合域选自下组：CD3ζ、CD3δ和CD3e。

111.实施方式109或110所述的用途，其中所述共刺激结构域选自下组：CD27、CD28、和4-1BB。

112.实施方式108-111中任一项所述的用途，其中所述CAR对肿瘤抗原具有靶向特异性。

113.实施方式108-112中任一项所述的用途，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：B淋巴细胞表面抗原、TNF家族成员、GPC和HER家族成员。

114.实施方式108-113中任一项所述的用途，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：CD19、BCMA、GPC3和HER2。

115.实施方式108-114中任一项所述的用途，其中所述TCR包含可变区片段，所述可变区片段选自以下组：TCRα可变区片段Va、TCRα可变区片段Jα、TCRβ可变区片段Vβ、TCRβ可变区片段Dβ和TCRβ可变区片段Jβ。

116.实施方式108-115中任一项所述的用途，其中所述TCR对肿瘤抗原和/或病毒具有靶向特异性。

117.实施方式115所述的用途，其中所述TCR对选自下组的靶标有靶向特异性：MAGEA家族成员、CTA家族成员、HPV病毒和酪氨酸酶。

118.实施方式108-117中任一项所述的用途，其中所述TCR对选自下组的靶标有靶向特异性：MAGEA3、MAGEA4、NY-ESO-1、MART1、HPV16-E6和黑素瘤抗原酪氨酸酶。

119.实施方式108-118中任一项所述的用途，其中所述TSCM具有以下特征：A)CD45RO-或CD45RO⁺；B)CCR7⁺；和C)CD95⁺。

120.实施方式119所述的用途，其中所述TSCM还具有一种或多种选自下组的特征：CD45RA⁺、CD27⁺、CD62L⁺、CD28⁺、CD127⁺、CD122⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD3⁺。

121.实施方式98-120中任一项所述的用途，其中所述制备包含以下步骤：向包含或能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用PGC-1α激活剂。

122.实施方式98-121中任一项所述的用途，其中所述癌症为肝癌。

123.实施方式98-122中任一项所述的用途，其中所述自身免疫疾病为系统性红斑狼疮、系统性硬化症或类风湿性关节炎。

124.实施方式98-123中任一项所述的用途，其中所述病毒感染疾病为流感、甲肝或HIV。

125.一种药物组合物，其包含干细胞样细胞，所述干细胞样细胞经向包含或能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用PGC-1α激活剂而制备。

126.实施方式125所述的组合物，其中所述PGC-1α激活剂包含下组的一种或多种：具有化学式I的化合物、噻唑烷二酮、SIRT1去乙酰化酶、奥替普拉(oltipraz)和苯扎贝特(bezafibrate)，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

127.实施方式126所述的组合物，其中所述PGC-1α激活剂包含具有化学式I的化合物，

其中，R1和R2独立地选自H或C1-6烷基。

128.实施方式126或127所述的组合物，其中所述PGC-1α激活剂包含具有化学式I的化合物，

其中，R1选自H或C1-6烷基；R2为H。

129.实施方式126-128中任一项所述的组合物，其中所述PGC-1α激活剂包含化合物ZLN005。

130.实施方式129所述的组合物，其中所述ZLN005的浓度为0.00lμM-50μM。

131.实施方式129或130所述的组合物，其中所述化合物ZLN005的浓度为0.05μM-1.5μM。

132.实施方式125-131中任一项所述的组合物，其中所述干细胞样细胞选自下组：记忆性干细胞样T细胞(TSCM)、iPS细胞和间充质干细胞。

133.实施方式132所述的组合物，其中所述TSCM包含经遗传修饰的T细胞。

134.实施方式133所述的组合物，其中所述经遗传修饰的T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。

135.实施方式134所述的组合物，其中所述CAR包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含一级信号传导结合域和/或共刺激结构域。

136.实施方式135所述的组合物，其中所述一级信号传导结合域选自下组：CD3ζ、CD3δ和CD3ε。

137.实施方式135或136所述的组合物，其中所述共刺激结构域选自下组：CD27、CD28、和4-1BB。

138.实施方式134-137中任一项所述的组合物，其中所述CAR对肿瘤抗原具有靶向特异性。

139.实施方式134-138中任一项所述的组合物，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：B淋巴细胞表面抗原、TNF家族成员、GPC和HER家族成员。

140.实施方式134-139中任一项所述的组合物，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：CD19、BCMA、GPC3和HER2。

141.实施方式134-140中任一项所述的组合物，其中所述TCR包含可变区片段，所述可变区片段选自以下组：TCRα可变区片段Vα、TCRα可变区片段Jα、TCRβ可变区片段Vβ、TCRβ可变区片段Dβ和TCRβ可变区片段Jβ。

142.实施方式134-141中任一项所述的组合物，其中所述TCR对肿瘤抗原和/或病毒具有靶向特异性。

143.实施方式134-142中任一项所述的组合物，其中所述TCR对选自下组的靶标有靶向特异性：MAGEA家族成员、CTA家族成员、HPV病毒和酪氨酸酶。

144.实施方式134-143中任一项所述的组合物，其中所述TCR对选自下组的靶标有靶向特异性：MAGEA3、MAGEA4、NY-ESO-1、MART1、HPV16-E6和黑素瘤抗原酪氨酸酶。

145.实施方式134-144中任一项中任一项所述的组合物，其中所述TSCM具有以下特征：A)CD45RO-或CD45RO⁺；B)CCR7⁺；和C)CD95⁺。

146.实施方式145所述的组合物，其中所述TSCM还表达一种或多种选自下组的标志物：CD45RA⁺、CD27⁺、CD62L⁺、CD28⁺、CD127⁺、CD122⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD3⁺。

147.实施方式134-146中任一项所述的组合物，其中所述干细胞样细胞为TSCM，且所述组合物还包含以下步骤：分离获得外周血单核细胞PBMC、CD3⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞或CD4⁺T淋巴细胞。

148.实施方式147所述的组合物，所述组合物还包含：向经分离的所述PBMC加入的一种或多种T细胞激活因子。

149.实施方式147所述的组合物，所述T细胞激活因子包含：B淋巴细胞表面抗原抗体、TNF抗体、细胞内聚酯和/或抗生素。

150.实施方式148或149所述的组合物，所述T细胞激活因子包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和/或离子霉素。

151.实施方式148-150中任一项所述的组合物，其中所述T细胞激活因子包含CD3抗体，且所述CD3抗体的浓度为1ng/mL-10000ng/mL。

152.实施方式148-151中任一项所述的组合物，其中所述T细胞激活因子包含CD28抗体，且所述CD28抗体的浓度为1ng/mL-10000ng/mL。

153.实施方式148-152中任一项所述的组合物，所述组合物还包含：向经分离的所述PBMC加入的一种或多种细胞因子。

154.实施方式153所述的组合物，其中所述细胞因子包含白细胞介素。

155.实施方式153或154所述的组合物，所述细胞因子包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

156.实施方式152-155中任一项所述的组合物，所述细胞因子包含IL2，且所述IL2的浓度为5U/mL-2000U/mL。

157.实施方式152-156中任一项所述的组合物，所述细胞因子包含IL21，且所述IL21的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

158.实施方式152-157中任一项所述的组合物，所述细胞因子包含IL7，且所述IL7的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

159.实施方式152-158中任一项所述的组合物，所述细胞因子包含IL15，且所述IL15的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

160.实施方式132-159中任一项所述的组合物，其中所述干细胞样细胞为iPS细胞。

161.实施方式132-160中任一项所述的组合物，其中所述干细胞样细胞为间充质干细胞。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的方法、用途、组合物、药物组合物的工作方式，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例1化合物ZLN005促进CD8⁺TSCM细胞体外增殖

新鲜人外周血经Ficoll分离获得外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)。实验组：PBMC(5×10⁵/mL)与CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例为3∶1)、IL2(200IU/mL)以及化合物ZLN005(化合物ZLN005用DMSO配制，浓度为0.42μM)共培养12天。对照组：PBMC(5×10⁵/mL)与CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例为3∶1)、IL2(200IU/mL)以及DMSO共培养12天。

实验组每2天换新鲜培养基并补加ZLN005和细胞因子以保持浓度稳定。在培养第7天，第12天分别取实验组和对照组的细胞孵育检测CD8⁺TSCM细胞的流式抗体(CD3、CD8、CD45RO、CD45RA、CD62L、CCR7、CD95、CD122、CD127、CD27、CD28)并用流式细胞仪检测。实验结果如图1所示(图1的四个点表示4次重复的实验)，其中横坐标分别表示对照组和实验组；纵坐标表示TSCM细胞占CD8⁺细胞的比例。图1的结果说明化合物ZLN005能够显著提升TSCM细胞(CD45RO^-、CCR7⁺、CD95⁺、CD62L⁺)占CD8⁺细胞的比例。

实施例2化合物ZLN005促进CD4⁺TSCM细胞体外增殖

新鲜人外周血经Ficoll分离获得外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)。实验组：PBMC(5×10⁵/mL)与CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例为3∶1)、IL2(200IU/mL)以及化合物ZLN005(化合物ZLN005用DMSO配制，浓度为0.42μM)共培养12天。对照组：PBMC(5×10⁵/mL)与CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例为3∶1)、IL2(200IU/mL)以及DMSO共培养12天。

实验组每2天换新鲜培养基并补加ZLN005和细胞因子以保持浓度稳定。在培养第7天，第12天分别取实验组和对照组的细胞孵育检测CD4⁺TSCM细胞的流式抗体(CD3、CD4、CD45RO、CD45RA、CD62L、CCR7、CD95、CD122、CD127、CD27、CD28)并用流式细胞仪检测。实验结果如图2所示(图2的四个点表示4次重复的实验)，其中横坐标分别表示对照组和实验组；纵坐标表示TSCM细胞占CD4⁺细胞的比例。图2的结果说明化合物ZLN005能够显著提升TSCM细胞(CD45RO-、CCR7⁺、CD95⁺、CD62L⁺)占CD4⁺细胞的比例。

实施例3不同浓度化合物ZLN005对TSCM细胞体外增殖的影响

新鲜人外周血经Ficoll分离获得外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)。实验组：PBMC(5×10⁵/mL)与CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例为3∶1)、IL21(25ng/mL)、IL7(20ng/mL)以及化合物ZLN005(化合物ZLN005用DMSO配制，浓度分别为0.21μM、0.42μM和0.63μM)共培养12天。对照组：PBMC(5×10⁵/mL)与CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例为3∶1)、IL21(25ng/mL)、IL7(20ng/mL)以及DMSO共培养12天。

实验组每2天换新鲜培养基并补加ZLN005和细胞因子以保持浓度稳定。在培养第7天，第12天分别取实验组和对照组的细胞孵育检测TSCM细胞的流式抗体(CD3、CD4、CD45RO、CD45RA、CD62L、CCR7、CD95、CD122、CD127、CD27、CD28)并用流式细胞仪检测。实验结果如图3所示，其中横坐标表示不同浓度的ZLN005，纵坐标该浓度的ZLN005所对应的TSCM细胞占CD3⁺细胞的比例，结果如图3所示。结果显示，低浓度化合物ZLN005能够显著提升TSCM细胞(CD45RO-、CCR7⁺、CD95⁺、CD62L⁺)占CD3⁺细胞比例。

实施例4化合物ZLN005具有低细胞毒性

新鲜人外周血经Ficoll分离获得外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)。实验组：PBMC(5×10⁵/mL)与CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例为3∶1)、IL2(200IU/mL)以及化合物ZLN005(化合物ZLN005用DMSO配制，浓度为0.42μM)共培养12天。空白对照组：PBMC(5×10⁵/mL)与CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例为3∶1)、IL2(200IU/mL)以及DMSO共培养7天。阴性对照组：PBMC(5×10⁵/mL)与CD3/CD28抗体(Dynabeads，磁珠与T细胞的比例为3∶1)、IL2(200IU/mL)以及化合物TWS119(C₁₈H₁₄N₄O₂，名称为3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基]氧基]苯酚，CASNo.601514-19-6，用DMSO配制，浓度为5μM)共培养7天。

实验组每2天换新鲜培养基并补加化合物和细胞因子以保持稳定。在培养第3天，第5天，第7天分别取细胞台盼蓝染色计数，检测T细胞增殖效果。实验结果如图4所示，其中，横坐标为培养的天数，纵坐标为TSCM细胞的增殖倍数。在相同条件下，化合物ZLN005对T细胞增殖效果抑制程度较低，而化合物TWS119会显著抑制T细胞增殖。可见化合物ZLN005对促进TSCM增殖的效果更为优越。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的优选的实施方案的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

Claims (87)

1.一种诱导干细胞样细胞体外增殖的方法，其包含以下步骤：向包含或能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用ZLN005，所述ZLN005的化学式如

所示，所述干细胞样细胞为记忆性干细胞样T细胞（TSCM）。

2.权利要求1所述的方法，其中所述TSCM包含经遗传修饰的T细胞。

3.权利要求2所述的方法，其中所述经遗传修饰的T细胞表达嵌合抗原受体（CAR）或T细胞受体（TCR）。

4.权利要求3所述的方法，其中所述CAR包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含一级信号传导结合域和/或共刺激结构域。

5.权利要求4所述的方法，其中所述一级信号传导结合域选自下组：CD3ζ、CD3δ和CD3ε。

6.权利要求4所述的方法，其中所述共刺激结构域选自下组：CD27、CD28、和4-1BB。

7.权利要求3所述的方法，其中所述CAR对肿瘤抗原具有靶向特异性。

8.权利要求3所述的方法，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：B淋巴细胞表面抗原、TNF家族成员、GPC和HER家族成员。

9.权利要求3所述的方法，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：CD19、BCMA、GPC3和HER2。

10.权利要求3所述的方法，其中所述TCR包含可变区片段，所述可变区片段选自下组：TCRα可变区片段Vα、TCRα可变区片段Jα、TCRβ可变区片段Vβ、TCRβ可变区片段Dβ和TCRβ可变区片段Jβ。

11.权利要求3所述的方法，其中所述TCR对肿瘤抗原和/或病毒具有靶向特异性。

12.权利要求3所述的方法，其中所述TCR对选自下组的靶标具有靶向特异性：MAGEA家族成员、CTA家族成员、HPV病毒和酪氨酸酶。

13.权利要求3所述的方法，其中所述TCR对选自下组的靶标具有靶向特异性：MAGEA3、MAGEA4、NY-ESO-1、MART1、HPV16-E6和黑素瘤抗原酪氨酸酶。

14.权利要求1所述的方法，其中所述TSCM具有以下特征：A）CD45RO-或CD45RO+；B）CCR7+；和C）CD95+。

15.权利要求14所述的方法，其中所述TSCM还具有一种或多种选自下组的特征：CD45RA+、CD27+、CD62L+、CD28+、CD127+、CD122+、CD4+、CD8+和CD3+。

16.权利要求1所述的方法，其中所述干细胞样细胞为TSCM，且所述方法还包含以下步骤：分离获得外周血单核细胞PBMC、CD3+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞。

17.权利要求16所述的方法，所述方法还包含：向经分离的所述PBMC加入一种或多种T细胞激活因子。

18.权利要求17所述的方法，所述T细胞激活因子包含：B淋巴细胞表面抗原抗体、TNF抗体、细胞内聚酯和/或抗生素。

19.权利要求17所述的方法，所述T细胞激活因子包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和/或离子霉素。

20.权利要求17所述的方法，其中所述T细胞激活因子包含CD3抗体，且所述CD3抗体的浓度为1ng/mL-10000ng/mL。

21.权利要求17所述的方法，其中所述T细胞激活因子包含CD28抗体，且所述CD28抗体的浓度为1ng/mL-10000ng/mL。

22.权利要求16所述的方法，所述方法还包含：向经分离的所述PBMC加入一种或多种细胞因子。

23.权利要求22所述的方法，其中所述细胞因子包含白细胞介素。

24.权利要求22所述的方法，所述细胞因子包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

25.权利要求22所述的方法，所述细胞因子包含IL2，且所述IL2的浓度为5U/mL -2000U/mL。

26.权利要求22所述的方法，所述细胞因子包含IL21，且所述IL21的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

27.权利要求22所述的方法，所述细胞因子包含IL7，且所述IL7的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

28.权利要求22所述的方法，所述细胞因子包含IL15，且所述IL15的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

29.权利要求1所述的方法，其中所述ZLN005的浓度为0.001μM-50μM。

30.权利要求1所述的方法，其中所述ZLN005的浓度为0.05μM -1.5μM。

31.权利要求1所述的方法，其中施用所述ZLN005激活剂的时间为1-15天。

32.一种组合物，其包含ZLN005，所述ZLN005的化学式如

所示，其中所述组合物还包含一种或多种T细胞激活因子。

33.权利要求32所述的组合物，其中所述组合物还包含细胞培养基。

34.权利要求33所述的组合物，其中所述细胞培养基包含选自下组的一种或多种：DMEM培养基、1640培养基、MEM培养基和X-VIVO培养基。

35.权利要求32所述的组合物，所述T细胞激活因子选自：B淋巴细胞表面抗原抗体、TNF抗体、细胞内聚酯和/或抗生素。

36.权利要求32所述的组合物，所述T细胞激活因子包含：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和/或离子霉素。

37.权利要求32所述的组合物，其中所述T细胞激活因子包含CD3抗体，且所述CD3抗体的浓度为1ng/mL-10000ng/mL。

38.权利要求32所述的组合物，其中所述T细胞激活因子包含CD28抗体，且所述CD28抗体的浓度为1ng/mL-10000ng/mL。

39.权利要求32所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种细胞因子。

40.权利要求39所述的组合物，其中所述细胞因子包含白细胞介素。

41.权利要求39所述的组合物，所述细胞因子包含选自下组的一种或多种：IL2、IL21、IL7和IL15。

42.权利要求39所述的组合物，所述细胞因子包含IL2，且所述IL2的浓度为5U/mL-2000U/mL。

43.权利要求39所述的组合物，所述细胞因子包含IL21，且所述IL21的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

44.权利要求39所述的组合物，所述细胞因子包含IL7，且所述IL7的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

45.权利要求39所述的组合物，所述细胞因子包含IL15，且所述IL15的浓度为0.1ng/mL-100ng/mL。

46.权利要求32所述的组合物，其中所述ZLN005的浓度为0.001μM-50μM。

47.权利要求32所述的组合物，其中所述ZLN005的浓度为0.05μM-1.5μM。

48.根据权利要求32所述的组合物，其中所述ZLN005和所述T细胞激活因子在使用前彼此不混合。

49.根据权利要求39所述的组合物，其中所述组合物中选自下组的两种或更多种物质在使用前彼此不混合：ZLN005、T细胞激活因子和细胞因子。

50.ZLN005在制备干细胞样细胞增殖诱导剂中的用途，所述ZLN005的化学式如

所示，所述干细胞样细胞为记忆性干细胞样T细胞（TSCM）。

51.权利要求50所述的用途，其中所述ZLN005的浓度为0.001μM-50μM。

52.权利要求50所述的用途，其中所述ZLN005的浓度为0.05μM-1.5μM。

53.权利要求50所述的用途，其中所述TSCM包含经遗传修饰的T细胞。

54.权利要求53所述的用途，其中所述经遗传修饰的T细胞表达嵌合抗原受体（CAR）或T细胞受体（TCR）。

55.权利要求54所述的用途，所述CAR包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含一级信号传导结合域和/或共刺激结构域。

56.权利要求55所述的用途，其中所述一级信号传导结合域选自下组：CD3ζ、CD3δ和CD3ε。

57.权利要求55所述的用途，其中所述共刺激结构域选自下组：CD27、CD28、和4-1BB。

58.权利要求54所述的用途，其中所述CAR对肿瘤抗原具有靶向特异性。

59.权利要求54所述的用途，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：B淋巴细胞表面抗原、TNF家族成员、GPC和HER家族成员。

60.权利要求54所述的用途，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：CD19、BCMA、GPC3和HER2。

61.权利要求54所述的用途，其中所述TCR包含可变区片段，所述可变区片段选自以下组：TCRα可变区片段Vα、TCRα可变区片段Jα、TCRβ可变区片段Vβ、TCRβ可变区片段Dβ和TCRβ可变区片段Jβ。

62.权利要求54所述的用途，其中所述TCR对肿瘤抗原和/或病毒具有靶向特异性。

63.权利要求54所述的用途，其中所述TCR对选自下组的靶标具有靶向特异性：MAGEA家族成员、CTA家族成员、HPV病毒和酪氨酸酶。

64.权利要求54所述的用途，其中所述TCR对选自下组的靶标有靶向特异性：MAGEA3、MAGEA4、NY-ESO-1、MART1、HPV16-E6和黑素瘤抗原酪氨酸酶。

65.权利要求50所述的用途，其中所述TSCM具有以下特征：A）CD45RO-或CD45RO+；B）CCR7+；和C）CD95+。

66.权利要求65所述的用途，其中所述TSCM还具有一种或多种选自下组的特征：CD45RA+、CD27+、CD62L+、CD28+、CD127+、CD122+、CD4+、CD8+和CD3+。

67.ZLN005在制备药物中的用途，所述ZLN005的化学式如

所示，其中所述药物用于治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病或病毒感染疾病，其中所述药物包含干细胞样细胞，所述干细胞样细胞为记忆性干细胞样T细胞（TSCM）。

68.权利要求67所述的用途，其中所述ZLN005的浓度为0.001μM-50μM。

69.权利要求67所述的用途，其中所述ZLN005的浓度为0.05μM-1.5μM。

70.权利要求67所述的用途，其中所述TSCM包含经遗传修饰的T细胞。

71.权利要求70所述的用途，其中所述经遗传修饰的T细胞表达嵌合抗原受体（CAR）或T细胞受体（TCR）。

72.权利要求71所述的用途，所述CAR包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含一级信号传导结合域和/或共刺激结构域。

73.权利要求72所述的用途，其中所述一级信号传导结合域选自下组：CD3ζ、CD3δ和CD3ε。

74.权利要求72所述的用途，其中所述共刺激结构域选自下组：CD27、CD28、和4-1BB。

75.权利要求71所述的用途，其中所述CAR对肿瘤抗原具有靶向特异性。

76.权利要求71所述的用途，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：B淋巴细胞表面抗原、TNF家族成员、GPC和HER家族成员。

77.权利要求71所述的用途，其中所述CAR对选自下组的靶标具有靶向特异性：CD19、BCMA、GPC3和HER2。

78.权利要求71所述的用途，其中所述TCR包含可变区片段，所述可变区片段选自以下组：TCRα可变区片段Vα、TCRα可变区片段Jα、TCRβ可变区片段Vβ、TCRβ可变区片段Dβ和TCRβ可变区片段Jβ。

79.权利要求71所述的用途，其中所述TCR对肿瘤抗原和/或病毒具有靶向特异性。

80.权利要求71所述的用途，其中所述TCR对选自下组的靶标有靶向特异性：MAGEA家族成员、CTA家族成员、HPV病毒和酪氨酸酶。

81.权利要求71所述的用途，其中所述TCR对选自下组的靶标有靶向特异性：MAGEA3、MAGEA4、NY-ESO-1、MART1、HPV16-E6和黑素瘤抗原酪氨酸酶。

82.权利要求67所述的用途，其中所述TSCM具有以下特征：A）CD45RO-或CD45RO+；B）CCR7+;和 C）CD95+。

83.权利要求82所述的用途，其中所述TSCM还具有一种或多种选自下组的特征：CD45RA+、CD27+、CD62L+、CD28+、CD127+、CD122+、CD4+、CD8+和CD3+。

84.权利要求67所述的用途，其中所述制备包含以下步骤：向包含或能够产生待增殖的所述干细胞样细胞的细胞群施用所述ZLN005。

85.权利要求67所述的用途，其中所述癌症为肝癌。

86.权利要求67所述的用途，其中所述自身免疫疾病为系统性红斑狼疮、系统性硬化症或类风湿性关节炎。

87.权利要求67所述的用途，其中所述病毒感染疾病为流感、甲肝或HIV。

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