KR20010071798A - 세포자멸사 관련질환 치료제 - Google Patents

Abstract

미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질이, 항암제, 자외선조사 및 허혈스트레스에 의한 세포자멸사유도를 억제하는 것을 발견했다. 이것에 의해, 세포자멸사에 기인하는 모든 질환, 예를 들면, 심질환, 신장질환, 신경질환, 또는 간장질환 등의 치료 및 예방에 대해, MK패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로 하는, 새로운 약제의 제공이 가능하다.

Description

세포자멸사 관련질환 치료제{Remedies for apoptosis-associated diseases}

세포자멸사(apoptosis, 자사)는, 괴사(necrosis)와의 형태적 상이로부터 발견되었다(Kerr,J.F.R.et al.:Brit.J.Cancer,26:239-257,1972). 즉, 괴사에서는, 세포전체도 미토콘드리아도 서서히 팽화하여, 세포질의 변화가 선행한다. 최종적으로 세포막이 파열되어, 소위 세포융해를 일으킨다. 그 결과, 염증을 동반하는 것이 일반적이다. 이에 대해, 세포자멸사에서는, 변화는 핵에서 먼저 시작되어, 핵도 세포도 축소된다. 세포질내의 미토콘드리아 등의 소기관은 정상이다. 최종적으로 세포자멸사 소체를 형성하여, 거의 흔적을 남기지 않고 마크로파지나 인접하는 식세포 등에 깨끗하게 먹힌다. 염증은 일으키지 않는다.

괴사는, 화상 등 병리적 요인에 의해, 손상을 입은 일군의 세포가 일제히 죽는 “병리적 세포사”인데 반해, 세포자멸사는, 병리적 요인 뿐 아니라, 발생, 면역, 호르몬작용 등, 다양한 생리적 요인에 의해서도 발생하는 “생리적 세포사”로, 시간적으로나 부위적으로도, 산발적으로 랜덤하게 발생하여, 생명현상에 필수인 세포사로서 중요한 역할을 해내고 있다.

이와 같이 세포자멸사는, 형태 뿐 아니라, 기능에 있어서 괴사와는 달리, 세포분열과 표리일체가 되어, 조직의 세포동태에 중요한 기능을 해내고 있다. 따라서, 그 이상(異常)은, 여러 가지 질환의 증상발생에 깊이 관여하고 있다. 즉, 세포자멸사의 저하에 관련되는 질환으로서, 암, 자기면역질환, 바이러스감염 등이 알려지고, 세포자멸사의 항진에 관련되는 질환으로서, 후천성 면역부전증후군(AIDS), 알쯔하이머병, 근위축성 측색경화증, 색소성 망막증, 소뇌변성, 재생불량성 빈혈, 심근경색, 뇌졸중, 재관류상해(reperfusion injury), 알코올에 의한 간장병, 치주병 등이 알려져 있다(Craig,B.T.:Science,267:1456-1462,1995). 또한, 1993년 이래, 국소뇌허혈모델(래트)에 있어서의 세포자멸사를 지지하는 보고가 타영역에서의 연구에 호응하여 보여지게 되었다(Linnik,M.D.et al.:Stroke, 24:2002-2009,1993;Li,Y.et al.: J.Cereb.Blood Flow.Metab.,15:389-397,1995;Linnik,M.D.et al.:Mol.Brain Res.,32:116-124,1995;Islam,N.et al.:Neurosci.Lett.,188:159-162,1995;Soriano, M.A.et al.:Neuroreport,7:425-428,1996;Charriaut-Marlangue,C.et al.:J.Cereb. Blood Flow.Metab.,16:186-194,1996;Du,C.et al.:J.Cereb.Blood Flow.Mctab.,16: 195-201,1996).

이러한 사실로부터, 최근, 세포자멸사를 유도, 또는 억제함으로써 세포자멸사 관련질환의 예방 및 치료를 꾀하는 시도가 행해지고 있다. 예를 들면, 치료적으로 유효하고 생리적 수용 가능한 디옥소피페라진을 투여함으로써, 세포자멸사를 방지 또는 지연하는 방법(국제공개번호:WO/95/03O54), 세포자멸사 관여 유전자에 의한 세포자멸사의 유도 내지 억제에 의한 세포자멸사 관련질환의 예방 및 치료(국제공개번호:WO/96/12017), 세포중의 Bcl-2의 활성을 증대시킴으로써, 세포자멸사 세포사에 이르는 질환 또는 병적 상태를 치료 및 예방하는 방법(국제공개번호:WO/94/27426), 치료적으로 유효량의 신규한 Fas 단백질을 투여함으로써, 환자의 Fas 중개세포사를 처치하는 방법(국제공개번호:WO/95/13701), 인간 Fas 항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날항체에 의한, Fas 리간드를 사이에 둔 세포자멸사를 억제하기 위한 치료조성물(국제공개번호:WO/95/10540) 등이 개시되어 있다

본 발명은 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로서 함유하는 세포자멸사 억제제 및 세포자멸사 관련질환을 치료, 또는 예방하기 위한 약제에 관한 것이다.

도1은 윌름즈종양 유래 주화세포 G401에 대한, 무처리군(대조군), 시스플라틴(cisplatin)(100μM)만 처리한 군 및 MK(1, 10, 또는100ng/mL)+시스플라틴처리(100μM)군에 있어서의, 12시간 배양 및 24시간 배양의 생존세포를, MTT법에 의한 흡광도(OD540-655)로서 나타낸다.

도2는 윌름즈종양 유래 주화세포 G401에 대한, 무처리군(대조군), 시스플라틴(100μM)만 처리한 군 및 MK(100ng/mL)+시스플라틴처리(100μM)군에 있어서의, 12시간 배양세포 및 24시간 배양세포를, 훽스트 33342로 염색한 도이다. A(무처리군), B(시스플라틴만 처리한 군) 및 C(MK+시스플라틴처리)군은 12시간 배양, D(무처리군), E(시스플라틴만 처리한 군) 및 F(MK+시스플라틴처리)는 24시간 배양을 나타낸다.

도3은 마찬가지로 훽스트 33342로 염색된 핵중, 염색질의 응축, 핵단편화를 일으킨 핵을 갖는 세포자멸사 세포사수의, 전체의 세포수에 대한 비율을 백분률로 나타낸다.

도4는 129/Sv계 MK 녹아웃 마우스(Heterozygote)(숫컷, 8∼12주령)에 있어서의, 생리식염수 투여군, MK 투여군 각각에, 오전에 생리식염수 10mL, MK 200㎍을 복강내 투여하고, 오후에 상기 2군의 각각에 시스플라틴 9.3mg/kg을 복강내 투여(Day O)하여, Day 1∼Day 3에 상기 2군에 대해, 생리식염수 10mL, MK 200㎍을 복강내 투여하고, Day 4에 신장을 적출하여 파라핀포매(包埋, embed)하고, 그 조각을 헤마톡시린 ·에오신 염색한 것이다. 비교대조로서, 무처리 야생형 마우스에 대해서도 헤마톡시린 ·에오신 염색한 것을 나타낸다.

도5는 마찬가지로 상기 파라핀처리 조각을, TUNEL법으로 해석한 것이다.

도6은 윌름즈종양 유래 주화세포 G401에 대한, 시스플라틴 무처리군으로서,MK 무처리군, 인간 MK(100ng/mL)처리군, 마우스 MK(100ng/mL)처리군, 시스플라틴처리(100μM)군으로서, 마찬가지로, MK 무처리군, 인간 MK(100ng/mL)처리군, 마우스 MK(100ng/mL)처리군의 6군을 설정하여, 이들의 배양세포에 있어서의 Bcl-2의 발현을, 웨스턴흡입법으로 해석한 것이다.

도7은 도6의 결과를 수치화한 것이다.

도8은 몽고쥐의 일과성 전뇌허혈상해 직전에, 생리식염수, 또는 MK 2㎍을 뇌실내에 주입하고, 그 7일 후에, 해마영역 CA1신경세포에 대해, TUNEL법으로 해석한 결과를 나타낸다. 현미경의 배율은 ×25이다.

도9는 마찬가지로 배율이 ×l00배인 도이다.

도10은 몽고쥐의 일과성 전뇌허혈상해 직전에 생리식염수(a), MK 2㎍(c), MK 1㎍(d), MK 0.5㎍(e), 또는 MK 0.25㎍(f)을 뇌실내에 주입하고, 그 7일 후에 있어서의, 해마CA1영역 신경세포의 헤마톡시린 ·에오신 염색조각을 나타낸다. 바의 길이는 0.5mm를 나타낸다. 현미경배율은 ×25배이다.

도11은 마찬가지로 배율이 ×1OO배인 도이다. 바의 길이는 5O㎛를 나타낸다.

도12는 도10에서 나타낸 HE 염색조각에 있어서의, 해마CA1영역의 생존하고 있는 신경세포의 핵수를 계측하여, CA1영역의 길이에 대한 비율로 나타낸 것이다. n은 동물의 수를 나타낸다.

도13은 몽고쥐의 일과성 전뇌허혈상해 직전에, MK를 2㎍ 뇌실내에 주입하고, 그 일주일 후, 2주일 후, 3주일 후 및 4주일째의 해마CA1영역의 생존 신경세포수를 계측하여, CA1영역의 길이에 대한 비율로 나타낸 것이다.

도14는 몽고쥐의 일과성 전뇌허혈상해 직전에 생리식염수(a), MK 2㎍(c), MK 1㎍(d), 또는 MK 0.5㎍(e)을 뇌실내에 주입하고, 그 7일 후에 있어서의, 해마CA1영역의 신경세포를 TUNEL법으로 해석한 도이다. 세포자멸사를 일으킨 세포의 핵은 강하게 염색되었다. 바의 길이는 50㎛를 나타낸다.

도15는 마찬가지로 세포자멸사를 일으킨 해마CA1영역 신경세포의 전체 세포수에 대한 비율을 나타낸다.

도16은 몽고쥐의 일과성 전뇌허혈상해 후의 2, 4, 6, 12 및 24시간 시점에서, 뇌실내에 MK 2㎍을 주입하고, 그 7일 후의 해마CA1영역의 생존 신경세포수를 CA1영역의 길이에 대한 수의 비율로 나타낸 것이다.

그러나, 지금까지는, 상기 질환상태를 모두 포함하는, 정상이 아닌 세포자멸사 세포사를 일으키는 많은 질환상태를 치료하기 위한 효과적 수단은 찾아내지 못하고 있다. 따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 상기 세포자멸사를 억제함으로써 세포자멸사가 관련되는 질환의 치료 및 예방수단을 제공하는 것에 있다. 본 발명자들은, 신경돌기신장, 신경세포생존유지, 혈관내피세포에서의 선용계의 활성화 등 여러 가지 생물활성을 갖는 미드카인(midkine:MK)이라는 헤파린결합성 성장분화인자가, 항암제 및 허혈스트레스에 의한 세포자멸사를 억제하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은, 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로서 함유하는 세포자멸사 억제제에 관한 것이고, 보다 구체적으로는,

(1) 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로서 함유하는 세포자멸사 억제제,

(2) (1)에 있어서, 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질이 미드카인(MK)인 세포자멸사 억제제,

(3) 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로서 함유하는 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제,

(4) (3)에 있어서, 세포자멸사 관련질환이 심질환인 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제,

(5) (3)에 있어서, 세포자멸사 관련질환이 신장질환인 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제,

(6) (3)에 있어서, 세포자멸사 관련질환이 간질환인 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제,

(7) (3)에 있어서, 세포자멸사 관련질환이 신경변성질환인 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제,

(8) (3) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질이 미드카인(MK)인 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제,

(9) 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로서 함유하는 Bcl-2증강제,

에 관한 것이다.

또는 본 발명은, 이하의 MK패밀리에 속하는 단백질을 사용하는 방법에 관한 것이다.

즉 본 발명은, 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 투여하는 것에 의한, 세포자멸사를 억제하기 위한 방법,

미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 투여하는 것에 의한, 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법,

및 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 투여하는 것에 의한, Bcl-2를 증강하기 위한 방법에 관한 것이다.

더욱이 본 발명은, 이하의 MK패밀리에 속하는 단백질의 사용에 관한 것이다.

즉 본 발명은, 세포자멸사를 억제하기 위한 약제를 제조하기 위한, 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질의 사용, 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한, 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질의 사용,

및 Bcl-2를 증강하기 위한 약제를 제조하기 위한, 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 MK라는 헤파린결합성 성장분화인자가, 항암제 및 허혈스트레스에 의한 세포자멸사를 억제한다고 하는, 본 발명자들에 의해 밝혀진 사실을 토대로 한다. 따라서, 본 발명은, 첫째 MK패밀리에 속하는 단백질에 의한 세포자멸사 억제에 관한 것이다.

MK는, 레티노인산에 의한 배성 종양세포의 분화유도과정에서 조기에 발현이 유도되는 유전자의 산물로서 발견되었다(Kadomatsu,K.et al.:Biochem.Biophys.RES. Commun.,151:1312-1318,1988). 플레이오트로핀(pleiotrophin,PTN)은, 신경돌기신장능을 갖는 헤파린결합 단백질로서, 신생래트의 뇌에서 발견되었다(Rauvala,H.:EMBOJ.,8:2933-2941,1989). MK와 PTN은, 발생과정에 있어서의 세포증식, 생존 및 분화를 제어하는 헤파린결합성 단백질이다(Tomomura,M,et al.:J.Biol.Chem.,265:10765-10770;Li,Y. et al.:Science 250:1690-1694,1990;Rauvala,H.:EMBO J.,8:2933-2941,1989; Wellstein,A.et al.:J.Biol.Chem.,267:2582-2587,1992). 성숙 MK 및 PTN은, 염기성 아미노산과 시스테인이 풍부한, 각각 123 및 136 아미노산으로 된 단백질로, 약 50%의 상동성을 가지고(Tomomura,M.et al.:J.Biol.Chem.,265:10765-10770;Kuo,M.et al;J.Biol.Chem.,265:18749-18752;Tsutsui,J.et al:Biochem.Biophys.Res.Commun., 176:792-797,1991), MK패밀리를 형성한다(Muramatsu,T.:Dev.Growth Differ.,36:1-8,1994).

그런데, 항암제가 세포를 죽일 때, 그 형태가 세포자멸사라고 하는 것이 보고되어 있다(Gunji, H.et al.:Cancer Res.,51:741-743,1991:Kaufmann, S.H.: Cancer Res.,49: 5870-5878,1989). 또한, 방사선 ·자외선이 세포자멸사를 유발하는 것이 알려져 있다(Miura, M., Yamada, T.eds.:실험의학별책 “용어라이브러리 세포자멸사”, 1996). 또한, 허혈에 의해 생기는 뇌세포의 지연신경세포사가, 세포자멸사에 의한 것이라는 사실이 나타내어져 있다(J.Neurosci.,19:4200-4210,1999).

이와 같은 배경을 근거로, 본 발명을 이하의 도 및 표에 근거하여 설명한다. 도1은, 항암제로 처리하여, 세포자멸사를 유도한 배양세포에 대해, MTT법에 의한 생세포수를 측정한 것이지만, MK+항암제처리군에 있어서는, 항암제만 처리한 군에 비해, MK의 농도의존적으로 생세포수가 증가하고 있는 것이 인정된다. 또한, 도2는, 마찬가지로 항암제로 처리하여, 세포자멸사를 유도한 배양세포에 대해,훽스트(Hoechst) 33342에 의한 염색결과를 나타내는 것이지만, 항암제만 처리한 군에서는, B(12시간 배양) 및 E(24시간 배양)에 나타내는 바와 같이, 명확하게 세포자멸사 특유의 염색질(chromatin)의 응집, 세포자멸사 소체의 형성이 인정되는데 비해, MK+항암제처리군에서는, C(12시간 배양) 및 F(24시간 배양)에 나타내는 바와 같이, 이들의 현상을 억제하고 있는 것이 인정된다. 또한, 도3은, 이들을 수치화한 것인데, MK+항암제처리군에 있어서는, 항암제만 처리한 군에 비해, MK의 농도의존적으로, 세포자멸사 세포사의 비율이, 줄어들어 있는 것이 인정된다.

그런데, 주화된 배양세포의 세포자멸사는, 세포증식의 경우와 마찬가지로, 세포주기의 제어를 받고 있다. 세포주기의 DNA 함량은, G1기에서 DNA 함량이 가장 적고(2C), G2기에서는, 그 2배(4C)의 DNA 함량을 갖는다. S기에서는, DNA 합성의 정도에 따라, 2C와 4C 사이에 분포한다. M기에서는, 분열했을 때에 4C에서 2C로 변화된다. 따라서, DNA에 결합하는 형광색소(요오드화프로피디움이나 에티디움브로마이드 등)로 핵을 염색하고, 플로사이트메트리(FACS)로 형광강도를 측정하여 세포의 DNA 함량을 구함으로써, 세포주기중의 세포분포를 알 수 있다. DNA 염색에 앞서, 70% 에탄올 고정에 의해, 단편화를 일으킨 저분자 DNA가 세포내에서 누출되어, G1기의 세포 보다 DNA 함량이 적은 세포자멸사 세포가 검출된다. 본 발명에서는, 살아남은 세포의 DNA 함량을 측정하여, G1기, S기 및 S/M기의 세포분포를 구하고 있다. MK의 존재하, 또는 비존재하에, 신경세포에 자외선을 조사한 후, DNA 결합성 형광색소로 세포를 염색하고, FACS로 DNA 함량을 측정하여, 세포주기를 해석하면, 표1에 나타내는 바와 같이, MK 존재하에서는, G1기의 세포비율이, 대조군에 대해약 10배 가까이 증가하고 있는데 비해, S기의 세포비율은, 반대로 1/8∼1/4로 감소하고 있다. 이런 사실로부터, MK는 자외선이나 방사선조사에 의한 세포의 세포자멸사 유도를 억제하는 작용을 갖는 것으로 생각된다.

더욱이 또한, MK가 약물성 신장장해나 간장장해를 경감하는 작용을 갖는(국제출원번호:PCT/JP98/01050) 것으로부터, 신뇨세관세포의 세포자멸사를 MK가 억제하고 있는 것은 아닌가 생각하고, 이하의 검토를 행했다. 세포자멸사를 일으킨 세포의 특징 중 하나로서 들 수 있는 것이 염색질 DNA의 뉴클레오좀단위(185bp)에서의 단편화이다. 이 단편화 DNA량을 조직화학적으로 검출하는 방법으로서, TUNEL법(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling)이 사용되고 있다. TUNEL법의 원리는, DNA의 3'-OH 말단을, biotin-dUTP를 사용하여 표지함으로써 판정할 수 있다.

따라서, MK 녹아웃 마우스(knockout mouse)에 대해, 항암제를 투여하고, 장해가 강했던 대표적인 마우스 신장의 파라핀조각에 대해, TUNEL법(In situ Apoptosis Detection Kit; TaKaRa)에 의해, DNA 단편화를 검출했다. 도5에 나타내는 바와 같이, 생리식염수 투여군에서는, 몇개의 핵이 TUNEL반응 양성인데 비해, MK 투여군에서는, TUNEL반응 양성을 나타내는 핵이 현저하게 감소하고 있다. 참고의 무처리 정상 마우스군에서는, TUNEL반응 양성을 나타내는 핵은 전혀 인정되지 않는다. 이들 사실로부터, MK는 항암제에 의한 신뇨세관세포의 세포자멸사를 억제하는 것으로 생각된다.

이와 같이, MK 존재하에서의, in vitro 및 in vivo 에 있어서의 세포자멸사유도실험의 결과로부터, MK는, 여러 가지 자극에 의한 세포자멸사 세포사를 억제하는 작용을 갖는 것이, 본 발명에 의해, 처음으로 명확해졌다. 이러한 사실로부터, MK패밀리를 형성하는 PTN이, 동일한 세포자멸사 억제작용을 갖을 것이라고 하는 것은, 당업자라면 용이하게 추측할 수 있고, 그것을 확립한 세포자멸사 실험법에 의해 추인하는 것이 가능하다. 또한, PTN도 본원 발명에 포함된다.

본 발명은 세포자멸사의 개선 및 억제에 유용한 약제를 제공한다. 세포자멸사를 억제하던가, 또는 지연시키는데 충분한 치료적 유효량의 MK패밀리단백질을 투여하는 것을 포함한다. 세포자멸사 억제의 in vivo에서의 징후는, 정상적인 혈액순환 감소에 의해 초래되는 일과성 허혈, 또는 재관류장해 후의 심근층, 뇌 및 신장에 있어서의 세포자멸사 세포사의 억제를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 세포자멸사가, 관상 동맥폐색에 의한 관류손상(perfusion damage):척수/두부외상 및 그에 동반되는 중도의 마비:및 동상과 같은 다른 상해에 의한 관류손상의 원인인 것이 현재 명확해져 있다. MK패밀리는, 이들 세포자멸사 관련 처치에 특히 유효하다. MK패밀리는, 또한, 슈퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD), 또는 항산화제에 의해 치료가능한 것으로 생각되었던 적응증 치료에 적합하다. 관상동맥폐색에 계속되는 허혈성 세포성 손상은, 급성 심근경색(AMI)으로 될 수 있다. AMI는, 색전, 혈전, 또는 육안적 영역의 소상(focal) 괴사의 출현으로 이어지는 것이 알려져 있다. 그리고 결과적으로, 저혈압에 의한 산소가 풍부한 혈액공급의 갑작스런 부전에 의해, 심장, 뇌, 비장, 신장, 장, 폐 및 정소가 이환(罹患)하는 것으로 생각되고 있다. 최근까지, 경색에 관련된 세포사는, 직접적으로 허혈에 의한 것으로 생각되어 왔다. 현재는, 세포자멸사는, 허혈영역의 조직 및 산소가 풍부한 혈액의 그 영역으로의 관류에 의해 일어나는 것이 발견되고 있다. 이것에 대해 도8, 9에서 나타내는 바와 같이 일과성 전뇌허혈모델 마우스에 있어서, 해마영역의 세포자멸사가, MK 투여에 의해 억제되는 것을 알 수 있었다. 또한, 도12에서 나타내는 바와 같이 허혈모델 마우스에 있어서, 세포자멸사에 의한 해마영역의 지연신경세포사가, MK 투여에 의해 억제되는 것이 나타내어졌다. 이 사실로부터, 허혈스트레스에 의한 세포자멸사에 대해서도, MK패밀리에 속하는 단백질은, 억제하는 효과가 있는 것으로 생각된다.

또한, 도16에서 나타내는 바와 같이 허혈모델 마우스를 사용한 실험으로부터, 허혈 후에 MK를 투여한 경우에도, 세포자멸사에 대한 억제효과가 보였다. 이 사실은 MK패밀리에 속하는 단백질이, 세포자멸사에 기인하는 여러 가지 질환을 치료하는 약제가 될 수 있는 가능성을 나타내는 것이다.

MK는, 몽고쥐(monglian gerbils)의 일과성 전뇌허혈 후의 해마 지발성 세포사를 개선하는 사실이 발견되었다. NGF 및 bFGF는, 이 시스템에 있어서의 지발성 신경세포사를 개선하는 것이 명백해져 있다(Shigeno, T. et al.: J. Neurosci,. 11: 2914-2919,1991: Nakata, N. et al.: Brain Res.,605: 354-356,1993). 뇌실내 주입시의, 보호에 필요한 NGF의 투여량은, 10㎍이고(Shigeno, T. et al.: J. Neurosci,. 11: 2914-2919,1991), bFGF의 경우는, 삼투압 미니펌프(osmotic minipump)에 의한 지속주입이 필요했다(Nakata, N. et al.: Brain Res.,605: 354-356,1993). 이렇게 하여, 이 방법으로 측정된 MK의, in vivo에 있어서의 신경영양인자활성은 현저하다.

또한, NGF의 투여는, 허혈상해 후 7일이 지난 지발성 신경세포사로부터 해마신경세포를 구하는데 효과가 있지만, 상해 후 28일이 지난시에는 그 효과는 없다(Ishimura, H.et al.: Brain Res.,789: 194-200,1998). 본 발명자들은, MK가 28일째에서도 유의한 활성을 나타내는 것을 명백하게 했다. 더욱 중요한 것은, 허혈상해 후에 투여한 MK는, 또한, 신경세포의 생존을 조장한 사실이다.

MK가, in vivo에서 신경세포사를 막는 강한 활성이 있는 것이 명백해짐으로써, MK를 뇌경색이나 신경변성질환시의 신경세포사를 막기 위한 치료약으로서 사용할 수 있는 것을 나타내는 것이다. MK 단백질이 염기성 성질인 사실로부터, 혈액뇌관문을 어느 정도는 통과할 수 있을지도 모른다. 또한, 배신경세포의 생존촉진에, MK와 NGF의 공동작용적 효과(synergystic effects)가 관찰되고 있는(Michikawa, M. et al.: J. Neurosci. Res.,35: 530-539,1993) 사실로부터, MK와 그 밖의 신경영양인자와의 동시투여가 고려된다.

따라서, MK패밀리에 속하는 단백질은, 급성 허혈 개시시, 산소가 풍부한 혈액의 순환중, 또는, 그 직후에 투여되는 경우에도 효과적이다. 또한 MK는, 도6의 웨스턴흡입법(western blotting)에 나타내는 바와 같이, 배양세포의 Bcl-2의 발현을 증강시킨다. 이 증강작용은, 항암제로 상기 세포를 처리한 경우에도, 동일하게 발휘된다.

bcl-2유전자는, 1984년에 츠지모토들에 의해 클로닝된 이래(Tsujimoto.Y.et al.: Science, 226; 1097-1099,1984), 현재까지 세포자멸사 제어기구의 연구에 있어서, 가장 활발히 해석되고 있는 유전자 중 하나이다. 최근, two-hybrid법 등을 사용하여, Bcl-2 코딩영역의 상동성으로부터, 그 패밀리를 구성하는 몇개의 분자가 발견되어, 이들 분자와의 결합과, 분자간 상호작용에 의한 세포자멸사 제어기구에 초점이 좁혀져 왔다. 이들 패밀리분자의 동정에 의해, Bcl-2에 의한 세포자멸사 제어기구는, 점점더 복잡한 양상을 띠어 오고 있어, 각 분자 상호의 회합상태와 양적 균형을 고찰하지 않으면 안 된다고 하는 것이 현상이다.

세포자멸사는, p53 암억제유전자, c-myc, ras 등의 암유전자, 항암제, 자외선이나 방사선, Fas 리간드를 대표로 하는, 어느 한 종의 사이토카인 등, 여러 가지 자극에 의해 유도되지만, 대부분의 유도시그널은, 최종적으로 세포자멸사 실행인자 카스파제(caspase)와 세포자멸사 억제인자 Bcl-2(Vaux, D.L.et al.:Nature, 335:440-442, 1988)패밀리에 의해 제어되고 있는 공통경로로 흘러 들어간다.

이와 같은 배경에 있어서, 본 발명은 예를 들면, 세포자멸사 세포사를 일으키는 질환 및 병변에 의해 영향받는 세포에 있어서, Bcl-2를 증강하기 위해 사용될 수 있는 약제, 또는 치료에 대한 상기 세포의 감수성을 증강시키기 위해, 악성 또는 바이러스 감염세포에 있어서의 Bcl-2활성을 감소시키기 위해 사용하는 약제를 제공한다.

본 발명은 Bcl-2의 세포자멸사 억제활성을 이용한다. 대부분의 다양한 질환에 공통적인 생리적 메커니즘을 표적으로 하는 것은, 특정 질환의 각각에 대한 다른 약제를 개발할 필요가 없다고 하는 점에서 효율적이고 비용면에서도 유효하다.

본 발명의 실시예에 있어서 사용하는 MK 또는 PTN은, 천연, 화학합성, 유전자재조합 등의 어느 유래이더라도 좋다. 또한, MK 또는 PTN의 정확한 아미노산서열의 사용에 한정되지 않는다. MK 또는 PTN의 생물학적 기능을 파괴하지 않고, 이들 단백질의 한정개변을 행하는 것이 가능하다. 생물학적 활성이 유사한, MK 또는 PTN 유전자의 수식, 예를 들면, 결실, 삽입, 또는 배열중 치환이 생각된다. 예를 들면, 특정 부위에 있어서, 화학적으로 동등한 아미노산을 생산하는 유전자배열중 변경이 생각된다. 이러한 변경을 하는 경우, 아미노산잔기의 상대적 유사성, 예를 들면, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 토대로 한다. 이들의 여러 가지 특성을 고려한 바람직한 치환은, 당업자에 주지인 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지는 않는다. 글리신/알라닌;발린/이소류신/류신:아스파라긴/글루타민:아스파라긴산/글루타민산;세린/트레오닌;리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신.

또한, MK 또는 PTN의 완전단백질의 하나 이상의 기능을 유지하는 단편도 본 발명에 포함된다. 예를 들면, MK의 C말단의 반, 60위-121위(C-half 60-121), 또는 C-half 62-104(Muramatsu, H.:et al.:Biochem.Biophys.Res.Commun.203:1131-1139,1994)에는, 신경돌기신장능을 갖고，헤파린결합부위도 이 부분에 존재하기 때문에, 이러한 폴리펩티드부분을 본 발명에 사용해 보는 것은, 당업자의 기술범위이다. 즉, 본 발명에 있어서의 단백질에는, 폴리펩티드도 포함된다.

또한, MK 또는 PTN의 생물학적 또는 기능적 등가물은, 부위특이적 변이유발을 사용하여 제작할 수 있다.

또한, 숙주중에서, 클론화된 MK 또는 PTN 유전자를 발현시켜 얻어지는 단백질에 대해서, 수식의 성질 및 정도의 대부분은, 숙주세포에서의 번역 후 수식능 및단백질의 아미노산서열에 존재하는 수식시그널에 의해, 결정되는 것으로 생각된다. 예를 들면, 잘 알려져 있는 바와 같이, 당부가반응(glycosylation)은, E.coli과 같은 세균숙주에서는 일어나지 않는다. 따라서, 당부가반응이 바람직한 경우에는, 일반적으로는, 진핵세포중에서 발현된다. 효모나 곤충세포는, 종종, 포유동물과 동일한 번역 후 당부가반응을 행한다. 본 발명에 사용하는 MK 또는 PTN은, 이들의 수식을 포함한다.

MK나 PTN과 같은 단백질은, 경구투여된 경우, 소화관내의 프로테아제에 의해, 매우 빠르게 분해되는 경우가 많기 때문에, 체내안정성을 부여하기 위해, 수용성 고분자, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜이나 폴리비닐피롤리돈 등을 결합시켜, 하이브리드화 MK, 또는 하이브리드화 PTN으로 할 수 있다. 이와 같은 예로서, IL-6이나 TNF-α 등의 하이브리드화가 시도되고, 최적의 혼성 조건을 선택함으로써, 작용의 증강이 얻어지는 사실이 명백해져 있다(Tsutsumi, Y. et al.: Br. J. Cancer.,74: 1090-1O95; Tsutsumi, Y. et al.:J.Control Release, 33; 447-451,1995).

본 발명의 세포자멸사 관련질환의 치료 또는 예방제의 적용이 되는 질환은, 세포자멸사에 관련되는 질환이라면, 특별히 한정되는 것은 아니다.

예를 들면, 급성 사구체신장염, 만성 사구체신장염, 당뇨병성 신장염, 사구체경화증, 낭창 등으로 분류되는 사구체신장염, 신아세포종, 중독이나 허혈에 의한 뇨세관장해, AIDS, 면역억제제나 항암제 투여에 의한 흉선세포의 장해, 말초T세포의 감소, 면역부전증 등의 면역관련질환, 혈관협착, 허혈 등의 순환기질환; 약제나바이러스 감염에 의한 간장해 등의 간장질환; 소화기질환; 뇌허혈에 의한 신경세포의 장해, 근위축성 측색경화증, 알쯔하이머병, 헌팅톤무도병(Huntington's chorea)이나 파킨슨병 등의 신경세포의 변성 질환, 신경세포 발달성 질환(정신병) 등의 신경질환; 장기이식이나 조직이식에 동반되는 거절반응; 세균독소, 식물독소나 동물독소에 의한 장해; 위축성 탈모증: 형태이상: 조직형성부전; 조직의 위축 등을 그 적용범위로 할 수 있다. 또한, 여기에 든 질환명은 예시이며, 세포자멸사가 관련되는 질환인 한, 이러한 예시질환에 본 발명의 세포자멸사 관련질환 치료제의 적용범위가 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 세포자멸사 관련질환 치료제는, 치료목적 뿐 아니라, 이들 질환의 예방목적으로도 사용할 수 있다.

유효농도 및 투여방법은, 경험적으로 도출할 수 있지만, 하루 약 1㎍∼10Omg/kg을, 1회 또는 여러차례로 나눠 투여하는 것이 고려된다. 이와 같이 하여 도출된 것은, 당업자의 기술범위내이다. 예를 들면, 환자의 성, 연령, 체중, 병의 용태 등에 따라 다르다. MK의 치료유효량이, 생리식염수, 또는 인산완충 생리식염수(PBS) 등에 현탁되어 환자에게 정맥투여된다. 다른 투여방법으로서, 경구, 피하, 근육, 점막, 복강, 또는 심근경색에 관련되는 세포사를 치료하기 위해 심장내와 같은 특정 기관으로의 직접투여 등이 포함되지만 이들에 한정되지는 않는다.

이하에 본 발명의 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] MK의 제작

(1) 실시예 2∼7(l)에 사용한 MK는, 특개평9-95454 공개공보의 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제작했다(서열번호:3).

(2) 실시예 7(2)∼8에 사용한 MK는, 이하의 방법으로 제작했다.

인간 MK 단백질을 생성하기 위해, 인간 MK의 오픈리딩프레임을 포함하는 cDNA 단편(누클레오티드번호 1-432, J.Tsutsui et al.Biochem.Biophys.Res.Commun. Vol.176,792-797,1991)을, 효모발현벡터 pPIC9(Invitrogen)에 삽입했다. 이 재조합 플라스미드를 효모(Pichia pasrotis GS115; Research Corporation Technologies)으로 트랜스펙션하여, 히스티딘(histidine) 및 G418에서 선택했다. 효모에 의해 배양액으로 분비된 인간 MK 단백질을, 이하의 컬럼크로마토그래피를 순서대로 행하여 정제했다.

1. SP Steamlines(Pharmacia; 20mM pH5.5 초산 완충제로 흡착 및 세정, NaCl을 포함하는 20mM pH3.5 초산 완충제로 용출)

2. Sulfated Cellulofine(Seikagaku Kogyo, Japan; 10mM pH7.2 인산 완충제로 흡착, 0.7M NaCl을 포함하는 완충제로 세정, 2.0M NaCl을 포함하는 완충제로 용출)

3. Superdex 75pg(Pharmacia; 생리식염수로 겔여과)

4. Poly Sulfoethyl A(Poly LC Co.; 0.6M NaCl을 포함하는 20mM 완충제로 흡착, 0.88M NaCl을 포함하는 완충제로 세정, 2M NaCl을 포함하는 완충제로 용출)

5. Superdex 75pg(Pharmacia; 생리식염수로 겔여과) MK 조제액을 생리식염수에 대해 투석하고, 정제한 단백질을 O.1mL씩 분주하여, -8O℃에서 보존했다. 단백질은 해동 후 곧바로 사용하여, 재동결 및 재해동을 피했다. 각 MK 단백질 정제물 활성의 유무는, 배성 뉴런에 대한 MK의 생존촉진활성(M.Michikawa et al. J. Neurosci. Rcs. Vol.35,530-539,1993)을 지표로 했다.

[실시예 2] 항암제 유도 세포자멸사에 대한 억제효과(MTT법)

소아 신장암인 윌름즈종양(Wilms' tumor)유래 주화세포 G401에 대해, 항암제에 의해 세포자멸사를 유도하여, MK의 세포자멸사 억제효과를 MTT법으로 조사했다.

무처리군, 시스플라틴(100μM)만 처리한 군 및 MK(1, 10, 또는 100ng/mL)+시스플라틴처리(100μM)군의 5군을 설정했다.

G401세포를, 10%의 소태아혈청(FBS)을 포함하는 달벡크개변 이글배지(10% FBS/DMEM)에 현탁하여, 96공 플레이트에, 5000개/웰 분주했다. CO₂인큐베이터(37℃, 5% CO₂; 이하 동일)속에서 배양하여, 세포를 플레이트에 접착시켰다.

세포를 0.1% FBS를 포함하는 DMEM(0.1% FBS/DMEM)으로 2회 세정한 후(이하 특별한 말이 없는 한, 0.1% FBS/DMEM을 세포의 세정에 사용한다), 0.1% FBS/DMEM에서 하룻밤 배양했다. 배양 후, MK 처리군에는, 1, 10, 또는 100ng/mL의 농도가 되도록 가했다. 각 군을 6시간 배양했다. 배양 후, 시스플라틴처리군에는, 0.5mg/mL의 시스플라틴(Bristol-myers Squib Company; Tokyo)을 6μL(100μM) 가했다. 각 군을 0.1% FBS/DMEM에서 2시간 배양했다. 배양 후, 세포를 3회 세정했다. 이어서, MK 처리군에는, MK를 1, 10, 또는 100ng/mL의 농도가 되도록 가했다. 각 군을 0.1% FBS/DMEM에서, 12, 또는 24시간 배양했다.

5mg/mL의 MTT시약(Wako Pure Chemical Laboratories; Osaka)을 상기 5군의 각 웰에 15μL씩 가하여 4시간 배양했다. 배양 후, 20% SDS를 포함하는 10mM 염산 100μL를 각 웰에 가하여 실온에서 24시간 놓아두었다. 마이크로평판 판독기(microplate reader)를 사용하여, 각 웰의 흡광도(OD_540-655)를 측정했다. 결과를 도1에 나타낸다.

12시간 배양한 군에 있어서는, 시스플라틴만 처리한 군에 비해, MK(1, 10, 또는 100ng/mL)+시스플라틴처리(100μM)군에서는, MK의 농도의존성에 생세포수가 많은 것이 관찰된다. 즉, MK는 항암제에 의한 세포사를 억제하는 작용을 갖는 것이명확하다.

[실시예 3] 항암제 유도 세포자멸사에 대한 억제효과(훽스트 염색법)

무처리군, 시스플라틴(100μM)만 처리한 군, MK(1, 10, 또는 100ng/mL)+시스플라틴처리(100μM)군의 5군을 설정했다.

2×10⁴개의 G401세포를 3.5cm 접시에 뿌려, 10% FBS/DMEM에서 하룻밤 배양했다. 각 접시에 10% FBS/DMEM을 첨가하여, 24∼48시간 더 배양했다. 세포를 2회 세정한 후, 0.1% FBS/DMEM에서 하룻밤 배양했다. 그 후, MK 처리군에는, MK를 1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL의 농도가 되도록 가했다. 0.1% FBS/DMEM에서 6시간 배양했다. 배양 후, 시스플라틴처리군에는, 각 접시에 농도 100μM이 되도록 시스플라틴을 가했다. 0.1% FBS/DMEM에서 2시간 배양했다. 배양 후, 세포를 3회 세정했다. 이어서, MK 처리군에는, 인간 MK를 1, 10, 또는 100ng/mL의 농도가 되도록 가했다. 0.1% FBS/DMEM에서, 12, 또는 24시간 배양했다.

세포를 메탄올 3, 초산 1 비율의 고정액으로 실온에서 10분간 고정한 후, 실온에서 30분간 건조시켰다. 훽스트 33342(ICN Biomedicals; Ohio, USA)를 가하여, 실온에서 10∼30분간 염색했다. 세포를 물로 3회 세정한 후, 바람으로 건조시켰다. 이어서 올려놓고, 형광현미경(Olympus, BX60)으로 사진촬영했다. 12시간 배양에 있어서의 무처리군을 도2A에, 시스플라틴(100μM)만 처리한 군을 도2B에, MK(100ng/mL)+시스플라틴처리(100μM)군을 도2C에, 또한, 24시간 배양에 있어서의 무처리군을 도2D에, 시스플라틴(100μM)만 처리한 군을 도2E에, MK(100ng/mL)+시스플라틴처리(100μM)군을 도2F에 나타낸다. 훽스트 33342로 염색된 핵중, 염색질의 응축, 핵단편화를 일으킨 핵을 갖는 세포수가, C와 F에서는, B와 E에 비교해볼 때, 현저히 감소해 있는 것이 관찰된다.

또한, 훽스트 33342로 염색된 핵중, 염색질의 응축, 핵단편화를 일으킨 핵을 갖는 세포자멸사 세포사수의, 전체 세포수에 대한 비율을 도3에 나타낸다. 도3으로부터, 시스플라틴(100μM)만 처리한 군의 세포자멸사 세포사의 비율에 비해, MK(1, 10, 또는 100ng/mL의 농도)+ 시스플라틴처리군(100μM)에 있어서는, 12시간, 또는 24시간의 배양시간 양쪽에 있어서, MK의 농도의존성에 세포자멸사 세포사의 비율이 적어져 있어, 12시간의 배양시간이 24시간으로 연장되면, 더욱이, 생세포수가 증가하고 있는 것이 인정된다.

[실시예 4]

세포자멸사 유도 신경세포의 DNA 함량 측정

배양 플라스크를 MK로 코팅하지 않은 것(대조군) 및 MK 100ng/mL, 또는 MK 10㎍/mL에서 각각 코팅한 군을 설정했다.

마우스의 신경모세포종(neuroblastoma) C1300과 교종(glioma)의 혼성화 세포인 NG108 주화세포(Nelson,P.G.et al.:Brain Res.,147:245,1978)를, 10% FBS/DMEM을 포함하는 FALCON 3110 세포배양 플라스크(75㎠, BECTON DICKINSON)중에서, 거의 컨플루언트(confluent)될 때까지 배양했다. 배양 후, 세포에 자외선을 수시간 연속조사(UV선 양으로서, 60∼100J/㎡)하여 세포자멸사를 유도했다.

세포를 원심(4℃, 1000회전, 10분간)하여 모으고, 10∼12mL의 샘플완충제[1g 글루코오스/1L PBS(_-);0.22㎛의 필터를 통과시킨 것]로 2회 세정했다. 세포를 샘플 완충제로 1∼3×10⁶/mL로 제조하고, 그 1mL를 원심튜브(FALCON; 15×75mm)에 취해, 원심(4℃, 1000회전, 10분간)했다. 상청을 버리고, 10초간 와류(vortex)에 걸어, 심하게 진탕했다. 천천히 와류에 더 걸면서, 빙냉 70% 에탄올 1mL를 한방울씩 가한 후, 4℃에서 하룻밤 고정했다.

하룻밤 고정한 세포를 짧게 와류에 건 후, 원심(3000회전, 5분간)했다. 상청의 70% 에탄올을 0.2mL 이하가 되도록 제거했다. 세포가 들어간 원심튜브를 천천히 와류에 걸어, 요오드화프로피디움(PI)염색액 1mL를 가했다. PI염색액의 조성은, 20배 PI용액 0.5mL, 100배 RNase A용액 0.1mL, 샘플 완충제 10mL이다. 여기서, PI의 20배용액은, PI(SIGMA) 1mg/mL 수용액을 제작하여, 0.22㎛의 필터를 통과시키고, 차광하여 4℃에 보존한 것이고, 100배의 RNase A용액은, RIBONUCLEASE A(Type I-A)(SIGMA)(10000U/mL)를 125mg/mL(80U/mg)로 제조한 것이다.

가볍게 진탕하면서, 실온에서 30분 이상 인큐베이트한 후, 흘림세포계측법(flow cytometry)에 의해 측정했다. 결과를 표1에 나타낸다. MK 존재하에서는, G1기의 세포비율이, 대조군에 대해 약 10배 가까이 증가하고 있는데 비해, S기의 세포비율은, 반대로, 1/8∼1/4로 감소하고 있다. 이 사실로부터, MK는 자외선이나 방사선조사에 의한 세포의 세포자멸사 유도를 억제하는 작용을 갖는 것으로 생각된다.

각 세포주기의 세포비율(%)

대조군 MK MK100ng/mL 10㎍/mL

G1 7 75 67S 84 19 9G2/M 9 5 24

합계 100 100 100

[실시예 5] 신뇨세관세포의 세포자멸사 억제효과

MK 유전자의 엑손2의 일부와 3의 일부를 파괴한 129/Sv계 MK 녹아웃 마우스(Heterozygote)(생화학 7, 1996년 ·제68권, pp.1239, 4-P-1244)(수컷, 8∼12주령)를, 생리식염수 투여군과 MK 투여군의 2군(각 군 14마리씩)에 나누었다. 또한, 대조군으로서 무처리의 야생형 마우스군(4마리)을 준비했다. MK의 투여량은, 200㎍/kg으로 하고, 생리식염수의 투여량은, 10mL/kg으로 했다.

MK, 또는 생리식염수를, 오전중에, 2군의 각 마우스에 대해, 복강내 투여했다. 오후, 시스플라틴 9.3mg/kg을 2군의 마우스에 대해, 복강내 투여했다(이날을 Day 0으로 한다).

Day 1 오전에, 2군의 각 마우스의 복강내에, MK, 또는 생리식염수를 Day O과 동일하게 투여했다.

Day 2에, 무처리 야생형 마우스군으로부터 4마리, 2군의 마우스로부터, 1군 4마리씩을 꺼내, 뇨의 채취 및 전채혈을 행했다. 전채혈한 혈액은 37℃, 1시간 혈병퇴축조작(血餠退縮操作)을 행한 후, 원심(4℃, 8000회전, 10분간)하여 혈청을 분리했다. 혈청은 시험까지 -20℃로 보존했다. 또한, 각 마우스의 신장을 꺼내, 완충제포르말린으로 고정(2∼4일간)한 후, 전자동포매기(SAKURA, ETP-120A)를 사용하여 파라핀포매했다. 파라핀포매한 신장은, 마이크로톰(ERMA OPTlCAL WORKS.LTD, No.1061)을 사용하여 4㎛ 조각으로 얇게 잘랐다. 나머지 2군의 각 마우스에는, Day 1과 동일하게, 복강내에 MK, 또는 생리식염수를 투여했다.

Day 3에, 2군의 마우스로부터, 1군 6마리씩을 꺼내, Day 2와 동일하게, 뇨의 채취 및 전채혈을 행하고, 더욱이, 각 마우스의 신장을 꺼내, 파라핀포매했다. 나머지 2군의 마우스에는, Day 2와 동일하게, 복강내에 MK, 또는 생리식염수를 투여했다.

마지막 Day 4에, 나머지 2군의 마우스 각 4마리에 대해, 뇨의 채취 및 전채혈을 행하고, 더욱이, 각 마우스의 신장을 꺼내, 파라핀포매했다.

혈청에 대해서는, 신장기능장해의 지표로서, 일상의 진료에 다용되고 있는 혈청요소질소(BUN) 및 혈청크레아티닌의 측정, 뇨에 대해서는, 뇨중 단백질의 간이정량을 행했다. 또한, 신장의 파라핀조각에 대해서는, 헤마톡시린-에오신(HE)염색을 행했다(도4). MK 투여군에, 시스플라틴에 의한 신장기능 장해를 경감시키는 효과가 인정되었다. 따라서, MK가 신뇨세관세포의 세포자멸사를 억제하고 있는 것은 아닌가 생각하고, 이하의 검토를 행했다.

Day 4에 있어서의 장해가 강했던 대표적인 마우스의 신장 파라핀조각에 대해서, TUNEL법(In situ Apoptosis Detection Kit; TaKaRa)에 의해, DNA 단편화를 해석했다. 결과를 도5에 나타낸다. 생리식염수 투여군에서는, 몇개의 핵이 TUNEL반응양성인데 비해, MK 투여군에서는, TUNEL반응 양성을 나타내는 핵이 현저하게 감소해 있다. 무처리 야생형 군에서는, TUNEL반응 양성을 나타내는 핵은 전혀 인정되지 않는다. 이상의 결과로부터, MK는 시스플라틴에 의한 신뇨세관세포의 세포자멸사를 억제하고 있는 것으로 생각된다.

[실시예 6] Bcl-2의 발현증강효과

bcl-2 유전자의 발현에 대한 MK의 영향을 조사했다. 무처리군, 시스플라틴(100μM)만 처리한 군, 인간 MK(100ng/mL)만 처리한 군, 인간 MK(l00ng/mL)+시스플라틴(100μM)처리군, 마우스 MK(100ng/mL)만 처리한 군, 마우스 MK(l00ng/mL)+시스플라틴(100μM)처리군의 6군을 설정했다.

G401세포를 3.5cm 접시에 뿌려, 10% FBS/DMEM에서 거의 컨플루언트 될 때까지 배양했다. 세포를 2회 세정한 후, 0.1% FBS/DMEM에서 하룻밤 배양했다. 배양 후, MK 처리군에는, MK 또는 마우스 MK(특개평8-196293)를, 100ng/mL의 농도로 첨가했다. 6시간 배양했다. 다음에, 시스플라틴처리군에 대해, 시스플라틴을 농도 100μM이 되 도록 첨가했다. 2시간 배양했다. 배양 후, 0.1% FBS/DMEM에서 3회, 세포를 세정한 후, 0.1% FBS/DMEM에서 10시간 배양했다. 배양종료 후, PBS에서 세포를 3회 세정했다.

200μL의 완충제(1% TritonX-100,150mM NaCl, 10mM Tris(pH7.4),1.0mM EGTA, 0.5% NP-40, 1mM PMSF, 0.1㎍/mL apiotinin, 40nM lewpeptin)를 각 접시에 가한 후, 얼음 위에 20분간 놓아두었다. 스크래퍼(scraper)로 각 접시의 세포를 벗겨, 26게이지의 바늘로 8∼10회 주사한 후, 각 접시의 세포를 원심튜브에 옮겨, 4℃로12000회전, 30분간 원심했다. 원심 후, 침강물의 단백질 정량을 행했다(BCA kit; PIERCE). 각 접시로부터 제조한 침강물 50㎍에 대해, 항Bcl-2 모노클로날항체(500배)(Dako; Denmark) 및 항마우스 HRP항체(Jackson Immuno Research)를 사용하여, 웨스턴흡입법 해석했다(도6). 각 레인의 밴드를 수치화 했다(도7).

도6 및 도7로부터, 인간 MK 및 마우스 MK는, 배양세포에서의 Bcl-2의 발현을 증강하는 것이 관찰된다. 이 증강작용은, 항암제로 상기 세포에 처리한 경우에도, 동일한 정도로 발휘된다(도7). 그 증강작용을 나타내는 농도는, 상기 세포의 경우는, 약 1Ong/mL 이상이라고 생각된다(데이터는 나타내지 않는다).

[실시예 7] in vivo에 있어서의 세포자멸사 억제효과(허혈상해전 투여)

(1) 1군 6∼16마리의 수컷 몽고쥐(6∼8주령, 체중 60∼80g)를, 플루오탄(Fluothane)전용 마취약 송부장치「HONEY MATIC M-3」(기무라의과기계주식회사)에 넣어, 흡입마취제「플루오탄」(일본약국방할로탄)을 용기내에 적절히 충만시켜, 마취를 행했다. 몽고쥐는, 주입기 고정장치 부착 수술대(NARISHIGE SCIENTIFIC INSTRUMENT LAB.; TYPE SR-5 N, No.97024)에 고정했다. 두부를 정중앙 절개한 후, 브레그마(bregma)의 위치에서 2mm 좌안구측으로 비켜난 곳에 치과용 드릴을 사용하여 주사기가 들어갈만한 적당한 구멍을 뚫었다. 이 구멍으로 MK 0.25mg/mL, 0.5mg/mL, 또는 1mg/mL 용액(생리식염수용액)을, 마이크로주사기(HAMILTON MICROLITER # 701)를 사용하여, 2μL씩(0.5㎍, 1.0㎍, 2.0㎍) 뇌실내에 주입했다. 대조군으로서, 생리식염수만 주입한 군 및 가짜수술군(Sham-op군)을 설치했다. 뇌실내에 주입 후 4분간 방치하고, 그 후 수술부를 봉합했다. 계속해서 흉부를 정중앙으로 절개하여, 좌우의 총경동맥을 노출시켜, 스기타뇌동맥혹클립(standard type; MlZUH0) 2개씩 양측의 총경동맥을 결찰하여 혈류를 5분간 차단한 후, 혈류를 재개했다. 허혈부하중은 뇌온, 체온을 일정(37±0.2℃)하게 유지했다. 개체식별을 행해, 마취가 풀린 후, 사육장에 되돌리고, 자유급수, 자유섭식하에서 사육했다. 일주일 후에 0.2%의 비율로 헤파린(노보 ·헤파린주100; 일본훽스트 ·마리온 ·루셀주식회사)을 포함하는 생리식염수와 4% 파라포름알데히드용액으로 관류고정하여, 단두했다. 두부로부터 가위를 사용하여 뇌를 꺼내었다. 뇌는 4% 파라포름알데히드 고정액중에 하루 방치한 후, 양날면도기(FEATHER)로 브레그마의 전방 2mm에서 후방을 3분할했다. 이들 조각을 24시간 더 고정했다. 등측 해마를 포함하는 조직편을 탈수투철 후, 파라핀포매했다.

이 파라핀블록으로부터 해마의 최첨단에서 0.5∼1.0mm 또는 시상 봉합의 후방 1.4∼1.9mm에 상당하는 두께 5㎛의 조각을 제작하여, TUNEL법(In situ Apoptosis Detection Kit(TaKaRa))으로 관찰했다. 결과를 도8(×25) 및 도9(×100)에 나타낸다. 도8로부터 명백하듯이, 생리식염수 투여군만이, 해마CA1 신경세포영역에 TUNEL반응 양성을 나타내는 핵을 갖는 세포가 다수 관찰된다. 도9는, 역시 생리식염수 투여군에서만, 신경세포에 TUNEL반응 양성의 핵을 갖는 세포가 관찰되고, 또한 위축된 신경세포도 많이 관찰된다. Sham-op군이나 MK 투여군에서는 이러한 신경세포는 관찰되지 않는다. 이들 결과로부터, MK는 신경세포의 허혈스트레스에 의한 세포자멸사로부터 신경세포를 보호하는 것이 분명하다.

(2) 상기(1)에 기재된 방법에 의해, MK 용액(0.063㎍, 0.125㎍, 0.25㎍, 0.5㎍, 1㎍, 또는 2㎍)을, 허혈상해 직전에 뇌실내에 주입하여, 지발성 신경세포사에 대한 보호효과를 조사했다. 허혈장해 7일 후에, CA1영역의 조각을 헤마톡시린-에오신 염색했다. 저배율(×25)에 의한 현미경사진(도10a : 생리식염수, 도10b : Sham-op, 도10c : MK 2㎍, 도10d : MK 1㎍, 도10e : MK 0.5㎍, 도10f : MK 0.25㎍) 및 고배율(×100)에 의한 현미경사진(도11a : 생리식염수, 도11b : Sham-op, 도11c : MK 2㎍, 도11d : MK 1㎍, 도11e : MK 0.5㎍, 도11f : MK 0.25㎍)을 나타낸다. 생리식염수를 투여한 군(도10a), 대조의 Sham-op군(도10b), 여러 가지 농도의 MK를 투여한 군(도10c-f) 사이에서, 형태학적 변화는 보이지 않았다. 생리식염수를 투여한 군에 있어서의 신경세포수는, Sham-op군(도10b), 0.5-2㎍의 MK를 투여한 군(10c-e)과 비교하여 현저하게 감소했다. 고배율에서는, 생리식염수 투여군(11a)에 있어서, 위축한 핵의 쇠퇴가 보였지만, Sham-op군(도11b) 및 0.5-2㎍의 MK 투여군(도11c-e)에서는, 생존한 윤상(輪狀) 핵이 관찰되었다. 0.25㎍의 MK 투여군에서는 쇠퇴한 핵이 보였다(도11f 1.0m MEDTA,).

정량적으로 평가를 하기 위해, CA1의 길이당 CA1영역에 포함되는 생존하는 핵의 수를 측정했다(도12). 값은, 생리식염수 투여군에서는 18±25/mm(n=15, 평균±표준편차), 가짜수술군(Sham-op군)에서는 265±38/mm(n=23)였다. MK를 0.5, 1, 및 2㎍ 투여한 군에서는, 값은 각각 217±109(n=7), 228±84(n=8) 및 243±82(n=10)였다. 저농도의 MK에서는, 값은 감소했다(도12). 생리식염수 투여군과 MK 투여군(0.5-2㎍의 MK)의 값은 통계적으로 유의차가 보였다(ANOVA 및 post-hoc Fisher's PLSD test, p<O.0001).

MK 투여(2㎍)의 효과가 장기간 지속되는지 여부의 시험을 행했다. 신경세포수는, 가짜수술군(Sham-op군)에서는 263±31(n=11)cells/mm, 허혈상해 7일 후에 단두한 생리식염수 투여군에서는 10±10(n=15)이었다. 2㎍의 MK를 재투여하여, 허혈 일주일 후, 2주일 후, 3주일 후 및 4주일 후에 단두한 몽고쥐의 신경세포수는, 이하의 값이었다.

일주일 후: 219±74(n=10)

2주일 후: 152±72(n=5)

3주일 후: 185±83(n=4)

4주일 후: 157±60(n=4)

어느 군에 있어서도, ANOVA 및 post-hoc Fisher's PLSD test(p<0.001)에 의해 비교하면, 생리식염수 투여군 보다 신경세포의 생존율이 현저하게 높은 것을 알 수 있었다. 신경세포수는 일주일 후와 비교하여 2주일 후에서는 감소하고 있지만, 그 후는 4주일 후에도 감소하지 않았다(도13). 따라서, MK는 지연신경세포사를 늦춘다기 보다 오히려 저지하는 효과가 있다고 할 수 있다.

해마CA1영역에서의 지발성 신경세포사는, 세포자멸사에 의한 것이라고 생각되고 있기 때문에, 조각을 TUNEL법에 의해 염색하여 세포자멸사에 의한 DNA의 단편화를 검출했다. 결찰 직전에 MK를 투여하고, 허혈상해 7일 후에 효과를 평가했다. 생리식염수 투여군(도14a)에서는, 강하게 염색된 핵이 많이 보이는데 비해, Sham-op군(도14b)에서는 염색된 핵은 보이지 않았다. MK의 0.5-2.0㎍ 투여군에서는, 염색된 핵은 소수 밖에 보이지 않았다(도14c-e). 정량적 평가는, 전핵수에 대한 세포자멸사 양성반응을 나타내는 핵수를 계측함으로써 행했다(도15). 값은, 생리식염수 투여군에서는 69.7±17.O(n=7), Sham-op군에서는 0.0±0.0(n=8)이었다. MK를 0.5, 1 및 2㎍ 투여한 군에서는, 값은 각각 7.8±19.8(n=7), 11.0±14.7(n=8) 및 4.6±12.2(n=7)였다. 생리식염수 투여군과 MK(0.5-2㎍)투여군의 값에는, 통계적인 유의차가 보였다(ANOVA 및 post-hoc Fisher's PLSD test, p<0.0001). 이상의 결과로부터, MK는 세포자멸사에 의한 지발성 신경세포사를 억제하는 효과가 있는 것이 나타내어졌다.

[실시예 8] in vivo에 있어서의 세포자멸사 억제효과(허혈상해 후 MK 투여)

몽고쥐의 일과성 전뇌허혈모델에 있어서, 허혈상해 후, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간 및 24시간 경과시점에서, MK 2㎍을 뇌실내에 주입했다. 허혈상해 후 7일째에, 생존 해마신경세포수를 세었다. 결과를 도16에서 나타낸다. 2시간 경과시점에서 MK를 투여한 경우, 신경세포수는 Sham-op군과 비교하여 감소했지만, 생리식염수 투여군과 비교하면, 값은 매우 높다. 24시간 후에 MK를 투여한 경우에도, 신경세포의 생존율 상승효과가 보였다(도16).

결찰 후 2, 4, 6, 12 및 24시간 후에 MK를 투여한 군의 해마신경세포수는, 각각 120±36(n=4), 90±23(n=6), 80±13(n=6), 86±34(n=6) 및 93±22(n=4)cells/mm였다(도16). 이들 값은, 생리식염수 투여군에 있어서의 값 보다 유의하게 높다(p<O.O 5).

본 발명에 의해, MK패밀리에 속하는 단백질이, 항암제, 자외선이나 방사선, 허혈스트레스 등, 여러 가지 자극에 의해 유도되는 세포자멸사를, 지연, 또는 억제하는 작용을 갖는 사실이 발견되었다. 이 사실에 의해, 세포자멸사에 기인하는 모든 질환, 예를 들면, 뇌질환, 심질환, 신장질환, 신경질환, 또는 간장질환 등의 치료 및 예방에 대해, MK패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로 하는, 새로운 약제를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.

Claims (9)

1. 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로서 함유하는 세포자멸사 억제제.
2. 제1항에 있어서, 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질이 미드카인(MK)인 세포자멸사 억제제.
3. 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로서 함유하는 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제.
4. 제3항에 있어서, 세포자멸사 관련질환이 심질환인 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제.
5. 제3항에 있어서, 세포자멸사 관련질환이 신장질환인 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제.
6. 제3항에 있어서, 세포자멸사 관련질환이 간질환인 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제.
7. 제3항에 있어서, 세포자멸사 관련질환이 신경변성질환인 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제.
8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질이 미드카인(MK)인 세포자멸사 관련질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제.
9. 미드카인(MK)패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로서 함유하는 Bcl-2 증강제.