CN102946896A - Sox9抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生有关的病症的方法。该方法包括给予哺乳动物钙调蛋白拮抗剂、瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂和钙调蛋白结合肽中的至少一种。

Description

SOX9抑制剂
发明领域
本发明涉及抑制SOX9以治疗一些不良的病理病症，具体而言，本发明涉及已知的和新型的化合物抑制SOX9的用途。
发明背景
脊髓损伤(SCI)是重大医疗保健问题的灾难性事件，其能导致终身残疾。在美国和加拿大，每年有超过12,000例脊髓损伤发生，以及有大约275,000人由于SCI而带着永久的严重残疾生活(Univ.of Alabama Nat.SCIStat.Cntr.和the Cdn.Paraplegic Assoc.)。据估计，神经外伤的影响是安大略省医疗系统单个最昂贵的突发事件之一。目前，对于SCI没有有效的治疗。已将SCI后轴突再生的缺失归因于受损髓鞘和疤痕中的轴突抵制分子。在疤痕的抑制性分子中，主要的分子是由反应性星形胶质细胞响应损伤而产生的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)。然而，星形胶质细胞还被显示分泌有助于轴突生长的ECM分子诸如层粘连蛋白和纤粘连蛋白。因此，星形胶质细胞既产生再生抑制性分子又产生再生促进性分子，并且成功地再生可能依赖于这些分子的平衡。
尽管许多不同的CSPG在SCI后表达(例如，NG2、神经蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、短蛋白聚糖(brevican)和多功能蛋白聚糖(versican))，所有这些CSPG都依赖于相同的酶即木糖基转移酶-I和木糖基转移酶-II(XT-I,XT-II)以及软骨素-4-磺基转移酶(C4ST)将轴突抵制的硫酸软骨素侧链添加至它们的核心蛋白。通过将木糖添加至核心蛋白的丝氨酸部分来启动硫酸软骨素侧链的合成。该功能由酶木糖基转移酶(XT)完成，所述木糖基转移酶以由两个不同基因XT-I和XT-II编码的两个同工型存在。这些侧链随后被软骨素-4-磺基转移酶(C4ST)硫酸化。这些硫酸软骨素侧链在轴突抵制中发挥的重要作用通过以下观测结果强化：通过酶软骨素酶消化这些侧链或者通过抑制XT-I干扰它们的合成增加了啮齿动物SCI模型中的轴突再生。SOX9是反应性星形胶质细胞中上调XT-I、XT-II和C4ST表达，并下调层粘连蛋白和纤粘连蛋白表达的转录因子。
已经确定，对SCI后所有CSPG上发现的硫酸软骨素侧链的酶促消化导致SCI后恢复和再生的改善。另一组利用核酶来促进SCI后感觉轴突的再生，该核酶针对编码CSPG产生所需的酶的mRNA。以下作用也被表明能改善再生：通过将层粘连蛋白γ1经鞘内给药至损伤处来增加受损伤大鼠脊髓中的层粘连蛋白。
XT-I、XT-II和C4ST在SCI后以相似的模式表达：已经证实，具有相关功能的基因在SCI后可以作为基因群被一起调控。这样据推测，在星形胶质细胞中，促进轴突再生的基因以及抑制轴突再生的基因将被差别性调节。通过实时定量PCR(Q-PCR)评价大鼠中SCI后XT-I、XT-II和C4ST群的表达。如通过Q-PCR所检测到的，XT-I、XT-II和C4ST在SCI后都显示了相似的基因表达模式。当利用来自脊髓损伤处的蛋白提取物和识别许多CSPG共有表位的抗体CS56，通过狭缝印迹杂交分析测量时，SCI后XT-I、XT-II和C4ST表达的增加伴随着CSPG水平的增加。Q-PCR还证实了，层粘连蛋白和纤粘连蛋白mRNA水平在SCI后早期而不是晚期提高。
SOX9调节CSPG合成酶和生长促进性细胞外基质蛋白的表达。先前已证实，SOX9是反应性星形胶质细胞中上调XT-I、XT-II和C4ST表达和下调层粘连蛋白和纤粘连蛋白表达的转录因子。原代大鼠星形胶质细胞中CMV-驱动的SOX9表达导致XT-I、XT-II和C4ST而不是层粘连蛋白或纤粘连蛋白mRNA水平的明显增加，同时靶向SOX9的小干扰RNA(siRNA)导致SOX9 mRNA水平下降75±12%，并导致XT-I mRNA下降71±5.5%(在XT-II和C4ST表达中观察到相似的下降)。在未处理的原代星形胶质细胞培养物中，SOX9敲低没有减少层粘连蛋白或纤粘连蛋白的基因表达，反而是增加了这些基因的表达。这些结果证实，SOX9上调XT-I、XT-II和C4ST表达，同时降低层粘连蛋白和纤粘连蛋白的表达。SOX9在与CNS疤痕形成有关的人类疾病的星形胶质细胞中表达。为了评价SOX9在人类CNS损伤和疾病中的潜在作用，调查了人类出血性中风、缺血性中风、外伤性脑损伤和SCI病例中SOX9的表达，并且发现在这些病症中，SOX9在反应性星形胶质细胞中表达。
目前，没有促进CNS损伤或疾病后的再生的疗法或得到认可的策略。治疗脊髓或脑损伤的典型试验性方法包括：限制免疫应答(即细胞免疫疗法诸如Proneuron-PN277)、限制凋亡和细胞毒性级联反应(例如，利用Cethrin、Neotrofin)、或者通过细胞替代(例如，基于干细胞)的再生。前两个策略依赖于治疗必须进行的非常有限的时间窗，将疤痕产生最小化是继发的作用。许多策略几乎专门集中在阻断神经抵制分子(NOGO、MAG)，而不是集中在增加促再生的分子。
因此，鉴于上述，显然需要开发治疗CNS损伤和疾病的有效疗法。
发明概述
目前已发现，抑制SOX9对于治疗与蛋白聚糖产生或调节有关的病症是有效的，并且已经鉴定了用于调节Sox9活性的化合物。
因此，在一方面，提供了治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生或调节有关的病症的方法，其包括给予哺乳动物钙调蛋白拮抗剂。
在本发明的另一方面，提供了治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生或调节有关的病症的方法，其包括给予哺乳动物拮抗钙调蛋白和调节免疫应答的化合物。
在本发明的另一方面，提供了治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生或调节有关的病症的方法，其包括给予哺乳动物钙通道拮抗剂。
在本发明的另外方面，提供了治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生或调节有关的病症的方法，其包括给予哺乳动物瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂。
在本发明的另一方面，提供了治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生或调节有关的病症的方法，其包括给予哺乳动物钙调蛋白结合肽。
本文通过参考下面的附图描述了本发明的这些方面和其他方面。
附图简述
图1是人类、大鼠和小鼠的XT-I、XT-II和CX4ST启动子区的序列分析图示，说明了定位和其他特征；
图2通过图示说明了脊髓损伤后Sox9 CSPG靶基因表达(XT1,XTΠ,C4ST)；
图3说明了将它莫西芬(Tamoxifen)给予随后经历脊髓损伤的条件性Sox9敲除小鼠降低损伤处(A)以及脊髓(B)中SOX9表达细胞的频数，并且降低GFAP阳性细胞的频数(C)；确定了GFAP表达细胞和SOX9表达细胞频数间的相关性(D)；但如通过线性回归分析(F)所确认的，看起来不影响星形胶质细胞的频数(谷氨酰胺合成酶阳性细胞和野生型SOX9敲除细胞的频数没有差异(E))；以及说明了SOX9敲除对SCI时SOX9基因表达的影响(G)；
图4说明了将它莫西芬给予来自条件性Sox9敲除小鼠的原代星形胶质细胞降低了SOX9靶基因的表达(A)；以及说明了在SOX9敲低小鼠中，SOX9活性降低对体外对疤痕基因表达的影响(B)；
图5说明了在用不同浓度的化合物处理的成熟星形胶质细胞培养物中，SOX9活性的荧光素酶测定结果(A-E)，所述化合物被设计为抑制钙内流和钙调蛋白活性中的至少一种；
图6说明了样品的SOX9靶基因表达的实时PCR分析结果和蛋白免疫印迹结果(A、B和C)，所述样品来自用不同浓度的化合物处理的熟星形胶质细胞培养物，所述化合物被设计为抑制钙内流和钙调蛋白活性中的至少一种；
图7说明了样品的SOX9靶基因表达的实时PCR分析结果，所述样品来自用cal-TAT(A/C)和TAT-cal肽(B)处理的成熟星形胶质细胞培养物；
图8说明了样品的SOX9靶基因表达的实时PCR分析结果，所述样品来自脊髓损伤后用氯丙嗪(A)和环孢霉素A处理(B)的大鼠脊髓；
图9显示了在4周(A)和更长的期限(B)时，调节SOX9对脊髓损伤后小鼠行为改善的趋势，以及测量了移动的距离以确定改善(C)；
图10说明了来自脊髓损伤后大鼠脊髓的样品的SOX9靶基因表达的组织学分析结果，其显示了降低的CSPG表达(A)、增加的层粘连蛋白(B)和增加的神经丝(neurafilament)表达(C)；
图11说明了有SOX9调节的行为改善的趋势；
图12说明了在来自通过腹腔注射用氯丙嗪处理的脊髓损伤小鼠的样品中，SOX9靶基因表达(A)的实时PCR分析结果，所述SOX9靶基因包括SOX9(B)、GFAP(C)、XT-1(D)、HAPLN1(E)、2A型胶原蛋白(F)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)(G)和短蛋白聚糖(H)；
图13说明了来自用不同浓度氯丙嗪处理的脊髓损伤小鼠的样品的SOX9靶基因表达的实时PCR分析结果；以及
图14说明了用不同浓度氯丙嗪处理的CNS损伤的大鼠中行为改善的趋势，如运动功能(A)和握力(B)试验中所显示的。
发明详细描述
提供了用于调节SOX9活性并治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生有关的病症的化合物，包括钙调蛋白拮抗剂、瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂和钙调蛋白结合肽的新家族。
SOX9是软骨细胞分化和软骨形成所需的转录因子。在人类中，SOX9是具有509个氨基酸的56Kda的蛋白(NCBI登录号为NP-000337.1)。包括人和其他哺乳动物SOX9序列在内的SOX9蛋白和核酸序列为本领域所熟知，例如，参见WO 2008/049226，其内容通过引用并入本文。SOX9蛋白变体序列的实例包括狗(NCBI登录号为NP-001002978)、黑猩猩(NCBI登录号为NP-001009029.1)和小鼠(NCBI登录号为NP-035578.2)中的SOX9。为了本发明的目的，术语“SOX9”包括任何功能性哺乳动物SOX9蛋白，包括其功能性变体。术语“功能性变体”指保留了天然的、自然存在的SOX9蛋白活性的SOX9蛋白，所述活性例如调节木糖基转移酶如XT-1或磺基转移酶诸如C4ST。
术语“蛋白聚糖”指包含核心蛋白以及一个或多个共价连接的糖胺聚糖链的糖蛋白家族，所述共价连接的糖胺聚糖链至少部分通过木糖基转移酶和磺基转移酶的作用形成。这种蛋白聚糖的实例包括具有核心蛋白的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)诸如磷酸蛋白聚糖、NG2和短蛋白聚糖；具有核心蛋白的硫酸皮肤素蛋白聚糖(DSPG)诸如核心蛋白聚糖；具有核心蛋白的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)诸如多配体蛋白聚糖、磷脂酰肌醇聚糖、基底膜蛋白聚糖、集聚蛋白(agrin)和胶原蛋白XVII；以及具有核心蛋白的硫酸角质素蛋白聚糖(KSPG)诸如基膜聚糖、角膜蛋白(Keratocan)、Mimecan、纤调蛋白聚糖、PRELP、骨黏附蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖。木糖基转移酶，例如XT-I或XT-II在通过添加木糖将糖胺聚糖链添加至蛋白聚糖核心蛋白中催化第一限速步骤。
术语“产生或调节”，当它涉及蛋白聚糖以及与其相关的病症时，指修饰或调节蛋白聚糖活性的分子的转录调控，其中该分子包括但不限于，核心蛋白聚糖蛋白、糖胺聚糖链和蛋白聚糖合成酶诸如XT-I、XT-II和C4ST。
本文所用的术语“与蛋白聚糖产生或调节有关的病症”包括蛋白聚糖产生/调节促成的不良病症和病变，以及其中降低至少一种蛋白聚糖所改善的病症或病变。例如，已知蛋白聚糖的产生诸如CSPG的产生，促成其中正常神经元生长或神经元可塑性(包括神经元再生)被阻断或以其他方式被阻止的病症。这类病症的实例包括但不限于，神经系统的原发性病症，其包括但不限于脊髓损伤、外伤性脑损伤、神经退行性疾病诸如弗里德希氏共济失调(Friedreich’s ataxia)、脊髓小脑性共济失调、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、帕金森病(Parkinson’s Disease)、路格里克氏病(Lou Gehrig’s Disease(ALS))、脱髓鞘疾病诸如多发性硬化、由脊髓损伤导致的横贯性脊髓炎、炎症、以及与视网膜神经元变性有关的疾病诸如老年性弱视、黄斑病变和视网膜病诸如病毒性、中毒性、糖尿病性和缺血性视网膜病、遗传性视网膜变性诸如Kjellin和Barnard-Scholz综合征、变性近视、急性视网膜坏死和年龄相关病变诸如认知功能的丧失。实例还包括导致脑血管损伤的病症，包括但不限于中风、血管畸形诸如动静脉畸形(AVM)、硬脑膜动静脉瘘(AVF)、脊髓血管瘤、海绵状血管瘤和动脉瘤、由脊髓血管闭塞导致的缺血，包括主动脉夹层动脉瘤、栓塞、动脉硬化和发育障碍诸如脊柱裂、髓膜脊髓瘤(meningomyolcoele)、或其他病因。
选择的化合物拮抗SOX9功能的效用很容易利用体外测定系统来确认，例如，利用转染了仅在SOX9存在下活化的报告构建体的细胞，例如，所述构建体包含与控制报告基因例如荧光素酶表达的启动子功能连接的一个或多个SOX蛋白结合位点。还可以监测CSPG相关基因表达以确定化合物作为SOX9拮抗剂的效用，这样CSPG相关基因表达的降低指示拮抗剂活性。如本领域技术人员所认识到的，合适的体内模型也可以用于确定潜在的SOX9拮抗剂或抑制剂的效用。
在本发明的一个方面，治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生或调节有关的病症的方法包括给予哺乳动物钙调蛋白拮抗剂。合适的钙调蛋白拮抗剂包括有效抑制或至少减少SOX9核转位的化合物。合适的钙调蛋白拮抗剂的实例包括α-肾上腺素能阻断剂诸如苯氧苄胺、哌唑嗪、特拉唑嗪、多沙唑嗪、坦索罗辛(Tamsulosin)及以上的衍生物诸如药学上可接受的盐；吩噻嗪类诸如氯丙嗪、卡米达佐(calmidazolium)、E6小檗胺、CGS 9343B、三氟拉嗪和氟奋乃静(fluphenazine)以及结构上类似的环多肽诸如环孢霉素、雷帕霉素和FK506，以及以上的衍生物诸如药学上可接受的盐；萘磺酰胺类诸如A7、J8、W-5、W-7、W-13以及以上的衍生物诸如药学上可接受的盐，例如盐酸盐；以及ACE抑制剂诸如氯沙坦(Losartan)、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦以及以上的衍生物诸如药学上可接受的盐；以及生物碱类诸如粉防乙碱(Tetrandrine)。如本领域的技术人员认识到的，许多这种钙调蛋白拮抗剂可以商购，或者能够容易地利用已知的化学合成技术来合成。
在本发明的另一方面，治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生或调节有关的病症的方法包括给予哺乳动物瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂。合适的TRP通道抑制剂包括有效抑制或至少减少TRP通道诸如TRPV通道处的钙内流并由此抑制钙调蛋白转运SOX9的能力的化合物。这种抑制剂的实例包括广谱TRP通道拮抗剂诸如2-APB拮抗剂和TRPV拮抗剂诸如钌红、柠檬醛、RN9893和RN1734，以及以上的衍生物诸如药学上可接受的盐。如本领域技术人员认识到的，TRP通道抑制剂可以商购，或者能够容易地合成。
在本发明的另一方面，治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生或调节有关的病症的方法包括给予哺乳动物钙调蛋白结合肽。合适的钙调蛋白结合肽包括包含足以结合钙调蛋白的氨基酸序列的肽。
本文所用的术语“氨基酸”指D-或L-型的天然存在的和合成的氨基酸。如本领域的技术人员会认识到的，氨基酸包括：甘氨酸；具有脂肪族侧链的那些氨基酸诸如丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；具有芳香族侧链的那些氨基酸诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有酸性侧链的那些氨基酸诸如天冬氨酸和谷氨酸；具有并入了羟基的侧链的那些氨基酸诸如丝氨酸、高丝氨酸、羟基正缬氨酸、羟基脯氨酸和苏氨酸；具有含硫侧链的那些氨基酸诸如半胱氨酸和甲硫氨酸；具有并入了酰胺基的侧链的那些氨基酸诸如谷氨酰胺和天冬酰胺；以及具有碱性侧链的那些氨基酸诸如赖氨酸、精氨酸、组氨酸和鸟氨酸。
本发明的适合的钙调蛋白结合肽由下述通式表示：
X1RP–间隔子–RX1X2
其中X1是带正电荷的氨基酸诸如精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)；X2是带正电荷的氨基酸诸如精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸，或者没有氨基酸；以及间隔子包含约8-12个氨基酸残基。
合适的钙调蛋白结合肽的实例包括来源于哺乳动物SOX蛋白诸如SOX1、SOX2、SOX3、SOX4、SOX5、SOX6、SOX7、SOX8、SOX9、SOX10、SOX11、SOX12、SOX13、SOX14、SOX15、SOX17、SOX18和SOX30的钙调蛋白结合位点，并且包括保留了结合钙调蛋白能力的SOX蛋白的功能等同变体。例如，SOX蛋白的功能等同变体是如下蛋白：可以包括一个或多个氨基酸取代、添加、删除或衍生化同时保留结合钙调蛋白能力。
在一个实施方案中，钙调蛋白结合肽选自：
KRPMNAFIVWSRDQRRK,KRPMNAFMVWSRGQRRK,
KRPMNAFMVWSRGQRRK,KRPMNAFMVWSRGQRRK,
KRPMNAFMVWSRGQRRK，KRPMNAFMVWSRAQRRK,
KRPMNAFMVWSQIERRK，KRPMNAFMVWSKIERRK,
KRPMNAFMVWSQHERRK，KRPMNAFMVWAKDERRK,
KRPMNAFMVWAKDERRK，KRPMNAFMVWAKDERRK,
KRPMNAFMVWAQAARRK，KRPMNAFMVWAQAARRK，
KRPMNAFMVWAQAARRK，RRPMNAFMVWAKDERKR,
RRPMNAFMVWAKDERKR，RRPMNAFMVWAKDERKR，
KRPMNAFMVWSSAQRR和KRPMNAFMVWARIHR。
利用已确立的制备肽的技术，能够容易地制备本发明的钙调蛋白结合肽。
如本领域技术人员会认识到的，在合成这种肽时，并入N-末端或C-末端保护基团是有利的，这些保护基团用于保护肽的氨基末端和羧基末端免于不希望的生物化学攻击。例如，有用的N-末端保护基团包括式为R--C(O)--的低级链烷酰基(alkanoyl group)，其中R是包含1-5个碳原子的线性或分支低级烷基链。优选的N-末端保护基团是乙酰基、CH3-C(O)--。还用作N-末端保护基团的是缺乏氨基官能的氨基酸类似物。通过凭借羧基官能的碳原子例如以形成酮或酰胺，或者凭借其氧原子以形成酯来并入封闭基团可以实现C-末端保护。因此，有用的羧基末端保护基团包括例如，形成酯的烷基，特别是低烷基基团诸如例如甲基、乙基和丙基，以及形成酰胺的氨基官能诸如伯胺(--NH2)，以及单烷基氨基和双烷基氨基基团诸如甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、甲基乙氨基等。通过并入脱羧基氨基酸类似物诸如胍基丁胺作为C-末端氨基酸也可以实现C-末端保护。当然，如果需要的话，还可以选择性地并入具有更大结构复杂性的N-保护基团或C-保护基团。
此外，修饰肽以并入在给药时辅助该肽递送到靶部位的元件可能是可取的。例如，该肽可以融合到另一肽以促进递送，诸如TAT序列，以及属于主要的两亲性肽家族的其他细胞穿透肽，诸如MPG、Pep-1和Wr-T(KETWWETWWTEWWTEWSQGPGrrrrrrrrr(r,D-对映体精氨酸)(SEQ IDNO:13)。
本方法可以单独利用选择的抑制剂(例如钙调蛋白拮抗剂、瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂或钙调蛋白结合肽)，或者利用组合物形式的选择的抑制剂(例如钙调蛋白拮抗剂、瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂或钙调蛋白结合肽)，其中所述抑制剂与至少一种药学上可接受的载体或佐剂组合。表述“药学上可接受的”意味着对于在药学和兽医领域使用是可接受的，即没有不能接受的毒性或者在其他方面不适合。药学上可接受的佐剂的实例是常规与特定类型化合物一起使用的佐剂，并可以包括稀释剂、赋形剂等。对于通用药物剂型的指南，可以参考"Remington's:The Scienceand Practice of Pharmacy",21 st Ed.,Lippincott Williams & Wilkins,2005。佐剂的选择取决于组合物预期的给药方式。在本发明的一个实施方案中，化合物被配制为用于通过输注给药，或者通过皮下或静脉注射给药，并相应地作为无菌和无热原形式的水性溶液使用，以及任选地为缓冲液或制备为等渗液。因此，化合物可以在蒸馏水中给药，或者更为理想地，在盐水、磷酸缓冲盐或5%葡萄糖(dextrose)溶液中给药。利用佐剂制备用于通过药片、胶囊或悬液口服给药的组合物，所述佐剂包括糖类诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，包括羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄芪胶粉；麦芽；明胶；滑石；硬脂酸；硬脂酸镁；硫酸钙；植物油诸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油和玉米油；多元醇诸如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；琼脂；海藻酸；水；等渗盐水和磷酸缓冲溶液。润湿剂、诸如月桂基硫酸钠的润滑剂、稳定剂、压片剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂和调味剂也可以存在。利用诸如甘油三酯基质的适合基质，可以制备乳霜、洗液和药膏用于局部应用。这类乳霜、洗液和药膏还可以包含表面活性剂。还可以制备例如用于经鼻递送的气溶胶制剂，其中使用了合适的推进剂佐剂。还可以向组合物添加其他佐剂，而不管其是如何给药的，例如，可以向组合物添加抗微生物剂以防止微生物在延长的储存期生长。
例如，还可以在脂质体或其他适于封装该抑制剂的制剂中配制选择的SOX9抑制剂，以促进其在给药时递送到靶部位。
按照本发明，在治疗与蛋白聚糖产生或调节有关的不良病症中，将治疗有效量的选择的SOX9抑制剂给予哺乳动物。如本文所用的，术语“哺乳动物”意指包括但不限于人，家畜诸如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊等，以及野生动物。术语“治疗有效量”是治疗给定病症所需的选择的SOX9抑制剂的量，而不超出可能导致显著副作用的量。选择的SOX9抑制剂的合适剂量会随着许多因素而变化，包括待治疗的特定病症和被治疗的个体。适合的剂量预期在约1μg-100mg的范围。
将SOX9抑制剂给予哺乳动物可以通过任何合适的给药途径，包括肠内给药(例如口服)或者胃肠外给药(例如静脉内、腹腔内、肌内、鞘内给药)以及借助适合的载体或基质材料通过吸入给药。
利用本发明的SOX9抑制剂(例如钙调蛋白拮抗剂、瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂或钙调蛋白结合肽)对与蛋白聚糖产生/调节有关的不良病症的治疗，可以通过利用钙调蛋白拮抗剂、瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂和钙调蛋白结合肽中的两种或更多种的组合得以增强。此外，本治疗方法可以用于补充其他治疗方法，包括基于细胞的疗法或者限制免疫应答或细胞毒性的方法。
通过参考下文具体的实施例描述了本发明的实施方案，这些实施例不应被解释为限定性的。
实施例1：星形胶质细胞培养系统
已经确定，转录因子SOX9能够上调原代星形胶质细胞培养物中XT-I、XT-II和C4ST的转录，以及下调促再生细胞外基质(ECM)分子层粘连蛋白和纤粘连蛋白的表达。与CSPG基因被联合调控的假设一致，Genomatix软件分析在它们各自启动子的所有9种中，鉴定了5种具有推定的结合位点的转录因子。这些单元的相对定位和特征显示在图1中。
为了确定SOX9上调XT-I、XT-II和C4ST的表达是直接还是间接的，进行了染色质免疫沉淀(ChIP)分析。在来自雌性(不表达SOX9)或雄性(表达SOX9)小鼠的生殖脊的细胞上，利用抗SOX9抗体的染色质免疫沉淀(ChIP)证实，SOX9与C4ST和XT-1的启动子区结合。利用标准条件以及位于C4ST启动子中2个推定的SOX9结合位点和XT-1启动子中3个推定的SOX9结合位点侧翼的引物对，通过PCR扩增由抗SOX9抗体免疫沉淀下来的DNA。如通过琼脂糖凝胶电泳所显现的，C4ST启动子中两个预测的SOX9结合位点(位于转录起始位点上游的5432bp和2.1kb处)相对雌性CHiPed DNA都被优先从雄性CHiPed DNA中扩增。XT-I启动子中，三个预测的SOX9结合位点仅有一个显示出PCR扩增的雄性CHiPed DNA(转录起始位点上游70bp的位点)的富集。这表明SOX9直接激活XT-I、XT-II和C4ST的表达。基因组DNA(未经免疫沉淀)用所有引物组扩增作为PCR反应的阳性对照。
已经利用原代星形胶质细胞开发了鉴定SOX9抑制剂的基于细胞的筛选。已经证实且被广泛接受的是，体外成熟的星形胶质细胞培养物能很好地代表成熟大脑内的星形胶质细胞。接种后早期的培养物具有与急性损伤相关的不成熟和反应性星形胶质细胞的特征。在该分析中，原代星形胶质细胞转染了由4个SOX9结合位点重复序列组成的SOX9报告构建体，该重复序列与克隆在质粒pGL4中荧光素酶基因上游的小鼠Col2a1最小启动子连接，如以前在WO 2008/049226中描述的。转染效率标准化后，可以通过荧光素酶活性监测转染的星形胶质细胞中的SOX9活性。在存在和不存在潜在抑制剂的情况下，培养转染了SOX9报告构建体的细胞24小时，在24小时时将细胞裂解并测量荧光素酶水平。相对于对照孔，降低荧光素酶活性水平的化合物被视为阳性“命中项(hit)”。在二级筛选中，利用细胞活力测定(CellTiter-Flour-Promega)，消除由于对细胞活力的影响而导致荧光素酶活性降低的假阳性。在二级筛选之后，通过在原代星形胶质细胞中的Q-PCR研究评价“命中项”对SOX9靶基因表达的影响。
用于验证该类筛选的简单统计学参数是计算Z'因子，所述Z'因子依照阴性和阳性对照间的总间隔减去与每一类型对照相关的误差描述了分析可利用的信号窗。大于0.5的Z'值表明可信的筛选。SOX9报告子分析的Z′＝0.71。而且，利用该报告子系统，已经证实降低SOX9靶基因在原代星形胶质细胞中表达的化合物可信地引起荧光素酶活性的显著降低(图5)。类似地，除了荧光素酶读数之外或包括荧光素酶读数在内，可以直接从培养物自身评价靶基因或蛋白以便推导出候选抑制剂对SOX9的活性的更详细的指征(图6)。
实施例2-Sox9与多种CNS病症有关
为了评价SOX9在人类CNS损伤和疾病中的潜在作用，研究了人类出血性中风(n=3)、缺血性中风(n=3)、外伤性脑损伤(n=2)病例中SOX9的表达。简言之，将人组织用福尔马林固定，并进行冰冻切片或用石蜡包埋并切片用于组织学检测。将切片用通常可商购的差异性荧光抗体(包括GFAP、CS56和Sox9)的组合染色，然后用荧光核染料DAPI复染。在GFAP阳性星形胶质细胞中以及在来自缺血性中风、TBI和脊髓损伤后人组织的样品中富集CSPG的区域内能够清楚地观察到SOX9表达。未受损伤的人CNS样品没有Sox9、GFAP和CSPG染色。类似地，MCAO和脊髓损伤后小鼠组织的免疫组化染色显示了与人组织类似的图谱。
除了啮齿动物SCI模型(由Gris et al.2007 Aug 15;55(11):1145-55描述)外，还使用了小鼠的标准大脑中动脉闭塞(MCAO)模型(由Belayev et al.Brain Res.1999Jul 3;833(2):181-90.描述)。MCAO模型用于模仿人类的缺血性中风。简言之，将包被有聚-L-赖氨酸的11mm长的单丝尼龙穿入小鼠颈总动脉，通过颈内动脉，并经过大脑中动脉(MCA)，从而有效地闭塞了MCA。向下收紧缝合线环，使小鼠在温暖的笼子里恢复。通过激光多普勒流量测定探针确认了脑血流量的有效降低(降低70%或更多指示成功的闭塞)。中度损伤30分钟或重度损伤60分钟后，再次麻醉小鼠并移除尼龙缝合线允许再灌注。损伤后7天和28天，在小鼠脑切片上进行SOX9、GFAP和CSPG表达的免疫组化。将未受损伤的小鼠的切片、MCAO之后7天或MCAO后28天的小鼠的切片进行SOX9、GFAP和/或CS56的免疫染色，并用DAPI复染。用通常商购的抗GFAP抗体和抗SOX9抗体对切片进行的双标记，证实了SOX9在反应性星形胶质细胞中的表达。显示了共表达GFAP和SOX9的细胞的高放大率。用识别几种不同CSPG的CS56抗体和抗SOX9抗体对切片进行的双标记，证实了SOX9在对CSPG发生免疫应答的区域周围的细胞中表达。未受损伤的小鼠组织没有染色。
还利用两种小鼠品系，直接评价了SOX9在啮齿动物疾病模型中调节靶瘢痕基因的作用。第一品系携带floxed SOX9(由loxP位点围绕的SOX9的外显子2和3)等位基因(SOX9flox/flox小鼠)。第二小鼠品系是转基因系，其在与CMV立早增强子连接的鸡β肌动蛋白启动子/增强子的控制下，广泛表达与小鼠雌激素受体(ER)的突变配体结合结构域融合的Cre重组酶(CAGGCre-ERTM转基因小鼠)。融合蛋白的突变ER配体结合结构域不结合内源性雌二醇，但对纳摩尔浓度的它莫西芬是高度敏感的。因此，在CAGGCre-ERTM小鼠中，CreER融合蛋白被截留在表达细胞的细胞质中。它莫西芬给药允许CreER蛋白运送至细胞核，在那里它切除loxP-侧翼的DNA区。研究已经表明，将它莫西芬给予CAGGCre-ERTM转基因小鼠导致在所检测的所有器官和脑区域中的Cre-介导的基因组重组。在SOX9flox/flox；CAGGCre-ERTM中的它莫西芬给药会消除SOX9编码区，从而使该基因无功能。SOX9flox/flox小鼠与CAGGCre-ERTM转基因小鼠交配以生成floxed SOX9等位基因为杂合的和Cre-ER转基因为半合子的小鼠，以及具有携带Cre-ER转基因的SOX9flox/flox的小鼠。利用这些小鼠，可以观察到在SOX9表达缺乏的情况下，对CNS损害的分子的、细胞的和神经学反应。
进行了利用SOX9flox/+;Cre-ERTM杂合小鼠的一系列实验，以验证Cre转基因如所预期的那样发挥作用，以及研究敲除一个SOX9等位基因是否对SOX9靶基因表达具有任何影响。SOX9flox/+；Cre-ERTM和不携带Cre转基因的SOX9flox/+小鼠用每日剂量的它莫西芬(玉米油中1.5mg/20g小鼠，通过管饲法递送)处理1周。随后使来自两组的小鼠经历SCI，在损伤后一周，处死它们用于基因表达研究。通过对SOX9蛋白含量的蛋白免疫印迹法分析从以损伤处为中心的5mm脊髓节段分离的蛋白。具体地，来自未受损伤的Sox9杂合条件性敲除小鼠、受损伤的消除SOX9的杂合条件性敲除小鼠或野生型对照小鼠的蛋白通过SDS-PAGE来分析，以及通过蛋白免疫印迹来分析。蛋白免疫印迹用识别Sox9磷酸化形式的抗-SOX9抗体和作为上样对照的抗-β-肌动蛋白抗体来探测。在受损伤的小鼠中，杂合Sox9敲除小鼠的Sox9表达相比野生型降低很多。通过Q-PCR对来自同一脊髓组织样品的RNA进一步的分析表明，SOX9蛋白的降低与SOX9靶基因XT-I、XT-II和C4ST mRNA水平的降低相关(图2)。
在纯合SOX9条件性敲除小鼠的情况下，用免疫组化和实时PCR分析确认了用它莫西芬处理和脊髓损伤后的SOX9的敲除。跨越损伤处，制备野生型和敲除小鼠脊髓的纵向切片，并用抗-SOX9抗体染色以及用DAPI复染。Sox9表达细胞的频数的量化表明，在损伤内部以及损伤部位的嘴侧和尾侧，条件性敲除小鼠中SOX9表达细胞的频数相比野生型的显著降低(图3A)。关于胶质疤痕的形成，在损伤处嘴侧和尾侧的细胞在调节疤痕组成中发挥最大作用。此外，SOX9阳性细胞在敲除小鼠的脊髓中相对野生型小鼠的总频数表明SOX9细胞的明显降低(图3B)。重要的是注意到，由于小鼠是条件性敲除这一事实，动物的所有细胞不会必然地都被敲除，保留了基础频数的具有野生型特征的细胞。如同上文，进行了进一步的免疫组化分析以评价SOX9和GFAP表达。SOX9和GFAP双染的切片的荧光显微镜检查证实了SOX9表达与GFAP的相关性。其定量显示了损伤处嘴侧和尾侧的GFAP阳性细胞在敲除小鼠中的频数相对野生型对照的频数降低(图3C)。此外，野生型和SOX9敲除小鼠间的线性回归分析显示，GFAP表达细胞和SOX9表达细胞的频数间有强相关性(图3D)。相对于更普遍的星形胶质细胞标志物诸如谷氨酰胺合成酶，GFAP被认为是活化的星形胶质细胞更特异性的标志物。为了确保SOX9敲除不影响星形胶质细胞的频数，从免疫组化染色切片中确定谷氨酰胺合成酶阳性细胞的频数，并证实该频数在野生型和SOX9敲除小鼠间没有明显差异(图3E)。野生型和SOX9敲除小鼠间的线性回归分析没有显示SOX9表达细胞和谷氨酰胺合成酶表达细胞频数间的相关性(图3F)。图3G显示了SOX9敲除对瘢痕基因表达影响的进一步体内实时PCR分析。脊髓损伤后1周的SOX9敲除小鼠和对照小鼠的分析显示，相比对照小鼠，SOX9敲除导致SOX9 mRNA表达降低大约66%。该SOX9表达统计学上显著的降低(p<0.05，通过学生氏T检验)与木糖基转移酶-I、软骨素-4-磺基转移酶、胶原蛋白2和4、短蛋白聚糖CSPG和神经蛋白聚糖CSPG的统计学上显著的降低(p<0.05，通过学生氏T检验)(与对照小鼠相比)相关。疤痕损伤处的进一步的免疫组化分析显示了，脊髓损伤后条件性SOX9敲除小鼠中CSPG蛋白显著减少(图10A)，以及促再生的层粘连蛋白增加(图10B)。最后，损伤内和邻近损伤处的神经丝蛋白水平的显著增加(图10C)，显示了神经的大量存在以及神经再生的证据。
为了确认和验证体内证据与体外条件下利用成熟的星形胶质细胞培养物生成的证据的关联，培养来自P0小鼠的星形胶质细胞，所述P0小鼠对于Floxed SOX9等位基因是纯合的以及对于Cr是杂合的。对照是来自同窝出生的不携带Cre的小鼠的星形胶质细胞。培养1周后，用1μM4-OH-它莫西芬处理星形胶质细胞1周。然后允许1周没有它莫西芬以“洗出”它莫西芬。它莫西芬应该仅在来自Cre hets的培养物中导致SOX9丧失。停止它莫西芬处理后一周，收集来自每一培养物的RNA。它莫西芬处理的培养物中XT-1、聚集蛋白聚糖、胶原蛋白2A、连接蛋白和GFAP的表达降低到野生型水平的约60%(图4A)。连接蛋白将CSPG铰链到ECM中的透明质酸基质。GFAP的减少与星形胶质细胞活化状态的减少一致。XT-2和C4ST没有显示明显的减少。此外，图4B详细地显示了利用实时PCR mRNA分析，在SOX9敲除小鼠和对照原代小鼠星形胶质细胞培养物中SOX9活性降低对体外疤痕基因表达的影响。与对照小鼠星形胶质细胞培养物相比，SOX9敲除导致SOX9 mRNA表达降低大约75%。该SOX9表达统计学上显著的降低(p<0.05，通过学生氏T检验)与木糖基转移酶-I、聚集蛋白聚糖CSPG、连接蛋白、胶原蛋白2和胶质纤维酸性蛋白表达的统计学上显著的降低(p<0.05，通过学生氏T检验)(与对照小鼠星形胶质细胞培养物相比)相关。
为了验证SOX9的调节和由此的疤痕靶基因能够导致啮齿动物的功能性行为改善，对如上文处理并遭受如实施例8中描述的脊髓损伤的SOX9敲除小鼠进行了行为测试。简言之，通过食物供应纯合的条件性SOX9敲除小鼠它莫西芬或阴性对照，持续1周后，在T8使小鼠受70千达因(kdyne)的挫伤。24小时后(时间0)，对受损伤的啮齿动物进行运动评价，如实施例8中所述的。忽视得分大于0.25的任何小鼠，因为能力丧失是不完全的。一周一次通过运动恢复的Basso小鼠量表(Basso Mousescale，BMS)来评价它们，BMS考虑踝关节如何运动，以及恢复的其他指数，即得分为2指示足底放置并且是要达到的重要的限制。
图9A显示了损伤后长达4周，小鼠行为改善的趋势。显然，相对对照动物，在Sox9敲除小鼠中有改善，这表明Sox9表达的降低能够改善脊髓损伤小鼠的行为恢复。类似地，图9B显示了较长期的BMS研究，其显示脊髓损伤后条件性SOX9敲除小鼠中随着时间的明显改善，以及相对在损伤后约4周改善达到平台期的受损伤的同窝出生对照小鼠，在条件性SOX9敲除小鼠中有连续性改善趋势。在行为恢复的另一测试中，其中行为恢复测量为在啮齿动物活动箱内移动的总距离，图9C表明，SOX9条件性敲除小鼠与对照小鼠相比表现出运动增强。在啮齿动物活动箱中2小时，SOX9条件性敲除小鼠与对照小鼠相比表现出运动增强，如通过单因素方差分析所确定的(p<0.05)。SOX9条件性敲除小鼠表现出与未受损伤的野生型对照小鼠和未受损伤的SOX9敲除小鼠相同的运动程度，如通过单因素方差分析所确定的(p<0.05)，N=10。
在作为促进功能性CNS再生的一般策略的SOX9调节的另一非限定性实例中，图11显示了，MCAO(如在实施例8中进一步描述的)以及条件性SOX9敲低后，作为中风疾病模型的啮齿动物的行为恢复。MCAO后，组织学显示，在同窝出生对照小鼠损伤同侧有指示活化的成纤维细胞的GFAP染色明显的星形胶质细胞，这与条件性SOX9敲除小鼠形成鲜明对比。进一步的组织学和CSPG染色确认了在SOX9敲除小鼠中含CSPG疤痕的减少。在随后的对MCAO±SD后敲除小鼠(n=14)和对照小鼠(n=12)墙角试验期间随时间的左转弯的数目(在总共10个转弯中)的评价，显示了在1到5周统计学上显著的差异p<0.05(Newman-Keuls检验)，这表明SOX9敲除对恢复的改善(图11B)。在墙角试验行为评价中，未受损伤的小鼠在遇到墙角时，对它的左侧或右侧是同等偏好的，而具有所提损伤的MCAO啮齿动物偏好左转弯。用其他行为试验包括握力得分和圆筒测试不对称(cyclinder test asymmetry)获得了类似的结果。
将如图3所示的SOX9条件性敲除对疤痕组织学影响的证据，以及对限制疤痕、限制CSPG和增加促神经支配层粘连蛋白和神经存在的直接影响结合起来考虑(图10)，运动恢复看起来是通过调节疤痕组成增加神经再生的结果。
实施例3-钙调蛋白拮抗剂影响星形胶质细胞和SCI中SOX9的表达
在转染了pGL4.1 4x48 Col2a1的培养的大鼠星形胶质细胞中，评价钙调蛋白拮抗剂(抑制剂)降低SOX9靶基因表达的效用，所述星形胶质细胞如在实施例1中描述的那样制备。该质粒包含来自Col2A1增强子的4-48bp SOX9结合位点，其促进SOX9在细胞核中是有活性的细胞中荧光素酶报告基因的表达。转染第二天，细胞用如下文和在图5中所述浓度的抑制剂处理24小时，然后进行荧光素酶测定。在使用氯丙嗪的情况下，在成熟的星形胶质细胞培养物中存在限制荧光素酶表达的明显剂量依赖性反应，经优化在20μM时是最明显的(图5A,B,D)。此外，钙调蛋白抑制剂W7和W5也显示了报告子活性的剂量依赖性降低，在50μM时表现出最大的降低(图5A,D)。类似地，氟奋乃静与W7和W5具有结构相似性，并且也显示出报告子活性的剂量依赖性降低(图5A)。类似地，如通过荧光素酶表达所指示的，卡米达佐使Sox9活性降低约20%(图5B)，而苯氧苄胺(C)使Sox9活性降低高达约80%以及钌红使之降低约25%。
为了探索这些化合物对SOX9靶基因的影响，将来自出生后1天的大鼠的原代星形胶质细胞培养2-3周，然后用介质或20μM选择的拮抗剂处理。该时间点是其中培养的星形胶质细胞与CNS中稳定的星形胶质细胞保持最大相似性的时间。处理48小时后，收集细胞并通过Q-PCR测量XT-I、XT-II和C4ST的表达水平。用20μM氯丙嗪对成熟的原代大鼠星形胶质细胞培养物的处理显著降低了XT1、XT2和C4ST的表达(图6A)。此外，用抗-胶原蛋白IV探测的来自培养物的蛋白提取物的蛋白免疫印迹显示，用20μM氯丙嗪处理后，胶原蛋白的水平降低。胶原蛋白IV是由星形胶质细胞产生的重要的疤痕形成的细胞外基质，并且参与胶质疤痕的抑制特性。用氯丙嗪处理更长时间(1周)的研究对SOX9靶基因产生了更为显著的降低，而对细胞存活没有任何影响。
为了验证化合物对啮齿动物相关病症的影响，进行了短期的实验以观察氯丙嗪是否可能在体内降低SOX9靶基因表达。大鼠(每组n=4)经历了SCI，并在2小时后经腹腔注射接受1ml盐水、或经腹腔注射接受1ml0.5mg/ml氯丙嗪(2mg/kg剂量)或经皮下注射接受1ml 5mg/ml环孢霉素A(20mg/kg剂量)。12小时后，处死大鼠，并从以其损伤处为中心的5mm受损的脊髓节段分离RNA。大鼠脊髓损伤以及用氯丙嗪或对照处理后对SOX9靶基因表达的分析显示，疤痕生成因子的表达降低(图8A)。特别地，GFAP表达的降低表明较低水平的星形胶质细胞活化。这一数据与用Cre-诱导型敲除小鼠数据产生的证据相关，在Cre-诱导型敲除小鼠数据中，星形胶质细胞活化减弱，以及星形胶质细胞的数目没有变化。此外，II型和IV型胶原蛋白表达降低，以及CSPG聚集蛋白聚糖相对其他标志物显著减少。总之，这表明钙调蛋白拮抗剂处理降低了破坏性疤痕基因的表达，以及结合敲除小鼠的数据，提示钙调蛋白拮抗剂的影响是基于SOX9活性并通过钙调蛋白抑制实现的。
实施例4–影响免疫调节途径、钙调蛋白和Sox9转运的肽
在转染了pGL4.1 4x48 Col2a1的培养的大鼠星形胶质细胞中评价环孢霉素对SOX9功能的影响。转染第二天，将细胞用环孢霉素(20μM)处理24小时，然后进行荧光素酶测定。在使用环孢霉素A的情况下，20μM化合物的应用在报告子测定中相对对照值显著且急剧地降低了荧光素酶的表达(图5A,B,D)。因此，环孢霉素直接抑制钙调蛋白-SOX9相互作用和SOX9的核转运。
为了确认SOX9活性的抑制对胶质疤痕基因表达具有影响，将稳定的原代星形胶质细胞用介质或20μM环孢霉素A处理。处理48小时后，收集细胞，并通过Q-PCR测量XT-I、XT-II和C4ST的表达水平。除Sox9外，用20μM环孢霉素A处理成熟的原代大鼠星形胶质细胞培养物还显著降低了XT1、XT2和C4ST的表达(图6A)。此外，用抗-胶原蛋白IV探测的来自培养物的蛋白提取物的蛋白免疫印迹显示，用20μM环孢霉素A处理后，胶原蛋白的水平降低。胶原蛋白IV是由星形胶质细胞产生的重要的疤痕形成的细胞外基质，并且参与胶质疤痕的抑制特性。用环孢霉素处理更长时间(1周)的研究对SOX9靶基因产生了更为显著的降低，而对细胞存活没有任何影响。
为了确定环孢霉素对啮齿动物疾病模型中星形胶质细胞活性的效用，进行了短期实验以观察环孢霉素A是否在体内降低SOX9靶基因表达。大鼠(每组n=4)经历了SCI，并在2小时后经腹腔注射接受1ml盐水、或经皮下注射接受1ml 5mg/ml环孢霉素A(20mg/g剂量)。12小时后，处死大鼠，并从以其损伤处为中心的5mm受损的脊髓节段分离RNA。大鼠脊髓损伤以及用环孢霉素A或阴性对照处理后对SOX9靶基因表达的分析显示，疤痕生成因子的表达降低(图8B)。特别地，除了CSPG聚集蛋白聚糖明显降低40%外，II型和IV型胶原蛋白表达也显著降低了(降低大约40%)。总之，这提示环孢霉素A的处理通过调节免疫应答和钙调蛋白抑制的结合降低破坏性疤痕基因的表达。
实施例5–影响钙调蛋白和Sox9转运的肽
调节钙调蛋白将SOX9转运入细胞核的能力的另一方法是通过钙调蛋白结合的竞争性抑制。为了该目的，产生新肽(SOX-CAL)以特异性阻断钙调蛋白SOX9结合位点。SOX-CAL肽的序列RRPMNAFMVWAQAARRK(SEQ ID NO.8)对应于SOX9中的钙调蛋白结合序列。为了确保该肽进入细胞，将其合成为与HIV-1 Tat蛋白的蛋白转导结构域融合。将来自出生后1天的大鼠的原代星形胶质细胞培养2-3周，然后用10μM SOX-CAL肽处理。处理48小时后，收集细胞并通过Q-PCR测量XT-I和C4ST的表达水平。用10μM Cal-TAT或TAT-Cal对成熟的原代大鼠星形胶质细胞培养物的处理显著降低了XT1和C4ST的表达，如通过实时q-PCR所确定的(图7A,B)。有趣的是，尽管看起来TAT-Cal在成熟的培养物中增加了Sox9的表达，但SOX9蛋白似乎并没影响SOX9靶基因的转录，这提示SOX9蛋白并没有如预期的那样进入细胞核。关于Cal-TAT对原代星形胶质细胞培养物中靶基因表达的影响的进一步评价显示，GFAP、XT-1、胶原蛋白2A、以及CSPG核心蛋白聚集蛋白聚糖和短蛋白聚糖显著降低(图7C)。相比对照FLAG-TAT肽，进行这一分析。
此外，用抗-胶原蛋白IV探测的来自Cal-TAT处理的培养物和对照培养物的蛋白提取物的蛋白免疫印迹显示，IV型胶原蛋白的水平降低。胶原蛋白IV是由星形胶质细胞产生的重要的疤痕形成的细胞外基质，并参与胶质疤痕的抑制特性。并不期望TAT的融合物对细胞存活和与神经再生相关的靶基因具有影响。不管Tat序列是在N-末端位置定位还是在C-末端位置定位，靶基因降低的水平都是相当的(图7)，这提示SOX-CAL对靶基因和活性的影响不依赖SOX-CAL肽序列和TAT融合物的构型。此外，进一步的研究提示，用SOX-CAL肽处理更长的时间(1周)对SOX9靶基因产生更为显著的降低，而对细胞存活没有任何影响。
关于体内应用，因为肽可能在血液中的半衰期极短，可以利用微量渗透泵通过鞘内递送肽。1002 Alzet微量渗透泵能够以每小时0.25μL的速率递送药物2周。可以进行利用对照肽FLAG-Tat(该肽与SOX-CAL肽相同，除了结合钙调蛋白的氨基酸已经被FLAG序列DYKDDDDK(SEQ ID NO:12)取代，可以获得该肽商购的抗体)的预实验，以估计药物递送4小时后被灌注的肽占据的脊髓体积。这种体积估计用于计算SOX-CAL肽在受损伤的脊髓中的预期稀释系数，并允许估计应该用于泵中的肽的浓度。
实施例6–调节星形胶质细胞活性和疤痕组成的TRPV拮抗剂
在该实施例中，测试了化合物调节钙通道进而调节SOX9活性的潜力。在转染了pGL4.1 4x48 Col2a1的培养的大鼠星形胶质细胞中评价组合物。转染第二天，将细胞用选择的抑制剂处理24小时，然后进行荧光素酶测定。苯氧苄胺在20和50μM时显示了对报告子活性的剂量依赖性抑制(图5C)。此外，粉防乙碱使荧光素酶活性降低了约20%(图5B)。最后，TRPV4特异性通道抑制剂钌红和2-APB都显著降低了荧光素酶产生(图5D,E)。这些化合物被认为能抑制钙内流，并因此抑制钙调蛋白将SOX9转运到细胞核以及活化荧光素酶报告子的能力。
测试了TRPV4阳离子通道拮抗剂以确定它们在星形胶质细胞中降低SOX9活性的能力。在转染了pGL4.1 4x48 Col2a1的培养的大鼠星形胶质细胞中评价TRPV4拮抗剂对SOX9功能的影响。转染第二天，将细胞用2-APB(100μM)或钌红(10μM)处理24小时，然后进行荧光素酶测定。广谱瞬时受体电位(TRP)通道拮抗剂2-APB将SOX9活性抑制大约70%，而辣椒素(vanniloid)亚家族特异性TRP拮抗剂钌红将SOX9活性抑制大约25%。关于SOX9靶基因，进行了成熟的原代星形胶质细胞培养物的Q-PCR分析以确定TRPV4拮抗剂对SOX9的影响。在暴露48小时后的大鼠原代星形胶质细胞(n=3)中，用钌红的处理特异性地使聚集蛋白聚糖和Col4a表达分别降低40%和50%(图6B)，而2-APB分别使XT-I、HAPLN1、聚集蛋白聚糖、Col2a和Col4a降低50%、70%、80%、50%和60%(图6B,C)。胶原蛋白IV是由星形胶质细胞产生的重要的疤痕形成的细胞外基质，并参与胶质疤痕的抑制特性。基于TRP通道在调节钙水平以及由此的钙调蛋白活性方面的作用，TRP通道阻断剂对SOX9活性的影响看起来是间接的。
实施例7:用影响钙调蛋白的化合物的体内试验
在用啮齿动物研究的情况下，利用通过腹腔注射(如实施例3中所述的)和鞘内微量渗透泵(如实施例5中所述的)的递送评价氯丙嗪的给药。概括起来，将三种剂量的氯丙嗪(2mg/kg、4mg/kg和6mg/kg)通过腹腔注射给药7天，一天一次。然后处死大鼠，并在脊髓样品上进行SOX9、GFAP、XT1、连接蛋白、胶原蛋白2A、聚集蛋白聚糖和短蛋白聚糖的实时pCR分析，并相对于18S标准化。图12显示了大鼠脊髓损伤后，通过腹腔注射递送氯丙嗪降低了SOX9靶基因(图12A)(包括SOX9(图12B)、GFAP(图12C)、XT-1(图12D)、HAPLN1(图12E)、2A型胶原蛋白(图12F)、聚集蛋白聚糖(图12G)和短蛋白聚糖(图12H))的表达。类似地，这些结果表明，2和4mg/ml的给药对靶基因表达有明显的影响。
为了评价作为化合物递送方式的鞘内微量渗透泵，脊髓损伤的大鼠接受盐水、0.35mg/ml或3.5mg/ml的氯丙嗪7天。在第7天时，通过以前描述的定量RT-PCR测量了包括GFAP、短蛋白聚糖、XT-1和Hapln1在内的SOX9靶基因表达的水平。图13中呈现的证据显示了与氯丙嗪和鞘内微泵递送相关的剂量反应结果，并提示在药物为3.5mg/ml时，有改善的预期结果。
作为化合物用于一般CNS损伤和修复的一般效用的例子，在脊髓损伤和中风(MCAO)的啮齿动物模型中评价氯丙嗪。图14A显示了利用实施例8中描述的BBB量表的行为测试结果。简言之，大鼠经历所描述的脊髓损伤，并通过鞘内微量渗透泵给予0.35mg/ml和3.5mg/ml的氯丙嗪7天。在第7天时，评价4只大鼠的行为恢复，然后处死大鼠用于上述的基因表达分析。图14A表明，盐水对照处理的大鼠没有一只显示出它们左脚或右脚运动功能的任何改善。在两种剂量的氯丙嗪下，鉴定到非零的分数表明功能恢复的证据，如通过足植入物所显示的。
为了证实在中风模型中的功效，在小鼠中进行如实施例8所述的MCAO，以及在损伤后24小时开始，每天通过腹腔注射给予剂量为lmg/kg或5mg/kg的氯丙嗪。在损伤后3天和7天时，通过握力测试评价受损一侧的恢复。图14B显示，在给予5mg/kg的氯丙嗪时，有以下证据：在损伤后3天相对盐水对照有约15%的改善，以及损伤后7天相对盐水对照有约20%的进一步改善。这提供了以下证据：一般CNS损伤(包括与脊髓损伤和中风相关的损伤)后，调节SOX9活性的化合物能够改善行为功能。
实施例8:利用治疗性化合物的啮齿动物实验
继实施例7，可以在啮齿动物SCI模型中评价SOX9抑制剂(氯丙嗪、环孢霉素、SOX-CAL、钌红和2-APB)的效力。进行预研究以确定研究中药物的最佳给药剂量。在啮齿动物研究的情况下，2-APB的给药剂量以腹腔注射2mg/kg开始。对于钌红，啮齿动物的给药剂量以腹腔注射1mg/kg开始。对于环孢霉素，啮齿动物的给药剂量以皮下注射10mg/kg开始。此外，高达50mg/kg的剂量在文献中是常见的。对于氯丙嗪，啮齿动物的给药剂量以腹腔注射2mg/kg开始。简言之，用1.5%氟烷麻醉小鼠，并进行椎板切除术以暴露第四胸椎节段。将被校准释放3g力的改进型动脉瘤夹放置在脊髓周围的硬膜外，并闭合60秒。通过产生长时间的、迅速施加的硬膜外压迫，该SCI模型很接近地复制了人类损伤的关键病理生理学特征。该模型产生了机械性损伤以及通过微血管破坏、出血、缺血、细胞内钙的增加、钙蛋白酶(calpain)活化、进行性轴突损伤和谷氨酸盐毒性产生了继发性损伤。可选地，利用Infinite Horizon撞击器，使大鼠接受T10(第10胸椎节段)的挫伤。从损伤后48小时开始，按照提出的给药剂量方案，用介质(对照)或用SOX9抑制剂处理动物。对于这些研究，药物给药2周，该时间点为疤痕已经在大鼠中良好形成的时间点。然后处死动物(每组n=6)并处理用于RNA分析。如以前(Gris 2009)所描述的，从以脊髓损伤处为中心的5mm脊髓节段分离RNA。在RNA样品上进行Q-PCR以评价SOX9靶基因的mRNA水平，所述SOX9靶基因包括XT-I、XT-II、C4ST、胶原蛋白2、聚集蛋白聚糖和连接蛋白。评价每种药物的三种剂量，以2倍增量增加。
显示了最强地降低SOX9靶基因表达的化合物和浓度在如下的长期研究中被测试。在这些研究中，大鼠(每组n=16)要接受SOX9抑制剂6周，在6周时，一半的动物会被处理用于通过Q-PCR的SOX9靶基因表达(如上文所述)，一半的动物会被处理用于免疫组化。免疫组化会使SOX9靶基因表达的改变与疤痕处CSPG、胶原蛋白和层粘连蛋白量的变化相关联。此外，在6周处理的过程中，大鼠会经历运动测试以评价可能归因于测试化合物的神经功能恢复的任何益处。在处理小鼠和对照小鼠中评价运动恢复、慢性疼痛综合征和自主功能。利用用于后肢功能评分的Basso,Beattie和Bresnahan(BBB)量表(Basso 1995)，一周一次评价运动功能。一周一次通过在损伤节段和损伤节段的嘴侧用改进型1.569mNSemmes Weinstein单丝刺激小鼠的背部，来评价机械性痛觉超敏(mechanical allodynia)(其中无害刺激被感觉为疼痛的疼痛综合征)的存在。这在开放的笼子里完成，并将对十次刺激回避反应的数目制成表。3g钳夹后，SCI小鼠常规地形成回避行为(试图逃避、发声、跳跃、退缩和/或试图咬住细丝)。最后，通过在处死动物前测量自主反射失调的程度来评价自主功能。自主反射失调的特征为由脊柱损伤节段以下的感官刺激触发的发作性高血压，并被认为是由于在损伤的脊髓处下行抑制输入缺失和异常反射的产生导致的(Brown 2006)。小鼠中的钳夹型SCI确实产生了自主反射失调，如通过响应与SCI程度相关的结肠扩张引起的血压增加所测量的。
如下文所列出的那样研究选择的化合物对其他CNS损伤(MCAO或TBI)的治疗作用。在损伤后1、3、6和8周处死动物用于组织学分析(n=4)、基因表达分析(n=4)。在损伤后6周进行神经可塑性分析(n=8)，以及在损伤后3、4、5和6周进行行为分析。
TBI损伤模型：利用液压冲击损伤的TBI模型完成这些实验。液压冲击损伤(FPI)是最常见的临床相关的TBI模型，有超过十年的文献支持其在大鼠和小鼠中的应用。简言之，将小鼠麻醉，并放置于立体定向的头夹中。在把头皮反映出来后，在矢状缝侧面0.5mm以及前囱尾侧0.5mm实施2.0mm直径的右侧颅骨切开术。然后将2.0mm(内径)的损伤罩(injury cap)放置在颅骨切开处并用胶固定。在允许小鼠从手术恢复的24小时后，将它们再次麻醉并通过高压管(2.0mm内径)将其连接至FPI装置。给予每只小鼠约3.5atm的损伤量级。损伤后，立即将动物与FPI装置断开，并允许它们在加热垫上恢复。利用基于抗体的方法在啮齿动物TBI模型中的证据(Utagawaa,Bramletta,Danielsa,Lotockia,Dekaban,Weaver,Dietrich,2008,Brain Research,1207:155-163)，我们已经证实，影响SOX9表达增加了对支持本文提供的概念机制数据佐证的信任，以及利用脊髓损伤和MCAO的体内证据在本文表明，本文提供的SOX9调节策略也适用于TBI应用。
中风损伤模型：利用标准的MCAO小鼠模型。简言之，将包被有聚-L-赖氨酸的11mm长的单丝尼龙穿入颈总动脉，通过颈内动脉，并经过大脑中动脉(MCA)，从而有效地闭塞了MCA。向下收紧缝合线环，使小鼠在温暖的笼子里恢复。通过激光多普勒流量测定探针确认脑血流量的有效降低(降低70%或更多指示成功的闭塞)。中度损伤30分钟或重度损伤60分钟后，再次麻醉小鼠并移除尼龙缝合线允许再灌注。
分析-组织学和基因表达：这些切片的甲酚紫染色和ImagePro软件会允许确定每一切片的梗死或损伤面积，以及确定处理是否导致SCI、MCAO或TBI后损伤体积的变化。利用如组织学分析所定义的立体定向坐标，主要在损伤中心的皮层损伤侧“凿出”相同大小的组织样品。通过Q-PCR以及分别从这些组织样品中分离的RNA和蛋白的狭缝印迹杂交分析来评价XT-I、XT-II、C4ST、层粘连蛋白和纤粘连蛋白的基因表达。不测量纤粘连蛋白，因为损伤部位的出血导致与新基因表达无关的高水平的纤粘连蛋白。
分析-神经可塑性：如上文评论的，CNS损伤后神经功能恢复的主要机制是通过增加神经可塑性，借此未受损伤的神经元在传入神经阻滞的神经元处形成新的连接，并发挥以前由受损伤的神经元执行的功能。例如，在未受损伤的动物中，大多数离皮层纤维投射到同侧中脑。然而，在MCAO后，对来自未受损伤一侧的皮层投射的生物素化葡聚糖胺(BDA)示踪显示，增加的离皮层纤维投射到对侧中脑。类似地，在未受损伤动物的颈脊髓中，大多数皮质脊髓纤维来源于对侧皮层。MCAO后的BDA示踪揭示，来自未受损皮层的纤维投射到同侧颈脊髓的数目增加。这些结果表明，MCAO随后是可塑期，在该阶段，来自未受损皮层的轴突可以投射至正常由MCAO损害的皮层一侧横贯和支配的区域。通过追踪闭塞MCA或TBI部位对侧的离皮层轴突来评价处理的和未处理的(阴性对照)小鼠的神经元可塑性。MCAO后6周，在处理的和未处理的小鼠中，在覆盖感觉运动皮层的颅骨中作一钻孔。在距离皮层表面1.5mm的深度处的7个部位注射BDA(0.5μl在PBS中的10%BDA)。BDA注射后2周，小鼠经历心脏灌注，并从它们的脑和颈脊髓制备冠状面切片和横断面切片。与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物孵育后，通过二氨基联苯胺反应显现BDA。投射至对侧中脑或同侧颈脊髓的BDA-标记的纤维在处理的小鼠中相对于未处理的小鼠的增加，表明处理增加了结构可塑性。
分析-TBI的行为结果：在先前SOX9消除和未消除的情况下，使用三种已建立的行为测试来监测未受损伤的小鼠和TBI后受损伤的小鼠中神经功能的损害/恢复：1)Deacon/Rawlins戏水池、2)高架十字迷宫(Elevated plus maze)以及3)Crawley社会行为箱。
分析-MCAO的行为结果：在先前SOX9消除和未消除的情况下，使用三种已建立的行为测试来监测未受损伤的小鼠和MCAO后受损伤的小鼠中神经功能的损害/恢复：1)粘附物移除测试(adhesive removal test)、2)爬杆测试和3)楼梯测试。处理过的小鼠在这些测试中的较好表现表明损伤后的处理改善了小鼠的神经功能恢复。

Claims (20)

1.治疗哺乳动物中与蛋白聚糖产生或调节有关的病理病症的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物选自钙调蛋白拮抗和瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂的药剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述病理病症是涉及抑制神经元生长或神经元可塑性的病症。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述病症选自脊髓损伤、外伤性脑损伤、神经退行性疾病、弗里德希氏共济失调、脊髓小脑性共济失调、阿尔茨海默病、帕金森病、路格里克氏病(ALS)、脱髓鞘疾病、多发性硬化、由脊髓损伤导致的横贯性脊髓炎、炎症、以及与视网膜神经元变性有关的疾病。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述钙调蛋白拮抗剂选自α-肾上腺素能阻断剂、吩噻嗪类、萘磺酰胺类、ACE抑制剂、生物碱类以及以上的药学上可接受的盐。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述钙调蛋白拮抗剂选自苯氧苄胺、哌唑嗪、特拉唑嗪、多沙唑嗪、坦索罗辛、氯丙嗪、卡米达佐、E6小檗胺、CGS 9343B、三氟拉嗪、氟奋乃静、环孢霉素、雷帕霉素、FK506、A7、J8、W-5、W-7、W-13、氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦和粉防乙碱。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂选自2-APB、钌红、柠檬醛、RN9893、RN1734以及以上的药学上可接受的衍生物或盐。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述钙调蛋白拮抗剂是钙调蛋白结合肽。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述钙调蛋白结合肽由下式表示：
X1RP–间隔子–RX1X2
其中X1是带正电荷的氨基酸诸如精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)；X2是带正电荷的氨基酸诸如精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸，或者没有氨基酸；以及间隔子包含约8-12个氨基酸残基。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述肽选自：
KRPMNAFIVWSRDQRRK    (SEQ ID NO.l)、
KRPMNAFMVWSRGQRRK    (SEQ ID NO.2)、
KRPMNAFMVWSRAQRRK    (SEQ ID NO.3)、
KRPMNAFMVWSQIERRK    (SEQ ID NO.4)、
KRPMNAFMVWSKIERRK    (SEQ ID NO.5)、
KRPMNAFMVWSQHERRK    (SEQ ID NO.6)、
KRPMNAFMVWAKDERRK    (SEQ ID NO.7)、
KRPMNAFMVWAQAARRK    (SEQ ID NO.8)、
RRPMNAFMVWAKDERKR    (SEQ ID NO.9)、
KRPMNAFMVWSSAQRR(SEQ ID NO.10)和KRPMNAFMVWARIHR(SEQ ID NO.11)。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述肽被修饰以并入能够稳定、保护或促进所述肽递送至靶部位的一个或多个基团。
11.如权利要求1所述的方法，其中将所述药剂与药学上可接受的载体联合给予所述哺乳动物。
12.如权利要求1所述的方法，其中以约1μg-l00mg的剂量范围给予所述药剂。
13.如权利要求1所述的方法，其中将所述药剂与能够调节SOX9表达或活性的一种或多种其他药剂联合给药。
14.钙调蛋白结合肽，其由下式表示：
X1RP–间隔子–RX1X2
其中X1是带正电荷的氨基酸诸如精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)；X2是带正电荷的氨基酸诸如精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸，或者没有氨基酸；以及间隔子包含约8-12个氨基酸残基。
15.如权利要求14所述的肽，其选自：
KRPMNAFIVWSRDQRRK    (SEQ ID NO.l)、
KRPMNAFMVWSRGQRRK    (SEQ ID NO.2)、
KRPMNAFMVWSRAQRRK    (SEQ ID NO.3)、
KRPMNAFMVWSQIERRK    (SEQ ID NO.4)、
KRPMNAFMVWSKIERRK    (SEQ ID NO.5)、
KRPMNAFMVWSQHERRK    (SEQ ID NO.6)、
KRPMNAFMVWAKDERRK    (SEQ ID NO.7)、
KRPMNAFMVWAQAARRK    (SEQ ID NO.8)、
RRPMNAFMVWAKDERKR    (SEQ ID NO.9)、
KRPMNAFMVWSSAQRR(SEQ ID NO.10)和KRPMNAFMVWARIHR(SEQ ID NO.11)。
16.如权利要求14所述的肽，其被修饰以并入能够稳定、保护或促进所述肽递送至靶部位的一个或多个基团。
17.如权利要求16所述的肽，其被修饰以在其内部位点或在其末端并入保护基团。
18.如权利要求16所述的肽，其被修饰以包括能够促进向靶部位递送、选自TAT肽、MPG肽、Wr-T和Pep-1肽的肽。
19.组合物，其包含权利要求14所述的肽。
20.制品，其包含包装和组合物，所述组合物包含钙调蛋白拮抗剂、钙调蛋白结合蛋白和瞬时受体电位(TRP)通道抑制剂中的至少一种，其中所述包装被标记以表明所述组合物用于治疗与蛋白聚糖生产或调节有关的病症。
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