CN105420369B - 一种颅内动脉瘤诊治靶点及其应用 - Google Patents

一种颅内动脉瘤诊治靶点及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种颅内动脉瘤诊治靶点及其应用。发明人基于高通量测序结果，挑选出候选基因HAPLN1，RT‑PCR验证结果证实了HAPLN1 mRNA在颅内动脉瘤组中高表达，干扰实验显示抑制HAPLN1的表达能够大大提高EPCs的迁移能力。本发明提供了颅内动脉瘤的潜在的治疗新靶点，具有重要的临床应用价值。

Description

一种颅内动脉瘤诊治靶点及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤标志物，具体涉及一种颅内动脉瘤诊治靶点及其应用，更具体的涉及HAPLN1基因及其表达产物在诊治颅内动脉瘤中的应用。
背景技术
颅内动脉瘤(intracranial aneurysm，IA)的形成病因和发病机制比较复杂，对IA的病因和形成机制的研究一直是国内外脑血管疾病研究的重点和热点领域。通常认为IA的形成、发展和破裂是由遗传、吸烟、年龄、环境、动脉粥样硬化、高血压和高血脂以及血流动力学改变等多重因素造成的。随着对其研究的不断深入，人们己经逐渐认识到血流动力学因素在IA的发生、发展和破裂过程中起着非常重要的作用。IA通常多发生在willis动脉环以及颅内动脉血管分叉处或血管弯曲部位，血液流经此处时形成冲击流等复杂流型使血管内皮细胞及其连接受损，炎症细胞和炎性物质等更易进入内皮下，引起的血管壁炎症和血管壁重构失调，研究显示持续的血流动力学变化会导致血管的病理重构，包括内弹力层的降解、平滑肌细胞和内皮细胞的缺失、细胞增殖减少等。血流动力学因素改变所导致的血管内皮损伤以及接下来出现的血管壁炎性细胞浸润、蛋白酶降解所致的血管壁病理性重构被认为是IA形成过程中的主要病理生理环节。无论是通过观察人的颅内动脉瘤壁分子病理学的研究还是从对IA形成过程中的实验研究均证明了血管内皮损伤是IA形成过程中的基本环节。但具体哪些基因参与其中仍有待研究。
发明人对5例颅内动脉瘤病例组和3例对照组组织样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，在差异表达明显的基因中挑选出高表达的候选基因HAPLN1，已有研究表明HAPLN1和假性软骨发育不全有关，但并没有研究揭示其与颅内动脉瘤的关系，发明人进行了分子验证，证实了HAPLN1在颅内动脉瘤组中高表达。本发明提供了新的颅内动脉瘤的监测治疗靶点，具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种颅内动脉瘤诊断制剂，所述颅内动脉瘤诊断制剂检测HAPLN1基因和/或HAPLN1基因的表达产物。
进一步，所述颅内动脉瘤诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测颅内动脉瘤组织中HAPLN1基因的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增HAPLN1基因的引物；所述的基因芯片中包括与HAPLN1基因的核酸序列杂交的探针，更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测HAPLN1基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。
进一步，直接检测外周血和/或组织中HAPLN1基因和/或基因的表达产物。
进一步，所述的颅内动脉瘤的诊断制剂采用免疫方法检测颅内动脉瘤外周血和/或组织中HAPLN1基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。
进一步，所述检测HAPLN1表达产物的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的HAPLN1单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被HAPLN1单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
进一步，所述检测HAPLN1蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的HAPLN1单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗HAPLN1单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
本发明的目的在于提供上述颅内动脉瘤诊断制剂在制备颅内动脉瘤诊断工具中的应用。
本发明的目的在于提供一种治疗颅内动脉瘤的制剂，所述制剂中含有抑制HAPLN1基因的转录或表达的试剂或化合物。优选的，制剂中含有药剂学可接受的载体。
进一步，所述治疗颅内动脉瘤的制剂中含有激活HAPLN1的抑制基因、激活抑制HAPLN1表达的蛋白、导入抑制HAPLN1转录或表达的siRNA、激活促进HAPLN1mRNA降解的microRNA、导入促进HAPLN1蛋白降解的分子、抑制 促进HAPLN1表达的因子及蛋白的表达。
优选的，所述治疗颅内动脉瘤的制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。更优选的，所述治疗颅内动脉瘤的制剂含有siRNA序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
本发明的目的在于提供上述治疗颅内动脉瘤的制剂在制备颅内动脉瘤治疗药物或试剂中的应用。
本发明的目的在于提供上述治疗颅内动脉瘤的制剂在制备增强EPCs活性制剂中的应用。
为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因HAPLN1基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了HAPLN1基因与颅内动脉瘤的关系：HAPLN1基因在外周血中高表达，与颅内动脉瘤具有很好的相关性，可用于制备颅内动脉瘤辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。
RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果 清晰。
基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
本发明的目的在于提供一种检测颅内动脉瘤的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测基因HAPLN1，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。
进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。所述内参为GAPDH。
所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
本发明目的是提供了一种颅内动脉瘤蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测HAPLN1蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
本发明目的是提供了一种检测颅内动脉瘤的基因芯片，所述的基因芯片包括与HAPLN1基因的核酸序列杂交的探针。
本发明的药剂学上可接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methylcellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。
本发明的药剂学可接受的载体除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制 剂详细记载于雷明登氏药学全书。
本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。
本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。
附图说明
图1干扰后各组HAPLN1mRNA相对表达量；图中B组：颅内动脉瘤患者组分离的内皮祖细胞；C1组：B组+转染脂质体；C2组：B组+转染非特异性的siRNA；S1组：B组+转染特异性的HAPLN1-siRNA1，S2组：B组+转染特异性的HAPLN1-siRNA2，S3组：B组+转染特异性的HAPLN1-siRNA3。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1病例的收集
所有组织标本均来医院神经外科2012年10月至2014年5月经DSA确诊的颅内动脉瘤患者，并进行显微手术开颅治疗。其中动脉瘤组织样本系显微手术中 切除的动脉瘤壁组织，对照的正常脑血管样本组织系同一时期，脑肿瘤开颅病人的颞浅动脉(STA)和/或脑膜中动脉(MMA)。为尽量减小样本间差异，选取的所有动脉瘤组织样本均系囊状动脉瘤。获取的样本组织立即置于液氮罐中。
实施例2提取样本中的总RNA
1)动脉瘤(正常对照血管)组织小块放在培养皿中，加入1ml Trizol，用眼科剪剪碎后，移至匀浆器中匀浆；
2)匀浆完成后，取出匀浆液置于EP管中，定容至lml，可冻存与-70℃；
3)15-30℃放置5min，加入200μl氯仿，剧烈震荡15sec，15-30℃放置10min；
4)2-8℃，低于12000g/min离心l 0min，弃上清，加入lml 75％乙醇，低于7500g/min离心5min，弃上清后，点离；
5)待沉淀干燥(呈半透明状，不用完全干燥，否则会降低稳定性)，用RNase-freewater 55-60℃溶解，冻存于-70℃。
实施例3高通量测序及分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组测序。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。样品合格后送往测序公司进行测序，测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序公司提供数据分析的结果结合文献我们筛选了差异表达基因HAPLN1。
实施例4颅内动脉瘤患者组及对照组HAPLN1基因表达情况
一、材料和方法
1、材料
选取23例颅内动脉瘤患者动脉瘤壁组织及11例对照正常脑血管样本组织，对其进行分组及编号。样本收集标准见实施例1。
2、方法
2.1RNA的提取
见实施例2。
2.2逆转录合成cDNA
采用 III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.3Real-Time PCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_001884.3(HAPLN1)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
HAPLN1基因扩增引物：
上游引物：5’-TGCTTCTCTGGTCATCAC-3’(SEQ ID NO.9)
下游引物：5’-ATCATCTTCTAATCCTTCAATCAC-3’(SEQ ID NO.10)
扩增长度82bp。
内参基因扩增引物：
上游引物：5’-CGCCTGGAGAAAGCTGCTA-3’(SEQ ID NO.11)
下游引物：5’-ACGACCTGGTCCTCGGTGTA-3’(SEQ ID NO.12)
扩增长度104bp。
操作过程如下：
(一)反应体系：用Power Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增：2×mix 10μl；10uM的上游引物和下游引物各0.5μl；模板2μl，加入灭菌蒸馏水补平至25μl。
扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，58℃45sec)×35个循环。
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(三)样品RealTimePCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
二、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较HAPLN1基因在颅内动脉瘤组和对照组中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中HAPLN1基因在颅内动脉瘤组中的表达水平为对照组的约3.5倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析HAPLN1基因在颅内动脉瘤患者中高表达的结果。
实施例5循环血EPCs的体外培养
一、材料
颅内动脉瘤组和对照组各选择5例，抽取静脉血约20mL。颅内动脉的结构不同于颅外动脉，其由内皮细胞构成的内膜、平滑肌细胞构成的中膜和胶原纤维构成的外膜3层结构组成。循环血内皮祖细胞(EPCs)可参与出生后血管再生和内皮损伤后的内皮修改，在颅内动脉瘤的发生和发展过程中起着十分重要的作用。
二、方法
1.人外周血内皮祖细胞的体外分离及培养
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：
(1)取人淋巴细胞分离液6mL，4℃600rpm，离心10min，备用；
(2)将采集的抗凝血20mL与0.01M磷酸盐(1×PBS)缓冲液2mL按照1:1混匀。
(3)将步骤2的混匀液缓慢加入到步骤1得到的人淋巴细胞分离液中(二者体积比例为2:3，血样与淋巴细胞分离液分层)；室温，1500rpm，离心20min；
(4)离心后标本分层明显(分四层)，用取样枪吸取中间白膜层(单个核细胞层)，置于离心管，加入2mLl×PBS缓冲液；在室温以1500rpm离心10min，进行第一次洗涤；
(6)弃上清，加入2mL1×PBS缓冲液，用取样枪轻吹打，充分混匀，在20℃以1200rpm离心10min，进行第二次洗涤；
(7)弃上清，加入内皮祖细胞培养液(EGM)，吹打均匀，重悬细胞，细胞计数，台盼蓝染色鉴定细胞活力(每孔1.5-2mL)；
(8)调整细胞密度，按照1×106/cm2，接种入预先包被FN的6孔细胞培养板，置于37℃5％CO2培养箱中培养。
2.细胞活力检测
末次离心后，弃上清，加入EGM培养基，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼蓝染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。计数200个单核细胞，计算活细胞的百分率(活细胞百分率＝活细胞数/总细胞数×100％)。
3.内皮祖细胞的培养及观察
培养至第4天时，换液去除未贴壁细胞。以后每3天换液一次，贴壁生长的细胞继续培养至14天。每日在倒置显微镜下观察细胞生长形态学变化。
4.内皮组细胞的鉴定
EPCs具有摄取acLDL和结合UEA-1的特性，我们用经培养7天后的细胞进行这步实验，通过这步实验，可以进一步鉴定培养的EPCs的内皮特性。具体如下：
(1)贴壁细胞与Dil-acLDL(2.4μg/ml)37℃孵育1小时以检测EPCs对acLDL的摄取；
(2)2％多聚甲醛室温固定10分钟后PBS洗净；
(3)将FITC-UEA-1(10μg/ml)加入上述标本37℃孵育1小时；
(4)荧光显微镜鉴定acLDL和UEA-1双染色阳性细胞的阳性率及数量。
三、实验结果
外周血经密度梯度离心分离后，可清楚观察到介于分离液和PBS液面之间的单个核细胞层，呈白色云雾状。密度梯度离心获取的单个核细胞经台盼蓝染色后活细胞百分率在96.13±2.17％。单个核细胞在纤维连接蛋白包被的培养皿中培7天后梭型细胞较前增多，形成细胞团，可见部分集落形成。同时培养7天后荧光显微镜鉴定acLDL和UEA-1双染色阳性细胞的阳性率>88％。
实施例6RNAi干扰HAPLN1表达及对内皮祖细胞的影响
一、材料
实施例5培养的内皮组细胞。
siRNA设计与合成依据在线设计软件，根据基因序列参照NCBI:NM_001884.3(HAPLN1)，设计相应的siRNA，具体序列见表1。设计后送往合成公司合成。
表1siRNA序列表
二、实验方法
(一)RNA干扰抑制内皮祖细胞HAPLN1基因的表达
1.细胞分组
A组：对照组分离的内皮祖细胞；B组：颅内动脉瘤患者组分离的内皮祖细胞；C1组：B组+转染脂质体；C2组：B组+转染非特异性的siRNA；S1组：B组+转染特异性的HAPLN1-siRNA1，S2组：B组+转染特异性的HAPLN1-siRNA2，S3组：B组+转染特异性的HAPLN1-siRNA3。
2.转染
按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent提供的步骤进行。
(1)内皮祖细胞同步化：转染前一天，取内皮祖细胞进行试验，使所有内皮祖细胞处于同步状态，减少试验干扰；
(2)5×104细胞接种在6孔板上，这些用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70％；
(3)准备siRNA-LipofectamineTM 2000复合物:
a.以250u1Opti-MEM稀释5ul LipofectamineTM 2000，轻轻混匀，室温下 孵育5分钟。
b.实验各组分别取7.5u1siRNA加入250u1Opti-MEM I中进行稀释，并轻轻摇动将其混匀；
c.孵育5分钟后，将稀释的siRNA和LipofectamineTM 2000混合后在室温下孵育20分钟。
(4)在培养板中的每个孔中都加入细胞、培养基及siRNA-LipofectamineTM2000复合物。然后轻轻摇动培养板，使他们充分混合；
(5)放置在37℃，CO2培养箱内孵育48小时，在荧光显微镜下观察细胞转染数量，检测转染效率；
(6)转染效率为荧光镜与光镜视野中的细胞数量的比值，细胞的转染效率均达到90％以上，方可以进行后续的实验。计算公式如下：
转染效率＝发荧光细胞的数量/相同视野下的细胞数量×100％
3.应用Real-time PCR方法检测转染前后HAPLN1基因表达的变化
(1)标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的内皮祖细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-100copies/ul的DNA模板，分别加入HAPLN1基因引物和内参引物，配制25u1反应体系，使用Real-time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到HAPLN1和内参的标准曲线。
(2)Real-time PCR方法检测转染前后HAPLN1基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进HAPLN1和内参的Real-timePCR反应，实验重复三次。
(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
(二)内皮组细胞迁移能力测定
使用的聚碳酸酯膜直径为6.5mm，孔径8.0μm。实验用Transwell进行EPC迁移能力测定，将细胞悬液收集于离心管中，以800rpm离心5min，弃上清，用PBS洗2遍，用含0.05％BSA的无血清培养基重悬，计数，调制成2×104EPCs/50μl悬液，0.05％BSA的作用为维持渗透压。分别将50μl调制好的细胞悬液注入到Transwell培养皿的上室中，将VEGF(50ng/ml)加入到含血清培养液，分别将200μl混合液加入到Transwell培养皿的下室。在37℃5％CO2细胞培养箱培养24h，弃去上室液体，小心取出上室，湿棉签拭去滤膜上面的未穿过膜细胞，用Hoechst33258复燃细胞核，在荧光显微镜下镜检，每个小室随机选择5个显微镜视野(×200)计数迁移到低层的细胞。
三、实验结果
分别观察各组siRNA转染内皮祖细胞，结果显示在大量内皮祖细胞内发现绿色荧光，证明内皮祖细胞内已经得到了siRNA的转染，然后在荧光镜和光镜下观察内皮祖细胞数量，进行转染效率的检测，结果显示转染率均达到90％以上。
Real-time PCR结果显示，转染脂质体的C1组和转让非特异性的siRNA的C2组对内皮祖细胞中HAPLN1基因表达无明显抑制作用，和B组对照组无统计学差异，转染的3个HAPLN1基因siRNA组都对内皮祖细胞中HAPLN1基因表达起到一定抑制作用，其中HAPLN1-siRNA1和HAPLN1-siRNA3抑制效果最明显，抑制率达67％和54％，具体见图1。
Transwell实验显示，与对照组分离的内皮祖细胞(A组，每200×视野，36.3±4.4)相比颅内动脉瘤患者组分离的内皮祖细胞(B组，每200×视野，20.1±2.5)迁移能力明显下降，干扰后迁移能力得到提高，其中S1组(干扰RNA为HAPLN1-siRNA1)迁移能力提高了近25％。

Claims (11)

1.一种颅内动脉瘤诊断制剂在制备颅内动脉瘤诊断工具中的应用，其特征在于，颅内动脉瘤诊断制剂为检测HAPLN1基因和/或基因的表达产物的诊断制剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，颅内动脉瘤诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测颅内动脉瘤组织中HAPLN1基因的表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增HAPLN1基因的引物；基因芯片中包括与HAPLN1基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测HAPLN1基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ IDNO.10。
5.治疗颅内动脉瘤的制剂在制备颅内动脉瘤治疗药物或试剂中的应用，其特征在于，制剂中含有抑制HAPLN1基因的转录或表达的试剂或化合物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，制剂中含有药剂学可接受的载体。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，治疗颅内动脉瘤的制剂中含有激活HAPLN1的抑制基因、激活抑制HAPLN1表达的蛋白、导入抑制HAPLN1转录或表达的siRNA、激活促进HAPLN1mRNA降解的microRNA、导入促进HAPLN1蛋白降解的分子、抑制促进HAPLN1表达的因子及蛋白的表达。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，治疗颅内动脉瘤的制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
9.治疗颅内动脉瘤的制剂在制备增强内皮祖细胞活性制剂中的应用，其特征在于，制剂中含有抑制HAPLN1基因的转录或表达的试剂或化合物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，治疗颅内动脉瘤的制剂中含有激活HAPLN1的抑制基因、激活抑制HAPLN1表达的蛋白、导入抑制HAPLN1转录或表达的siRNA、激活促进HAPLN1mRNA降解的microRNA、导入促进HAPLN1蛋白降解的分子、抑制促进HAPLN1表达的因子及蛋白的表达。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，治疗颅内动脉瘤的制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
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