CN104404146B - 一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法及应用 - Google Patents

一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法，构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，采用Rat LncRNA Array v2.0芯片筛选出心肌细胞缺氧再复氧过程中差异表达的lncRNA；构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型和langendorff离体心脏缺血再灌注模型，采用实时定量PCR验证芯片的结果。并采用干扰lncRNA使其表达发生下调继而通过调控心肌细胞内自噬水平从而达到保护心肌缺氧再复氧损伤的目的。因此提出了通过调控lncRNA保护心肌细胞缺氧再复氧损伤，对进一步研究心肌缺血再灌注相关的lncRNA在预测以及防治心肌梗死的具有重要的意义。

Description

一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法，本发明还涉及一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的应用。
背景技术
冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是心血管最常见疾病，急性心肌梗死是人类致死的主要原因之一。再灌注治疗可以挽救缺血心肌，但也能使可逆性缺血损伤转化为不可逆性再灌注损伤。如何降低心肌细胞损伤程度，改善预后已成为当前心血管疾病领域的一个重要课题。缺血再灌注造成心肌细胞损伤的机制尚未完全阐明，目前公认的机制可能为：细胞线粒体功能失衡、细胞内钙离子超载、大量活性氧自由基产生等，最终导致细胞死亡。
在人类基因组中，大约有98％转录体并不编码蛋白质，而这种非编码RNA却在细胞生长、分化和人类疾病中扮演着重要的角色。非编码RNA可分为两大种类:短链非编码RNA(包括siRNA、miRNA和piRNA)以及长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)。长链非编码RNA是一类长度大于200nt的核糖核酸序列，它本身并不编码蛋白质，但能在多种层面上包括表观遗传水平、转录水平和转录后水平来调控基因的表达，广泛参与机体的生理和病理过程。
因此研究心肌缺血再灌注过程中lncRNAs的变化与作用有助于我们进一步的认识心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程，为我们临床预防和治疗可逆性缺血损伤提供新的思路，也为新型的药物开发与应用提供新的作用靶点。然而到底有哪些lncRNAs参与心肌缺血再灌注损伤的过程中并不清楚，而且这些lncRNA所行使的功能更无从了解。
发明内容
本发明的目的是提供一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法，填补了该项领域的空白。
本发明的另一目的是提供一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的应用。
本发明所采用的第一技术方案是，一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，采用Rat LncRNAArray v2.0芯片筛选出心肌细胞缺氧再复氧过程中差异表达的lncRNA；
步骤2、构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型和langendorff离体心脏缺血再灌注模型，采用实时定量PCR验证芯片的结果。
本发明的特点还在于，
步骤1构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，采用Rat LncRNAArray v2.0芯片筛选出心肌细胞缺氧再复氧过程中差异表达的lncRNA的具体步骤为：
步骤1.1、心肌细胞缺氧再复氧处理及正常细胞处理：将心肌细胞株H9c2置于无糖DMEM无FBS的细胞培养液中，分别放入低氧培养箱培养1小时，然后再将两组细胞放入常氧培养箱进行复氧2小时，建立心肌细胞缺氧再复氧损伤的心肌细胞模型，正常组细胞在常氧培养箱中培养3小时；其中，低氧培养箱为<1％O2、5％CO2、约95％N2；常氧培养箱为21％O2、5％CO2、74％N2；
步骤1.2、直接在培养盘中加入1ml TRIZOL试剂裂解细胞，裂解时用枪吸打几次；在TRIZOL中加入0.2ml氯仿，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；加入上述中上层水相等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，然后4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；在上述沉淀中加入质量分数为75％的乙醇1ml，颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清；再次4℃下12000rpm离心2分钟；弃上清，室温下干燥1～2分钟，加20μl无RNA酶水溶解，得到RNA提取液，-80℃保存备用；提取上述两组细胞总RNA，用Agilent公司的快速Amp标记试剂盒标记RNA，与芯片上的探针杂交；
步骤1.3、收集芯片的数据，用Agilent GeneSpring GX v12.0软件分析数据，筛选出变化倍数大于1.5倍，P值小于0.05的差异表达的lncRNA；
步骤1.4、采用GO分析和Pathway分析挑选出与心肌细胞凋亡和自噬过程有着密切关系的lncRNA，即BC089936；BC168700；NR_001567；NR_002154；NR_026689；NR_002597，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示。
步骤2构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型和langendorff离体心脏缺血再灌注模型，采用实时定量PCR验证芯片的结果的具体步骤为：
步骤2.1、构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型：将心肌细胞株H9c2置于无糖DMEM无FBS的细胞培养液中，分别放入低氧培养箱培养1小时，然后再将两组细胞放入常氧培养箱进行复氧2小时，建立心肌细胞缺氧再复氧损伤的心肌细胞模型，正常组细胞在常氧培养箱中培养3小时；其中，低氧培养箱为<1％O2、5％CO2、约95％N2；常氧培养箱为21％O2、5％CO2、74％N2；
步骤2.2、构建langendorff离体心脏缺血再灌注模型：取280-300g的SD雄性大鼠麻醉后开胸腔取心脏，将心脏的主动脉与仪器的灌流针口连接后灌注K-H液，待心脏复博后将自制心室内压球囊测压管送入左心室，此后稳定20分钟，心律齐，心率≥220次/分，且左室收缩压≥60mmHg再进行后续实验；其中对照组持续灌流150分钟，缺血再灌注组全心停灌30分钟后再灌120分钟，实验结束后收集心脏组织样本，放-80℃备用；
步骤2.3、将步骤2.1中经缺氧再复氧处理后的细胞中加入1ml TRIZOL试剂裂解，裂解时用枪吸打几次；每50-100mg组织样品，加入1ml的TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆；所加样品体积不能超过匀浆此样品所使用的TRIZOL试剂体积的10％；在上述的TRIZOL中加入0.2ml氯仿，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；加入与上述上层水相等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，然后4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；在上述沉淀中加入质量分数为75％的乙醇1ml，颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清；再次4℃下12000rpm离心2分钟；弃上清，室温下干燥1～2分钟，加20μl无RNA酶水溶解，得到RNA提取液，-80℃保存备用；采用RNA抽提试剂提取正常大鼠心肌组织以及缺血再灌注处理后大鼠心肌组织总的RNA，用逆转录试剂对RNA提取液进行逆转录反应得到cDNA；
步骤2.4、对步骤2.3中的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测扩增结果，结果表明与心肌细胞凋亡和自噬过程有着密切关系的LncRNA为BC089936；BC168700；NR_001567；NR_002154；NR_026689；NR_002597。
BC089936的引物为：F:5’GGAAAGCTGTGGCGTGAT3'；R:5’AAGGTGGAAGAATGGGAGTT3’；所述BC168700的引物为：F:5’CAGAATGTGTGCTGCACTGT3’；R:5’GGTCACTTTAGGGTGGGTAT3’；所述NR_001567的引物为：F:5’GCTGTGGGTTCTGTTCTTTTG3’；R:5’CTACGCTGACATTTTTTGAGGTT3’；所述NR_002154的引物为：F:5’AGGGGAGGGGGAAAGTAGAA3’；R:5’CACATGGAAGCCAGTGGTCA3’；所述AF030086的引物为：F:5’TTGGGTGGAGTTTGGTCGG3’；R:5’AAGAGGGCGTTGCTGGGAA3’；所述MRAK035284的引物为：F:5’CCTGTAACTTCTCTGTCTGGA3’；R:5’GGAAACTTGTGTCTCTCTGGT3’；所述NR_026689的引物为：F:5’CCAACAGAACCCAGAATCCTAA3’；R:5’AGCAATGGCTTCATCCCTC3’；所述NR_022597的引物为：F:5’TGTGAGAGGTTGGGGATTTAG3’；R:5’CCATCCACACTTGCGTCA3’。
本发明所采用的第二技术方案是，一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA在预测和防治心肌梗死的应用。
本发明的有益效果是：本发明证实了心肌缺血再灌注过程中6条lncRNA的表达量发生了上调，经过生物信息学的分析发现其中1条lncRNA与心肌细胞的自噬有着密切的关系并且下调该lncRNA后可以起到保护心肌细胞缺氧再复氧损伤，这为我们研究心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程提供一种新的思路，并为心肌缺血再灌注损伤的预测和防治提供新的分子依据或治疗靶点。
附图说明
图1是实施例1的两组细胞样本的芯片杂交检测图；
图2是实施例2的细胞水平的心肌缺氧再复氧6条lncRNA的实时定量PCR验证图；
图3是实施例2的整体水平的心肌缺血再灌注6条lncRNA的实时定量PCR验证图；
图4是实施例3中的四组细胞样本的细胞活性检测图；
图5是实施例3中的四组细胞样本的Western blot检测图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，采用Rat LncRNAArray v2.0(4x44K,Arraystar)芯片筛选出心肌细胞缺氧再复氧过程中差异表达的lncRNA步骤如下：
a.心肌细胞缺氧再复氧处理及正常细胞处理：将心肌细胞株(H9c2)置于无糖DMEM无FBS的细胞培养液中，分别放入低氧培养箱(<1％O2、5％CO2、约95％N2)培养1小时，然后再将两组细胞放入常氧培养箱(21％O2、5％CO2、74％N2)进行复氧2小时，建立心肌细胞缺氧再复氧损伤的心肌细胞模型，正常组细胞在常氧培养箱((21％O2、5％CO2、74％N2)中培养3小时。
b.单层贴壁细胞匀浆：直接在培养盘中加入1ml TRIZOL试剂裂解细胞，裂解时用枪吸打几次。
c.在步骤b的TRIZOL中加入0.2ml氯仿，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；
d、异丙醇沉淀：加入与步骤c中上层水相等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，然后4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；
e、乙醇洗涤：在步骤d的沉淀中加入质量分数为75％的乙醇1ml，颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清；
f、干燥RNA：上一步弃上清后，再次4℃下12000rpm离心2分钟；弃上清，室温下干燥1～2分钟，加20μl无RNA酶水溶解，得到RNA提取液，-80℃保存备用；
g.提取上述两组细胞总RNA，用Agilent公司的快速Amp标记试剂盒标记RNA，结果见表1：A1、A2、A3(生物学三重复)代表正常组，B1、B2、B3(生物学三重复)代表缺氧再复氧组，上述各组的RNA与芯片上的探针杂交，结果如图1所示：A、B、C图表示正常组的细胞RNA跟芯片杂交的示意图，D、E、F图表示缺氧再复氧组细胞RNA跟芯片杂交的示意图。
h.收集芯片的数据，用Agilent GeneSpring GX v12.0软件分析数据，筛选出变化倍数大于1.5倍，P值小于0.05的差异表达的lncRNA。
表1实施例1的两组与基因芯片杂交的RNA信息表
i.制作mRNA芯片，根据mRNA芯片的结果采用GO分析和Pathway分析挑选出了6条我们与心肌细胞凋亡和自噬密切相关的lncRNA(BC089936；BC168700；NR_001567；NR_002154；NR_026689；NR_002597，均较正常组上调的lncRNA)(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.6)用以后续验证实验。
以上所述的心肌细胞缺氧再复氧条件能很好的模拟临床上心肌缺血再灌注的病理过程。此外从表1中可以看出，上述的RNA提取方法中RNA稳定性高不易降解，实验的可重复性好，因此lncNRA芯片筛选的结果可信度高。
实施例2
构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型和langendorff离体心脏缺血再灌注模型，采用实时定量PCR验证芯片的结果。
a.构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，同实施例1中的a中所述。
b.构建langendorff离体心脏缺血再灌注模型：应用随机数字表法将6只雄性SD大鼠(SD大鼠体重为280-330g之间)随机分为2组取大鼠，称重，按给予10％水合氯醛腹腔注射麻醉，动物充分麻醉后，置于动物台上并固定。开胸暴露主动脉弓，轻提主动脉与无名动脉汇合处，从主动脉弓以下剪断主动脉，提着主动脉断端，剪下完整的心脏，迅速放入预备好的K-H液，提前将蠕动泵调为7.5ml/min的流速，排净管路中气体，以免空气挤入主动脉，造成空气栓塞，立刻用眼科镊夹持主动脉管壁将灌注管道插入主动脉，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，4号线系线固定，逆行灌注正式开始将右心耳剪开一个小口以便灌流液流出。建立标准的离体心脏灌注模型后，保持恒定状态:恒温37℃，恒流(实时测冠脉流量为7.5ml/min)混合气(95％O2，5％CO2)持续对灌流液进行鼓泡式氧合，待心脏复跳且搏动良好，心律齐，剪开左心耳，经左心耳破孔二尖瓣，将自制心室内压球囊测压管送入左心室，测压导管通过压力感受装置连接多导生理记录仪，记录全程心率(heart rate，HR)左心室舒张终末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、收缩终末压(leftventricular end-systolic pressure，LVESP)等从而计算出左心室发展压(leftventricular developed pressure，LVDP)左室内压下降最大速率(-dp/dtmax)左室内压上升最大速率(+dp/dtmax)等心功能指标。待心脏收缩舒张功能恢复(约20分钟的稳定期)，心律齐，记录下正常指标，左心室舒张终末压(5-10mmHg)作为基线，实验入组标准:心律齐，心率(≥220次/分，且左室收缩压(LVSP≥60mmHg)。其中对照组持续灌流170分钟，缺血再灌注组稳定灌注20分钟后全心停灌30分钟，最后再灌120分钟，实验结束后收集心脏组织样本，放-80℃备用。
c.单层贴壁细胞匀浆:将步骤a中经缺氧再复氧处理后的细胞中加入1mlTRIZOL试剂裂解，裂解时用枪吸打几次。
d.组织样本匀浆:每50-100mg组织样品，加入1ml的TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆。所加样品体积不能超过匀浆此样品所使用的TRIZOL试剂体积的10％。
e.在步骤c和d的TRIZOL中加入0.2ml氯仿，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；
f、异丙醇沉淀：加入与步骤e中上层水相等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，然后4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；
g、乙醇洗涤：在步骤f的沉淀中加入质量分数为75％的乙醇1ml，颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清；
h、干燥RNA：上一步弃上清后，再次4℃下12000rpm离心2分钟；弃上清，室温下干燥1～2分钟，加20μl无RNA酶水溶解，得到RNA提取液，-80℃保存备用；
i、RNA逆转录：用逆转录试剂对步骤f中的RNA提取液进行逆转录反应得到cDNA溶液，置-20℃保存备用；
j、PCR检测：对步骤i的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增上下游引物为lncRNA特异性扩增上下游引物或GAPDH扩增上下游引物(如表2所示)，再用荧光定量PCR仪检测。如图2和图3所示：在缺氧再复氧模型中，6条lncRNA(BC089936；BC168700；NR_001567；NR_002154；NR_026689；NR_002597)均较正常组上调，结果跟芯片结果一致。此外，上述b中所述的langendorff离体心脏缺血再灌注模型的条件很好的模拟了临床上心肌缺血再灌注损伤，并且可以排除体内其他神经体液因素的干扰。并且在此模型上，即整体水平，这6条LncRNA(BC089936；BC168700；NR_001567；NR_002154；NR_026689；NR_002597)也均较正常组上调，结果与芯片结果和体外缺氧再复氧模型结果一致，更近一步证实了这6条LncRNA在心肌缺血再灌注过程中中发生了改变，可能参与这其中的病理生理过程，为后续的功能研究提供了线索和思路。
表2实时定量PCR使用引物列表
实施例3
(1)采用siRNA干扰lncRNA(NR_002154)，观察体外心肌细胞缺氧再复氧处理后的变化，采用实时定量PCR观察干扰的效果，CCK-8检测细胞活性，WB检测自噬相关指标LC3B的变化情况
a.siRNA干扰心肌细胞内lncRNA(NR_002154)，挑选出最合适的一条siRNA用于后续实验：合成针对lncRNA(NR_002154)的小干扰片段(3条)，序列1：正义链：5'GCAUCCUGGUGCUAAGUUA dTdT 3'，反义链：3'dTdT CGUAGGACCACGAUUCAAU 5'；序列2：正义链：5'GCGCCAUUGCUGCAAAUUA dTdT 3'，反义链：3'dTdT CGCGGUAACGACGUUUAAU 5'；序列3：正义链：5'GCAGGACACAGUUAAGAAU dTdT 3'反义链：3'dTdT CGUCCUGUGUCAAUUCUUA 5'。将H9c2细胞铺于6孔板中，当细胞密度达到60％开始转染siRNA。对于每个转染样本均按照如下步骤准备：
1)稀释siRNA：用50μl 1×riboFECTTM CP Buffer稀释1.25μl 20μM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5分钟。
2)混合液制备：加入5μl riboFECTTM CP Reagent,轻轻吹打混匀，室温孵育15分钟。
3)将riboFECTTM CP混合液加入443.75μl细胞培养基中，轻轻混匀。
4)将培养板置于常氧培养箱里培养48小时，应用实施例2中的c至j步骤所述检测lncRNA(NR_002154)干扰效率最佳的一组。根据实时定量PCR的结果siRNA干扰序列1的干扰效果最佳，故用于后续的实验
b.干扰后的心肌细胞经过缺氧再复氧造模后用实时定量PCR检测干扰的效果：实验分为：正常对照组；缺氧再复氧组；缺氧再复氧+siRNA NC组；缺氧再复氧+siRNA-1组；其中缺氧再复氧+siRNA NC组转染的序列作为转染实验的对照组。按照实施例3中a所述的步骤转染siRNA后，再按照实施例1中的a所述对这4组细胞进行缺氧再复氧处理，最后应用实施例2中的c至j步骤所述检测lncRNA(NR_002154)的表达量，验证干扰是否成功。
c.CCK-8检测siRNA干扰lncRNA(NR_002154)后细胞进过缺氧再复氧处理后的活性：按照施例3中的步骤转染细胞，再按照实施例1中的a所述对这4组细胞进行缺氧再复氧处理，最后使用CCK-8检测试剂观察效果。如图4所示：缺氧再复氧组较正常组活性明显降低，缺氧再复氧+siRNA NC组的活性较缺氧再复氧组无明显变化，然而缺氧再复氧+siRNA-1组中的细胞活性较缺氧再复氧组有明显的提高，证实干扰lncRNA(NR_002154)可以增加心肌细胞经缺氧再复氧损伤后的活性。
d.Western blot方法检测干扰lncRNA后自噬相关的指标LC3B的表达：按照施例3中的步骤转染细胞，再按照实施例1中的a所述对这4组细胞进行缺氧再复氧处理，最后采用Western blot方法检测各组细胞LC3B的表达情况，如图5所示：缺氧再复氧组较正常组活性LC3B的表达量明显增加，缺氧再复氧+siRNA NC组LC3B的表达量较缺氧再复氧组无明显变化，然而缺氧再复氧+siRNA-1组中LC3B的表达量较缺氧再复氧组有明显的下降，证实干扰lncRNA(NR_002154)可以增加心肌细胞经缺氧再复氧损伤后的活性的部分机制是通过调控细胞内自噬水平达到的。

Claims (1)

1.一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，采用Rat LncRNA Array v2.0芯片筛选出心肌细胞缺氧再复氧过程中差异表达的lncRNA；具体过程为：
步骤1.1、心肌细胞缺氧再复氧处理及正常细胞处理：将心肌细胞株H9c2置于无糖DMEM无FBS的细胞培养液中，分别放入低氧培养箱培养1小时，然后再将两组细胞放入常氧培养箱进行复氧2小时，建立心肌细胞缺氧再复氧损伤的心肌细胞模型，正常组细胞在常氧培养箱中培养3小时；其中，低氧培养箱为<1％O2、5％CO2、约95％N2；常氧培养箱为21％O2、5％CO2、74％N2；
步骤1.2、直接在培养盘中加入1ml TRIZOL试剂裂解细胞，裂解时用枪吸打几次；在TRIZOL中加入0.2ml氯仿，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；向所述上层水相中加入等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，然后4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；在上述沉淀中加入质量分数为75％的乙醇1ml，颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清；再次4℃下12000rpm离心2分钟；弃上清，室温下干燥1～2分钟，加20μl无RNA酶水溶解，得到RNA提取液，-80℃保存备用；提取上述两组细胞总RNA，用Agilent公司的快速Amp标记试剂盒标记RNA，与芯片上的探针杂交；
步骤1.3、收集芯片的数据，用Agilent GeneSpring GX v12.0软件分析数据，筛选出变化倍数大于1.5倍，P值小于0.05的差异表达的lncRNA；
步骤2、构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型和langendorff离体心脏缺血再灌注模型，采用实时定量PCR验证芯片的结果；具体过程为：
步骤2.1、构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型：将心肌细胞株H9c2置于无糖DMEM无FBS的细胞培养液中，分别放入低氧培养箱培养1小时，然后再将两组细胞放入常氧培养箱进行复氧2小时，建立心肌细胞缺氧再复氧损伤的心肌细胞模型，正常组细胞在常氧培养箱中培养3小时；其中，低氧培养箱为<1％O2、5％CO2、约95％N2；常氧培养箱为21％O2、5％CO2、74％N2；
步骤2.2、构建langendorff离体心脏缺血再灌注模型：将280-300g的SD雄性大鼠麻醉后开胸腔取出的心脏的主动脉与仪器的灌流针口连接后灌注K-H液，待心脏复博后将自制心室内压球囊测压管送入左心室，此后稳定20分钟，心律齐，心率≥220次/分，且左室收缩压≥60mmHg再进行后续实验；其中对照组持续灌流150分钟，缺血再灌注组全心停灌30分钟后再灌120分钟，实验结束后收集心脏组织样本，放-80℃备用；
步骤2.3、将步骤2.1中经缺氧再复氧处理后的细胞中加入1ml TRIZOL试剂裂解，裂解时用枪吸打几次；每50-100mg组织样品，加入1ml的TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆；
所加样品体积不能超过匀浆此样品所使用的TRIZOL试剂体积的10％；在上述的TRIZOL中加入0.2ml氯仿，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；加入与上述上层水相等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，然后4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；在上述沉淀中加入质量分数为75％的乙醇1ml，颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清；再次4℃下12000rpm离心2分钟；弃上清，室温下干燥1～2分钟，加20μl无RNA酶水溶解，得到RNA提取液，-80℃保存备用；采用RNA抽提试剂提取正常大鼠心肌组织以及缺血再灌注处理后大鼠心肌组织总的RNA，用逆转录试剂对RNA提取液进行逆转录反应得到cDNA；
步骤2.4、对步骤2.3中的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测扩增结果。
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