CN105251014B - Nonratt021972小干扰rna在制备心肌缺血损伤、交感神经疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸在制备心肌缺血损伤、心血管及交感神经系统疾病药物中的应用。心肌缺血引起交感兴奋反射(血压升高、心率和呼吸加快等),进而加重心肌缺血损伤。心交感神经兴奋增强本身也可导致血管收缩功能改变,引发心血管疾病。长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸可降低心肌缺血损伤引起的交感神经反射引起的进一步加重心肌缺血缺氧现象,从而减轻心肌缺血损伤;抑制颈部交感神经节兴奋增强传递可防治心血管功能异常引发的疾病;抑制交感异常兴奋及相关病理过程可防治交感神经疾病。长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸以口服、注射、含片或其它局部或全身可用药剂型药物进行上述疾病防治。
Description
技术领域
本发明属于心肌缺血损伤、心血管及交感神经系统疾病药物用途发明领域。
背景技术
急性心肌肌缺血通常是由冠状动脉已经或者即将闭塞而引起的心肌需氧和供氧之间的失衡所致。急性冠脉综合征是指急性心肌缺血导致的一系列症状,包括心肌梗死(ST段抬高和压低、Q波型和无Q波型)和不稳定型心绞痛等症状。临床研究发现,切除颈上神经节(superior cervical ganglion,SCG)、星状神经节(stellate ganglion,SG)等交感神经节后可使50-60%冠心病患者的心绞痛症状消失,提示支配心脏的交感神经涉及心肌缺血损伤反应。心脏同时接受心交感神经和心迷走神经的支配,在生理状态下,心迷走神经对心脏的作用占主导地位,比心交感更占优势。在心脏外周信息传递中,心脏感觉传入神经与颈部交感心脏传出节后神经元形成反馈环路,改变交感传出节后神经元的功能。颈部交感神经节不是简单的信号中继站,而是对各种信息具有整合作用。心肌缺血伤害性信号可通过感觉神经的传入信息影响颈部交感神经节细胞的功能,进而加强交感节后神经活动,引起血压升高和心率加快等交感兴奋性增强的反射,进而加重心肌缺血损伤。心交感神经兴奋增强本身也可导致血压升高,引发高血压。
三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphophate,ATP),是一种嘌呤类物质,它通过兴奋P2X受体参与神经传递和神经调节。P2受体分有P2X和P2Y受体两大类,P2X受体为配体门控型离子通道受体,P2Y受体为G-蛋白耦联受体。到目前为止,已有七种P2X受体亚型P2X1-7和八种类型P2Y受体亚型(P2Y1,2,4,6,11-14)被克隆。心肌缺血发生时,心肌组织以及交感神经末梢(颈上神经节节前、节后纤维)均可通过胞吐或外渗作用释放ATP,使心脏感觉传入神经末梢兴奋,引发胸痛,由此产生的交感传出兴奋性反射常表现为血压升高和交感神经活动增加。心交感兴奋性加强可加重心肌缺血、缺氧使心绞痛加重。酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)是交感神经的标志物。
P2X7受体由595个氨基酸组成,其前395个氨基酸编码两个跨膜区、一个大的胞外环和N端,P2X7受体的胞内C端长于其它成员。P2X7受体是双功能受体,受刺激持续时间、强度和其他因素影响,产生两种不同反应:P2X7受体在低浓度激动剂短暂剌激时引起非选择性阳离子内流,几乎无失活;在较高浓度激动剂长时间或反复激活后可形成质膜孔道,分子量达800Da的大分子和离子可通透,细胞骨架重排,终致细胞死亡。
本发明前期用SOLiD高通量测序并通过生物信息学预测和分子生物学验证确定大鼠颈部交感神经节(颈上神经节和星状神经节)、心肌存在长非编码核糖核酸NONRATT021972[http://www.noncode.org],并发现心肌缺血模型大鼠颈部交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972表达较对照组明显增加,提示心脏的长非编码核糖核酸NONRATT021972与心血管、交感神经的病理变化有关。长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸是否可对心肌缺血损伤产生保护作用尚不清楚,是否可作用于颈部交感神经节神经细胞P2X7受体影响心肌缺血引发的交感增强反射对心肌、心血管、心交感神经损伤产生保护作用目前尚无文献报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸的第一个新用途,即NONRATT021972小干扰核糖核酸在制备预防治疗心肌缺血损伤(急性冠脉综合征等)药物中的应用。
本发明的第二个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸的第二个新用途,即NONRATT021972小干扰核糖核酸在制备预防治疗高血压药物中的应用。
本发明的第三个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸的第三个新用途,即NONRATT021972小干扰核糖核酸在制备预防治疗交感神经系统疾病药物中的应用。
长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸可降低心肌缺血大鼠引起的交感神经反射(血压升高、心率和呼吸加快等),从而减轻或缓解心肌缺血损伤、心血管病变。长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸在预防治疗心肌缺血损伤(急性冠脉综合征等)、心血管和交感神经病变的作用机理为:影响P2X7受体介导的交感兴奋反射传递,产生防治心肌缺血损伤、心血管和交感神经疾病的作用。
本发明的技术效果:长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸可降低心肌缺血损伤引起的交感神经反射(血压升高、心率和呼吸加快等),避免因为心交感兴奋增强所引起的进一步加重心肌缺血缺氧现象,从而减轻或缓解心肌缺血损伤。长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸抑制颈部交感神经节兴奋增强传递可防治心血管疾病、抑制交感异常兴奋及相关病理过程可防治交感神经疾病。
附图说明
图1为长非编码核糖核酸NONRATT021972在心肌缺血大鼠颈上神经节、星状神经节中表达量的变化;
图2为长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸对心肌缺血损伤模型大鼠心电图的影响图。其中分别为对照组;假手术组;心肌缺血模型组;心肌缺血模型+亮蓝G组;心肌缺血模型+乱序小干扰处理组;心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组。
图3为苏木精-伊红染色法(HE)染色观察长非编码核糖核NONRATT021972小干扰核糖核酸对模型大鼠缺血损伤心肌的影响图。图中分别为对照组;假手术组;心肌缺血模型组;心肌缺血模型+亮蓝G组;心肌缺血模型+乱序小干扰处理组;心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组(Scalebars:50μm)。
图4为NONRATT021972小干扰核糖核酸对血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)浓度影响图。图中分别为对照组;假手术组;心肌缺血模型组;心肌缺血模型+亮蓝G组;心肌缺血模型+乱序小干扰处理组;心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组。**p<0.01与对照组比较;##p<0.01与心肌缺血模型组比较。
图5为NONRATT021972小干扰核糖核酸对血清中去甲肾上腺素、肾上腺素浓度影响图。图中分别为对照组;假手术组;心肌缺血模型组;心肌缺血模型+亮蓝G组;心肌缺血模型+乱序小干扰处理组;心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组。**p<0.01与对照组比较;##p<0.01与心肌缺血模型组比较。
图6为实时定量聚合酶链式反应检测NONRATT021972小干扰核糖核酸对颈上神经节、星状神经节P2X7受体信使核糖核酸表达的影响图。图中分别为对照组;假手术组;心肌缺血模型组;心肌缺血模型+亮蓝G组;心肌缺血模型+乱序小干扰处理组;心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组。**p<0.01与对照组比较;##p<0.01与心肌缺血模型组比较。
图7为免疫组织化学检测NONRATT021972小干扰核糖核酸对颈上神经节(图7(a))P2X7受体免疫反应性表达的影响图。图中分别为对照组;假手术组;心肌缺血模型组;心肌缺血模型+亮蓝G组;心肌缺血模型+乱序小干扰处理组;心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组。图7(b)为统计分析数据的柱状图。**p<0.01与对照组比较;##p<0.01与心肌缺血模型组比较(Scale bars:20μm)。
图8为免疫组织化学检测NONRATT021972小干扰核糖核酸对星状神经节(图8(a))P2X7受体免疫反应性表达的影响图。图中分别为对照组;假手术组;心肌缺血模型组;心肌缺血模型+亮蓝G组;心肌缺血模型+乱序小干扰处理组;心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组。图7(b)为统计分析数据的柱状图。**p<0.01与对照组比较;##p<0.01与心肌缺血模型组比较(Scale bars:20μm)。
图9为蛋白印迹检测NONRATT021972小干扰核糖核酸对颈上神经节嘌呤2X7受体蛋白表达的影响图。图中分别为对照组;假手术组;心肌缺血模型组;心肌缺血模型+亮蓝G组;心肌缺血模型+乱序小干扰处理组;心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组。图9(a)为蛋白印迹实验结果图,图9(b)为实验数据分析比较柱状图。**p<0.01与对照组比较;##p<0.01与心肌缺血模型组比较。
图10为蛋白印迹检测NONRATT021972小干扰核糖核酸对星状神经节嘌呤2X7受体蛋白表达的影响图。图中分别为对照组;假手术组;心肌缺血模型组;心肌缺血模型+亮蓝G组;心肌缺血模型+乱序小干扰处理组;心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组。图10(a)为蛋白印迹实验结果图,图10(b)为实验数据分析比较柱状图。**p<0.01与对照组比较;##p<0.01与心肌缺血模型组比较。
具体实施方式
下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1。
用本技术领域公知的方法,制成适用于涉及颈部交感神经节或心肌P2X7受体介导心肌缺血损伤(急性冠脉综合征等)预防治疗的口服、注射或局部应用(含服等)的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸制剂。
实施例2。
用本技术领域公知的方法,制成适用于涉及颈部交感神经节或心肌P2X7受体介导高血压预防治疗的口服、注射或局部应用的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸制剂。
实施例3。
用本技术领域公知的方法,制成适用于涉及颈部交感神经节P2X7受体介导交感神经系统疾病预防治疗的口服、注射或局部应用的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸制剂。
为了更好地理解本发明的实质,下面以长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸对P2X7受体介导心肌缺血损伤和交感神经兴奋作用研究的实验和结果来证明NONRATT021972小干扰核糖核酸的用途。
一、材料和方法。
1.动物和分组。
健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重180-220g),雄性,由南昌大学医学院实验动物科学部提供。大鼠随机分为对照组;假手术组;心肌缺血模型组;心肌缺血模型+亮蓝G小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+乱序小干扰处理组;心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组;心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组。制备缺血模型采用结扎大鼠左冠状动脉前降支,结扎冠状动脉。P2X7受体的拮抗剂亮蓝G按30毫克/公斤/天腹腔给药。
2.心肌缺血模型大鼠长非编码核糖核酸NONRATT021972或嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸实验。
长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸(siRNA)序列由Invitrogen(Carlsbad,CA)公司提供,靶序列为5’-TGTGAATCATGGAAATATC-3’;阴性对照scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸)购至Invitrogen(Carlsbad,CA)公司。在体转染试剂由EntransterTM公司提供。根据EntransterTM在体转染说明书,对心肌缺血造模成功的大鼠进行长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸在体小干扰实验。320 μLNONRATT021972小干扰核糖核酸或阴性对照乱序小干扰核糖核酸溶液通过用微量注射器舌下静脉给药或用微量注射器直接注射至颈部交感神经节内。
P2X7小干扰核糖核酸(siRNA)序列靶序列为5’-GTG CAG TGA ATG AGT ACT A-3’,舌下静脉给药。
3.药物与试剂。
兔抗P2X7单克隆抗体(ABcam公司);鼠抗TH(酪氨酸羟化酶)多克隆抗体(SantaCrus公司);即用型SABC组化试剂盒(武汉博士德公司);β-actin抗体(北京中杉金桥);P2X7原位分子杂交试剂盒(武汉博士德公司);大鼠肿瘤坏死因子-α定量酶联检测试剂盒(上海森熊科技实业有限公司);大鼠白细胞介素-6定量酶联检测试剂盒(上海森熊科技实业有限公司);NA,EPI ELISA Kit(肾上腺素和去甲肾上腺素素酶联免疫试剂盒)(Uscn LifeScience Inc.);Trizol、2×EasyTaq PCR SuperMix及D2000(marker)(天根生化科技有限公司)。
4.主要仪器。
智能无创血压计BP-2006A(北京软隆生物技术有限公司);发光检测仪GLOMAX(PROMEGA公司);酶标仪(迪肯公司);冰冻切片机(德国徕卡公司)TKR-200C小动物呼吸机(江西特力麻醉呼吸设备有限公司);Medlab生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司);消毒纱布、手巾、棉签等,碘酒及75%酒精,手术器械包:剪刀、眼科小弯镊、血管钳、丝线等。
5.大鼠心肌缺血模型制备。
腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)进行麻醉。麻醉后大鼠取仰卧位,固定于手术台,心电图电极固定在双上肢和右下肢皮下,前胸备皮、消毒,使用Medlab生物信号采集处理系统记录标准II导联的心电图。暴露大鼠声门,行气管插管术,接通小动物呼吸机。手术区域铺上洞巾,以胸骨角为标志点,在左胸第4肋间隙位置行皮肤纵切口,剪开表皮,钝性分离结缔组织和肌肉,暴露肋骨,以止血钳游离肋骨旁的肌肉,撑开肋间隙,暴露心脏,清理创口。并用玻璃分针挑破心包膜。右手持止血钳扩开肋间隙,增加心脏暴露区域,左手轻挤胸廓将心脏挤出,拇指向上翻转心脏,可见左心耳与动脉圆锥间的左冠状动脉前降支,用小号缝合针快速穿刺血管底部心肌,深度约1.5-2.0mm,结扎成功且快速回纳心脏,观察心电图可见ST段呈弓背向上抬高,验证心肌缺血模型成功建立。待大鼠心电图平稳后,观测数分钟,大鼠胸腔清创后逐层关闭胸腔。逐渐控制呼吸机潮气量和频率,使大鼠逐步摆脱呼吸机。待大鼠恢复自主呼吸后,拔出气管插管,清除口腔内分泌物,给予生理盐水湿润或刺激。碘伏和酒精创口消毒,并行右后肢肌肉注射抗生素,防止术后感染。
6.血压、心率测定。
使用BP-2006A智能无创血压计监测生理盐水对照组、结扎冠状动脉心肌缺血模型组、假手术组和结扎冠状动脉P2X7受体、NONRATT021972小干扰核糖核酸处理组大鼠血压、心率的变化。在安静的监测室,将清醒状态的大鼠放入含鼠网的鼠袋中,尾巴置于鼠袋外面,鼠袋温度控制在37℃,待大鼠安静后,加压感应器套在鼠尾根部三分之一处,启动无创智能血压计,进入监测状态,点击开始键可自动测量各组大鼠血压和心率的变化。同一大鼠在相同时间内重复测量三次血压和心率,取其平均值,每次操作由同一人完成。
7.大鼠心率变异性(HRV)指标的测定。
腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉大鼠。麻醉后仰卧位固定于手术台上,心电图的电极固定在双上肢和右下肢皮下,使用Medlab生物信号采集处理系统记录标准II导联的心电图。将采集的心电信号用心率变异性分析软件分析,采用短时程5min频域分析法,取5min心电图作HRV分析。HRV频域分析法有关参数:
低频(low frequency,LF):中心频率位于0.04Hz-0.15Hz的低频分量曲线的积分值,即低频分量曲线与其横轴所夹的面积,单位为ms2。
高频(high frequency,HF):中心频率位于0.15Hz-0.4Hz的高频分量曲线的积分值,即高频分量曲线与其横轴所夹的面积,单位为ms2。
低频/高频(LF/HF):低频与高频功率的比值,代表交感神经张力与迷走神经张力的平衡。
窦性R-R间期差数的均方根和(rMSSD):单位ms。
窦性R-R间期标准差(SDANN):单位ms。
8.苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色。
1)心肌标本制备:分别于模型制作成功后14天,麻醉的大鼠,生理盐水灌注心脏,用4%多聚甲醛固定后,取出整个心脏,0.1M PBS清洗,4%多聚甲醛固定,蔗糖脱水24小时后冰冻切片机切厚度为12μm冰冻切片。
2)HE染色:取冰冻切片恢复至室温,放进苏木素中染色5min,自来水冲洗10min,充分蓝化;再放进1%的伊红溶液染色5min,自来水洗10min,酒精梯度脱水、二甲苯透明和中性树胶封片。
9.心肌酶测定。
分别于连续给药14天后,腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)进行麻醉,左手抓住大鼠两耳间皮肤,固定头部,轻压右侧颈部,使大鼠右眼眼球充分外突,眶后静脉丛充血;右手持一长约2-3cm的抗凝玻璃毛细管,将其光滑端插入眶后眼睑与眼球之间并向眼底方向移动,轻轻转动,感觉有突破感后,血液即流入抗凝玻璃管中,采集约1-2ml血液后,拔出玻璃毛细管并压迫止血。收集的血液立即离心5min(3000rpm),取上层血浆,用美国罗氏COBAS E601全自动电化学发光仪检测各组大鼠心肌酶指标。
10.免疫组织化学。
(1)取出大鼠颈上、星状神经节的冰冻切片恢复至室温后,用0.1M PBS洗3次,5min/次;(2)0.3%的H2O2室温孵育5min,降低内源性过氧化物酶;(3)0.1M PBS洗3次,5min/次;封闭液37℃孵育1h;(4)加入兔来源的0.1M PBS稀释为1:100的P2X7一抗,4℃孵育过夜;(5)0.1M PBS洗3次,5min/次;滴加适量生物素标记二抗工作液,37 ℃孵育40min;(6)0.1MPBS洗3次,5min/次;滴加适量辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液,室温孵育20min;(7)0.1M PBS洗3次,5min/次;DAB显色,双蒸水冲洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。实验结果用Image-Pro Plus图像分析系统对P2X7阳性细胞进行综合光密度分析。
11.实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative PCR)技术。
1)总RNA的提取:
a)消化后的细胞,4℃,12000r/min,离心5min,弃上清;
b)用Mini Kit(250)提取RNA,得到30μl的RNA;
2)Perkin Elmer LS-50B型荧光发光分光光度计检测RNA浓度;
3)Real-time PCR:
a)cDNA合成:建立20μl逆转录反应体系:5×Reaction mix 4μl,Maxima enzymemix2μl,Template RNA 1μl(5μg),Nuclease-free water 13μl,PCR仪逆转录30min;
b)引物序列:
P2X7上游:5’-CTTCGGCGTGCGTTTTG-3’;
下游:5’-AGGACAGGGTGGATCCAATG-3’;
β-actin上游:5’-GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT-3’;
下游:5’-CTTCTGCATCCTGTCAGCAA-3’;
c)实时定量PCR检测,20μl体系:PowerGreen PCR Master Mix 10μl,10μM上下游引物各1μl,cDNA1μl,Water,nuclease-free 7μl。混匀,置于Step One Plus型PCR仪,采用SYBR-green法进行测定。
12.蛋白印迹。
用匀浆裂解法于第15天提取各组大鼠颈上神经节心肌中的总蛋白,从每个样本中取约20微克进行SDS-PAGE电泳后将蛋白从胶上转移到PVDF膜,分别进行P2X7受体一抗和二抗孵育等免疫反应后再进行化学发光、显影、定影,将胶片进行扫描,分析目标带的分子量,结果用Image-Pro Plus图像分析系统观察测定光密度值,与其对应的β-actin条带的比值作为P2X3受体表达的相对量,比较各组结果。
13.酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。
酶联免疫吸附测定血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、肾上腺素和去甲肾上腺素。
各组实验大鼠于术后第15天经眼眶取血,离心后收集血清。酶联免疫测定严格按照酶联免疫测定试剂盒说明书操作,根据标准品所得曲线计算出各组血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度。
14.实验数据的统计处理。
实验数据用Excel及SPSS 11.5统计软件进行统计分析,各实验组数据以均数+标准差表示,多组间比较用单因素方差分析,继以最小显著差法(LSD)行两两比较。p<0.05为差异有显著性。
二、结果。
2.1长非编码核糖核酸NONRATT021972在心肌缺血大鼠及正常大鼠颈部交感神经节中的变化
经实时定量PCR检测正常大鼠及心肌缺血大鼠颈上、星状交感神经节中NONRATT021972的表达变化,结果显示,心肌缺血大鼠颈上和星状神经节中NONRATT021972的表达量明显高于正常组(p<0.01)(图1)。
2.2血压、心率和心电图的变化。
术后30天心肌缺血模型组、心肌缺血模型+乱序小干扰处理组大鼠的心率、收缩压、舒张压相比对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组明显升高(p<0.01,F(HR)(5,24)=8.32,F(SBP)(5,24)=7.97,F(DBP)(5,24)=7.09),对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组之间无明显差异(p>0.05,F(HR)(4,20)=1.24,F(SBP)(4,20)=2.10,F(DBP)(4,20)=1.43),且MI组与干扰阴性对照组MI+SC si组也无明显差异(p>0.05)。
表1.各实验组大鼠收缩压、舒张压及心率的变化
n=5.**p<0.01与对照组比较。
通过心电图观察到建模心肌缺血大鼠结扎冠状动脉左前降支后,心电图即出现ST段呈弓背抬高。心肌缺血模型大鼠成模30天后,心肌缺血模型组、心肌缺血模型+乱序小干扰处理组大鼠的心电图出现深大的病理性Q波,而心肌缺血大鼠分别注射亮蓝G、NONRATT021972小干扰核糖核酸、P2X7小干扰核糖核酸后未出现病理性Q波和ST段的抬高(图2)。
2.3心肌结构及心肌酶变化。
2.3.1心肌HE染色。
大鼠心肌组织的HE染色显示对照组、假手术组的心肌纤维染色为粉红色,胞质和胞核显示清晰,细胞膜完整,细胞排列规则,细胞间隙适中。而心肌缺血模型组、心肌缺血模型+乱序小干扰处理组大鼠的心肌纤维出现凝固性坏死,核碎裂并出现消失,胞质呈不规则粗颗粒状,间质水肿,有少量中性粒细胞浸润。心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组心肌纤维坏死程度有所缓解(图3)。
2.3.2心肌酶的测定。
全自动电化学发光仪(美国罗氏COBAS E601)检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。检测结果如下:心肌缺血模型组的CK-MB、CK、LDH和AST浓度,与对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组比较显著增加(n=8)(p<0.01,F(CK-MB)(5,42)=3.76,F(CK)(5,42)=10.23,F(LDH)(5,42)=7.14.,F(AST)(5,42)=5.34)。而心肌缺血模型组、心肌缺血模型+乱序小干扰处理组间无明显差异(p>0.05),对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组间也无显著差异(p>0.05,F(CK-MB)(4,35)=1.03,F(CK)(4,35)=1.46,F(LDH)(4,35)=1.57,F(AST)(4,35)=2.04)(见表)。
表3.各实验组大鼠血清中肌酸激酶同工酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶和天冬氨酸氨基转移酶的浓度
n=8.**p<0.01与对照组比较。
2.4血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、去甲肾上腺素(NA)、肾上腺素(EPI)浓度的测定。
心肌缺血模型组血清中IL-6、TNF-α、NA、EPI含量明显高于对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组(p<0.01,F(IL-6)(5,30)=6.54,F(TNF-α)(5,30)=4.72,F(NA)(5,30)=4.58.,F(EPI)(5,30)=4.96),心肌缺血模型组与心肌缺血模型+乱序小干扰处理组间无明显差异(p>0.05),对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组间也无显著差异(p>0.05,F(IL-6)(4,25)=2.27,F(TNF-α)(4,25)=2.18,F(NA)(4,25)=1.15,F(EPI)(4,25)=1.36)(图4、5)。
2.5颈上神经节、星状神经节P2X7受体mRNA的表达。
实时定量PCR检测颈上神经节、星状神经节P2X7受体mRNA表达水平,以对照组P2X7受体mRNA表达水平为1,比较各实验组P2X7受体mRNA的相对水平。结果显示心肌缺血模型组P2X7受体mRNA的表达与对照组、假手术组相比显著升高,而通过给心肌缺血大鼠分别注射P2X7受体的特异性拮抗剂亮蓝G、NONRATT021972小干扰核糖核酸、P2X7小干扰核糖核酸后,其mRNA的表达量显著降低(p﹤0.01,F(SCG)(5,12)=10.79,F(SG)(5,12)=11.23)。心肌缺血模型组mRNA的表达与干扰阴性对照的心肌缺血模型+乱序小干扰处理组无明显差异(p﹥0.05),对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组间的表达也无明显差异(p﹥0.05,F(SCG)(4,10)=2.68,F(SG)(4,10)=2.19)(图6)。
2.6免疫组织化学检测。
2.6.1颈上神经节P2X7免疫反应性。
由Image-Pro Plus软件分析免疫组化的结果分析得:心肌缺血模型组大鼠的颈上神经节P2X7受体免疫反应性的表达明显高于照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组(p<0.01)。肌缺血模型组与干扰阴性对照的心肌缺血模型+乱序小干扰处理组P2X7受体免疫反应的表达无明显差异,对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组之间P2X7受体免疫反应性的表达也无显著性差异(p>0.05)。与P2X7受体的特异性拮抗剂亮蓝G、P2X7小干扰核糖核酸相似,NONRATT021972小干扰核糖核酸也可降低心肌缺血大鼠中颈部交感神经节中上调的P2X7受体蛋白的表达(图7)。
2.6.2星状神经节P2X7免疫反应性。
由Image-Pro Plus软件分析免疫组化的结果分析得:心肌缺血模型组大鼠的星状神经节P2X7受体免疫反应性的表达明显高于照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组(p<0.01)。肌缺血模型组与干扰阴性对照的心肌缺血模型+乱序小干扰处理组P2X7受体免疫反应的表达无明显差异,对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组之间P2X7受体免疫反应性的表达也无显著性差异(p>0.05)。与P2X7受体的特异性拮抗剂亮蓝G、P2X7小干扰核糖核酸相似,NONRATT021972小干扰核糖核酸也可降低心肌缺血大鼠中颈部交感神经节中上调的P2X7受体蛋白的表达(图8)。
2.7蛋白印迹检测。
2.7.1颈上神经节P2X7的蛋白表达。
蛋白印迹结果经β-actin标化后示:心肌缺血模型组颈上神经节P2X7受体蛋白表达量较于对照组、假手术组明显升高(p<0.01)。心肌缺血模型组大鼠在经过亮蓝G、P2X7小干扰核糖核酸、NONRATT021972小干扰核糖核酸分别处理后,P2X7受体蛋白的表达量都明显下降(p<0.01)。而心肌缺血模型组与干扰阴性对照的心肌缺血模型+乱序小干扰处理组P2X7受体蛋白的表达无明显差异,对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组之间P2X7受体蛋白的表达也无显著性差异(p>0.05,F(SCG)(4,25)=2.34,F(SG)(4,25)=1.91)(图9)。
2.7.2星状神经节P2X7的蛋白表达。
蛋白印迹结果经β-actin标化后示:心肌缺血模型组星状神经节P2X7受体蛋白表达量较对照组、假手术组明显升高(p<0.01)。MI组大鼠在经过亮蓝G、P2X7小干扰核糖核酸、NONRATT021972小干扰核糖核酸分别处理后,P2X7受体蛋白的表达量都明显下降(p<0.01)。而心肌缺血模型组与干扰阴性对照的心肌缺血模型+乱序小干扰处理组P2X7受体蛋白的表达无明显差异,对照组、假手术组、心肌缺血模型+亮蓝G组、心肌缺血模型+NONRATT021972小干扰核糖核酸组、心肌缺血模型+嘌呤2X7受体小干扰核糖核酸组之间P2X7受体蛋白的表达也无显著性差异(p>0.05)(图10)。
申请人实验室的研究发现心肌缺血损伤时颈部交感神经节P2X7受体表达增加、兴奋性增强。长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸可降低心肌缺血大鼠引起的交感神经反射(血压升高、心率和呼吸加快等),减少交感兴奋递质肾上腺素、去甲肾上腺素释放、炎性物质(TNF-α和IL-6)释放,避免因为交感兴奋增强所引起的进一步加重心肌缺血缺氧现象,从而减轻或缓解心肌缺血损伤,有利于急性冠脉综合征等疾病防治。抑制颈部交感神经节兴奋增强传递可防治心血管疾病。抑制交感神经异常兴奋及其病理过程可防治交感神经疾病。NONRATT021972小干扰核糖核酸的作用机理为:降低颈部交感神经节P2X7受体的病理性上调表达、抑制交感兴奋物质和炎性介质释放,阻断心肌缺血引发的反射性交感兴奋传递,产生防治心肌缺血损伤(急性冠脉综合征等)、心血管和交感神经疾病的作用。此外,由于P2X7嘌呤受体涉及体内许多生理功能和病理作用,探寻出NONRATT021972小干扰核糖核酸对P2X7嘌呤受体涉及的病理生理变化的影响,将极大地推动长非编码核糖核酸及其小干扰核糖核酸在体内各种生理功能和病理作用的研究工作。
Claims (4)
1.长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸在制备预防治疗心肌缺血损伤药物中的应用,所述的长非编码核糖核酸NONRATT021972序列如SEQ ID NO.3所示,所述的小干扰核糖核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
2.长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸在制备预防治疗高血压药物中的应用,所述的长非编码核糖核酸NONRATT021972序列如SEQ ID NO.3所示,所述的小干扰核糖核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
3.长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸在制备预防治疗交感神经系统疾病药物中的应用,所述的长非编码核糖核酸NONRATT021972序列如SEQ ID NO.3所示,所述的小干扰核糖核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
4.长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸制备的口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型药物,所述的长非编码核糖核酸NONRATT021972序列如SEQ ID NO.3所示,所述的小干扰核糖核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
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