JP2016034964A - 骨髄間葉系および/または多能性幹細胞の血中動員による組織再生促進剤 - Google Patents
骨髄間葉系および/または多能性幹細胞の血中動員による組織再生促進剤 Download PDFInfo
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Abstract
Description
一方、生体は臓器の損傷時の為に、損傷部位の修復再生機構を備えているが、損傷部位が大きい場合には非機能的な瘢痕組織によって損傷部位を塞ぐことが知られている。このような瘢痕組織による損傷治癒は、脳梗塞や脊髄損傷では、神経再生の阻害因子となり、心筋梗塞では心破裂の要因となり、広範囲熱傷や手術創ではケロイドとなるなど、生命予後、美容面においてQOLを著しく損なう原因となっている。生体が持つ損傷組織の修復再生機構を賦活化することが可能になれば、瘢痕治癒することなく機能的な組織による損傷組織(臓器)の再生を誘導することが期待できる。
骨髄内には、白血球や赤血球などに分化する造血系幹細胞の他、骨、軟骨、脂肪などに分化可能な間葉系の幹細胞が存在することが知られているが、近年になって上皮系や神経系の細胞に分化することが可能な多能性幹細胞が存在することが明らかになってきている。
また、脳梗塞モデルマウス脳における骨髄由来細胞の存在を確認したところ、脳梗塞作製後HMGB-1を静脈投与したマウスにおいて、神経細胞マーカーを発現する骨髄由来細胞を脳内に認めた。次に、脳梗塞巣の縮小効果を確認したところ、コントロールマウスと比較して、HMGB-1静脈投与マウスにおいて、脳梗塞巣において顕著な改善効果が確認された。また、脳梗塞後の生存率改善を確認したところ、HMGB-1静脈投与例ではマウスの生存率が上昇した。
さらに、マウスを用いて、骨折治癒過程における、骨折部以外の部位の骨髄多能性幹細胞の関与を確認したところ、損傷部位遠方の骨髄由来細胞が骨折部分に移動して損傷組織の修復を行っていることが明らかになった。
さらに、骨折モデルマウスを用いて、HMGB1静脈投与による損傷部位への骨髄間葉系幹細胞の動員活性を評価したところ、HMGB1の静脈内投与によって血中内に動員された骨髄間葉系幹細胞が骨折部分に集まってくることが明らかになった。
〔1〕以下の(a)から(q)のいずれかに記載の物質を含有する組織再生促進剤であって、再生が必要な組織とは異なる組織に投与される薬剤;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔2〕非経口投与される、〔1〕記載の薬剤。
〔3〕注射投与である、〔2〕記載の薬剤。
〔4〕血管内、筋肉内、皮下、皮内又は腹腔内に投与される、〔1〕記載の薬剤。
〔5〕細胞又は組織の抽出液が細胞又は組織を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の薬剤。
〔6〕細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分が以下の工程を含む方法で製造される、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の薬剤;
(a)細胞又は組織を溶媒に浸す工程、
(b)工程(a)で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
(c)固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。
〔7〕神経組織、骨組織、又は皮膚組織の再生促進に用いられる、〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の薬剤。
〔8〕以下の(a)から(q)のいずれかに記載の物質を含有する組成物を含む、組織再生促進キットであって、該組成物が、再生が必要な組織とは異なる組織に投与される前記キット;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔9〕非経口投与される、〔8〕記載のキット。
〔10〕注射投与である、〔9〕記載のキット。
〔11〕血管内、筋肉内、皮下、皮内又は腹腔内に投与される、〔8〕記載のキット。
〔12〕神経組織、骨組織、又は皮膚組織の再生促進に用いられる、〔8〕〜〔11〕のいずれかに記載のキット。
〔13〕以下の(a)から(q)のいずれかに記載の物質を含有する組成物を、再生が必要な組織とは異なる組織にその有効量を投与する工程を含む、組織の再生を促進する方法;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔14〕非経口投与である、〔13〕記載の方法。
〔15〕注射投与である、〔14〕記載の方法。
〔16〕血管内、筋肉内、皮下、皮内又は腹腔内に投与する、〔13〕記載の方法。
〔17〕神経組織、骨組織、又は皮膚組織の再生を促進する、〔13〕〜〔16〕のいずれかに記載の方法。
〔18〕組織再生促進剤の製造における以下の(a)から(q)のいずれかに記載の物質を含有する組成物の使用であって、該組織再生促進剤が、再生が必要な組織とは異なる組織に投与される、前記使用;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔19〕該組織再生促進剤が非経口投与される、〔18〕記載の使用。
〔20〕注射投与である、〔19〕記載の使用。
〔21〕該組織再生促進剤が血管内、筋肉内、皮下、皮内又は腹腔内に投与される、〔18〕記載の使用。
〔22〕該組織再生促進剤が、神経組織、骨組織、又は皮膚組織の再生促進剤である、〔18〕〜〔21〕のいずれかに記載の使用。
〔23〕組織の再生を促進する方法に使用するための、以下の(a)から(q)のいずれかに記載の物質を含有する組成物であって、再生が必要な組織とは異なる組織に投与される、前記組成物;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔24〕非経口投与される、〔23〕記載の組成物。
〔25〕注射投与である、〔24〕記載の組成物。
〔26〕血管内、筋肉内、皮下、皮内又は腹腔内に投与される、〔23〕記載の組成物。
〔27〕組織の再生を促進する方法が、神経組織、骨組織、又は皮膚組織の再生を促進する方法である、〔23〕〜〔26〕のいずれかに記載の組成物。
HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9は骨髄多能性幹細胞を動員する活性を有している。骨髄多能性幹細胞は間葉系の他、上皮系や神経系の細胞にも分化可能である。広範囲の組織損傷の際に、骨髄多能性幹細胞を血流を介し損傷部位に動員する事が可能になれば、骨髄多能性幹細胞による生理的な損傷組織の修復再生を促進することが期待できる。
本発明により、骨髄多能性幹細胞動員因子である、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9を静脈内投与などの方法で損傷部位から遠位部に投与することで、末梢血中内に骨髄多能性幹細胞を動員し、損傷組織修復を促進する方法が提供された。例えば脳梗塞の様な体内深部臓器の疾患を治療する場合、損傷部位(脳)への治療薬の直接投与は困難である。一方、本発明では、一般診療において広く施行されている静脈投与による治療を可能にしたため、治療薬を任意の回数、濃度で安全かつ簡便に投与することが可能となり、このことは従来の治療方法と比較して優れた効果である。
また、最近開発された骨髄細胞を使用した脳梗塞の治療法としては、患者本人の骨髄から細胞を採取し血液循環中に再投与する方法が有効であることが知られているが、骨髄細胞採取の際には体内深部の骨髄に太い針を刺して吸引する必要があるため大きな侵襲を伴うことが避けられない。これに対し、本発明では、薬剤を静脈内投与することで骨髄細胞を直接血液循環中に動員する事が可能であるため、脳梗塞の患者に頻回に投与しても大きな侵襲を伴うことがない。
骨髄由来の多能性幹細胞は間葉系、上皮系、神経系などの多様な細胞に分化する潜在能力を有するが、損傷部位に移動した後は周囲のニッチ環境に応じて分化し組織修復を誘導すると考えられる。再生医療や細胞治療では希少な骨髄多能性幹細胞を生体外で培養し増殖させた後に治療に利用するが、従来の医薬品と異なり、培養過程で起きうる細胞の劣化(癌化や細菌、ウイルスなどのコンタミネーション)の危険があるため十分な安全管理が必要である。本発明では、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9を投与することで、骨髄多能性幹細胞を末梢循環血内に動員するが、細胞を体外に取り出し人工的操作を加えることはしないため安全性の高い治療法である。
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
該組織再生促進剤は、再生が必要な組織とは異なる組織に投与されることで、骨髄細胞を骨髄から再生が必要な組織に末梢循環を介して動員(誘導または局所誘導とも表現される)することを特徴とする。ここで、「末梢循環」とは、「血液循環」、「末梢循環血流」とも称される。
非瘢痕性組織再生促進剤であって、再生が必要な組織とは異なる組織に投与される薬剤、
非瘢痕性組織再生促進剤であって、再生が必要な組織とは異なる組織に投与され、骨髄から骨髄細胞を末梢血中に動員し、末梢循環系を介して、再生が必要な組織に骨髄由来細胞を動員することにより、組織の再生を促進することを特徴とする薬剤
とも表現することもできる。
本発明において、再生が必要な組織とは異なる組織への投与とは、再生が必要な部位以外の部位(再生が必要な部位とは異なる部位)に投与することを意味する。したがって、「再生が必要な組織とは異なる組織」は、再生が必要な組織とは異なる部位、再生が必要な部位とは異なる部位、再生が必要な組織から離れた部位、再生が必要な部位から離れた部位、再生が必要な部位から遠位にある部位、再生が必要な組織から遠位にある組織、遠位部、遠位組織と表現することもできる。
特に、本発明の薬剤は、体外から直接薬剤を投与することが困難な組織(脳、心臓など)を再生するために、有効に利用される。
また、再生が必要な組織とは異なる組織としては、血液組織、筋肉組織、皮下組織、皮内組織、腹腔等が例示できる。
本発明の薬剤には、好ましくは、神経組織、骨組織、皮膚組織等の再生促進剤が含まれるが、これらに限定されない。神経組織の再生促進剤としては、中枢神経組織の再生促進剤が挙げられるが、これに限定されない。また、神経組織の再生促進剤は、例えば、脳梗塞、脳出血、脳挫傷等の治療に使用できるが、これらに制限されない。また骨組織の再生促進剤は、例えば、骨折の治療に使用できるが、これに限定されない。また皮膚組織の再生促進剤は、例えば、皮膚潰瘍、手術創の縫合不全、熱傷、切傷、挫傷、皮膚びらん、擦過傷等の治療に使用できるが、これらに制限されない。
本明細書において、「骨髄細胞」とは、骨髄内に存在する細胞を意味し、一方、「骨髄由来細胞」とは、骨髄外に動員された「骨髄細胞」を意味する。
配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25または27に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、骨髄由来細胞を再生が必要な組織に動員する活性を有するタンパク質、又は骨髄由来細胞を遊走する活性を有するタンパク質が挙げられる。
改変されるアミノ酸の数は、典型的には50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内(例えば、1アミノ酸)であると考えられる。
また、非保存的置換によりタンパク質の活性などをより上昇(例えば恒常的活性化型タンパク質などを含む)させることも考えられる。
ハイブリダイゼーションを利用することによって、たとえば配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25または27に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質以外のHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質のホモログをコードするDNAの単離が可能である。
酵母では、Pichia属酵母が糖鎖を備えたタンパク質の発現に有効なことが公知である。糖鎖の付加という点では、昆虫細胞をホストとするバキュロウイルスベクターを利用した発現系も有用である(Bio/Technology, 6:47-55, 1988)。更に、哺乳動物の細胞を利用して、CMV、RSV、あるいはSV40等のプロモーターを利用したベクターのトランスフェクションが行われており、これらのホスト/ベクター系は、いずれもHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質の発現系として利用することができる。また、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターを利用して遺伝子を導入することもできる。
溶媒に浸される細胞又は組織としては、特に制限はないが、組織由来細胞、組織由来細胞から樹立された株化細胞(例えば、HeLa、HEK293が例示できるが、これらに制限されない)、単離された細胞、単離されていない細胞(例えば単離された組織中に存在する細胞)、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードするDNAが導入された細胞などが例示できる。上記組織としては、どのような組織でもよく、例えば、生体皮膚組織、体内生検(手術)組織(脳、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、膵臓、腎臓、膀胱、脾臓、子宮、精巣や血液など)が例示できるが、これらに制限されるものではない。
末梢血抽出液の調整方法は、注射器などを用いて採血した後、冷凍庫や液体窒素、ドライアイスなどで細胞を凍結し、その後0℃以上の温度下で再融解する。さらに、細胞の不溶成分を取り除くために、例えば、4℃〜25℃(例えば4℃)、重力加速度10G〜100000G(例えば440G)で遠心し、上清を分取することにより、溶媒から細胞の不溶成分を取り除くことができるが、これに制限されない。該上清を細胞や組織の抽出液として利用できる。細胞の不溶成分を除去するためには、遠心操作の代わりに、0.45μmの微少の孔をもつニトロセルロースフィルターなどを通過させることで、不溶成分を取り除くことができる。また、採血した末梢血を3時間から48時間4℃の状態に置くことで、細胞の壊死を誘発し、末梢血中の細胞から細胞内成分を分泌させることができる。この後重力加速度10G〜100000G(例えば440G)で遠心し、上清を分取することにより、溶媒から細胞の不溶成分を取り除くことができるが、これに制限されない。該上清を細胞や組織の抽出液として利用できる。細胞の不溶成分を除去するためには、遠心操作の代わりに、0.45μmの微少の孔をもつニトロセルロースフィルターなどを通過させることで、不溶成分を取り除くことができる。
(a)細胞又は組織を溶媒に浸す工程、
(b)工程(a)で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
(c)固定化ヘパリンからヘパリン結合画分(ヘパリン精製画分、ヘパリンカラム精製画分とも表現しうる)を溶出する工程
固定化ヘパリンとは、ヘパリンを不溶性担体に共有結合させたものである。上記不溶性担体としては、Sepharose beads(Sepharose 4B,Sepharose 6B等:GE Healthcare)が例示されるが、これに制限されるものではない。本発明においては、市販の固定化ヘパリン(Hitrap Hepalin HP column: GE Healthcare)を用いてもよい。
細胞や組織の抽出液と固定化ヘパリンの接触条件としては、pH7〜8程度(好ましくはpH7.5)、塩濃度は0〜200mM、好ましくは100〜200mM程度が例示されるが、これらに制限されない。抽出液と固定化ヘパリンとが接触している時間は特に限定されないが、ヘパリン結合画分を固定化ヘパリンに十分吸着させるという観点では5分以上保持されることが好ましい。また、温度としては、4〜8℃、好ましくは4℃が挙げられるが、これらに制限されない。さらに、固定化ヘパリンに吸着したヘパリン結合画分の溶出条件としては、pH7〜8程度、塩濃度200〜1000mM(好ましくは1000mM程度)が例示されるが、これらに制限されるものではない。
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
該組織再生促進用キットは、再生が必要な組織とは異なる組織に投与されることで、骨髄細胞を骨髄から再生が必要な組織に末梢循環を介して動員することを特徴とする。
また、本発明のキットには、上記再生が必要な組織を治療するためのキットが含まれる。好ましくは、本発明のキットには、非経口投与されるキット、さらに好ましくは注射投与されるキットが含まれる。また、本発明のキットには、好ましくは、血管内、筋肉内、皮下、皮内又は腹腔内に投与されるキットが含まれる。
また、好ましくは、本発明のキットには、神経組織、骨組織、又は皮膚組織の再生促進に用いられるキットが含まれる。
組織再生促進用キットとしては、(1)フィブリノゲンに溶解した上記物質、および(2)トロンビンを含む組織再生促進用キット、または、(1)上記物質、(2)フィブリノゲン、および(3)トロンビンを含む組織再生促進用キットが例示できる。本発明においては、市販のフィブリノゲンやトロンビンを使用することができる。例えば、フィブリノゲンHT-Wf(ベネシスー三菱ウェルファーマー)、ベリプラスト(ZLBベーリング)、ティシール(バクスター)、ボルヒール(化血研)、タココンブ(ZLBベーリング)が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
(1)以下の(a)から(q)のいずれかに記載の物質を含有する組成物を、再生が必要な組織とは異なる組織にその有効量を投与する工程を含む、組織の再生を促進する方法;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
(2)組織再生促進剤の製造における以下の(a)から(q)のいずれかに記載の物質を含有する組成物の使用であって、該組織再生促進剤が、再生が必要な組織とは異なる組織に投与される、前記使用;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
(3)組織の再生を促進する方法に使用するための、以下の(a)から(q)のいずれかに記載の物質を含有する組成物であって、再生が必要な組織とは異なる組織に投与される、前記組成物;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
新生マウス皮膚からTrizol (invitrogen) を用いてRNAを抽出し、更にSuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)を用いてcDNAを合成した。このcDNAをテンプレートとしてHMGB1のcDNAをPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法を用いて増幅し、精製のためにアミノ酸配列のN末端にGST tagおよび6XHis tagの配列を付加したタンパクを発現するように、哺乳類細胞でタンパクを発現させるプラスミドベクターpCAGGSに挿入した。
ヒト胎児腎細胞由来HEK293培養細胞株にポリエチレンイミン(PEI)を用いてpCAGGS-GST-His-HMGB1をトランスフェクションし、48時間後細胞及び培養上清を回収した。細胞及び培養上清は4℃で4400g・5分間遠心し、上清と細胞を分離しそれぞれ回収した。回収した上清はさらに直径0.8μm孔をもつセルロースアセテートフィルターを通過させた後、0.45μmの孔を持つニトロセルロースフィルターを通過させ、それにより不溶画分を除去したサンプルを調整した。本サンプルを、50mM NaCl含50mM Tris HCl pH8.0 (50mL)で平衡化した5 mL HisTrap FF(GE)に挿入し、吸着成分をさらに、10mM イミダゾール含有50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0で洗浄して非特異的吸着成分を除去した。特異的吸着成分を、カラムから、100mM イミダゾール含有50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0で溶出した。吸着画分はそれぞれ、500μLずつシリコンコートしたプラスチックチューブに分画し、タンパク含有フラクションをまとめた後、脱塩カラムPD10(GE)を用いてイミダゾールを除去し、50mM Tris HCl pH. 7.5, 150mM NaCl を用いて溶出した。溶出したサンプルにHRV3C(Novagen)を添加し、4℃、8時間反応させた。切断後、サンプルを50mM Tris HCl pH.7.5,150 mM NaClで平衡化したHiTrap Heparin 1 mL カラム(GE)に結合させ、50mM Tris HCl pH.7.5,150 mM NaClでカラム内部を洗浄後、50mM Tris HCl pH.7.5,1000 mM NaClで結合タンパク質を溶出した。溶出したサンプルは50mM Tris HCl pH.8.8 20mM NaClにて50倍希釈し同じバッファーで平衡化した1mL HiTrap Q FF (GE)に吸着させた。50mM Tris HCl pH.8.8 500mM NaClを使用しNaClの濃度を徐々に上昇させることで吸着タンパク質を溶出した。ニッケルカラム、ヘパリンカラム、Qカラムに結合したタンパク質はSDS-PAGEしクマシーブリリアントブルー染色を行いタンパク質の存在を確認した。
その結果、図1に示すように、高純度のHMGB-1が精製された。以降の実施例では本精製方法を使用したHMGB-1を使用する。
ヒト胎児腎細胞由来HEK293培養細胞株にリポフェクション試薬(Invitrogen)を用いてpCAGGS-GST-S100A8をトランスフェクションし、48時間後細胞及び培養上清を回収した。細胞及び培養上清は4℃で4400g・5分間遠心し、上清(上清A)と細胞を分離しそれぞれ回収した。細胞は0.1%Tween20含PBSを加え氷冷下で30秒間超音波をあてることで細胞膜を破壊した。さらに、4℃で4400g・5分間遠心し、上清を回収した(上清B)。上清Aおよび上清Bを混合し、あらかじめ30mLのPBSでバッファーを置換したHiTrap GST FF column (GE healthcare,5mL)に添加した。添加後PBS100mLでカラムを洗浄し、還元型グルタチオン含20mMリン酸バッファー(pH.8)で吸着したタンパク質を溶出した。グルタチオンを除くために、ゲル濾過カラムPD-10(GE社製)にてバッファーをPBSに置換した。
C57BL/6雄マウス(6週齢)に致死量放射線(10Gy)を照射し、その直後に尾静脈よりGFP(green fluorescent protein)トランスジェニックマウス(Okabe M. et al, FEBS Lett. 407, 313-319, 1997)由来骨髄細胞(5x106個/0.1ml 生理的リン酸緩衝溶液pH7.4)を移植した。8週間後、背部に直径6mmの円形の皮膚潰瘍を作製した。マウスの皮膚が収縮することを防ぐため、シリコン製の外径10mm内径6mm厚さ1mmの円盤を両面粘着テープおよび医療用接着剤アロンアルファA(三共)を用いて潰瘍部に接着した。潰瘍部分の乾燥と細菌感染を防ぐため直径10mm厚さ1mmのシリコン製の円盤で潰瘍部を覆った。潰瘍部を保護するため、テガダーム(3M)で被覆した。
皮膚潰瘍作製当日から24時間間隔で5回尾静脈からHMGB-1(40μg)もしくはS100A8(250ng)を投与した。潰瘍作製から2週間後、マウスにイソフルランを用いて吸入麻酔した後、背部に作製した皮膚潰瘍作製部分のGFP蛍光の集積程度を蛍光実体顕微鏡使用して観察した。さらに、皮膚潰瘍作製部分の皮膚を円形に切除し4%パラホルムアルデヒド含PBS(リン酸緩衝液,nacalai)で固定し、OCTコンパウンドに包埋後冷却装置付ミクロトーム(Leica)を使用して8マイクロメートルの薄切切片を作製した。切片をプレパラートに貼り付けた後、PBSにてコンパウンドを洗浄し、核をDAPIによって染色した。さらにPBSにて余剰のDAPIを洗浄し、蛍光退色防止剤入り封入材を用いて封入した。それぞれのサンプルについて蛍光顕微鏡を用いてGFPの蛍光を検出した。
C57BL/6雄マウス(8週齢)に背部に直径6mmの円形の皮膚潰瘍を作製した。マウスの皮膚が収縮することを防ぐため、シリコン製の外径10mm内径6mm厚さ1mmの円盤を両面粘着テープおよび医療用接着剤アロンアルファA(三共)を用いて潰瘍部に接着した。潰瘍部分の乾燥と細菌感染を防ぐため直径10mm厚さ1mmのシリコン製の円盤で潰瘍部を覆った。潰瘍部を保護するため、テガダーム(3M)で被覆した。
皮膚潰瘍作製当日から24時間間隔で尾静脈からHMGB-1(40μg)もしくはS100A8(250ng)を計五回投与した。潰瘍作成後3日目、5日目、10日目の潰瘍部分の面積を計測した。
C57BL/6雄マウス(8週齢)に背部に直径6mmの円形の皮膚潰瘍を作製した。マウスの皮膚が収縮することを防ぐため、シリコン製の外径10mm内径6mm厚さ1mmの円盤を両面粘着テープおよび医療用接着剤アロンアルファA(三共)を用いて潰瘍部に接着した。潰瘍部分の乾燥と細菌感染を防ぐため直径10mm厚さ1mmのシリコン製の円盤で潰瘍部を覆った。潰瘍部を保護するため、テガダーム(3M)で被覆した。
皮膚潰瘍作製当日から24時間間隔で尾静脈からHMGB-1(40μg)を計五回投与した。潰瘍作成後4週後の潰瘍部分を採取し10%緩衝ホルムアルデヒドで固定した。サンプルをパラフィン包埋した後、ミクロトームを使用して薄切切片を作製した。脱パラフィン後HE(ヘマトキシリン・エオジン)染色、およびMT(マッソン・トリクローム)染色を行った。
GFP骨髄移植マウスに脳梗塞を作成した(中大動脈寒栓糸モデル)。具体的には、上述の実施例の方法で作成したGFP骨髄移植マウスにイソフルランを用いて吸入麻酔を行った後、頭部皮膚を切開し、頭蓋骨に直接レーザードップラー血流計プローブを接着し脳血流を確認した。さらに胸骨から下顎まで正中皮膚を切開し、右総頚動脈を剥離し4号絹糸を用いて緩く結紮した。右外頚動脈の遠位部に6号絹糸をかけて結紮した。総頚動脈の糸に緊張を加えながら右外頚動脈近位部に穴を開けて、先端700μmを加熱成形した6号モノフィラメントナイロン糸(塞栓糸)を挿入した。内頚動脈に向けて塞栓糸を進め、塞栓糸の先端から約8 mmまで挿入した部位で総頚動脈糸をゆるめた。レーザードップラー血流計によって血流遮断前後で血流計の数値が10分の1になることを確認した。
血流遮断30分後に塞栓糸を抜去し血流を回復させた。12時間後、精製HMGB-1(100μg)を500μLのPBSに希釈しで作製した疾患モデルマウスの尾静脈から投与した。以後4回24時間おきに同様にHMGB-1を投与した。コントロールマウスにはPBSを投与した。
治療最終日から2週間後、イソフルランによる吸入麻酔下で2%パラホルムアルデヒドを使用して灌流固定を行った。脳を頭蓋骨から取り出し10%スクロース液に12時間、20%スクロース液に24時間浸透させて脳組織から脱水を行った。脱水後OTC コンパウンド内に投入し、ドライアイス上で凍結させブロックを作製した。ブロックは凍結切片用のミクロトームを使用して厚さ8μmの切片を作製し、シランコーティングのプレパラート上に伸展した。伸展後十分に乾燥させ、PBSを用いてコンパウンドを洗浄した。
2%スキムミルク含PBSをサンプルに浸透させた後、2%スキムミルク含PBSに抗マウスNestin 抗体およびβIII Tubulin抗体を500倍に希釈しサンプルに4℃で8時間浸透させた。PBSにて5分間ずつ5回充分に洗浄した後、2%スキムミルク含PBS で500倍に希釈したPE 標識抗ラットIgG抗体をサンプルに室温で1時間浸透させた。同様にPBSにて充分に洗浄した後DAPI溶液を室温で10分間浸透させ、PBSで充分に洗浄した。蛍光消退防止剤含有封入剤で封入後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、GFP・DAPI・PEの蛍光を観察した。
本結果から、脳梗塞作製後HMGB-1を静脈投与したマウスにおいて、神経細胞マーカーを発現する骨髄由来細胞を脳内に認めた。これらのGFP陽性細胞の由来は、骨髄間葉系幹細胞などの非炎症系細胞に由来すると予想される。
8週齢C57/Bl6 メスマウスにイソフルランを用いて吸入麻酔を行った後、頭部皮膚を切開し、頭蓋骨に直接レーザードップラー血流計プローブを接着し脳血流を確認した。さらに胸骨から下顎まで正中皮膚を切開し、右総頚動脈を剥離し4号絹糸を用いて緩く結紮した。右外頚動脈の遠位部に6号絹糸をかけて結紮した。総頚動脈の糸に緊張を加えながら右外頚動脈近位部に穴を開けて、先端700μmを加熱成形した6号モノフィラメントナイロン糸(塞栓糸)を挿入した。内頚動脈に向けて塞栓糸を進め、塞栓糸の先端から約8 mmまで挿入した部位で総頚動脈糸をゆるめた。レーザードップラー血流計によって血流遮断前後で血流計の数値が10分の1になることを確認した。
血流遮断30分後に塞栓糸を抜去し血流を回復させた。12時間後、精製HMGB1(10μg)を500μLのPBSに希釈し、作製した疾患モデルマウスの尾静脈から投与した。以後4回24時間おきに同様にHMGB-1を投与した。コントロールマウスにはPBSを投与した。
治療最終日から5日後、イソフルランによる吸入麻酔下で2%パラホルムアルデヒドを使用して灌流固定を行った。脳を頭蓋骨から取り出し、脱水後OTC コンパウンド内に投入し、ドライアイス上で凍結させブロックを作製した。ブロックは凍結切片用のミクロトームを使用して厚さ8μmの切片を作製し、シランコーティングのプレパラート上に伸展した。伸展後十分に乾燥させ、PBSを用いてコンパウンドを洗浄した。4%パラホルムアルデヒド含PBSにて10分間固定した後、リン酸緩衝液で5分間洗浄し、蒸留水にて10分間浸透させた。さらに0.5%クレシルバイオレット溶液にて13分間染色した。蒸留水で1分間洗浄した後、50%エタノール、75%エタノール、95%エタノール、100%エタノール、にそれぞれ10秒浸透させた後キシレンに2分間浸透させることを2回繰り返した。さらにエンテラン液を用いて封入した。
8週齢C57/Bl6 雄マウスにイソフルランを用いて吸入麻酔を行った後、頭部皮膚を切開し、頭蓋骨に直接レーザードップラー血流計プローブを接着し脳血流を確認した。さらに胸骨から下顎まで正中皮膚を切開し、右総頚動脈を剥離し4号絹糸を用いて緩く結紮した。右外頚動脈の遠位部に6号絹糸をかけて結紮した。総頚動脈の糸に緊張を加えながら右外頚動脈近位部に穴を開けて、先端700μmを加熱成形した6号モノフィラメントナイロン糸(塞栓糸)を挿入した。内頚動脈に向けて塞栓糸を進め、塞栓糸の先端から約8 mmまで挿入した部位で総頚動脈糸をゆるめた。レーザードップラー血流計によって血流遮断前後で血流計の数値が10分の1になることを確認した。
血流遮断を一定時間(45分間もしくは60分間)それぞれのマウスに行った後で塞栓糸を抜去し血流を回復させた。12時間後、精製HMGB1(10μg)を500μLのPBSに希釈しで作製した疾患モデルマウスの尾静脈から投与した。以後4回24時間おきに同様にHMGB-1を投与した。コントロールマウスにはPBSを投与した。梗塞作製後7日間の生存率の観察を行った。
C57BL/6雄マウス(6週齢)に致死量放射線(10Gy)を照射し、その直後に尾静脈よりGFP(green fluorescent protein)トランスジェニックマウス由来骨髄細胞(5x106個/0.1ml 生理的リン酸緩衝溶液pH7.4)を移植した(GFP骨髄キメラマウス)。8週間後、GFP骨髄キメラマウス(図8 左のマウス)と野生型マウス(図8 右のマウス)を皮膚で結合したパラビオーシスを作製した。さらに、野生型マウス(図8 右のマウス)の右下肢に骨折を作製し、骨折治癒後の組織切片を作製した。切片に対し、4%スキムミルク含PBSでブロッキング後、4%スキムミルク含PBSに希釈した抗マウスオステオカルシン抗体を反応させ、PBSで洗浄後、4%スキムミルク含PBSに希釈したPE標識抗ラットIgG抗体と室温で1時間反応させた。PBSで洗浄後、DAPIを用いて核を染色しさらにPBSで洗浄した。封入後共焦点レーザー顕微鏡を利用して蛍光を観察した。
方法:上記の目的に対して以下の方法により研究を行った。
1)実験ではPDGFレセプターαのプロモーターの下流にGFPタンパクをゲノムにノックインしたマウス(PDGFRα-GFPマウス)(参考文献:Hamilton et al., Mol Cell Biol. 2003 Jun;23(11):4013-25)を使用した。このマウスはPDGFレセプターαが発現している細胞においてGFPタンパクが発現するため、蛍光顕微鏡を用いて観察すると緑色の蛍光を検出できる。
2)PDGFRα-GFPマウスの骨髄細胞を採取し、細胞培養用皿に播種し10% FBS含有α-MEMで培養を行った。3-4日ごとに培地を交換し約14日後に付着している細胞を回収した。回収した細胞を抗CD11b MACSビーズを使用してCD11b陽性細胞とCD11b陰性細胞にわけた。蛍光顕微鏡で観察したところCD11b陽性細胞はGFP陰性(図42のA1,A2)であり、CD11b陰性細胞はGFP陽性(図42のB1,B2)であることを確認した。HMGB1がこれらの細胞をマイグレーションさせるかを調べるためにボイデンチャンバー法を行った。ボイデンチャンバーの上層にはそれぞれCD11b陽性細胞またはCD11b陰性細胞を入れ、下層にはHMGB1を0・50・100μg/mLになるように10%FBS含有DMEMに希釈して入れた。チャンバーは37℃、5%CO2のインキュベーター内で静置した。4時間後チャンバーのメンブレンを回収し下層に向かってマイグレーションした細胞を染色することで検出した(図43)。
3)12週齢雄PDGFRα-GFPマウスをイソフルランにて全身麻酔し、左下腿頸骨の骨折モデルを作成した。骨折作成直後、24時間後、48時間後の計三回10μgのHMGB1を500μLのPBSに希釈し尾静脈から投与した。陰性コントロールは500μLのPBSを尾静脈から投与した(N=6)。
4)骨折作成72時間後左下腿脛骨を取り出し4%パラホルムアルデヒド含PBSを用いて24時間静置し組織を固定した。PBSで洗浄した後、蛍光実体顕微鏡を用いてGFPの蛍光を検出した(図44)。
CD11b陽性の細胞はGFP陰性でありPDGFレセプターαを発現していないことが示唆された(図42のA1,A2)。CD11b陰性の細胞はGFP陽性でありPDGFレセプターαを発現していることが示唆された(図42のB1,B2)。CD11b陽性(PDGFレセプターα陰性)細胞はHMGB1によってマイグレーションしなかったが、CD11b陰性(PDGFレセプターα陽性)細胞はHMGB1によってマイグレーションした(図43)。
陰性コントロールマウスであるPBS投与(図44のD1)群に比較すると、HMGB1投与(図44のD2)群のうち6匹中4匹において、骨折部位周囲の骨にGFP陽性(PDGFレセプターα陽性)細胞が認められた。
目的:生体移植皮膚組織の機能的再生時における骨髄由来細胞寄与の評価
方法:上記の目的に対して以下の方法により研究を行った。
1)GFP骨髄移植マウスに対する生体皮膚移植系を利用して、移植皮膚片の機能的再生時の骨髄由来細胞寄与程度を検討した。具体的には、C57BL/6雄マウス(6〜8週齢)に致死量放射線(10Gy)を照射し、その直後に尾静脈よりGFP(green fluorescent protein)トランスジェニックマウス由来骨髄細胞(5x106個/0.1ml 生理的リン酸緩衝溶液pH7.4)を移植した。
2)移植骨髄細胞の生着を待って(6週間)得られたGFP骨髄移植マウスの背部皮膚に、新生マウス皮膚(雌)を移植した。
3)移植皮膚片の生着と十分な皮膚組織再生を待って(4週間)、移植皮膚片領域におけるGFP蛍光の集積程度を、蛍光実体顕微鏡を利用して観察した。
4)吸入麻酔下に移植皮膚片を生検により採取し、冷却装置付ミクロトームを用いて皮膚凍結切片(6μm)を作製、4%パラホルムアルデヒド固定(30分間)、組織内細胞核をDAPIで染色、表皮細胞特異的ケラチン5の抗体を用いて免疫染色を施行した後、組織を封入して共焦点レーザー顕微鏡によりGFP陽性骨髄由来細胞の存在を検討した。また一部の標本はHE染色によりその組織構築を検討した。
結果:GFP骨髄移植マウスへの生体皮膚移植系において、再生した皮膚領域に一致した強いGFP蛍光の集積が観察された(図9)。また、移植皮膚片のHE標本を用いた組織学的観察では、多数の毛包を含む皮膚組織の機能的再生が確認された(図9)。共焦点レーザー顕微鏡による観察では、ケラチン5を発現している表皮角化細胞、真皮線維芽細胞、さらには平滑筋細胞や脂肪細胞の多くがGFP蛍光を示し、これらの細胞が骨髄由来であることが示された(図10)。即ち、移植皮膚の機能的再生時に必要な上皮系および間葉系細胞の多くが、骨髄由来幹細胞により供給されていることが初めて明らかとなった。
考察:これらの研究結果は、これまで臨床現場で日常的に行われている皮膚移植における皮膚再生時に、骨髄由来細胞が大きく寄与していることを初めて明確に示したものであり、極めて画期的な発見である。
目的:皮膚組織抽出液内に存在する骨髄間葉系幹細胞誘導因子の同定
方法:疎血状態にある切除皮膚からの放出が予想される骨髄間葉系幹細胞動員因子の同定を目的として、以下の方法により研究を進めた。
1)マウス骨髄由来間葉系幹細胞を得るために、C57BL/6マウスの骨髄細胞を大腿骨もしくは下腿の骨から採取し、10%胎仔ウシ血清含D-MEM(Nacalai 社製)を細胞培養培地として細胞培養皿に撒き、37℃、炭酸ガス濃度5%の条件下で培養した。細胞が占める面積が培養皿底面積に対して70から100%に増殖した時点で、0.25%トリプシン1mMEDTA(Nacalai社製)を用いて細胞を培養皿からはがし、さらに同じ条件で継代培養した。継代作業は少なくとも5回以上繰り返した。さらにこれらの付着細胞を単離培養しフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の分析を行いLin陰性、CD45陰性、CD44陽性、Sca-1陽性、c-kit陰性であることを確認した。これらの細胞は骨細胞、脂肪細胞に分化可能で骨髄間葉系幹細胞の性質を有することを確認した。
2)新生マウス400匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH7.4(PBS)400ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液を作製した。
3)得られた皮膚抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在することを確認するため、ボイデン・チャンバーを用い、本発明者らが既に株化しているC57BL6マウス骨髄由来間葉系幹細胞に対する遊走活性を検討した。具体的にはボイデン・チャンバーの下槽(容量25μl)に皮膚抽出液(25μl)を挿入し、8μmの微細穴を持つポリカーボネートメンブレンを乗せ、さらにこれに接してボイデン・チャンバー上槽(容量50μl)を載せて、その中に骨髄由来間葉系幹細胞浮遊液(5x104個/50ml培養液:DMEM/10%ウシ胎仔血清)を入れ、CO2インキュベーター内で37℃、4〜24時間培養した。培養後、チャンバーの上槽をはずし、シリコン薄膜を取り出して、その微細穴を通過してチャンバー下槽に遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の数を染色により定量的に検討した。
4)皮膚抽出液内の骨髄由来間葉幹細胞動員活性をもつ因子を精製するために、ヘパリンアフィニティーカラム・クロマトグラフィー、および陰イオン交換カラム(Qカラム)クロマトグラフィーを施行した。皮膚抽出液を4℃の9倍容20 mM リン酸バッファー pH 7.5を用い 10倍に希釈した(希釈液A)。あらかじめ、20 mM リン酸バッファー pH 7.5(30ml)をHiTrap Hepalin HP column(カラム容量: 5ml、GE Healthcare)の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液Aをカラムに結合させた。その後20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 100mM NaCl(30ml)でカラムを洗浄した。吸着したタンパクを溶出するため20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 1000mM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。吸着画分をそれぞれ、2)で説明したボイデン・チャンバーを利用した遊走活性評価法により遊走能を有する画分を集めた。これを9倍容50 mM Tris HCl pH 8.0で希釈した(希釈液B)。あらかじめ、50 mM Tris HCl pH 8.0(30ml)をHiTrap mono Q column(カラム容量: 1ml、GE Healthcare)の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液Bをカラムに結合させた。吸着したタンパクを溶出するためTris HCl pH 8.0, 1000mM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。以上の精製過程はすべて4〜16℃で行うことが可能であるが、4〜8℃で行うことが好ましく、4℃で行うことが更に好ましい。この溶出液を2)で説明したボイデン・チャンバーを利用した遊走活性評価方法により評価した。
6)5)のSDS-PAGE電気泳動および銀染色により単一バンドとしてゲル内分画された皮膚抽出液由来蛋白群の中で、骨髄由来間葉系幹細胞動員活性の最も強いクロマトグラフィー精製標品から得られた蛋白バンドをすべて切り出して、質量分析およびデータベース解析により当該蛋白の同定を進めた。
7)同定した蛋白群の中から骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つ候補蛋白を選定し、その候補蛋白を含む精製標品を中和抗体で処理(精製標品溶液100μlを当該蛋白のポリクロナール抗体100倍希釈条件にて氷上で30分間インキュベート)した後、骨髄由来間葉系幹細胞動員活性の阻害程度を、ボイデン・チャンバーを用いた遊走能アッセイにて検討した。
8)得られた骨髄由来間葉系幹細胞精製標品をマトリゲルの中に約10%ボリュームとなるように混入し、直径約1mm、5mm長のシリコンチューブ内に挿入し、これをGFP骨髄移植マウス背部皮下に移植した。2週間後に挿入チューブを取り出して、チューブ内に遊走した骨髄由来細胞から出るGFP蛍光を蛍光測定装置により定量的に解析した。さらに、チューブ内から遊走細胞を取り出し、DMEM/10%ウシ胎仔血清培地に播種してCO2インキュベーター内で培養することにより、骨髄由来間葉系幹細胞の生体内動員活性を検討した。2週間継続して培養した細胞は2%パラホルムアルデヒドで25℃の条件下で、10分間固定した後、5分間ずつ4回PBSを用いてパラホルムアルデヒドを洗浄し、2%スキムミルク液で処理をし、0.5% tween20含有2%スキムミルクで1000倍に希釈した抗マウスケラチン5抗体を4℃の条件下で16時間反応させた。5分間ずつ4回PBSを用いて抗体を洗浄し、2%スキムミルクで1000倍に希釈したAlexa546標識抗ウサギIgG抗体を25℃の条件下で1時間反応させた。
さらに、HMGB1が生体内で骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つことを確認する目的で、この精製標品を入れたシリコンチューブをGFP骨髄移植マウス背部皮下に挿入し、2週間後にチューブ内に動員された細胞の性質を検討した。その結果、対照コントロール(図12におけるSDS-PAGEレーン4に用いた精製標品)に比較して、HMGB1精製標品はGFP陽性の骨髄由来細胞をチューブ内に多数(対照コントロールの約3倍)動員していた(図14)。図15に蛍光実体顕微鏡による強拡大像を示す。さらに、チューブ内に動員されたGFP陽性細胞を取り出し、DMEM/10%ウシ胎仔血清培地内で培養した結果、培養開始直後は円形の浮遊細胞状態であったが(図16)、24時間後にはGFP陽性骨髄由来細胞は培養シャーレに付着し、紡錘系の線維芽細胞様形態、さらには類円形の上皮細胞様形態の細胞として増殖することが確認された(図17)。さらにこれらの細胞を2週間継続して培養するとGFP陽性骨髄由来細胞の中に毛包の形態を呈する細胞を確認した(図18A;明視野、弱拡大、図18B;GFP蛍光、弱拡大、図18C明視野、強拡大、図18D;GFP蛍光、強拡大)。また、上皮ケラチノサイトのマーカーであるケラチン5に対する免疫組織化学を行ったところ、GFP陽性骨髄由来細胞の中にケラチン5陽性細胞を確認した(図18E;明視野、図18F;ケラチン5陽性細胞の蛍光)。
目的:皮膚抽出液中HMGB1ファミリーの同定と骨髄間葉系幹細胞誘導活性の検討
方法:新生マウス皮膚抽出液中に含まれるHMGB蛋白ファミリーの有無をWestern blot 法を用いて確認した。サンプルとして〔参考例2〕で得られた皮膚抽出液を10μl をSDS-PAGE法を用いて電気泳動し、ゲル中で分離した蛋白をブロッティング装置(ATTO)を用いPVDF膜にトランスファーした。3%スキムミルク0.1% Tween 20 含PBS(S-T-PBS)にて、室温で1時間インキュベートした後、S-T-PBSで1000倍に希釈したラビット抗マウスHMGB1 抗体、ラビット抗マウスHMGB2抗体、ラビット抗マウスHMGB3抗体をそれぞれ4℃で16時間反応させた。反応後、同PVDF膜をS-T-PBSにて5分間5回洗浄後、S-T-PBSで2000倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラビットIgG抗体(GE Healthcare)にて同PVDF膜を25℃で1時間インキュベートした。さらにS-T-PBSにて5分間5回洗浄後ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare)を同PVDF膜と反応させ、ECL film を感光させた後現像してHMGB1、HMGB2、HMGB3タンパクの存在を検出した。
目的:骨髄間葉系幹細胞誘導因子組織抽出液の作製方法の確立
方法:6週齢C57BL6一匹分の脳、心臓、腸、腎臓、肝臓及び新生マウス皮膚一匹分を生理的リン酸緩衝液pH7.4(PBS)1ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して組織抽出液とした。得られた抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在することを確認するため、ボイデン・チャンバーを用い、〔参考例2〕と同様に骨髄由来間葉系幹細胞に対する遊走活性を検討した。また、同じサンプル中に含まれるHMGB1の濃度をHMGB1 ELISA kit(シノテスト)を用いて計測した。更に脳、心臓および皮膚の組織抽出液を〔参考例2〕と同様に、ヘパリンアフィニティーカラムに結合させ、結合画分のタンパクの骨髄間葉系幹細胞誘導活性をボイデン・チャンバーを用いて確認した。
目的:培養細胞から間葉系幹細胞遊走活性物質を抽出する方法を確立する。
方法:ヒト胎児腎由来培養細胞株HEK293及びヒト子宮頸癌細胞株HeLaはそれぞれ10%胎仔牛血清含D-MEM(nacalai 社製)で培養した。それぞれの細胞をPBSで洗浄後、細胞107個を4℃の5mlのPBS(nacalai社製)に16時間浸した。重力加速度440Gで4℃で5分間遠心し上清を回収した。ボイデン・チャンバーの上層にヒト骨髄間葉系幹細胞をいれ、下層にDMEMで5倍希釈した細胞抽出液をいれ、ヒト骨髄間葉系幹細胞遊走活性を確認した。
結果:HEK293抽出液もHeLa抽出液も同様に骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性を示した(図26)。
考察:培養細胞をPBSに浸すという簡便な方法で骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性物質を抽出することに成功した。
目的:マウス脳欠損モデルを作成し、局所損傷部位に皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分を徐放化して投与することで、自己の骨髄系に含まれる幹細胞を局所損傷部位に遊走させ、神経系細胞の再生を誘導できないか検討する。
方法:
(1) 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分の作製
切除した新生マウス皮膚からPBS(一匹/ml)中に4℃で16時間インキュベーションし抽出した皮膚抽出液を4℃の9倍容20 mM リン酸バッファー pH 7.5を用い 10倍に希釈した。あらかじめ、20 mM リン酸バッファー pH 7.5(30ml)をHiTrap Hepalin HP column(カラム容量: 5ml、GE Healthcare)の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液をカラムに結合させた。その後20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 100mM NaCl(30ml)でカラムを洗浄した。吸着したタンパクを溶出するため20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 1000mM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。吸着画分をそれぞれ、マウス骨髄由来細胞株の遊走活性を上記に示したボイデン・チャンバー法を用いて評価し遊走能を有する画分を集めた。この活性を有する溶液を皮膚抽出液ヘパリン精製画分として以下の実験に使用した。
マウスに10GyのX線単回照射を行い、骨髄抑制マウスを作成した。
GFPマウスの両側大腿骨および下腿骨より骨髄細胞を採取した。これを照射後24時間経過した骨髄抑制マウスの尾静脈より投与した。なお、投与はイソフルランによる吸入麻酔下に施行した。
GFPマウスの骨髄細胞を移植した骨髄抑制マウスにイソフルランにて吸入麻酔を行い、ペントバルビタール(45mg/kg)を腹腔内に注入した。マウスを脳定位固定装置に固定し、メスにて頭部に正中切開を加えた。ブレグマから右外側2.5mm、前方1mmにドリルを用いて穿頭を施した(図27A)。この部位から深さ3mmの位置を先端にして、20Gサーフロー針の外筒を挿入して固定した。ここでシリンジを用いて、陰圧をかけ、脳組織を一部吸引した(図27B)。
前述の位置に、ハミルトンシリンジと26Gシリンジを用いて、フィブリン糊製剤のフィブリノゲン(ボルヒール(化血研))に溶解した皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分を5μl注入し、次にフィブリン糊製剤のトロンビン(ボルヒール(化血研))を5μl注入した(図27C)。この操作によって、皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分の徐放剤としての効果を狙った。
コントロール群と治療群のマウスとを用いて評価した。適切な経過設定を決め(経時的に)、マウスを4%パラホルムアルデヒドにて灌流固定後、脳の切り出しを行った。さらに、4%パラホルムアルデヒドを外固定した。15%と30%の勾配をつけたショ糖にて脱水後、凍結切片を作成した。
DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)solusionにて核染色を行い、退光防止剤を用いて封入した。共焦点レーザー顕微鏡にて損傷部位(脳組織欠損部)でのGFP陽性細胞の集積を評価した。
結果:投与後、2週間および6週間後のGFP陽性細胞集積を定性的に示す。2週間後(コントロール;図27D, 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分;図27E)および6週間後(コントロール;図27F 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分;図27G)ともに、コントロール群に比して治療群の損傷部位にGFP陽性細胞の集積が高い傾向にあった。
考察:皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分投与により、骨髄由来細胞が脳組織欠損部位に集積し神経細胞の形態を示した。骨髄由来間葉系幹細胞は神経細胞にも分化することが知れており、本結果から、皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分によって脳損傷部位における神経系細胞再生の誘導できることが明らかになった。また、これは、脳虚血性疾患や脳挫傷における脳組織障害部位での神経再生にも応用可能である。
目的:皮膚組織抽出液内に存在する骨髄由来組織幹細胞誘導因子による骨髄組織幹細胞の末梢血への動員
方法:上記の目的に対して以下の方法により研究を行った。
1)骨髄由来組織幹細胞誘導剤の調製:新生マウス(2日齢)25匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH 7.4(PBS)25 mlに浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440 Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液(SE)を作製した。
また、C57/Bl6新生マウス皮膚からTrizol (invitrogen) を用いてRNA を抽出し更にSuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen) を用いてcDNA を合成した。このcDNA をテンプレートとしてHMGB1のcDNAをPCR (ポリメラーゼ連鎖反応)法を用いて増幅し、アミノ酸配列のN末端にFlag tagの配列(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys;配列番号:30)を付加したタンパク質を発現するように、哺乳類細胞でタンパク質を発現させるプラスミドベクターpCAGGSに挿入した(図20)。これらのプラスミドベクターをHEK293 (ヒト胎児腎細胞由来培養細胞株)に遺伝子導入し48時間培養しタンパク質を発現させた。HMGB1タンパク質をそれぞれ発現させた細胞及び培養上清は4℃で16時間インキュベートした後、4400 g・5分間遠心し上清を回収した。この上清50 mL あたり100μLのAnti Flag 抗体Gel(Sigma)を混合し4℃で16時間インキュベートした。遠心しGelを回収した後PBSを用いて、5回洗浄した。更に 3X Flag peptide(final 100μg/ml)を用いて溶出した。溶出したタンパク質はHMGB1 ELISA kit (シノテスト)を用いて濃度を確認し、凍結乾燥後PBSを用いて200μg/mLに調整した。
8週齢雄マウス(C57/Bl6)の尾静脈からマウスHMGB1を250μL(1μg/μL)もしくは陰性コントロール群としてPBS250μLを30G1/2の注射針を装着したシリンジを用い投与した(図29)。投与12時間後、イソフルランによる吸入麻酔下、マウスの心臓からヘパリンコートした1 mLのシリンジを用いて末梢血1 mLを採血し、3 mLのPBSと混合した後、3 mLのFicol(GE healthcare)の上に静かに重層した。遠心機を用い、25℃で400 g、40分間遠心した。中間層の白濁した層の細胞を単核球画分として回収した。回収した細胞に1 mLの溶血剤であるHLB solution(免疫生物研究所)を加え室温で5分インキュベートした。この溶血操作を2回繰り返した。10 mLのPBSを加え、25℃で440 g、5分間遠心し上清を除去して細胞を回収した。この細胞1,000,000個に抗マウスPE標識PDGFRα抗体(e-Bioscience)、PerCy5標識抗マウスCD44抗体(BD biosciences)それぞれをPBSで100倍希釈し20分間室温でインキュベートした。その後この細胞を25℃、440 g、5分間遠心し上清を除去した。1%パラホルムアルデヒド含PBSを400μL加え、フローサイトメトリー解析のサンプルとした。
目的:組み換えHMGB1蛋白の静脈内投与によって、間葉系幹細胞が末梢血中へ動員されるかを確認した。
方法:C57BL6マウス(8〜10週齢、オス)尾静脈より組み換えHMGB1蛋白/生理食塩水(100 μg/ml)を400μl (40μg HMGB1)あるいは生理食塩水400μl投与した。12時間後にマウス末梢血を採取してPBSを加え全量を4mLに希釈した。遠心管にFicoll-Paque Plus(GE)液を3mL 挿入後その上に希釈血液を重層した。400G (18℃)で40分間遠心し、単核球を含む中間層を新しい遠心管に回収し、45 mL のPBSを加え800G(18℃)5分で遠心し上清を除去した。さらにもう一度45 mL のPBSを加え800G(18℃)5分で遠心し上清を除去した。得られた単核球をPhycoerythrobilin(PE)標識抗マウスPDGFRα抗体およびFluorescein isothiocyanate(FITC)標識抗マウスCD44抗体で反応させた後、フローサイトメトリー(Facscan ; Becton, Dickinson and Company)により単核球分画内のPDGFRα陽性/CD44陽性細胞の存在頻度を評価した。
目的:生体移植皮膚組織の機能的再生時における骨髄由来細胞寄与の評価
方法:上記の目的に対して以下の方法により研究を行った。
1)GFP骨髄移植マウスに対する生体皮膚移植系を利用して、移植皮膚片の機能的再生時の骨髄由来細胞寄与程度を検討した。具体的には、C57BL/6雄マウス(6〜8週齢)に致死量放射線(10Gy)を照射し、その直後に尾静脈よりGFP(green fluorescent protein)トランスジェニックマウス由来骨髄細胞(5x106個/0.1ml 生理的リン酸緩衝溶液pH7.4)を移植した。
2)移植骨髄細胞の生着を待って(6週間)、得られたGFP骨髄移植マウスの背部皮膚に、新生マウス皮膚(雌)を移植した。
3)移植皮膚片の生着と十分な皮膚組織再生を待って(4週間)、移植皮膚片領域におけるGFP蛍光の集積程度を、蛍光実体顕微鏡を利用して観察した。
4)吸入麻酔下に移植皮膚片を生検により採取し、冷却装置付ミクロトームを用いて皮膚凍結切片(6μm)を作製、4%パラホルムアルデヒド固定(30分間)、組織内細胞核をDAPIで染色、蛍光退色防止剤入り封入材を用いて組織を封入した後共焦点レーザー顕微鏡によりGFP陽性骨髄由来細胞の存在を検討した。
骨髄内には造血系幹細胞と間葉系幹細胞の二つの幹細胞システムが存在することが報告されている。今回の研究で示された、移植皮膚内に大量動員された骨髄由来上皮系細胞および間葉系細胞が骨髄由来造血系幹細胞から供給されていると予想するのは困難であり、移植組織の機能的再生には骨髄由来間葉系幹細胞が寄与している可能性が強く示唆される。即ち、植皮直後に疎血・壊死方向にある移植皮膚組織から骨髄由来間葉系幹細胞動員因子が放出され、骨髄から間葉系幹細胞を、末梢血液循環を介して移植皮膚片内に動員し、機能的皮膚組織再生を誘導していることが予想された。
目的:皮膚組織抽出液内に存在する骨髄由来組織幹細胞誘導因子の同定
方法:疎血状態にある切除皮膚からの放出が予想される骨髄間葉系幹細胞動員因子の同定を目的として以下の方法のように研究を進めた。
1)マウス骨髄由来間葉系幹細胞を得るために、C57BL/6マウスの骨髄細胞を大腿骨もしくは下腿の骨から採取し、10%胎仔ウシ血清含D-MEM(Nacalai 社製)を細胞培養培地として細胞培養皿に撒き、37℃、炭酸ガス濃度5%の条件下で培養した。細胞が占める面積が培養皿底面積に対して70から100%に増殖した時点で、0.25%トリプシン1mMEDTA(Nacalai社製)を用いて細胞を培養皿からはがし、さらに同じ条件で継代培養した。継代作業は少なくとも5回以上繰り返した。さらにこれらの付着細胞を単離培養しフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の分析を行いLin陰性、CD45陰性、CD44陽性、Sca-1陽性、c-kit陰性であることを確認した。これらの細胞は骨細胞、脂肪細胞に分化可能で骨髄間葉系幹細胞の性質を有することを確認した。
2)新生マウス(2日齢)5匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH7.4(PBS)5ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液を作製した。また同様に、6週齢マウス1匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH7.4(PBS)5ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液を作製した。
3)得られた皮膚抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在することを確認するため、ボイデン・チャンバーを用い、本発明者らが既に株化しているC57BL6マウス骨髄由来間葉系幹細胞に対する遊走活性を検討した。具体的にはボイデン・チャンバーの下槽(容量25μl)に2日齢もしくは6週齢のマウス皮膚抽出液(5μl)とDMEM(20μl)の混合液を挿入し、8μmの微細穴を持つポリカーボネートメンブレンを乗せ、さらにこれに接してボイデン・チャンバー上槽(容量50μl)を載せて、その中に骨髄由来間葉系幹細胞浮遊液(5x104個/50ml培養液:DMEM/10%ウシ胎仔血清)を入れ、CO2インキュベーター内で37℃、4〜24時間培養した。培養後、チャンバーの上槽をはずし、シリコン薄膜を取り出して、その微細穴を通過してチャンバー下槽に遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の数を染色により定量的に検討した(図34)。
分画したサンプルをそれぞれ、上記と同様にボイデン・チャンバーを利用した遊走活性を評価した(図37)。
分画したサンプルをそれぞれ、上記と同様にWestern blot法を用いてS100A8とS100A9のタンパク質の存在を検出した(図38)。
Claims (7)
- 以下の(a)から(q)のいずれかに記載の物質を含有する組織再生促進剤であって、再生が必要な組織とは異なる組織に投与される薬剤;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(j)S100A8タンパク質
(k)S100A8タンパク質を分泌する細胞
(l)S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(m)S100A9タンパク質
(n)S100A9タンパク質を分泌する細胞
(o)S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(p)細胞又は組織の抽出液
(q)細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。 - 非経口投与される、請求項1記載の薬剤。
- 注射投与である、請求項2記載の薬剤。
- 血管内、筋肉内、皮下、皮内又は腹腔内に投与される、請求項1記載の薬剤。
- 細胞又は組織の抽出液が細胞又は組織を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される、請求項1〜4のいずれかに記載の薬剤。
- 細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分が以下の工程を含む方法で製造される、請求項1〜4のいずれかに記載の薬剤;
(a)細胞又は組織を溶媒に浸す工程、
(b)工程(a)で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
(c)固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。 - 神経組織、骨組織、又は皮膚組織の再生促進に用いられる、請求項1〜6のいずれかに記載の薬剤。
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