CN110205289A - 扩增骨髓间充质干细胞的方法、系统和计算机可读介质 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及扩增骨髓间充质干细胞的方法、系统和计算机可读介质。该方法包括：将骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃、N2的体积浓度为91～93％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为4.5～5.5％、O2的体积浓度为1.5～2.5％的条件下进行1～3天的诱导培养；将诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃、CO2的体积浓度为4.5～5.5％、O2的体积浓度为15％～25％条件下进行继续培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。该方法可以快速地扩增骨髓间充质干细胞并获得增殖能力、生物活性及内皮分化功能俱佳的骨髓间充质干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体地，本发明涉及扩增骨髓间充质干细胞的方法、系统和计算机可读介质，更具体地，本发明涉及扩增骨髓间充质干细胞的方法、扩增骨髓间充质干细胞的系统以及计算机可读介质。
背景技术
骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)是存在于骨髓中的一群异质性细胞，它具有自我更新能力和多向分化的潜能，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、内皮细胞等，并能形成多种结缔组织，如骨骼肌、肌腱、韧带、真皮、脂肪和骨髓基质等，在组织再生、创伤修复以及多种疾病的治疗中都有着巨大的潜力。而干细胞来源的内皮细胞在组织损伤修复及缺损区域血流重建方面具有更加重要而广泛的意义。
BMMSCs是目前研究较为深入的一类成体干细胞。体外培养的BMMSCs在形态上呈梭形或纺锤形，生长方式一般为漩涡状生长。多项研究表明，体外分离得到的BMMSCS是多种细胞混杂的细胞群，其表面抗原也不具有均一性，它能够表达表皮干细胞、内皮细胞、间充质干细胞的表面标志物，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等，还表达CD90、CD105等。但不表达造血干细胞的表面标志物，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达主要组织相容性复合物类分子，如HLA-DR抗原等。
CD105是一种内皮细胞增殖的标志物，为间充质干细胞的特征性表型，也是转化生长因子β(TGFβ)受体复合物的成分之一，与TGF-β1有较高的亲和力，可与TGF-β受体I组成功能性的受体复合物，参与调节细胞的增值与分化。TGF-β在体外可以抑制内皮细胞的生长，而在体内却可通过结合炎症细胞诱导其释放血管生成因子刺激内皮细胞分裂增殖。另外，研究表明CD105在活性血管生成区高表达，因此，CD105不仅调节细胞对TGF-β的反应，也促进血管的形成，对于移植治疗急性心肌梗死、慢性心肌梗死以及心脏衰竭引起的缺血性心脏病具有重要意义。
血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin/CD144)是内皮细胞黏附连接的主要结构蛋白。相邻的血管内皮钙黏蛋白细胞外结构域通过钙离子发生同质性连接形成血管内皮钙黏蛋白连接复合体，而构成了内皮细胞间的黏附连接。CD144于内皮细胞成熟阶段开始表达，12d达高峰，是血管内皮的特异性钙黏蛋白，专一地表达在血管内皮细胞的表面，并集中分布于内皮细胞连接处，是黏附连接的主要黏附分子。大量研究表明，血管内皮钙黏蛋白对维持血管内皮细胞极性和血管的完整性是必不可少的。因此研究者们将CD144作为内皮终末分化的特异性标志。
目前在对BMMSCs的基础研究与临床应用研究中，都需要大量的具有良好生物活性和分化功能的细胞。然而，BMMSCs在骨髓内的含量很少，且随着供者年龄的增长，BMMSCs在体内的数量逐渐减少，在体外的常规培养过程中出现增殖能力下降、生物活性及功能变差的状况，这在一定程度上限制了对BMMSCs更深入的研究与临床应用。
因此，需要一种新的体外培养方法以获得足量的、生物特性和体内分化修复功能都更好的BMMSCs。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
相对于空气中21％的O2含量，人体内各组织器官均处于低氧状态。研究发现，人体中骨小梁表面密质网内骨髓的集落形成能力是周围其他骨髓的4倍，而骨小梁表面密质网内的O2浓度仅为1％，大脑、肝脏、心脏、肾脏等内脏器官的平均氧含量为2％-9％，骨小梁表面密质网内的O2浓度明显低于其他部位。BMMSCs在体内正是存在于平均氧浓度1％的乏氧的骨髓腔中，由此，发明人推测，低氧的环境更有利于人BMMSCs的生长。另外，发明人发现，常规的体外培养BMMSCs的方法是在常氧的环境中进行的，然而，在BMMSCs的实际临床应用中，需把经过体外扩增培养的BMMSCs直接输入到人体中。对于在常氧条件下培养的细胞，在输入到人体的过程中会经历从常氧到低氧环境的骤然变化，可能会导致细胞难以快速适应体内的环境，生物特性和功能发生变化，从而影响细胞在体内发挥预期的治疗效果。
因此，为了得到数量更多、细胞状态也更接近体内细胞的BMMSCs，发明人在结合当前常氧培养方法的基础上，体外模拟BMMSCs在体内骨髓腔中的生长环境，提出了一种新的在体外扩增培养BMMSCs的方法，该方法可以快速地扩增骨髓间充质干细胞并获得增殖能力、生物活性以及内皮分化功能俱佳的骨髓间充质干细胞，适合应用于体外扩增后重新移植回体内进行干细胞治疗的目的。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种扩增骨髓间充质干细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃，如36.5、37或37.5℃；N2的体积浓度为91～93％，如91.3、91.5、91.7、92、92.3、92.5或92.7％；空气的体积浓度为1％；CO2的体积浓度为4.5～5.5％，如4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3或5.4％；O2的体积浓度为1.5～2.5％，如1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3或2.4％的条件下进行1～3天，如1.5、2或2.5天的诱导培养；将诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃，如36.5、37或37.5℃；CO2的体积浓度为4.5～5.5％，如4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3或5.4％；O2的体积浓度为15～25％，如16、17、18、19、20、21、22、23或24％的条件下进行继续培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。发明人发现，所述诱导培养的时间过长或过短，会导致扩增得到的骨髓间充质干细胞的增殖潜能和内皮分化能力变弱，甚至会导致BMMSCs的凋亡，低氧预处理(即诱导培养)无法达到最佳效果。所述诱导培养在上述条件下进行时，扩增得到的骨髓间充质干细胞，不仅具有更高的增殖潜能，体外存活率更高，而且能较好地保持其生物特性及内皮分化功能，细胞表面分子CD105的表达率更高。究其原因，发明人发现，经过所述诱导培养后的骨髓间充质干细胞，其细胞反应趋向减轻低氧状态所造成的损伤影响，包括细胞周期停止、大分子合成减少、应激控制基因表达增加。因而，所述诱导培养条件在维持骨髓间充质干细胞良好的细胞状态和细胞干性上发挥着重要作用，同时可以促进细胞的快速增殖和向内皮方向的分化。根据本发明实施例的方法能快速地获得增殖能力、生物活性及内皮分化功能都较好的骨髓间充质干细胞，以满足实际科研及临床用中对细胞的需求，对于移植治疗急性心肌梗死、慢性心肌梗死以及心脏衰竭引起的缺血性心脏病具有良好的应用前景。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述诱导培养是在温度为37℃、N2的体积浓度为92％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为2％的条件下进行2天。在一些实施例中，所述诱导培养是在湿度饱和的条件下进行的。根据本发明的实施例，所述继续培养是在温度为37℃、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为21％的条件下进行的。发明人发现，所述诱导培养和所述继续培养在上述条件下进行时，根据本发明实施例的方法扩增得到的骨髓间充质干细胞的增殖能力、生物活性以及内皮分化功能更好。
根据本发明的实施例，所述诱导培养和所述继续培养中，培养基包括：α-MEM、FBS、谷氨酰胺和青链霉素。在一些实施例中，所述谷氨酰胺是以水溶液的形式提供的，所述谷氨酰胺的水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mmol/L。在一些实施例中，基于所述培养基的总体积，所述α-MEM的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺的水溶液的体积分数为1％，所述青链霉素的浓度为100U/mL。发明人发现，利用所述培养基进行诱导培养和继续培养，可以获得增殖能力、生物活性及内皮分化功能更好的骨髓间充质干细胞。
根据本发明的实施例，所述骨髓间充质干细胞为原代骨髓间充质干细胞。需要说明的是，所述原代骨髓间充质干细胞为利用淋巴细胞分离液分离得到的原代骨髓间充质干细胞。另外，在接种后的诱导培养和继续培养的整体培养过程中，每隔2-3天换液一次，同时，如果检测到细胞长到80％以上融合，则进行一次传代，每次传代的细胞密度为2*105/cm2。由于在目前临床应用上大部分使用P5代的干细胞给病人使用，因此，为与今后的应用相一致，发明人在进行功能学鉴定和分化能力鉴定时，所使用的细胞也均选用P5代骨髓间充质干细胞。
根据本发明的实施例，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度为2*105/cm2。需要说明的是，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度指的是将原代骨髓间充质干细胞进行接种以便进行诱导培养时的接种密度。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种扩增骨髓间充质干细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将原代骨髓间充质干细胞进行接种，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度为2*105/cm2；将接种后的所述原代骨髓间充质干细胞在温度为37℃、N2的体积浓度为92％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为2％的条件下进行2天的诱导培养；将诱导培养后的骨髓间充质干细胞在温度为37℃、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为21％条件下进行继续培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞；
其中，所述诱导培养和所述继续培养中，培养基由α-MEM、FBS、谷氨酰胺水溶液和青链霉素制备而成，所述谷氨酰胺水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mmol/L，基于所述培养基的总体积，所述α-MEM的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺水溶液的体积分数为1％，所述青链霉素的浓度为100U/mL。根据本发明实施例的方法可以快速地扩增骨髓间充质干细胞并获得增殖能力、生物活性及内皮分化功能更优的骨髓间充质干细胞。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种扩增骨髓间充质干细胞的系统。根据本发明的实施例，参考图5，所述系统包括：诱导培养装置100，所述诱导培养装置100用于将骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃，如36.5、37或37.5℃；N2的体积浓度为91～93％，如91.3、91.5、91.7、92、92.3、92.5或92.7％；空气的体积浓度为1％；CO2的体积浓度为4.5～5.5％，如4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3或5.4％；O2的体积浓度为1.5～2.5％，如1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3或2.4％的条件下进行1～3天，如1.5、2、2.5天的诱导培养；以及继续培养装置200，所述继续培养装置200与所述诱导培养装置100相连，用于将诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃，如36.5、37或37.5℃；CO2的体积浓度为4.5～5.5％，如4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3或5.4％；O2的体积浓度为15～25％，如16、17、18、19、20、21、22、23或24％的条件下进行继续培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。在一些实施例中，所述诱导培养装置为低氧培养箱，例如型号为ThermoHERACELL 150i的低氧培养箱。发明人发现，所述诱导培养装置与所述继续培养装置直接相连，以便将诱导培养后的骨髓间充质干细胞从诱导培养装置快速地转移到继续培养装置中进行继续培养，有利于实现骨髓间充质干细胞扩增的自动化。由此，利用根据本发明实施例的系统能快速地扩增得到增殖能力、生物活性及内皮分化功能都较好的骨髓间充质干细胞。
根据本发明的实施例，上述系统还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述诱导培养是在温度为37℃、N2的体积浓度为92％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为2％的条件下进行2天。在一些实施例中，所述诱导培养是在湿度饱和的条件下进行的。根据本发明的实施例，所述继续培养是在温度为37℃、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为21％的条件下进行的。发明人发现，所述诱导培养和所述继续培养在上述条件下进行时，利用根据本发明实施例的系统扩增得到的骨髓间充质干细胞的增殖能力、生物活性及内皮分化功能更好。
根据本发明的实施例，所述诱导培养和所述继续培养中，培养基包括：α-MEM、FBS、谷氨酰胺和青链霉素。在一些实施例中，所述谷氨酰胺是以水溶液的形式提供的，所述谷氨酰胺的水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mmol/L。在一些实施例中，基于所述培养基的总体积，所述α-MEM的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺的水溶液的体积分数为1％，所述青链霉素的浓度为100U/mL。发明人发现，利用所述培养基进行诱导培养和继续培养，可以获得增殖能力、生物活性及内皮分化功能更好的骨髓间充质干细胞。
根据本发明的实施例，所述骨髓间充质干细胞为原代骨髓间充质干细胞。根据本发明的实施例，参考图6，所述系统进一步包括：接种装置300，所述接种装置300用于将所述原代骨髓间充质干细胞进行接种处理。发明人发现，所述接种装置300与所述诱导培养装置100不一定直接相连，所述接种装置300只要能够将原代骨髓间充质干细胞定量接种到培养基中，便于进行后续的诱导培养即可，可以是单独设置的装置。由此，利用根据本发明实施例的系统能更加快速、简便地获得增殖能力、生物活性及内皮分化功能都较好的骨髓间充质干细胞。
根据本发明的实施例，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度为2*105/cm2。需要说明的是，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度指的是将原代骨髓间充质干细胞进行接种以便进行诱导培养时的接种密度。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种计算机可读介质。根据本发明的实施例，所述计算机可读介质中存储有指令，所述指令被适于处理执行，以便通过下列步骤扩增骨髓间充质干细胞：将骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃，如36.5、37或37.5℃；N2的体积浓度为91～93％，如91.3、91.5、91.7、92、92.3、92.5或92.7％；空气的体积浓度为1％；CO2的体积浓度为4.5～5.5％，如4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3或5.4％；O2的体积浓度为1.5～2.5％，如1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3或2.4％的条件下进行1～3天，如1.5、2、2.5天的诱导培养；将诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃，如36.5、37或37.5℃；CO2的体积浓度为4.5～5.5％，如4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3或5.4％；O2的体积浓度为15～25％，如16、17、18、19、20、21、22、23或24％的条件下进行继续培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞；
其中，所述诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞的活力不低于90％，密度为90～95％，且表达表皮干细胞、内皮细胞、间充质干细胞的表面标志物，如CD90、CD105，不表达造血干细胞的表面标志物，如CD34、CD45等，也不表达主要组织相容性复合物类分子，如HLA-DR抗原；所述继续培养后的所述骨髓间充质干细胞的活力不低于90％，密度为90～95％，且表达表皮干细胞、内皮细胞、间充质干细胞的表面标志物，如CD90、CD105，不表达造血干细胞的表面标志物，如CD34、CD45等，也不表达主要组织相容性复合物类分子，如HLA-DR抗原，为目标骨髓间充质干细胞的指示。由此，利用根据本发明实施例的计算机可读介质能快速地扩增得到增殖能力、生物活性及内皮分化功能都较好的骨髓间充质干细胞。
本领域普通技术人员可以理解，上述各种扩增骨髓间充质干细胞的方法的全部或部分步骤可以通过程序来指令相关硬件完成，该程序可以存储于计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘或光盘等，有利于实现骨髓间充质干细胞扩增的自动化。需要说明的是，所述诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞的表面标志和活力可以作为存储介质中相关程序是否指令相关硬件进行下一个操作步骤—继续培养的指示。换句话说，如果诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞达到上述表面标志和活力指标，则存储介质中的相关程序会自动作出指令，指示相关硬件进行下一个操作步骤—继续培养。同样地，所述继续培养后的所述骨髓间充质干细胞的表面标志和活力可以作为存储介质中相关程序是否指令相关硬件进行下一个操作步骤—如将获得的骨髓间充质干细胞进行继续扩增、功能检测或分化的指示。其中，所述目标骨髓间充质干细胞指的是所述继续培养后的表面标志和活力达到了上述指标，可以用于后续的如继续扩增、功能检测或分化的骨髓间充质干细胞。
根据本发明的实施例，上述计算机可读介质还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述诱导培养是在温度为37℃、N2的体积浓度为92％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为2％的条件下进行2天。在一些实施例中，所述诱导培养是在湿度饱和的条件下进行的。根据本发明的实施例，所述继续培养是在温度为37℃、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为21％的条件下进行的。发明人发现，所述诱导培养和所述继续培养在上述条件下进行时，利用根据本发明实施例的计算机可读介质获得的骨髓间充质干细胞的增殖能力、生物活性及内皮分化功能更好。
根据本发明的实施例，所述诱导培养和所述继续培养中，培养基包括：α-MEM、FBS、谷氨酰胺和青链霉素。在一些实施例中，所述谷氨酰胺是以水溶液的形式提供的，所述谷氨酰胺的水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mmol/L。在一些实施例中，基于所述培养基的总体积，所述α-MEM的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺的水溶液的体积分数为1％，所述青链霉素的浓度为100U/mL。发明人发现，利用所述培养基进行诱导培养和继续培养，可以获得增殖能力、生物活性及内皮分化功能更好的骨髓间充质干细胞。
根据本发明的实施例，所述骨髓间充质干细胞为原代骨髓间充质干细胞。需要说明的是，所述原代骨髓间充质干细胞为利用淋巴细胞分离液分离得到的原代骨髓间充质干细胞。另外，在接种后的诱导培养和继续培养的整体培养过程中，每隔2-3天换液一次，同时如果检测到细胞长到80％以上融合，则进行一次传代，每次传代的传代密度为2*105/cm2。由于在目前临床应用上大部分使用P5代的干细胞给病人使用，因此，为与今后的应用相一致，发明人在进行功能学鉴定和分化能力鉴定时，所使用的细胞也均选用P5代骨髓间充质干细胞。
根据本发明的实施例，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度为2*105/cm2。需要说明的是，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度指的是将原代骨髓间充质干细胞进行接种以便进行诱导培养时的接种密度。
附图说明
图1是根据本发明实施例的不同低氧方法扩增后BMMSCs的增殖曲线鉴定结果示意图；
图2是根据本发明实施例的不同低氧方法扩增后BMMSCs的诱导成脂细胞鉴定结果示意图；
图3是根据本发明实施例的不同低氧方法扩增后BMMSCs的诱导成骨细胞鉴定结果示意图；
图4是根据本发明实施例的不同低氧方法扩增后BMMSCs的向内皮细胞分化鉴定结果示意图，染色为内皮标志蛋白CD144的免疫荧光染色，其中：(a)为未经过低氧预处理，未内皮诱导的骨髓MSC，(b)为未经过低氧预处理，向内皮诱导的骨髓MSC，(c)为经过低氧预处理2h，向内皮诱导的骨髓MSC，(d)为经过低氧预处理2d，向内皮诱导的骨髓MSC；
图5是根据本发明实施例的扩增骨髓间充质干细胞的系统的结构示意图，其中，实线表示两个装置直接相连；
图6是根据本发明另一实施例的扩增骨髓间充质干细胞的系统的结构示意图，其中，虚线表示两个装置不一定直接相连。
附图标记：
100：诱导培养装置
200：继续培养装置
300：接种装置
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明采取以下技术方案：
将体外分离后的骨髓间充质干细胞置于36～38℃、4.5～5.5％CO2、1.5～2.5％O2的低氧培养箱中培养1-3d，然后转移置36～38℃、4.5～5.5％CO2，O2的体积浓度为15～25％常氧培养箱中，培养基为α-MEM、1％谷氨酰胺和5％胎牛血清(FBS)，并进行了相关的检测。其具体步骤如下：
(1)体外分离大鼠股骨和胫骨中的骨髓液，并用密度为1.077g/mL的大鼠淋巴细胞分离液进行分离提取，获得骨髓单个核细胞。
(2)分离后的骨髓间充质干细胞置于36～38℃、4.5～5.5％CO2、1.5～2.5％O2的低氧培养箱中培养，培养时间为1-3d，然后转移置36～38℃、4.5～5.5％CO2、O2的体积浓度为15～25％常氧培养箱中。
(3)经处理后的细胞，用CCK8检测了其增殖能力，用流式细胞仪、诱导分化和免疫荧光进行其功能学鉴定。
步骤(1)中所述的分离骨髓液的方法是先将股骨和胫骨两头的关节面小心横断切开，当看到有微红的骨髓露出时，用注射器带9号针头吸取α-MEM培养液插入骨髓腔(针头以刚刚能够插入骨髓腔为好，不要将股骨折断)，先从股骨头一侧冲洗，缓慢将注射器下压，可见冲出物开始呈混浊的浅红色，然后变清亮。如此反复冲洗4-5次。
所述的用密度为1.077g/mL的大鼠淋巴细胞分离液分离提取骨髓单个核细胞的方法是先将5mL密度为1.077g/mL的大鼠淋巴细胞分离液加入离心管中，然后将骨髓细胞重悬于培养液中，沿管壁一滴一滴的缓缓地加入到淋巴细胞分离液上。轻轻地放置离心机中，离心机设置为慢升慢降，以1800rpm，离心20-30min。离心后，轻轻吸取界面上的细胞至另一个离心管中。
步骤(2)中所述的培养骨髓间充质干细胞的培养基的配置方法为：α-MEM：89mL；FBS：10mL；谷氨酰胺水溶液：1mL。配置时在超净台内进行并保证严格无菌，使用期限为2周。
所述的低氧培养箱型号为Thermo HERACELL 150i。使用过程中，将温度设置为36～38℃、CO2含量设定为4.5～5.5％、O2含量设定为1.5～2.5％。
步骤(3)所述的CCK8的检测方法是将种好板的细胞上加配置好的CCK8，孵育4h，然后用酶标仪进行检测；
所述的流式细胞仪进行功能学鉴定的方法是收集细胞后，用PE-CD90、PE-CD45、FITC-CD105抗体在4度冰箱中旋转架上孵育30-40min。
所述的诱导分化的方法是收集细胞后，定向诱导成成脂、成骨、内皮细胞分化，然后通过染色和免疫荧光观察。
本发明技术方案带来的有益效果：
本发明提供了一种快速地分离、扩增骨髓间充质干细胞并获得增殖能力强、状态佳的骨髓间充质干细胞的新方法，即一种经低氧条件处理扩增的骨髓间充质干细胞的新方法。所述经低氧条件处理来扩增骨髓间充质干细胞是将体外分离后的骨髓间充质干细胞置于36～38℃、4.5～5.5％CO2、1.5～2.5％O2的低氧培养箱中培养1～3d。实验结果表明，经该低氧条件处理来扩增的骨髓间充质干细胞具有更高的增殖潜能，可有效地从骨髓中获得较多的骨髓间充质干细胞，增加骨髓间充质干细胞在体外的存活率，不仅能较好地保持其生物特性及功能，而且提高了细胞表面分子CD105的表达率。该处理方法能快速地获得增殖能力、生物活性及功能都较好的骨髓间充质干细胞，以满足实际科研及临床用中对细胞的需求。因而本发明对于移植治疗急性心肌梗死、慢性心肌梗死以及心脏衰竭引起的缺血性心脏病具有良好的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《SIRT1isrequired for long-term growth of human mesenchymal stem cells》(Yuan HF,ZhaiC,Yan XL,Zhao DD,Wang JX,Zeng Q,Chen L,Nan X,He LJ,Li ST,Yue W,Pei XT.SIRT1isrequired for long-term growth ofhuman mesenchymal stem cells.J Mol Med(Berl).2012，90(4):389-400.)
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例中的常氧培养条件指的是37℃、5％CO2、21％O2的培养条件；低氧处理2h、2d指的是在37℃、5％CO2、2％O2的条件下预处理2h或2d。
实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用；在产业实施中，来源于大鼠等哺乳动物的各种细胞均为离体的，并包括从细胞库中取得、或商业购买获得，还包括按照已有文献的介绍制备获得，以及经可以商业获取的多种干细胞用已知方法诱导而来的。
实施例经低氧诱导处理的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)增殖及其功能鉴定
一、大鼠BMMSCs的扩增
1)取雄性6个月龄的SD大鼠(购自广州中医药大学动物实验中心)，乙醚处死，75％酒精浸泡5min；超净台内铺手术巾，于消毒托盘中剪开大鼠皮肤。
2)用无菌剪刀等手术器械分离大鼠股骨和胫骨，用注射器吸取α-MEM培养液(购自GIBCO公司)反复冲洗骨髓腔至颜色发白(约4-5次)。
3)用400目筛网过滤冲洗液，离心，弃上清，收集细胞。
4)吸取密度为1.077g/mL的大鼠淋巴细胞分离液(购自天津灏洋公司)5mL加入离心管中，用5mLα-MEM培养液将骨髓细胞沉淀重悬，然后将其沿管壁轻轻加到大鼠淋巴细胞分离液上，1800rpm离心30分钟(室温下)。
5)小心吸取界面间的乳白色单个核细胞层，加入α-MEM培养液中充分混匀，离心，弃上清，洗涤细胞沉淀。
6)将分离的BMMSCs按2×105/cm2的浓度接种于装有含10％FBS(购自Hyclone公司)的α-MEM培养液(预先加入青-链霉素100U/mL)的直径10cm的细胞培养皿中，置于37℃、5％CO2、2％O2、饱和湿度的孵箱中进行低氧培养，不同时间设定组别的细胞分别培养不同时间后，转移至常氧条件下(37℃、5％CO2、21％O2)进行培养。
7)接种48h后更换新鲜培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每隔2-3天换液一次。待细胞长到80％融合时，用TrypLETM Express(购自GIBCO公司)消化细胞进行传代培养。连续扩增至P5代。由于临床应用大部分使用P5代的细胞，因此，以下功能学鉴定和分化鉴定的实验细胞均用P5代骨髓间充质干细胞细胞。
二、经低氧处理的BMMSCs的增殖及其功能鉴定
1.经低氧处理后BMMSCs的增殖曲线鉴定
1)大鼠BMMSCS经分离后，每一组按照800个细胞重悬于100μL的培养基中，低氧2h、1d、2d、3d、4d、7d，每组三个平行，加入至96孔板中，置于37℃、5％CO2、2％O2的低氧培养箱中培养。
2)低氧培养结束24h后，且细胞贴壁后，加入配制好的CCK8(10μL加入100μL培养基中)，36～38℃孵育4h，用酶标仪进行检测，连续进行测试7d。细胞增殖结果见图1，其中：正常组为：细胞未经低氧处理；低氧2h组：细胞经低氧处理2h；低氧1d组：细胞经低氧处理1d；低氧2d组：细胞经低氧处理2d；低氧3d组：细胞经低氧处理3d；低氧4d组：细胞经低氧处理4d；低氧7d组：细胞经低氧处理7d。测试方法为：CCK-8增殖实验。
图1结果表明：低氧培养的时间不同，细胞增殖的速度存在的差异较小，但是低氧处理2d组在培养至第4、5、6d时细胞增殖的速度相对较快一点。
2.经低氧处理后BMMSCs的功能学鉴定
1)分别取相同数量的经低氧2h、2d处理和常氧培养条件下(其他培养条件相同)的BMMSCs，消化后吹打收集细胞并离心。
2)用PBS重悬后分别等分为4份，分别加入4个1.5mL EP管中。
3)离心，去上清。
4)按100μL的反应体系，各管分别加2μLPE-CD90(购自Biolegend公司)，PE-CD45(购自Biolegend公司)，FITC-CD105(购自Millipore公司)，以及PBS(流式空白管)，4℃孵育30min。
5)PBS洗涤后，用流式细胞仪(Becton Dickinson，USA)检测BMMSCs的表面分子，细胞表面分子的表达结果见下表1。
表1：不同低氧方法扩增后BMMSCs的流式鉴定结果
| CD45 | CD90 | CD105 | |
| 常氧组(对照组) | 1.29％ | 99.66％ | 27.77％ |
| 2％O<sub>2</sub>处理2h | 1.52％ | 99.94％ | 46.89％ |
| 2％O<sub>2</sub>低氧处理2d | 1.05％ | 99.56％ | 59.74％ |
由上表1分析可知，BMMSCs培养条件经过不同条件的处理后，低氧处理2h组、低氧处理2d组、对照组表面分子CD45均表达阴性，CD90均表达阳性；但是各组CD105的表达有明显差异，与低氧处理2h相比，低氧处理2d的骨髓MSC标志物CD105提高，同时血细胞标志物CD45显著下调，表明骨髓MSC得到了更好的纯化。
3.经低氧处理后BMMSCs的分化能力鉴定
分别取相同数量的经低氧2h、2d处理和常氧条件下(作为对照组)的BMMSCs，消化后吹打收集细胞并离心，其中，对照组是在37℃、5％CO2、21％O2中培养获得的BMMSCs。
(1)向成脂细胞分化：以1.0×105个cell/孔接种于24孔培养板中，每孔加入0.5mLPL培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每3天换液1次，待细胞密度达到100％时，弃上清，每孔加入0.5mL提前配置好的大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液(Cyagen，货号：RASMX-90031)培养3天，然后换成大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基B液培养24h，如此循环3-5个周期后，B液继续培养4-7天，期间每3天更换一次B液。诱导结束后以油红O染液进行染色分析。其中，A液、B液指的是上述货号的商品化的诱导培养基自带的A、B液。
结果见图2，其中，染色为：油红O；细胞起始接种密度相同，所用成脂诱导分化体系相同。对照组：未经过低氧预处理，成脂诱导的骨髓MSC；低氧2h组：细胞经过低氧预处理2h后，成脂诱导的骨髓MSC；低氧2d组：细胞经过低氧预处理2d后，成脂诱导的骨髓MSC。从图2中可以看到，细胞经过低氧2h和低氧2d处理组均能向成脂细胞分化。
(2)向成骨细胞分化：每孔加入0.25mL 0.1％明胶至24孔培养板中，摇匀使其覆盖孔底，室温孵育30min后弃去明胶，晾干。取处理后的细胞，常规消化后成单细胞悬液，以5×104个cell/孔接种于已包被明胶的24孔培养板中，每孔加入0.5mL PL培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后弃上清，每孔加入0.5mL提前配置好的成骨诱导完全培养基，每3天换液一次，诱导3周后以VON KOSSA钙染色试剂盒进行成晚骨染色分析。
结果见图3，其中，染色为：VON KOSSA钙染色；细胞起始接种密度相同，所用成骨诱导分化体系相同。对照组：未经过低氧预处理，成骨诱导的骨髓MSC；低氧2h组：细胞经过低氧预处理2h后，成骨诱导的骨髓MSC；低氧2d组：细胞经过低氧预处理2d后，成骨诱导的骨髓MSC。从图3中可以看到，细胞经过低氧2h和低氧2d处理组均能向成骨细胞分化。
(3)向内皮细胞分化：吸去24孔板中的培养上清，用PBS洗1-2次；用新鲜配制的(两周内)4％多聚甲醛固定15min，用PBS洗2次；常温下加0.1％TritonX-100破膜10min，用PBS洗2次；用山羊血清室温下封闭30min，吸去山羊血清(不洗涤)；加入CD144抗体工作液200μL，阴性对照组加入PBS代替一抗，4℃下孵育过夜(12-16h)；PBS洗3次，5min/次；加入FITC标记的兔抗山羊IgG工作液，36～38℃下避光孵育30min；PBS洗3次，每次5min；用DAPI(1:500稀释)染色2min，并用PBS洗2次；加入200μLPBS，于荧光显微镜下观察。
结果见图4，其中，图片放大倍数：100X；细胞起始接种密度相同，所用内皮诱导体系相同，图中细胞染色为CD144免疫荧光检测结果。从图4中可以看到，低氧预处理2d后即(d)组，CD144+内皮细胞数量及染色强度显著高于低氧预处理2h组即(c)组；和未经预处理的常规骨髓MSC内皮诱导组(b)组相比，低氧预处理2d后，虽然CD144+染色强度和细胞数量基本相同，但细胞状态要优于前者(前者细胞已经伸出代表细胞状态不佳或衰老的细胞伪足)，因此，经低氧处理2d后有利于骨髓MSC向内皮细胞定向诱导分化。
在本说明书的描述中，参考术语“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (14)
1.一种扩增骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：
将骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃、N2的体积浓度为91～93％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为4.5～5.5％、O2的体积浓度为1.5～2.5％的条件下进行1～3天的诱导培养；
将诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃、CO2的体积浓度为4.5～5.5％、O2的体积浓度为15％～25％条件下进行继续培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养是在温度为37℃、N2的体积浓度为92％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为2％的条件下进行2天；
任选地，所述继续培养是在温度为37℃、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为21％的条件下进行的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养和所述继续培养中，培养基包括：α-MEM、FBS、谷氨酰胺和青链霉素；
任选地，所述谷氨酰胺是以水溶液的形式提供的，所述谷氨酰胺的水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mmol/L；
任选地，基于所述培养基的总体积，所述α-MEM的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺的水溶液的体积分数为1％，所述青链霉素的浓度为100U/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞为原代骨髓间充质干细胞；
任选地，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度为2*105/cm2。
5.一种扩增骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：
将原代骨髓间充质干细胞进行接种，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度为2*105/cm2；
将接种后的所述原代骨髓间充质干细胞在温度为37℃、N2的体积浓度为92％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为2％的条件下进行2天的诱导培养；
将诱导培养后的骨髓间充质干细胞在温度为37℃、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为21％条件下进行继续培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞；
其中，所述诱导培养和所述继续培养中，培养基由α-MEM、FBS、谷氨酰胺水溶液和青链霉素制备而成，所述谷氨酰胺水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mmol/L，基于所述培养基的总体积，所述α-MEM的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺水溶液的体积分数为1％，所述青链霉素的浓度为100U/mL。
6.一种扩增骨髓间充质干细胞的系统，其特征在于，包括：
诱导培养装置，所述诱导培养装置用于将骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃、N2的体积浓度为91～93％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为4.5～5.5％、O2的体积浓度为1.5～2.5％的条件下进行1～3天的诱导培养；
继续培养装置，所述继续培养装置与所述诱导培养装置相连，用于将诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃、CO2的体积浓度为4.5～5.5％、O2的体积浓度为15％～25％条件下进行继续培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述诱导培养是在温度为37℃、N2的体积浓度为92％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为2％的条件下进行2天；
任选地，所述继续培养是在温度为37℃、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为21％的条件下进行的。
8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述诱导培养和所述继续培养中，培养基包括：α-MEM、FBS、谷氨酰胺和青链霉素；
任选地，所述谷氨酰胺是以水溶液的形式提供的，所述谷氨酰胺的水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mmol/L；
任选地，基于所述培养基的总体积，所述α-MEM的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺的水溶液的体积分数为1％，所述青链霉素的浓度为100U/mL。
9.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞为原代骨髓间充质干细胞。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，进一步包括：接种装置，所述接种装置用于将所述原代骨髓间充质干细胞进行接种处理；
任选地，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度为2*105/cm2。
11.一种计算机可读介质，其特征在于，所述计算机可读介质中存储有指令，所述指令被适于处理执行，以便通过下列步骤扩增骨髓间充质干细胞：
将骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃、N2的体积浓度为91～93％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为4.5～5.5％、O2的体积浓度为1.5～2.5％的条件下进行1～3天的诱导培养；
将诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞在温度为36～38℃、CO2的体积浓度为4.5～5.5％、O2的体积浓度为15％～25％条件下进行继续培养，以便扩增所述骨髓间充质干细胞；
其中，所述诱导培养后的所述骨髓间充质干细胞的活力不低于90％，密度为90～95％，且表达表皮干细胞、内皮细胞、间充质干细胞的表面标志物，不表达造血干细胞的表面标志物，也不表达主要组织相容性复合物类分子；
所述继续培养后的所述骨髓间充质干细胞的活力不低于90％，密度为90～95％，且表达表皮干细胞、内皮细胞、间充质干细胞的表面标志物，不表达造血干细胞的表面标志物，也不表达主要组织相容性复合物类分子，为目标骨髓间充质干细胞的指示。
12.根据权利要求11所述的计算机可读介质，其特征在于，所述诱导培养是在温度为37℃、N2的体积浓度为92％、空气的体积浓度为1％、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为2％的条件下进行2天；
任选地，所述继续培养是在温度为37℃、CO2的体积浓度为5％、O2的体积浓度为21％的条件下进行的。
13.根据权利要求11所述的计算机可读介质，其特征在于，所述诱导培养和所述继续培养中，培养基包括：α-MEM、FBS、谷氨酰胺和青链霉素；
任选地，所述谷氨酰胺是以水溶液的形式提供的，所述谷氨酰胺的水溶液中，所述谷氨酰胺的浓度为200mmol/L；
任选地，基于所述培养基的总体积，所述α-MEM的体积分数为89％，所述FBS的体积分数为10％，所述谷氨酰胺的水溶液的体积分数为1％，所述青链霉素的浓度为100U/mL。
14.根据权利要求11所述的计算机可读介质，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞为原代骨髓间充质干细胞；
任选地，所述原代骨髓间充质干细胞的接种密度为2*105/cm2。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190906 |