CN102083962A - 生物体内功能性细胞的高效采集方法 - Google Patents

生物体内功能性细胞的高效采集方法 Download PDF

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Abstract

在将填充了具有动员生物体内的特定功能细胞的活性的生物因子的生物低侵袭性容器留置在生物体内，在使特定功能细胞迁移到容器内后，将容器取出到生物体外，或者从留置于生物体内的容器直接回收动员到容器内的功能性细胞团。

Description

生物体内功能性细胞的高效采集方法
技术领域
本发明涉及用于将生物体内组织中极少量地存在的干细胞等功能性细胞低侵袭且高效地回收的新的细胞采集方法。
背景技术
以往，作为从生物体内采集高功能细胞的方法，例如，当为骨髓造血干细胞时，有将针直接刺入长骨或骨盆骨的骨髓中以采集骨髓液，然后在给予人的情况下通过离心分离将干细胞团浓缩，以干细胞表面标记为指标用细胞仪采集、确认荧光标记的细胞等方法；当为末梢血干细胞时，有通过给予G-CSF将造血干细胞动员到末梢血中，然后采集末梢血并分离造血干细胞等方法；当为间充质干细胞时，有直接培养骨髓液、回收附着性增殖细胞，从而得到间充质干细胞的方法，通过手术采集脂肪组织等末梢组织并分离、培养其中存在的间充质干细胞等方法。但是，从骨髓采集骨髓液由于侵袭性强、伴随着疼痛、并且有骨髓内感染引起骨髓炎的危险，因此其施行需要专家来进行极严密的医疗技术，并且难以多次施行。末梢组织的手术采集也存在同样的风险。利用G-CSF的造血干细胞动员在经济上的负担重、并且也难以多次施行。
如果能够开发出更高效且安全地采集生物体内功能性细胞的方法，则不用说对于苦于需要这些细胞的很多难治性疾病的患者来说是个鼓舞人心的好消息。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Transplantation of hematopoietic stem cells from theperipheral blood.J Cell Mol Med.2005；9：37-50
非专利文献2：Role of mesenchymal stem cells in regenerate medicine：application to bone and cartilage repair.Expert Opin Biol Ther.2008；8：
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供用于将生物体内组织中极少量地存在的干细胞等功能性细胞低侵袭且高效地回收的新技术。
用于解决课题的手段
本发明提供仅通过将管低侵袭性地插入生物体内，从而高效地采集生物体内功能性细胞的全新的技术。
具体而言，在用生物低刺激性有机硅树脂制成的圆筒状管(单面为开放面、其相反侧面为封闭面，长径为10毫米、截面积为约2平方毫米)内分别填充HMGB1、透明质酸、磷酸缓冲液等，然后移植到GFP骨髓移植小鼠背部皮下。移植2周后回收管，采集被动员且聚集到管内的细胞，对一部分细胞进行细胞培养，一部分进行利用FACS的细胞表面标记的分析。其结果，与磷酸缓冲液相比，从填充了其他因子的管回收到显著多的PDGFRα阳性细胞，并确认了这些细胞团中包含具有骨分化能力和软骨分化能力的间充质干细胞。
本申请基于该认识提供以下的发明。
〔1〕一种从由皮下取出到体外的容器回收细胞团的方法。
〔2〕根据上述的从由皮下取出到体外的容器回收细胞团的方法，其中，所述细胞团被以下的(a)～(r)中任一项记载的物质、或者以下的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物从骨髓动员到所述容器内；
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
(j)S100A8蛋白质
(k)分泌S100A8蛋白质的细胞
(l)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
(m)S100A9蛋白质
(n)分泌S100A9蛋白质的细胞
(o)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
(p)透明质酸
(q)细胞或组织的提取液
(r)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
〔3〕一种收集骨髓细胞的方法，其包含由从埋入皮下的容器回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序。
〔4〕一种收集骨髓细胞的方法，其包含由从埋入皮下的容器回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序，其中，所述细胞团被以下的(a)～(r)中任一项记载的物质、或以下的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物从骨髓动员到所述容器内；
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
(j)S100A8蛋白质
(k)分泌S100A8蛋白质的细胞
(l)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
(m)S100A9蛋白质
(n)分泌S100A9蛋白质的细胞
(o)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
(p)透明质酸
(q)细胞或组织的提取液
(r)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
〔5〕根据〔3〕或〔4〕所述的方法，其包含在从细胞团分离出骨髓细胞的工序之前，从取出到体外的所述容器回收细胞团的工序。
〔6〕根据〔2〕或〔4〕所述的方法，其中细胞或组织的提取液是通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的。
〔7〕根据〔2〕或〔4〕所述的方法，其中，细胞或组织的提取液的肝素结合级分是通过包含以下工序的方法制造的；
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序、
(b)使工序(a)中得到的提取液与固定化肝素接触的工序、和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的工序。
〔8〕一种细胞团，其是通过〔1〕、〔2〕、〔6〕和〔7〕中任一项所述的方法回收的。
〔9〕一种骨髓细胞，其是通过〔3〕～〔7〕中任一项所述的方法分离出来的。
〔10〕一种组织再生剂，其含有〔8〕所述的细胞团。
〔11〕一种组织再生剂，其含有〔9〕所述的骨髓细胞。
〔12〕一种回收细胞团的方法，其包含以下工序；
(I)将容器埋入皮下的工序、
(II)从容器回收细胞团的工序。
〔13〕根据〔12〕所述的方法，其包含在工序(I)之后将以下的(a)～(r)中任一项记载的物质、或以下的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物给予血管或肌肉的工序；
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
(j)S100A8蛋白质
(k)分泌S100A8蛋白质的细胞
(l)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
(m)S100A9蛋白质
(n)分泌S100A9蛋白质的细胞
(o)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
(p)透明质酸
(q)细胞或组织的提取液
(r)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
〔14〕根据〔12〕所述的方法，所述容器含有以下的(a)～(r)中任一项记载的物质、或以下的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物；
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
(j)S100A8蛋白质
(k)分泌S100A8蛋白质的细胞
(l)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
(m)S100A9蛋白质
(n)分泌S100A9蛋白质的细胞
(o)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
(p)透明质酸
(q)细胞或组织的提取液
(r)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
〔15〕一种收集骨髓细胞的方法，其包含以下工序；
(I)将容器埋入皮下的工序、
(II)从容器回收细胞团的工序、
(III)从回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序。
〔16〕根据〔15〕所述的方法，其包含在工序(I)之后，将以下的(a)～(r)中任一项记载的物质、或以下的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物给予血管或肌肉的工序；
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
(j)S100A8蛋白质
(k)分泌S100A8蛋白质的细胞
(l)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
(m)S100A9蛋白质
(n)分泌S100A9蛋白质的细胞
(o)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
(p)透明质酸
(q)细胞或组织的提取液
(r)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
〔17〕根据〔15〕所述的方法，其中，容器含有以下的(a)～(r)中任一项记载的物质、或以下的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物；
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
(j)S100A8蛋白质
(k)分泌S100A8蛋白质的细胞
(l)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
(m)S100A9蛋白质
(n)分泌S100A9蛋白质的细胞
(o)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
(p)透明质酸
(q)细胞或组织的提取液
(r)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
〔18〕根据〔13〕、〔14〕、〔16〕和〔17〕中任一项所述的方法，其中，细胞或组织的提取液是通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的。
〔19〕根据〔13〕、〔14〕、〔16〕和〔17〕中任一项所述的方法，其中，细胞或组织的提取液的肝素结合级分是通过包含以下工序的方法制造的；
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序、
(b)使工序(a)中得到的提取液与固定化肝素接触的工序、和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的工序。
〔20〕一种细胞团，其是通过〔12〕～〔14〕中任一项所述的方法回收的。
〔21〕一种骨髓细胞，其是通过〔15〕～〔17〕中任一项所述的方法分离出来的。
〔22〕一种组织再生剂，其含有〔20〕所述的细胞团。
〔23〕一种组织再生剂，其含有〔21〕所述的骨髓细胞。
附图说明
图1为生物体内功能性细胞的高效回收方法的概略图。通过将填充了生物体内功能性细胞的特异性动员因子的低刺激性管(硅胶管等)留置在生物体内，从而将末梢循环中或者组织中存在的功能性细胞选择性地动员到管内。
图2为显示管内聚集的细胞(tube-entrapping cells；TECs)为GFP阳性的照片。
图3为TECs培养开始24小时后的照片。左照片表示附着于培养塑料平皿的增殖的成纤维细胞样细胞和上皮细胞样细胞的亮场像、右照片表示其暗视野的GFP荧光像。
图4为评价从管内回收的TECs的成骨细胞分化能力的照片。将从管回收的细胞在成骨细胞分化诱导培养基中进行培养，结果确认在约2周时分化为茜素红染色阳性成骨细胞。
图5为评价从管内回收的TECs的脂肪细胞分化能力的照片。将从管回收的细胞在脂肪细胞分化诱导培养基中进行培养，结果确认在约2周时分化为油红染色阳性脂肪细胞。
图6为评价从管内回收的TECs的表皮细胞分化能力的照片。将从管回收的细胞在表皮细胞分化诱导培养基中进行培养，结果确认在约2周时分化为表达表皮细胞特异性角蛋白5的角化细胞。
图7为研究PDGFRα和CD44在TECs中的表达的图。确认了PDGFRα阳性和CD44阳性细胞被回收到管内。
图8为使用Western blot法检测新生小鼠皮肤提取液中的HMGB家族的照片。
图9为HMGB1表达载体的图。
图10为显示在HEK293细胞表达的纯化重组Flag tag-HMGB家族融合蛋白质的Western blot的结果的照片。
图11为显示使用了boyden小室的重组HMGB1、HMGB2、HMGB3的骨髓间充质干细胞迁移活性的图。任一重组蛋白与对照组相比均显示迁移活性。
图12为显示在小鼠的皮肤溃疡治疗模型中HMGB家族的治疗结果的图。HMGB1、HMGB2、HMGB3与对照组相比均显示显著地缩小溃疡面积的效果。
图13为使用boyden小室确认人HMGB1和人皮肤提取液具有使人骨髓来源的间充质干细胞迁移的活性的照片。
图14为用肝素柱纯化小鼠心脏、小鼠脑和小鼠皮肤提取液中的骨髓间充质干细胞诱导活性物质并使用boyden小室确认活性的照片。
图15为使用boyden小室法确认培养细胞株HEK293和HeLa提取液的人骨髓间充质干细胞迁移活性的照片。任一培养细胞株均显示人骨髓间充质干细胞迁移活性。
图16A为将小鼠固定于脑定位固定装置，用手术刀在头部正中切开，使用钻头进行头部穿孔的照片。图16B为使用注射器并对脑施加负压以吸引脑组织的一部分的照片。图16C为注入5μl将溶解于纤维蛋白胶制剂(纤维蛋白原)的皮肤提取液肝素柱纯化级分，接着注入5μl纤维蛋白胶制剂(凝血酶)后的照片。图16D和图16E为脑损伤模型治疗2周后的照片。与对照的图16D相比可见在使用皮肤提取液肝素柱纯化级分的治疗组的图16E中GFP阳性细胞聚集。图16F和图16G为脑损伤模型治疗6周后的照片。与对照的图16F相比可见在使用皮肤提取液肝素柱纯化级分的治疗组的图16G中GFP阳性细胞聚集。
图17为表示使用了boyden小室测定的皮肤提取液对骨髓来源的间充质干细胞的迁移能力活性的测定结果的照片。其是用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行染色而得到的图像，所述骨髓间充质干细胞从boyden小室的上槽内通过具有8μm的微孔的聚碳酸酯膜的微孔迁移到含有皮肤提取液的下槽侧并附着于膜下槽侧。向下层中加入从2日龄小鼠和6周龄小鼠采集的皮肤的提取液。
图18为使用Western blot法确认皮肤提取液中的S100A8、S100A9的蛋白质的存在情况的图。
图19为显示将皮肤提取液中的Heparin结合蛋白质从肝素亲和层析柱利用NaCl浓度梯度进行洗脱的结果的照片。各级分的蛋白质利用SDS-PAGE进行分离并用银染色进行检测。
图20为表示使用了boyden小室测定的皮肤提取液对骨髓来源的间充质干细胞的迁移能力活性的测定结果的照片。其是用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行染色而得到的图像，所述骨髓间充质干细胞从boyden小室的上槽内通过膜上的微孔迁移到皮肤提取液的肝素结合的各级分(下槽侧)中并附着于膜下槽侧。
图21为使用Western blot法检测皮肤提取液的肝素结合的各级分中的S100A8、S100A9蛋白质的存在情况的结果的照片。
图22为S100A8、S100A9表达载体的图。
图23为表示使用了boyden小室测定的皮肤提取液对骨髓来源的间充质干细胞的迁移能力活性的测定结果的照片。其是用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行染色而得到的图像，所述骨髓间充质干细胞从boyden小室的上槽内通过膜上的微孔迁移到分别含有重组GST-S100A8、GST-S100A9、皮肤提取液的下层侧并附着于膜下槽侧。
图24A为从小鼠的尾静脉给予GST-S100A8、GST-S100A9，并对12小时后末梢血中的CD45阴性细胞的级分进行CD44、PDGFRα、PDGFRβ的FACS而得到的图。图24B为以FACS的结果为基础，对GST-S100A8、GST-S100A9给予12小时后末梢血中的CD45阴性CD44阳性PDGFRα阳性细胞、或者CD45阴性CD44阳性PDGFRβ阳性细胞的出现进行定量而得到的图。
图25为显示S100A8对正常小鼠的皮肤溃疡的治疗效果的图。
图26为显示S100A8对糖尿病小鼠的皮肤溃疡的治疗效果的图。
图27为显示被皮肤提取液、末梢血提取液动员到装置内的细胞对皮肤溃疡的治疗效果的图。
图28为显示用荧光显微镜检测被末梢血提取液的肝素亲和层析柱结合成分动员到装置内的骨髓细胞的图。
图29为用荧光显微镜检测被末梢血提取液的肝素亲和层析柱结合成分动员到装置内的骨髓细胞，并用图像处理软件对细胞数进行定量而得到的图。
图30为用荧光显微镜检测分别使用S100A8、HMGB1、HMGB2、HMGB3动员到装置内的骨髓来源的细胞(GFP阳性细胞)的图(A：S100A81、B：HMGB1、C：HMGB2D：HMGB3E：阴性对照)。
图31为分别使用S100A8、HMGB1、HMGB2动员到装置内的骨髓来源的细胞对在BALB/cAJcl-nu/nu制作的皮肤溃疡的治疗效果的图。
图32为HMGB1表达载体的图。
图33为从小鼠尾静脉给予皮肤提取液(SE)并采集末梢血的图。
图34为用抗小鼠PDGFRα抗体、抗小鼠CD44抗体对给予皮肤提取液(SE)12小时后的小鼠末梢血单核细胞级分进行荧光标记，并利用流式细胞仪进行分级的图。上面3个为阴性对照的PBS给予组(n＝3)、下面3个为皮肤提取液(SE)给予组(n＝3)。长轴表示CD44的表达量、横轴表示PDGFRα的表达量。蓝线围住的部分显示CD44阳性且PDGFRα阳性细胞群，其在皮肤提取液给予组(SE)中与PBS组相比增加。
图35为从小鼠尾静脉给予HMGB1并采集末梢血的图。
图36为用抗小鼠PDGFRα抗体、抗小鼠CD44抗体对给予HMGB112小时的小鼠末梢血单核细胞级分进行荧光标记，并用流式细胞仪进行分级的图。左图为阴性对照的PBS给予小鼠、右图为HMGB1给予小鼠的图。长轴表示CD44的表达量、横轴表示PDGFRα的表达量。蓝线围住的部分表示CD44阳性且PDGFRα阳性细胞群，其在HMGB1给予小鼠中与PBS给予小鼠相比增加。
图37A为显示具有CD44和PDGFRα的细胞的存在频度的流式细胞仪的结果的图。末梢血中的PDGFRα阳性且CD44阳性细胞和PDGFRα阳性且CD44阴性细胞的所有细胞群均在HMGB1给予后增加。图37B为显示比较PDGFRα阳性且CD44阳性细胞、图37C为显示比较PDGFRα阳性且CD44阴性细胞分别在PBS给予组和HMGB1给予组的末梢血中的出现频度的结果的图。在所有细胞群中，HMGB1给予组均统计学上显著地增加。
具体实施方式
本发明提供从由皮下取出到体外的容器回收细胞团的方法。
另外，本发明还提供一种收集骨髓细胞的方法，其包含由从埋入皮下的容器回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序。所述方法也可以包含在从细胞团分离出骨髓细胞的工序之前，从取出到体外的所述容器回收细胞团的工序。
本发明提供一种回收细胞团的方法，其包含以下工序：
(I)将容器埋入皮下的工序
(II)从容器回收细胞团的工序。
另外，本发明还提供一种收集骨髓细胞的方法，其包含以下工序：
(I)将容器埋入皮下的工序
(II)从容器回收细胞团的工序
(III)从回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序。
另外，上述方法还可以包含在工序(I)之后，将容器从皮下取出的工序。
作为上述容器的材料，优选有机硅树脂、乙烯基树脂、塑料、其他生物低刺激性材料，但并不限制于此。另外，关于容器的大小，虽然在本实施例中使用长径10mm×截面积2mm(容积为20ml、小鼠用)的容器，但只要是能够插入皮下的尺寸，则不限制于此。关于容器的厚度，虽然在本实施例中使用壁厚为约0.5mm的容器，但只要是足够强度维持所需的厚度，则不限制于此。关于容器的形状，虽然在本实施例中使用圆筒形且仅单面开放的容器，但只要是圆筒、纺锤形、球形、卵形等不会对生物体组织造成损伤的形状，则没有特殊制限。作为本申请中使用的容器，只要是硅胶管、乙烯基树脂袋、注射用留置针等能够在生物体内留置的医用器材、医用材料，则没有特别限制。
本发明中，从容器回收的细胞团包括骨髓来源的细胞。
本发明的骨髓细胞为除造血系干细胞和其来源的白细胞、红细胞、血小板以外的细胞，目前包括以被称为骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞的细胞为代表的干细胞或者存在于骨髓中的组织祖细胞团。作为本发明的骨髓细胞，为能够通过骨髓采集(骨髓细胞采集)或者末梢血采集来进行分离的细胞。造血系干细胞为非附着细胞，本发明的骨髓细胞可以以附着细胞的形式如下获得：通过对从骨髓采集(骨髓细胞采集)、末梢血采集获得的血液中的单核细胞级分进行培养而获得。另外，本发明的骨髓细胞包括间充质干细胞，并优选具有分化为成骨细胞(诱导分化可通过观察钙的沉积来识别)、软骨细胞(可通过阿辛蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来识别)、脂肪细胞(可通过苏丹III染色阳性来识别)，进一步优选具有分化为成纤维细胞、平滑肌细胞、基质细胞、肌腱细胞等间充质细胞，更进一步优选具有分化为神经细胞、上皮细胞(例如表皮角化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族)、血管内皮细胞的能力，分化后的细胞并不限定于上述细胞，也包括分化为肝脏、肾脏、胰脏等实质器官细胞的能力。
在本发明中，骨髓来源的间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞是指存在于骨髓内的细胞，其能够从骨髓直接采集或者从其他组织(血液、皮肤、脂肪或其他组织)间接地采集并作为附着于(塑料或者玻璃制)培养皿的细胞进行培养、增殖，其为具有分化为骨、软骨、脂肪等间充质组织(间充质干细胞)、或者分化为骨骼肌、心肌、甚至分化为神经组织、上皮组织(多能干细胞)的能力这样的特征的细胞，其可以通过骨髓血采集、末梢血采集、甚至通过采集脂肪等间充质组织、皮肤等上皮组织、脑等神经组织来获得。另外，骨髓来源的间充质干细胞或骨髓来源的多能干细胞或骨髓多能干细胞还具有下述特征：通过将一度附着于培养皿的这些细胞给予生物体的损伤部位，具有分化为例如构成皮肤的角质形成细胞等上皮组织、构成脑的神经系统的组织的能力。
本发明的骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞除了具有分化为成骨细胞(诱导分化可通过观察钙的沉积等来识别)、软骨细胞(可通过阿辛蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来识别)、脂肪细胞(可通过苏丹III染色阳性等来识别)的能力外，优选具有分化为例如成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、基质细胞、肌腱细胞等间充质细胞、神经细胞、色素细胞、表皮细胞、毛囊细胞(表达细胞角蛋白家族、毛发角蛋白家族等)、上皮细胞(例如表皮角化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族等)、内皮细胞，并进一步优选具有分化为肝脏、肾脏、胰脏等实质器官细胞的能力，但分化后的细胞并不限定于上述细胞。
组织祖细胞被定义为具有单方向性地分化为除血液系统以外的特定组织细胞的能力的未分化细胞，包括具有分化为上述的间充质组织、上皮组织、神经组织、实质器官、血管内皮的能力的未分化细胞。
另外，作为本发明的骨髓细胞，可列举出例如细胞表面标记CD44、PDGFRα和PDGFRβ中的至少1个为阳性的骨髓细胞，但并不限定于这样的细胞。
本发明中，将器器埋入皮下的工序如下进行：在施行全身(或局部)麻醉后，用手术刀将皮肤切开几毫米，使用前端为圆形的金属棒(蚊式止血钳等)通过钝性分离在皮下脂肪组织内形成需要的空间，在该空间内埋入硅胶管等细胞回收用容器，最后缝合或用stapler固定。
作为用于将容器留置在皮下的其他方法，可以考虑将注射用针的外筒与内筒(注射针)一起刺入皮下，然后仅取出内筒而将外筒留置；将插入有导向针的球囊导管的导管插入皮下，在去除导向针后，用药液使球囊扩大而留置等方法。
作为埋入容器的对象，可列举出人或非人动物，可例示出例如人、小鼠、大鼠、猴、猪、狗、兔、仓鼠、豚鼠等，优选人。
本发明中，作为从容器回收细胞团的工序，可以是从在埋入皮下的状态下的容器回收细胞团的工序、或者是从皮下取出容器，从取出的容器回收细胞团的工序的任一种。例如，在本申请实施例中，通过切开皮肤将埋入皮下的硅胶管回收，用移液管从管内吸引、回收细胞，但也可以使用其他方法。
作为从在埋入皮下的状态下的容器回收细胞团的方法，使要埋入皮下的容器的一端延长为管状并在取出到体外的状态下固定，在细胞回收时将注射器固定到管上，利用负压吸引、回收细胞。之后，将HMGB1溶液等、细胞诱导液再注入到留置在体内的管内，从而能够反复地回收埋入皮下的容器内的细胞。将能够实施该方法的形状的容器留置在体内。
本发明中，从回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序可以如下进行：例如从回收的细胞团将附着于培养皿的附着性细胞分离。
作为其他方法，可以如下进行：例如使从取出到体外的管内利用移液管操作回收的细胞与细胞表面标记CD44、PDGFRα、PDGFRβ中的至少一种反应，在与用不同荧光种类标记的抗体反应后，用细胞仪以各荧光的有无为指标分别取出具有特定的细胞表面标记的细胞团。
另外，作为其他方法，还有下述方法(MACS)：例如代替荧光而使用固定有金属粒子的抗体，使其同样地与各种细胞表面标记反应，利用磁力使与该金属附着抗体结合的细胞在管内吸附、固定于一个壁上，使抗体和非反应性细胞充分地洗脱，然后除去磁力，回收吸附于管内的目标细胞。
本发明提供一种从由皮下取出到体外的容器回收细胞团的方法，其中，所述细胞团被以下的(a)～(r)中任一项记载的物质、或以下的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物从骨髓动员到该容器内。
另外，本发明还提供一种收集骨髓细胞的方法，其包含从埋入皮下的容器回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序，其中，所述细胞团被以下的(a)～(r)中任一项记载的物质、或以下的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物从骨髓动员到该容器内。上述方法还可以包含在从细胞团分离出骨髓细胞的工序之前，从取出到体外的所述容器回收细胞团的工序。
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
(j)S100A8蛋白质
(k)分泌S100A8蛋白质的细胞
(l)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
(m)S100A9蛋白质
(n)分泌S100A9蛋白质的细胞
(o)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
(p)透明质酸
(q)细胞或组织的提取液
(r)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
本发明提供一种回收细胞团的方法，其包含以下工序，且包含在工序(I)之后，将上述的(a)～(r)中任一项记载的物质、或上述的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物给予血管或肌肉的工序。
(I)将容器埋入皮下的工序
(II)从容器回收细胞团的工序。
对于工序(II)，可以从置于体内的容器回收细胞团，也可以从取出到体外的容器回收细胞团。
另外，本发明还提供一种收集骨髓细胞的方法，其包括以下工序，且包含在工序(I)之后，将上述的(a)～(r)中任一项记载的物质、或上述的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物给予血管或肌肉的工序。
(I)将容器埋入皮下的工序
(II)从容器回收细胞团的工序
(III)从回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序。
对于工序(II)，可以从置于体内的容器回收细胞团，也可以从取出到体外的容器回收细胞团。
本发明提供一种回收细胞团的方法，其包含以下工序，且容器含有上述的(a)～(r)中任一项记载的物质、或上述的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物。
(I)将容器埋入皮下的工序
(II)从容器回收细胞团的工序。
对于工序(II)，可以从置于体内的容器回收细胞团，也可以从取出到体外的容器回收细胞团。
另外，本发明提供一种收集骨髓细胞的方法，其包含以下工序，且容器含有上述的(a)～(r)中任一项记载的物质、或上述的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物。
(I)将容器埋入皮下的工序
(II)从容器回收细胞团的工序
(III)从回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序。
对于工序(II)，可以从置于体内的容器回收细胞团，也可以从取出到体外的容器回收细胞团。
此外，本发明还提供一种回收细胞团的方法，其包含以下工序，且容器含有上述的(a)～(r)中任一项记载的物质、或上述的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物，并且包含在工序(I)之后，将上述的(a)～(r)中任一项记载的物质、或上述的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物给予血管或肌肉的工序。
(I)将容器埋入皮下的工序
(II)从容器回收细胞团的工序
对于工序(II)，可以从置于体内的容器回收细胞团，也可以从取出到体外的容器回收细胞团。
另外，本发明提供一种收集骨髓细胞的方法，其包含以下工序，且容器含有上述的(a)～(r)中任一项记载的物质、或上述的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物，并且包含在工序(I)之后，将上述的(a)～(r)中任一项记载的物质、或上述的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物给予血管或肌肉的工序。
(I)将容器埋入皮下的工序
(II)从容器回收细胞团的工序
(III)从回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序
对于工序(II)，可以从置于体内的容器回收细胞团，也可以从取出到体外的容器回收细胞团。
作为本发明中的HMGB1蛋白质，可例示出包含序列号：1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的HMGB1蛋白质还包括与包含序列号：1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可列举出例如1)由在序列号：1、3或5中记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成，且与包含序列号：1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质、和2)为由与包含序列号：2、4或6中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质，且与包含序列号：1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。
作为本发明中的HMGB2蛋白质，可例示出包含序列号：7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的HMGB2蛋白质还包括与包含序列号：7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可列举出例如1)由在序列号：7、9或11中记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成，且与包含序列号：7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质、和2)为由与包含序列号：8、10或12中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质，且与包含序列号：7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。
作为本发明中的HMGB3蛋白质，可例示出包含序列号：13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的HMGB3蛋白质还包括与包含序列号：13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可列举出例如1)由在序列号：13或15中记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成，且与包含序列号：13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质、和2)为由与包含序列号：14或16中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质，且与包含序列号：13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。
作为本发明中的S100A8蛋白质，可例示出包含序列号：17、19或21中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的S100A8蛋白质还包括与包含序列号：17、19或21中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可列举出例如1)由在序列号：17、19或21中记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成，且与包含序列号：17、19或21中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质，和2)为由与包含序列号：18、20或22中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质，且与包含序列号：18、20或22中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。
作为本发明中的S100A9蛋白质，可例示出包含序列号：23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的S100A9蛋白质还包括与包含序列号：23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可列举出例如1)由在序列号：23、25或27中记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成，且与包含序列号：23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质，和2)为由与包含序列号：24、26或28中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质，且与包含序列号：23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。
与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质可以是包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质的同源物或者旁系同源物。关于与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质，本领域技术人员可以通过公知的方法(実験医学別冊·遺伝子工学ハンドブック，pp246-251、羊土社、1991年発行)来分离。
作为与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质，可列举出具有骨髓来源的细胞的诱导活性的蛋白质。
作为由在序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质包括天然存在的蛋白质。一般来说，如通过干扰素基因等所已知的，真核生物的基因具有多态性(polymorphism)。根据该多态性所产生的碱基序列的变化的不同而不同，有时1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加。属于这样自然存在的蛋白质且具有在序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且与由序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等同的蛋白质也包括在本发明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质中。
另外，只要是与由序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等同的蛋白质，则人为制作的变异蛋白质也包括在本发明中。作为对给定的碱基序列施加随机变异的方法，已知例如通过DNA的亚硝酸处理的碱基对的替换(Hirose，S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，79：7258-7260，1982)。该方法中，通过对欲导入变异的片段进行亚硝酸处理，能够在特定的片段中随机地导入碱基对的替换。或者另外，作为在任意位点导入目标变异的技术，有gappedduplex法等(Kramer W.and Fritz HJ.，Methods in Enzymol.，154：350-367，1987)。将克隆要导入变异的基因而得到的环状双链载体分成单链，使其与在目标部位具有变异的合成寡核苷酸杂交。使被限制性内切酶切断而形成线状的载体来源的互补单链DNA与上述环状单链载体黏着(anneal)，用DNA聚合酶填充该载体与上述合成核苷酸之间的间隙，进而通过连接形成完整的双链环状载体。
所改变的氨基酸的数目典型地为50个氨基酸以内、优选为30个氨基酸以内、进一步优选为5个氨基酸以内(例如1个氨基酸)。
在人为地替换氨基酸的情况下，如果替换为性质相似的氨基酸，则容易维持原蛋白质的活性。本发明的蛋白质包括为在上述氨基酸替换中进行保守性替换而得到的蛋白质，且与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。在替换对于蛋白质活性来说重要的区域的氨基酸等情况下，保守性替换是重要的。这样的氨基酸的保守性替换对于本领域技术人员来说是熟知的。
作为相当于保守性替换的氨基酸的组，可列举出例如碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等。
另外，通过非保守性替换也会使蛋白质的活性等进一步提高(包括例如恒定的活化型蛋白质(constitutively activated proteins)等)。
此外，作为获得与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质的方法，可列举出利用杂交反应的方法。即，将编码如序列号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28所示的本发明的编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA、或者或其断片制成探针，分离能够与其杂交的DNA。若在严格的条件下实施杂交反应，能够选择同源性高的DNA作为碱基序列，其结果是分离的蛋白质含有与HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质在功能上等同的蛋白质的可能性增加。同源性高的碱基序列是指能够显示例如70％以上、优选90％以上的相同性。
另外，严格的条件具体地是指例如在6×SSC、40％甲酰胺、25℃下进行杂交、且在1×SSC、55℃下进行洗涤的条件。严格性受盐浓度、甲酰胺的浓度或温度等条件的影响，但只要是本领域技术人员，就能够设定这些条件以获得所需的严格性。
通过利用杂交，能够将编码例如除包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质以外的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的同源物的DNA分离。
与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质通常与序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列具有高的同源性。高的同源性是指至少30％以上、优选50％以上、进一步优选80％以上(例如95％以上)的序列具有相同性。关于碱基序列或氨基酸序列的相同性，可以利用使用了网络的同源性检索网站来进行[例如在日本DNA数据库(DDBJ)中，可以利用FASTA、BLAST、PSI-BLAST和SSEARCH等同源性检索[例如日本DNA数据库(DDBJ)网站上的同源性检索(Search and Analysis)的网页：http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html]。另外，在National Center forBiotechnology Information(NCBI)中，还可以进行使用了BLAST的检索(例如NCBI主页的网站的BLAST网页：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/；Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.，1990，215(3)：403-10；Altschul，S.F.&Gish，W.，Meth.Enzymol.，1996，266：460-480；Altschul，S.F.et al.，Nucleic Acids Res.，1997，25：3389-3402)]。
例如，在使用Advanced BLAST 2.1中的氨基酸序列的相同性的计算中，相同性(identity)的值(％)可以如下进行检索来得到：程序使用blastp，将Expect值设定为10、将Filter全部设定为OFF，Matrix使用BLOSUM62，并将Gap existence cost、Per residue gap cost和Lambda ratio分别设定为11、1、0.85(缺省值)(Karlin，S.and S.F.Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68；Karlin，S.and S.F.Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-7)。
本发明的蛋白质或在功能上与其等同的蛋白质可以是进行了糖链等生理性修饰、荧光或放射性物质等标记或者与其他蛋白质的融合等各种修饰而得到的蛋白质。特别是在后文所述的基因重组体中，糖链的修饰可能因用于表达的宿主的不同而产生差异。但是，即使在糖链的修饰方面存在差异，只要显示与本说明书中公开的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质相同的性状，则均属于本发明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质或在功能上等同的蛋白质。
HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质不仅可以从生物体材料获得，而且可以通过将对其进行编码的基因整合入适当的表达体系并制成基因重组体(recombinant)来获得。为了通过基因工程技术获得HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质，可以将上文所述的编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA整合入适当的表达体系并使之表达。作为本发明中可应用的宿主/载体体系，可举出例如表达载体pGEX和大肠杆菌。由于pGEX可以使外来基因以与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白质的方式表达(Gene，67：31-40，1988)，因此通过热激将整合了编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的基因的pGEX导入BL21等大肠杆菌株中，在适当培养一段时间后，添加isopropylthio-β-D-galactoside(IPTG)以诱导GST融合HMGB1、GST融合HMGB2、GST融合HMGB3、GST融合S100A8或GST融合S100A9蛋白质的表达。本发明的GST由于吸附于谷胱甘肽琼脂糖4B，因此表达产物能够容易地通过亲和层析法(affinity column chromatography)分离、纯化。
此外，作为用于获得HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的重组体的宿主/载体体系，还可以采用下述的体系。首先，当利用细菌作为宿主时，市售的有利用了组氨酸标签(histidine-tag)、HA标签(HA-tag)、FLAG(FLAG-tag)标签等的融合蛋白质的表达用载体。关于酵母，已公知Pichia属酵母对于具有糖链的蛋白质的表达是有效的。从糖链的添加的角度出发，还可以采用利用了以昆虫细胞为宿主的杆状病毒载体的表达体系(Bio/Technology，6：47-55，1988)。此外，还利用哺乳动物的细胞可以进行利用了CMV、RSV或SV40等启动子的载体的转染，这些宿主/载体体系均能够用作HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的表达体系。另外，还可以利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等病毒载体来导入基因。
得到的本发明的蛋白质可以从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，然后纯化成实质上纯且均一的蛋白质。蛋白质的分离、纯化可以使用在通常的蛋白质纯化中使用的分离、纯化方法，没有任何限定。例如，可以适当选择、组合色谱柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透析、重结晶等以对蛋白质进行分离、纯化。
作为色谱法，可列举出例如亲和层析法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤法、逆相色谱法、吸附层析法等(Marshak et al.，Strategies forProtein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.EdDaniel R.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1996)。这些色谱法可以使用液相色谱法例如HPLC、FPLC等液相色谱法来进行。
另外，本发明的蛋白质优选是实质上经纯化的蛋白质。这里，“实质上经纯化”是指本发明的蛋白质的纯化度(本发明的蛋白质在蛋白质成分总体中的比例)为50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、100％或者接近100％。接近100％的上限依赖于本领域技术人员的纯化技术和分析技术，例如为99.999％、99.99％、99.9％、99％等。
另外，只要是具有上述纯化度的蛋白质，则可以是通过任何纯化方法进行了纯化的蛋白质，包括实质上经纯化的蛋白质。例如，可例示出通过适当选择或组合上述色谱柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透析、重结晶等方法而实质上纯化得到的蛋白质，但并不限定于这些。
作为本发明的释放或分泌HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的细胞，基本上生物体内所有组织来源的细胞均可以。作为容易采集和培养的细胞，可例示出成纤维细胞(例如正常皮肤成纤维细胞和其来源的细胞株)，但并不限定于这些。另外，分泌HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的细胞也可以通过将下述载体导入成纤维细胞(例如正常皮肤成纤维细胞和其来源的细胞株)等哺乳类细胞、昆虫细胞或其他细胞来制作，所述载体是通过将编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA、或者通过将编码分泌信号的DNA(ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTGTGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC；序列号：29)结合到编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA上而得到的DNA插入公知的表达载体或基因治疗用载体而制作的。作为编码分泌信号的DNA，可例示出具有上述序列的DNA，但并不限定于此。另外，这些细胞所来源的动物种没有特别限制，优选使用要给予载体的对象动物种的细胞、对象自身的细胞、或者与要给予载体的对象具有血缘关系的动物来源的细胞。
编码本发明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA只要编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质，则可以是cDNA、也可以是基因组DNA，另外，还可以是天然的DNA或是人工合成的DNA。编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA通常以插入到载体中的状态给予。
作为本发明中的载体，可例示出质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、仙台病毒载体、仙台病毒包膜载体、乳头状瘤病毒载体等，但并不限定于这些。该载体中还可以包括有效地诱导基因表达的启动子DNA序列、控制基因表达的因子以及维持DNA的稳定性所需的分子。
另外，本发明中还可以利用属于HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的部分多肽且具有诱导骨髓来源的细胞的活性的多肽、分泌该部分多肽的细胞或插入有编码该部分多肽的DNA的载体。
透明质酸(hyaluronan)是N-乙酰葡糖胺与葡萄糖醛酸这两种糖结合、连接而成的糖胺聚糖(粘多糖)。化学名表示为[→3]-2acetamiod-2deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)β-D-glucopyrano-syluronic acid-(1→]n。天然的透明质酸大多为具有分子量数为十万以上的分子量的高分子透明质酸，而人工可以制作2糖～14糖的低分子透明质酸。例如在医疗技术领域中，当用于注入关节腔内时以透明质酸钠的形式使用。作为制造方法，有提取、纯化由乳酸菌的一种Streptococcus zooepidemicus产生的透明质酸的方法，有从鸡的鸡冠等提取、纯化的方法等。可以对透明质酸进行酯化、过碘酸酸化、异脲偶联、硫酸化等各种修饰。另外，还可以进行醚交联、酯交联。通过进行这些修饰，能够增加对分解的稳定性、不溶性、可制成海绵状、对物质进行缓释的性质。另外，CD44为透明质酸的受体，因此透明质酸对细胞表面具有CD44的间充质干细胞具有迁移活性。
在本发明方法中使用的细胞或组织的提取液可通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法来制造。
作为浸渍到溶剂中的细胞或组织，没有特殊限制，可例示出组织来源的细胞、由组织来源的细胞建立的细胞株(可例示出例如HeLa、HEK293，但并不限制于这些)、经分离的细胞、未经分离的细胞(例如分离的组织中存在的细胞)、导入有编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA的细胞等。作为上述组织，可以是任意组织，可例示出例如活体皮肤组织、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸或血液等)，但并不限定于这些。
作为上述溶剂，可例示出生理盐水、PBS(Phosphate-buffered saline)、TBS(Tris-buffered saline)，但并不限制于这些。另外，作为将细胞或组织浸渍到溶剂中的时间，可例示出诱导细胞坏死所需的充足的时间，即1小时～48小时(例如6小时～48小时)，优选12～24小时，但并不限定于该时间。因此，“将细胞浸渍到溶剂中的工序”也可以换言之为“在用于诱导坏死所需的足够的时间内、将细胞浸渍到溶剂中的工序”或“使细胞坏死的工序”。另外，作为将细胞或组织浸渍到溶剂中的温度，可例示出4℃～25℃(例如4℃～8℃)、优选为4℃，但并不限制于此。另外，作为将细胞或组织浸渍到溶剂中的pH，可例示出pH为7～8、优选pH为7.5，但并不限制于此。另外，作为缓冲液的成分，可列举出10mM～50mM、优选10～20mM的浓度的磷酸缓冲液，但并不限制于此。
另外，本发明中，在将细胞或组织浸渍到溶剂中后，还可以从含有细胞或组织的溶剂中除去该细胞或该组织。从溶剂中除去细胞或组织的方法可以是本领域技术人员公知的方法，没有特殊限制。例如可以通过在4℃～25℃(例如4℃)、且重力加速度为10G～100000G(例如440G)下进行离心以分离得到上清液，从而从溶剂中除去细胞或组织，但并不限制于此。可以将该上清液用作细胞或组织的提取液。
本发明中使用的通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的细胞或组织的提取液，可列举出例如皮肤提取液或末梢血单核细胞提取液(末梢血提取液)，但并不限制于这些。
末梢血提取液的制备方法为：在使用注射器等采血后，用冰箱、液氮或干冰等将细胞冷冻，然后在0℃以上的温度下使其再融解。此外，为了除去细胞的不溶成分，可以通过例如在4℃～25℃(例如4℃)、且重力加速度为10G～100000G(例如440G)下进行离心以分离得到上清液，从而从溶剂中除去细胞的不溶成分，但并不限制于此。可以将该上清液用作细胞或组织的提取液。为了除去细胞的不溶成分，代替离心操作，可以使其通过具有0.45μm的微小孔的硝化纤维素滤膜等来将不溶成分除去。另外，可以通过将采集的末梢血在4℃的状态下放置3小时～48小时来诱发细胞坏死，以使从末梢血中的细胞释放细胞内成分。可以通过在该后重力加速度为10G～100000G(例如440G)下进行离心以分离得到上清液，来从溶剂中将细胞的不溶成分除去，但并不限制于此。可以将该上清液用作细胞或组织的提取液。为了除去细胞的不溶成分，代替离心操作，还可以使其通过具有0.45μm的微小孔的硝化纤维素滤膜等来将不溶成分除去。
本发明的方法中使用的细胞或组织的提取液的肝素结合级分可以通过包含以下工序的方法来制造。
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序、
(b)使工序(a)中得到的提取液与固定化肝素接触的工序、和
(c)从固定化肝素中将肝素结合级分(也可表述为肝素纯化级分、肝素柱纯化级分)洗脱的工序
固定化肝素是将肝素共价结合到不溶性载体上而得到的。作为上述不溶性载体，可例示出Sepharose beads(Sepharose 4B，Sepharose 6B等：GEHealthcare)，但并不限制于此。本发明中还可以使用市售的固定化肝素(Hitrap Hepalin HP column：GE Healthcare)。
作为细胞或组织的提取液与固定化肝素的接触条件，可例示出pH为7～8左右(优选pH为7.5)，盐浓度为0～200mM、优选为100～200mM左右，但并不限制于这些。提取液与固定化肝素接触的时间没有特殊限定，但从使肝素结合级分充分地吸附于固定化肝素的观点出发，优选保持5分钟以上。另外，作为温度，可列举出4～8℃、优选4℃，但并不限制于这些。此外，作为吸附于固定化肝素的肝素结合级分的洗脱条件，可例示出pH为7～8左右、盐浓度为200～1000mM(优选为1000mM左右)，但并不限制于这些。
另外，作为本发明的方法中使用的上述(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物，可列举出例如透明质酸与HMGB1蛋白质、透明质酸与HMGB2蛋白质、透明质酸与HMGB3蛋白质、透明质酸与S100A8蛋白质、透明质酸与S100A9蛋白质、透明质酸与HMGB1蛋白质与HMGB2蛋白质、透明质酸与HMGB2蛋白质与HMGB3蛋白质、透明质酸与HMGB1蛋白质与HMGB3蛋白质、透明质酸与HMGB1蛋白质与HMGB2蛋白质与HMGB3蛋白质、透明质酸与S100A8蛋白质与S100A9蛋白质、透明质酸与HMGB1蛋白质与S100A8蛋白质、透明质酸与HMGB2蛋白质与S100A8蛋白质、透明质酸与HMGB3蛋白质与S100A8蛋白质、透明质酸与HMGB1蛋白质与S100A9蛋白质、透明质酸与HMGB2蛋白质与S100A9蛋白质、透明质酸与HMGB3蛋白质与S100A9蛋白质、细胞或组织的提取液与透明质酸、细胞或组织的提取液的肝素结合级分与透明质酸等的组合，优选为细胞或组织的提取液与透明质酸的混合液，但并不限定于这些。关于混合的比例，在溶解到溶剂的状态下，当将体积比最少的成分作为1时，可以达到它的10000倍地混合其他成分，优选当将最少的成分作为1时，其他成分可以以1～10倍的量添加。
作为本发明中的提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的来源的动物种，可列举出人或非人动物，可例示出例如人、小鼠、大鼠、猴、猪、狗、兔、仓鼠、豚鼠等，优选为与上述提取液等所给予的动物种相同的动物种。
当给予本发明的提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质时，其给予方法为给予血管内或肌肉的非经口给予。作为所述的给予方法，具体地可列举出注射给予。例如，可以通过血管内注射(动脉内注射、静脉内注射等)、肌肉内注射、皮下注射等来将本发明的药剂给予血管、肌肉或皮下(例如埋入皮下的容器中或容器的附近)。另外，还可以通过可经皮吸收的贴剂或外用剂来缓释地使其吸收。
另外，可以根据对象的年龄、症状来选择适当的给予方法。当给予HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质时，例如每次给予可以在每1kg体重在0.0000001mg～1000mg的范围中选择给予量。或者，可以例如在每位对象0.00001～100000mg/body的范围内选择给予量。当给予分泌HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的细胞或插入有编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA的基因治疗用载体时，可以按照HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的量达到上述范围内的方式给予。但是，本发明的本发明中的提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的给予量并不限于这些给予量。
给予时，可以将提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质按照常规方法制成制剂(例如，Remington′sPharmaceutical Science，latest edition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)，还可以同时含有医药上可容许的载体或添加物。可列举出例如表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但并不限制于这些，还可以适当使用其他常用的载体。具体而言，可列举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯固化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
另外，当容器含有本发明的提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质时，提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质可以如下注入到容器中。具体而言，将各溶剂溶解到生理盐水中，使用注射器或移液管手工地注入。或者在管制造时机械地注入。
另外，关于容器中含有的本发明的提取液、肝素结合级分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质在容器中的注入量，可根据细胞回收用容器的容积来适当确定。例如当留置于腹部皮下脂肪内时，可以注入10ml左右，当留置于其他皮下时，可以达到数ml。
本发明提供通过上述回收细胞团的方法回收的细胞团。
另外，本发明还提供通过上述收集骨髓细胞的方法回收的骨髓细胞。
本发明的细胞团或骨髓细胞可以通过给予遗传性疾病、皮肤疾病(烧伤、皮肤溃疡等)、脑神经疾病(脑梗塞、阿尔茨海默病、脊髓损伤、脑损伤等)、循环器官疾病(心肌梗塞、心肌症、动脉塞栓症等)、骨软骨疾病(骨折、风湿病等)等伴随有组织损伤的疾病来进行治疗。可以通过采集后直接给予静脉内、动脉内等循环血流内或者可以通过直接给予损伤组织部位，来使组织再生。或者可以在使用培养皿、培养瓶进行培养操作后，将细胞以分散的状态、形成片状的状态、形成细胞块的状态给予来使组织再生。给予量可以给予细胞1个～1014个，优选给予102个～1010个。因此，本发明还提供一种组织再生剂，其含有通过上述回收细胞团的方法回收的细胞团或通过上述收集骨髓细胞的方法回收的骨髓细胞。
作为再生的组织，没有特殊限制，只要是损伤的组织，则可以是任意组织，可例示出例如活体皮肤组织、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸或血液等)。特别是，本发明的药剂可以有效地用于使从体外难以直接给予药剂的组织(脑、心脏等)再生。本发明中，作为损伤组织，可列举出由引起缺血、灌注不足/缺氧状态的各种病理状态、外伤、烧伤、炎症、自身免疫、基因异常等而导致的损伤的组织，但并不限定于这些原因。另外，损伤组织也包括坏死组织。
作为本发明的组织，只要是骨髓来源的细胞能够分化的组织，则没有特殊制限，例如可例示出皮肤组织、骨组织、软骨组织、肌肉组织、脂肪组织、心肌组织、神经系统组织、肺组织、消化道组织、肝/胆/胰组织、泌尿/生殖器等生物体内的所有组织。另外，通过使用上述组织再生促进剂，难治性皮肤溃疡、皮肤创伤、水疱症、脱发症等皮肤疾病就不用说了，还能够对脑梗塞、心肌梗塞、骨折、肺梗塞、胃溃疡、肠炎等的组织损伤进行治疗。作为可给予上述组织再生促进剂的动物种，可列举出人或非人动物，例如可例示出人、小鼠、大鼠、猴、猪、狗、兔、仓鼠、豚鼠等，但并不限定于这些。另外，本发明的药剂还可以给予糖尿病患者。已知作为糖尿病的皮肤并发症的难治性皮肤溃疡比正常人的皮肤溃疡更难以治愈，但本发明的药剂可有效地用于这样的糖尿病患者。
本发明的组织再生剂可以通过在采集后用生理盐水对细胞进行分散，然后给予静脉内、动脉内等循环血流内来使组织再生。或者可以通过涂抹、贴到损伤组织部位的表面等来给予以使组织再生。此外，还可以通过使用注射器等注入到损伤部位的内部来使组织再生。另外，还可以通过在使用培养皿、培养瓶进行培养操作后，将细胞以分散的状态、形成为片状的状态、形成为细胞块的状态给予损伤部位来使组织再生。给予量可以给予细胞1个～1014个，优选给予102个～1010个。
需要说明的是，本说明书中引用的全部现有技术文献被引入本说明书中以作为参照。
实施例
以下，通过实施例进一步具体地对本发明进行说明，但本发明并不限于这些实施例。
〔实施例1〕
目的：开发将生物体内组织中极少量地存在的干细胞等功能性细胞低侵袭且高效地回收的新技术
方法：针对上述目的通过以下的方法来进行研究。
1)对8周龄小鼠(雄性)进行放射线(10Gy)照射后，通过尾静脉移植green fluorescent protein(GFP)转基因小鼠来源的骨髓细胞(5×106个/0.1ml生理性磷酸缓冲溶液pH7.4)，从而制作GFP骨髓移植小鼠。
2)将HMGB1、透明质酸、皮肤提取液、生理性磷酸缓冲溶液(pH7.4)分别填充到用生物低刺激性材料(有机硅树脂)制成的管中，将其移植到GFP骨髓移植小鼠背部皮下(图1)。
3)2周后取出移植管(图2)，回收管内聚集的细胞(tube-entrapping cell，TECs)，然后用含有10％胎牛血清的Dulbecco培养基(D-MEM)在37℃、二氧化碳气体浓度5％的条件下培养。
4)当TECs的培养密度达到培养皿底面积的约80％时，将培养基分别更换为骨分化诱导培养基、脂肪分化诱导培养基、表皮分化诱导培养基，然后继续培养。在用各分化诱导培养基开始培养2周后，对骨分化采用茜素红染色、对脂肪分化采用油红染色、对表皮分化采用针对角蛋白5的免疫染色来进行评价。
5)利用流式细胞仪分析TECs的血小板源性生长因子α(PDGFRα)阳性、CD44阳性细胞的比例。
结果：将填充了HMGB1、透明质酸、皮肤提取液的硅胶管移植到GFP骨髓移植小鼠皮下，结果显示在填充了任一溶液的情况下，1周时GFP阳性的骨髓来源的细胞(TECs)大量聚集于管内。图2显示HMGB1填充硅胶管内聚集的GFP阳性细胞图像。而在填充了磷酸缓冲液的硅胶管中，回收的附着性TECs的数量显著地少。对从HMGB1填充硅胶管回收的细胞进行培养，结果观察到培养开始后24小时时附着于培养皿的增殖的附着性TECs(图3)。将这些迁移到HMGB1填充硅胶管内的附着性TECs用骨分化、脂肪分化和表皮分化诱导培养基进行培养，结果证明分别显示分化成茜素红阳性成骨细胞、油红阳性脂肪细胞、角蛋白5阳性表皮细胞的能力，并且附着性TECs中存在具有分化为间充质和上皮的能力的细胞团(图4～6)。另外，利用流式细胞仪对已知在间充质干细胞表面表达的PDGFRα和CD44在TECs中的表达情况进行研究，结果显示，TECs的约60％为PDGFRα和CD44阳性(图7)。
另外，将以100ng/ml(PBS)填充了透明质酸硅胶管移植到GFP骨髓移植小鼠背部皮下，2周后取出，用FACS对被动员到管内的细胞的表面标记进行分析，结果显示与从HMGB1管得到的TECs同样地约60％为CD44阳性、PDGFRα阳性的P44细胞，具有分化为成骨细胞或脂肪细胞等间充质细胞或上皮细胞的能力。
讨论：这次本发明的发明人发现通过将分别填充了HMGB1、透明质酸、皮肤提取液的硅胶管移植到皮下，从而能够非常高效地回收具有骨分化能力、脂肪分化能力、表皮分化能力的骨髓来源的TECs。将这些骨髓来源的TECs中大多表达已知在间充质干细胞表面表达的PDGFRα和CD44的事实以及HMGB1、透明质酸、皮肤提取液均具有间充质干细胞动员活性的事实结合起来考虑，可见骨髓来源的间充质干细胞被选择性地动员到了TECs。通过选择填充到硅胶管中的溶液，能够根据该溶液内所含的特定功能细胞动员活性物质来选择性且高效地回收特定的生物功能细胞。通过该新的发明技术，可期待能够避免采用将针刺入骨髓等高侵袭性的方法，而能够根据需要来回收生物功能细胞，并能够涉及根据目的的定制的(order-made)再生医疗技术。另外，回收的细胞还能够被提供以用作以干细胞研究为代表的很多基础研究的材料，相信其对于基础、临床研究的进展、药物发现、医疗技术的进步会有很多贡献。
〔实施例2〕
目的：动员到皮下装置的骨髓来源的细胞对皮肤溃疡的治疗效果的评价
方法：
1)制作体内埋入型装置。
2)为了制备含有骨髓多能干细胞动员因子的皮肤组织提取液，将从2只C57/BL6新生小鼠(2日龄)得到的游离皮片浸渍到生理性磷酸缓冲液pH7.4(PBS)2ml内，在4℃下孵育24小时，然后为了除去组织，在4℃下以440G离心10分钟，回收上清液，从而制作皮肤提取液。另外，为了制备末梢血单核细胞提取液，从2只4周龄C57/BL6小鼠采集末梢血全血，然后用PBS将全量稀释到4mL。在将Ficoll-Paque Plus(GE)液3mL加入离心管后，在其上层置(overlaid)稀释血液。以100G(18℃)离心10分钟，将含有单核细胞的中间层回收到新的离心管中。为了从回收的中间层中除去Ficoll-Paque Plus液，加入45mL的PBS以440G(18℃)离心5分钟并除去上清液，然后再一次加入45mL的PBS、以440G(18℃)离心5分钟并除去上清液。向沉淀的细胞中加入200μL的PBS使其悬浮。将细胞悬浮液在-80℃的冰箱内冷冻30分钟，从冰箱转移到冰上使其融解。重复该冷冻融解的操作3次。然后，以440G(4℃)离心15分钟并回收上清液(末梢血提取液)。
3)对C57/BL6雄性小鼠(6～8周龄)照射致死量放射线(10Gy)，然后立即从尾静脉移植GFP(green fluorescent protein)转基因小鼠来源的骨髓细胞(5×106个/0.1ml生理性磷酸缓冲溶液pH7.4)。仅将存活到移植后8周以后的小鼠用于以后的实验。
4)向装置中加入2)中制作的皮肤提取液、末梢血提取液、作为阴性对照的PBS 40μL。将该装置左右各一个(计2个/只)插入3)中制作的小鼠的左右的背部皮下的筋膜侧并使装置的孔相接。2周后，从小鼠取出装置。
5)除去C.B-17/lcr-scid/scidJcl8周龄(日本Charles River)的背部的毛，然后在背部左右制作直径为6mm的圆形的皮肤溃疡。为了防止小鼠的皮肤收缩，使用双面胶带和医用粘接剂Aron alpha A(三共)将有机硅树脂制的外径为10mm、内径为6mm、厚度为1mm的圆盘粘接到溃疡部。从3)中取出的左右装置的单侧的装置内部采集细胞，给予皮肤溃疡。为了防止溃疡部分发生干燥和细菌感染，用直径为10mm、厚度为1mm的有机硅树脂制的圆盘覆盖溃疡部。为了保护溃疡部，用Tegaderm(3M)覆盖。7天后测定溃疡的面积。(图27)
其结果，阴性对照的溃疡面即使经过7天也没有封闭，而与此相对，给予了从血液提取液中采集的细胞的溃疡在第5日天即观察到溃疡面积的减小。并且，给予了从皮肤提取液中采集的细胞的溃疡在第7天观察到溃疡面积封闭(图27)。
根据本实施例，确认了将被动员到含有组织提取液的体内埋入型装置内的骨髓来源的细胞给予皮肤溃疡部的溃疡治疗效果。利用不是从骨髓采集的骨髓细胞、而是将动员到体内装置的细胞进行治疗的例子是迄今为止所没有的新的治疗方法。
〔实施例3〕
1)通过上述实施例2中记载的方法制作皮肤提取液和末梢血提取液。
将HiTrap Heparin HP 1mL柱(GE)用10mM磷酸缓冲液pH.7.510mL平衡。将皮肤提取液、末梢血提取液分别用10倍容积的10mM磷酸缓冲液pH 7.5稀释，使之结合到经平衡的柱上。使用10mL的10mM磷酸缓冲液pH7.5对柱内进行洗涤，洗出非特异性吸附的成分。吸附的成分使用含有1000mM NaCl的10mM磷酸缓冲液pH7.5洗脱，并每个120μL分注到塑料管中。使用Protein assay kit(Bio-Rad)对蛋白量进行定量，回收浓度最高的3个级分(组织提取液肝素吸附)。
2)制作含有0.1％透明质酸的PBS，将该透明质酸溶液10μL与组织提取液40μL混合，加入实施例2的装置内。阴性对照使用含有1000mM NaCl的10mM磷酸缓冲液pH7.5与透明质酸的混合液。
3)与实施例2同样地制作GFP骨髓移植小鼠，在该小鼠的背部皮下插入2)中制作的装置。插入10天后，从皮下取出装置，回收细胞。回收的细胞在含有10％胎牛血清的IMDM(Invitrogen)中用培养皿在37℃、5％CO2环境下培养。培养开始1天后更换培养基，除去非附着性细胞。其后每3天更换一次培养基。细胞回收1周后使用荧光显微镜进行观察，检测骨髓来源的细胞(GFP阳性细胞)(图28)。另外，使用图像处理软件(ImageJ)对GFP阳性细胞数进行测量(图29)。
透明质酸与组织提取液的肝素结合级分混合液(血液提取液(图28C)、皮肤提取液(图28D))与透明质酸单独(图28B)或PBS(图28A)相比，观察到其对动员到装置内的骨髓来源的附着系细胞具有强烈的动员活性(图28、29)。
通过本实施例确认了组织提取液的骨髓细胞动员因子可以用肝素柱进行纯化。皮肤提取液中含有HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9，由于这些成分结合于肝素柱，因此启示骨髓细胞的动员可能与这些细胞相关。另外考虑，由于肝素柱中还结合了多种生长因子等细胞因子，因此也可能与这些多种因子的综合效果相关。
〔实施例4〕
1)使用Trizol(invitrogen)从新生小鼠皮肤提取RNA，然后使用SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板，使用PCR(聚合酶链反应)法对S100A8的cDNA进行扩增，为了纯化，将其插入哺乳类细胞的表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中，以使在氨基酸序列的N末端添加了Flag tag和6XHis tag序列的蛋白质表达。使用聚乙烯亚胺(PEI)将pCAGGS-Flag-His-S100A8转染到人胎肾细胞来源的HEK293培养细胞株中，48小时后回收细胞和培养上清液。将细胞和培养上清液在4℃下以4400G离心5分钟，分别回收上清液和细胞。使回收的上清液进一步通过具有直径为0.8μm孔的醋酸纤维素滤膜(Nalgene)，然后使其通过具有0.45μm的孔的硝化纤维素滤膜(Corning)，从而制备除去了不溶级分的样品。将该样品加入用含50mMNaCl的50mM Tris HCl pH8.0(50mL)平衡的5mL HisTrap FF(GE)中，将吸附成分进一步用含有10mM咪唑的50mMNaCl 50mM Tris HCl pH8.0洗涤，以除去非特异性吸附成分。将特异性吸附成分从柱中用含有100mM咪唑的50mM NaCl 50mM TrisHCl pH8.0洗脱。将吸附级分分别每个500μL分级到有机硅树脂涂覆的塑料管中，合并含有蛋白质的级分并使之与抗Flag抗体M2珠粒(Sigma)混合，在4℃下缓慢混合12小时，同时使其反应。反应后，将珠粒以440G离心5分钟，在除去上清液后，用PBS将珠粒悬浮，然后同样地进行离心，除去上清液。将珠粒加入到容量为3mL、内径为1cm的柱中，用100mMGlycine-pH3.5从珠粒将吸附蛋白质洗脱，并用10分之1量的500mM TrisHCl pH 7.5进行中和。纯化的蛋白质量用Protein assay kit(Bio-Rad)进行定量。
2)使用Trizol(invitrogen)从新生小鼠皮肤提取RNA，然后使用SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板，使用PCR(聚合酶链反应)法对HMGB1的cDNA进行扩增，为了纯化，将其插入哺乳类细胞的表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中，以使在氨基酸序列的N末端添加了Flag tag和6XHis tag序列的蛋白质表达。使用聚乙烯亚胺(PEI)将pCAGGS-GST-His-HMGB1转染到人胎肾细胞来源的HEK293培养细胞株，48小时后回收细胞和培养上清液。将细胞和培养上清液在4℃下以4400G离心5分钟，分别回收上清液和细胞。使回收的上清液进一步通过具有直径为0.8μm孔的醋酸纤维素滤膜，然后使其通过具有0.45μm的孔的硝化纤维素滤膜，从而制备除去了不溶级分的样品。将该样品加入用含50mMNaCl的50mM Tris HCl pH8.0(50mL)平衡的5mLHisTrap FF(GE)中，将吸附成分进一步用含有10mM咪唑的50mMNaCl50mM Tris HCl pH8.0洗涤，以除去非特异性吸附成分。将特异性吸附成分从柱中用含有100mM咪唑的50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0洗脱。将吸附级分分别每个500μL分级到有机硅树脂涂覆的塑料管中，合并含有蛋白质的级分，然后使用脱盐柱PD10(GE)除去咪唑，使用50mM Tris HCl pH.7.5，150mMNaCl进行洗脱。向洗脱的样品中添加HRV3C(Novagen)，在4℃下使其反应3小时。使切断后的样品结合于用50mM Tris HCl pH.7.5、150mM NaCl平衡的HiTrap Heparin 1mL柱(GE)上，用50mM Tris HClpH.7.5、150mM NaCl对柱内部进行洗涤，然后用50mM Tris HCl pH.7.5、1000mM NaCl对结合蛋白质进行洗脱。洗脱的样品每个500μL地分注到有机硅树脂涂覆的塑料管中。
3)将S100A8、HMGB1、HMGB2、HMGB3分别每个40μg地加入有机硅树脂制装置中，按照使孔与筋膜相接的方式插入GFP骨髓移植小鼠的左右背部皮下。插入10天后，从皮下取出装置并回收装置内聚集的细胞。细胞在含有10％胎牛血清的IMDM(Invitrogen)中使用培养皿在37℃、5％CO2环境下培养。培养开始1天后更换培养基以除去非附着性细胞。其后每隔3天更换一次培养基。细胞回收1周后用荧光显微镜进行观察，检测骨髓来源的细胞(GFP阳性细胞)(图30)。
4)在BALB/cAJcl-nu/nu 8周龄(日本Charles River)的背部左右制作直径为6mm的圆形的皮肤溃疡。为了防止小鼠的皮肤发生收缩，使用双面胶带和医用粘接剂Aron alpha A(三共)将有机硅树脂制的外径为10mm、内径为6mm、厚度为1mm的圆盘粘接到溃疡部。
5)使用0.5g/l-Trypsin/0.53mmol/l-EDTA液(Nacalai Tesque)对3)的细胞进行处理，使其从培养皿游离，在用含有10％FBS的IMDM中使胰蛋白酶灭活后，以440G、在4℃下离心5分钟，除去上清液，然后给予4)中制作的溃疡。为了防止局部的干燥和细菌感染，用直径为10mm、厚度为1mm的有机硅树脂制的圆盘覆盖溃疡部。此外，为了保护溃疡部，用Tegaderm(3M)覆盖。7天后测定溃疡的大小(图31)。
与阴性对照(E)相比，S100A8、HMGB1、HMGB2、HMGB3均可见骨髓细胞的动员活性(图30-A；S100A8、B；HMGB1、C；HMGB2、D；HMGB3)。特别是HMGB1、HMGB2观察到强的动员活性。
另外，通过给予被HMGB1、HMGB2、S100A8动员的骨髓来源的细胞来治疗皮肤溃疡，结果与阴性对照(给予PBS)相比，观察到溃疡缩小的效果(图31)。
在本实施例中，S100A8、HMGB1、HMGB2、HMGB3均可见将骨髓来源的附着性细胞动员到装置内的动员活性。骨髓内的主要细胞为红细胞、血球等血细胞系细胞，但这些细胞几乎均为非附着性的细胞。作为附着性的细胞，已知有间充质干细胞等间充质细胞，另外也包括能够分化为上皮或神经系统的多能性细胞。根据本实施例，可见被S100A8、HMGB1、HMGB2动员到装置内的细胞对皮肤溃疡的治疗效果，因此被动员到装置内的细胞为可治疗诱导组织损伤的骨髓来源的细胞。也有关于通过将骨髓间充质干细胞给予皮肤溃疡部位从而显示治疗效果的报告(Mesenchymal stemcells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis.Wu Y，Chen L，Scott PG，Tredget EE.Stem Cells.2007Oct；25(10)：2648-59.Epub2007Jul 5.)，因此启示本实施例中的治疗效果与骨髓间充质干细胞相关。另外，骨髓间充质干细胞等骨髓来源的细胞已知能够分化为神经细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、上皮细胞。利用本装置采集的细胞能够用于将这些细胞供给到损伤组织来进行治疗的新的再生诱导医疗技术中。
〔参考例1〕
目的：皮肤提取液中HMGB1家族的鉴定和骨髓间充质干细胞诱导活性的研究
方法使用Western blot法确认新生小鼠皮肤提取液中是否含有HMGB蛋白家族。作为样品，将从400只新生小鼠获得的游离皮片浸渍到生理性磷酸缓冲液pH7.4(PBS)400ml内，在4℃下孵育24小时后，为了除去组织，在4℃的条件下以440G离心10分钟，回收上清液，使用SDS-PAGE法对得到的皮肤提取液10μl进行电泳，使用印迹装置(ATTO)将凝胶中分离的蛋白转移到PVDF膜上。用含有3％脱脂乳的0.1％Tween 20的PBS(S-T-PBS)在室温下孵育1小时，然后使其分别与用S-T-PBS稀释至1000倍的兔抗小鼠HMGB1抗体、兔抗小鼠HMGB2抗体、兔抗小鼠HMGB3抗体在4℃下反应16小时。反应后，将该PVDF膜用S-T-PBS洗涤5分钟，5次，然后将该PVDF膜使用用S-T-PBS稀释2000倍的过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(GE Healthcare)在25℃下孵育1小时。然后用S-T-PBS洗涤5分钟、5次，然后使ECL Western Blotting Detection System(GEHealthcare)与该PVDF膜反应，在使ECL胶片感光后进行显影，检测HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质的存在情况。
使用Trizol(invitrogen)从新生小鼠皮肤提取RNA，然后使用SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板，使用PCR(聚合酶链反应)法对HMGB1、HMGB2、和HMGB3的cDNA进行扩增，将其插入哺乳类细胞的表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中，以使在氨基酸序列的N末端添加了Flag tag(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys；序列号：30)的蛋白质表达。将这些质粒载体基因导入HEK293(人胎肾细胞来源的培养细胞株)，培养48小时使蛋白质表达。将分别表达HMGB1、HMGB2、和HMGB3蛋白质的细胞和培养上清液在4℃下孵育16小时，然后以4400g离心5分钟，回收上清液。将该上清液每50mL与100μL的Anti Flag抗体Gel(Sigma)混合，在4℃下孵育16小时。离心回收Gel，然后用PBS洗涤5次。然后使用3X Flagpeptide(final 100μg/ml)进行洗脱。用使用了用S-T-PBS稀释1000倍的小鼠抗Flag抗体、和用S-T-PBS稀释2000倍的过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体(GE Healthcare)的Western blot法确认重组蛋白的表达。使用boyden小室评价这些纯化重组蛋白的小鼠骨髓间充质干细胞迁移活性。另外，为了观察HMGB家族在体内的药效，将8周龄C57BL/6小鼠的背部皮肤切出直径为8μm的圆形，从而制作皮肤溃疡模型，然后将纯化的HMGB1、HMGB2、HMGB3各(100ng/μL)与1g/100mL PBS的浓度的透明质酸溶液分别等量混合，然后将100μL给予溃疡面。为了使溃疡面不发生干燥，用粘着性透明创伤覆盖/保护材料Tegaderm(3M Healthcare)覆盖，测量经时的创伤面积，从而测定治愈效果。
此外，为了研究人皮肤提取液和人纯化HMGB1是否具有使人骨髓间充质干细胞迁移的活性，使用boyden小室进行评价。将面积为1cm2的人皮肤浸渍到1ml的PBS中，在4℃的条件下孵育16小时，然后在4℃的条件下以440G离心10分钟。仅回收上清液，将其用作人皮肤提取液。另外，加入boyden小室的上部的细胞使用人骨髓间充质干细胞(Cambrex公司)。(该细胞使用流式细胞仪进行细胞表面抗原的分析的结果为CD105阳性、CD166阳性、CD29阳性、CD44阳性、CD34阴性、CD45阴性。此外，在分化诱导试验中，向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞的分化为阳性。)另外，在小室下部加入100ng/well人HMGB1(R&D公司)和用PBS稀释10倍的人皮肤提取液，使用PBS作为对照。
结果：Western blot的结果为，除了HMGB1的条带以外还检测到HMGB2和HMGB3的条带。因此确认，新生小鼠皮肤提取液中在除HMGB1之外还含有家族蛋白质的HMGB2和HMGB3(图8)。制作分别在蛋白质的N末端添加了Flag tag的HMGB1、HMGB2、HMGB3的表达载体(图9)。将表达载体基因导入HEK293细胞，在使用Flag tag将表达的蛋白质纯化后，使用Western blot法对蛋白质进行确认(图10)。对使用了这些纯化蛋白质的小鼠骨髓间充质干细胞迁移活性进行测定，结果确认了任一蛋白质均具有活性(图11)。每7天测量在小鼠背部制作的溃疡面积，结果与非治疗组相比，HMGB1、2和3的治疗组具有显著的溃疡面积缩小的效果(图12)。从而可知与小鼠的情况同样地，人HMGB1和人皮肤提取液也具有使人骨髓间充质干细胞迁移的活性(图13)。
讨论：作为与HMGB1同源性高的蛋白质，已知有HMGB2和HMGB3。期待这些蛋白质也具有与HMGB1同样的性质。这里，确认了从游离皮片提取液中获得了HMGB1的家族即HMGB2和HMGB3。此外，制作了HMGB1、HMGB2、HMGB3的重组蛋白，确认了在体外的骨髓间充质干细胞迁移活性，并确认了在体内的皮肤溃疡的治疗效果。可知新生小鼠游离皮片中的HMGB家族(HMGB1、HMGB2、HMGB3)和重组HMGB家族具有骨髓间充质干细胞诱导活性和将骨髓来源的能够分化为上皮系的干细胞诱导到局部的活性，并且，这些被诱导的骨髓来源的细胞群在损伤组织中能够分化为表皮角质形成细胞、毛囊和成纤维细胞等各种各样的细胞，从而具有促进损伤组织愈合的效果。另外，骨髓间充质干细胞由于是多能干细胞，因此相信对于其他组织损伤状态例如脑损伤、心肌梗塞、骨折等组织损伤的治疗也可期待具有与全身给予或局部给予HMGB家族同样的治疗效果。
另外可知，人与小鼠的各自构成HMGB1的氨基酸序列具有98％(213/215)的同源性，各自构成HMGB2的氨基酸序列具有96％(202/210)的同源性，各自构成HMGB3的氨基酸序列具有97％(195/200)的同源性。因此认为，人的HMGB具有与小鼠的HMGB同样的活性，根据该结果，可知人的皮肤提取液、HMGB1与小鼠的皮肤提取液、HMGB1同样地具有诱导骨髓间充质干细胞的活性。
〔参考例2〕
目的：建立骨髓间充质干细胞诱导因子组织提取液的制作方法
方法：将一只6周龄C57BL6的脑、心脏、肠、肾脏、肝脏和一只新生小鼠的皮肤浸渍到生理性磷酸缓冲液pH7.4(PBS)1ml内，在4℃下孵育24小时后，为了除去组织，在4℃的条件下以440G离心10分钟，回收上清液，从而获得组织提取液。为了确认得到的提取液中存在骨髓间充质干细胞诱导活性，使用boyden小室研究骨髓来源的间充质干细胞迁移活性。另外，使用HMGB1ELISA kit(Shino-Test)测量相同的样品中所含的HMGB1的浓度。然后，使脑、心脏和皮肤的组织提取液结合于肝素亲和层析柱，使用boyden小室确认结合级分的蛋白质的骨髓间充质干细胞诱导活性。
结果：小鼠脑提取液中含有与新生小鼠皮肤提取液等同的HMGB1。此外，小鼠脑的骨髓间充质干细胞的诱导活性也与皮肤同样地得到确认。小鼠肠提取液和小鼠心脏提取液中几乎不含有HMGB1，但也可见有骨髓间充质干细胞的诱导活性。另外，小鼠脑、小鼠心脏的肝素柱结合级分与小鼠皮肤的肝素柱结合级分同样地具有诱导骨髓间充质干细胞的活性(图14)。表1示出了测定小鼠各组织提取液的HMGB1浓度与骨髓间充质干细胞的诱导活性的结果。
表1
  HMGB1浓度(ng/mL)   骨髓间充质干细胞诱导活性
皮肤 110 有
  脑   140   有
  心脏   4   有
  肠   0   有
  肾脏   115   ND
  肝脏   61   ND
ND：未实施
讨论：本发明开发出了仅通过将不仅仅是皮肤而且包括脑的器官浸渍到生理性缓冲液中这样简便的方法来简便地提取HMGB1的方法。该方法对于其他器官例如肝脏或肾脏也是同样的。另外，尽管从心脏或肠获得的提取液虽然几乎不含有HMGB1，但也可见骨髓间充质干细胞诱导活性。这认为是由于提取液中含有与HMGB1不同的其他骨髓间充质干细胞诱导物质。这些提取液中所含的物质本来即存在于各组织中，在生理上当组织损伤时将骨髓间充质干细胞诱导到损伤组织。本发明开发出了从各种器官功能性地且简便地提取含有HMGB1的多种骨髓间充质干细胞诱导物质的新的方法。此外，为了纯化从组织提取液获得的骨髓间充质干细胞诱导物质，开发出了使其与肝素柱结合的方法。另外，这些具有骨髓间充质干细胞诱导活性的成分能够通过与皮肤同样的方法采用肝素柱进行纯化，从脑或心脏获得的成分也同样。
〔参考例3〕
目的：建立从培养细胞提取间充质干细胞迁移活性物质的方法。
方法：将人胎肾来源的培养细胞株HEK293和人子宫颈癌细胞株HeLa分别在含有10％胎牛血清的D-MEM(Nacalai公司制)中培养。将各细胞用PBS洗涤后，将细胞107个浸渍到4℃的5ml的PBS(Nacalai公司制)中16小时。以重力加速度为440G在4℃下离心5分钟，回收上清液。在boyden小室的上层加入人骨髓间充质干细胞，在下层加入用DMEM稀释了5倍的细胞提取液，确认人骨髓间充质干细胞迁移活性。
结果：HEK293提取液、HeLa提取液同样地均显示使骨髓间充质干细胞迁移的活性(图15)。
讨论：本发明通过将培养细胞浸渍到PBS中这样的简便方法成功地提取了使骨髓间充质干细胞迁移的活性物质。
〔参考例4〕
目的：制作小鼠脑缺损模型，通过将皮肤提取液肝素柱纯化级分缓释地给予局部损伤部位，使自身骨髓系中所含的干细胞迁移到局部损伤部位，从而来研究是否能够诱导神经系统细胞的再生。
方法：
(1)皮肤提取液肝素柱纯化级分的制作
将切除的新生小鼠皮肤在PBS(一只/ml)中在4℃下孵育16小时，将从中提取的皮肤提取液用4℃的9倍容积的20mM磷酸缓冲液pH 7.5稀释到10倍。预先使20mM磷酸缓冲液pH 7.5(30ml)流入HiTrap Hepalin HPcolumn(柱容量：5ml、GE Healthcare)中，使柱平衡。然后，使稀释液与柱结合。其后，用20mM磷酸缓冲液pH 7.5、100mM NaCl(30ml)对柱进行洗涤。为了将吸附的蛋白质洗脱，向柱内加入20mM磷酸缓冲液pH7.5、1000mM NaCl，将洗脱液分级到管中。使用boyden小室法分别评价吸阳级分的小鼠骨髓来源的细胞株迁移活性，收集具有迁移能力的级分。将该具有活性的溶液作为皮肤提取液肝素纯化级分用于以下的参考例中。
(2)骨髓抑制小鼠的制作
对小鼠进行10Gy的X射线单次照射，制成骨髓抑制小鼠。
(3)向骨髓抑制小鼠的GFP小鼠骨髓移植
从GFP小鼠的两侧大腿骨和下腿骨采集骨髓细胞。将其从照射后24小时的骨髓抑制小鼠的尾静脉给予。其中，给予是在异氟醚吸入麻醉下进行的。
(4)小鼠脑损伤(脑组织缺损)模型的制作
对移植了GFP小鼠的骨髓细胞的骨髓抑制小鼠用异氟醚进行吸入麻醉，向腹腔内注入戊巴比妥(45mg/kg)。将小鼠固定到脑定位固定装置，用手术刀从头部正中切开。在距前囟的右外侧2.5mm、前方1mm处用钻头进行头部穿孔(图16A)。在该部位以深度为3mm的位置为前端，插入并固定20G Surflow针的外筒。这里，使用注射器并施加负压，以吸引部分脑组织(图16B)。
(5)皮肤提取液肝素柱纯化级分向脑组织缺损部的给予
在上述位置，使用Hamilton注射器和26G注射器，注入溶解于纤维蛋白胶制剂(纤维蛋白原)(Bolheal(化血研))的皮肤提取液肝素柱纯化级分5μl，接着注入纤维蛋白胶制剂(凝血酶)(Bolheal(化血研))5μl(图16C)。通过该操作，获得皮肤提取液肝素柱纯化级分作为缓释剂的效果。
(6)脑组织缺损部的神经系统细胞再生效果的评价
使用对照组和治疗组的小鼠进行评价。确定适当的经过设定(经时地)，将小鼠用4％多聚甲醛灌流固定后，将脑切出。然后，用4％多聚甲醛外固定。在用15％和30％梯度的蔗糖脱水后，制成冷冻切片。
用DAPI(4′，6-Diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride)溶液进行核染色，使用光漂白防止剂进行封固。用激光共聚焦显微镜评价损伤部位(脑组织缺损部)的GFP阳性细胞的聚集。
结果：定性地显示给予后的2周和6周后的GFP阳性细胞聚集情况。在2周后(对照：图16D，皮肤提取液肝素柱纯化级分：图16E)和6周后(对照：图16F，皮肤提取液肝素柱纯化级分：图16G)，与对照组相比，治疗组的损伤部位具有GFP阳性细胞的聚集更多的倾向。
讨论：通过给予皮肤提取液肝素柱纯化级分，骨髓来源的细胞聚集于脑组织缺损部位并显示神经细胞的形态。已知骨髓来源的间充质干细胞能够分化为神经细胞，从本结果证明皮肤提取液肝素柱纯化级分能够诱导脑损伤部位的神经系统细胞再生。另外，其也能够用于脑缺血性疾病或脑挫伤中的脑组织障碍部位的神经再生。
〔参考例5〕
目的：鉴定皮肤组织提取液内存在的骨髓来源的组织干细胞诱导因子
方法：为了鉴定被推测是从处于灌注不足状态的切除皮肤释放的骨髓间充质干细胞动员因子，通过以下的方法进行研究。
1)为了获得小鼠骨髓来源的间充质干细胞，从C57BL/6小鼠的大腿骨或下腿骨采集小鼠的骨髓细胞，将含有10％胎牛血清的D-MEM(Nacalai公司制)作为细胞培养培养基加入细胞培养皿中，在37℃、二氧化碳气体浓度为5％的条件下进行培养。当细胞增值到其所占的面积相对于培养皿底面积为70～100％时，用0.25％胰蛋白酶1mMEDTA(Nacalai公司制)将细胞从培养皿上剥离下来，再在相同的条件下进行传代培养。传代操作至少重复5次以上。然后，将这些附着细胞分离培养，用流式细胞仪对细胞表面抗原进行分析，确认为Lin阴性、CD45阴性、CD44阳性、Sca-1阳性、c-kit阴性。确认这些细胞能够分化为骨细胞、脂肪细胞且具有骨髓间充质干细胞的性质。
2)将从5只新生小鼠(2日龄)获得的游离皮片浸渍到生理性磷酸缓冲液pH7.4(PBS)5ml内，在4℃下进行24小时的孵育后，为了除去组织，在4℃的条件下以440G离心10分钟，回收上清液，从而制作皮肤提取液。另外，同样地将从1只6周龄小鼠获得的游离皮片浸渍到生理性磷酸缓冲液pH7.4(PBS)5ml内，在4℃下孵育24小时后，为了除去组织，在4℃的条件下以440G离心10分钟，回收上清液，从而制作皮肤提取液。
3)为了确认获得的皮肤提取液中存在骨髓间充质干细胞诱导活性，本发明人等使用boyden小室对已形成细胞株的C57BL6小鼠骨髓来源的间充质干细胞迁移活性进行了研究。具体而言，在boyden小室的下槽(容量为25μl)中加入2日龄或6周龄小鼠的皮肤提取液(5μl)与DMEM(20μl)的混合液，置于具有8μm微孔的聚碳酸酯膜上，然后与该碳酸酯膜相接地置于boyden小室上槽(容量为50μl)，向其中加入骨髓来源的间充质干细胞悬浮液(5×104个/50ml培养液：DMEM/10％胎牛血清)，在CO2培养箱内、在37℃下培养4～24小时。培养后，将小室的上槽拿开，取出有机硅树脂薄膜，利用染色定量地研究通过所述微孔迁移到小室下槽的骨髓来源的间充质干细胞的数量(图17)。
4)各采集约2cm2的2日龄小鼠、6周龄小鼠的皮肤，在液氮中快速冷冻后，用研钵粉碎。使用RNeasy(Qiagen)从这些样品中提取并纯化RNA。使用纯化的RNA利用微阵列技术筛选在2日龄小鼠中更多地表达的mRNA。2日龄小鼠的2倍以上的得分高的基因有767个。从这些基因中，研究与肝素亲和性高的蛋白质、具有分泌可能性的蛋白质、2日龄小鼠的6倍以上的得分高的基因，结果存在上游第57个的基因即S100A9。这里，用Western blot法检测S100A9和已知与S100A9形成异源二聚体的S100A8在2日龄皮肤提取液中的存在情况。即，将2日龄皮肤提取液5μl与SDS-PAGE sample buffer 5μl(Bio-Rad)混合，在98℃下用加热块加热5分钟，然后冷却至25℃。将该样品施于12.5％丙烯酰胺凝胶的e-PAGEL(ATTO)上，用电泳装置(ATTO)以40mA电泳75分钟。回收电泳后的凝胶，用印迹装置(blotting device)(ATTO)，将凝胶中的蛋白质转印到预先用100％甲醇处理的长7cm、宽9cm的PVDF膜(Millipore)上。转印在120mA下进行75分钟。转印结束后回收PVDF膜，在含4％脱脂乳的PBS(nacalai)中室温下振荡30分钟。然后，将回收的PVDF膜浸渍到5μl的将抗S100A8抗体(R&D)或抗S100A9(R&D)用10mL的含4％脱脂乳的PBS稀释而得到的液体中，室温下振荡60分钟。除去抗体液后，用30mL的含0.1％Tween 20的PBS将膜在室温下振荡洗涤5分钟。洗涤重复5次。洗涤后，将膜加入5μl的将HRP标记抗山羊IgG抗体(GEhealthcare)用10mL的含4％脱脂乳的PBS稀释而得到的液体中，在室温下振荡45分钟。在除去抗体液后，用30mL的含0.1％Tween 20的PBS将膜在室温下振荡洗涤5分钟。洗涤重复5次。用ECL检测试剂盒(GE healthcare)使膜发光从而使胶片感光。利用显影装置对胶片进行显影，得到S100A8和S100A9的蛋白质的信号(图18)。
5)进行肝素亲和层析柱·色谱法以对皮肤提取液内的具有骨髓来源的间充质干细胞动员活性的因子进行纯化。以下操作使用FPLC装置(GEhealthcare)进行。首先，将2日龄小鼠皮肤提取液用4℃的9倍容积的20mM磷酸缓冲液pH7.5稀释到10倍(稀释液A)。预先使20mM磷酸缓冲液pH7.5(300ml)流到HiPrep 16/10Heparin FF(GE Healthcare)中使柱平衡。然后，使稀释液A与柱结合。然后，用20mM磷酸缓冲液pH 7.5(300ml)对柱进行洗涤。为了将吸附的蛋白洗脱，制作(A液)20mM磷酸缓冲液pH7.5、10mMNaCl与(B液)20mM磷酸缓冲液pH 7.5、500mMNaCl。起始以A液100％/B液为0％进行送液、缓缓地增加B液的比例并最终以A液为0％/B液为100％进行送液。总送液量为150mL。将洗脱液每个3mL地分级到有机硅树脂涂覆的管中。将分级的样品各5μl与SDS-PAGE sample buffer 5μl(Bio-Rad)混合，在98℃下用加热块加热5分钟，然后冷却至25℃。将该样品施于(5-20％graduent)丙烯酰胺凝胶的e-PAGEL(ATTO)上，用电泳装置(ATTO)以40mA电泳75分钟。电泳后用Dodeca silver stain kit(Bio-Rad)检测电泳后的蛋白质(图19)。
分别与上文同样地使用boyden小室评价经分级的样品的迁移活性(图20)。
分别与上文同样地使用Western blot法检测经分级的样品中S100A8和S100A9蛋白质的存在情况(图21)。
6)使用Trizol(invitrogen)从新生小鼠皮肤提取RNA，然后使用SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)合成cDNA。将该cDNA作为模板，使用PCR(聚合酶链反应)法对S100A8和S100A9的cDNA进行扩增，将这些cDNA插入到哺乳类细胞的表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中，以使在氨基酸序列的N末端添加有GST tag的序列(序列号：31(氨基酸序列)、序列号：32(DNA序列))的蛋白质表达(图22)。使用脂转染试剂(Invitrogen)将pCAGGS-GST-S100A8或pCAGGS-GST-S100A9转染到人胎肾细胞来源的HEK293培养细胞株中，48小时后回收细胞和培养上清液。将细胞和培养上清液在4℃下以4400g离心5分钟，将上清液(上清液A)和细胞分离，分别进行回收。向细胞中加入含0.1％Tween20的PBS并在冰冷却下对其进行30秒的超声处理，破坏细胞膜。然后，在4℃下以4400g离心5分钟，回收上清液(上清液B)。将上清液A和上清液B混合，添加到预先用30mL的PBS替换了缓冲液的HiTrap GST FF column(GEhealthcare、5mL)中。添加后用PBS100mL对柱进行洗涤，用含有还原型谷胱甘肽的20mM磷酸缓冲液(pH.8)将吸附的蛋白质洗脱。研究使用了重组S100A8和S100A9的boyden小室的骨髓间充质干细胞迁移活性。将纯化的S100A8和S100A9蛋白质的浓度调整到0.1ng/μL 且溶解于DMEM而得到的样品或用4倍容积的DMEM稀释2日龄小鼠皮肤提取液而得到的样品加入到boyden小室的下层。阴性对照同样地使用从转染了未插入S100A和S100A9cDNA的对照载体的细胞中提取蛋白质、从HiTrap GST FFcolumn洗脱而得到的级分。将样品加入下层后，置于具有8μm的微孔的聚碳酸酯膜上，然后与该聚碳酸酯膜相接地置于boyden小室上槽(容量为50μl)，向其中加入骨髓来源的间充质干细胞悬浮液(5×104个/50ml培养液：DMEM/10％胎牛血清)，在CO2培养箱内、在37℃下培养4～24小时。培养后，将小室的上槽拿开，取出聚碳酸酯膜，利用染色定量地研究通过其微孔迁移到小室下槽的骨髓来源的间充质干细胞的数量(图23)。
7)从8周龄雄性小鼠的尾静脉注入上述纯化的GST-S100A8和S100A9重组蛋白质250μL(1ng/μL)。12小时后在异氟醚吸入麻醉下，用肝素涂覆的1mL的注射器从小鼠的心脏采集末梢血1mL，与3mL的PBS混合，然后轻轻地层置于3mL的Ficol(GE healthcare)的上部。用离心机在25℃下以400g离心40分钟。回收中间层的白色混浊层的细胞作为单核细胞级分。向回收的细胞中加入1mL的溶血剂HLB溶液(免疫生物研究所)，在室温下孵育5分钟。重复该溶血操作2次。加入10mL的PBS，在25℃下以440g离心5分钟，除去上清液，回收细胞。将该细胞1,000,000个与分别用PBS稀释100倍的抗小鼠PE标记PDGFRα抗体(e-Bioscience)、PE标记抗小鼠PDGFRβ抗体(e-Bioscience)、FITC标记抗小鼠CD45抗体(BDbiosciences)、PerCy5标记抗小鼠CD44抗体(BD biosciences)在室温下孵育20分钟。其后，将该细胞在25℃以440g离心5分钟，除去上清液。加入含1％多聚甲醛的PBS 400μL，作为流式细胞分析的样品。抗体使用(I)PDGFRα/CD45/CD44(II)PDGFβ/CD45/CD44的组合。分析结果为研究PDGFRα(或β)和CD44的表达细胞与CD45弱阳性-阴性细胞的比例(图24A、图24B)。
结果：通过研究切除的2日龄小鼠皮肤和6周龄小鼠皮肤的骨髓间充质干细胞迁移活性，结果可见与6周龄小鼠相比2日龄小鼠的皮肤提取液具有更强的活性。根据DNA微阵列分析的结果可见，S100A9在2日龄小鼠皮肤中强烈地表达。可见将皮肤提取液用肝素柱进行粗纯化得到的样品的间充质干细胞迁移活性与含有S100A9和S100A8相关。制作了这些蛋白质的表达载体，并使用HEK293生产、纯化了重组蛋白质。在使用了boyden小室的分析中证明这些S100A8、S100A9纯化品具有骨髓间充质干细胞迁移活性。另外可知，通过小鼠静脉给予(给药)，这些蛋白质表现出了将PDGFRα、CD44阳性细胞群动员到末梢血中的活性(图24)。
讨论：这次本发明的发明人在世界上首次发现了游离皮片产生S100A8和S100A9，所产生的S100A8和S100A9具有强的使骨髓来源的间充质干细胞迁移的活性。另外，骨髓间充质干细胞已知是能够分化为骨组织、脂肪组织、软骨组织、成纤维细胞等的多能干细胞，最近也指出，骨髓来源的细胞中存在能够分化为心肌、神经细胞、表皮细胞等组织的多能干细胞。这次植皮片的表皮细胞、毛囊细胞、皮下组织的成纤维细胞等由骨髓来源的细胞构成，因此认为S100A8或S100A9能够将骨髓来源的组织干细胞动员到植皮片中，从而诱导损伤组织的功能性修复。由于S100A8和S100A9通过静脉注射给予能够将骨髓间充质干细胞动员到末梢血中，从而使得难以局部给予的深部组织(脑、心脏、脊髓等)也能够通过末梢循环来进行给予。相信通过利用本发明技术来制造药品，能够在损伤组织再生时将包括间充质干细胞的骨髓来源的组织干细胞动员到局部，从而不仅能够使皮肤组织的组织损伤愈合，而且可期待在脑、肌肉、骨等各种组织损伤愈合过程中能够缩短愈合时间、使损伤组织功能性再生等效果。
〔参考例6〕
目的：确认S100A8对正常小鼠和糖尿病小鼠的皮肤溃疡的治疗效果
方法：将重组S100A8蛋白质给予小鼠皮肤溃疡模型，从而对溃疡治疗效果进行研究。受验小鼠使用移植了表达GFP的骨髓细胞的C57/B16小鼠或糖尿病模型小鼠BKS.Cg-m+/+Leprdb/J(db小鼠)。在小鼠皮肤上制作直径为6mm的皮肤溃疡。在小鼠制作的皮肤溃疡的皮肤缺损部分周围的皮肤迅速收缩。本实验中为了制作缺损皮肤不收缩而通过再生皮肤覆盖来进行治疗的模型，在皮肤缺损部将外径为10mm、内径为6mm、厚度为0.5mm的硅橡胶制的圆盘用皮肤手术用粘接剂(Aron alpha A)和尼龙线固定到溃疡周围的皮肤。然后将重组S100A8蛋白质以1.5μg/天、连续7天直接给予溃疡面。另外，为了防止溃疡面干燥，用膜敷料剂Tegaderm(3M)保护表面。为了确认治疗效果，测定经时的溃疡面积。
结果和讨论：在正常小鼠中可见，从治疗开始第7天以后，S100A8治疗组比对照组的溃疡面积显著地缩小(图25)。另外，在糖尿病小鼠中也可见，从治疗开始第7天以后，S100A8治疗组比对照组的溃疡面积显著地缩小(图26)。即，确认在正常小鼠、糖尿病小鼠中皮肤溃疡均显著地缩小的效果。从该结果确认，S100A8不仅对正常小鼠而且对糖尿病小鼠也具有皮肤溃疡的治疗效果。
〔参考例7〕
目的：皮肤组织提取液内存在的骨髓来源的组织干细胞诱导因子将骨髓组织干细胞动员到末梢血的研究
方法：针对上述目的，通过以下的方法进行研究。
1)骨髓来源的组织干细胞诱导剂的制备：将从25只新生小鼠(2日龄)获得的游离皮片浸渍到生理性磷酸缓冲液pH 7.4(PBS)25ml中，在4℃下孵育24小时后，为了除去组织，在4℃的条件下以440G离心10分钟，回收上清液，从而制作皮肤提取液(SE)。
使用Trizol(invitrogen)从C57/B16新生小鼠皮肤提取RNA，然后使用SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板，使用PCR(聚合酶链反应)法对HMGB1的cDNA进行扩增，将其插入哺乳类细胞的表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中，以使在氨基酸序列的N末端添加了Flag tag(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys；序列号：30)的蛋白质表达。将这些质粒载体基因导入HEK293(人胎肾细胞来源的培养细胞株)，培养48小时使蛋白质表达。分别将表达HMGB1蛋白质的细胞和培养上清液在4℃下孵育16小时，然后以4400g离心5分钟，回收上清液。将该上清液每50mL与100μL的Anti Flag抗体Gel(Sigma)混合，在4℃下孵育16小时。离心回收Gel，然后用PBS洗涤5次。然后使用3XFlag peptide(final 100μg/ml)进行洗脱。使用HMGB1 ELISA kit(Shino-Test)确认洗脱的蛋白质的浓度，冷冻干燥后用PBS将其调整到200μg/mL。
2)从8周龄雄性小鼠(C57/B16)的尾静脉用安装有30G1/2的注射针的注射器给予上述皮肤提取液(SE)500μL或者作为阴性对照组的PBS500μL(图33)。在给予6/12/24/48小时后，在异氟醚吸入麻醉下，从小鼠的心脏用肝素涂覆的1mL的注射器采集末梢血1mL，在与3mL的PBS混合后，轻轻地层置于3mL的Ficol(GE healthcare)的上面。用离心机在25℃下以400g离心40分钟。回收中间层的白色混浊层的细胞作为单核细胞级分。向回收的细胞中加入1mL的溶血剂HLB溶液(免疫生物研究所)，在室温下孵育5分钟。重复该溶血操作2次。加入10mL的PBS，在25℃下以440g离心5分钟，除去上清液，回收细胞。将该细胞1,000,000个与分别用PBS稀释100倍的抗小鼠PE标记PDGFRα抗体(e-Bioscience)、PE标记抗小鼠PDGFRβ抗体(e-Bioscience)、PerCy5标记抗小鼠CD44抗体(BD biosciences)在室温下孵育20分钟。其后，将该细胞在25℃以440g离心5分钟，除去上清液。加入含1％多聚甲醛的PBS 400μL，作为流式细胞分析的样品。
从8周龄雄性小鼠(C57/B16)的尾静脉用安装有30G1/2的注射针的注射器给予小鼠HMGB1250μL(1μg/μL)或者作为阴性对照组的PBS 250μL(图35)。在给予12小时后，在异氟醚吸入麻醉下，从小鼠的心脏用肝素涂覆的1mL的注射器采集末梢血1mL，在与3mL的PBS混合后，轻轻地层置于3mL的Ficol(GE healthcare)的上面。用离心机在25℃下以400g离心40分钟。回收中间层的白色混浊层的细胞作为单核细胞级分。向回收的细胞中加入1mL的溶血剂HLB溶液(免疫生物研究所)，在室温下孵育5分钟。重复该溶血操作2次。加入10mL的PBS，在25℃下以440g离心5分钟，除去上清液，回收细胞。将该细胞1,000,000个与分别用PBS稀释100倍的抗小鼠PE标记PDGFRα抗体(e-Bioscience)、PerCy5标记抗小鼠CD44抗体(BD biosciences)在室温下孵育20分钟。其后，将该细胞在25℃以440g离心5分钟，除去上清液。加入含1％多聚甲醛的PBS 400μL，作为流式细胞分析的样品。
结果：在注射皮肤提取液(SE)12小时后的末梢血中，确认了PDGFRα阳性、CD44阳性细胞被显著地动员(图34)。在注射HMGB112小时后的末梢血中，确认了PDGFRα阳性、CD44阳性细胞被显著地动员(图36)。
〔参考例8〕
目的：通过静脉内给予重组HMGB1蛋白，确认间充质干细胞是否被动员到末梢血中。
方法：从C57BL6小鼠(8～10周龄、雄性)的尾静脉给予重组HMGB1蛋白/生理盐水(100μg/ml)400μl(40μg HMGB1)或者生理盐水400μl。12小时后采集小鼠末梢血，加入PBS将总量稀释到4mL。向离心管中加入Ficoll-Paque Plus(GE)液3mL，然后在其上层置稀释血液。以100G(18℃)离心10分钟，将含有单核细胞的中间层回收到新的离心管中，加入45mL的PBS以440G(18℃)离心5分钟，除去上清液，然后再一次加入45mL的PBS、以440G(18℃)离心5分钟并除去上清液。使得到的单核细胞与Phycoerythrobilin(PE)标记抗小鼠PDGFRα抗体和Allophycocyanin(APC)标记抗小鼠CD44抗体反应，然后利用流式细胞仪(Facscan；Becton，Dickinson and Company)评价单核细胞级分内的PDGFRα阳性/CD44阳性细胞的存在频度。
结果：可见给予HMGB112小时后，末梢血单核细胞级分内的PDGFRα阳性且CD44阳性细胞和PDGFRα阳性且CD44阴性细胞显著地增加(图37)。即显示，HMGB1具有将作为间充质干细胞的标记已知的PDGFRα阳性细胞从骨髓内动员到末梢血中的活性。
讨论：PDGFRα和CD44已知是以骨髓来源的多能干细胞为代表的骨髓间充质干细胞的表面标记。骨髓间充质干细胞是能够分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞的多能干细胞，并且甚至能够分化为神经细胞或上皮细胞等。另外，本实验中使用的皮片由于为缺血状态，组织慢慢地变为坏死状态，从而将细胞的表面的蛋白质甚至核等的细胞内的蛋白质释放到周围。另外，HMGB1是皮肤提取液中含有的蛋白质。在植皮等中，这些蛋白质成为信号将骨髓来源的组织干细胞动员到植皮片中，在植皮片内重建骨髓细胞来源的表皮、皮下组织、毛囊组织等，使皮肤功能性地再生。本实验中通过将这样的皮肤提取液或HMGB1给予到静脉内，从而首次发现成功地将骨髓来源的组织干细胞动员到末梢循环中。根据该发现，通过将骨髓来源的多能干细胞动员到末梢血中，从而使针对脑梗塞、心肌梗塞、骨折、皮肤溃疡等伴随着组织损伤的难治性疾病的新的治疗方法成为可能。另外，动员到末梢血中的细胞能够与通常的采血方法同样采集，因此与迄今为止为了治疗脑梗塞而从骨髓进行采集的以往的方法相比，是简便且安全的骨髓来源的组织干细胞的采集方法。
产业上的可利用性
本发明使以往非常困难的生物体功能性细胞的低侵袭性回收成为可能。其结果，可期待使用这些生物体来源的功能性细胞的基础研究和利用了回收细胞的再生医疗技术得以进展，并可期待成为向苦于难治性疾病的患者提供新的医疗技术的革新技术。另外，可期待插入生物体内的容器成为用于开发新医疗材料的种子而对本领域产业的发展做出贡献。
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Claims (11)

1.一种从由皮下取出到体外的容器回收细胞团的方法。
2.根据权利要求1的从由皮下取出到体外的容器回收细胞团的方法，其中，所述细胞团被以下的(a)～(r)中任一项记载的物质、或以下的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物从骨髓动员到所述容器内；
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
(j)S100A8蛋白质
(k)分泌S100A8蛋白质的细胞
(l)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
(m)S100A9蛋白质
(n)分泌S100A9蛋白质的细胞
(o)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
(p)透明质酸
(q)细胞或组织的提取液
(r)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
3.一种收集骨髓细胞的方法，其包含由从埋入皮下的容器回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序。
4.一种收集骨髓细胞的方法，其包含由从埋入皮下的容器回收的细胞团分离出骨髓细胞的工序，其中，所述细胞团被以下的(a)～(r)中任一项记载的物质、或以下的(a)～(r)中记载的物质中的任意2种以上物质的混合物从骨髓动员到所述容器内；
(a)HMGB1蛋白质
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞
(c)插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体
(d)HMGB2蛋白质
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
(g)HMGB3蛋白质
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
(j)S100A8蛋白质
(k)分泌S100A8蛋白质的细胞
(l)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
(m)S100A9蛋白质
(n)分泌S100A9蛋白质的细胞
(o)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
(p)透明质酸
(q)细胞或组织的提取液
(r)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，包含在由细胞团分离出骨髓细胞的工序之前，从取出到体外的所述容器回收细胞团的工序。
6.根据权利要求2或4所述的方法，其中，细胞或组织的提取液是通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序的方法制造的。
7.根据权利要求2或4所述的方法，其中，细胞或组织的提取液的肝素结合级分是通过包含以下工序的方法制造的；
(a)将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序、
(b)使工序(a)中得到的提取液与固定化肝素接触的工序、和
(c)从固定化肝素洗脱肝素结合级分的工序。
8.一种细胞团，其是通过权利要求1、2、6和7中任一项所述的方法回收的。
9.一种骨髓细胞，其是通过权利要求3～7中任一项所述的方法分离出来的。
10.一种组织再生剂，其含有权利要求8所述的细胞团。
11.一种组织再生剂，其含有权利要求9所述的骨髓细胞。
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