CN108300687A - 一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法 - Google Patents

一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108300687A
CN108300687A CN201711483650.6A CN201711483650A CN108300687A CN 108300687 A CN108300687 A CN 108300687A CN 201711483650 A CN201711483650 A CN 201711483650A CN 108300687 A CN108300687 A CN 108300687A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
damage model
suspension liquid
complete medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711483650.6A
Other languages
English (en)
Inventor
黄锋
桂滢
陈务贤
吴菁
罗祖纯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Priority to CN201711483650.6A priority Critical patent/CN108300687A/zh
Publication of CN108300687A publication Critical patent/CN108300687A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：(1)HK‑2细胞复苏；(2)细胞传代培养；(3)显微镜下观察培养期细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，离心，加入完全培养基制成细胞重悬液；(4)将细胞重悬液转接入完全培养基中，接种密度为40％～50％，培养；(5)当细胞生长密度达80％～90％时，进行离心，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.0～1.5*106个/ml)；(6)将制成的细胞重悬液，按每40～60ul接种至2ml的完全培养基中，进行培养40～50h，换无血清培养基培养4～8h，然后加入浓度为45～55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续培养5～7h后得到损伤模型细胞。本发明能够培养出与造影剂肾病患者术后血清HMGB‑1含量类似、损伤更接近、体系毒素更少的细胞损伤模型。

Description

一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法
技术领域
本发明涉及造影剂细胞损伤模型制备技术领域，具体涉及一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法。
背景技术
由于血管造影及介入诊疗技术在疾病诊断上具有不可替代的优势，碘造影剂的使用越来越广泛。然而，造影剂肾病的发生数量不断上升。至目前为止，造影剂肾病已成为医源性肾衰竭的第三大病因，发病率仅次于肾灌注不足和肾毒性药物。
造影剂肾病的发生机制未完全明确，其中血清高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)是近年发现的一种高度保守的核蛋白，主要作用是稳定染色体结构并协助其功能，参与DNA复制、转录、重组和修复；HMGB-1作为一个经典的损伤相关模式分子，不仅有促进炎症反应、细胞分化等作用，而且还对线粒体自噬有重要的调控作用。碘造影剂引起体内升高，介导PINK1-Parkin信号通路致使肾小管上皮细胞线粒体自噬异常，是造影剂肾病发生的其中原因之一。由于伦理问题，不能直接在人体开展深入研究，分子机制往往需通过体外细胞实验证实，但至今虽然有通过在体外细胞培养液中加入造影剂而获得人肾小管上皮细胞损伤的报道，但得到的只是受损严重的人肾小管上皮细胞，与实际造影剂肾病患者体内损伤细胞及胞外环境相差很大，不利于相关药物的研发试验，甚至导致相关药物试验结果的错误。因此，目前尚未发现有建立合适的引起HMGB-1升高而导致肾小管上皮细胞损伤的稳定研究模型。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
发明内容
本发明针对上述技术问题提供一种基于肾小管上皮细胞培养出与造影剂肾病患者术后血清HMGB-1含量类似、损伤更接近、体系毒素更少的细胞损伤模型的培养方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏；
(2)将复苏后的HK-2细胞在完全培养基内进行传代培养；
(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在900～1100rmp下离心4～6min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜完全培养基中，置于培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达80％～90％时，将细胞培养液在900～1100rmp下离心4～6min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.0～1.9*106个/ml)；
(6)将步骤(5)制成的细胞重悬液，按每40～60ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养40～50h，换无血清培养基培养4～8h，然后加入浓度为45～55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续培养5～7h后得到损伤模型细胞。
优选的，所述完全培养基为按10％FBS、1％双抗的比例配置。
优选的，所述第(4)步骤，将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜完全培养基中时，其接种的密度为40％～50％。
优选的，所述第(3)和第(5)步骤中的离心速度为1000rmp，时间为5min。
优选的，所述第(5)步骤，制成的所述细胞重悬液其细胞浓度为1.875*106个/ml或1.475*106个/ml或1.125*106个/ml或1.7*106个/ml。
优选的，所述第(6)步骤，将第(5)步骤制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养48h，换无血清培养基培养6h。
优选的，所述第(6)步骤，加入的碘克沙醇溶液浓度为50mgI/ml。
优选的，所述第(6)步骤，加入碘克沙醇溶液后，继续培养6h后得到损伤模型细胞。
优选的，所述第(1)～(6)步骤中涉及到的细胞培养，培养条件为37℃、5％CO2浓度培养箱中培养。
本发明与现有技术相比的有益效果：本发明通过将HK-2细胞进行传代培养后，通过离心、接种比例控制、培养时间控制等，尤其是通过结合上述步骤后，当细胞生长密度达80％～90％时，制成细胞浓度为1.0～1.5*106个/ml的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养48小时后，再换无血清培养基培养6小时，然后加入浓度为45～55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续培养5～7h后得到损伤模型细胞。能够实现整个培养体系的毒素最低，细胞生长状况最佳，同时，通过对各阶段进行HMGB-1蛋白检测，发现此时体系内细胞上清液的HMGB-1蛋白含量与患者术后血清HMGB-1含量十分接近，细胞损伤更接近，进而得到理想的细胞损伤模型。
具体实施方式
具体实施例1
一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏；
(2)将复苏后的HK-2细胞在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；
(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在900rmp下离心6min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜所述完全培养基中，接种密度为40％，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达90％时，将细胞培养液在900rmp下离心6min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.875*106个/ml)；
(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜所述完全培养基中，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养48小时后，换无血清培养基培养6小时，然后向培养体系加入浓度为45mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养7h后得到损伤模型细胞。
具体实施例2
一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏；
(2)将复苏后的HK-2细胞在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；
(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在1000rmp下离心5min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜所述完全培养基中，接种密度为50％，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达90％时，将细胞培养液在1000rmp下离心5min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度1.475*106个/ml)；(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜所述完全培养基中，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养48小时，换无血清培养基培养6小时，然后向培养体系加入浓度为50mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养6h后得到损伤模型细胞。
具体实施例3
一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏；
(2)将复苏后的HK-2细胞在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；
(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在950rmp下离心5.5min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜所述完全培养基中，接种密度为40％，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达80％时，将细胞培养液在950rmp下离心5.5min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.125*106个/ml)；
(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜所述完全培养基中，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养48小时，换无血清培养基培养6小时，然后向培养体系加入浓度为55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养5h后得到损伤模型细胞。
具体实施例4
一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏；
(2)将复苏后的HK-2细胞在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；
(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在1100rmp下离心4min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜所述完全培养基中，接种密度为40％，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达80％时，将细胞培养液在1100rmp下离心4min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度1.7*106个/ml)；
(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜所述完全培养基中，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养48小时，换无血清培养基培养6小时，然后向培养体系加入浓度为55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养5h后得到损伤模型细胞。
具体实施例5
本实施例与具体实施例3的区别仅在于：
第(5)步骤中制成的所述细胞重悬液其细胞浓度为1.0*106个/ml。
第(6)步骤中将步骤(5)制成的细胞重悬液，按每40ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养50h，换无血清培养基培养4h。
具体实施例6
本实施例与具体实施例1的区别仅在于：
第(5)步骤中制成的所述细胞重悬液其细胞浓度为1.9*106个/ml。
第(6)步骤中将步骤(5)制成的细胞重悬液，按每60ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养40h，换无血清培养基培养8h。

Claims (9)

1.一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏；
(2)将复苏后的HK-2细胞在完全培养基内进行传代培养；
(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在900～1100rmp下离心4～6min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜完全培养基中，置于培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达80％～90％时，将细胞培养液在900～1100rmp下离心4～6min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.0～1.9*106个/ml)；
(6)将步骤(5)制成的细胞重悬液，按每40～60ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养40～50h，换无血清培养基培养4～8h，然后加入浓度为45～55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续培养5～7h后得到损伤模型细胞。
2.根据权利要求1所述的一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，所述完全培养基为按10％FBS、1％双抗的比例配置。
3.根据权利要求1所述的一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，所述第(4)步骤，将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜完全培养基中时，其接种的密度为40％～50％。
4.根据权利要求1所述的一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，所述第(3)和第(5)步骤中的离心速度为1000rmp，时间为5min。
5.根据权利要求1所述的一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，所述第(5)步骤，制成的所述细胞重悬液其细胞浓度为1.875*106个/ml或1.475*106个/ml或1.125*106个/ml或1.7*106个/ml。
6.根据权利要求1所述的一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，所述第(6)步骤，将第(5)步骤制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养48h，换无血清培养基培养6h。
7.根据权利要求1所述的一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，所述第(6)步骤，加入的碘克沙醇溶液浓度为50mgI/ml。
8.根据权利要求1所述的一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，所述第(6)步骤，加入碘克沙醇溶液后，继续培养6h后得到损伤模型细胞。
9.根据权利要求1所述的一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，所述第(1)～(6)步骤中涉及到的细胞培养，培养条件为37℃、5％CO2浓度培养箱中培养。
CN201711483650.6A 2017-12-29 2017-12-29 一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法 Pending CN108300687A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711483650.6A CN108300687A (zh) 2017-12-29 2017-12-29 一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711483650.6A CN108300687A (zh) 2017-12-29 2017-12-29 一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108300687A true CN108300687A (zh) 2018-07-20

Family

ID=62867861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711483650.6A Pending CN108300687A (zh) 2017-12-29 2017-12-29 一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108300687A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109771403A (zh) * 2019-01-24 2019-05-21 广州医科大学附属第一医院 一种大鼠造影剂肾病模型的构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1576117A4 (en) * 2002-07-19 2006-02-01 Vesta Therapeutics Inc METHOD FOR OBTAINING VIABLE HUMAN LIVER CELLS, INCLUDING STEM CELLS / HEPATIC PRECURSORS
CN102076350A (zh) * 2008-04-30 2011-05-25 吉诺米克斯股份有限公司 将骨髓来源的多能干细胞动员到末梢循环的药物
CN102083962A (zh) * 2008-04-30 2011-06-01 吉诺米克斯股份有限公司 生物体内功能性细胞的高效采集方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1576117A4 (en) * 2002-07-19 2006-02-01 Vesta Therapeutics Inc METHOD FOR OBTAINING VIABLE HUMAN LIVER CELLS, INCLUDING STEM CELLS / HEPATIC PRECURSORS
CN102076350A (zh) * 2008-04-30 2011-05-25 吉诺米克斯股份有限公司 将骨髓来源的多能干细胞动员到末梢循环的药物
CN102083962A (zh) * 2008-04-30 2011-06-01 吉诺米克斯股份有限公司 生物体内功能性细胞的高效采集方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAO-FENG GUAN ET AL: "Contrast Media-Induced Renal Inflammation Is Mediated Through HMGB1 and Its Receptors in Human Tubular Cells", 《DNA AND CELL BIOLOGY》 *
姜阳 等: "HMGB-1与炎症研究进展", 《遵义医学院学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109771403A (zh) * 2019-01-24 2019-05-21 广州医科大学附属第一医院 一种大鼠造影剂肾病模型的构建方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103936838B (zh) 小分子多肽TAT-p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中药物中的应用
WO2019019526A1 (zh) 一种微流控芯片及其应用
BR112015021189B1 (pt) método não centrífugo para produzir um banco de células de mamífero congeladas de alta densidade
CN105524924A (zh) 环状RNA circ-ZKSCAN1的用途
CN101624473B (zh) 一种规模化培养肝细胞的方法
CN113583939A (zh) 一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法
CN108300687A (zh) 一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法
CN106566863A (zh) 一种基于微流控芯片的细胞双向侵袭监测方法
CN113897300A (zh) 一株具有改善皮肤屏障功能损伤与皮肤敏感的动物双歧杆菌
CN102329726B (zh) 细胞培养皿
CN104711240B (zh) 禽呼肠孤病毒σA蛋白及其相关生物材料的应用
CN108165521A (zh) 一种接近cin患者血清hmgb-1含量的体外细胞培养方法
CN116875530A (zh) 一种模拟人脑免疫微环境name模型及其构建方法
CN105969735B (zh) 一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞及制备方法及应用
CN110487877A (zh) 一种筛选降尿酸小分子化合物的方法
WO2019119819A1 (zh) 一种胎盘多能干细胞制剂在制备治疗急性肺损伤药物中的应用
CN101732709B (zh) 一种多层培养瓶培养原代细胞制备出血热疫苗的方法
Li et al. A single-use, scalable perfusion bioreactor system
CN104762274B (zh) 禽呼肠孤病毒σNS蛋白及其相关生物材料的应用
CN107418891A (zh) 一种灌流式膀胱细菌生物膜动态孵育模拟系统
CN107267467A (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离方法
CN103948639B (zh) 一种须癣毛癣菌感染兔模型的构建方法
CN109536452B (zh) 一株可视化鼻咽癌细胞及其应用
Romagnani et al. Modeling the glomerular filtration barrier: are you kidney-ing me?
CN100410368C (zh) 染色体核型分析淋巴细胞培养标本预处理方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180720

RJ01 Rejection of invention patent application after publication