CN113583939A - 一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法 - Google Patents

一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法，包括以下步骤：将配置好的星形胶质细胞接种于芯片上层；将配置好的人脑微血管内皮细胞倒置接种于芯片下层；将芯片置于配套的精密摇床以此来模拟人体血管内的流体剪切力；对所述双层共培养芯片进行连续培养以使脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长至血脑屏障结构形成。本发明提供的技术方案，成功构建了体外血脑屏障模型，更准确、更接近的反应了体内血脑屏障的特征，可以用于AAV跨越血脑屏障的相关研究。本发明添加流体剪切力，更符合体内真实环境，且可实现高通量、减少细胞和试剂的消耗量。

Description

一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及体外双层细胞动态共培养构建血脑屏障模型以及使用该模型进行腺相关病毒跨越血脑屏障相关研究。
背景技术
中枢神经系统疾病是最难治疗的疾病之一，其相关的致残率很高，通常难以完全治愈，治疗困难的主要原因是因为血脑屏障(blood-brain-barrier，BBB)的存在。血脑屏障是一种选择性渗透屏障，其选择性地限制或阻断许多亲水分子或大分子的透过。因此，血脑屏障在保护脑组织的同时也限制了许多治疗药物的输送，严重影响治疗效果。
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)作为载体已成为基因治疗的重要组成部分，因为它无毒、免疫原性低、可在体内持续表达。AAV载体的特性使其成为基因治疗中枢神经系统疾病的候选基因载体。目前发现的AAV载体血清型中仅有少数几类如AAV9、AAVrh10等，可以跨过血脑屏障进入神经端，但其为全身转导型，不具有靶向性，因此跨越效率不高，治疗效果受限，且跨越机理尚不明确。
建立高保真血脑屏障模型对血脑屏障功能研究以及对AAV跨越血脑屏障的相关研究具有重要意义。目前血脑屏障模型分为体内模型和体外模型两大类。体内模型直接利用整个活体生物，其优势在于可以反映BBB环境的复杂性，但体内模型存在成本高、实验周期长、伦理问题等缺点。体外模型具有成本低、简单易控、模型相对稳定、适合高通量筛选的特点。体外血脑屏障模型多建立在静态二维培养系统中，但该模型无法复制BBB的剪切力等关键特征。
发明内容
本发明旨在提供一种体外动态双层共培养构建血脑屏障模型的方法，该模型可用于腺相关病毒跨越血脑屏障的相关研究。
具体的，本发明实现上述目的的具体方案如下：
一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法，所述的方法包括以下步骤：
1)使用一芯片，所述的芯片设有上腔室以及下腔室，上腔室和下腔室之间采用多孔滤膜隔开，所述的多孔滤膜孔径小于待培养细胞直径，厚度5-20μm；脑微血管内皮细胞培养于下腔室内，星形胶质细胞培养于上腔室内；
2)芯片预处理：将鼠尾胶原溶液注入器官芯片上腔室和下腔室；
3)细胞接种与培养：将星形胶质细胞消化后调整至适宜浓度，接种于芯片上腔室，静置于培养箱1-3h后向芯片内补充星形胶质细胞培养基；每隔20-25h换液一次；
将脑微血管内皮细胞消化后调整至适宜浓度，接种于芯片下腔室，倒置于培养箱使其贴附于多孔滤膜界面上，1.5-2.5h后翻转芯片，向芯片内补充DMEM高糖培养基；
将芯片置于配套精密摇床上连续动态培养，芯片在向上和向下分别和水平面呈30度角的范围内上下摆动)，1-3circle/min，通过重力作用驱动流体流动，实现无泵、连续恒定灌流，每隔20-25h换液一次，
4)使脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长至屏障形成，即对应生成模拟的血脑屏障；；
5)将腺相关病毒加入，研究腺相关病毒跨越血脑屏障特性。
优选地，在研究腺相关病毒跨越血脑屏障效率和机制需多个实验组时，该芯片可达到240组实验同步进行；
优选地，所述鼠尾胶原溶液注入浓度为0.3mg/mL，芯片上腔室注入量为50μL，下腔室注入量为100μL；
优选地，将永生化人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)和原代人脑星形胶质细胞分别使用DMEM高糖培养基和星形胶质细胞培养基进行复苏培养，培养至细胞达80-90％融合时分别对其进行消化收集，对应获得脑微血管内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液。其中：
优选地，所述培养条件为培养箱温度为37℃、湿度为95％、CO2浓度为5％；
优选地，所述人脑微血管内皮细胞悬液浓度为1×107cells/mL、人星形胶质细胞悬液浓度为2.5×106cells/mL。
优选地，将星形胶质细胞悬液注入器官芯片上腔室，放入培养箱静置2h。
优选地，所述星形胶质细胞悬液注入量为10μL/腔室。
优选地，向器官芯片上腔室补充星形胶质细胞培养基100μL，器官芯片下腔室补充星形胶质细胞培养基200μL。
优选地，将器官芯片放上精密摇床动态培养2天，每天换液。
优选地，将脑微血管内皮细胞悬液注入器官芯片下腔室，芯片倒置放入培养箱静置2h；
优选地，所述脑微血管内皮细胞悬液注入量为10μL/腔室；
优选地，将芯片正置，向器官芯片上腔室补充DMEM高糖培养基100μL，器官芯片下腔室补充DMEM高糖培养基200μL。
优选地，所述动态培养时间为4天，培养条件：培养箱温度为37℃、湿度为95％、CO2浓度为5％，并每天更换培养基。
优选地，表征过程如下：
免疫荧光，常规免疫荧光染色操作，ZO-1免疫染色，表征血脑屏障紧密连接情况；
小分子渗透，使用小分子荧光物质，分析小分子物质的渗透性，表征血脑屏障模型的渗透性；
分析各血清型AAV跨越血脑屏障效率，将各血清型腺相关病毒加入器官芯片下腔室，上腔室补充DMEM高糖培养基。
优选地，所述各种血清型腺相关病毒为2型腺相关病毒(AAV2)、9型腺相关病毒(AAV9)以及一种重组腺相关病毒AAV-PHP.eB，各种血清型腺相关病毒浓度为1×1010GC/mL，每孔加入量为200μL，上层补充DMEM高糖培养基100μL；
在一定时间点从器官芯片上腔室取样15μL，同时补充DMEM高糖培养基15μL，分析各类血清型AAV跨越效率；
本发明微流控仿生器官芯片动态培养可以提供机械应力、流体剪切力、生化浓度和其他物理、化学刺激等条件来模拟更接近真实人体器官情况的环境，与传统的二维静态培养相比，动态培养细胞可以在更接近真实情况的条件下做出更加真实的反应从而表现出更加真实的器官生理功能。本发明提供的技术方案中，以人脑微血管内皮细胞和人脑星形胶质细胞为模型细胞，注入到器官芯片中进行动态培养，实现血脑屏障模型体外动态的构建。一方面，使用人源性细胞进行实验，避免了采用动物细胞因物种问题导致的实验结果不准确；另一方面，使用脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养，且精密摇床能够提供与体内血流相似的流体剪切力，使得模型更准确的反应了屏障特性。同时，器官芯片还具有高通量、减少样品用量的优点。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为血脑屏障结构示意图；
图2为芯片结构示意图；其中：
1下腔室第一储液槽 2上腔室储液槽
3下腔室第二储液槽 4下腔室第一溶液进出口
5上腔室溶液进出口 6下腔室第二溶液进出口
图3为基于器官芯片的细胞共培养构建血脑屏障模型示意图；
图4为精密摇床模拟人体血管内流体剪切力示意图；
图5为本发明提供的体外模拟人血脑屏障构建方法的一实施例中所采用的微流控芯片的俯视结构示意图；
图6为血脑屏障模型脑微血管内皮细胞ZO-1免疫荧光图，A-C：HCMEC/D3单培养模型Z0-1免疫荧光染色图，D-F：HCMEC/D3与HA共培养模型Z0-1免疫荧光染色图；
图7为血脑屏障模型渗透表征图，A为HCMEC/D3单培养、HCMEC/D3与HA共培养Transwell模型，B为HCMEC/D3单培养、HCMEC/D3与HA共培养芯片模型；
图8为血脑屏障模型跨膜电阻；
图9为基于体外血脑屏障模型上AAV跨越量表征图，A为HCMEC/D3与HA共培养Transwell模型，B为HCMEC/D3与HA共培养芯片模型。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和有点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
图2至图5为本发明所使用的芯片的结构示意图。该芯片设有多个培养单元，在本实施例中，有24个培养单元。每个培养单元包括上腔室、下腔室以及设于芯片上表面的三个储液槽，即下腔室第一储液槽1、下腔室第二储液槽3和上腔室储液槽2。两个储液槽(1和3)底部相通(见图3)共同构成下腔室；芯片的第一储液槽1的底部开口为下腔室第一溶液进出口4、下腔室第二储液槽3的底部开口为下腔室第二溶液进出口6，以及上腔室储液槽2的底部开口为上腔室溶液进出口5。芯片设有上腔室以及下腔室，上、下腔室之间采用多孔滤膜(PET膜)隔开，所述的PET膜孔径约0.4μm，厚度约10μm。脑微血管内皮细胞培养于下腔室内，星形胶质细胞培养于上腔室内。
构建并表征体外血脑屏障模型：
芯片预处理：将鼠尾胶原溶液注入芯片的上腔室以及下腔室；所述鼠尾胶原溶液注入浓度为0.3mg/mL，芯片上腔室注入量为50μL，下腔室注入量为100μL。
脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞来源于人脑细胞。人类细胞的使用提供更准确的反应体内血脑屏障的优点，并且避免物种间的差异。
脑微血管内皮细胞可以选自人脑微血管内皮细胞(HBMEC)、永生化脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)或由多能干细胞(ips)诱导分化而来的细胞。在本发明的实施例中，具体采用的是永生化脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)，购买自北京北纳创联生物技术研究院。星形胶质细胞可以通过商业购买得到。在本发明的具体实施例中，由厦门大学杨朝勇教授惠赠。
将星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞分别使用星形胶质细胞培养基和DMEM高糖培养基进行复苏培养，当细胞融合度达到80-90％时，分别消化星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞，对应获得星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞悬液，其中：
所述复苏培养条件为：培养温度37℃、CO2浓度5％、培养湿度95％。
将星形胶质细胞调整至细胞密度2.5×106cells/mL，取10μL加入芯片上腔室，静置于培养箱2h后向芯片内补充星形胶质细胞培养基，细胞贴附于0.4μm多孔滤膜界面生长，将芯片放入37℃培养箱培养2天，每隔24h换液一次；
永生化脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)经消化后，调整至细胞密度1×107cells/mL，取10μL加入芯片下腔室，在光学显微镜下观察到细胞均匀分布时，立即将芯片倒置放入培养箱静置培养2h，此时液体量较少，由于表面张力原因芯片倒置时液体不会滴落，因此无需封闭溶液进出口。待细胞贴附于0.4μm多孔滤膜界面，将芯片翻转正置，向器官芯片上腔室补充DMEM高糖培养基100μL，器官芯片下腔室补充DMEM高糖培养基200μL，放上精密摇床(所采用精密摇床采购于北京大橡科技有限公司)进行动态培养，提供与体内血流相似的流体剪切力，2circle/min，上、下30°角摆动(见图4，即芯片向上和向下分别和水平面呈30度角的范围内上下摆动)，每隔24h换液一次。
单培养模型
永生化脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)经消化后，调整至细胞密度1×107cells/mL，取10μL加入芯片下腔室，在光学显微镜下观察到细胞均匀分布时，立即将芯片倒置放入培养箱静置培养2h，待细胞贴附于0.4μm多孔滤膜界面，将芯片翻转正置，向器官芯片上腔室补充DMEM高糖培养基100μL，器官芯片下腔室补充DMEM高糖培养基200μL，放上精密摇床(所采用精密摇床采购于北京大橡科技有限公司)进行动态培养，2circle/min，30°角摆动，每隔24h换液一次。
transwell单培养模型
将鼠尾胶原溶液注入Transwell的上腔室以及下腔室；所述鼠尾胶原溶液注入浓度为0.15mg/mL，芯片上腔室注入量为100μL，下腔室注入量为600μL。
永生化脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)经消化后，调整至细胞密度8.25×105cells/mL，取100μL加入Transwell上腔室，下腔室补充DMEM高糖培养基600μL，于培养箱中静置培养，每隔48h换液一次。
transwell共培育模型
将鼠尾胶原溶液注入Transwell的上腔室以及下腔室；所述鼠尾胶原溶液注入浓度为0.15mg/mL，芯片上腔室注入量为100μL，下腔室注入量为600μL。
星形胶质细胞经消化后，调整至细胞密度5.9×105cells/mL，取100μL滴至倒置的Transwell，期间每隔30min补充100μL星形胶质细胞培养基于Transwell，放于培养箱静置2h待细胞贴壁后正置Transwell，上腔室补充100μL、下腔室补充600μL DMEM高糖培养基，于培养箱中静置培养2天，每隔48h换液一次。
永生化脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)经消化后，调整至细胞密度8.25×105cells/mL，取100μL加入Transwell上腔室，下腔室补充DMEM高糖培养基600μL，于培养箱中静置培养，每隔48h换液一次。
待细胞生长状态良好，进行后续模型表征实验；
跨膜电阻值，使用细胞电阻仪从模型构建第一天开始每隔24h对其电阻值进行一次测定；
免疫荧光，常规免疫荧光染色操作，ZO-1免疫染色，表征血脑屏障紧密连接情况；
小分子渗透，使用小分子荧光物质，分析小分子物质的渗透性，表征血脑屏障模型的渗透性。
常规免疫荧光染色法表征血脑屏障模型细胞表面ZO-1蛋白的表达，如图2所示，可见共培养和单培养模型都已形成紧密连接，具有屏障结构，且共培养模型ZO-1蛋白表达量大于单培养模型；
以小分子荧光物质(荧光素钠、FITC-右旋糖酐)为探针，表征血脑屏障模型的渗透性，如图3所示，可见，其中共培养模型荧光物质透过量最小，且芯片共培养模型比Transwell共培养模型透过量显著减小，说明在芯片上双层细胞动态共培养血脑屏障模型屏障效果最好；上述荧光物质透过率计算公式为Artursson(1990)系数公式：
Figure BDA0003160972810000071
Figure BDA0003160972810000072
每分钟被测物质通过的量；
Figure BDA0003160972810000073
滤膜表面积；
Figure BDA0003160972810000074
被测物质的初始浓度；
不同时间点测量血脑屏障的跨膜电阻，如图4所示，可见芯片共培养模型电阻值比单培养大，且芯片血脑屏障模型电阻值比Transwell血脑屏障模型电阻值显著增加。
实施例2
AAV跨越血脑屏障相关研究。
分析各类血清型AAV跨越血脑屏障效率；
用培养基将各类血清型AAV稀释至适宜滴度后，取200μL加入芯片下腔室，上腔室补充DMEM高糖培养基100μL；
所述各种血清型腺相关病毒为2型腺相关病毒(AAV2)、9型腺相关病毒(AAV9)以及一种重组腺相关病毒AAV-PHP.eB，各种血清型腺相关病毒浓度为1×1010GC/mL，下腔室病毒加入总量为200μL，上层补充DMEM高糖培养基100μL；
在12h、24h、36h、48h从芯片上层取样15μL，同时补充DMEM高糖培养基15μL，用实时荧光定量PCR(qPCR)对样品进行测定，分析各类AAV的跨越效率，结果如图5所示。可见，AAV-PHP.eB的跨越效率最高，与在Transwell血脑屏障模型上趋势一致。

Claims (10)

1.一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法，所述的方法包括以下步骤：
1)使用一芯片，所述的芯片设有上腔室以及下腔室，上腔室和下腔室之间采用多孔滤膜隔开，所述的多孔滤膜孔径小于待培养细胞直径，厚度5-20μm；脑微血管内皮细胞培养于下腔室内，星形胶质细胞培养于上腔室内；
2)芯片预处理：将鼠尾胶原溶液注入器官芯片上腔室和下腔室；
3)细胞接种与培养：将星形胶质细胞消化后调整至适宜浓度，接种于芯片上腔室，静置于培养箱1-3h后向芯片内补充星形胶质细胞培养基；
将芯片置于配套精密摇床上动态培养45-55h，每隔20-25h换液一次；
将脑微血管内皮细胞消化后调整至适宜浓度，接种于芯片下腔室，倒置于培养箱使其贴附于多孔滤膜界面上，1.5-2.5h后翻转芯片，向芯片内补充DMEM高糖培养基；
将芯片置于配套精密摇床上连续动态培养，芯片在向上和向下分别和水平面呈30度角的范围内上下摆动，1-3转/min，通过重力作用驱动流体流动，实现无泵、连续恒定灌流；每隔20-25h换液一次；
4)脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长至屏障形成，即对应生成模拟的血脑屏障；
5)将腺相关病毒加入，研究腺相关病毒跨越血脑屏障特性。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞来源于人类细胞。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述脑微血管内皮细胞为永生化脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)、脑微血管内皮细胞(HBMEC)或从人多能干细胞(ips)诱导分化而来的细胞中的至少一种。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞配制成对应细胞悬液步骤中：
将星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞分别使用星形胶质细胞培养基和DMEM高糖培养基进行复苏培养，当细胞融合度达到80-90％时，分别消化星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞，对应获得星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞悬液，其中：
所述复苏培养条件为：培养温度37℃、CO2浓度5％、培养湿度95％。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
所述星形胶质细胞悬液浓度为2.5×106cells/mL，注入量为每孔10μL；
所述脑微血管内皮细胞消化后调整悬液浓度为1×107cells/mL，注入量为每孔10μL。
6.如权利要求1中所述的构建方法，其特征在于，步骤4)中，待细胞生长良好，屏障功能形成进行步骤5)之前，先对模型屏障功能表进行表征。
7.如权利要求6中所述的构建方法，其特征在于，表征过程如下：
跨膜电阻值，使用细胞电阻仪从模型构建第一天开始每隔24h对其电阻值进行一次测定；
免疫荧光，常规免疫荧光染色操作，ZO-1免疫染色，表征血脑屏障紧密连接情况；
小分子渗透，使用小分子荧光物质，分析小分子物质的渗透性，表征血脑屏障模型的渗透性。
8.如权利要求1中所述的构建方法，其特征在于，步骤5)中，过程如下：
分析各血清型腺相关病毒跨越血脑屏障效率，将各血清型腺相关病毒加入芯片下腔室，上腔室补充DMEM高糖培养基；
各种血清型腺相关病毒浓度为1×1010GC/mL，每孔加入量为200μL，上腔室补充DMEM高糖培养基100μL；
在定期从器官芯片上腔室取样，同时补充DMEM高糖培养基，用实时荧光定量PCR(qPCR)对样品进行测定，分析各类AAV的跨越效率。
9.如权利要求8中所述的构建方法，其特征在于，所述各种血清型腺相关病毒为2型腺相关病毒(AAV2)、9型腺相关病毒(AAV9)以及重组腺相关病毒AAV-PHP.eB。
10.如权利要求8中所述的构建方法，其特征在于，所述的定期为在12h、24h、36h、48h从芯片上腔室中取样。
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