CN114134196A - 一种模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学模拟检测技术领域，具体公开一种模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法及装置。所述模拟方法包括：a、在内皮细胞培养槽的底部培养形成单层的小鼠脑微血管内皮细胞；b、将神经干细胞加入到设有氧化石墨烯多孔细胞支架的神经干细胞培养槽中培养；c、将神经干细胞培养槽与内皮细胞培养槽的底部连通，向内皮细胞培养槽内加入毒素，控制内皮细胞培养槽向神经干细胞培养槽内流入的液体的流量，观察神经干细胞的生理活性。本发明提供的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法为神经发育相关疾病的预防和治疗研究提供理论参考和支持，将对PM2.5暴露引发相关神经发育相关疾病的研究领域产生极大的推动作用。
Description
技术领域
本发明涉及医学模拟检测技术领域，尤其涉及一种模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法及装置。
背景技术
在大脑和脑血管之间存在有屏障组织，该屏障组织被称为“血脑屏障”。血脑屏障可以调节分子、营养物质和细胞等进出大脑来维持整个脑部微环境的稳定。经研究发现，很多脑部疾病都与血脑屏障的破坏有关，也有很多疾病随着恶性程度的发展能够破坏血脑屏障。但同时，由于血脑屏障对屏障外分子的特异性转运和屏障作用，很多药物或外界毒素不能顺利通过血脑屏障，进而无法对相应脑部疾病进行有效的治疗和模拟。因此，根据体内血脑屏障的结构和功能特性，体外建立稳定有效的血脑屏障模型，对于进一步研究体外毒素对细胞毒性的影响和治疗至关重要。
目前，针对大脑神经干细胞的体外实验研究模型存在不能有效解决细胞模型其无法模拟体内三维生长和流体环境控制并存的问题，致使目前的建立研究外界毒素对神经干细胞毒性的血脑屏障模型与实际生理特征差距较大的情况，无法对神经发育相关疾病的预防和治疗研究提供可靠的体外实验支持。
发明内容
针对现有大脑神经干细胞的体外实验研究模型存在的上述诸多技术难点的问题，本发明提供一种模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法及装置，该模拟方法可以准确、快速的模拟出外界毒素对大脑神经干细胞的生理活性的影响，最大限度的减小了外界背景环境对经干细胞的影响。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、将原代小鼠脑微血管内皮细胞加入装有内皮细胞培养液的内皮细胞培养槽中进行培养，并使所述小鼠脑微血管内皮细胞在所述内皮细胞培养槽的底部形成单层的小鼠脑微血管内皮细胞层；
b、将原代神经干细胞加入到内部设有氧化石墨烯多孔衬底多孔细胞支架，并装有神经干细胞培养液的神经干细胞培养槽中进行培养；
c、将所述神经干细胞培养槽通过微通道与所述内皮细胞培养槽的底部连通，向所述内皮细胞培养槽内加入毒素，并控制所述内皮细胞培养槽通过微通道向所述神经干细胞培养槽内流入的液体的流量，在所述神经干细胞的培养过程中，观察所述神经干细胞的生理活性。
本发明提供的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，用单层的小鼠脑微血管内皮细胞层模拟血脑屏障，用内部设有氧化石墨烯多孔细胞支架的神经干细胞培养槽模拟体内的神经干细胞的生长环境，使毒素透过小鼠脑微血管内皮细胞层后通过微通道进入所述神经干细胞培养槽内，模拟外界毒素进入体内，对神经干细胞的作用，为与神经系统发育相关的生物学及医学领域的研究提供有效的体外实验模型。
利用本发明提供的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，能够快速、高效地进行PM2.5暴露对大脑神经干细胞增殖和分化的影响的研究，且该方法可准确、快速的模拟长期暴露在较高浓度PM2.5环境下对体内的神经干细胞造成的影响，为研究因PM2.5暴露所导致的早期神经系统发育异常受到影响而引起相关的疾病的预防和治疗提供了可靠的数据参考。首次实现将微流控结合细胞培养技术应用到研究环境污染物PM2.5对大脑神经系统发育影响中来，为神经发育相关疾病的预防和治疗研究提供理论参考和支持，将对PM2.5暴露引发相关神经发育相关疾病的研究领域产生极大的推动作用。
可选的，所述内皮细胞培养液为DMEM完全培养基，其中含有4.5g/L谷氨酰胺、10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
上述特定的内皮细胞培养液的配方可进一步提高形成小鼠脑微血管内皮细胞层的活性，并使形成的小鼠脑微血管内皮细胞层的生长活性更加接近体内血脑屏障的阻隔活性。
可选的，所述神经干细胞培养液的配方为：每100mL所述神经干细胞培养液包括94mL的Neurobasal培养基、1mL的200mmol/L谷氨酰胺、1mL的10000U/mL青霉素和10000μg/mL链霉素混合溶液、2mL的B-27、2mL的N-2和25μL的EGF。
上述特定的神经干细胞培养液结合3D氧化石墨烯多孔细胞支架作为培养神经干细胞的生存环境，不但可以长期保持神经干细胞的高活性，还可以使神经干细胞的生理活性、生长规律和生长模式以更加接近天然神经干细胞的细胞属性。
可选的，所述原代神经干细胞的加入量为(1-5)×106cells/mL。
可选的，所述内皮细胞培养槽通过微通道向所述神经干细胞培养槽内流入的液体的流量为800-1200μL、流速为10-20μL/min。
上述特定流量和流速的控制，可以更加精准的模拟体内的微循环作用机制，以及神经干细胞与细胞外基质的相互作用。
可选的，所述氧化石墨烯多孔细胞支架内部的孔结构的孔径大小为30-50μm。
上述特定孔径大小的氧化石墨烯多孔细胞支架可以进一步提高体外神经干细胞的天然生长属性。
本发明还提供所述模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法在模拟PM2.5暴露所导致的早期神经系统发育异常的研究中的应用。
本发明提供的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法在模拟PM2.5暴露所导致的早期神经系统发育异常的研究中的应用，可以快速、高效地研究进行PM2.5暴露对大脑神经干细胞增殖和分化的影响，为研究因PM2.5暴露所导致的早期神经系统发育异常受到影响而引起相关的疾病的预防和治疗提供参考。
本发明提供了该模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法所用的装置，该装置包括用于模拟构建体内微环境的聚二甲基硅氧烷载体，所述聚二甲基硅氧烷载体包括相互粘合的上载体和下载体，所述上载体在下载体上表面、并与所述下载体呈台阶状设置；
在所述上载体上设有向所述下载体延伸的内皮细胞培养槽，与所述内皮细胞培养槽水平连通有第一微通道，在所述内皮细胞培养槽底部设有向下延伸的主干微通道；其中，所述内皮细胞培养槽底部用于铺设小鼠脑微血管内皮活性细胞层，所述内皮细胞培养槽用于加入血管内皮细胞培养液；
在所述下载体的台阶表面上设置2个以上神经干细胞培养槽、在所述神经干细胞培养槽底部固定有氧化石墨烯多孔细胞支架，所述神经干细胞培养槽与所述主干微通道之间连通有第二微通道；其中，所述氧化石墨烯多孔细胞支架用于负载有待测神经干细胞；
所述第一微通道还连通有毒素加入口，待测毒素通过所述毒素加入口进入所述内皮细胞培养槽、并经所述小鼠脑微血管内皮活性细胞层及所述主干微通道和第二微通道进入神经干细胞培养槽。
本发明提供的上述模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法所用的装置实现了细胞的区域化培养及多种类细胞空间分层共培养，允许细胞和细胞外微环境的模式化结合，通过微流控通道将细胞和细胞外微环境连接，实现介质循环，同时本发明提供的模拟装置可以精确地控制细胞外基质成分或者培养基的浓度梯度，以模拟细胞外基质的供给和分布，确保细胞与细胞外基质的精准作用；还原细胞在体内的三维空间生长模式以获得更多的天然细胞属性。
可选的，所述第一微通道设置在所述上载体与下载体的粘合处，且所述第一微通道高于所述内皮细胞培养槽的槽底；所述毒素加入口通过向下的第三微通道与所述第一微通道连通。
可选的，所述主干微通道自所述内皮细胞培养槽底部竖直向下延伸至与所述第二微通道连通。
可选的，在所述内皮细胞培养槽的两端设置2个所述第一微通道及与所述第一微通道连通的2个毒素加入口。
可选的，所述神经干细胞培养槽延伸至第二下载体。
可选的，所述内皮细胞培养槽为内径为0.4-1cm的圆形凹槽，所述神经干细胞培养槽为内径为0.8-2cm的圆形凹槽。
可选的，所述下载体包括相互扣合的第一下载体和第二下载体，所述第二微通道设置在所述第一下载体和第二下载体的扣合处，且所述第二微通道高于所述神经干细胞培养槽的槽底。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞毒性的微流控装置的示意图；
图2是本发明实施例1提供的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞毒性的微流控装置沿主干微通道的轴线纵切的纵切面图；
图3是本发明实施例1提供的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞毒性的微流控装置沿第一微通道的轴线纵切的纵切面图；
图4是本发明实施例5中不同环境条件下的神经干细胞的细胞活性统计图；
附图标记说明：
1、上载体，11、内皮细胞培养槽，12、第一微通道，13、毒素加入口，14、第三微通道，2、第一下载体，21、神经干细胞培养槽，22、主干微通道，3、第二下载体，31、第二微通道。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法所用的装置，该装置包括用于模拟构建体内微环境的聚二甲基硅氧烷载体，具体如图1-3所示，聚二甲基硅氧烷载体包括相互粘合的上载体1和下载体，上载体1在下载体上表面、并与下载体呈台阶状设置；
在上载体1上设有向下载体延伸的内皮细胞培养槽11，与内皮细胞培养槽11水平连通有第一微通道12，在内皮细胞培养槽11底部设有向下延伸的主干微通道22；其中，内皮细胞培养槽11底部用于铺设小鼠脑微血管内皮活性细胞层，内皮细胞培养槽11用于加入血管内皮细胞培养液；
在下载体的台阶表面上设置4个神经干细胞培养槽21，在神经干细胞培养槽21底部固定有氧化石墨烯多孔细胞支架，氧化石墨烯多孔细胞支架内部的孔结构的孔径大小为30-50μm；神经干细胞培养槽21与主干微通道22之间连通有第二微通道31；其中，氧化石墨烯多孔细胞支架用于负载有待测神经干细胞；
第一微通道12还连通有毒素加入口13，待测毒素通过毒素加入口13进入内皮细胞培养槽11、并经小鼠脑微血管内皮活性细胞层及主干微通道22和第二微通道31进入神经干细胞培养槽21。
第一微通道12设置在上载体1与下载体的粘合处，且第一微通12道高于内皮细胞培养槽11的槽底；毒素加入口13通过向下的第三微通道14与第一微通道12连通。
在内皮细胞培养槽11的两端设置2个第一微通道12及与第一微通道12连通的2个毒素加入口13。
主干微通道22自内皮细胞培养槽11底部竖直向下延伸至与第二微通道31连通。
神经干细胞培养槽21延伸至第二下载体3。
内皮细胞培养槽11为内径为1cm的圆形凹槽，神经干细胞培养槽21为内径为2cm的圆形凹槽。
下载体包括相互扣合的第一下载体2和第二下载体3，第二微通道31设置在第一下载体2和第二下载体3的扣合处，且第二微通道31高于神经干细胞培养槽21的槽底。
实施例2
PM2.5样品的采集：
选取石家庄市国家空气污染与人群健康影响监测点所在城区的环保监测点2km范围内的两所小学教学楼楼顶，采集大气PM2.5，采样高度为14.5m。采样点位于商业交通居民以及工业混合区，对该市大气颗粒物的污染状况具有较好的代表性。使用TH－150D中流量大气细颗粒物采样器(武汉天虹仪器有限公司，武汉，中国)于每年每月10-16日连续采集7天PM2.5，同时遇到AQI≥200(中央气象台发布)天气也继续采样。采样流量为100L/min，采样时间为22h/次。采样前后石英纤维滤膜(Whatman，美国)保存在恒温恒湿箱中，使用电子天平(精度0.00001g，梅特勒托利多，美国)准确称量并记录。然后将采集的PM2.5样品储存在-20℃冰箱中备用。
利用实施例1中的装置模拟PM2.5穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，包括以下步骤：
a、将原代小鼠脑微血管内皮细胞加入装有内皮细胞培养液(内皮细胞培养液的配方为DMEM完全培养基，其中含有4.5g/L谷氨酰胺、10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的内皮细胞培养槽11中进行培养，并使小鼠脑微血管内皮细胞在内皮细胞培养槽11的底部形成单层的小鼠脑微血管内皮细胞层；
b、将原代神经干细胞加入到内部设有氧化石墨烯多孔衬底多孔细胞支架，并装有神经干细胞培养液(神经干细胞培养液的配方为：每100mL神经干细胞培养液包括94mL的Neurobasal培养基、1mL的200mmol/L谷氨酰胺、1mL的10000U/mL青霉素和链霉素10000μg/mL混合溶液、2mL的B-27、2mL的N-2和25μL的EGF)的神经干细胞培养槽21中进行培养，原代神经干细胞的加入量为3×106cells/mL；
c、通过毒素加入口13向内皮细胞培养槽11内加入采集的PM2.5样品(样品中PM2.5的浓度为50μg/mL，加入量为500μL)，并控制内皮细胞培养槽11通过微通道向神经干细胞培养槽21内流入的液体的流量为800μL、流速为10μL/min，在神经干细胞的培养过程中，观察神经干细胞的生理活性。
每隔12h时间观察一次神经干细胞的生理状态，持续加入采集的PM2.5样品24h时间后，神经干细胞开始出现明显的增殖毒性，持续72h时间后神经干细胞的增殖毒性与长期暴露在PM2.5的浓度为100μg/mL下的小鼠体内的神经干细胞的增殖毒性即为相似。
实施例3
利用实施例1中的装置模拟PM2.5穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，包括以下步骤：
a、将原代小鼠脑微血管内皮细胞加入装有内皮细胞培养液(内皮细胞培养液的配方为DMEM完全培养基，其中含有4.5g/L谷氨酰胺、10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的内皮细胞培养槽11中进行培养，并使小鼠脑微血管内皮细胞在内皮细胞培养槽11的底部形成单层的小鼠脑微血管内皮细胞层；
b、将原代神经干细胞加入到内部设有氧化石墨烯多孔衬底多孔细胞支架，并装有神经干细胞培养液(神经干细胞培养液的配方为：每100mL所述神经干细胞培养液包括94mL的Neurobasal培养基、1mL的200mmol/L谷氨酰胺、1mL的10000U/mL青霉素和链霉素10000μg/mL混合溶液、2mL的B-27、2mL的N-2和25μL的EGF)的神经干细胞培养槽21中进行培养，原代神经干细胞的加入量为1×106cells/mL；
c、通过毒素加入口13向内皮细胞培养槽11内加入采集的PM2.5样品(样品中PM2.5的浓度为50μg/mL，加入量为500μL)，并控制内皮细胞培养槽11通过微通道向神经干细胞培养槽21内流入的液体的流量为1000μL、流速为15μL/min，在神经干细胞的培养过程中，观察神经干细胞的生理活性。
每隔12h时间观察一次神经干细胞的生理状态，持续加入采集的PM2.5样品24h时间后，神经干细胞开始出现明显的增殖毒性，持续72h时间后神经干细胞的增殖毒性与长期暴露在PM2.5的浓度为100μg/mL下的小鼠体内的神经干细胞的增殖毒性极为相似。
实施例4
利用实施例1中的装置模拟PM2.5穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，包括以下步骤：
a、将原代小鼠脑微血管内皮细胞加入装有内皮细胞培养液(内皮细胞培养液的配方为DMEM完全培养基，其中含有4.5g/L谷氨酰胺、10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的内皮细胞培养槽11中进行培养，并使小鼠脑微血管内皮细胞在内皮细胞培养槽11的底部形成单层的小鼠脑微血管内皮细胞层；
b、将原代神经干细胞加入到内部设有氧化石墨烯多孔衬底多孔细胞支架，并装有神经干细胞培养液(神经干细胞培养液的配方为：每100mL所述神经干细胞培养液包括94mL的Neurobasal培养基、1mL的200mmol/L谷氨酰胺、1mL的10000U/mL青霉素和链霉素10000μg/mL混合溶液、2mL的B-27、2mL的N-2和25μL的EGF)的神经干细胞培养槽21中进行培养，原代神经干细胞的加入量为5×106cells/mL；
c、通过毒素加入口13向内皮细胞培养槽11内加入采集的PM2.5样品(样品中PM2.5的浓度为50μg/mL，加入量为500μL)，并控制内皮细胞培养槽11通过微通道向神经干细胞培养槽21内流入的液体的流量为1200μL、流速为20μL/min，在神经干细胞的培养过程中，观察神经干细胞的生理活性。
每隔12h时间观察一次神经干细胞的生理状态，持续加入采集的PM2.5样品24h时间后，神经干细胞开始出现明显的增殖毒性，持续72h时间后神经干细胞的增殖毒性与长期暴露在PM2.5的浓度为200μg/mL下的小鼠体内的神经干细胞的增殖毒性极为相似。
实施例5
利用实施例1中的方法，将PM2.5样品制备成不同的浓度，分别进行模拟实验。
实验结果发现，暴露PM2.5(加入不同浓度的PM2.5)24h后，随着PM2.5暴露浓度的升高，神经干细胞的增殖毒性越大，具有统计学意义。此外与普通培养(神经干细胞培养槽中不加入氧化石墨烯支架)相比，氧化石墨烯支架培养环境并未改变PM2.5暴露后神经干细胞增殖毒性的变化规律，但却显著提高了神经干细胞的活性，使神经干细胞的生理活性更加接近自然生理活性。具体结果如图4所示，其中自然状态下的神经干细胞的细胞活性定义为100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、将原代小鼠脑微血管内皮细胞加入装有内皮细胞培养液的内皮细胞培养槽中进行培养，并使所述小鼠脑微血管内皮细胞在所述内皮细胞培养槽的底部形成单层的小鼠脑微血管内皮细胞层；
b、将原代神经干细胞加入到内部设有氧化石墨烯多孔细胞支架，并装有神经干细胞培养液的神经干细胞培养槽中进行培养；
c、将所述神经干细胞培养槽通过微通道与所述内皮细胞培养槽的底部连通，向所述内皮细胞培养槽内加入毒素，并控制所述内皮细胞培养槽通过微通道向所述神经干细胞培养槽内流入的液体的流量，在所述神经干细胞的培养过程中，观察所述神经干细胞的生理活性。
2.如权利要求1所述的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，其特征在于：所述内皮细胞培养液为DMEM完全培养基。
3.如权利要求1所述的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，其特征在于：所述神经干细胞培养液的配方为：每100mL所述神经干细胞培养液包括94mL的Neurobasal培养基、1mL的200mmol/L谷氨酰胺、1mL的10000U/mL青霉素和10000μg/mL链霉素混合溶液、2mL的B-27、2mL的N-2和25μL的EGF。
4.如权利要求1所述的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，其特征在于：所述原代神经干细胞的加入量为(1-5)×106cells/mL；
和/或所述内皮细胞培养槽通过微通道向所述神经干细胞培养槽内流入的液体的流量为800-1200μL、流速为10-20μL/min。
5.如权利要求1所述的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法，其特征在于：所述氧化石墨烯多孔细胞支架内部的孔结构的孔径大小为30-50μm。
6.权利要求1-5任一项所述的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法在模拟PM2.5暴露所导致的早期神经系统发育异常的研究中的应用。
7.权利要求1-5任一项所述的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法所用的装置，其特征在于：包括用于模拟构建体内微环境的聚二甲基硅氧烷载体，所述聚二甲基硅氧烷载体包括相互粘合的上载体和下载体，所述上载体在下载体上表面、并与所述下载体呈台阶状设置；
在所述上载体上设有向所述下载体延伸的内皮细胞培养槽，与所述内皮细胞培养槽水平连通有第一微通道，在所述内皮细胞培养槽底部设有向下延伸的主干微通道；其中，所述内皮细胞培养槽底部用于铺设小鼠脑微血管内皮活性细胞层，所述内皮细胞培养槽用于加入血管内皮细胞培养液；
在所述下载体的台阶表面上设置2个以上神经干细胞培养槽、在所述神经干细胞培养槽底部固定有氧化石墨烯多孔细胞支架，所述神经干细胞培养槽与所述主干微通道之间连通有第二微通道；其中，所述氧化石墨烯多孔细胞支架用于负载有待测神经干细胞；
所述第一微通道还连通有毒素加入口，待测毒素通过所述毒素加入口进入所述内皮细胞培养槽、并经所述小鼠脑微血管内皮活性细胞层及所述主干微通道和第二微通道进入神经干细胞培养槽。
8.如权利要求7所述的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法所用的装置，其特征在于：所述第一微通道设置在所述上载体与下载体的粘合处，且所述第一微通道高于所述内皮细胞培养槽的槽底；所述毒素加入口通过向下的第三微通道与所述第一微通道连通；
和/或所述主干微通道自所述内皮细胞培养槽底部竖直向下延伸至与所述第二微通道连通。
9.如权利要求7所述的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法所用的装置，其特征在于：在所述内皮细胞培养槽的两端设置2个所述第一微通道及与所述第一微通道连通的2个毒素加入口；
和/或所述神经干细胞培养槽延伸至第二下载体；
和/或所述内皮细胞培养槽为内径为0.4-1cm的圆形凹槽，所述神经干细胞培养槽为内径为0.8-2cm的圆形凹槽。
10.如权利要求7所述的模拟毒素穿过血脑屏障对神经干细胞进行作用的方法所用的装置，其特征在于：所述下载体包括相互扣合的第一下载体和第二下载体，所述第二微通道设置在所述第一下载体和第二下载体的扣合处，且所述第二微通道高于所述神经干细胞培养槽的槽底。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |