WO2020217652A1

WO2020217652A1 - 医薬用組成物

Info

Publication number: WO2020217652A1
Application number: PCT/JP2020/005525
Authority: WO
Inventors: 正太小玉; 西村　益浩; 松本　慎一; 修澤本
Original assignee: 学校法人福岡大学; 株式会社大塚製薬工場
Priority date: 2019-04-24
Filing date: 2020-02-13
Publication date: 2020-10-29
Also published as: US20220233599A1; JPWO2020217652A1

Abstract

本発明は、各種疾患、損傷部、創傷及び褥瘡に対して優れた治療効果を奏する間葉系幹細胞を含む医薬組成物を提供することを目的とする。本発明は、非ブタ動物を治療するための医薬用組成物であって、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃから選ばれる少なくとも１の液性因子を産生する幼若ブタ由来間葉系幹細胞を含有する、医薬用組成物に関する。

Description

医薬用組成物

　本発明は、非ブタ動物を治療するための医薬用組成物に関し、より詳細には、幼若ブタ由来の間葉系幹細胞を含有する、非ブタ動物を治療するための医薬用組成物に関する。

　近年の間葉系幹細胞をはじめとする体性幹細胞研究の進歩により、体性幹細胞の臨床応用は、既に基礎的な研究段階から開発段階へ移行している。体性幹細胞は、大きく３つの機能（多分化能、免疫調節能、細胞外環境のリモデリング能）をもち、難治性疾患の治療用細胞として期待されている。

　１つ目の多分化能については、体性幹細胞が直接骨又は軟骨などに分化する能力であり、投与された体性幹細胞が失われた細胞を補完したり、機能が不十分な細胞に置換したりすることで治療効果を発揮する。

　２つ目の免疫調節能は、体性幹細胞からの抗炎症性サイトカイン、ケモカイン又はエクソソームなどの分泌を介し、あるいは、細胞間の接着因子などを介し、患者の免疫担当細胞に働きかけ、炎症又は移植片対宿主病などの免疫反応を抑制することで治療効果を発揮する。

　３つ目の細胞外環境のリモデリング能については、虚血性疾患における梗塞部位や、炎症によって引き起こされた線維化部位などに対し、体性幹細胞からの血管新生促進因子、血管誘導因子、成長因子又は抗線維化因子などの分泌により治療効果を発揮するものである。

　間葉系幹細胞は、哺乳類の骨髄、脂肪、膵島又は臍帯血等に存在し、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞であり、間葉系に属する細胞への分化能を有する。近年、移植片対宿主病、心血管障害、自己免疫疾患、変形性関節症、骨形成不全、肝障害、呼吸器疾患、脊髄損傷、脳梗塞又は腎不全等の疾患に対して臨床治験が行われており（非特許文献１）、様々な臨床応用が期待されている（非特許文献２）。しかし、これら臨床応用における効果は十分とは言えない。

　また、間葉系幹細胞の臨床応用においては、ドナー確保、ドナーに対する侵襲、ドナーごとのウイルス否定検査等の安全性の担保などの課題がある。間葉系幹細胞の効力は、ドナーやその年齢等の条件により大きく変動するため、安定した品質確保も大きな課題である（非特許文献３）。

　血管新生は多岐にわたる血管新生促進因子、抑制因子、メタロプロテアーゼ又はその他の酵素などのバランスのもとに複雑に制御されており、創傷治癒又は様々な疾患に深く関わっている。血管新生には、創傷時の肉芽形成などで観察される生理的現象と、炎症性疾患又は動脈硬化症などの血管新生病などにおける病理的現象とがある（非特許文献４）。

　リンパ管は血管とともに生体内において広範囲なネットワークを形成しており、末梢組織で血管から漏出した間質液、タンパク質、脂肪又は免疫担当細胞などを吸収し、集合リンパ管を介して血管系へと環流することにより血管の閉鎖循環系を維持している。創傷及び様々な病的炎症の治癒において血管新生とともにリンパ管新生の誘導が観察されている（非特許文献５）。

Lemos NE, de Almeida Brondani L, Dieter C, Rheinheimer J, Boucas AP, Bauermann Leitao C, Crispim D, Bauer AC. Islets. 2017 Jul 5:e1335842. doi: 10.1080/19382014.2017.1335842 風間　智彦、日大医誌、第７５巻、第２号、６１－６６頁、２０１６年大串　始、生化学、第８１巻、第２号、９９－１０４頁、２００９年２月小野　眞弓ら、化学と生物、第３７巻、第１号、１４－１９頁、１９９９年細野　加奈子ら、日薬理誌、第１４１号、２９０－２９１頁、２０１３年

　本発明は、上記状況に鑑み、各種疾患、損傷部、創傷及び褥瘡に対して優れた治療効果を奏する間葉系幹細胞を含む医薬用組成物を提供することを目的とする。

　本発明者らは、幼若ブタより調製した間葉系幹細胞は、特定の液性因子を高発現し、且つ従来の間葉系幹細胞と比較して細胞サイズが小さく、増殖能に優れていることを見出し、本発明を完成させた。

　すなわち、本発明は下記に関する。
１．非ブタ動物を治療するための医薬用組成物であって、
　形質転換成長因子－β（以下、ＴＧＦ－β）１、ＴＧＦ－β２、血管内皮増殖因子（以下、ＶＥＧＦ）－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃから選ばれる少なくとも１の液性因子を産生する幼若ブタ由来間葉系幹細胞を含有する、医薬用組成物。
２．血管新生及び／又はリンパ管新生の促進により前記非ブタ動物を治療する、前記１に記載の医薬用組成物。
３．末梢動脈疾患、脳梗塞、心筋梗塞、急性肺損傷、創傷、皮膚損傷及び褥瘡から選ばれる少なくとも１を治療する、前記１または２に記載の医薬用組成物。
４．前記幼若ブタ由来間葉系幹細胞が胎児から生後１ヶ月未満のブタ由来である前記１～３のいずれか１に記載の医薬用組成物。
５．前記幼若ブタ由来間葉系幹細胞が胎児から生後２５日未満のブタ由来である前記１～４のいずれか１に記載の医薬用組成物。
６．前記非ブタ動物が、ヒトである、前記１～５のいずれか１に記載の医薬用組成物。

　本発明の医薬用組成物は、幼若ブタ由来間葉系幹細胞を含有することにより、該幼若ブタ由来間葉系幹細胞が産生する液性因子の作用により、各種疾患、損傷部、創傷及び褥瘡に対し優れた治療効果を奏する。

図１（ａ）は、本発明の幹細胞を培養したときの、特定の培養期間（日）における全細胞量を示す図である。図１（ｂ）は、本発明の幹細胞を培養したときの、特定の培養期間（日）における全細胞増殖率を示す図である。図１（ａ）および図１（ｂ）において、点線および黒丸は幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞（以下、ｎｐＢＭ－ＭＳＣとも略す）を、実線および白丸はヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、ｈＢＭ－ＭＳＣとも略す）を示す。図２（ａ）は、ｎｐＢＭ－ＭＳＣおよびマウス骨髄由来間葉系幹細胞（以下、ｍＢＭ－ＭＳＣとも略す）の培養上清における、ＴＧＦ－β１の濃度を測定した結果を示す。図２（ｂ）は、ｎｐＢＭ－ＭＳＣおよびｍＢＭ－ＭＳＣの培養上清における、ＴＧＦ－β２の濃度を測定した結果を示す。図３（ａ）は、ｎｐＢＭ－ＭＳＣおよびｍＢＭ－ＭＳＣの培養上清における、ＶＥＧＦ－Ａの濃度を測定した結果を示す。図３（ｂ）は、ｎｐＢＭ－ＭＳＣおよびｍＢＭ－ＭＳＣの培養上清における、ＶＥＧＦ－Ｃの濃度を測定した結果を示す。図４は、虚血肢の大腿筋組織に、ｎｐＢＭ－ＭＳＣを筋肉注射し、血流を評価した結果を示す。図５は、虚血肢の大腿筋組織に、ｎｐＢＭ－ＭＳＣ又はｍＢＭ－ＭＳＣを筋肉注射し、血流を評価した結果を示す。

　間葉系幹細胞は、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞であり、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞等の間葉系に属する細胞への分化能を有し、該分化能を維持したまま増殖できる細胞をいう。本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞は幼若ブタから単離された間葉系幹細胞であればよく、例えば、幼若ブタの骨髄、膵島、皮膚又は脂肪など由来の間葉系幹細胞が含まれる。

　本発明において、「幼若ブタ」とは、胎児から生後１ヶ月未満、好ましくは生後２５日未満のブタを示す。幼若ブタは医療用であることが好ましく、ヒトへ細胞移植することができる幼若ブタであることがより好ましい。ブタの種類は特に限定されないが、例えば、ランドレース種（例えば、デンマーク・ランドレース種、アメリカン・ランドレース種、ブリティッシュ・ランドレース種、オランダ・ランドレース種、スウェディッシュ・ランドレース種）、大ヨークシャー種、バークシャー種、デュロック種、ハンプシャー種、中ヨークシャー種、ミニブタが挙げられ、中でもランドレース種が好ましい。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞は、幼若ブタから単離された間葉系幹細胞であればよく、その初代培養細胞、該初代培養細胞を継代培養した細胞であって、各種分化マーカーを発現する各種細胞を生じることができる間葉系幹細胞であってもよい。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃから選ばれる少なくとも１の液性因子を産生し、これらの中でも少なくともＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＶＥＧＦ－Ｃを産生することが好ましい。

　ＴＧＦ－βは後半な生物学的活性を有するサイトカインファミリーであり、哺乳類では構造的相同性の高い３つのアイソフォームＴＧＦ－β１、２及び３が存在する。ＴＧＦ－βは、血管新生の促進作用、リンパ管新生の促進作用を有する。

　ＶＥＧＦは血管内皮細胞に特異的に作用するサイトカインファミリーであり、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰｌＧＦ（胎盤増殖因子、ｐｌａｃｅｎｔａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）－１及びＰｌＧＦ－２の７つが存在する。ＶＥＧＦは血管新生の促進作用、リンパ管新生の促進作用を有する。

　本発明の医薬用組成物は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃから選ばれる少なくとも１の液性因子を産生する幼若ブタ由来間葉系幹細胞を含有することにより、該細胞から産生される該液性因子の作用により血管新生及びリンパ管新生の少なくとも一方を促進し、非ブタ動物を治療することができる。

　血管新生及びリンパ管新生の少なくとも一方の促進による治療としては、疾患治療、損傷部治療及び創傷治癒から選ばれる少なくとも１が挙げられ、好ましくは末梢動脈疾患、脳梗塞、心筋梗塞、急性肺損傷、創傷、皮膚損傷及び褥瘡から選ばれる少なくとも１の治療が挙げられる。

　非ブタ動物としては、ブタ以外の動物であれば特に限定されず、ブタ以外の哺乳動物であることが好ましく、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、マーモセット、サル等が挙げられる。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞の前記液性因子の産生は高発現であることが好ましい。ここで、「高発現」とは、従来の間葉系幹細胞と比較して液性因子の発現量が同等以上であることをいう。ここで、従来の間葉系幹細胞としては、実施例において後述するマウス骨髄由来間葉系幹細胞が例として挙げられる。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞は、マウス骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、前記液性因子の発現量が有意に高く、マウス骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、タンパク質の発現強度が１．１以上であることが好ましく、より好ましくは１．２以上、さらに好ましくは１．３以上である。前記タンパク質の発現強度は、例えば、特異的抗体を用いたＦＡＣＳ解析、ＥＬＩＳＡ等により確認することができる。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞が高発現する好ましい液性因子の組合せとして、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＶＥＧＦ－Ｃが挙げられる。具体的には、例えば、本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞を後述のＭＳＣ培地で３日間の培養後のＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β２の発現量は、同条件で培養したマウス骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、１．１倍以上であることが好ましく、より好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上である。また、例えば、本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞を後述のＭＳＣ基礎培地で３日間の培養後のＶＥＧＦ－Ｃの発現量は、同条件で培養したマウス骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、１．１倍以上であることが好ましく、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．３倍以上である。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞は、細胞マーカーである、ＣＤ４４及びＣＤ９０がともに６０％以上陽性であることが好ましく、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上陽性である。また、細胞マーカーであるＣＤ２９が６０％以上陽性であることが好ましく、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上陽性である。細胞マーカーの陽性率は実施例において後述するように、フローサイトメトリーを用いる方法等により確認できる。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞は、対数増殖期における倍加時間が３６時間以下であることが好ましく、より好ましくは３２時間以下、さらに好ましくは２８時間以下、特に好ましくは２４時間以下、最も好ましくは２０時間以下である。また、対数増殖期における倍加時間は１４時間以上であることが好ましく、１６時間以上であることがより好ましい。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞の対数増殖期における培養は、例えば、後述のビタミンＣを含有する培地（例えば、ＭＳＣ培地）に本発明の幹細胞を播種し、３７℃にて５％ＣＯ_２存在下で、培養用インキュベーターで培養することにより行うことができる。対数増殖期における倍加時間が短いほど、短時間且つ安価に大量の幼若ブタ由来間葉系幹細胞を調製することが可能となる。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞は、平均直径が１７μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１６．５μｍ以下であり、さらに好ましくは１６μｍ以下であり、特に好ましくは１５．５μｍ以下であり、最も好ましくは１５μｍ以下である。平均直径は１０μｍ以上であることが好ましく、１２μｍ以上であることがより好ましい。平均直径が小さいほど、幼若ブタ由来間葉系幹細胞の投与による肺塞栓の形成を防止することができる。平均直径は、例えば、Ｎｕｃｌｅｏ　Ｃｏｕｎｔｅｒ　ＮＣ－２００（商標）を用いて計測することができる。ここで、平均とは相加平均を意味する。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化は、例えば、インスリン、ＭＣＧＳ（血清成分、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、デキサメタゾン、インドメタシン、イソブチルメチルキサンチン等の存在下で本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞を培養することで、脂肪細胞へ分化誘導することができる。

　脂肪細胞への分化および維持には市販のキットまたは培地等を用いてもよく、例えば、Ｌｏｎｚａ　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製ｈＭＳＣ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）－ａｄｉｐｏｇｅｎｉ(ＰＴ－３００４)、Ｌｏｎｚａ　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製ｈＭＳＣ　ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ（ＰＴ－３１０２Ｂ）、Ｌｏｎｚａ　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製ｈＭＳＣ　ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｍｅｄｉｕｍ（ＰＴ－３１０２Ｂ）等が挙げられる。幼若ブタ由来間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化は市販のキットを用いて確認することができ、例えば、Ｌｏｎｚａ社製Ａｄｉｐｏ　Ｒｅｄ（商標）　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔが挙げられる。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞から骨細胞への分化は、例えば、デキサメタゾン、アスコルビン酸塩、ＭＣＧＳ、β－グリセロリン酸等の存在下で本発明の幼若ブタ由来間葉系幹細胞を培養することで、骨細胞へ分化誘導することができる。また、市販のキットを用いてもよく、例えば、Ｌｏｎｚａ　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製ｈＭＳＣ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）－ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ、ＰＴ－３００４等が挙げられる。幼若ブタ由来間葉系幹細胞から骨細胞への分化は、市販のアルカリフォスファターゼ染色キット（例えば、コスモ・バイオ社製等）、市販の石灰化染色キット（例えば、コスモ・バイオ社製等）等により確認することができる。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化は、例えば、ＴＧＦ－β３、デキサメタゾン、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸（ＩＴＳ）、ピルビン酸ナトリウム、プロリン、アスコルビン酸塩、の存在下で本発明の幼若ブタ由来間葉系幹細胞を培養することで、軟骨細胞へ分化誘導することができる。また、市販のキットを用いてもよく、例えば、Ｌｏｎｚａ　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製ｈＭＳＣ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）－ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ、ＰＴ－３００３等が挙げられる。幼若ブタ由来間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化は、アルシアンブルー染色等により確認することができる。

　本発明に係る医薬用組成物の製造方法は、幼若ブタ由来間葉系幹細胞を調製する工程を含む。幼若ブタ由来間葉系幹細胞を調製する方法の一態様としては、例えば、以下の工程を含む方法が挙げられる。
（１）幼若ブタから細胞を採取する工程
（２）工程（１）において採取した細胞を培養し、幼若ブタ由来間葉系幹細胞を調製する工程
　以下、各工程について説明する。

（１）幼若ブタから細胞を採取する工程
　工程（１）では幼若ブタの骨髄、脂肪、皮膚、膵臓等から細胞を採取する。具体的には例えば、幼若ブタの骨髄から細胞を採取する場合、幼若ブタの大腿骨、腸骨稜及び胸骨などから骨髄細胞を採取することができる。例えば、幼若ブタから大腿骨を回収し、両端を切断して針を挿入し、ヘパリンを添加した生理的緩衝液（例えば燐酸緩衝液、以後ＰＢＳとも言う）で洗い流し、反対側の場所から流出液を骨髄液として回収する。流出液の量が減少したら、骨を逆にして針を反対側に挿入し、ＰＢＳで再び洗い流して、細胞含有溶液である骨髄液を調製する。

　さらに、上記において調製した細胞含有溶液を通常遠心分離することにより幼若ブタ由来単核球細胞画分を単離してもよい。上記において調製した細胞含有溶液をＰＢＳ等で希釈し、ヒトリンパ球分離用の媒体（例えば、ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ等）を入れたチューブ内の該媒体層の上に希釈した細胞含有溶液を入れる。

　前記チューブを遠心分離して分層させ、幼若ブタ由来単核球細胞を含む層を回収する。回収した溶液をさらに遠心分離し、上清を除去した後、ＰＢＳ等で希釈して再度遠心分離し、単核球細胞画分を単離する。このようにして単離した単核球細胞画分の細胞は、培養前に凍結保存してもよい。単離した幼若ブタ由来単核球細胞画分の細胞を凍結することにより凍結融解の影響を受けにくい細胞を選択的に調製できる。培養前に凍結保存する場合、温度は－８０℃以下であることが好ましく、より好ましくは－１５０℃以下である。

　また、例えば、幼若ブタの膵臓から細胞を採取する場合、幼若ブタから膵島を回収し、更に、場合によってはその膵島を浮遊培養することにより、幹細胞を調製する目的で接着培養に使用する細胞塊を調製する。

　また、例えば、幼若ブタの脂肪から細胞を採取する場合、幼若ブタから脂肪を採取してはさみで細かく刻んだ後、酵素処理を行う。セルストレーナーでフィルターをかけ、低速で遠心をする。チューブ底に沈降した細胞を培養に用いる。また、例えば、幼若ブタの皮膚（毛を含む）から細胞を採取する場合、幼若ブタから皮膚を採取し、酵素処理を行う。酵素処理後皮膚より毛を抜きＢｕｌｇｅ部分を採取して培養に用いる。培養を行う際は３Ｔ３フィーダー細胞を用いる。

（２）工程（１）において採取した細胞を培養し、幼若ブタ由来間葉系幹細胞を調製する工程
　上記工程（１）で採取した細胞、細胞画分、または細胞塊には、幹細胞以外の目的外の細胞が多く含まれる。通常、これらの目的外細胞の生存に必須である、ビタミンＣを含まない基礎培地（例えば、後述のＭＳＣ基礎培地）を用いることで、これらの細胞を除去する培養方法が用いられている。

　本発明の工程（２）においては、上記工程（１）で採取した細胞、細胞分画、または細胞塊を、好ましくは３５～３９℃、より好ましくは３６～３８℃、最も好ましくは３７℃にて、好ましくは４～６％の、より好ましくは４．５～５．５％の、最も好ましくは５％の、ＣＯ_２存在下で培養用インキュベーターにて培養することにより、間葉系幹細胞以外の目的外の細胞を除去するとともに、本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞を増殖させる。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞は、増殖速度が顕著に速いことから、上記の目的外の細胞を除去する培養のために、ビタミンＣを含まない基礎培地を用いず、ビタミンＣを含む培地（例えば、後述のＭＳＣ培地）のみを用いても、本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞を調製することができる。なお、上記の目的外の細胞を除去するために、ビタミンＣを含まない基礎培地を用いて培養した後、ビタミンＣを含む培地に交換して本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞を増殖させることにより、本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞を調製することもできる。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞は、具体的には例えば、次の方法で培養する。ゼラチンでコートした培養用容器（例えば、０．１％ゼラチンでコートしたプレート）またはゼラチンコート無しの培養用容器（例えば、プレート）を用いてビタミンＣを含まない基礎培地（例えば、後述のＭＳＣ基礎培地）、またはビタミンＣを含む培地（例えば、後述のＭＳＣ培地）を用いて、好ましくは５．０×１０^５個～５．０×１０^７個の細胞／９．６ｃｍ^２を播種し、例えば３７℃にて５％ＣＯ_２、９０％湿度の条件下でインキュベートして初代培養細胞を得る。

　初代培養細胞を得るための培養期間は、播種後、好ましくは３～１２日、より好ましくは３～１１日、最も好ましくは３～１０日である。初代培養細胞は継代してもよい。継代して得られた幹細胞を継代培養細胞ともいう。

　初代培養細胞または継代培養細胞の継代は、幹細胞を播種後、好ましくは２～６日後、より好ましくは２～５日後、さらに好ましくは２～４日後、最も好ましくは３日後に、幹細胞が、３０％～１００％コンフルエントに、好ましくは５０％～９５％コンフルエントに、より好ましくは６０％～９０％コンフルエントに、最も好ましくは７０％～８５％コンフルエントに達した以降に行う。

　幹細胞の播種は、ゼラチンでコートした培養用容器（例えば、０．１％ゼラチンでコートしたプレート）またはゼラチンコート無しの培養用容器（例えば、プレート）を用いてビタミンＣを含む培地（例えば、後述のＭＳＣ培地）を用いて、好ましくは５．０×１０^５個～５．０×１０^７個の細胞／９．６ｃｍ^２を播種する。幹細胞の培養は、例えば３７℃にて５％ＣＯ_２、９０％湿度の条件下で培養する。幹細胞の培養の間、必要に応じて培地交換して本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞を増殖させる。

　ＭＳＣ基礎培地およびＭＳＣ培地としては、従来公知のものを用いることができ、市販のものを用いてもよい。ＭＳＣ基礎培地としては、例えば、５００ｍＬのＧｉｂｃｏ社製ＭＥＭα（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ｎｏ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ）に５５ｍＬのＧｉｂｃｏ社製Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　（ＦＢＳ）及び５．５ｍＬのＳｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加した培地が挙げられる。また、ＭＳＣ培地としては、例えば、５００ｍＬのＧｉｂｃｏ社製ＭＥＭα（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）に５５ｍＬのＧｉｂｃｏ社製Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、５．５ｍＬのＳｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ及び２２．２μＬ　のＳｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製ＦＧＦ－Ｂａｓｉｃ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ，ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：１ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地が挙げられる。

　継代は少なくとも１回以上実施することが好ましい。継代回数は本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞が得られる限り特に限定されないが、好ましくは１～３回であり、より好ましくは１～２０回である。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞は凍結保存が可能である。凍結保存のタイミングは特に限定されないが、好ましくは継代１～２０回の後であり、より好ましくは継代２～１０回の後である。凍結保存および解凍の方法は従来公知の方法を用いることができる。

　本発明における幼若ブタ由来間葉系幹細胞の凍結保存方法としては、具体的には例えば、凍結保存液に分散させ、必要になるまで冷凍庫にて－８０℃以下または液体窒素中で凍結保存することができる。凍結保存液としては、例えば、ＯＰＦ－３０１［３％トレハロース及び５％デキストランを含有する乳酸リンゲル液（国際公開第２０１４／２０８０５３号）］とジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を９：１の比率で混合した溶液、動物細胞の凍結保存に使用可能な血清含有若しくは無血清保存液、または市販の細胞凍結保存用試薬［好ましくは、タカラバイオ社製ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）等のセルバンカー］が挙げられる。

　本発明の医薬用組成物は、期待される治療効果が維持されることを条件として、幼若ブタ由来間葉系幹細胞以外の他の成分を含有してもよい。本発明の医薬用組成物に使用することのできる成分としては、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン又はフィブリノーゲン等の有機系生体吸収性材料、ヒアルロン酸、コラーゲン（例えば、酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等の可溶性コラーゲン）又はフィブリン糊等のゲル化材料、滅菌水、生理食塩水又はリン酸塩溶液等の緩衝液等の水系溶媒が挙げられる。また、これらの成分の他、抗生物質、安定化剤、保存剤、ｐＨ調整剤、液性因子等を含んでいてもよい。

　本発明の医薬用組成物を医薬品として用いる場合の投与方法としては、特に制限されないが、筋肉内投与、皮下投与、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与等が好ましく、中でも、筋肉内投与、皮下投与及び血管内投与がより好ましい。

　本発明の医薬用組成物の用量（投与量）は、患者の状態（例えば、体重、年齢、症状、体調等）、及び本発明の医薬用組成物の剤形等によって異なり得るが、十分な予防又は治療効果を奏する観点から、その量は多い方が好ましく、一方、副作用を抑制する観点からはその量は少ない方が好ましい傾向にある。

　通常、成人に投与する場合には、幼若ブタ由来間葉系幹細胞数として、５×１０^２～１×１０^１２個／回、好ましくは１×１０^４～１×１０^１１個／回、より好ましくは１×１０^５～１×１０^１０個／回である。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与してもよい。

　また、通常、成人に投与する場合には、体重当たりの幼若ブタ由来間葉系幹細胞数として、１×１０～５×１０１０個／ｋｇ、好ましくは１×１０^２～５×１０^９個／ｋｇ、より好ましくは１×１０^３～５×１０^８個／ｋｇである。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与してもよい。

参考例１
〔幼若ブタ由来骨髄細胞の回収〕
　幼若ブタの大腿骨から骨髄を採取した。幼若ブタ（生後２３日の医療用ランドレース種ブタ）から大腿骨を回収し、両端を切断して１２Ｇ針を挿入し、５０ｍＬのヘパリン処理したＰＢＳ［３ｍＬのヘパリン（１０００Ｕ／ｍＬ）、４７ｍＬのＰＢＳ］で洗い流し、反対側の場所から５０ｍＬの骨髄の流出液（以下、骨髄液とも略す）を回収した。流出液の量が減少したら、骨を逆にして針を反対側に挿入し、ＰＢＳで再び洗い流して骨髄液を収集した。カウント用の１５ｍＬコニカルチューブで１９５０μＬのＰＢＳ（４０倍希釈）に５０μＬのサンプルを取り、セルカウンターで細胞数を測定した。

〔幼若ブタ由来単核球細胞（ｎｐＭＮＣ）画分の単離〕
　上記手順で得られた骨髄液を静かに再懸濁した。骨髄液全体を５０ｍＬチューブ４本に各１０ｍＬずつに分け、各々ＰＢＳで３０ｍＬに希釈し、細胞がチューブに付着していないことを確認してよく混合した。１０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製）を４本の新しい５０ｍＬチューブに加え、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ層の上にＰＢＳと混合した３０ｍＬの骨髄液を入れた。

　前記チューブを２０℃にて３０分間４００×ｇで遠心分離し、ゆっくりとブレーキなしで加速させ（フルスピードの１／３）、３つの異なる層を形成させた。単核球細胞画分は浮遊白色リングに配置されているため、白色リング全体を２５ｍＬのＰＢＳを含む５０ｍＬチューブ（×４）に回収した。室温にて４００×ｇで７分間遠心分離し、上清を除去した。ＰＢＳを４０ｍＬまで加え、室温にて４００×ｇで７分間再び遠心分離した。上記と同様に細胞数を測定したところ、骨髄細胞全体のうち２５～３０％の細胞が単核球細胞画分として、それぞれ（２０～３０）×１０^６個単離された。

〔ｎｐＭＮＣ画分の細胞の凍結保存〕
　単離された単核球細胞画分の細胞を、１０^７細胞／ｍＬのＤＭＳＯを混合したＦＢＳ（９０％ＦＢＳと１０％ＤＭＳＯ）を含むクライオバイアルに入れ、細胞懸濁液の全容量を１ｍｌとした［細胞数／１０×１０^６＝ＤＭＳＯを混合したＦＢＳの容量（ｍＬ）とした］。クライオバイアルを－２０℃にて１時間保存し、続いて－８０℃にて２４時間保存後、最終的に長期保存用の液体窒素タンクに移した。

〔ｎｐＭＮＣ画分の細胞の培養およびｎｐＢＭ－ＭＳＣの調製〕
　３７℃の水浴でクライオバイアルに冷凍保存していたｎｐＭＮＣ画分の細胞を含む細胞懸濁液を素早く解凍し、マイクロピペットを用いて、解凍した細胞懸濁液を３０ｍＬの温度平衡（３７℃）に調整したＭＳＣ基礎培地［５００ｍＬのＧｉｂｃｏ社製ＭＥＭα（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ｎｏ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ）に５５ｍＬのＧｉｂｃｏ社製Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　（ＦＢＳ）及び５．５ｍＬのＳｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加した培地、以下同様］に静かに加えた。室温にて５分間、５００×ｇで遠心分離し、ペレットを４ｍＬの温度で平衡化したＭＳＣ基礎培地に再懸濁し、上下に穏やかにピペッティングした。総細胞数および生細胞数を計測した結果、総細胞数４．１８×１０^６個、生細胞数６．６×１０^５個、生存率：１５．８％であった。

　０．１％ゼラチンで６ウェルプレートをコートし、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中に１０～１５分間静置後、使用前にゼラチンを除去した。調製した各０．１％ゼラチン被覆６－ウェルプレートに細胞懸濁液を加え、穏やかに揺動させて増殖表面（ゼラチンコート）上に細胞懸濁液を分散させ、２ｍＬのＭＳＣ基礎培地中に２．０９×１０^６個の細胞／１ウェルを播種した。ＣＯ_２インキュベーター中で、３７℃にて５％ＣＯ_２、９０％湿度の条件下で培養し、３日後にＭＳＣ培地［５００ｍＬのＧｉｂｃｏ社製ＭＥＭα（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）に５５ｍＬのＧｉｂｃｏ社製Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、５．５ｍＬのＳｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ及び２２．２μＬのＳｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製ＦＧＦ－Ｂａｓｉｃ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ，ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：１ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地、以下同様］に交換して細胞を増殖させ、以後、３日間に１回、ＭＳＣ培地の交換を行った。１０日後にｎｐＢＭ－ＭＳＣがコンフルエントとなった。なお、ゼラチンコート無しのプレートを用いた場合についても、同様に１０日後にｎｐＢＭ－ＭＳＣがコンフルエントとなった。

〔継代〕
　ｎｐＢＭ－ＭＳＣがほぼ１００％コンフルエントに達した後、２ウェルから細胞を回収し、０．１％ゼラチンコート有りまたは無しでＴ７５フラスコにそれらを再播種した。

　２ｍＬのＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウム不含）で細胞を洗浄し、１ウェル当たり０．２５％トリプシン３２０μＬを加えてインキュベーターに数分間静置し、細胞が剥がれたら、１６８０μＬのＭＳＣ培地で中和した。１ｍＬピペットを用いて細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに採取し、１６ｍＬ（８ｍＬ×２ウェル）のＭＳＣ培地を添加した後、室温にて５分間、５００×ｇで遠心分離した。ピペットを用いて、得られたペレットを温度平衡化したＭＳＣ培地（２ｍＬ）に穏やかに再懸濁した。総細胞数および生細胞数を計測した結果、総細胞数２．０５×１０^６個、生細胞数２．０２×１０^６個、生存率：９８．５％であった。

　ＭＳＣ培地を０．１％ゼラチンコート有りおよび無しのＴ７５フラスコに加え、４．５×１０^５生細胞／フラスコＴ７５フラスコとなるように再播種し、ＣＯ_２インキュベーター中で、３７℃にて５％ＣＯ_２、９０％湿度の条件下で培養した。これらの細胞を第１継代とした。第１継代を播種した３日後に、０．１％ゼラチンコートの有無にかかわらず、１００％コンフルエントに達した。

〔ｎｐＢＭ－ＭＳＣの調製〕
　ｎｐＢＭ－ＭＳＣがほぼ１００％コンフルエンスに達した後、０．１％ゼラチンコートを含むまたは含まないＴ７５フラスコの２つのフラスコから細胞を回収した。８ｍＬのＰＢＳ（－）で細胞を洗浄し、１ウェルあたり０．２５％のトリプシン２．４ｍＬを加え、インキュベーターに数分間静置し、細胞が剥がれたら１２．６ｍＬのＭＳＣ培地で中和した。細胞懸濁液を５０ｍＬのチューブに集めて、室温にて５分間、５００×ｇで遠心分離した。

　得られたペレットに温度平衡化したＭＳＣ培地（１０ｍＬ）を添加し、ピペットで上下に静かに再懸濁し、総細胞数および生細胞数を計測した結果を下記に示す。
　０．１％ゼラチンコートされたフラスコ（×２）からの細胞：総細胞数１．６２×１０^７個、生細胞数１．６０×１０^７個、生存率：９８．８％
　ゼラチンコートなしのフラスコ（×２）からの細胞：総細胞数１．４８×１０^７個、生細胞数１．４６×１０^７個、生存率：９８．６％

〔ｎｐＢＭ－ＭＳＣの凍結保存〕
　上記した培養とは別に、早期継代のｎｐＢＭ－ＭＳＣを凍結して細胞ストックを作製した。所望の濃度のＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）１またはＯＰＦ－３０１［３％トレハロース及び５％デキストランを含有する乳酸リンゲル液（国際公開第２０１４／２０８０５３号）］とＤＭＳＯを９：１の比率で混合した溶液中でトリプシン処理したｎｐＢＭ－ＭＳＣペレットを再懸濁し、１．５×１０^６細胞／１ｍＬ／バイアルとした。バイアルをバイセルに入れて－８０℃にて２４時間保存した後、細胞を－８０℃から液体窒素に移して長期保存した。

〔ＣＦＵアッセイ〕
　ｎｐＢＭ－ＭＳＣ（Ｐ２）を、２１ｃｍ^２培養ディッシュ（ゼラチンコート無しまたは０．１％ゼラチンコート）に６３０細胞を３０細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、ＭＳＣ培地中で培養した。ＭＳＣ培地は３日毎に交換した。６日間の培養後、接着細胞を４ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、４ｍＬの氷冷メタノールで４℃にて１５分間固定した。コロニーを可視化するために、リン酸緩衝液で１：１９に希釈した４ｍＬのギムザで３０分間細胞を染色後、室温（ＲＴ）で洗浄し、Ｈ_２Ｏで２回洗浄した。

　次いで、５０個を超える細胞のコロニー数を計測し、細胞のコロニー形成効率を計算した。細胞のコロニー形成効率は、１ディッシュ当たりのコロニー数を、１ディッシュ当たり播種した細胞数（６３０個）で割ることによって計算した。結果を表１に示す。なお、表１の値は平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。

　表１に示すように、ＣＦＵアッセイの結果、得られたｎｐＢＭ－ＭＳＣは、ゼラチンコートの有無にかかわらず、コロニー形成し得ることがわかった。

〔細胞の平均直径〕
　ｈＢＭ－ＭＳＣ（Ｐ４）および得られたｎｐＢＭ－ＭＳＣについて、細胞の平均直径を計測した結果を表２に示す。細胞の平均直径はＮｕｃｌｅｏ　Ｃｏｕｎｔｅｒ　ＮＣ－２００（商標）を用いて計測し、平均値（ｎ＝３）を算出した。

　表２に示すように、得られた幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、平均直径が小さいことがわかった。

〔増殖速度の評価〕
　ｈＢＭ－ＭＳＣおよびｎｐＢＭ－ＭＳＣについて、細胞をＴ２５フラスコ中で５０００細胞／ｃｍ^２（１．２５×１０^５細胞／フラスコ）の密度で播種し、ＭＳＣ培地を用いて培養した。ＭＳＣ培地は３日毎に交換した。培養開始から１、２、４および８日後に生存可能な細胞および死んだ細胞の総数を数えた。結果を表３および表４、並びに図１（ａ）および図１（ｂ）に示す。なお、表３および表４の値は平均値±ＳＤ（ｎ＝４）である。

　表３および表４、並びに図１（ａ）および図１（ｂ）に示すように、得られた幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、細胞の増殖速度が顕著に速いことがわかった。

〔脂肪細胞への分化〕
　ｈＢＭ－ＭＳＣおよびｎｐＢＭ－ＭＳＣについて、ｈＭＳＣ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）－ａｄｉｐｏｇｅｎｉ、ＰＴ－３００４（Ｌｏｎｚａ　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製）を用いて、プロトコールに従って脂肪細胞への分化を誘導した。誘導開始後１７日目にＳｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製Ｏｉｌ　Ｒｅｄを用いて染色した。その結果、得られた幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞と同様に、脂肪細胞に分化し得ることがわかった。

〔骨細胞への分化〕
　ｈＢＭ－ＭＳＣおよびｎｐＢＭ－ＭＳＣについて、ｈＭＳＣ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）－ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ、ＰＴ－３００２（Ｌｏｎｚａ　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製）を用いて、プロトコールに従って骨細胞への分化を誘導した。誘導開始後１４日目に、コスモ・バイオ社製アルカリフォスファターゼ染色キットを用いて染色して骨細胞への分化を確認した。その結果、得られた幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞と同様に、骨細胞に分化し得ることがわかった。

〔軟骨細胞への分化〕
　ｎｐＢＭ－ＭＳＣについて、ｈＭＳＣ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）－ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ、ＰＴ－３００３（Ｌｏｎｚａ　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社製）を用いて、プロトコールに従って骨細胞への分化を誘導した。誘導開始後１９日目に、ＨＥ染色した。その結果、得られたｎｐＢＭ－ＭＳＣは、軟骨細胞に分化し得ることがわかった。

参考例２
〔ｎｐＭＮＣ画分の細胞の培養およびｎｐＢＭ－ＭＳＣ調製〕
　ＭＳＣ基礎培地またはＭＳＣ培地は、使用前にインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）中に１０～１５分間静置した。試験例１と同様に、３７℃の水浴でクライオバイアルに冷凍保存していたｎｐＭＮＣ画分の細胞を含む細胞懸濁液を素早く解凍した。マイクロピペットを用いて、解凍した細胞懸濁液を３０ｍＬの温度平衡（３７℃）ＭＳＣ基礎培地に静かに加え、５０ｍＬのチューブ２本に１５ｍＬずつ分注した。

　室温にて５分間、５００×ｇで遠心分離し、ペレットを２ｍＬの温度平衡ＭＳＣ基礎培地またはＭＳＣ培地に再懸濁し、上下に穏やかにピペッティングした。総細胞数および生細胞数を計測した結果を下記に示す。
　２ｍＬのＭＳＣ基礎培地：総細胞数２．６０×１０^６個、生細胞数４．８×１０^５個、生存率１８．５％
　２ｍＬのＭＳＣ培地：総細胞数２．５５×１０個、生細胞数４．５×１０^５個、生存率１７．６％

　播種細胞数が下記となるように計算された量の細胞懸濁液を各ウェルにつき下記培地を入れた６ウェルプレート（ゼラチンコート無し）に加え、穏やかに揺り動かして増殖表面上に細胞懸濁液を分散させた。
　２ｍＬのＭＳＣ基礎培地：２．６０×１０^６個／１ウェルの細胞を播種
　２ｍＬのＭＳＣ培地：２．５５×１０^６個／１ウェルの細胞を播種

　ＣＯ_２インキュベーターに入れ、３７℃にて、５％ＣＯ_２、９０％湿度の条件下でインキュベートした。播種して３日後及び６日後にＭＳＣ培地にて培地交換して細胞を増殖させて、播種後８日目に継代した。

〔継代〕
　ｎｐＢＭ－ＭＳＣがほぼ５０～６０％コンフルエントに達した後、１ウェルから細胞を回収し、ゼラチンコートなしでＴ７５フラスコにそれらを再播種した。

　２ｍＬのＰＢＳ（－）で細胞を洗浄し、１ウェル当たり０．２５％トリプシンを３２０μＬ加えてインキュベーターに数分間静置し、細胞が剥がれたら１６８０μＬのＭＳＣ培地で中和した。細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに集めて８ｍＬのＭＳＣ培地を加え、室温にて５分間、５００×ｇで遠心分離した。

　得られたペレットに温度平衡化したＭＳＣ培地（２ｍＬ）を添加して、ピペットで上下に穏やかに再懸濁し、総細胞数および生細胞数の計測した結果を下記に示す。
　Ｐ０播種時にＭＳＣ基礎培地の群：総細胞数５．０×１０^５個、生細胞数５．０×１０^５個、生存率：１００％
　Ｐ０播種時にＭＳＣ培地の群：総細胞数３．３×１０^５個、生細胞数３．３×１０^５個、生存率：１００％

　１５ｍＬのＭＳＣ培地をＴ７５フラスコ（ゼラチンコート無し）に加え、下記細胞数となるように、ｎｐＢＭ－ＭＳＣを再播種した、インキュベーターにて培養した。これらの細胞を第１継代とした。
　Ｐ０播種時にＭＳＣ基礎培地の群：生細胞数５．０×１０^５個／フラスコ
　Ｐ０播種時にＭＳＣ培地の群：生細胞数３．３×１０^５個／フラスコ

〔ｎｐＢＭ－ＭＳＣの調製〕
　前記手順により再播種した細胞がほぼ８０～９０％のコンフルエンスに達した後、Ｔ７５フラスコ（ゼラチンコート無し）の１フラスコから細胞を集めた。８ｍＬのＰＢＳ（－）で細胞を洗浄し、０．２５ｍＬ／１ウェルのトリプシン２．４ｍＬを加え、インキュベーターに数分間静置し、細胞が剥がれたら１２．６ｍＬのＭＳＣ培地で中和した。細胞懸濁液を５０ｍＬのチューブに集めて、室温にて５分間、５００×ｇで遠心分離した。

　得られたペレットに温度平衡化したＭＳＣ培地（５ｍＬ）を添加し、ピペットで上下に静かに再懸濁して総細胞数および生細胞数を計測した結果を下記に示す。
　１つのフラスコからの細胞（Ｐ０の播種後の３日間のＭＳＣ基礎培地）：総細胞数５．１２×１０^６個、生細胞数５．０９×１０^６個、生存率：９９．５％
　１つのフラスコからの細胞（Ｐ０の播種時からＭＳＣ培地）：総細胞数４．７６×１０^６個、生細胞数４．７３×１０^６個、生存率：９９．４％

〔ｎｐＢＭ－ＭＳＣの凍結保存〕
　上記した培養とは別に、試験例１と同様にして、早期継代の細胞を凍結して細胞ストックを作製した。

参考例３
　参考例１および参考例２で調製したｎｐＭＮＣの細胞表面抗原を解析した。解析に用いた各サンプルの調製方法について、表５に示す。表５において、「Ｓｗｉｔｃｈ」とは、初期培養時はＭＳＣ基礎培地（ビタミンＣフリー）を用い、増殖培養時には増殖培地であるＭＳＣ培地（ビタミンＣ含有）に変更して培養したことを示す。

〔細胞表面抗原の解析〕
　各細胞サンプルを液体窒素タンクより取出して蓋を緩めて圧を抜き、再びふたを閉め、３７℃に予め加温しておいた恒温槽で１～２分間軽く撹拌しながら融解した。Ｓｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社製）５ｍＬを入れた１５ｍＬ遠沈管に融解させた各細胞を移し、４℃にて５００×ｇ、５分間遠心し、上清を取り除いた。５ｍＬのＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒを入れ、４℃にて５００×ｇ、５分間遠心し、２回洗浄した。

　２ｍＬのＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社製）で再懸濁し、生細胞数をカウントした。再遠心（５００×ｇ、５分間、４℃）を行い、細胞数１×１０^７個／ｍＬとなるようＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社製）で再懸濁し、２０μＬ（細胞数２×１０^５個）ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、非染色コントロール、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌの計４本ずつ調製した。　

　４μＬのＡｎｔｉ－ＣＤ４４，Ｍｏｕｓｅ（ＭＥＭ－２６３），ＰＥ（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）、１μＬのＰＥ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＣＤ９０（ＢＤ社製）（ブタとの交差性あり）、４μＬのＰＥ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１，κ　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社製）をそれぞれのチューブに添加し、遮光氷上で４５分間インキュベートした。非染色コントロールも氷上で保管した。

　各チューブにＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社製）を１ｍＬずつ入れて、４℃にて５００×ｇで５分間遠心し、２回洗浄した。細胞ペレットをタッピングしてほぐし、５００μＬのＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社製）で再懸濁し、解析直前にフィルターを通してフローサイト用のテストチューブに移した。解析までの間は遮光氷上で保管し、フローサイトメトリーを用いて解析した。

　その結果、いずれのサンプルにおいても間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ４４およびＣＤ９０が陽性であった。また、初期培養時にゼラチンによるコーティングを行わなくても、目的とする間葉系幹細胞が樹立することができた。なお、いずれの場合もＩｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌの測定では非特異な反応は見られなかった。

　参考例４　
〔幼若ブタ膵島由来間葉系幹細胞の調製〕　
　幼若ブタから膵島を回収し、浮遊培養することにより細胞塊を調製した後、参考例１と同様にして、冷凍保存した。３７℃の水浴でクライオバイアルに冷凍保存していた幼若ブタ膵島を素早く解凍した。

　マイクロピペットを用いて、解凍した膵島懸濁液を３０ｍＬの温度平衡（３７℃）に調整したＭＳＣ基礎培地に静かに加えた。４℃にて１分間、２１０×ｇで遠心分離した。なお、膵島を凍結しない場合は、室温にて、自然落下で膵島が沈殿後、上清を除去した。ペレットを４ｍＬの温度で平衡化したＭＳＣ基礎培地に再懸濁し、上下に穏やかにピペッティングした。

　６－ウェルプレートに膵島懸濁液を加え、穏やかに揺動させて増殖表面（ゼラチンコートなし）上に細胞懸濁液を分散させ、２ｍＬのＭＳＣ基礎培地中に１６５０ＩＥＱ～２１２５ＩＥＱの範囲の膵島／１ウェルを播種した。

　ＣＯ_２インキュベーター中で、３７℃にて５％ＣＯ_２、９０％湿度の条件下で培養し、３日後にＭＳＣ培地に交換して細胞を増殖させ、以後、３日間に１回、ＭＳＣ培地の交換を行った。表６にサンプルの調製条件を示す。初期凍結の有無にかかわらず、播種してから６日後に１００％コンフルエントに達した。

〔継代〕
　幼若ブタ膵島由来間葉系幹細胞（ｎｐＩＳＬＥＴ－ＭＳＣ）が約８０％～ほぼ９５％コンフルエンスに達した後、２ウェルから細胞を回収し、ゼラチンコートなしでＴ７５フラスコにそれらを再播種した。

　２ｍＬのＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウム不含）で細胞を洗浄し、１ウェル当たり０．２５％トリプシン３２０μＬを加えてインキュベーター内に数分間静置し、細胞が剥がれたら１６８０μＬのＭＳＣ培地で中和した。１ｍＬピペットを用いて細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに採取し、１６ｍＬ（８ｍＬ×２ウェル）のＭＳＣ培地を添加した後、室温にて５分間、５００×ｇで遠心分離した。ピペットを用いて、得られたペレットを温度平衡化したＭＳＣ培地（２ｍＬ）に穏やかに再懸濁した。

〔細胞の平均直径〕
　２０ｍＬの前記ＭＳＣ培地をゼラチンコート無しのＴ７５フラスコに加えて再播種し、ＣＯ_２インキュベーター中で、３７℃にて５％ＣＯ_２、９０％湿度の条件下で培養した。これらの細胞を第１継代とした。第１継代を播種した３日後に、初期凍結の有無にかかわらず、１００％コンフルエントに達した。このことから、幼若ブタの膵島から調製した間葉系幹細胞の増殖速度は、幼若ブタの骨髄から調製した間葉系幹細胞の増殖速度と同程度であることがわかった。得られた幼若ブタ膵島由来間葉系幹細胞の平均直径を表７に示す。

　表７に示すように、膵島の調製における凍結条件に関わらず、幼若ブタ膵島由来間葉系幹細胞を調製可能であり、凍結有りの場合、凍結無しの場合に関係なく平均直径は同程度であることがわかった。

　２ｍＬのＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社製）で再懸濁し、生細胞数をカウントした。再遠心（５００×ｇ、５分間、４℃）を行い、細胞数１×１０^７個／ｍＬとなるようＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社製）で再懸濁し、２０μＬ（細胞数２×１０^５個）ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、非染色コントロール、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０の計４本ずつ調製した。　

　１μＬのＭｏｕｓｅ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｐｉｇ　ＣＤ２９（ＢＤ社製）、４μＬのＡｎｔｉ－ＣＤ４４，Ｍｏｕｓｅ（ＭＥＭ－２６３），ＰＥ（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）、１μＬのＰＥ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＣＤ９０（ＢＤ社製）（ブタとの交差性あり）をそれぞれのチューブに添加し、遮光氷上で４５分間インキュベートした。非染色コントロールも氷上で保管した。

　その結果、いずれのサンプルにおいても間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ９０について高い陽性率が観察された。また、初期培養時における凍結の有無によらずに、目的とする間葉系幹細胞が樹立することができた。

試験例１　
　６ウェルプレートに、参考例１と同様にして調製したｎｐＢＭ－ＭＳＣを細胞数５×１０^４個／２ｍＬ／ウェル又はｍＢＭ－ＭＳＣ（ＯｒｉＣｅｌｌＴＭ系統Ｃ５７ＢＬ／６マウス、カタログ番号ＭＵＢＭＸ－０１００１、ロット番号１７０２２１Ｉ３１、Ｃｙａｇｅｎ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．）を細胞数１×１０^５個／２ｍＬ／ウェルとなるように播種し、ＭＳＣ培地を用いて培養した。３日間の培養後、上清を回収してＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃの濃度を測定した。ＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β２濃度は、ＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、上清回収時の細胞数で補正した。結果を図２（ａ）及び（ｂ）、図３（ａ）及び（ｂ）に示す。なお、ブタ及びマウスのＴＧＦ－β１濃度はＲ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標）　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）　ＥＬＩＳＡ　Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ／Ｐｏｒｃｉｎｅ／Ｃａｎｉｎｅ　ＴＧＦ－β１（ＭＢ１００Ｂ，Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いて測定した。ブタ及びマウスのＴＧＦ－β２濃度はＲ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標）　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）　ＥＬＩＳＡ　Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ／Ｃａｎｉｎｅ／Ｐｏｒｃｉｎｅ　ＴＧＦ－β２（ＭＢ２００，Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて測定した。ブタのＶＥＧＦ－Ａ及びマウスのＶＥＧＦ－Ａ濃度はそれぞれＳｗｉｎｅ　ＶＥＧＦ－Ａ　Ｄｏ－Ｉｔ－Ｙｏｕｒｓｅｌｆ　ＥＬＩＳＡ（ＫＦＳ－ＤＩＹ０７５１Ｓ－００３，Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）及びＭｏｕｓｅ　ＶＥＧＦ－Ａ　Ｄｏ－Ｉｔ－Ｙｏｕｒｓｅｌｆ　ＥＬＩＳＡ（ＫＦＳ－ＤＩＹ０７４６Ｍ－００３，Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。ブタのＶＥＧＦ－Ｃ及びマウスのＶＥＧＦ－Ｃ濃度はそれぞれＰｏｒｃｉｎｅ　ＶＥＧＦ－Ｃ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（ＭＢＳ２５１２０２５，ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＭｏｕｓｅ　ＶＥＧＦ－Ｃ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（ＭＢＳ２５０３４６２，ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。

　図２（ａ）及び（ｂ）、図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃを産生していることがわかった。また、幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞は、マウス骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＶＥＧＦ－Ｃを高発現していることがわかった。

試験例２　
　文献（Motohiro Nishida,et al:J Vasc Surg:2016:64:219-226）に記載の方法に従い、１２週齢相当雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの左大腿動脈を結紮後、切離して虚血肢を作製した。作製した虚血肢の大腿筋組織に、参考例１と同様にして調製した幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞を細胞数１×１０^５個、５×１０^５個、１×１０^６個又は２．５×１０^６個／０．１ｍＬとなるようにＰＢＳに懸濁し、０．１ｍＬを筋肉注射した。

　レーザドップラー流速計（Ｍｏｏｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，ＵＫ社製ＤＳ２）を用いて、術後４週まで経時的に下肢の血流を測定し、患側と健常（コントロール）側とを比較した。結果を図４に示す。

　図４に示すように、幼若ブタ由来間葉系幹細胞の投与により、著しい血流改善効果が得られた。

試験例３
　試験例２と同様にして作製した虚血肢の大腿筋組織に、参考例１と同様にして調製した幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞、又はマウス骨髄由来間葉系幹細胞を細胞数１×１０^５個、又は１×１０^６個／０．１ｍＬとなるようにＰＢＳに懸濁し、０．１ｍＬを筋肉注射した。

　レーザドップラー流速計（Ｍｏｏｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，ＵＫ社製ＤＳ２）を用いて、術後４週まで経時的に下肢の血流を測定し、患側と健常（コントロール）側とを比較した。結果を図５に示す。

　図５に示すように、幼若ブタ由来間葉系幹細胞による血流改善効果は、マウス骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、顕著に高いことが分かった。

　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１９年４月２４日付けで出願された日本特許出願（特願２０１９－８２７６８）に基づいており、その全体が引用により援用される。

Claims

　非ブタ動物を治療するための医薬用組成物であって、
　形質転換成長因子－β（以下、ＴＧＦ－β）１、ＴＧＦ－β２、血管内皮増殖因子（以下、ＶＥＧＦ）－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃから選ばれる少なくとも１の液性因子を産生する幼若ブタ由来間葉系幹細胞を含有する、医薬用組成物。
　血管新生及び／又はリンパ管新生の促進により前記非ブタ動物を治療する、請求項１に記載の医薬用組成物。
　末梢動脈疾患、脳梗塞、心筋梗塞、急性肺損傷、創傷及び皮膚損傷から選ばれる少なくとも１を治療する、請求項１または２に記載の医薬用組成物。
　前記幼若ブタ由来間葉系幹細胞が胎児から生後１ヶ月未満のブタ由来である請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬用組成物。
　前記幼若ブタ由来間葉系幹細胞が胎児から生後２５日未満のブタ由来である請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬用組成物。
　前記非ブタ動物が、ヒトである、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬用組成物。