JPH11513254A

JPH11513254A - 細胞培養のためのコロイドシリカ

Info

Publication number: JPH11513254A
Application number: JP9514426A
Authority: JP
Inventors: シーウォルコット，クリスティン
Original assignee: Corning Inc
Current assignee: Corning Inc
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-02
Publication date: 1999-11-16
Also published as: AU7514296A; EP0853664A1; WO1997012966A1; EP0853664A4; US5814550A

Abstract

(57)【要約】コロナ処理したポリスチレンのような基体上に薄いコロイドシリカフイルムを形成する方法が提供される。乾燥フイルムは、50ｎｍ厚、高シラノール、均質、高表面積、多孔性、亀裂がない、付着性、湿潤性、負の荷電、およびガンマ放射安定性として特徴付けられる。コロイドシリカフイルムのいくつかの特異的な利点が、上皮細胞培養、特に、血清を含まない培地中の一次培養に関して示された。フイルムに対する細胞反応は、組織培養ポリスチレンと比較して、増大した外殖体付着、増大した細胞増殖速度、および継代培養前後の識別関数の増大した式であった。

Description

【発明の詳細な説明】細胞培養のためのコロイドシリカ発明の背景１．発明の分野本発明は、細胞培養に関し、特に、培養において、一次細胞を含む細胞の付着および増殖に役立つ表面を提供することに関するものである。２．従来技術 1970年代まで、ソーダ石灰ケイ酸塩ガラスが組織培養に用いられる主な材料であった。この時期における標準的な培養容器は、ペンシルバニア州、ブロックウェイのブロックウェイガラスカンパニーにより作成された処方ボトルであった。これらのガラス容器は、繰り返しの洗浄後、すなわち、表面浸食後の組織培養用途のために著しく改良されてきた。Rappaport C.，J.P.PooleおよびH.P.Rappapo rtの「Studies of the Surfaces Required for Growth of Mammalian Cells in Synthetic Medium」，Exp ．Cell Res.，Vol．20，1960，465-510頁参照のこと。 1970年代に、組織培養材料として、射出成形ポリスチレン（ＰＳ）が導入された。今日、ポリスチレンに加えて、ポリカーボネート（ＰＣ）およびポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）のような高分子もまた、培養における付着依存性哺乳類細胞の増殖基体として一般に用いられている。これらの材料のシートまたは射出成形容器が、一般に用いられている形状の例である。ほとんどの高分子は、電気プラズマ放電により処理され、表面を親水性にすることにより、細胞付着を改良している。高分子がポリスチレンである場合には、これらの表面は、細胞培養ＰＳまたは単にＴＣＰＳと呼ばれている。ＴＣＰＳの増大した湿潤性および表面酸化（−ＯＨ基および−ＣＯＯＨ基）により、周囲の培地から細胞付着分子を吸着することができ、したがって、細胞が付着することができる。基体を多孔性とすることにより、ある用途に関して、特に、分化機能の発現が必要とされる場合に、高分子表面を改良する。高分子表面は、ほとんどの細胞培養用途、特に、組織培養ＰＳへの付着および分裂によく適した株化細胞系統を含む用途に利用できる。しかしながら、これらのＰＳ表面は、ある場合には、一次細胞培養および血清を含まない細胞培養のような用途には適していない。ほとんどの哺乳類細胞培養は、増殖培地中に5-10％の胎仔ウシ血清を用いて、細胞の付着を向上させ、細胞生存度および増殖を維持することにより行われている。付着させるのが困難な細胞のこのような培養では通常、単体または組合せのいずれかの形態の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分により被覆して、細胞付着を改良することにより、高分子基体を改良している。ＥＣＭ成分の例としては、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンが挙げられる。ＥＣＭ成分由来の配列を有するペプチドもまたこの目的に使用される。例えば、Hubbell等の米国特許第5,278,063号を参照のこと。血清およびＥＣＭコーティングは、評価または適用するのに費用が高く、時間がかかり、ロット間で不均一である場合があるので、血清またはＥＣＭコーティングの必要ないまたは必要の少ない表面が望まれている。培養において足場依存性細胞を成長させるのに、ミシガン州、アンアーバーの SoloHill Labs，Inc.により製造されたガラス被覆マイクロキャリヤが用いられている。SoloHillは、それらのビーズを滑らかな表面を有するものとして記載している。ビーズ上で成長したＭＲＣ−５細胞は、ＤＥＡＥ−デキストランマイクロキャリヤ上で成長した細胞よりも、トリプシン化後の細胞生存度が大きいと報告されている。ガラス基体はまた、デキストランまたはコラーゲンゲルのいずれかと比較して、培養において、ウイルス中枢（生存可能なウイルス感染細胞）の生成を増大させると報告されている。Variani,J.，M.J．BendelowおよびW.J.Hil legas,の「The Effect of Substrate on the Production of Infectious Virus by Cells in Culture」，J ．of Biol．Stand.，Vol.16，1988，333-338頁参照のこと。 SoloHillビーズ上で成長した細胞は、細胞を容易に脱着できる、細長い糸状足により付着すると言われている。米国特許第4,029,045号、同第4,448,884号、同第4,564,532号、および同第4,661,407号は、これらのキャリヤに関するものである。これらに記載されているように、ガラスコーティングは、化学蒸着技術（米国特許第4,029,045号、同第4,564,532号、および同第4,661,407号）または高周波スパッター技術（米国特許第4,029,045号および同第4,448,884号）により高分子ビーズに施されている。組織培養表面を生成するのにコロイドシリカを使用することは、記載も示唆もされていない。反対の形状を有する、すなわち、内側にガラスを、外側に有機高分子を有するマイクロキャリヤが、CELLFASTの商標で、北アイルランド、アントリムのQDM La boratoriesにより販売されている。これらの粒子は、個々の細胞が固着し、増殖できる凹部を有するものとして記載されている。可溶性ケイ酸塩溶液、有機高分子溶液、および酸性溶液を組み合わせることによるガラスビーズの製造について記載している、ＰＣＴ特許公報ＷＯ86/07345、およびＷＯ86/07345に開示された種類のビーズを高分子被覆して、細胞培養のための凹部含有マイクロキャリヤを製造することを記載している、ＰＣＴ特許公報ＷＯ87/02703を参照のこと。ケイ酸ヘテロ重合縮合体を、生きている細胞の培養においてコーティング組成物として使用することが、Scholze等の米国特許第4,243,692号に記載されている。この特許によれば、置換シラン、官能シラン、および加水分解性ケイ酸を同時に縮合して、ヘテロ重合縮合体を生成している。ある場合には、縮合反応の一部が、被覆されている支持体上で行われる。この特許の工程では、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）粒子を基体に適用していない。微生物を増殖させるための培地として、例えば、寒天培地の代替物として、コロイドシリカから生成されるシリカゲルを使用することか、Pramer，D.の「The Influence of Physical and Chemical Factors on the Preparation of Silica Gel Media」，Applied Micrbiol.，Vol.5，392-395頁，1957年；Kingsbury,J.M. およびBarghoorn,E.S.の「Silica Gel as a Microbiological Medium: Potentia lities and a New Method of Preparation」，Applied Microbiol.，Vol.2，5-8 頁，1954年；およびTemple,K.L.の「A New Method for the Preparation of Sil ica Gel Plates」，J ．Bacteriol.，Vol.57，57頁，1949年に論じられている。本発明とは異なり、コロイドシリカのこれらの初期の使用目的は、コーティングが施される基体上に高度に架橋された実質的に永久的なフイルムを形成するためにコーティング工程中に水を除去するためではなく、むしろ、ゲル中に水を保持する（すなわち、離液を最小にするために）ことにあった。発明の概要上述した点に鑑みて、本発明の目的は、組織培養における細胞の増殖に使用する改良表面を提供することにある。本発明の目的は、特に、一次細胞の増殖に役立つ表面を提供するにある。本発明のさらなる目的は、細胞培養作業に現在用いられている基体に容易に施せる表面、またはペトリ皿、カバーグラス、フラスコ、細胞管、マルチウェルプレート、細胞ウェルインサート等のような、将来開発されるかもしれない表面を提供することにある。上述した目的および他の目的を達成するために、本発明は、基体および基体の少なくとも一部に施されるコロイドシリカのフイルムからなる、細胞培養を行う装置を提供する。本発明はまた、コロイドシリカの水溶液を基体に施し、乾燥させて、所望のフイルムを形成する、そのような装置を製造する方法を提供する。以下詳細に記載するように、本発明によれば、コロイドシリカにより被覆された基体は、被覆されていない基体とは著しく異なる、培養における細胞からの反応を誘発することが分かった。特に、コロイドシリカフイルムは、特に一次細胞に関して、より生体内様の細胞反応を誘発する増殖表面を提供する。ここに用いているように、「コロイドシリカフイルム」という用語は、コロイドシリカの水溶液（すなわち、粒子が予め選択された温度、例えば、25℃の温度で溶液内に実質的に分散した状態にあるように、寸法および濃度が十分に小さいシリカ粒子を含有する溶液）を基体に施し、水を除去した結果としてシリカ粒子が架橋して、基体上にフイルムを形成するように溶液を乾燥させることにより基体上に形成されたフイルムを称する。シリカ粒子は好ましくは、水溶液中で架橋しないように荷電されている。図面の簡単な説明図１は、コロイドLUDOX分散体により被覆され、クリスタルバイオレットラクトン（ＣＶＬ）により染色された皿に関する吸光度対回転速度のプロットである。図２は、様々な溶剤中にフイルムを浸漬した後の、本発明により調製したコロイドシリカフイルムで被覆された皿からのクリスタルバイオレットの脱着を示すプロットである。図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、ポリスチレン表面（図３Ａ）および本発明により調製したコロイドシリカで被覆したポリスチレン表面（図３Ｂおよび３Ｃ）上で増殖したＭＤＣＫ細胞の顕微鏡写真である。これらの図の増殖培地は、血清を含んでいた。図４Ａおよび４Ｂは、ポリスチレン表面（図４Ａ）および本発明により調製したコロイドシリカフイルムで被覆したポリスチレン表面（図４Ｂ）上で増殖したＭＤＣＫ細胞の顕微鏡写真である。これらの図の増殖培地は、血清を含んでいなかった。図５Ａおよび５Ｂは、ポリスチレン表面（図５Ａ）および本発明により調製したコロイドシリカフイルムで被覆したポリスチレン表面（図５Ｂ）上の一次ウサギ腎臓近位細管外殖体から増殖した細胞の顕微鏡写真である。明細書に含まれ、その一部を構成する上述した図面は、本発明の様々な形態を説明するものであり、記載と共に、本発明の原理を説明する役割を果たす。もちろん、図面と記載の両方は、説明のためのみであり、本発明の限定するものではないことが理解されよう。好ましい実施の形態の記載上述したように、本発明は、コロイドシリカフイルムを基体に施すことによる細胞培養表面の調製に関するものである。本発明を実施する際に、様々な幾何学形状を有し、様々な材料から作成された様々な基体を使用しても差し支えない。基体の例としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびポリエチレンテレフタレートのような有機材料から作成された基体、およびガラス、セラミック、ガラスセラミック、および金属のような無機材料から作成された基体が挙げられる。さらに、基体は、複数の材料から構成されていても差し支えなく、例えば、層形状を有していても差し支えない。中実および多孔性の両方の基体を用いても差し支えない。基体に関して可能性のある形態の例としては、ペトリ皿、カバーグラス、スライド、プレート、フラスコ、細胞管、マルチウェルプレート、細胞ウェルインサート等が挙げられる。基体表面の全てまたは一部を本発明のフイルムにより所望なように被覆しても差し支えない。基体は、コロイドシリカコーティング溶液のシリカと、基体との間に結合が形成できるように、湿潤性表面を有する必要がある。ポリスチレンのような重合材料の場合には、そのような湿潤性表面は、例えば、プラズマ処理またはコロナ処理により達成することができる。本発明のフイルムは、コロイドシリカの水溶液を被覆すべき基体に施し、次いで、水を除去して所望のフイルムを作成することにより形成される。このフイルムは、好ましくは、約100ｎｍ未満、そして最も好ましくは約50ｎｍ末満である厚さ、比較的高いＳｉ−ＯＨ含有量、および好ましくは少なくともある程度の多孔度により特徴付けられる。水溶液中のシリカ粒子は、粒子が、例えば、室温で分散された状態に維持されるように十分に小さい寸法を有している。これらの粒子の適切な平均直径は約12 ｎｍであるが、所望であれば、これより大きいまたは小さい平均直径を有する粒子を用いても差し支えない。平均値辺りのシリカ粒子の分布を用いて、完成フイルムの多孔度を制御することができる。特に、小さい粒子と大きい粒子との組合せを用いることにより、小さい粒子は大きい粒子の間の空間を埋める傾向にあるので、多孔度を減少させることができる。シリカ粒子は好ましくは純粋なＳｉＯ₂であるが、所望であれば、例えば、アルミナを含めることにより表面の改質された粒子を用いても差し支えない。特に、アルミナを含ませることにより、ある種の細胞に望ましいかもしれない正電荷を有する粒子が形成される。基体に施される水溶液は一般的に、薄いフイルムを確実に形成するために、例えば、約10重量％および好ましくは約５重量％未満の比較的低濃度のシリカ粒子を有する。溶液の残りは主に、シリカ粒子を懸濁状態に維持するのに必要な、いくつかの対イオンを有する水である。溶液は好ましくは有機材料を含まないが、フイルム形成高分子が、フイルム形成工程、活性シラノール部位の数、または完成フイルム上の細胞の増殖を実質的に妨げなれけば、所望であれば、それらを含んでも差し支えない。水溶液に含まれる有機物は、所望であれば酸素プラズマ処理により少なくともある程度まで乾燥フイルムから除去しても差し支えない。また、所望であれば、例えば、酸溶液中で乾燥フイルムを洗浄して、有機物を除去しても差し支えない。シリカ粒子の水溶液を様々な様式で基体に施すことができる。好ましい手法は、中でも回転被覆によるものである。何故ならば、基体が回転している速度を単に変更することにより、フイルムの厚さを容易に制御できるからである。水溶液の粘度は、回転速度と共同した、さらなる変数である。これを用いてフイルム厚を制御しても差し支えない。粘度は、例えば、水溶液に有機物を加えることにより増大させることができる。他の可能性のある被覆手法の例としては、溶液を霧状にし、霧として基体に施すこと、基体を溶液中に浸漬すること等が挙げられる。どのような方法を用いたとしても、最終的なフイルムは、亀裂および剥離を避けるほど十分に薄くなければならない。一度基体にしたら、コーティングを乾燥させて、所望のフイルムを形成しなければならない。乾燥は、単に室温での蒸発により行っても差し支えなく、または、所望であれば、高温（または低温）で行っても差し支えない。再度、乾燥は、フイルムが、剥離につながる亀裂を発生させないような速度で行わなければならない。また、乾燥は、基体から材料がブリードしないような温度で行うべきである。その上、乾燥は、例えば、約120℃未満の温度で、フイルムからシラノール基が実質的に失われないような温度で行うべきである。さらに、有機基体を用いる場合には、乾燥温度は、基体が著しく変形しないように十分に低いべきである。このように作成された本発明のコロイドシリカフイルムを用いることが一般的に好ましいが、所望であれば、このフイルムを改質しても差し支えない。例えば、これらのフイルムを、コラーゲン層、ＥＣＭ層、またはジアルデヒドデンプンの層のような続いての層のための結合剤として用いても差し支えない（米国特許第5,281,660号参照）。また、有機官能シランを気相または液相でフイルムに施して、表面化学柔軟性を加えても差し支えない。細胞培養前に、フイルムを生物活性無機イオン（例えば、Ｃａ、Ｍｇ）により改質しても差し支えない（カルシウム表面の分裂促進効果の議論に関する、Chen gの来国特許第4,757,017号参照）。表面改質を行った場合、系のｐＨを制御して、コロイドシリカフイルムが実質的に溶解しないようにする必要がある。フイルムに局部的なデリバティゼーションを行って、組織細胞増殖の特殊形態を得ても差し支えない。例えば、Kleinfeld等の「Controlled Outgrowth of Dis sociated Neurons on Patterned Substrates」，J ．of Neurosci，Vol.8，No.11 , 1988，4098-4120頁を参照のこと。デリバティゼーションを用いるよりもむしろ、例えば、局部的なプラズマ処理またはコロナ処理により、基体上に局部的な湿潤区域および非湿潤区域を形成することにより、パターン化増殖を行っても差し支えない。シリカコーティング溶液は湿潤区域のみに付着し、したがって、続いての細胞増殖のためのパターン化表面を形成する。コロイドシリカの分散およびコーティングの形成におけるそれらの使用に関する議論が、Dobanの米国特許第2,906,658号、Ilerの米国特許第2,833,661号および同第3,773,776号、Payneの米国特許第3,754,984号、Wolinskiの米国特許第2,9 09,443号、およびWoodwardの米国特許第3,676,189号に見られる。以下詳細に記載するように、本発明のある好ましい実施の形態により、回転被覆により、コロナ処理されたＰＳ皿にコロイドシリカ分散液を施した。回転被覆により、亀裂が無く透明で、反応性シラノール基が表面に多くある、50ｎｍ厚の付着フイルムが形成された。これらのフイルムは、非常に湿潤性であり、緩衝液中でやや可溶性であった。これらのフイルムは、血清を含まない培地中での一次細胞の培養において、非被覆コロナ処理ＰＳより優れていることが分かった。従来技術において知られているように、血清を含まない培地中で一次細胞を培養することは困難であるので、このことは、本発明の重要な利点である。いかなる様式にも限定することを意図せずに、本発明を以下の実施例によってより完全に記載する。実施例１コロイドシリカフイルムによる基体の被覆１．基体コーニングコスター社（ニューヨーク州、オネオンタ）により製造された従来のコロナ処理35ｍｍポリスチレンペトリ皿を基体として用いた。皿のいくつかは、被覆時点で滅菌されていなかったが、その他の皿には、被覆前に滅菌のためにガンマ線を放射した。２．コロイドシリカコーティング溶液 20から40ミリリットルのコロイドシリカコーティング溶液を、デュポンのLUDO X銘柄のコロイドシリカ、グレードHS-40（デラウェア州、ウィルミントン、デュポンスペシャルティーケミカルス）を用いて調製した。製造業者により報告されているように、このグレードは以下の特性を有している：粒子の電荷−−負；平均粒子直径−−12ｎｍ；比表面積−−220ｍ²／ｇ；ＳｉＯ₂含有量−−40重量％；安定化対イオン−−ナトリウム；ＳｉＯ₂／Ｎａ₂Ｏ比（重量）−−95；25℃でのｐＨ−−9.7。「Ludox Colloidal Silica -- Properties，Uses，Storage，an d Handling,」Dupont Specialty Chemicals，Wilmington，Delaware，Publicati on No.H-47771，January，1994を参照のこと。コーティング溶液もまたLUDOXグレードSKを用いて調製した。製造業者により報告されているように、このグレードは以下の特性を有している：粒子の電荷− −負；平均粒子直径−−12ｎｍ；比表面積−−230ｍ²／ｇ；ＳｉＯ₂含有量−−2 5重量％；；25℃でのｐＨ−−４−７。安定化対イオン（例えば、ナトリウム）を用いるよりはむしろ、グレードSKに用いたシリカ粒子の表面は、溶液のｐＨにかかわらず、永久的な負の電荷を有するようにアルミナにより改変されている。その上、SKグレードは、水溶性のフイルム形成高分子（ポリビニルアルコール）を含んでいる。「Ludox Colloidal Silica -- Properties，Uses，Storage，and Handling,」Dupont Specialty Chemicals，Wilmington，Delaware，Publicatio n No.H-47771，January，1994を参照のこと。コーティング溶液は、HS-40分散体を脱イオン水で希釈して、10％（容積／容積）溶液（10倍の希釈）を調製することにより、基体を被覆する直前に調製した。ある実験において、50％（容積／容積）溶液を用いた（２倍の希釈）。LUDOX SKにより調製したコーティング溶液を２倍の希釈で使用した。 HS-40溶液のｐＨは希釈後に＞９のままであったが、少量のシリカホイスカが希釈から数時間後に形成された。脱イオン水ではなく、ｐＨ９の水を使用することにより、ホイスカが形成されなくなることが分かった。 0.2μ非滅菌界面活性剤不含有酢酸セルロースシリンジフィルタ（ニューヨーク州、ロチェスター、ナルジーン、カタログ番号191-2020）を用いて、希釈した分散体を濾過した。濾液の化学分析（ＤＣＰ）により測定したように、濾過中において、シリカは、著しくは損失しなかった。LUDOX HS-40は、40重量％のＳｉＯ₂ として証明されている。10倍に希釈され、濾過された溶液が、4.7重量％のシリカ濃度を有することが分かった。３．被覆方法ラミナーフローフッドの内部に配置されたベンチトップフォトレジストスピナー（テキサス州、ガーランド、ヘッドウェイリサーチ社、カタログ番号1-EC-101 D-R485）を用いて、ポリスチレンペトリ皿を一度に１つずつ回転被覆した。スピナーは、フットペダルスイッチおよび3/4インチ（1.9ｃｍ）の真空回転チャックに接続された制御器からなる。各々の皿の底面が、回転前に完全に被覆されるように、過剰のコーティング溶液（0.2−0.4ｍｌ）をパスチャーピペットを用いて各々の皿上に滴下し、皿を手で揺らした。パスチャーピペットを、それぞれの使用ごとに0.1ＮのＮａＯＨ中で洗浄して、ピペット上で重合シリカ粒子が形成されないようにした。次いで、皿を真空チャック内に配置し、40秒間に亘り4,000ｒｐｍの速度で回転させて、過剰の溶液を除去した。フイルムが薄くなるにつれ、回転の最初の２ −５秒以内で、シリカフイルムの色が急速に変化するのが観察された。回転後、皿を金属製ラック上に真っ直ぐに（開放部分を上にして）配置した。 40−100の皿を回転被覆した後に、ラックおよび皿を60分間に亘り50−70℃の強制空気オーブン内に配置して、乾燥させた。ある期間の乾燥時間が与えられなかったフイルムは洗浄により容易に除去されたので、この乾燥工程は、本発明のコロイドシリカフイルムの成功にとって重要である。しかしながら、室温で乾燥させたフイルムもまた洗浄に耐えることが分かったので、高温での乾燥は必要ではない。４．洗浄乾燥後、被覆皿を１％（容積／容積）の硫酸中で洗浄し、ナトリウムイオンを浸出させ、未結合コロイドシリカを除去した。酸洗浄はまた、運送および貯蔵中に細菌およびカビが増殖しないように製造業者によりLUDOX中に含まれた殺生剤を除去する（不活化させる）と考えられている。 100までの皿を、撹拌せずに、30−60分間に亘り室温で２リットルのナルジーンビーカー中の２リットルの酸中に浸漬した。皿を酸から取り出し、脱イオン水で３回濯ぎ、10リットルの脱イオン水を流しながら30分間に亘り洗い流した。次いで、皿を60分間に亘り50−70℃の強制空気オーブン内に真っ直ぐに配置して、乾燥させた。５．滅菌乾燥させた皿をホイルパッケージまたはプラスチックスリーブ内に配置し、ガンマ線の放射により滅菌した（1.0-2.5 Mradまたは10-25 KGrey）。滅菌皿、特に、LUDOX HS-40の10倍希釈物により作成された皿を、実施例３において以下に記載する細胞培養実験に用いた。実施例２コロイドシリカフイルムの物理的および化学的特徴付けＩ．材料および方法Ａ．フイルム厚ポリスチレン上の回転被覆シリカフイルムの厚さを干渉法により測定した。確認のために、研磨したシリコンウエハ上にもフイルムを形成し、その厚さを楕円偏光測定器を用いて測定した。２つの技術により測定した厚さは一致した。Ｂ．フイルムの化学的性質本発明のコロイドシリカフイルムと染料との反応により、表面の化学的性質を間接的に研究した。クリスタルバイオレットラクトン（ＣＶＬ）は、シラノール表面に特異的な染料である。Iler,R.K.，The Chemistry of Silica，John Wiley & Sons Inc.，NY , 1979,および「Process for Determining Amount and Uniformity of Distribu tion of Colloidal Silica」と題するTurnerの米国特許第3,023,401号を参照のこと。Turnerの特許に記載されているように、この種のラクトン染料を用いて、染色された紙の色を標準化された標品の色と単に比較することにより、紙上の吹付けコロイドシリカの量および均一性を測定することができる。キシレン（またはＣＣｌ₄）中のＣＶＬ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー、アルドリッヒケミカル社、カタログ番号332488）の２％（重量／容積）溶液を用いて、実施例１に記載したように調製したシリカ被覆ポリスチレン皿上のシラノール基の存在を測定した。少量のＣＶＬ溶液（0.2-0.5ｍｌ）を試験皿上にピペットで移し、揺らして、ピペットで取った。溶液中ではやや黄色であるＣＶＬ染料が、シラノール含有シリカと接触すると青に変色する。青色の強度を、分光光度計を用いて、試験皿を直接通しての600ｎｍでの吸光度を測定することにより定量した。図１は、2000−5000ｒｐｍの範囲の速度でLU DOX HS-40の10倍希釈物により回転被覆された皿に関する吸光度のデータを示している。この図面に示したように、低速で被覆された皿は、高速で被覆されたものよりも大きい吸光度値を有していた（すなわち、より厚いフイルム）。HS-40 の２倍希釈物により作成されたフイルムは、10倍希釈物により被覆されたものよりも著しく暗い青であった。水性カチオン染料であるクリスタルバイオレットは通常、細胞培養に用いられている。Rappaport等およびCarrol & Freemanにより報告されているように、この染料は、シリカに対して反応性である。Rappaport,C.，J.P.PooleおよびH.P.R appaportの「Studies on Properties of Surface for Growth of Mammalian Cel ls in Synthetic Medium」，Experimental Cell Research，Vol.20，465-510頁，1960；およびCarroll,B.およびE.Freemanの「The Behavior of Colloidal Sil icate Solutions as Revealed by Adsorption Indicators」，J．Phys Chem.，V ol.58，335-338頁，1954を参照のこと。特に、Rappaport等は、クリスタルバイオレット染料吸着を浸食ガラス表面の生物活性と関連付けた。それらの実験において、ガラス管またはボトルを５分間に亘りクリスタルバイオレット中に浸漬し、水で濯いだ。次いで、染料をエタノールで脱着し、溶液を分光光度計により600ｎｍで読んだ。Rappaport等は、より多くの染料を吸着したガラス表面は、表面積が大きく、負の電荷を有したことを示した。強いクリスタルバイオレットの反応性を有する表面が、それらの一次細胞培養において最高の性能を示した。 Rappaport等のクリスタルバイオレット技術を以下に記載するように用いて、様々な溶剤に浸漬する前後で、本発明のコロイドシリカフイルムの耐久性を定量した。Ｃ．鏡検法染色したものと染色していないフイルムの600倍まで光学鏡検法を用いて、フイルムが微小亀裂を有するか否かを求めた。走査型電子鏡検法（ＳＥＭ）を皿の表面に行って、被覆したときと、緩衝液中に浸漬した後の両方で、乾燥したフイルムの微小組織を求めた。ＩＩ．結果Ａ．微小亀裂および剥離 LUDOX HS-40の２倍希釈物により作成したフイルム（20％のＳｉＯ₂）は回転被覆後に微小亀裂を有したが、LUDOX SKの２倍希釈物（12.5％のＳｉＯ₂）によるものと、HS-40の10倍希釈物（４％のＳｉＯ₂）によるものは微小亀裂を有さなかった。これらの試験に用いた回転速度は、4,000ｒｐｍであった。観察された微小亀裂は、ゲル化（脱水）中に生じた応力によるものであると考えられ、泥割れの外観を有している。微小亀裂は、基体からのコロイドシリカフイルムの剥離につながることがあるので、望ましくない。重要なパラメータは、乾燥前のフイルムの薄さである。したがって、高濃度のシリカを含有するコーティング溶液は、回転速度が高い場合に使用しても差し支えない。実施例３の細胞培養実験に用いた皿は、LUDOX HS-40の10倍希釈物を用いて被覆され、微小亀裂を有さなかった。Ｂ．シラノールおよびフイルム適用範囲全てのＳｉＯ₂濃度（すなわち、20％、12.5％、および４％）で作成したフイルムにより、容易に観察できる、実質的に均一なＣＶＬ染料との青反応が得られた。より高濃度の溶液により作成したフイルムは、より多くのシリカによるより多くのシラノールを示すより暗い反応を有した。ＣＶＬ実験に用いたキシレン溶剤は、コロイドシリカフイルムの元でポリスチレンを化学的に攻撃することが分かった。特に、粗いＰＳ表面が観察された。溶剤の基体に到達する能力は、フイルムが多孔性であることを示している。Ｃ．表面組織および化学的性質 LUDOX HS-40（10倍希釈物）により作成された、乾燥し、炭素被覆されたコロイドシリカフイルムの多孔度および表面組織をＳＥＭにより調査した。5,000−2 0,000の倍率で、最軟調交差線が見られた。100,000倍では、観察できた唯一の特徴は、＜10ｎｍ範囲にある非常に微細な組織であり、認識できる細孔はなかった。いくつかの被覆皿を、疑似体液（ＳＢＦ）、すなわち、イオン成分および血液の血漿濃度を有する緩衝溶液中に37℃で６日間に亘り浸漬した。Li,P.，K.Nakan ishi，T.KokuboおよびK.deGrootの「Induction and Morphology of Hydroxyapat ite，Precipitated from Metastable Simulated Body Fluids on Sol-Gel Prepr ared Silica」，Biomaterials，Vol.14，No.13，963-968頁，1993を参照のこと。次いで、皿を水で洗浄して乾燥させ、生物活性ガラスの特徴である、リン酸カルシウムコーティングの存在についてアッセイした。そのようなコーティングは見られなかった。使用した条件下で、ＮａＣｌ結晶が見られた。10,000倍でのＳＥＭは、処理したフイルムが、処理しなかったフイルムと比較して、より粗い表面組織を有することを示した。ＥＤＡＸによる化学分析は、このフイルムは明らかに、溶液からの塩の吸着により化学的に改変されなかったことを示した。しかしながら、フイルムは、水和および脱水により物理的に変化していた。Ｄ．フイルム厚 LUDOX HA-40の10倍希釈物、4,000ｒｐｍの回転速度、および40秒間の回転時間を用いて形成したフイルムが、約50ｎｍの厚さを有した。同一の回転速度と回転時間で、LUDOX SKの２倍希釈物により、200ｎｍの厚さのフイルムを形成した。Ｅ．フイルム分布および耐久性クリスタルバイオレットの染色は、LUDOX HA-40（10倍希釈物）により形成したコロイドシリカフイルムが均一であり、皿の側面と底面に存在したことを示した。皿の側面のフイルムの存在は、コーティング溶液が回転中に側壁まで移動したことを示している。底面と側壁が交わる角領域において、フイルムの厚くなる箇所が生じるかもしれない。図２は、様々な溶剤に一晩に亘り浸漬した皿の脱着クリスタルバイオレット染料の600ｎｍでの吸光度グラフである。コロナ処理した（ＴＣ＋）非被覆ＰＳおよびコロナ処理していない（ＴＣ−）非被覆ＰＳの両方は、非常に小さい吸光度値を有している。溶剤に浸漬していない本発明のコロイドシリカフイルムにより被覆した皿（ＨＳ）（特に、LUDOX HA-40により10倍の希釈で被覆された皿）は、負の対照の５−６倍の値を有した。予測されるように、強アルカリまたはフッ化水素アンモニウムに浸漬した被覆皿は、非被覆皿と等しい吸光度レベルとなった（すなわち、フイルムは溶解により除去された）。ＨＣｌ、Ｈ₂ＳＯ₄、および純粋なイソプロピルアルコールの１Ｍ溶液に浸漬した皿により、未処理皿に近い吸光度値が得られた。試験はしていないけれども、フイルムの溶解度は、イソプロピルアルコールよりも小さい分子量を有するアルコール中におけるほうが高いと思われる。Iler,R.K.のThe Chemi stry of Silica ，John Wiley & Sons Inc.，NY，1979を参照のこと。生物学的緩衝液（ＤＰＢＳ；ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に浸漬した皿により、浸漬後に、負の表面荷電および／または表面積のいずれかの損失を示す、負と正の対照の間の値が得られた。Ｆ．溶解度様々な期間に亘り37℃で、LUDOX HS-40（10倍希釈物）により被覆した皿に接触させられた緩衝溶液中の可溶性シリカレベルを測定することにより、本発明のコロイドシリカフイルムの溶解動力学を研究した。粉末から作成したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ニユーヨーク州、グランドアイランド、ライフテクノロジーズ、カタログ番号12400）およびＤＰＢＳ培地をこれらの研究に用いた。上述したように被覆した35ミリリットルのペトリ皿に、２ミリリットルの緩衝液を加えた。各々の実験に関して、３つの皿からの溶液を収集し、アッセイした。得られた結果は以下のとおりである：曝露時間これらのデータは、５日間の保温中に平坦域レベルに到達せずに溶液中のシリカのレベルの増大、すなわち、培地中へのシリカの「遅い放出」を示している。より多くのシリカが、ｐＨ7.2でのＤＰＢＳよりもｐＨ8.1でのＤＭＥＭ／Ｆ１２において放出された。増大したアルカリ度もまた、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に関して観察された比較的高い154ｐｐｍのシリカレベルを説明しているかもしれない。しかしながら、溶液は、過飽和レベルでピークとなり、次いで、平衡レベルまで減少し得る。Iler,R.K.のThe Chemistry of Silica，John Wiley & Sons Inc. ，NY，1979を参照のこと。比較のために、ガラスボトル中に貯蔵したいくつかの他の溶液に関して、ＳｉＯ₂レベルを測定した。予備混合し、ガラス中に貯蔵したＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液（ミズーリ州、セントルイス、メディアテック、CELLFROW、カタログ番号15-090 -LV）は、＜１ｐｐｍのＳｉＯ₂を有した。使用済みと新しいガラス組織培養ブレーキボトルを５日間に亘り37℃で25ｍｌのＤＰＢＳ溶液とともに保温した。これらのボトルは、緑がかった色をしており、ソーダ石灰ガラスから作成されたようである。新しいボトル、または使用済みボトルのいずれからも、５日後に、シリカの溶解は検出されなかった。これらの結果は、本発明のコロイドシリカフイルムは、高表面積のために、使用済み（浸食）ガラスよりも著しく溶解度が高いことを示している。シリカの溶解性は、複雑であり、シリカおよび溶剤の両方を含む多くの因子に依存する。水性培地中へのシリカの溶解は、以下のように、水和反応により生じる：ケイ酸は、非常に反応性が高く、溶液中の無機塩まは有機化合物と結合するかもしれず、またはシリカ表面に吸着されるかもしれない。脱水される場合には、ケイ酸は重合する。 Ilerに論じられているように、上記反応の速度は、シリカの表面積；表面水和［Ｓｉ−ＯＨ］；非晶質シリカ対結晶質シリカ；シリカの純度；溶剤のｐＨ、温度、および容量；および溶剤の化学的性質（例えば、塩濃度）を含む様々なパラメータに依存する。Iler,R.K.のThe Chemistry of Silica，John Wiley & Sons Inc.，NY，1979を参照のこと。Ｇ．性質の概要表１は、HS-40およびSK分散体を用いて調製したコロイドシリカフイルムの特性を要約したものである。ここに示されているように、本発明のコロイドシリカフイルムは、シラノールの含有量が多く、ＰＳに対する付着性が良好であった。コロイドシリカフイルムは、低コスト、使用しやすいこと、均質性、高表面積および湿潤性を含む他の望ましい特徴を有している。また、そのような分散体は、表１に示したものに加えて、様々な異なる表面化学的性質および粒径を有するものとして得られる。実施例３コロイドシリカフイルム上の細胞培養Ｉ．材料および方法Ａ．一般原理２種類のよく特徴付けられた細胞培養系、すなわち、上皮細胞系統（ＭＤＣＫ）、および一次腎臓上皮（近位細管外殖体）標品を用いて、本発明のコロイドシリカフイルムを評価した。Taub,M.等の「Growth of Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cell (MDCK) Line in Hormone-Supplemented，Serum-Free Medium 」，Proc．Natl．Acad．Sci.，Vol.76，No.7，3338-3342頁，1979；およびJung, J.C., S.Lee，N.KadakiaおよびM.Taubの「Growth of Primary Rabbit Proximal Tubule Cells in Glucose-Free Serum-Free Medium」，J．of Cell．Phys.，Vol .150, 243-250頁，1992を参照のこと。ＭＤＣＫ細胞に関して、血清を補った培地および血清を含まずホルモンを補った培地の両方においてデータを得た；一次細胞に関しては、血清を含まない培養のデータのみを得た。一般的に、実験は、三重に行った。新しい表面に対する細胞の特異的反応は、予測するのが困難であるので、細胞培養は、細胞の付着、伸展、増殖速度、分化、および継代性を含むいくつかの細胞反応を測定するように設計した。分化機能の発現は、刷子縁酵素アルカリホスファターゼの活性により測定した。継代性は、トリプシン化による継代培養における成功として定義した。位相差顕微鏡並びにＳＥＭおよびＴＥＭの特徴付けによる細胞形態を求めた。以下に示す結果において、本発明により調製した皿を「ＨＳ皿」（「ＨＳ表面」）と称する。対照皿は、「ＰＳ皿」（「ＰＳ表面」）と称される、従来の滅菌され、コロナ処理された、ポリスチレン組織培養皿であった。Ｂ．血消を含むＭＤＣＫ細胞ＭＤＣＫ細胞を、10％のＦＣＳを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含有する35ｍｍ皿中に５×10³細胞／皿で平板培養した。細胞を、４日間に亘り５％のＣＯ₂／ 95％の空気で加湿された環境内において37℃で保温した。次いで、細胞をＥＤＴＡトリプシンにより皿から除去して、コルターカウンターで計測した。以下に報告する値は、三重測定の平均（±標準偏差）である。Ｃ．血清を含まないＭＤＣＫ細胞ＭＤＣＫ細胞を、５μｇ／ｍｌのインシュリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５×10⁸Ｍのハイドロコルチゾン、５×10^-12ＭのＴ₃および25ｎｇ／ｍｌのＰＧＥ₁を補った血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含有する35ｍｍの培養皿中に皿当たり10⁴細胞で平板培養した。細胞を、毎日各々の条件において二重の皿において計測した。増殖速度を、培養におけるｌｏｇ₂細胞数対日数のプロットから測定した。Ｄ．ＭＤＣＫ継代培養ＭＤＣＫ細胞を、血清を含まない培地Ｋ−１中で密集するまで増殖させた。血消を含まない培地Ｋ−１は、５種類の成分（５μｇ／ｍｌのインシュリン、５μ ｇ／ｍｌのトランスフェリン、５×10-¹²のＴ₃、５×10⁸Ｍのハイドロコルチゾン、25ｎｇ／ｍｌのＰＧＥ₁）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含有していた。続いて、細胞を、血清を含まない培地Ｋ−１、または10％のウシ胎児血清を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２のいずれかと共に、35ｍｍ皿中に10⁴細胞／皿で平板培養した。37℃で５％のＣＯ₂／95％の空気の雰囲気内において３日後に細胞を計測した。以下に報告する値は、三重測定の平均（±標準偏差）である。培地を平板増殖後およびその後の規定どおりの日に培地を変えた場合、血清を含まない培地Ｋ−１内においてＨＳおよびＰＳ表面上で、密集するまで増殖が行われた。細胞が密集した後、培地Ｋ−１または10％のウシ胎児血清を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２のいずれか有する培養皿中に細胞を継代培養（10⁴細胞／35ｍｍ皿）した。この研究の結果は、継代培養後に、細胞は、血清を含まない培地Ｋ−１または10％のウシ胎児血清を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２の両方において、両面に増殖できたことを示している。特定の操作理論に結びつけることを意図するものではないが、血清を含まない培地Ｋ−１中のＨＳ下層により得られた増殖は、この実験において行われた規定どおりの培地の交換に帰するかもしれない。Ｅ．血清を含まない一次腎臓培養ウサギ腎臓近位細管細胞の一次培養物を、５μｇ／ｍｌのインシュリン、５μ ｇ／ｍｌのトランスフェリン、および５×10⁸Ｍのハイドロコルチゾンを補った血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中で増殖させた。培養物を、規定どおりに培地を交換しながら、20日間に亘り37℃、５％のＣＯ₂／95％の空気の加湿雰囲気中に維持した。次いで、コルターカウンターを用いて、培養皿中の細胞の数を測定した。以下に報告する値は、三重測定の平均（±標準偏差）である。ポリスチレン上で高増殖速度に導かれる濃度および著しく低い濃度（通常の平板増殖濃度の1/6）で皿に平板増殖された管状材料について実験を行った。両方の密度で、ＨＳおよびＰＳ表面の両方で、増殖が行われた。上述した血清を含まない培地中での増殖は、繊維芽細胞の過剰増殖なしに生じた。ＨＳおよびＰＳ表面での増殖もまた、グルコースを含まない培地中で観察され、典型的に、腎近位細管のグルコース新生能力を示した。Ｆ．一次培養物のアルカリホスファターゼ活性一次ウサギ腎臓近位細管細胞が、生体内環境において観察されたような生体外偏光動力学を示す。これらの細胞は、微じゅう毛を有する頂表面（すなわち、刷子縁）、および刷子縁酵素を保持する。特定の刷子縁酵素、アルカリホスファターゼのレベルを、ＨＳおよびＰＳ表面に維持された一次培養物内で実験した。特に、一次培養物は、５μｇ／ｍｌのインシュリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、および５×10⁸Ｍのハイドロコルチゾンを補った血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で密集するまで増殖させた。次いで、培養物を、Taub,M.，L aurie,G.W.，Martin,G.R.,およびKleinman,H.K.の「Altered Basement Membrane Protein Biosynthesis by Primary Cultures of CPK/CPK Mouse Kidney」，Kid ney International ， Vol.37，1990，1090-1097頁に記載されているように、アルカリホスファターゼアッセイに用いた。アルカリホスファターゼ活性を、ｐ−ニトロフェノールホスフェーテッドからのｐ−ニトロフェノールの放出速度により測定した。値は三重測定の平均である。Ｇ．血清を含まない一次腎臓継代増殖細胞を特定の下層（例えば、ＨＳ）から同一の下層（例えば、ＨＳ）まで継代した。１：３の継代比で継代した場合、ＨＳおよびＰＳ上の一次継代細胞は、最初に同様に増殖するように見えた。２週間後、ＨＳ上の一次継代細胞は、多くの大きい多細胞ドームを形成した密集単層を形成することが観察された。このことは、上皮溶質移送の能力を示している。以前、ドームは典型的に、一次継代培養においては観察されなかったが、それらの外観が、通常のプラスチック上の一次培養の密集単層内で観察された。ウサギ腎臓近位細管細胞もまた、低継代比（１：２０）で継代した。細胞はまたこの継代比で生存した。ＰＳ上の細胞は、老化（非常に拡大した形態学により示されるように）し始めたが、ＨＳ上の細胞は、通常の上皮形態学を維持した。Ｈ．ウサギ腎臓近位細管の付着一次細胞腎臓近位細管細胞を、ＨＳ皿およびＰＳ皿上に精製ネフロンセグメントを平板増殖させることにより開始した。次の日に、20の顕微鏡領域に付着させた細管の数を、倒立顕微鏡により100倍で測定した。顕微鏡領域当たりに付着した細管の数は、各々の条件に関して、３つの皿について行った測定からの平均である。１１．結果Ａ．血清を含むＭＤＣＫ細胞血清を含むＭＤＣＫ細胞をＨＳ皿およびＰＳ皿の両方の上に付着させ、伸展させて、再生した。ＨＳ皿当たりの平均細胞数は、４日後にＰＳ対照皿における細胞数の70％であった（ＨＳの53,860±3,400対ＰＳの77,060±11,200）。位相差による細胞形態学は、立方体様または玉石状であり、ＨＳ皿および対照皿における細胞に関して同様であった。図３を参照のこと。培地が比較的より酸性であったので、ＨＳ皿上のＭＤＣＫ単層は、ＰＳ細胞（白い矢印）よりも密集後のより多い増殖を示し、ＰＳ上よりも明らかに代謝活性が大きかった。細胞単層を能動的に移送することを示す、「ドーミング」、または半球水疱形成と呼ばれる現象が、対照ＰＳ皿およびＨＳ皿の両方に見られた。ドームは、皿からやや高くなっており、図３（黒い矢印）におけるようなＰＳ皿およびＨＳ皿上の隆起円形領域として見える細胞単層の多細胞区域である。ドーミングを生じさせるために、３つの細胞条件が必要である：機能的形質膜偏光、閉鎖結合（例えば、タイト結合）の形成、およびベクトラル上皮活性イオン移送。Lever,J.E.の「lnducers of Dome Formation in Epithelial Cell Cult ures Including Agents That Cause Differentiation」，Chap.1 in Tissue Cul ture of Epithelial Cells ，Ed．M.Taub，Plenum Press，NY，1985を参照のこと。ドーミングは、基底外側の流体蓄積が妨げられるので、コラーゲン被覆メッシュまたはニトロセルロースフィルタのような多孔性支持体上では生じない。Cere ijido,M.等の「Polarized Monolayers Formed by Epithelial Cells on Permeab le and Translucent Support」，J ．of Cell Biology，Vol.77，853-880頁，197 8を参照のこと。明らかに、ＨＳ表面は、ＰＳのようにドーミングに必要とされる細胞条件を誘発し、湿って、ドーム形成を妨げる「漏れ」られるときに十分な多孔度を提供しない。Ｂ．血清を含まないＭＤＣＫ細胞血清を含まないＭＤＣＫは、ＰＳ皿と、ＨＳ皿とでは非常に異なって反応した。ＨＳ上では、細胞は形態学において上皮のように見えた。ＰＳ上では、細胞は上皮のように見えたが、ＨＳ上よりも伸展していた。ＰＳ上の細胞を付着させ、伸展させ、増殖させた（おそらく、培養には血清を含まなかったので、細胞膜結合リガンドによる）。ＨＳ皿上の細胞は、付着したが、伸展も増殖もしなかった。図４参照。ＨＳ上の増殖速度は、ＰＳ対照皿に関する1.8と比較して、0.06倍加／日と不十分であった。ＰＳ皿に関しては、密集は、７日の培養期間内に達成されたが、ＨＳ皿に関しては、この期間内には密集は達成されなかった。伸展していない細胞中において有糸分裂が欠如していることは、培養における既知の関連細胞の伸展および増殖であることを考慮すると、驚くべきことではない。細胞分裂の頻度が、細胞伸展における実験的に制御された増加とともに増加することが観察されている。現在の理論は、より良好に伸展した細胞は、より多くの増殖因子を捕獲し、表面積が大きいために多量の栄養素を取り込むことができるというものである。Alberts,B.等のMolecular Biology of the Cell，3rd E d.，Garland Publishing Inc.，NY，969頁，1994を参照のこと。細胞がＰＳ上に付着して伸展したので、付着促進リガンドの欠如することが、それら細胞がＨＳ表面上に伸展しなかったことの説明にはならない。特定の操作の理論に結びつけることを意図するものではないが、コロイドシリカ基体対ポリスチレン基体への付着促進リガンドの付着の差である可能性がある。このことにより、接着域および細胞伸展が発達することができなかった。他の水和「ゲル」は、同様に伸展細胞の伸展を阻害する（例えば、マサチューセッツ州、ベッドフォードのコラボレイティブバイオメディカルプロダクツにより製造されているMA TRIGEL）。毎日の培地の交換が、平板増殖から24時間後に開始された場合、ＭＤＣＫ細胞は、ＨＳ皿上の血清を含まない培養において伸展し、密集するまで再生した。この結果は、付着阻害因子の除去または新しい付着因子の添加のいずれかが、ＨＳ上の血清を含まないＭＤＣＫ伸展に必要であったことを示唆している。しかしながら、後者の可能性は、培地が血清を含まないので、ありそうもないと思われる。いくつかのプールＭＤＣＫのＨＳ皿からの使用された培地の化学分析により、約100ｐｐｍのＳｉＯ₂がＨＳ表面から培地中に溶解した（おそらくＳｉ（ＯＨ）₄ として）ことが示された。ここでも、特定の操作理論に結びつけることを意図するものではないが、可溶性シリカが伸展阻害剤として作用した可能性もある。血清を含まない細胞培養物は典型的に、おそらく、血清成分が培地中の阻害因子を不活化するので、血清含有培養物よりも阻害因子に対する感度が大きい。ＨＳ皿上の血清を有するＭＤＣＫ培養物の場合には、血清成分は、コロイドシリカ上に吸着され、続いてのシリカの溶解を減少または除去して、可溶性シリカの作用を最小にする。Ｃ．ＭＤＣＫ継代培養血清含有培地中においてＨＳおよびＰＳ上で密集するまで増殖したＭＤＣＫ細胞は、同一種類の表面に容易に継代培養することができる。継代培養は、細胞が高い比率で（例えば、１：２）分割された場合だけではなく、ずっと低い継代増殖比（１：10、１：20、１：50）でも成功した。細胞は、密集するまで増殖した。上述したように、培地は比較的酸性が強かったので、ＨＳ皿上の密集ＭＤＣＫ単層は、著しい細胞増殖を示し、ＰＳ皿上の細胞よりも代謝的により活性であるように見えた。ＭＤＣＫ細胞を、ＨＳ皿およびＰＳ皿上で血清を含まずに密集するまで増殖させ、次いで、酵素により放出させ、洗浄し、血清を含む場合と含まない場合の両方で、同一腫の新しい皿上に平板増殖させた。血清を含まないＰＳ皿上に平板増殖された血清を含まないＰＳ皿を、100％の細胞数で陽性の対照として用いた。ＰＳ皿上で、血清を含む継代培養物および血清を含まない継代培養物は、３日後に106％±3％および100％±13％の同等の比率で増殖した。血清を含んだＨＳ継代培養物は、対照細胞数の118％±33％まで増殖し、細胞の伸展の阻害を示し、増殖は、血清を含まないＨＳ表面に曝した後では、「転移された」状態ではなかった。血清を含まないＨＳ継代培養物は、伸展を維持し、対照細胞数の３％± ０％で増殖が阻害された。ここでも、特定の操作理論に結びつけることを意図するものではないが、これらの実験は、細胞内作用ではなくむしろ細胞外作用が、血清を含まないＨＳ培養に見られる伸展阻害の原因のようであることを示している。Ｄ．細胞を含まない一次腎臓培養ＨＳ対ＰＳ上の一次外殖体の培養に関して、いくつかの特異的な利点を確認した。ＰＳ表面上で増殖するように適用された一次細胞および細胞系統にはよくあることであるが、腎臓の一次性が、ＭＤＣＫ細胞系統とは異なった挙動を示した。第一に、腎臓細管外殖体（ネフロンセグメント）の付着は、ＰＳよりもＨＳのほうが良好であった。このことは、ＰＳ対照表面への乏しい付着が観察された点で、組織標品が最適以下である実験において最も明白であった。これらの条件下で、ＰＳ皿と比較して、ＨＳ皿上に、顕微鏡領域当たり10倍の細管セグメントが付着した（ＨＳに関して16±5細管セグメント／顕微鏡領域対ＰＳに関して1.6± 1.4細管セグメント／顕微鏡領域）。付着により貢献する条件下では、ＨＳ皿は、ＰＳ皿よりも高い付着レベルを達成し続けた（ＨＳに関して10.7±1.0細管セグメント／顕微鏡領域対ＰＳに関して4.6±1.0細管セグメント／顕微鏡領域）。組織の付着機構は、個々の細胞の付着ほどには明確には定義されていない（すなわち、インテグリン受容体およびリガンドは明確には定義されていない）。ここでも、特定の操作理論に結びつけることを意図していないが、ＨＳ皿の場合には、付着は、コラーゲンに関して負に帯電したシリカゲルの親和性によるものであろう。図５は、培養における外殖体からの細胞の外殖を示している。ＨＳ皿上のこの段階の細胞は、ＰＳ皿上の細胞よりも著しくより多い細胞内小胞を有していた。これらの小胞は、位相差顕微鏡により白であり、それらの意味は知られていない。第二に、腎臓細胞は、ＰＳ上よりも、ＨＳ皿上のほうがより速く外殖体から再生する。ある培養セットは、ＰＳのものよりも約3.5倍の10日目のＨＳ上での細胞平均数／皿を有した。細胞を別の実験において20日目に計測し、ＰＳ皿と比較して、ＨＳ皿上に約1.6倍の細胞が見られた（ＨＳに関する、83,360±14,311細胞／皿対ＰＳに関する51,563±17,715細胞／皿）。ＨＳ皿上の密集一次培養物は、同等のＰＳ培養物の約2.8倍のアルカリホスファターゼ活性を示した（ＨＳに関する、22.6±5.4ナノモルｐ−ニトロフェノール／ｍｇタンパク質／分対ＰＳに関する、8.2±1.7ナノモルｐ−ニトロフェノール／ｍｇタンパク質／分）。続いての実験において、この差は不定であるが、全ての場合において、アルカリホスファターゼ活性に関して、ＨＳ表面が、ＰＳ表面と同程度あるか、またはそれより良好であることが分かった。一次培養におけるコロイドシリカフイルムの第三の、そして、おそらく最も重要な利点が、継代培養において見られた。細胞を、ＰＳ皿と同様にＨＳ皿から容易に酵素処理により表面から除去し、同一の基体上で継代培養した。細胞は、特にＨＳ表面上で増殖した場合に、上皮形態学を維持した。ＨＳ皿上で継代培養された細胞を、対照皿よりもゆっくりとトリプシン化から回収したが、細胞は段々と、密集するまで増殖し、より特異的な形態学を維持した。ＰＳ上の継代培養における細胞の個体群は、より大きい程度まで老化し、密集の際に、個々の細胞が大きくなり、ドーミングが欠如した。ＨＳ皿上で継代培養した細胞は、立方体様形態学を維持し、より大きいドームを形成した。特定の操作に結びつけることを意図するものではないが、一次細胞は、より多くの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分を生長させ、外殖体組織の付着後にいくつかのＥＣＭを作成する「機会の窓」を明らかに有し、付着および伸展のために基体の「条件を整える」ので、一次培養は、ＭＤＣＫ細胞（血清を含まない）よりもコロイドシリカフイルム上でよりうまくいったかもしれない。さらに、可溶性シリカと培養における細胞との間には、細胞付着促進リガンドに関して競合が存在するかもしれない。これは、可溶性シリカの頻繁な除去により、血清を含まないＭＤＣＫ培養物における伸展が促進されることの理由となり得る。一次腎臓細胞は、可溶性シリカによる損失を克服するのに十分な量のリガンドを生成するかもしれない。特定の操作の理論に結びつけることを意図するものではないが、以上の細胞培養結果の洞察は、ケイ素含有材料の生体内挙動の考察から得られると考えられる。特に、シリカゲルおよびＥＣＭ成分の「自然の」親和性の証拠が文献に見られる。ケイ酸塩インプラント内に見られる組織結合現象の機構が、Larry Hench等により探求されている。Hench,L.L.およびJ.Wilsonの「Bioceramics」，MRS Bull. Vol.16，No.9，1991，62-74頁；Henchの「Bonding of Bone to Material，Prese nting a High Specific Area，Porous，Silica-Rich Surface」と題する米国特許第4,171,544号；Ohura,K.等の「Bone-bonding Ability of P205-Free Cao-Sio 2 Glasses」，J ．of Biomed．Mats．Res.，Vol.25，1991，357-365頁；およびLi ,P.等の「Process of Formation of Bone-like Apatite Layer on Silica Gel」，J. of Mats ．Sci.: Mats．in Med.，Vol.4，1993，127-131頁を参照のこと。組織結合の主要な表面成分が、インプラント−組織界面でのシラノール基であると報告されている。シラノール表面が、生体内と生体外での細胞の付着および増殖を可能にするＥＣＭ成分の付着を支持することが示されている。シラノールが豊富な表面もまた、骨のインプラントを囲み、しっかりと付着する新しい骨となるハイドロキシアパタイト［Ｃａ₅（ＰＯ₄）₄（ＯＨ）］の結晶の核形成を行えると考えられている。Henchは、「高表面積で多孔性のシリカが豊富な表面」の重要性を認識しており、彼の米国特許第4,171,544号において、多孔性ＶＹＣＯＲおよびポートランドセメントを例示している。 BIOGLASSインプラント（フロリダ州、アレイチュア、ユーエスバイオマテリアルス）は、生体内に中間体シリカゲル／リン酸カルシウム／ＥＣＭ「ｓｅａｍ」を形成することにより、骨および軟部組織と結合する。これらのガラスの軟部組織および硬部組織と結合する能力は、移植後数分以内に生じる浸食工程に依存しており、これらの浸食および無機質化の現象が広範囲に詳述されている。コラーゲン並びにグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が、生体外における浸食BIOGLASS表面中に取り込まれることが分かった。Hench,L.L.の「Bioceramics」，MRS Bulle tin ，Vol.16，No.9，62-74頁，1991を参照のこと。ゾルゲル由来の多孔性シリカ基体が、日本の京都大学でコクドタダシにより生物活性であることが分かった。生物材料の分野においてコクド等は、「生物活性」への鍵は、インプラント表面にあるシラノール基の量およびヒドロキシル化の速度であることを発見した。Ohura,K.等の「Bone-bonding Ability of P205-Fre e Cao-Sio2 Glasses」，J ．of Biomed．Mats．Res.，Vol.25，1991，357-365頁；Li,P.等の「Process of Formation of Bone-like Apatite Layer on Silica G el」，J．of Mats．Sci.: Mats．in Med.，Vol.4，1993，127-131頁；およびLi, P.，I.Kangasneimi，K.deGroot，T.Kokubo,およびA.U.Yli-Urpoの「Apatite Cry stallization from Metastable Calcium Phosphate Solution on Sol-Gel-Prepa red Silica」，J ．of Non-Crystalline Solids，Vol.168，1994，281-286頁。結合組織の形成における本態性微量元素としてのケイ素の役割が、動物の栄養研究により測定され、BirchallおよびCarlisleにより示された。Birchallおよび Chappel,前出；およびCarlisle,E.M.の「Silicon as an Essential Trace Eleme nt in Animal Nutrition」，in Silicon Biochemistry，eds．D.EveredおよびM. O'Connor，John Wiley & Sons Ltd，Sussex，UK，1986を参照のこと。ヒトさい帯組織から精製されたＧＡＧおよびポリウロナイド中のケイ素の結合形態をSchwartzが発見したことにより、ケイ素の分子生物学が観察された。Schw artz,K.の「A Bound Form of Silicon in Glycosaminoglycans and Polyuronide S」，Proc ．Nat．Acad．Sci.，USA，Vol.70，No.5，1608-1612頁，1973を参照のこと。ケイ素の結合は、シラノレート（Ｓｉ−Ｏ−Ｃ）結合による共有であり、このようにして、結合組織内で架橋剤として機能すると考えられた。そのような結合が、本発明のコロイドシリカフイルムをコロナ処理したＰＳ皿に保持するのに含まれているかもしれない。 Barnes等は、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびヒト血清からの他の付着促進リガンドを分離するのにアフィニティークロマトグラフィーカラム中にガラスビーズを使用することを報告した。Barnes,D.等の「Glass-Beads AffinityC hromatography of Cell Attachment and Spreading-Promoting Factors in Huma n Serum」，Anal．Biochem.，Vol.137，196-204頁，1984を参照のこと。ガラスビーズは、濃縮酸中に一晩浸漬し、蒸留水により洗浄し、炭酸ナトリウムによりｐＨ８に調節することにより調製した。ｐＨ８で、血清から付着促進リガンドを枯渇させ、ｐＨ９に調節した後に、カラムからリガンドを溶離させる。十分に大きい比率のガラスビーズ表面積対血清容積が要求された。分離するためには、クロマトグラフィーの前および最中にアルカリ雰囲気を維持することが要求された。Barnes等は、「血清ＳＦ、フィブロネクチン、およびラミニンの全てが、ガラスビーズへの結合およびそれからの溶離に関して同様の特性を示し、この特性が、ある様式で、これら３種類の細胞の付着および伸展促進糖タンパク質の生物学的活性に関連するかもしれないことを示唆していることは興味深い」と述べている。 Barnes等はまた、他の血清タンパク質（例えば、増殖因子）は、この処理により枯渇されたのかもしれないと述べている。リガンドをクロマトグラフィー枯渇血清に戻すことにより、細胞伸展阻害剤を導入するクロマトグラフィーの可能性を試験し、細胞への阻害効果がないことが分かった。Barnes等は、それらのガラスの表面化学的性質を測定しなかったが、それらの方法は、反応性が高く、浸出したシリカゲル表面層が形成されたことを示唆している。ｐＨを９まで上昇させることにより、下にあるシリカが溶解することによってリガンドを放出したのかもしれない。ガラス上の細胞増殖に関する代謝速度が上昇することが以前に報告されている。 Warren等は、プラスチックフラスコと比較して、ガラス（ブレーキボトル）上で増殖した腎臓細胞系統（ＢＨＫ）により放射線標識グルコサミンの吸収が３から４倍に増大したことを報告した。Warren,L.，D.L.BlitheおよびG.Cossuの「Vari ation in the Carbohydrates of Glycoproteins of Cells Growing on Differen t Surfaces」，J ．of Cell．Phvs.，Vol.113，17-22頁，1982を参照のこと。War ren等はまた、これらの基体上で増殖する細胞の糖タンパク質の炭水化物における変異（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）を例証した。実施例４比較例コロナ処理したＰＳ皿をPA04およびLUDOX HS-40コロイドシリカの混合物で被覆した（以後「ＰＡ皿」（「ＰＡ表面」）と称する）。PA04は、ＰＳに光結合可能な、ＢＳＩコーポレーション（ミネソタ州、プレイリー、エデン）により作成されたポリアクリルアミドゲル材料である。ガンマ滅菌の前に放射したＵＶおよびポアオンポアオフ技術を用いて、皿を湿潤被覆した。これらのコーティングは、透明であったが不均質であった。ミクロンサイズのシリカ粒子がコーティングの表面に見られた。これらの粒子はＣＶＬ染料により青色に染まったが、全体的なコーティングは染まらなかった。このことは、コーティング中のシラノールの分散度が低いことを示している。ＳＥＭ顕微鏡写真およびＥＤＡＸ分析は、ＣＶＬ観察を支持した。このコーティングの特徴の概要が表１に示されている。実施例３の方法にしたがって、ＭＤＣＫ細胞および一次細胞の培養実験をＰＡ皿に関して行った。これらの実験は、ＭＤＣＫ細胞に関して、ＰＡ表面がＰＳ表面とＨＳ表面との間の中間体であることを示した（血清を含むＭＤＣＫ細胞−− ＨＳに関する35ｍｍ皿当たり53,860±3,400対ＰＳに関する77,060±11,200対ＰＡに関する58,860±4020；血清を含まないＭＤＣＫ細胞−−ＨＳに関する0.06倍加／日対ＰＳに関する1.8対ＰＡに関する1.0；血清を含むおよび含まない継代培養−−ＨＳに関する118％±33％および対照の３％±０％対ＰＳに関する106％± ３％および100％±13％対ＰＡに関する115％±11％および９％±０％対照）。一次細胞に関して、ＰＡ表面では、ＰＳ表面またはＨＳ表面のいずれかよりも少なく増殖が行われた（ＨＳに関する83,360±14,311細胞／皿対ＰＳに関する51,563 ± 17,715対ＰＡに関する31,360±220）。このデータは、血清を含まない培地における一次細胞の増殖に関して、フイルム全体に亘りＳｉ−ＯＨ基を有することの重要性を示している。上述したように、均一に分布したシリカにもかかわらず、ＰＡフイルムのみが局所的にシリカ粒子を有した。これらの粒子は、ＨＳフイルムにより達成された向上した一次細胞増殖を行うのに十分なシラノール基を提供しなかった。本発明の好ましい並びに他の実施の形態をここに記載したが、以下の請求の範囲により定義されるように、本発明の範囲から逸脱せずに、当業者にはさらなる実施の形態が理解されよう。

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも一部がコロイドシリカフイルムにより被覆された基体からなる、培養において細胞を増殖させる装置。２．前記基体が湿潤性表面を有することを特徴とする請求の範囲１記載の装置。３．前記基体が高分子材料からなることを特徴とする請求の範囲１記載の装置。４．前記コロイドシリカフイルムが多孔性であることを特徴とする請求の範囲１記載の装置。５．前記コロイドシリカフイルムが反応性Ｓｉ−ＯＨ基を含有することを特徴とする請求の範囲１記載の装置。６．前記コロイドシリカフイルムが培養培地中に部分的に可溶性であることを特徴とする請求の範囲１記載の装置。７．前記コロイドシリカフイルムが、約100ナノメートル未満の厚さを有することを特徴とする請求の範囲１記載の装置。８．前記コロイドシリカフイルムが、血清を含まない培地中の一次細胞の増殖に役立つことを特徴とする請求の範囲１記載の装置。９．前記非被覆基体が、血清を含まない培地中における一次細胞の増殖を支持し、前記コロイドシリカフイルムが、同等の条件下の該非被覆基体上で行われた増殖と比較して、前記培地中の細胞の増殖を向上させることを特徴とする請求の範囲８記載の装置。 10．培養培地および増殖させるべき細胞を請求の範囲１記載の装置のコロイドシリカフイルムに施す工程からなることを特徴とする細胞を増殖させる方法。 11．前記細胞が一次細胞であることを特徴とする請求の範囲10記載の方法。 12．前記培養培地が血清を含まないことを特徴とする請求の範囲11記載の方法。 13．細胞培養を行う装置を製造する方法であって、 (a) 基体を提供し、 (b) 該基体の少なくとも一部にコロイドシリカの水性分散体を施し、 (c) 該基体の一部上の該水性分散体の少なくとも一部を乾燥させてフイルムを形成させる各工程からなり、該フイルムが、培養において細胞を増殖させるための付着表面として機能することを特徴とする方法。 14．前記基体が湿潤性表面を有することを特徴とする請求の範囲13記載の方法。 15．前記基体が高分子材料からなることを特徴とする請求の範囲13記載の方法。 16．前記フイルムが多孔性であることを特徴とする請求の範囲13記載の方法。 17．前記フイルムが反応性Ｓｉ−ＯＨ基を含有することを特徴とする請求の範囲 13記載の方法。 18．前記フイルムが培養培地中に部分的に可溶性であることを特徴とする請求の範囲13記載の方法。 19．前記フイルムが、約100ナノメートル未満の厚さを有することを特徴とする請求の範囲13記載の方法。 20．前記フイルムが、血清を含まない培地中における一次細胞の増殖に貢献することを特徴とする請求の範囲13記載の方法。 21．前記非被覆基体が、血清を含まない培地における一次細胞の増殖を支持し、前記フイルムが、同等の条件下の該非被覆基体上で行われた増殖と比較して、前記培地中の細胞の増殖を向上させることを特徴とする請求の範囲20記載の方法。 22．前記水性分散体中のシリカの濃度が約５重量パーセント未満であることを特徴とする請求の範囲13記載の方法。