CN116745403A - 细胞球体的生产方法及工具 - Google Patents

细胞球体的生产方法及工具 Download PDF

Info

Publication number
CN116745403A
CN116745403A CN202280010598.5A CN202280010598A CN116745403A CN 116745403 A CN116745403 A CN 116745403A CN 202280010598 A CN202280010598 A CN 202280010598A CN 116745403 A CN116745403 A CN 116745403A
Authority
CN
China
Prior art keywords
spheres
cell
cells
matrix material
matrix
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280010598.5A
Other languages
English (en)
Inventor
萨纳埃·克尔-阿拉纳
奥利维耶·普雷纳-索弗
卡尔－海因茨·克劳泽
斯特凡纳·迪吕阿尔
阿里·莫达雷西
托马斯·布拉斯什拉尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Geneve
Hopitaux Universitaires De Geneve
Original Assignee
Universite de Geneve
Hopitaux Universitaires De Geneve
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Geneve, Hopitaux Universitaires De Geneve filed Critical Universite de Geneve
Publication of CN116745403A publication Critical patent/CN116745403A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/12—Specific details about manufacturing devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
    • B01L2300/163—Biocompatibility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/74—Alginate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/76—Agarose, agar-agar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/78—Cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/80—Hyaluronan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
    • C12N2535/10—Patterned coating

Abstract

本发明涉及用于形成细胞球体/类器官的基体材料及其用途。本发明还涉及这种基体材料的制备方法及其相关工具用途、使用这种基体材料形成细胞球体的方法、所得球体及其用途。

Description

细胞球体的生产方法及工具
技术领域
本发明涉及用于形成细胞球体的基体材料及其用途。本发明进一步涉及这些球体的制备方法及其用途。
背景技术
细胞球体迅速受到欢迎，因为它们能够模拟自然的细胞间和细胞与基质的相互作用，使细胞功能更接近体内情况，并建立也复制原始组织的营养和氧气梯度。显示出设计细胞球体的可能性的方法，包括点滴法(Li等，2016，Urology，97:277)、自身或强制聚集法(Rettinger等，2018，Stem Cells.Methods Mol Biol.，1773:21-30)、微重力生物反应器(Zhang等，2015，Biomaterials，41:15-25)、磁悬浮(Daquinag等，2013，Tissue Eng Part CMethods，19(5):336-344)、支架或颗粒中的包封(Feng等，2017，Sci Rep.2017；7(1):1548；Furuhata等，2016，Genes Cells.，21(12):1380-1386；Gorkun等，2018，Biomed Mater.，13(4)：044108；Jeon等，2016，J Mater Chem B.，4(20)：3526-3533；Kim等，2019，Biomaterials，188:198-212；Kim等，2018，Int J Biol Macromol.，110:472-478；Mineda等，2015，Stem Cells Transl Med.，4(12)：1511-1522)。存在一个明确的共识，即与在塑料上生长的二维(2D)单层相比，细胞球体的产生增加了它们与体内情况的相似性。从生物技术的角度来看，许多药物筛选、毒性测定和疾病建模都使用细胞球体或类器官。从细胞治疗的角度来看，球体更具吸引力，原因如下：
-简化了细胞培养，降低了成本，减少了细胞传代和相关的质量控制。这些简化在良好医疗实践(GMP)环境中尤其重要；
-与单层相比，球体降低了细胞培养基的体积以及相关成本；
-据报道，细胞球体在移植后显示出更好的体内存活(Bhang等，2012，Tissue EngPart A.，18(19-20):2138-2147)和对氧化环境的更高抗性(Zhang等，2012，Stem CellsDev.，21(6):937-947)。
-在再生细胞治疗的情况下，间充质干细胞(MSC)的球体相比在单细胞悬浮液中的MSC产生更好的愈合分泌组。
来自脂肪组织的MSC，即脂肪来源的干细胞(ASC)，对于再生细胞治疗特别有吸引力。它们的易获得性和在培养基中的扩张，与强大的再生、免疫调节和抗纤维化分泌组相关联(Lombardi等，2019，Int J Mol Sci.，20(15))，使ASC成为再生医学最有前途的候选者之一(Si等，2019年，Biomed Pharmacother.，114:108765)。主要关注炎症和/或退行性疾病，目前用ASC注册了300多项临床试验(ClinicalTrials.gov)。与体外2D悬浮液中的单细胞相比，MSC形成的球体具有升高的再生特性(Di Stefano等，2018，J Cell Physiol.，233(11)：8778-8789；Gwon等，2017，Acta Biomater.，49:284-295；Kapur等，2012，Biofabrication.，4(2)：025004；Kim等，2018，Tissue Cell.，53:93-103)。在体内，通过使用肾变性(Xu等，2016，J Cell Mol Med.，20(7):1203-1213)、肝纤维化(Zhang等，2016，Stem Cells Int.，2016:4626073)或衰竭(Zhang等，2015，同上)、尿路变性(Li等，2016，同上)、伤口(Feng等，2017，同上；Mineda等，2015，同上；Cheong等，1990，Singapore Med J.，31(4):350-354)和肺部疾病(Cho等，2017，BMB Rep.，50(2):79-84)的模型，MSC球体在缺血条件下表现出更好的存活和对氧化应激诱导的细胞凋亡的更高抗性(Zhang等，2012，同上)。
肿瘤病也在体外用球体和类器官进行集中建模，以帮助发现新的靶点和治疗(Zanoni等，2020，Journal of Hematology&Oncology，13:97https://doi.org/10.1186/s13045-020-00931-0)。此外，球体和类器官是毒理学筛选测定非常感兴趣的(Augustyniak等，2019，Appl Toxicol.，39(12):1610-1622)。
细胞球体的使用需要均匀的形状、大小和细胞数量，无论是在筛选测定、毒理学测定、肿瘤建模还是在细胞治疗产品的制造中。尽管细胞球体具有公认的优势，但许多技术限制仍然强烈限制了其在筛选测定和细胞治疗中的应用。悬滴法是一种繁重的手动程序，与涉及试验所需细胞数量的标准化和良好的制造条件不兼容。低附着板中的自发聚集正在发挥作用，但会产生球体尺寸的不受控制的分布，混合具有高度不均匀性的小聚集体和大聚集体。这种现象是由于球体本身之间以及球体和塑料之间的频繁粘附，大大降低了其生产的标准化。为了防止粘附在塑料上，浸泡中的搅拌方法不足以解决这个问题，有助于聚集成更大的聚集体和球体变化。由于制剂的标准化和纯度似乎是球体对于所有应用的主要限制，因此开发了封装方法，并提供了大规模和尺寸可控的生产(Jeon等人，2016，同上；Kim等，2019；Lee等，2018，Biomaterials，165:105-120)。然而，如果基于支架的细胞治疗方法显著地为细胞治疗应用提供了有吸引力的支持，那么它也会引起导致炎症和毒性的异物反应，并且由于降解非常缓慢，有时还会干扰固有组织的再生。许多制造商现在提供即时可用的微孔用于强制聚集，目的是以低成本和最短时间生成大量均匀的球体，这可能是目前最好的选择。但这种方法对MSC的主要限制是与细胞间聚集同时开始的MSC与微孔的快速粘附，这是由于MSC与塑料的高亲和力。基于这一主要限制，已经开发并商业化了用琼脂糖(Napolitano等，2007，Tissue Eng.，13(8):2087-2004)或聚乙二醇水凝胶(Cha等，2018，Sci Rep.，8(1):1171)制成的非粘附微孔。这种方法的不便之处在于微孔浸没在介质中：介质的变化会破坏每个微孔底部的球体的稳定性，而这些静态条件会减少球体中的氧气扩散。在这些静态条件下，形成坏死核心(Alvarez Perez等，2005，MAGMA，18(6):293-301；Groebe等，1996，Int J Radiat Oncol Biol Phys.，34(2):395-401)。相反，浸没聚集体的动态培养(在搅拌下)较少报告坏死核心(Alimperti等，2014，Biotechnol Prog.，30(4):974-983；Baraniak等，2012，Cell Tissue Res.，347(3):701-711)，但同时其与MSC不兼容，这是由于它们之间的球体的强而快速的融合。
因此，关于细胞球体的生物技术和临床潜力，迫切需要更标准化和简化的制造工艺。
发明内容
本发明涉及一种制备球体的方法的意外发现，该方法适用于形成球体和类器官的所有类型的细胞，该方法简单而快速，并得到纯的、高度标准化的和非包封的细胞球体。该方法已通过ASC球体、多能干细胞(PSC)和来自PSC的神经球进行了验证，其导致标准化、随时间稳定并在存活、稳定性、再生和均匀性方面表现出持久的特性的球体。
与已知方法相比，本发明的方法具有动态和静态条件的多个优点，而不需要任何外部支架。该方法的简单性(干预最少，所需培养基较少)和非常高的标准化水平为将球体的使用转移到临床和以非常合理的成本筛选测定开辟了现实的可能性。
本发明的一个目的是提供一种能够以有效、准确和可靠的方式简单快速地制备球体的基体材料以及制备所述基体材料的方法。
有利的是提供一种用于制备基体的方法，该方法允许制备球体，该球体可以容易地定制以产生基体材料，所述基体材料适合用于球体形成中使用的细胞类型和所形成的球体的期望尺寸。
有利的是，提供一种允许制备球体的基体材料，其可以以成本有效的方式容易地运输和储存。
有利的是提供一种允许制备球体的可供使用的基体材料。
本发明的另一个目的是提供一种制备球体的方法，该方法能够以有效、准确和可靠的方式获得各种类型细胞的球体。
有利的是提供一种用于制备球体的方法，该方法可以适应该制备中使用的细胞的性质和所需球体或类器官的尺寸。
有利的是提供一种用于制备球体的方法，该方法允许制备具有标准化特征(尺寸和形状)的球体。
有利的是提供一种用于制备球体的方法，该方法允许以成本和时间有效的方式制备球体。
有利的是提供一种用于制备球体的方法，该方法允许制备稳定的允许长期培养的球体。
有利的是提供一种用于制备球体的方法，该方法允许由MSC和ASC制备具有高再生特性的球体。
本发明的另一个目的是提供具有标准化特性(尺寸和形状)和长期稳定特性的来自各种类型细胞的球体。
有利的是，提供可用于组织再生或生物组织培养(体外或离体)以及组织工程或化妆品应用的来自ASC的球体。
有利的是，提供积极产生大量伤口愈合因子的来自ASC的球体和任何含有这些的材料。
有利的是提供一种用于制备球体的方法，该方法允许制备神经球，特别是用于神经组织的建模或用于细胞替代疗法。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备基体材料的试剂盒，该试剂盒允许以有效、准确和可靠的方式制备球体。
有利的是提供一种试剂盒，该试剂盒允许制备用于制备球体的基体材料，该基体材料适用于球体形成中使用的细胞类型和所形成球体的期望尺寸。
本发明的另一个目的是提供一种以有效、准确和可靠的方式制备球体的试剂盒。
有利的是提供一种试剂盒，该试剂盒允许制备球体，该球体对于球体形成中使用的细胞类型和所形成球体的目标尺寸是特异的。
通过提供根据权利要求1的方法和根据权利要求5和6的基体材料、根据权利要求8的制备球体的方法及其根据权利要求7和13的用途、根据权利要求11的细胞球体、根据权利要求15的制备用于细胞培养的基体材料的模具、根据权利要求16的用于制备基体材料或根据权利要求17的用于制备球体的试剂盒，本发明的目的得以实现。
根据本发明的第一方面，本文公开了一种制备用于细胞培养的基体材料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供由支撑框架在其边缘上支撑的半透膜；
b)在所述半透膜上形成亲水多孔材料的延展层，以形成复合基质；
c)将包括多个锥形突起的疏水模具压入所述复合基质的亲水材料的延展层的外表面，以在所述层中形成多个孔形凹陷；
d)从亲水材料层移除模具以获得压印复合基质，所述压印复合基质包括亲水材料层，所述亲水材料层在其外表面上具有由内表面上的半透膜支撑的多个持久的孔形凹陷。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备球体的基体材料，其中所述材料包括：亲水多孔材料层，其外表面上具有由其内表面上的半透膜支撑的多个持久的孔形凹陷，其中所述孔形凹陷具有1μm2至1mm2的孔口和约1μm2至1mm2的底表面。
根据本发明的另一个方面，提供了本发明的基体材料用于制备球体的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备球体的方法，所述方法包括以下步骤：
i)在细胞培养容器中提供球体培养基；
ii)放置包括亲水多孔材料层的基体材料，所述亲水多孔材料材料层在其外表面上具有由内表面上的半透膜支撑的多个持久的孔形凹陷(在培养基的表面上，使得基体材料漂浮在培养基表面上)；
iii)使细胞悬浮液与漂浮的基体材料的表面接触，直到细胞在所述漂浮的基体材料的表面上形成球体。
根据本发明的另一个方面，提供了可从根据本发明的方法获得的球体，其具有标准化特性(尺寸/形状均匀性)和长期稳定特性，不含坏死核心。坏死核心的缺失可以通过流式细胞术、组织学、ATP测量、荧光探针染色来评估。
根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明的球体，其用于细胞治疗或用于制备可用于再生或替代治疗的细胞组织或可用于体外测定的细胞基体。
根据本发明的另一个方面，提供了球体用于制备细胞材料、组织或细胞替代物的用途，所述细胞材料、组织或细胞替代物可用于再生或替代疗法，或用作体外测定的基体。
根据本发明的另一个方面，提供了包含根据本发明球体的细胞材料、组织或细胞替代物(例如，细胞治疗材料/组织，用于筛选测定、毒理学研究的细胞基体，用于健康或患病组织建模的细胞材料/组织)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备用于细胞培养的基体材料的模具，所述模具包括手柄和图案化表面，所述图案化表面具有约5mm至10cm的尺寸，由亲水性材料制成并包括多个锥形突起(例如三角形或球形、线性或金字塔形)，其中所述锥形突起具有20μm至2mm的基部表面积和1mm2至100cm2的尖端表面积。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备基体材料的试剂盒，该试剂盒允许以有效、准确和可靠的方式制备球体，所述试剂盒包括至少一个根据本发明的模具和使用说明书。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备球体的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据本发明的基体材料和使用说明书。
根据本发明的另一个方面，提供了一种从受试者再生生物组织的方法，所述方法包括使一个或多个个体化细胞球体与所述生物组织接触。
附图说明
图1提供了根据本发明制备基体材料的方法的主要步骤的示意图(A)，并描绘了如实施例1所述的在步骤d)结束时得到的本发明基体材料(B)和步骤e)结束时得到的本发明基体材料(C)。
图2示出了可用于制备根据本发明的基体材料的模具的各种实施例(A1-A3有37个3x3x3.6 mm的突起，E1-E3有373个1x1x1.16 mm的突起，A1-A2和E1-E2是设计模具，A3和E3是制造模具)、示例模具的锥形突起的细节(分别为B和F)、包括由步骤c)产生的多个孔形凹陷的相应的支撑的琼脂糖层(分别为C和G)和琼脂糖层中孔形凹陷的显微镜视图(分别为D和H)。
图3提供了根据本发明的基体材料在根据本发明的方法中用于制备球体的用途的说明(A)、漂浮在细胞培养基M上的根据本发明的基体材料中的孔形凹陷内(被细胞外基质E包围)的球体的形成的示意图(B)、以及通过强制聚集(C1-C4)和通过实施例2中所述的根据本发明的方法(D1-D3)获得的球体的通过显微镜的比较。通过在AggrewellTM-800(StemCell)微孔板中的ASC细胞悬浮液的强制聚集的标准方法形成球体(对比例)：C1：离心后立即；C2：板离心后24小时；C3：板离心后24小时，ASC球体在细胞培养板中转移后24小时附着在塑料上；C4：板离心后24小时，ASC球体在在细胞培养板中转移并在恒定搅拌下培养后24小时融合并附着在塑料上。D1-D3：细胞接种后24小时，通过本发明的方法形成3个ASC系(ASC9、ASC10、ASC11)的球体。
图4示出了根据本发明的方法，在细胞悬浮液与漂浮的基体材料的表面接触24小时后，使用图2的模具形成不同尺寸ASC球体的照片。A1-A3：使用图2E-F的模具在琼脂糖中在小孔形凹陷中获得的不同尺寸的3种ASC球体，通常在250个细胞到1000个细胞的范围内；B1-B2：使用图2A-B的模具在琼脂糖中在大的孔形凹陷中获得的2个不同尺寸的ASC球体(通常范围为5000个细胞至10000个细胞)。
图5示出了如实施例3中所述的根据本发明由ASC制备的球体的生存能力和同一性的表征。A1-A4：光透射照片(A1)和用碘化丙啶PI(A2)、荧光素二乙酸酯FDA(A3)和Stro-1(A4)染色的由ASC制成的球体；B：来源于组织培养板中植板在塑料上的球体的细胞系中ASC标记物的流式细胞术分析。C：球体和ASC在2D中的比较，用于ASC鉴定的标记物的mRNA表达；D1-D3：来源于组织培养板中植板在塑料上的球体的细胞系的多向分化。将来源于球体的细胞暴露于诱导分化为脂肪细胞(FABP4)(D1)、软骨细胞(软骨蛋白聚糖)(D2)或骨细胞(骨钙素)(D3)的不同培养基。
图6表征了根据本发明方法制备的球体中的基因调控，与实施例3中描述的2D中的ASC进行了比较。A：在单层(2D)或球体中在第0天或48小时后分析三个独立ASC系(ASC9、ASC10、ASC11)的ASC的完整基因表达谱，并通过主成分分析进行比较；B：2D中2天ASC或来自相同ASC的2天球体的完整基因表达谱的分级聚类。比较了三种独立的ASC系。C：比较2D中2天ASC或来自相同ASC的2天球体的基因表达的显著调节的字云分析。比较了三种独立的ASC系。
图7表示根据本发明制备的2天球体中再生基因的靶向筛选，与实施例3中描述的2D中ASC进行比较。在转录组学数据中筛选了215个涉及再生的基因，以确定最重要的调控。基于倍数变化(<2或>2，具有显著p值)被认为是显著的调控在此给出，并根据其功能进行分类。
图8表示根据本发明的球体分泌的蛋白质组的分析，与实施例3中描述的2D中的ASC进行比较。A：在对其蛋白质组成进行质谱分析之前，在无血清培养基(＝条件培养基)中培养2D中的ASC或球体。给出了每个样品中鉴定的蛋白质的数量；B：来自球体和2D中ASC的条件培养基之间最显著差异的词云分析。
图9示出了实施例4中描述的用于重建手术的脂肪移植模型中本发明球体的体内再生特性。A：Balbc/J小鼠组皮下(头皮)移植混合有生理盐水、2D的ASC或根据本发明的球体的人脂肪。移植16周后，通过CT扫描成像监测大小；B：移植后6周脂肪移植物图片。
图10示出了通过强制聚集、然后浸入培养基或通过实施例5中所述的本发明方法制造的PSC球体的基因表达谱。A：PSC球体是通过强制聚集、然后在搅拌下在6孔板中转移(＝浸入＝3Di)或通过使用本发明的方法(＝3D)来制造的；B：3Di和3D之间差异表达基因的词云分析。C：与本发明的方法相比，3Di中制备的PSC球体中的一些神经外胚层基因的上调。
图11将根据本发明制造的来自PSC的神经球与实施例6中所述的通过强制聚集和浸入培养基制造的来自PSC的神经球进行了比较。A：根据本发明的(3D)或在强制聚集后浸入培养基中(3Di)的来自PSC的球体的尺寸和形状的监测。B：根据本发明(3D)或在强制聚集后浸入培养基中(3Di)制造的来自PSC的神经球之间的面积、周长和直径分布的基于软件的分析。
图12示出了，根据本发明的、最终分化为神经元细胞的来自PSC的神经球。3周后，将来自PSC的神经球在适当的培养基中植板在聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的组织培养板上，用于最终成长为神经元细胞，并通过电子显微镜(A)、倒置光学显微镜(B)或针对神经元标记物βIII微管蛋白的免疫荧光(C)分析衍生的神经元。
图13示出了马上(左侧)或对细胞核DAPI标记后(右侧)后分别在不同放大倍数x5(A)、x10(B)和x20(C)下拍摄的含有球体的微孔的冷冻切片，其如实施例6所述制备。
图14是实施例7中描述的非本发明标准方法(左)和本发明方法(右)的多巴胺能球体培养条件的示意图。
图15表示在实施例7所述的根据本发明的方法中，浸入培养的(非本发明的对比方法)和在气液界面培养的多巴胺能神经元球体之间缺氧相关基因在第6周的基因表达倍数变化。正条表示在本发明的方法中的上调，而相反的负条表示在3D浸入中的上调。
图16表示如实施例8所述的、培养并保持活力、稳定和功能活性直到培养第19周的多巴胺能球体的光学显微镜图像，其中多巴胺能球体是根据本发明的(3D)，并与不来自本发明的、在对比方法(3Di)中培养的那些相比较。
具体实施方式
根据本发明合适的细胞包括间充质干细胞、脂肪衍生干细胞、肝细胞、心肌细胞、软骨细胞、神经细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、类胚体、皮肤细胞、肺上皮细胞、所有肿瘤细胞(例如乳腺癌症细胞)、肝脏细胞、胰腺细胞、肠细胞、表皮细胞、角质形成细胞或骨细胞或上述列表中两种或多种细胞类型的混合物。
根据本发明的合适的细胞还特别包括成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞、肌肉细胞、血细胞、血管细胞、多能干细胞、单能干细胞以及一般的粘附或非粘附细胞。
根据本发明的细胞材料涉及包含细胞或由细胞(例如组织或细胞替代物)制备的材料、细胞测定基体或包含细胞的药物或化妆品组合物。
术语“组织替代物”或“细胞替代物”是指可以替代受损的受试者的天然组织或细胞的替代材料。在特定实施方式中，根据本发明的组织或细胞替代物包括皮肤替代物、神经元替代物和内脏组织替代物。
术语球体是指三维细胞模型，与二维细胞模型相比，其更好地再现体内情况的环境条件，特别是细胞间和细胞与基质相互作用。它包括三维生长的“类器官”、“微组织”和一般的“细胞聚集体”。
术语“球体培养基”是指适于形成球体的细胞培养基。其包括用于细胞培养维持的细胞培养基，所述细胞培养基包含促进细胞增殖、分化、自组织、成熟或维持球体/类器官的一种或多种生物活性因子。生物活性因子优选为小分子、化学化合物、细胞外基质因子、主要信号通路的蛋白质、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、纤维蛋白或细胞外基质成分。典型的球状培养基和合适的生物活性因子描述于实施例4和5或“Tieng等，2014，Stem Cells andDevelopment，1535-1547”。
词语“半透膜”是指允许溶剂和部分溶质通过的膜。与其他物质相比，它允许溶液中存在的某些物质优先通过，这取决于孔的大小。它包括亲水膜、过滤膜和多孔膜。本文提供了这些实施例。
根据本发明的基体材料的制备方法
参考附图，特别是首先参考图1A，提供了用于细胞培养的基体材料的制备方法的说明，包括以下步骤：
a)提供由支撑框架在其边缘(2a)上支撑的半透膜(2)；
b)在所述半透膜上形成亲水多孔材料的延展层(3)，以形成复合基质(3b)；
c)将包括多个锥形突起(4a)的模具(4)压入所述复合基质(3b)的亲水多孔材料的延展层的外表面(3b)中，以在所述层中形成多个孔形凹陷(5)；
d)从疏水性聚合物层移除模具(4)以获得压印复合基质(6)，所述压印复合基质包括亲水多孔材料层，所述亲水多孔材料层在其外表面上具有由内表面上的半透膜(2)支撑的多个持久的孔形凹陷(5)。
根据一个特定方面，支撑框架包括不可逆地粘附到亲水性材料(例如聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和任何有机疏水性塑料)上的材料。半透膜在其边缘处附接到支撑框架，并且可以是围绕半透膜的环形、正方形或矩形框架的形式，以赋予膜的表面一定的轴向刚度和平面性。
根据一个特定方面，半透膜允许空气/液体界面细胞培养条件。通常，根据本发明的半透膜具有直径为约1nm至约200μm、例如约2nm至约40μm的孔。
根据另一方面，典型地，根据本发明的半透膜具有约0.4μm至约12μm的孔。根据另一特定方面，所述半透膜包含或由至少一种材料构成的膜，所述至少一种材料选自聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和纤维素酯或其组合。
根据另一特定方面，所述半透膜是包含或由至少一种材料构成的膜，所述至少一种材料选自聚苯乙烯磺酸盐和聚丙烯。
根据另一个具体方面，亲水多孔材料是亲水性凝胶，其允许水性细胞培养基扩散而不附着到细胞。通常，根据本发明的亲水性凝胶由选自琼脂糖、聚乙烯醇(PVA)、琼脂、海藻酸盐、透明质酸、果胶或淀粉或任何等效的合成凝胶的聚合物制成。
根据另一个具体方面，根据本发明的亲水性凝胶由聚合物制成，所述聚合物选自：细胞相容的天然(或改性的)衍生材料，所述材料选自碳水化合物(例如琼脂糖、琼脂、海藻酸盐、淀粉、果胶、壳聚糖、右旋糖酐、多糖)、蛋白质或ECM组分(例如层粘连蛋白、胶原蛋白、透明质酸、纤维蛋白)、肽(例如明胶)及其混合物；或衍生自天然ECM的凝胶，优选MatrigelTM(一种从小鼠肉瘤(一种富含细胞外基质蛋白的肿瘤)中提取的重组基底膜制剂(一旦分离，这种材料含有约60％的层粘连蛋白、30％的IV型胶原和8％的巢蛋白。巢蛋白是一种与层粘连蛋白和IV型胶原相互作用的桥接分子，有助于这些细胞外基质分子的结构组织。康宁MatrigelTM基质还含有硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(串珠素)、转化生长因子(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、组织纤溶酶原激活剂和其他在EHS肿瘤中自然出现的生长因子。还存在源自肿瘤细胞的残余基质金属蛋白酶)、肌凝胶(如“Abberton等，2008，cells Tissues Organics，188(4):347-58。doi:10.1159/000121575。2008年3月20日电子出版。PMID:18354248；Salo等，2015，BMC Cancer，15，981https://doi.org/10.1186/s12885-015-1944-z”中所述的、从人类良性肿瘤组织“平滑肌瘤”中提取的基于人的细胞外基质肌凝胶)、或软骨凝胶(软骨的细胞外基质提取物)、或选自聚(乙二醇)、聚脂聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚(环氧乙烷)、聚环氧丙烷、聚乙二醇、聚丙二醇、聚四亚甲基氧化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)及其混合物的合成衍生材料。
根据另一个特定方面，亲水凝胶可以通过本领域已知的许多方法制备，并且涉及共价交联或非共价组装或两者的组合。共价交联可以作为合成过程的一部分进一步进行，例如通过在聚合过程中使用双官能单体，或者通过在该过程中使用天然或合成大分子交联亲水性聚合物的预形成的大分子，其中聚合物是直链或支链的。
根据另一个特定方面，亲水多孔材料的延展层是在高于凝胶的胶凝温度的温度(例如，高于所述胶凝温度20℃至100℃)下形成的亲水性凝胶层。通常，通过在75℃至100℃的温度下在半透膜上沉积琼脂糖以形成复合基质，由此形成琼脂糖延展层。
根据另一特定方面，亲水凝胶的延展层在高于胶凝温度时为约5mm至10cm大和约2mm至10mm厚。亲水凝胶一旦形成，就有利地防止细胞和球体的粘附，从而避免在细胞培养过程中在离心之前使用抗粘附溶液。
根据另一个具体方面，根据本发明的亲水多孔材料的延展层具有允许氧气和细胞营养物质通过的孔隙率。通常，其孔隙率范围为约10nm至约500μm。
根据另一个具体方面，根据本发明的亲水多孔材料(例如琼脂糖)的延展层具有约100nm至约500mm的孔隙率，其主要由水分子占据，允许营养物质、小分子、化学化合物以及甚至蛋白质(例如白蛋白)通过。
根据一个特定的实施方式，所述模具包括手柄和图案化表面，所述图案化表面具有约1mm2至2000cm2、例如约1mm2至100cm2的尺寸，由可模压的疏水性材料制成，并且包括多个锥形突起(例如，三角形或线性或卵形金字塔形或圆形形状)，其中所述锥形突起具有约100μm2至10cm2、例如100μm2至1mm2的基部表面积和约0μm2至约1mm2、例如约100μm2至1mm2的尖端表面积。
根据一个特定的实施方式，包括多个锥形突起的模具被压入所述复合基质的亲水多孔材料的延展层的外表面，使得突起深入亲水多孔材料的延展层，直到突起的上端与半透膜接触。
根据一个特定方面，一旦亲水性凝胶的温度低于其胶凝温度，就从亲水性材料中移除模具以获得压印复合基质。
根据一个特定方面，所述压印复合基质包括亲水多孔材料层，所述亲水多孔材料层在其外表面上具有由其内表面上的半透膜支撑的多个持久的孔形凹陷，其中所述孔形凹陷具有约100μm2至10cm2、例如约100μm2至1mm2的孔、约100μm至40mm、例如100μm至1mm的深度和约0μm2至1mm2、例如约100μm2至1mm2的底部表面积。根据一个特定方面，金字塔形式的孔形凹陷，这些孔的合适的底部：孔径比可以是大约0.8:3。
根据一个特定方面，所述压印复合基质包括亲水凝胶层，所述亲水凝胶层在其外表面上具有多个持久的孔形凹陷，所述孔形凹陷由在其内表面上的半透膜支撑，其中所述亲水凝胶层的表面上的孔形凹陷的密度为约10cm-2至10000cm-2。
根据一个特定方面，孔形凹陷是倒置的金字塔形空腔(<1mm)。
根据另一个具体方面，根据本发明的用于细胞培养的基体材料的制备方法适用于球体的培养。
根据另一个进一步的具体方面，亲水材料层表面上的孔形空腔允许在细胞培养或离心过程中细胞在重力作用下在其底部聚焦聚类。
根据另一个进一步的具体方面，压印复合基质包括亲水凝胶层，该亲水凝胶层在其外表面上具有多个持久的孔形凹陷，该凹陷由其内表面上的半透膜支撑。它特别适合于空气/液体界面细胞培养条件。特别地，亲水凝胶(例如琼脂糖)的亲水性和多孔性允许位于半透膜下方的培养基扩散，以在细胞和形成的球体上形成培养基膜。
根据另一个进一步的具体方面，所获得的压印复合基质可以在其形成后容易地使用，或者可以储存以备以后使用。例如，压印复合基质可以在4℃或室温下储存在缓冲溶液中，或在没有缓冲剂的情况下以冷冻状态或在封闭容器中储存，优选在真空或冻干状态下储存。
根据另一个具体方面，根据本发明的方法可以进一步包括制备所获得的用于储存的复合基质的步骤(例如，选自在真空下在密封容器中调理复合基质、冻干或冷冻复合基质的至少一个步骤)。
适用于制备根据本发明的基体材料的模具
参考附图，特别是图2A-B和2E-F，提供了一种用于制备用于细胞培养的基体材料的模具，所述模具(44)包括手柄(45)和图案化表面(46)，所述图案化表面具有约1mm2至100cm2的尺寸，由可模压的疏水材料制成，并包括多个锥形突起(44a)(例如三角形、线性或卵形金字塔形状)，其中所述锥形突起具有100μm2至1mm2的基部表面积(44b)和100μm2至1mm2的尖端表面积。
根据一个特定的实施方式，可模压的疏水材料选自硅酮、(甲基)丙烯酸酯基光固化体系、硫醇烯和硫醇烯光固化体系、环氧树脂或双酚-F环氧树脂、聚酯、环氧树脂和聚氨酯、双酚型环氧树脂、ABS和增强型ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)、PMMA-ABS(聚甲基丙烯酸甲酯ABS)、SEBS-ABS(苯乙烯-乙烯-丁二烯-苯乙烯/ABS)、UHMWPE-ABS(超高分子量聚乙烯-ABS)、PLA-PBS(聚乳酸-聚丁二酸丁二醇酯)、TPU(聚氨酯)、PLA(聚乳酸)、PVA(聚乙烯醇)、PET-PEPN(聚对苯二甲酸乙二醇酯-苯乙炔)、PIB(聚异丁烯)、PTFE(聚四氟乙烯)、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PC(聚碳酸酯)、PPS(聚苯砜)和PEI(聚醚酰亚胺)。
根据另一特定实施方式，可模压疏水材料是不锈钢。
根据另一特定实施方式，可模压疏水材料选自二氧化硅和硝酸硅。
根据一个特定方面，根据本发明的模具可以通过在包括1μm2至1mm2的孔形腔(例如AggrewellsTM孔)的合适的母模中模压疏水材料(例如聚二甲基硅氧烷(PDMS))来制备，或者通过在SLA(立体光刻)或DLP(数字光处理)3D打印机上使用UV可固化的甲基丙烯酸酯树脂进行3D打印来制备。3D打印的优点是可以在尺寸、深度和形状方面创建任何锥形突起的任何设计。
根据本发明的可用于球体形成的基体材料
根据一个特定的实施方式，提供了可从根据本发明的方法获得的基体材料。
参考附图，特别是图3A和图B，提供了一种用于制备球体的基体材料(6)，其中所述材料包括：亲水多孔材料层(3)，所述亲水多孔材料层在其外表面上具有多个持久的孔形凹陷(5)，由其内表面上的半透膜(2)支撑，并且其中所述半透膜由其边缘上的支撑框架(2a)支撑，其中所述孔形凹陷具有1μm2到1mm2的孔口和约1μm2至1mm2的底部表面。
根据一个特定方面，亲水多孔材料层是亲水性凝胶层，例如由琼脂糖、聚乙烯醇(PVA)、琼脂、海藻酸盐、透明质酸、果胶、淀粉或任何不附着于细胞的合成水凝胶形成。
根据另一个具体方面，提供了一种用于制备根据本发明的球体的基体材料，所述基体材料包括亲水材料层，所述亲水材料层在其外表面上具有多个持久的孔形凹陷，所述孔形凹陷由其内表面上的半透膜支撑，并且其中所述孔形凹陷具有100μm2至约1mm2的孔口和约100μm2到约1mm2的底部表面。
根据另一个具体方面，提供了一种用于制备根据本发明的球体的基体材料，其包括根据本发明的压印复合基质。
根据另一个具体方面，提供了一种用于制备根据本发明的球体的基体材料，其中所述多个持久的孔形凹陷在4至1536个孔形凹陷之间。
根据另一特定方面，所述半透膜如本文所述。
根据另一方面，本发明的基体材料处于冷冻状态，例如用于储存或运输。
根据另一个进一步的方面，在每个孔形凹陷中进一步包括个体化球体或个体化类器官的本发明的基体材料处于冷冻状态，例如用于储存或运输。
对于进一步的用途，本发明的冷冻基体材料然后可以被冷冻切片或解冻，例如通过直接在Milestone冷冻包埋化合物(MCC)中冷冻包括形成的球体的本发明的基体材料的孔形凹陷，然后用低温恒温器切割至5μm至20μm范围内的厚度，如实施例6中所述。然后在显微镜下观察之前，将切片收集在载玻片上。
根据一个特定方面，特别是在根据本发明的方法中，根据本发明的基体材料可用于制备球体或类器官。
根据一个特定方面，根据本发明的基体材料可用于制备用于研究目的的球体或类器官。
根据另一个特定方面，根据本发明的基体材料可用于制备用于临床和细胞治疗目的的球体或类器官。
根据本发明的球体的制备方法
参考附图，特别是图3A和B，提供了一种制备球体的方法，所述方法包括以下步骤：
i)在细胞培养容器(7)中提供球体培养基(8)；
ii)放置包括亲水多孔材料层(3)的基体材料(6)，所述亲水多孔材料层在其外表面上具有多个持久的孔形凹陷(5)，所述孔形凹陷其由内表面(2)上的半透膜支撑，并且其中所述半透膜在其边缘上由支撑框架(2a)支撑在所述培养基的表面上，使得所述基体材料漂浮在培养基的表面上；
iii)使细胞悬浮液(9)与所述漂浮的基体材料的表面接触，直到细胞在所述漂浮的基体材料的表面上形成球体。
根据一个特定方面，球体培养基的体积为约1μl至约1000ml。
根据另一个特定方面，通过将细胞与有利于球体/类器官细胞培养(例如分化、增殖或维持)的细胞相容性材料混合来制备根据本发明的细胞悬浮液，这种细胞相容性材料包括天然衍生的生物材料，如多糖、凝胶蛋白，细胞外基质(ECM)成分包括：琼脂糖、海藻酸盐、壳聚糖、右旋糖酐、明胶、层粘连蛋白、胶原蛋白、透明质酸、纤维蛋白、功能性变体和混合物，或源自天然ECM的凝胶，如MatrigelTM、肌凝胶或软骨凝胶。
根据另一个特定方面，球体的形成可以在步骤iii)下通过约2小时至5小时的重力或通过对含有细胞接种的漂浮基体材料的细胞培养容器进行离心以诱导细胞聚集而随着时间的推移而实现。
根据一个特定方面，将细胞培养容器以100×g离心5至10分钟。
根据一个特定方面，细胞是干细胞，例如多能干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞和间充质干细胞。
根据一个特定方面，细胞悬浮液是ASC悬浮液。根据一个特定的实施方式，在制备细胞悬浮液之前，通过酶处理(胰蛋白酶/EDTA或TrypLE)分离ASC。
根据一个特定方面，细胞悬浮液是多巴胺能神经细胞悬浮液。
根据一个特定方面，细胞悬浮液是非人胚胎干细胞悬浮液。
根据一个特定方面，细胞悬浮液是多能干细胞悬浮液。
根据一个特定方面，细胞在本发明的方法中用于共培养。特别地，所述细胞被提供为以下两种或多种细胞类型的混合物：成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞、肌肉细胞、血细胞、血管细胞、多能干细胞、单能干细胞、间充质干细胞、脂肪衍生干细胞、肝细胞、心肌细胞、软骨细胞、神经细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、多能干细胞，iPS、胚胎体、皮肤细胞、肺上皮细胞、所有肿瘤细胞、肝脏细胞、胰腺细胞、肠细胞、表皮细胞、角质形成细胞或骨细胞，以及一般粘附细胞(干细胞或非干细胞)、非粘附细胞或混合物。
根据另一个具体实施方式，可以通过直接使用共培养物作为接触漂浮的基体材料表面的细胞悬浮液来进行共培养，直到细胞在漂浮的基体材料的表面上形成球体。
或者，可以通过在基体材料漂浮其上的培养基中(例如在含有培养基的容器的基部中)培养其他细胞类型来进行共培养。
根据另一个特定方面，细胞共培养物包括成纤维细胞和癌症细胞的组合。
根据另一个特定方面，细胞共培养物包括成纤维细胞和造血细胞的组合。
根据另一个特定方面，细胞共培养物包括神经元细胞和血管细胞的组合。
根据另一个特定方面，细胞共培养物包括神经细胞和免疫细胞的组合。
根据另一个特定方面，细胞共培养物包括癌症细胞和免疫细胞的结合。
根据另一个特定方面，细胞共培养物包括肝细胞和免疫细胞的组合。
根据本发明的一个特定方面，通过本发明的方法获得的球体可以通过将它们从基体中分离(例如通过移液)而容易地使用(例如用作可用于再生或替代疗法的细胞材料，或用作用于实施例中所述的体外测定的基体，或用于类器官的形成)。
或者，通过本发明的方法获得的球体可以保持在培养物中，例如用于制备类器官，并且在这种情况下，形成的球体保持在漂浮基体材料的表面上直到成熟或分化，同时定期改变基体材料下的培养基(例如每2-3天)。
根据一个特定方面，根据本发明的球体的制备方法是在气液界面条件下进行的，并具有几个优点：(i)培养基的改变可以在基体的不与(在半透膜的与培养基接触的一侧的)球体接触的一侧进行，从而避免球体的可能阻止融合的失稳；(ii)球体在其在孔形凹陷内形成期间个体化，并且通过在形成的球体上形成培养基膜而单独稳定，孔形凹陷和膜形成的组合防止球体的迁移及其融合；(iii)细胞和空气之间的交换防止在这些静态培养条件下存在的球体中的缺氧和坏死核心的形成。
根据一个特定方面，根据本发明的方法有利地允许制备球体，所获得的球体具有非常高的均匀性(尺寸和形状)的球体，其在至少6周的时间内是稳定的。
根据一个特定方面，根据本发明的方法有利地允许制备球体，所获得的球体具有非常高的均匀性(尺寸和形状)，其在至少5个月的时间内是稳定的。事实上，在5个月时，球体的直径的标准偏差为81μm，而相比之下用经典方法培养的球体为563μm。此外，关于球体形状的分析，对于完美圆，圆度评估其比值等于1，通过本发明的方法生产的球体具有0.92+/-0.02的圆度，而通过传统方法在浸没中培育的球体具有0.85+/-0.05的圆度。
该方法进一步允许减少制造时间和成本，从而减少所需培养基的数量和干预。
一旦球体保持培养一定时间(例如用于类器官的形成)，该方法允许在不引起形成的球体上的微流体扰动的情况下容易地改变培养基。
这种方法进一步防止了坏死核心的形成和球体之间的融合。
最后，在倒置显微镜下可以很容易地观察到球体的形成。
根据本发明的球体及其用途
根据一个特定的实施方式，提供了可从根据本发明的方法获得的球体。
根据一个特定的实施方式，提供了基本上不含坏死核心并且稳定至少6周、例如至少5个月的个体化细胞球体。
根据一个特定的实施方式，提供了本发明的个体化细胞球体，其中与在浸没和旋转下通过经典方法培养的球体相比，缺氧相关基因(如LDHA、EGFR、VEGFC)没有上调。
根据本发明的方法是非常有利的，因为用于临床应用的ASC球体的形成以前还没有实现过。
根据本发明的另一个方面，提供了ASC球体，特别是个体化的ASC球体，其具有均匀特性(大小和形状)和长期稳定特性，具有不同于通过任何其他已知方法获得的ASC球体的基因表达谱。特别地，这些ASC球体具有细胞外基质蛋白高度表达的表达谱。
根据本发明的另一个方面，提供了神经球，特别是个体化神经球，其具有优于通过已知方法制备的神经球的优点。特别地，本发明提供了具有均匀特性(大小和形状)和长期稳定特性的个体化神经球，其基因表达谱具有增加的神经祖细胞基因表达。
根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明的球体，其用于再生医学例如脂肪移植，特别是用于治疗皮肤创伤以及用于自体脂肪移植(例如使用ASC球体)、骨和软骨修复(例如使用ASC、软骨细胞或骨细胞球体)、皮肤修复(例如，使用角质形成细胞或成纤维细胞球体)、心脏组织修复(例如使用心肌细胞球体)的细胞治疗，特别适用于治疗心脏局部缺血、胰腺细胞移植(例如使用Langherans胰岛球体)，特别适用于糖尿病或治疗神经元损伤(例如使用神经球)，例如治疗中风、创伤性脑损伤、神经退行性疾病(如帕金森氏症)。
根据本发明的另一个方面，提供了ASC球体用于制备可用于治疗慢性创伤的细胞组织的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了包含根据本发明的ASC球体的组织替代物，其例如为水凝胶形式，包含海藻酸盐、壳聚糖、胶原、透明质酸、糖胺聚糖、果胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮，进一步包含本发明的ASC球体。
根据本发明的另一个方面，提供了一种药物或化妆品组合物，其包含根据本发明的ASC球体和至少一种药学上或美容上可接受的载体。这些组合物的实施例可以是局部使用的软膏、油或乳膏。
根据本发明的另一个方面，提供了神经球的用于制备细胞替代物的用途，所述细胞替代物可用于神经组织建模或用于药物筛选和毒性测定或细胞替代治疗。
根据本发明的另一个方面，提供了一种细胞或组织替代物，其包括根据本发明的、例如在“Campos等，2004，J.Neurosci.Res.，1578(6)：761-9；Takahashi，2006，J.ErnstSchering Res.Found.Workshop.，(60)：229-44；Gottlieb，2002，Annu Rev Neurosci.，25:381-407”中描述的神经球。
根据本发明的另一个方面，提供了一种生物组织再生的方法，所述方法包括使一个或多个根据本发明的个体化的细胞球体与所述生物组织接触。特别地，提供了一种用于生物组织再生的离体方法，其中所述一个或多个个体化细胞球体用于制备可用于组织再生或组织替代治疗的离体细胞组织。
根据本发明的另一个方面，根据本发明的球体可用于小鼠的人源化：人源化小鼠是表达人类基因或已移植人类干细胞或组织的免疫缺陷实验室小鼠。在这种情况下，通过本发明的方法生产的复制器官(例如大脑、肝脏或胰腺)的球体或类器官，可以移植到这些类型的小鼠中以使其人源化。
根据本发明的试剂盒
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备基体材料的试剂盒，该试剂盒允许以有效、准确和可靠的方式制备球体，所述试剂盒包括至少一个根据本发明的模具和使用说明书。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备用于制备球体的基体材料的试剂盒，该试剂盒还包括至少一种另外的元件：
-一种可用于形成亲水性凝胶的亲水多孔材料，例如选自琼脂糖、聚乙烯醇(PVA)、琼脂、海藻酸盐、透明质酸、果胶或淀粉或任何等效的合成凝胶；
-半透膜，例如包含或由至少一种材料组成的膜，所述材料选自聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和纤维素酯或其组合，所述半透膜单独或可移除地安置在支撑基底上。
根据另一个方面，根据本发明的半透膜包括选自聚苯乙烯磺酸盐和聚丙烯的至少一种材料或由其组成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备球体的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据本发明的基体材料和使用说明书。
根据另一个具体方面，提供了一种用于制备球体的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据本发明的基体材料，其中所述基体材料包括4到1536个孔形凹陷的多个孔形凹陷。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备球体的试剂盒，该试剂盒进一步包括至少一种另外的元件：
-细胞培养基；
-细胞培养容器；
-根据本发明的用于处理基体材料的工具。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据本发明的试剂盒，其中细胞培养容器是具有约25cm2至1720cm2的表面的细胞培养皿。
根据本发明的另一个方面，提供了一种3D体外培养系统试剂盒，所述试剂盒包括：至少一种根据本发明的基体材料，其中所述基体材料在每个孔形凹陷中还包括个体化球体或个体化类器官；适用于支持球体类器官维持的细胞培养基；以及使用说明书。
根据本发明的另一个方面，提供了一种3D体外培养系统试剂盒，所述试剂盒包括：
-基体材料，所述基体材料包括亲水多孔材料层，所述亲水多孔材料层在其外表面上具有多个持久的孔形凹陷，所述凹陷由内表面上的半透膜支撑，并且其中所述半透膜由其边缘上的支撑框架支撑，其中所述基体材料在每个孔形凹陷中包括个体化球体或个体化类器官；
-适于支持球体类器官维持的细胞培养基；
其中所述基体材料漂浮在所述培养基的表面上；以及使用说明书。
根据另一个方面，提供了一种3D体外培养系统试剂盒，其中在每个孔形凹陷中包含个体化球体或个体化类器官的所述基体材料被冷冻。
根据另一个方面，提供了一种3D体外培养系统试剂盒，其中在每个孔形凹陷中包含个体化球体或个体化类器官的所述基体材料以约5至约20μm厚的切片被冷冻。切片可以通过使用低温恒温器进行冷冻切片来获得。
根据另一个进一步的方面，提供了一种3D体外培养系统试剂盒，其中所述基体材料被提供在优选地具有盖子的细胞培养容器中。
根据另一个进一步的方面，细胞培养容器和盖子由透明材料(例如聚苯乙烯、玻璃或具有薄聚苯乙烯膜或盖玻片底部的板)制成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包括多个细胞培养容器的细胞培养系统，每个细胞培养容器包括根据本发明的基体材料，其中所述基体材料漂浮在细胞培养基的表面上。通常，所述多个细胞培养容器的细胞培养容器表面代表约0.011cm2至500cm2的表面。通常，培养基的培养基体积为约1μl至约150ml。
根据本发明的另一方面，提供了一种根据本发明的试剂盒或细胞培养系统，其中所述试剂盒或系统可用于生成脑、肝、肺、脂肪来源的基质细胞球体或癌症类器官。
根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明的试剂盒或细胞培养系统，其中所述试剂盒或系统可用于保持球体类器官的稳定性和完整性，并在没有结构改变的情况下方便地运输它们。
根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明的试剂盒或细胞培养系统，其中所述试剂盒或系统可用于在同一平面中进行几个球体/类器官的冰冻切片/冷冻切片，并可连续进行各种组织学或免疫组织化学标记。冷冻切片技术显著缩短了传统组织活检制备的初步组织学分析时间，实现了高准确性，并保留了酶和抗原功能。
下文将参照附图中所示的实施方式以更详细的方式描述说明本发明的实施例。
实施例
以下缩写分别指以下定义：
实施例1：本发明基体材料的制备
执行图1A所示的可用于制备球体的本发明基体材料的制备方法。特别地，该方法包括以下步骤：
a)提供由支撑框架在其边缘(2a)上支撑的半透膜(2)
提供由聚苯乙烯支撑框架支撑的聚碳酸酯半透膜(Millicell Cell CultureInsert，30mm，聚四氟乙烯，0.4μm的孔)。
b)在所述半渗透膜上形成亲水凝胶形式的亲水多孔材料的延展层(3)，以形成复合基质(3a)
在前面描述的支撑的半透膜上形成1ml的2.5％的加热的琼脂糖(100℃)(LE，分析级，Promega)的超纯水溶液(1)，从而形成复合基质(3a)，所述复合基质包括在半透膜上的琼脂糖的延展层(1mm)(3)。
c)将包括多个锥形突起(4a)的模具(4)压入所述复合基质(3a)的亲水多孔材料的延展层的外表面(3b)中，以在所述层中形成多个孔形凹陷(5)
在琼脂糖凝胶化之前，将包括如下所述的多个金字塔形突起(4a)的模具(4)立即压入加热的琼脂糖层的外表面，使得突起与半透膜接触，以在琼脂糖层表面(3)上形成多个孔形凹陷(5)。
所用的模具由硅制成，并利用根据制造商的方案使用的硅弹性体试剂盒(聚二甲基硅氧烷(PDMS)，SYLGARD 184，RTV，Dow Corning，美国)制备。为此，将Sylgard 184聚合物和固化剂以10∶1的规定比例混合，在真空下脱气30分钟，并倒入微孔培养板(AggrewellTM板)中(图1B)，从而形成包括微孔培养板大小和形式的多个突起的硅染料模具(图1C)。
或者使用参数化3D建模器(例如FreeCAD 0.18)设计3D打印模具。随后，生成的设计被导出为STL格式文件，并转换为G代码(例如Autodesk Netab2020软件)，生成的文件被导入到具有UV 385nm高功率led和1920x1080px高清分辨率的数字光处理(DLP)3D打印机(Rapidshape P30系列，)中。使用丙烯酸树脂(Sheraprint型号加砂UV)打印层厚度为50μm的模具。打印后，在室温下，在超声波浴(28-34kHz)中，在异丙醇中将模型洗涤两次，持续6分钟。一旦干燥，模型在固化单元(Shera闪光灯-+3D)中进一步固化：在灭菌和使用之前，进行2循环2000次闪光(100W/280-700nm/10次闪光/秒)。
用于产生孔形凹陷的模具的实施例如图2所示：设计(A1-A2)和制造(A3)，用于在亲水多孔材料层中、例如在具有大微孔的支撑琼脂糖层中(C-D)产生大孔形凹陷；设计(E1-E2)和制造(E3)，用于在亲水多孔材料层中、例如在具有微孔小微孔的支撑的琼脂糖层中产生小的孔形凹陷(G，H)。
d)从亲水多孔材料层移除模具(4)以获得压印复合基质(6)，所述压印复合基质包括亲水多孔材料层，所述亲水多孔材料层在其外表面(5)上具有多个持久的孔形凹陷，所述凹陷由其内表面上的半透膜支撑，所述膜在其边缘处由支撑框架支撑
在室温下10分钟后，轻轻移除模具，并在琼脂糖层中形成孔形凹陷(图1A，a))。
如实施例2和图3所述，所得到的包含多个孔形凹陷的支撑琼脂糖层可用于制备球体。例如，它可以例如在真空下或缓冲液中储存，或者冻干或冷冻以备日后使用，或者立即用于制备球体。
具有小凹陷的支撑亲水凝胶层被成功地用于生产不同尺寸的小ASC球体，范围从250个细胞到1000个细胞(图4A1-A3)。更大的占用空间被成功地用于生产不同尺寸的更大ASC球体，范围从5000个细胞到10000个细胞(图4B1-B2)。
实施例2：在本发明的基体材料上制造脂肪来源的干细胞(ASC)球体
在本发明的基体上制造球体是从ASC的培养物中进行的，并与商业化的基于强制聚集的最标准化的可用方法(即AggrewellTM技术，如“Mirab等，2019，PLos ONE 14(1):e0211078”中所述)进行了比较。
ASC培养与差异化
来源于人类脂肪组织手术片的ASC(伦理授权NAC 14-183，日内瓦大学医院，IlkerUckay博士)在补充有10％的人血小板裂解物(Stemulate，Cook Regentek)、1％青霉素和链霉素抗生素(均来自Thermofisher)的Dulbecco改良伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖，L-谷氨酰胺)型培养基中生长。细胞在37℃和5％的CO2下培养。培养基每2-3天更换一次，用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液(Thermofisher)传代。
形成ASC球体的已知方法(AggrewellTM技术)
在市售的AggrewellTM-800装置中强制离心和培养2小时后，细胞聚集(每个球体1000个细胞，图3C1)，但在24小时后，形成的球体附着在孔上并移动到孔的底部之外(图3C2)，因为ASC也通过其与用于细胞培养的塑料的粘附来定义(Bourin等，2013，Cytotherapy，15(6):641-648)。为了解决这一限制，必须将它们转移到传统的6孔板中，以在37℃、5％CO2下搅拌培养。在将球体转移到常规细胞培养板中后，ASC球体快速粘附到塑料上(图3C3)，并且还与每个球体聚集以合并成大的聚集体(图3C4)，其生物学特性和治疗潜力无法利用。
在本发明的基底上形成ASC球体
i)在细胞培养容器中提供球体培养基；
在细胞培养容器(如常规6孔板)(7)中，提供适合培养来自ASC的球体(8)的培养基(含有4.5g/l葡萄糖和Glutamax(Thermofisher)、1％青霉素和链霉素、10％人血小板裂解物(multiPL-100，Macopharma)的DMEM)(图3A)。
ii)将基体材料(6)放置在培养基表面上，使得所述基体材料漂浮在培养基的表面上，所述基体材料包括亲水多孔材料层，所述亲水多孔材料层在其外表面(5)上具有多个持久的孔形凹陷，所述凹陷由在其内表面(2)上的半透膜支撑
将根据本发明的基体材料沉积在ASC培养基M(8)上，以在细胞培养容器(7)中建立空气/液体界面条件(图3A)，所述基体材料为包含在实施例1中获得的多个孔形凹陷的支撑琼脂糖层形式(6)。这些空气/液体界面条件的更详细方案如(图3B)所示，其中包括多个孔形凹陷的支撑琼脂糖层漂浮在培养基上。
iii)使细胞悬浮液与漂浮基体材料的表面接触，直到形成球体
通过细胞过滤器(Corning，40μm)过滤其培养基中的ASC单细胞悬浮液(9)，并将1ml悬浮液沉积在包含多个孔形凹陷的漂浮支撑琼脂糖层的表面上。
对含有细胞接种的漂浮基体材料的细胞培养容器进行离心以诱导细胞聚集：然后将6孔板以100×g离心约5分钟，以迫使细胞聚集在琼脂糖孔中。然后用0.5x16毫米的针头抽吸除去培养基，球体刚好被残留培养基的薄膜(10)覆盖。琼脂糖和球体的亲水性通过这种培养基薄膜的毛细管作用保持，然后创造空气/液体界面细胞培养条件。
首先测试三个ASC系，用于制造每个含有1000个细胞的球体，首先通过使用PDMS模具以形成如上所述的本发明的支撑的琼脂糖基体。ASC球体在空气/液体界面条件下24小时后没有附着在琼脂糖孔上，并且具有圆形形状(图3，D1-D3)。它们在这些静态条件下稳定达6周。使用ImageJTM软件测量4个不同ASC系内的30个球体的大小，并如下面表1中所述对数据进行分析。
表1
ASC系 ASC1 ASC2 ASC3 ASC4
平均直径(m,n＝30) 166+/-5,3 168+/-4,3 159+/-5,2 172+/-4,5
对于每个系，球体之间的标准偏差约为5μm。由此获得的球体在4个系之间但也在每个系内具有均匀的尺寸和形状。
因此，本发明的方法允许制造在培养中具有高度稳定性的高度均匀ASC球体。培养基的改变只需要将本发明的接种基体材料转移到新的细胞培养容器中的新鲜培养基的界面处，然后增强新制备的球体的非常高的稳定性。
实施例3：ASC制成的球体的特性
球体培养中的主要问题是球体中坏死核心的形成，因此如下所述研究根据本发明制备的ASC球体的细胞活力。此外，细胞的同一性通过如下所述的免疫染色来控制。
细胞活力
根据供应商的说明书，使用含有荧光素二乙酸酯(FDA)和碘化丙啶(PI)的荧光标记试剂盒(Ibidi)控制球体的活力，然后使用倒置荧光显微镜观察球体(图5A1)。如图5A2-4所示，48小时后，标记活细胞的FDA信号存在于大多数细胞中，遍布球体的整个表面。相反，细胞死亡相关的PI仅在球体的极少数细胞上以高强度表达。因此，在根据本发明制备的ASC球体中观察到48小时和一周后的良好细胞活力。
细胞的识别
球体免疫染色是在悬浮液中进行的。球体首先在PBS中洗涤，然后在室温下用4％多聚甲醛溶液固定20分钟。然后将球体在PBS中冲洗，并重新悬浮在补充有1％牛血清白蛋白、0.3％Triton X-100的PBS中。然后将球体用一抗Stro1小鼠IgM(LifeTechnologies)在+4℃下培养过夜。在PBS中洗涤三次后，用Alexa555二抗Stro1小鼠IgM(Invitrogen)培养90分钟。
Stro-1在所有标记的球体中的表达均为阳性，表明球体中的细胞保持基质同一性。
接下来，将细胞在100μl补充有10％牛血清白蛋白的PBS中培养，每次稀释抗体l。使用具有相同荧光色素的同种型对照。细胞和抗体在4℃下培养30分钟，用PBS洗涤并重悬于PBS中，然后用流式细胞仪LSRFortessaTM(Becton Dickinson)进行分析。使用FlowJo软件进行数据分析。通过流式细胞术对细胞表面标志物进行的分析示出，在来源于球体的单层细胞(培养一周后)中，ASC标志物(CD44、CD73、CD90、CD105)表达，以及不存在在ASC中必须为阴性的标志物(HLA-DR、CD45、CD14)(图5B)。在球体培养9天后和在单层中额外培养一周后，它显示了与ASC相容的细胞表面表型。
此外，分析了一个完整的转录组。根据制造商的说明书，使用来自Qiagen的RNeasy试剂盒进行总RNA的分离。RNA浓度通过光谱仪(Thermo ScientificTM NanoDrop 2000)测定，并通过2100生物分析仪(安捷伦)验证RNA质量。对于微阵列分析，使用Affymetrix芯片进行，该芯片靶向提取的RNA上的21448个mRNA(CompleteInstrument System，www.affymetric.com)。
ASC标记物的mRNA在球体和2D条件下都被发现，CD44除外(图5C)。在流式细胞术中可以看到CD44的表达(图5B)，这可能是由于微阵列中CD44检测的不足。因此，由ASC制成的球体中的细胞也具有与ASC相容的基因表达谱。
最后，如下所述测试由ASC制成的球体中细胞的多能性。单层细胞从ASC制成的球体中衍生一周，然后在适当的培养基下分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。获得了三种细胞类型，这通过脂肪细胞标记物FABP4、软骨细胞标记(蛋白聚糖)和骨细胞标记物(骨钙素)的表达而看到(图5D)。因此，由ASC制成的球体衍生的细胞具有ASC的多能特性。
ASC制成的球体的特性：完整的基因表达谱
利用默认设置使用热图软件包对使用TAC4.0.1.36软件( )生成的数据进行热图和基本成分分析(https://cran.r-project.org/web/pac kages/pheatmap/index.html)。使用统计软件R和Gosummaries软件包相结合的算法生成了词云分析。
在Affymetrix芯片上分析从3个ASC系(ASC9、ASC10、ASC11)中提取的总RNA，以比较球体与球体形成48小时后2D(在塑料表面上亚融合培养)中的ASC的基因表达谱。主成分分析(PCA)显示，球体中ASC的基因表达谱与2D或分析前(＝第0天)的ASC不同(图6A)。因此，球体中的ASC与单层培养的ASC对其基因表达的调节不同。还生成了代表2D和3D ASC之间每个转录组的表达水平的全局视图的热图来分析结果。所研究的条件由地图生成软件自动排序，以便将最一致的条件组合在一起。热图(图6B)显示，根据本发明制备的2D ASC和球体ASC被自动分类为两个分化良好的组，与2D相比，证实了球体中的基因调控。进行了词云分析，以确定球体和2D之间差异表达的基因的功能性质。与细胞周期和细胞增殖相关的基因在球体中下调，而与自噬(包括溶酶体反应)相关的基因上调。这些观察结果表明，与增殖和细胞传代恒定的单层中的ASC相比，球体中的ASC减少了其增殖。然后提出了无毒性的对压力的自噬反应(通过上述活力测定证实)，其可能有利于ASC的血管分泌特性。事实上，自噬是血管形成的主要诱导剂(Hassanpour等，2018，Stem Cell Res Ther.，9(1):305)，并被证明在缺氧条件下保护MSC免于凋亡(Zhang等，2012，Stem Cells Dev.，21(8):1321-1332)。此外，自噬MSC分泌更多的VEGF、bFGF和血管生成素，从而加速再生(Hassanpour等，2018，同上)，而自噬的抑制降低了它们的促血管生成作用。
此外，通过任意选择理论上参与组织再生的基因(215mRNA)(代表2D和3D之间的倍数变化)，进行筛选(图7)。几乎所有负责细胞增殖的基因都在球体中下调，具有相当强的调节作用。相反，MMP9和血管生成性ANGPTL-2上调。HGF和TGFβ3明显上调。然而，促炎性IL-6和CCL-2以及神经营养NRG1被下调。编码细胞外基质蛋白质的基因显示出一些惊人的上调：皮连蛋白(DPT)，层粘连蛋白α-1(LAMA4)，尤其是胶原蛋白14(COL14A1)。总之，这些数据意味着再生基因在通过本发明的方法制备的球体中的表达的整体维持，具有一些注意到的调节。
由ASC制成球体的表征：分泌蛋白质组
2D或球体中的细胞用无血清DMEM(Thermofisher)洗涤，并在37℃下在该无血清培养基中培养过夜。收集培养基并以500×g离心10分钟，以除去残留细胞和游离细胞核。然后将样品在-80℃下冷冻。蛋白质被沉淀、消化，并使用easynLC1000(Thermo FisherScientific)结合QExactive HF质谱仪(Thermo Fisher Scientific)，通过nanoLC MSMS分析肽。使用Mascot(Matrix Science)对人类参考蛋白质组数据库(Uniprot)进行数据库搜索。利用具有1％蛋白质FDR的Scaffold(蛋白质组软件)和具有0.1％肽FDR的每个蛋白质至少2个独特肽，分析和验证数据。
根据本发明的方法，从2D或在无蛋白培养基中培养12小时的球体(48小时)中的2个ASC系(ASC 10、ASC 11)的上清液中提取总蛋白，并通过质谱分析。注意到的第一个差异是在细胞上清液中发现的蛋白质总量。在2D样品中发现每个细胞15.51+/-1.4μg的蛋白质。相反，在球体样品中，每个细胞仅发现6.92+/-0.5μg，这表明当细胞被压实时，分泌蛋白中存在屏障作用。相反，与2D相比，在球体样品中质谱法鉴定了更大的蛋白质多样性：在球体样本中鉴定了1291种蛋白质，而在2D样本中鉴定出782种蛋白质(图8A)。其中，667种蛋白质仅在球体样品中发现，158种蛋白质仅在2D样品中鉴定。总之，这些观察结果表明，根据本发明的方法在球体中生长的ASC的分泌组在其多样性方面更丰富，但由于屏障效应而在数量上减少。对ASC球体中显著上调或下调的蛋白质进行词云分析(图8B)。在球体中上调(或诱导)的蛋白质中，与自噬有关的蛋白质被确认。相反，参与细胞外基质组织化的蛋白质被显著下调，可能在球体细胞之间产生的细胞外基质中高度激活。
由ASC制成的球体的表征：重建手术的临床前模型中的生物活性
通过该溶液制备的ASC球体的再生特性在脂肪移植的小鼠模型中进行了测试，该模型是最公认的脂肪填充动物模型：免疫活性Balb/c小鼠中的人脂肪皮下移植，如下所述。
动物实验
不能使用免疫抑制的动物，因为免疫系统和炎症是整个再生过程的一部分，脂肪免疫原性仍然很低，完全异种排斥的时间延迟。将0.6ml人脂肪移植物通过1.05mm细套管放置在BALB/cJ小鼠的头皮皮肤下，添加单细胞悬浮液中的ASC(2D)与ASC球体与对照(单独的载体)。使用三通阀将脂肪与ASC球体或单悬浮液ASC或盐水缓冲液预混合。在整个研究过程中，在全身麻醉下对移植物体积进行体内微CT扫描成像(Quantum GX)，并通过图像数据后处理软件套件(VivoQuant)分析数据。
另一方面，进行了另一个实验。以与之前相同的方式，注射0.6ml含有或不含有ASC表达荧光素酶的脂肪。在整个实验中，在全身麻醉下通过显微CT扫描成像监测移植物体积。CT扫描仪图像如上所述进行分析，并通过IVIS图像分析软件对发光图像进行分析。
根据本发明方法制备的球体或2D中的ASC，与单独的载体相比，降低了移植物的再吸收(图9A)。与2D中的ASC相比，本发明的ASC球体提高了移植物的长期稳定性，移植后第7周开始，并维持到移植后第16周。宏观上看，与类似的2D和单独载体对照相比，ASC球体在第16天的脂肪移植物更大(第6周的实施例，图9B)。因此，根据本发明制备的ASC球体在脂肪填充的小鼠模型中诱导更稳定和长期的脂肪移植物。总之，通过本发明的方法产生的ASC球体被证实在体内更具再生性，并且可用于重建手术中的脂肪填充应用。
实施例4：在本发明的基体材料上制造人多能干细胞球体
本发明的方法用于从人多能干细胞制备球体，并将获得的球体与在Aggewell-800中强制离心后在搅拌下浸入(3Di)获得的球体进行比较。
多能干细胞的培养
在37℃和5％CO2下，在Stemflex培养基(Thermofisher)的Laminin-521(Thermofisher)包被的培养板上且在1％青霉素/链霉素(Thermofisher)中，培养HS420人胚胎干细胞系。细胞通过酶促程序(Accutase Stemcell)传代。为了更好地存活，将所需密度的重新植板的细胞暴露于Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(10μM)24小时。
通过强制聚集然后浸入(3Di)制造多能干细胞衍生的球体-对比例HS420细胞以每微孔2200个细胞的比例沉积在Aggrewell-800TM(Stemcell technologies，6孔板，每孔2ml)中的培养基中(此处使用的微孔板每孔包含1800个微孔)。为了正确地将细胞分布在每个微孔中，轻轻地摇动平板并将其放置在稳定的支架上。15分钟后，将平板在37℃下培养24小时以产生球体。球体形成24小时后，用不含ROCK抑制剂的新鲜维持培养基代替该培养基，并将球体转移到6孔板(商业上可获得的标准条件被称为3D和浸入(3Di))中，每孔2ml培养基，在37℃和5％CO2下持续搅拌(60rpm，轨道摇床)培养。
通过根据本发明的方法制造多能干细胞衍生的球体
将维持培养基(Stemflex培养基(ThermoFisher)，1％青霉素/链霉素(ThermoFisher))中的每微孔2200个的人多能干细胞沉积在根据实施例1制备的基体材料上，其每孔含有720个微孔(＝1mL含ROCK抑制剂的维持培养基中的160万个细胞)。为了将细胞正确分布在每个微孔中，轻轻摇晃基体材料，并将其放置在稳定的支撑物上15分钟。然后用0.5x16 mm的针抽吸去除培养基，并且，在37℃下培养板24小时之前，仅用残留培养基的薄膜(10)覆盖球体。球体形成24小时后，用不含ROCK抑制剂的新鲜维持培养基代替培养基。
RNA测序分析比较了单层中的PSC培养物、使用商业强制聚集然后在搅拌下保持浸入(3Di)的球体、使用我们的具有空气/液体界面的溶液(3D)的球体。测试了四个不同批次的细胞。该RNAseq分析中的第一个观察结果是，细胞培养方法对细胞有影响，因为通过多维尺度分析，获得了3个完全不同的群体，它们每个条件下都有非常接近的四份(图10A)。为了了解3Di和3D之间哪些生物过程发生了显著变化，进行了词云分析。在该分析中，有趣的是观察到3Di中的几个生物过程上调，如发育、代谢、形态发生和分化(图10B)。为了更准确地了解使用溶液时哪些生物途径受到调节，进行了基因集富集。这种计算方法确定先验定义的基因集是否在差异表达基因的排名列表的两端显示出统计学上显著的富集。根据该分析，观察到在所有被调节的基因之间，与3Di相比，溶液有34个显著上调的途径和62个下调的途径。其中，参与外胚层、神经嵴和神经元分化的途径出现在15个更加上调的途径的列表中，如其归一化富集分数(NES)和假发现率(FDR)(＝假阳性值的概率)的分类所示(图10C)。因此，通过根据本发明的方法制备的PSC球体被调节，从而有利于分化、特别是神经分化。
实施例5：在本发明的基体材料上制造神经球
来源于多能干细胞(PSC)的神经球被广泛用于许多应用：健康或患病的神经组织建模、药物筛选和毒性测定，以及未来可能的细胞治疗应用。本发明的方法用于制备神经球，获得的神经球与通过市售的AgrewellTM-800然后在搅拌下浸入(3Di)获得的那些进行比较。
通过强制聚集然后浸入(3Di)制造多能干细胞衍生的神经球—对比例
如上所述(3Di)制造多能干细胞衍生的球体。球体形成24小时后，收集球体，然后将其转移到DMEM-F12培养基中的6孔板中，该培养基补充有1％N-2补充剂(Thermofisher)、1％青霉素/链霉素、0.5μMSB431542和10μM LDN193189(双重SMAD抑制鸡尾酒)。然后在2毫升培养基中在持续搅拌下(60rpm，轨道摇床)培养球体。在第8天，用补充有1％N-2、1％B-27补充剂(Thermofisher)和bFGF(20ng/ml)的DMEM-F12代替培养基。在第21天，将神经球植板在成熟培养基中的聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的组织培养板中，成熟培养基：含Glutamax的50％DMEM F12、50％Neurobasal培养基、1％B-27、1％N-2、1％非必需氨基酸、β-巯基乙醇(0.1mM)、1％青霉素/链霉素、20ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF)和20ng/ml神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)。
通过根据本发明的方法制造多能干细胞衍生的神经球
多能干细胞衍生的球体如上所述制造。球体形成24小时后，更换培养基：DMEM-F12培养基，补充1％N-2补充剂(Thermofisher)、1％青霉素/链霉素、0.5μM SB431542和10μMLDN193189(双重SMAD抑制鸡尾酒)。在第8天，用补充有1％N-2、1％B-27补充剂(Thermofisher)和bFGF(20ng/ml)的DMEM-F12代替培养基。在第21天，收集神经球，并将其植板在成熟培养基中的聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的组织培养板上，成熟培养基：含有Glutamax的50％DMEM F12、50％Neurobasal培养基、1％B-27、1％N-2、1％非必需氨基酸、β-巯基乙醇(0.1mM)、1％青霉素/链霉素、20ng/ml BDNF和20ng/ml GDNF。
神经球来源神经元的免疫荧光
将玻璃盖玻片上的细胞在PBS中洗涤，然后在室温下用4％多聚甲醛溶液固定30分钟。将其在PBS中冲洗，并在补充有1％牛血清白蛋白、0.3％Triton X-100的PBS中替换。然后将细胞与一抗βIII微管蛋白多克隆兔抗体(Biolegend Covance)在+4℃下培养过夜。在PBS中洗涤三次后，用Alexa555二抗βIII微管蛋白(Invitrogen)培养90分钟。再次，在用DAPI(300nM)标记细胞核染色之前，在PBS中进行三次洗涤的步骤。在PBS中连续洗涤3次后，在纯水中漂洗细胞，并将其固定在Fluorsave安装培养基(Calbiochem)中。用荧光显微镜(ZEISS Axio2)对样品进行成像。
神经球来源神经元的电镜
细胞首先在PBS中洗涤，然后在室温下用4％多聚甲醛溶液固定30分钟。然后将细胞在PBS中漂洗，并在具有连续增加百分比的乙醇的浴中脱水。然后，将样品放在通风橱中过夜以干燥。使用溅射涂层HHV(班加罗尔，印度)用20nm金膜覆盖样品，并在来自Zeiss(Oberkochen，德国)的sigma 300VP FE-SEM(场发射SEM)中成像。
与传统的强制聚集后浸入/搅拌相比，使用该溶液诱导的PSC神经球更均匀，并具有高标准化程度
在33天内进行来自PSC的神经球培养，并通过光学显微镜观察神经球的大小和形状的演变。如图11A所示，两种方法在圆形和尺寸方面都没有早期的显著差异。然而，在培养10天后，用溶液生长的神经球比在3Di上生长的更均匀。图11A示出了不同时间点的球。这种高标准化程度通过基于软件的面积、周长和直径分布范围的量化得到了证实(图11B)，对于3D来说明显更低。此外，最初具有圆形的球体通过本发明的方法保持了其圆形形态，而3Di中的那些演变成更不均一的和细长的形状。第21天，在聚鸟氨酸-层粘连蛋白包被的板上评估两种技术的神经球的神经元成熟度。电子显微镜(图12A)、相位对比显微镜(图12B)和针对神经元标记物β-III微管蛋白的免疫荧光(图12C)显示了两种技术的丰富神经元，证实了本发明的方法保持了产生的球体的神经干细胞特性。
总之，这些数据支持了根据本发明的方法有利地制造(简化培养过程和维护，所需培养基更少)高度标准化的神经球(大小和形状)的可能性，并且这些有利的性质有望为使用神经球和神经移植物的所有应用带来强大的益处。
实施例6：在本发明的基体材料上制备几种球体/类器官的冷冻切片
根据本发明的基体材料用于根据本发明的方法制备球体，如实施例4中所述，每个微孔细胞具有2000个细胞。将含有所形成球体的本发明基体材料的孔形凹陷在Milestone冷冻包埋化合物(MCC)中直接冷冻，然后用低温恒温器切割至5μm至20μm的厚度。厚度为5μm的切片以不同放大倍数x5、x10和x20在细胞核DAPI标记后马上(左侧照片)和之后(右侧照片)拍照，分别如图13A、B和C所示。
这些结果表明，根据本发明的基体材料允许直接冷冻/冷冻保存含有球体的微孔，以便在同一平面中进行几个球体/类器官的冻结切片/冷冻切片，并连续进行各种组织学或免疫组织化学标记。
实施例7：在3D常规培养“3D浸入”(3Di)方法中培养的多巴胺能神经球体与根据本发明方法培养的那些的性质的比较
作为一个实用的提醒，在标准方法“3D浸入”中，球体首先在塑料微孔中强制聚集，然后取出并转移到标准培养板中，保持搅拌，如实施例4中所述，这由图14(左)图示。
相反，根据本发明的方法，球体被迫聚集在基体材料的孔形凹陷中，所述基体材料包括亲水多孔材料层，在其外表面上具有多个持久的孔形凹陷，所述凹陷由其内表面上的半透膜支撑，其中半透膜由其边缘上的支撑框架支撑，基体材料在培养基的表面上以使基体材料漂浮在培养基的表面上。与3D浸入相比，它们被单独地保持在微孔中，而没有任何转移、浸入和搅拌。球体在气液界面中培养，如图14(右)所示，进入半透膜/多孔膜表面的微孔中，并用培养基的纳米膜覆盖，直接暴露于空气中。半透膜允许其长期稳定性，并建立有利于与空气的气体交换的空气/液体界面条件，允许更多的氧气进入细胞。
空气和细胞之间的距离显著减小，从而允许高扩散氧气并维持由培养器施加的氧气百分比或细胞培养参数。该系统避免了限制某些细胞的O2供应和诱导缺氧。
在本例中，用多巴胺能神经球体进行培养，并且用作本发明的基体材料的、在其外表面上具有多个持久的孔形凹陷的亲水多孔材料层是实施例4中所述的琼脂糖。在多巴胺能分化结束时，从通过本发明方法或通过标准方法培养的球体中提取总RNA。分析了完整的转录组。根据制造商的说明书，使用Qiagen RNeasy试剂盒进行总RNA分离。RNA浓度通过光谱仪(Thermo ScientificTM NanoDrop 2000)测定，并通过2100生物分析仪(安捷伦)验证RNA质量。通过RNAseq对3个独立实验进行转录组学分析以评估基因表达。
在用3D浸入法培养的球体中，观察到缺氧相关基因表达的上调(如实施例3和4所述)(图15)。
因此，这些数据清楚地支持：根据本发明的方法和基体材料有利地允许避免细胞缺氧，即使在经典的3D方法中，细胞缺氧也是坏死核心形成的根源。
实施例8：通过3D浸入制备的多巴胺能球体和通过根据本发明的方法制备的那些的稳定性和形态比较
在5个月内研究多巴胺能神经球体的形态和均匀性，以将用实施例7中所述的3D常规培养“3D浸入”获得的那些与通过根据本发明的方法获得的那些进行比较。
为此，进行了多巴胺能分化。向多巴胺能细胞诱导HS420(多能干细胞)。双重SMAD抑制(LDN-193189，如来自国家生物技术信息中心的CID 54613581的PubChem CompoundSummary中所述的BMP信号抑制剂，LDN-193189单盐酸盐，见https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/LDN-193189-monohydrochlori d，.以及SB-431542，ALK5/TGF-β型I受体的选择性抑制剂，如来自国家生物技术信息中心的CID4521392的PubChem Compound Summary所述，见https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/sb-431542)用于神经诱导。FGF-8(成纤维细胞生长因子8)、SHH(音速刺猬蛋白)、CHIR 99021(如来自国家生物技术信息中心的CID 99556119的PubChem Compound Summary所述，见https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/chir-99021)、嘌吗啡胺被用作多巴胺能规格的因子。为了神经分化和神经元成熟，在神经基础培养基中加入AMPC(环磷酸腺苷)、BDNF、GDNF、TGFB3(转化生长因子β3)、FGF20(成纤维细胞生长因子20)和化合物E，但如“Cossetat等，2019，J.Vis.Exp.，(148)，e59682，doi:10.3791/59682”所述从13天起为了成熟步骤除去CHIR。
然后，在19周内通过光学显微镜观察所获得的多巴胺能神经球体的大小和形状的演变。球体的照片每周用光学显微镜以X4倍的放大倍数拍摄，然后用一种名为imagej的软件进行分析。
如图16所示，在第0周，两种方法在圆形形状和大小上都没有显著差异。然而，在培养19周后，根据本发明生长的多巴胺能神经球比在3D浸入上生长的那些(其融合且形状上不均一和不规则)更均匀。

Claims (21)

1.一种制备用于细胞培养的基体材料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供由支撑框架在其边缘上支撑的半透膜；
b)在所述半透膜上形成亲水多孔材料的延展层，以形成复合基质；
c)将包括多个锥形突起的疏水模具压入所述复合基质的亲水材料的延展层的外表面，以在所述层中形成多个孔形凹陷；
d)从亲水材料层移除模具以获得压印复合基质，所述压印复合基质包括亲水材料层，所述亲水材料层在其外表面上具有由内表面上的半透膜支撑的多个持久的孔形凹陷。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述半透膜是包含或由至少一种材料组成的膜，所示至少一种材料选自聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、纤维素酯、聚苯乙烯磺酸盐和聚丙烯或其组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中亲水多孔材料是亲水凝胶，特别是根据本发明的亲水凝胶由选自琼脂糖、聚乙烯醇(PVA)、琼脂、海藻酸盐、透明质酸、果胶或淀粉等的聚合物制成。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述压印复合基质包括疏水聚合物层，所述疏水聚合物层在其外表面上具有多个持久的孔形凹陷，所述孔形凹陷由其内表面上的半透膜支撑，其中，所述孔形凹陷具有：约100μm2至10cm2、例如约100μm2至约1mm2的孔口，约100μm至40mm、例如从100μm至1mm的深度，以及约0μm2至1mm2、例如约100μm2至约1mm2的底部表面积。
5.一种可从根据权利要求1至4中任一项所述的方法获得的基体材料，用于制备球体或类器官。
6.一种用于制备球体或类器官的基体材料，其中所述材料包括：亲水多孔材料层，其外表面具有多个持久的孔形凹陷，由其内表面的半透膜支撑，其中所述孔形凹陷具有100μm2至约1mm2的孔口和约100μm2到约1mm2底部表面，其中所述亲水多孔材料层具有允许氧气和细胞营养物质通过的孔隙率。
7.根据权利要求5或6所述的基体材料，其中所述半透膜具有直径为约1nm至约200μm、例如约2nm至约40μm的孔。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的基体材料用于制备球体的用途。
9.一种制备球体的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在细胞培养容器中提供球体培养基；
(ii)将包含亲水多孔材料层的基体材料放置在培养基表面上，使得基体材料漂浮在培养基的表面上，亲水多孔材料层的外表面上具有多个持久的孔形凹陷，由其内表面上的半透膜支撑，其中半透膜由其边缘的支撑框架支撑；
(iii)使细胞悬浮液与浮动基体材料的表面接触，直到细胞在浮动基体材料表面上形成球体。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述基体材料是根据权利要求1至4中任一项所述的。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述细胞是选自MSC、ASC、PSC、iPS、神经球、肝球、心肌细胞、肺上皮、角质形成细胞的干细胞，特别是ASC和多能干细胞。
12.一种个体化的细胞球体，其基本上不含坏死核心并且稳定至少6周。
13.根据权利要求12所述的个体化细胞球体，其中与在浸入和旋转下通过经典方法培养的球体相比，缺氧相关基因如LDHA、EGFR、VEGFC没有上调。
14.根据权利要求12或13所述的细胞球体，用于细胞治疗，特别是再生或替代治疗。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的细胞球体的用途，用于制备可用于再生或替代疗法的细胞组织或可用于体外测定的细胞基体。
16.一种细胞材料或组织替代物，其包含至少一种根据权利要求12或13所述的球体。
17.一种用于制备用于细胞培养的基体材料的模具，所述模具包括手柄和图案化表面，所述图案化表面具有约1mm2至2000cm2、例如约1mm2至100cm2的大小，由可模压的疏水材料制成并包括多个锥形突起，其中所述锥形突起具有约100μm2至10cm2、例如约100μm2至1mm2的基部表面积和约0μm2至约1mm2、例如大约100μm2到1mm2的尖端表面积。
18.一种用于制备用于制备细胞球体的基体材料的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个根据权利要求17所述的模具和使用说明书。
19.一种用于制备细胞球体的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求5至7中任一项所述的基体材料和使用说明书。
20.一种用于生物组织再生的方法，所述方法包括使一个或多个根据权利要求12-14中任一项所述的个体化细胞球体与所述生物组织接触。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法是用于生物组织再生的离体方法，其中所述一个或多个个体化细胞球体被用于离体制备用于组织再生或组织替代治疗的细胞组织。
CN202280010598.5A 2021-01-18 2022-01-17 细胞球体的生产方法及工具 Pending CN116745403A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21152106.7A EP4029934A1 (en) 2021-01-18 2021-01-18 Methods of producing cell spheroids and tool therefore
EP21152106.7 2021-01-18
PCT/EP2022/050920 WO2022152916A1 (en) 2021-01-18 2022-01-17 Methods of producing cell spheroids and tool therefore

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116745403A true CN116745403A (zh) 2023-09-12

Family

ID=74187167

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280010598.5A Pending CN116745403A (zh) 2021-01-18 2022-01-17 细胞球体的生产方法及工具

Country Status (4)

Country Link
EP (2) EP4029934A1 (zh)
CN (1) CN116745403A (zh)
CA (1) CA3204075A1 (zh)
WO (1) WO2022152916A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3237597T3 (da) * 2014-12-22 2021-03-15 Ecole Polytechnique Fed Lausanne Epfl Indretninger til højgennemløbsaggregering og manipulation af pattedyrsceller
EP3296018A1 (en) * 2016-09-19 2018-03-21 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Organoid arrays
CN110997900A (zh) * 2017-07-14 2020-04-10 多伦多大学管理委员会 用于快速产生用于化合物筛选的类器官/球状体的微流体平台
JP2021511823A (ja) * 2018-01-23 2021-05-13 バル・イラン・ユニバーシティＢａｒ Ｉｌａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 細胞培養装置および方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4277979A1 (en) 2023-11-22
CA3204075A1 (en) 2022-07-21
EP4029934A1 (en) 2022-07-20
WO2022152916A1 (en) 2022-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tavassoli et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: a biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products
Wang et al. Feasibility of chitosan-alginate (Chi-Alg) hydrogel used as scaffold for neural tissue engineering: a pilot study in vitro
Liu et al. Looking into the future: toward advanced 3D biomaterials for stem‐Cell‐based regenerative medicine
Neto et al. Microparticles in contact with cells: from carriers to multifunctional tissue modulators
Krontiras et al. Adipogenic differentiation of stem cells in three‐dimensional porous bacterial nanocellulose scaffolds
Li et al. Bridging the gap: from 2D cell culture to 3D microengineered extracellular matrices
Wang et al. Modulation of human multipotent and pluripotent stem cells using surface nanotopographies and surface-immobilised bioactive signals: A review
Hayman et al. Enhanced neurite outgrowth by human neurons grown on solid three-dimensional scaffolds
Wang et al. Constructing tissuelike complex structures using cell-laden DNA hydrogel bricks
US20190367872A1 (en) Organoid tissue engineering
JP2012509663A (ja) 細胞培養のための、突起間隔を開けた基板および装置
KR20190143830A (ko) 탈세포화된 뇌조직 매트릭스 기반 뇌 오가노이드 배양용 조성물 및 이의 제조방법
KR102446764B1 (ko) 생물학적-관련 물질을 포함하는 스페로이드 및 관련 방법
EP2610335A1 (en) Dried hydrogel, dried vitrigel film, and processes for producing these
Wang et al. Stimulation of early osteochondral differentiation of human mesenchymal stem cells using binary colloidal crystals (BCCs)
US11633523B2 (en) Method for producing cell tissue, and porous film
Vadivelu et al. Liquid marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues
CN107075443B (zh) 三维细胞培养系统和使用该系统的细胞培养方法
Tudureanu et al. Insight and recent advances into the role of topography on the cell differentiation and proliferation on biopolymeric surfaces
Jamalpoor et al. Comparative evaluation of morphology and osteogenic behavior of human Wharton's jelly mesenchymal stem cells on 2D culture plate and 3D biomimetic scaffold
JP6206792B2 (ja) 培地及び細胞の培養方法
Jiang et al. bFGF and poly‐RGD cooperatively establish biointerface for stem cell adhesion, proliferation, and differentiation
Sun et al. One-stop assembly of adherent 3D retinal organoids from hiPSCs based on 3D-printed derived PDMS microwell platform
Leight et al. Manipulation of 3D cluster size and geometry by release from 2D micropatterns
CN116745403A (zh) 细胞球体的生产方法及工具

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination