KR102446764B1 - 생물학적-관련 물질을 포함하는 스페로이드 및 관련 방법 - Google Patents

Abstract

생체적합성 매질 내에 분산된 하나 이상의 생물학적-관련 물질을 갖는 현탁액을 제공하는 단계를 포함하는 스페로이드의 제조 방법이 제공된다. 일정량의 친수성 물질이 초-소수성 표면의 정의된 영역 상에 침적되고, 현탁액의 소적이 초-소수성 표면 상에 위치하는 친수성 물질 상에 바이오프린팅되어 스페로이드가 생성된다.

Description

생물학적-관련 물질을 포함하는 스페로이드 및 관련 방법

관련 출원

이 출원은 2016 년 6 월 27 일에 제출된 미국 가출원 일련 번호 62/354,929, 및 2016 년 11 월 16 일에 제출된 미국 가출원 일련 번호 62/422,694 에 대한 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 전체 공개는 본원에 참조로 포함된다.

기술 분야

본원에 공개된 주제는 일반적으로 생물학적-관련 물질을 포함하는 스페로이드 (spheroid) 및 관련된 방법에 관한 것이다. 특히, 본원에 공개된 주제의 특정 구현예는 생물학적 관련 물질 (biologically relevant material) 을 포함하는 스페로이드 및 그러한 스페로이드의 제조 방법으로서, 하나 이상의 생물학적-관련 물질을 함유하는 현탁액이 초-소수성 (super-hydrophobic) 표면 상에 바이오프린팅 (bioprinting) 되는 방법에 관한 것이다.

세포 배양을 위한 3-차원 환경의 사용은 세포 거동의 시험관내 (in vitro) 모델링을 위한 및 후속적 이식용 구축물의 제작을 위한 더욱 생리학적으로-적절한 시스템을 제공한다. 신체에서, 조직은 다수의 세포 유형으로 구성되고, 세포는 특정 공간 배열로 조직화되어 기관 기능에 특이적인 기하구조로의 세포의 배향을 제공한다. 조직 배양 표면 (예를 들어, 유리 및 플라스틱) 에서 성장된 세포를 원래 이용하는, 시험관내 세포 기능의 연구는 이제 종종 콜라겐 겔에 내포되는 세포의 3-차원 (3D) 배양물로 이행했다. 동등하게, 연구자들은 배양 동안 스페로이드의 자발적 형성을 겪는 2- 및 3-차원 세포 배양물의 능력을 평가했다. 상피 및 내피 유기관 배양물이 이러한 방식으로 확립되었다. 이들 절차에서, 배아 줄기 세포는 현적 (hanging drop) 으로서 배양되고 배양체 (embryoid body) (EB) 를 형성하는 것이 허용된다. 스페로이드 배양 전략은 그 후 모든 복합 조직의 공통 세포 성분인, 혈관구조의 세포를 나타내는, 내피를 포함하는 것으로 진전했다. 그리고 최근에, 실질 (parenchymal) 세포 및 혈관 세포를 함유하는 복합 3-차원 조직 구축물이 실험 모델에 이식되었다. 이들 연구 각각은 기능적 조직 유기관이 시험관내 구축되고, 조직에 이식될 수 있다는 것과, 이식물과 수용부위 순환 사이의 혈관 통합의 증거 및 유기관이 조직 기능의 회복을 제공할 수 있다는 증거를 보여준다.

3-차원 조직 구축물의 혈관 통합에서 도움이 되기 위헤서, 여러 연구는 지방질-유래의 기질 혈관 분획 (stromal vascular fraction) (SVF) 을 사용했다. 지방질-유래의 SVF 은 생체내 (in vivo) 및 임상 적용을 위한 다수의 재생 특성을 갖는 세포의 이질성 집단이다. SVF 및 많은 다른 줄기 및 재생 세포 집단을 위한 현재의 일차 전달 방식은 용액에 현탁된 세포의 직접 주입이다. 그러나, SVF 의 직접 주입의 하나의 큰 단점은 이식 부위에서 세포 체류 (retention) 의 결여가 관찰되는 점이다. 그에 따라, 주입 후 세포의 체류를 증가시키기 위해, 직접 캡슐화 또는 배양-의존적 자가-응집에 의한, 응집물로의 세포의 집합이 제안되었다. 이와 관련하여, SVF 은 이전에 스캐폴드 내에 내포되거나 또는 시험관내 적용을 위한 여러 가지 매트릭스 하이드로겔 내에 캡슐화되었고, 이들 캡슐화된 응집물은 SVF 국소화 및 체류를 증가시켰다. SVF 세포 응집을 향한 이전의 작업은 또한 알기네이트 캡슐화를 사용하여 콜라겐 겔 중 SVF 의 스페로이드 및 기타 3D 배양물을 형성하는 것을 포함했다.

현재, 스페로이드의 생성은 일차적으로 세포성 스페로이드, 표면 시딩된 스페로이드, 및 캡슐화된 스페로이드의 명목 카테고리에 속한다. 그래도 또한, 그러한 세포성 스페로이드는 전형적으로 현적 방법에 의해 생성되거나 또는 그렇지 않으면 기타 부착점의 결여로 인한 세포 자가-응집의 메카니즘에 의존한다. 세포는 세포의 중심 덩어리 또는 응집물로의 이주를 지지하는 부착점을 이용하여 자발적으로 응집할 수 있다. 이러한 생성 과정은 스페로이드를 생성하는데 며칠이 걸리고, 세포 증식 속도에 의해 심하게 확대되는 불일치를 겪는다. 표면 시딩된 스페로이드는 선택된 생체고분자로 사전-제조되고, 그 후 선택된 세포와 인큐베이션되어 세포 이주 추진되는 시딩을 허용한다. 선택된 생체물질이 사전제조될 수 있기만 하면, 이러한 생성 전략은 매우 넓은 범위의 적용을 갖는다. 사전제조된 스페로이드의 결점은 세포 시딩이 이주/부착 기반이므로, 스페로이드의 전체 부피보다는 스페로이드 표면에 주로 국한되어 스페로이드 로딩 용량을 제한한다는 점이다. 캡슐화된 스페로이드의 세번째 전략은 세포를 현탁액 내로 혼합한 후 그 현탁액이 선택된 스캐폴드/하이드로겔로 되는 것을 허용하는 아이디어를 중심으로 삼는다. 캡슐화 기반 스페로이드는 하루도 안되는 시간에 생성되는 능력 및 세포 운반을 위해 스페로이드의 전체 부피를 이용할 수 있는 이점을 갖는다. 그러나, 이러한 전략은 매우 생체물질 특이적이었고, 콜라겐의 경우에, 기계적 특성 및 대리로서 원래의 생체물질을 매우 매력적으로 만든 일부 생물학적 특성을 변경하는 알기네이트와 같은 지지 물질의 사용을 빈번히 요구했다.

요약하면, 3-차원 세포 및 조직 구축물의 형성은 아직 완전히 실현되지 않았다. 따라서, 그러한 복합 생물학적 구조의 생성에서 임의의 개선이 매우 바람직할 뿐만 아니라 유익할 것이다.

본원에 공개된 주제는 위에 명시된 필요 중 일부 또는 전부를 만족시키며, 이는 이 문서에 제공된 정보의 연구 후에 통상의 기술자에게 분명해질 것이다.

이 요약은 본원에 공개된 주제의 여러 구현예를 기재하고, 많은 경우에 이들 구현예의 변형 및 치환을 열거한다. 이 요약은 단지 다수의 다양한 구현예의 예시이다. 제시된 구현예의 하나 이상의 대표적 특색의 언급은 마찬가지로 예시적이다. 그러한 구현예는 전형적으로 언급된 특색(들)의 존재 하에 또는 부재 하에 존재할 수 있다; 마찬가지로, 이들 특색은 이 요약에서 열거되었든 또는 열거되지 않았든지 간에 본원에 공개된 주제의 다른 구현예에 적용될 수 있다. 과잉 반복을 피하기 위해서, 이 요약은 그러한 특색의 모든 가능한 조합을 열거 또는 제안하지 않는다.

본원에 공개된 주제의 일부 실시형태에서, 생물학적-관련 물질을 포함하는 스페로이드의 제조 방법이 제공된다. 하나의 실시형태에서, 하나 이상의 생물학적-관련 물질을 포함하는 스페로이드의 제조 방법이 제공되며, 이 방법에서는 현탁액이 첫째로 생성 또는 제공되며, 여기에서 현탁액은 생체적합성 매질 내에 분산된 하나 이상의 생물학적-관련 물질을 포함한다. 그 후 적합한 기재 (substrate) 의 초-소수성 표면 상에 일정량의 친수성 물질이 정의된 영역에 및/또는 정의된 양으로 침적된다. 일부 실시형태에서, 초-소수성 표면 상에 침적된 친수성 물질은 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체로 구성된다. 일부 실시형태에서, 본원에 공개된 주제에 따라 이용되는 초-소수성 표면은 약 150° 초과의 물 접촉각, 예컨대, 일부 실시형태에서, 약 150° 내지 약 170° 의 물 접촉각을 갖는다.

본원에 공개된 주제의 예시적 방법에서 이용되는 특정 친수성 물질 및/또는 초-소수성 표면의 물 접촉각과 무관하게, 현탁액 및 기재가 생성된 후, 현탁액의 소적 (droplet) 이 초-소수성 표면 상에 위치하는 친수성 물질 상에 직접 바이오프린팅 (예를 들어, 다이렉트 라이트 프린팅 (direct write printing)) 되어 그에 의해 생물학적-관련 물질을 포함하는 스페로이드가 생성된다. 현탁액의 바이오프린팅에 후속하여, 결과적인 스페로이드는 그 후 그들의 스페로이드 모양을 유지하면서 생리학적 온도에서 일정 기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원하는 경우에, 스페로이드는 그 후 세포 배양 배지에서 추가로 배양될 수 있다.

본원에 공개된 방법의 일부 실시형태에서, 예시적 스페로이드에 포함된 하나 이상의 생물학적-관련 물질은 자기 비드, 기질 혈관 분획 세포, 줄기 세포, 하나 이상의 관련 세포, 조직 또는 세포의 군, 또는 그들의 조합으로 구성된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 관련 세포, 예컨대 췌장 섬 (islet) 세포와의 조합으로 기질 혈관 분획 세포를 포함하는 스페로이드가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 생물학적-관련 물질은 따라서 기질 혈관 분획 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 생물학적-관련 물질은 하나 이상의 섬 세포를 포함한다.

본원에 공개된 방법에서 이용되는 현탁액을 형성하는데 사용되는 생체적합성 매질에 관하여, 일부 실시형태에서, 생체적합성 매질은 하이드로겔을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 아가로스, 알기네이트, 콜라겐, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체; 실리콘, 다당류, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리우레탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질로 구성된다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 콜라겐 유형 I 로 구성된다.

본원에 공개된 주제의 추가의 특색 및 이점은 이 문헌의 설명, 도면, 및 비제한적 예의 연구 후에 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.

도 1A-1D 는 양쪽친화성 표면 상에 바이오프린팅한 직후의 기질 혈관 분획 (SVF) 함유 (laden) 콜라겐 I 스페로이드를 보여주는 이미지 (도 1A-1C) 및 양쪽친화성 표면 및 콜라겐 I 스페로이드의 횡단면을 보여주는 도해 (도 1D) 를 포함한다.
도 2A-2H 는 다음을 보여주는 이미지를 포함한다: 위상차 현미경관찰에 의해 시각화된 스페로이드 형태 (도 2A 및 2E); 살아 있는 세포 (도 2B 및 2F), 죽은 세포 (도 2C 및 2G) 에 대한 4X 배율에서의 형광 (epifluorescence) 에 의해 시각화된 캡슐화된 SVF 형태; 및 칼세인 AM, 에티디움 호모다이머-1, 및 Hoechst 33258 비스-벤즈이미드를 각각 사용하여 시각화된 세포 분포 (도 2D 및 2H). 스페로이드를 2 일 동안 (도 2A-2D) 및 6 일 동안 (도 2E-2H) 교반 배양으로 배양했다. 도 2H 에서 보여지는 현미경사진은 도 2E-2G 에서 보여지는 것과 상이한 스페로이드로부터 얻어졌다.
도 3 은 제 0 일, 제 2 일, 제 6 일, 제 9 일, 및 제 13 일에 스페로이드 내에서의 세포 생활력을 보여주는 그래프이다.
도 4A-4D 는 교반 배양의 제 2 일 (도 4A), 제 6 일 (도 4B), 제 9 일 (도 4C), 및 제 13 일 (도 4D) 에 SVF 함유 콜라겐 I 스페로이드의 4X 배율 위상차 현미경사진을 보여주는 이미지를 포함한다.
도 5 는 SVF 함유 콜라겐 스페로이드가 교반 배양 인큐베이션의 6 내지 13 일에 유의한 평균 직경 감소를 겪는 것을 보여주는 그래프이다 (n=12). 통계적 유의도는 P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001 에서 확인되었다.
도 6A-6B 는 교반 배양에서 14 일 후에 내피 특이적 렉틴 그리포니아 심플리시폴리아, GS-1 (녹색), 알파 평활근 세포 액틴, (α-SMA) (적색), 및 핵 염색제, RedDot (청색) 으로 염색된 SVF 함유 콜라겐 I 스페로이드의 10X 배율 공초점 현미경사진을 보여주는 이미지를 포함한다. 관 유사 구조가 화살표로 강조표시되어 있다. 도 6B 는 도 6A 에서 보여지는 정상 뷰 (top view) 에 비해 대략 20° 관점 이동을 보여준다.
도 7A-7B 는 3D 바이오프린팅 시스템, 및 초소수성 표면을 사용하여 사전혈관형성된 섬 이식편을 생성하는 실행가능성을 보여주는 바이오프린팅된 인간 지방질 SVF/섬 스페로이드를 보여주는 이미지를 포함한다. 도 7A 는 프린팅 및 중합 직후의 SVF/섬 스페로이드를 보여주는 위상차 이미지이다. 도 7B 는 7 일 SVF/섬 스페로이드를 보여주는 스페로이드의 이미지이다. 스페로이드는 배양 동안 수축을 겪는다. 축척 막대 = 500 미크론.
도 8 은 당뇨병 동물 모델에서 고혈당증을 치료하는 섬/SVF 스페로이드의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 9A-9G 는 SVF 스페로이드의 위상차 및 공초점 현미경관찰 이미지를 포함한다. 도 9A 는 스페로이드 내의 SVF 세포 분포를 보여주는 배양 11 일 후의 위상차 이미지이다. 막대 = 100 미크론. 도 9B 는 수축의 개시를 보여주는 배양에서 12 일 후의 위상차 이미지이다. 막대 = 100 미크론. 도 9C 는 배양에서 8 일 후의 위상차 이미지이다. 막대 = 50 미크론. 도 9D 는 제 8 일 스페로이드에 비해 더 광범위한 분지 형성을 보여주는 배양에서 11 일 후의 위상차 이미지이다. 막대 = 50 미크론. 도 9E 는 내피 특이적 렉틴 그리포니아 심플리시폴리아, GS-1 (녹색), 알파 평활근 세포 액틴, (α-SMA) (적색), 및 핵 염색제, RedDot (청색) 으로 염색된 14 일 후의 SVF 함유 콜라겐 I 스페로이드의 공초점 현미경 이미지이다. 막대 = 100 미크론. 도 9F 및 9G 는 화살표로 경계표시되어 있는 분지 구조를 보여주는 GS-1 및 α-SMA 로 동시-표지된 도 6E 에서의 혈관 유사 구조의 2 개의 더 높은 배율 관점이다. 막대 = 50 미크론.

예시적 구현예의 설명

본원에 공개된 주제의 하나 이상의 구현예의 세부사항이 이 문헌에 제시되어 있다. 이 문헌에 기재된 구현예 및 기타 구현예에 대한 수정은 이 문헌에 제공된 정보의 연구 후에 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이 문헌에 제공된 정보, 및 특히 기재된 예시적 구현예의 구체적 세부사항은 주로 이해의 명확을 위해 제공되고, 불필요한 제한이 그로부터 이해되지 않을 것이다. 충돌의 경우에, 정의를 포함하는, 이 문헌의 설명이 지배할 것이다.

본원에서 사용되는 용어는 통상의 기술자에 의해 잘 이해될 것으로 여겨지지만, 특정 정의가 본원에 공개된 주제의 설명을 용이하게 하기 위해서 제시되어 있다.

다르게 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명(들)이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

본원에서 전체 공개를 통하여 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 공보, GenBank 서열, 데이타베이스, 웹사이트 및 기타 공개된 물질은, 다르게 언급되지 않으면, 그 전문이 참조로 포함된다.

URL 또는 기타 그러한 식별자 또는 주소가 언급되는 경우에, 그러한 식별자는 변화할 수 있고 인터넷 상의 특정 정보는 잠깐 있다가 없어질 수 있으나, 인터넷을 검색하여 대등한 정보가 발견될 수 있다는 것이 이해된다. 그에 대한 언급은 그러한 정보의 입수가능성 및 공중의 보급을 입증한다.

본원에 기재된 것과 유사한 또는 대등한 임의의 방법, 장치, 및 물질이 본원에 공개된 주제의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 대표적 방법, 장치, 및 물질이 본원에 기재된다.

본 출원은 본 발명의 성분 뿐만 아니라 본원에 기재된 기타 구성성분 또는 요소를 "포함하거나" (개방형) 또는 그것으로 "본질적으로 이루어질 수 있다". 본원에서 사용되는, "포함하는" 은 개방형이고, 언급된 요소, 또는 구조 또는 기능에서의 그의 등가물, 및 언급되지 않은 임의의 기타 요소 또는 요소들을 의미한다. 용어 "갖는" 및 "포함하는" 은 또한 문맥이 다르게 시사하지 않는 한 개방형으로 해석될 것이다.

오래된 특허법 관습에 따르면, 용어 "하나", "한", 및 "그" 는 청구항을 포함하여 이 출원에서 사용될 때 "하나 이상" 을 언급한다. 따라서, 예를 들어, "세포" 에 대한 언급은 복수의 그러한 세포를 포함하는 것 등이다.

다르게 명시되지 않으면, 명세서 및 청구항에서 사용되는 구성성분의 양, 특성 예컨대 반응 조건 등을 포현하는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약" 에 의해 수식되는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 반대로 명시되지 않으면, 이 명세서 및 청구항에서 제시된 수치 파라미터는 본원에 공개된 주제에 의해 얻어지는 것이 추구되는 요망되는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다.

본원에서 사용되는, 값 또는 질량, 중량, 시간, 부피, 농도 또는 백분율을 언급할 때 용어 "약" 은 명시된 양으로부터 일부 구현예에서 ±20%, 일부 구현예에서 ±10%, 일부 구현예에서 ±5%, 일부 구현예에서 ±1%, 일부 구현예에서 ±0.5%, 및 일부 구현예에서 ±0.1% 의 편차를 망라하는 것으로 의미되며, 그러한 편차는 공개된 방법을 수행하는데 적당하다.

본원에서 사용되는, 범위는 "약" 하나의 특정 값, 및/또는 내지 "약" 또다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 다수의 값이 본원에 공개되어 있고, 각각의 값은 또한 그 값 자체에 더하여 "약" 그 특정 값으로서 본원에서 공개된다는 것이 또한 이해된다. 예를 들어, 값 "10" 이 공개되는 경우에, 그 때 "약 10" 이 또한 공개된다. 두 개의 특정 단위 사이의 각각의 단위가 또한 공개된다는 것이 또한 이해된다. 예를 들어, 10 및 15 가 공개되는 경우에, 그 때 11, 12, 13, 및 14 가 또한 공개된다.

본원에서 사용되는, "임의적" 또는 "임의로" 는 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는다는 것 및 설명이 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의로 변이형 부분은 그 부분이 변이형 또는 비-변이형이라는 것을 의미한다.

본원에 공개된 주제는 콜라겐 I 겔 중 기질 혈관 분획 (SVF) 함유 스페로이드를 포함하는, 생물학적-관련 물질을 포함하는 스페로이드의 자동화된 생성을 지지하는 초-소수성 표면을 갖는 기재와의 조합으로 3-차원 (3D) 바이오프린팅 기술이 이용될 수 있다는 발견에, 적어도 부분적으로, 기반한다. 벌크 콜라겐 겔의 이용에서 제한 인자는 이식 전 및 동안의 취급성이다. 액체로부터 가교된 하이드로겔로의, 콜라겐 I 중합은 전형적으로 모양-홀더 예컨대 멀티-웰 플레이트 내에서 일어난다. 그러한 중합된 구축물은 그 후 전형적으로 제거되고 멸균 장비로 수동으로 취급된다. 그러나, 취급성, 및 임의의 잠재적 후속적 겔 손상은 매우 조절하기 어렵다. 게다가, 콜라겐 겔은 일부 탄성을 갖지만, 생체내 적용은 일반적으로 불규칙적인 모양을 필요로 하므로, 벌크 겔을 강제하여 절편으로 절단되게 하거나 유의한 변형 하에 놓여지게 하여 필요한 모양에 맞추는 것을 요구한다. 임의의 특정 메카니즘 이론에 구속되는 것을 바라지 않으면서, 이러한 문제는 콜라겐 겔을 작은 스페로이드로 단위화함으로써 완화될 수 있다고 여겨졌고, 또한 그러한 콜라겐 스페로이드는 유체 현탁액에서의 단순화된 취급성의 유익을 갖고 세포 현탁액 주입 단독과 비교할 때 우수한 방식으로 생체내 적용 요건에 맞는 정확한 공간 및 도우징 (dosing) 제어를 허용한다고 여겨졌다.

본원에 공개된 주제의 일부 실시형태에서, 스페로이드의 제조 방법이 따라서 제공된다. 일부 실시형태에서, 스페로이드의 제조 방법이 제공되며, 이 방법에서는 친수성 물질이 첫째로 기재의 표면 상의 정의된 영역 상에 놓여지고, 기재의 표면은 초-소수성이다. 하나 이상의 생물학적-관련 물질이 그 후 생체적합성 매질 내에 현탁되어 현탁액을 생성하고, 현탁액의 소적이 친수성 물질 상에 바이오-프린팅된다. 예를 들어, 바이오프린팅의 형태로서 다이렉트-라이트 (direct-write) 프린팅을 이용하는, 본원에 공개된 주제의 스페로이드의 제조 방법의 하나의 예시적 실시형태에서, 독립적 X- 및 Y-축 번역을 허용할 뿐만 아니라 하나 이상의 번역 프린트 헤드/분배 시스템의 Z-축 이동을 허용하는, 컴퓨터-제어되는 스테이지를 사용하는 BioArchitecture Tool (BAT; 참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,857,756; 참고, 또한 Smith, et al., Tissue Eng. 2004; 10:1566-1576, 상기 문헌 둘 모두는 참조로 본원에 포함됨) 이 이용된다. 이와 관련하여, 바이오프린팅 파라미터는 첫째로 프린팅 명령으로서 스크립트되고 그 후 프린팅 툴에 업로드될 수 있으며, 그에 따라 프린팅 툴 (즉, BAT) 이 사용되어 현탁액을 함유하는 정확한 구조를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 그러한 프린팅 툴을 사용함으로써, 소적을 프린팅하는데 사용되는 펜의 크기를 제어함으로써 및 소적이 펜으로부터 압출되는 압력을 제어함으로써 그러한 시스템에 의해 프린팅되는 소적의 크기가 제어될 수 있다. 일부 구현예에서, 약 15 게이지 펜 내지 약 25 게이지 펜 및 약 2 psi 내지 약 7 psi 의 압력이 사용되어 직경 약 .2 ㎜ 내지 약 5 ㎜ 의 크기를 갖는, 아래 상세히 기재된 소적, 또는 결과적인 스페로이드를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 소적, 또는 결과적인 스페로이드는 약 1 ㎜ 내지 약 5 ㎜, 약 2 ㎜ 내지 약 4 ㎜, 또는 약 3 ㎜ 내지 약 4 ㎜ 의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 소적 또는 스페로이드의 크기는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 파라미터를 조정함으로써 제어된다: 현탁액의 점도, 전달 펜 팁의 크기, 전달 펜으로부터 현탁액을 압출하는데 사용되는 압력, 및 전달 펜 내의 현탁액에 가해지는 시간 압력의 양. 그러한 파라미터는 통상의 기술자에 의해 용이하게 조정되어 요망되는 크기를 갖는 소적 또는 스페로이드를 생성할 수 있다.

하나 이상의 생물학적-관련 물질을 포함하는 스페로이드의 제조 방법의 하나의 예시적 실시형태로서, 스페로이드는 첫째로 중공 바늘 또는 관 유사 구조로 구성되는 전달 펜 내에, 세포 현탁액 (예를 들어, 콜라겐 유형 I 중에 혼합된 인간 기질 혈관 분획 세포 집단으로 구성되는 세포 현탁액) 형태의 현탁액을 위치시킴으로써 생성된다. 전달 펜으로부터 생물학적 현탁액의 압출은 그 후 전달 펜 내의 압력을 특정 값으로 증가시키고, 그에 의해 소적이 형성되는 것을 야기함으로써 제어된다. 전달 펜은 그 후 기재의 초소수성 표면 상에 위치하는 친수성 물질을 향하여 예정된 속도 (예를 들어, 5 ㎜/초) 로 하강된다. 친수성 물질과 접촉한 후에, 현탁된 소적은 후속적으로 친수성 물질에게로 끌어당겨지고 펜으로부터 방출되어 그에 의해 초-소수성 표면 상의 친수성 영역 위에 스페로이드를 형성한다. 일부 실시형태에서, 현탁액의 바이오프린팅에 후속적으로, 결과적인 스페로이드는 그 후 생리학적 온도 (예를 들어, 37 ℃) 에서 일정 기간, 예컨대 이용되는 생물학적 매질을 중합하는데 충분한 시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원하는 경우에, 스페로이드는 그 후 세포 배양 배지에서 추가로 배양될 수 있다.

용어 "현탁액" 은 본원에서 생체적합성 매질 내에 분산된, 자기 입자, 세포, 조직, 단백질 등을 포함하여, 생물학적-관련 물질을 포함하는 조성물을 언급하는데 사용된다. 본원에 공개된 주제에 따라 사용하기에 적합한 생체적합성 매질은 전형적으로 실온 (예를 들어, 25 ℃) 에서 겔, 반고체, 또는 액체, 예컨대 저-점도 액체인 임의의 생체적합성 물질로부터 형성될 수 있고, 세포, 조직, 단백질, 및 기타 관심의 생물학적 물질을 위한 3-차원 기재로서 사용될 수 있다. 본원에 공개된 주제에 따라 생체적합성 매질을 형성하는데 사용될 수 있는 예시적 물질은, 콜라겐, 피브린, 키토산, MATRIGEL™ (BD Biosciences, San Jose, CA), 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 예를 들어 화학적으로-가교가능한 또는 광-가교가능한 덱스트란 등, 뿐만 아니라 전자회전 생물학적, 합성, 또는 생물학적-합성 블렌드를 포함하는 중합체 및 하이드로겔을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 생체적합성 매질은 내피화를 지지하는 물질로 구성된다. 참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,744,515 및 7,220,276 (상기 문헌 둘 모두는 참조로 본원에 포함됨). 일부 실시형태에서, 생체적합성 매질은 하이드로겔로 구성된다.

용어 "하이드로겔" 은 본원에서, 물이 분산 매질로서 작용하고 중합체 사슬 사이의 공간을 채우는, 중합체 사슬의 3-차원 네트워크를 포함하는 2- 또는 멀티-성분 겔을 언급하는데 사용된다. 본원에 공개된 주제에 따라 사용되는 하이드로겔은 일반적으로, 사용될 프린팅 파라미터 뿐만 아니라 구조에 위치될 생물학적 현탁액 내로 통합되는 생물학적 물질 (예를 들어, 세포) 의 거동 및 활성에 대해 선택된 하이드로겔이 가질 효과를 고려하여, 구조의 의도되는 용도에 기반하여 특정 적용 (예를 들어, 특정 스페로이드) 을 위해 선택된다. 본원에 공개된 주제의 예시적 하이드로겔은 하기를 포함하나 그에 제한되지 않는 중합체성 물질로 구성될 수 있다: 알기네이트, 콜라겐 (콜라겐 유형 I 및 VI 을 포함), 피브리노겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브리넥틴, 프로테오글리칸, 당단백질, 폴리락티드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리카프로락톤, 폴리콜리드, 폴리디옥사논, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리술폰, 펩티드 서열, 단백질 및 유도체, 올리고펩티드, 겔라틴, 엘라스틴, 피브린, 라미닌, 폴리메타크릴레이트, 폴리아세테이트, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리안하이드라이드, 폴리아미노산 탄수화물, 다당류 및 개질된 다당류, 및 그의 유도체 및 공중합체 뿐만 아니라 무기 물질 예컨대 유리 예컨대 생체활성 유리, 세라믹, 실리카, 알루미나, 방해석, 히드록시아파타이트, 칼슘 포스페이트, 본 (bone), 및 상기 모두의 조합. 본원에 공개된 주제의 하이드로겔을 구성할 수 있는 물질에 관한 추가의 정보에 관하여, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,919,11, 6,991,652 및 6,969,480 (이들 각각은 참조로 본원에 포함됨) 을 참고한다.

스페로이드를 생성하는데 사용되는 하이드로겔에 관하여, 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 아가로스, 알기네이트, 콜라겐 유형 I, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 (예를 들어, Pluronic® F127 (BASF Corporation, Mount O살아 있는, NJ)), 실리콘, 다당류, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리우레탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질로 구성된다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 알기네이트로 구성된다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 콜라겐 유형 I 로 구성된다.

이제 예시적 현탁액에 포함되고 본원에 공개된 주제에 따라 사용되는 생물학적-관련 물질에 관하여, 구절 "생물학적-관련 물질" 은 본원에 정의된 바와 같은 생체적합성 매질에 포함되고 후속적으로 생물학적 시스템과 상호작용 및/또는 그에 영향을 미칠 수 있는 물질을 기술하는데 본원에서 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 생물학적-관련 물질은 자기 비드 (즉, 그 자체로 자성이거나 또는 자기장에 반응하는 물질, 예컨대 철 입자를 함유하는 비드) 이며, 상기 자기 비드는 하이드로겔과 조합된 후 하이드로겔과 함께 바이오프린팅되어 정의된 크기를 갖는 스페로이드를 생성할 수 있고, 상기 스페로이드는 기기의 보정에서 또는 세포 및 조직의 분리 및 정제를 위해 통상의 기술자에게 알려진 방법에 따라 사용될 수 있다. 또다른 예로서, 기타 실시형태에서, 생물학적-관련 물질은 하나 이상의 세포 및 조직을 포함하며, 그에 따라 세포 또는 조직과 적당한 생체적합성 매질과의 조합으로 세포 또는 조직 현탁액의 형성을 초래한다. 일부 실시형태에서, 생물학적-관련 물질은 기질 혈관 분획 세포, 줄기 세포, 하나 이상의 관련 세포, 또는 그들의 조합으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 생물학적-관련 물질은 기질 혈관 분획 세포로 구성된다.

본원에 공개된 주제의 방법에 따라 사용되는 기질 혈관 분획 세포에 관하여, 기질 혈관 분획 세포는 전형적으로 대상체로부터 수득된 일정량의 지방질 조직을 효소적으로 소화시키고, 그에 뒤이어 원심분리에 의해 지방질 조직의 기질 혈관 분획을 펠렛화하여 얻어지는 세포이다. 이와 관련하여, 기질 혈관 분획은 다수의 세포 유형, 예를 들어 내피 세포, 평활근 세포, 혈관주위세포, 지방전구세포, 간엽 줄기 세포 (MSC), 내피 선조 세포, T 세포, B 세포, 비만 세포, 및 지방질 조직 마크로파지, 뿐만 아니라 기질 혈관 분획 내에서 발견되는 작은 혈관 또는 미세혈관 분절을 함유한다. 지방질 조직의 해리로 기질 혈관 분획을 생성하는 것에 관한 추가의 설명 및 안내에 관해, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,820,626 (이의 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨) 을 참고한다. 일부 구현예에서, 지방질 조직의 불완전 소화가 또한 사용되어 지방질 미세혈관 분절을 산출할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,029,838 (이는 또한 참조로 본원에 포함됨) 을 참고한다.

본 발명의 방법에 따라 이용될 수 있는 줄기 세포에 관하여, 본원에서 사용되는, 용어 "줄기 세포" 는 전통적 줄기 세포, 선조 세포, 전선조 세포, 전구 세포, 예비 세포 등을 광범위하게 언급한다. 예시적 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 근육 전구 줄기 세포, 내피 선조 세포, 골수 줄기 세포, 연골발생 줄기 세포, 림프계 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중추 신경계 줄기 세포, 말초 신경계 줄기 세포 등을 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 줄기 세포, 및 그의 단리 및 배양 방법의 설명은, 특히, Embryonic Stem Cells, Methods and Protocols, Turksen, ed., Humana Press, 2002; Weisman et al., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 17:387-403; Pittinger et al., Science, 284:143-47, 1999; Animal Cell Culture, Masters, ed., Oxford University Press, 2000; Jackson et al., PNAS 96(25):14482-86, 1999; Zuk et al., Tissue Engineering, 7:211-228, 2001; 및 미국 특허 번호 5,559,022, 5,672,346 및 5,827,735 에서 찾을 수 있다. 기질 세포, 및 그의 단리 및 배양 방법의 설명은, 특히, Prockop, Science, 276:71-74, 1997; Theise et al., Hepatology, 31:235-40, 2000; Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino et al., eds., John Wiley & Sons, 2000; 및 미국 특허 번호 4,963,489 에서 찾을 수 있다. 조직 구축물에 포함시키기 위해 선택되는 줄기 세포 및/또는 기질 세포는 전형적으로 그러한 세포가 특정 구축물의 의도되는 용도에 적당한 경우에 선택된다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

마지막으로, 본 발명의 방법에 따라 이용될 수 있는 관련 세포에 관하여, 본원에서 사용되는 용어 "관련 세포 (relevant cell)" 는, 그 스페로이드의 의도되는 용도에 기초하여, 본원에 공개된 주제의 스페로이드 내로 통합되기에 적당한 세포를 언급한다. 일부 구현예에서, 용어 "관련 세포" 는 용어 "재생 세포" 와 호환되게 사용될 수 있으며, 이는 본원에 기재된 관련 세포가 이식 후에 기능적 조직을 형성하는 능력을 갖기 때문이다. 예를 들어, 특정 손상된 조직 또는 기관의 복구, 재구성, 또는 재증식에 적당한 관련 세포는 전형적으로 그 조직 또는 기관에서 통상적으로 발견되는 세포 또는 세포의 군을 포함할 것이다. 이와 관련하여, 본원에 공개된 주제의 스페로이드 내로 통합될 수 있는 예시적 관련 세포는 뉴런, 심장근육세포, 근육세포, 혈관 및/또는 위장 평활근 세포, 연골세포, 췌장 선포 세포, 랑게르한스섬, 섬 베타 세포, 골세포, 간세포, 쿠퍼 세포, 섬유아세포, 근아세포, 위성 세포, 내피 세포, 지방세포, 지방전구세포, 담즙 상피 세포 등을 포함한다. 이들 유형의 세포는 단리되고 즉시 사용되거나 또는 당해 기술분야에 알려진 종래의 기술에 의해 배양에 적용될 수 있다. 예시적 기술은 특히 Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques, 4th ed., Wiley Liss, John Wiley & Sons, 2000; Basic Cell Culture: A Practical Approach, Davis, ed., Oxford University Press, 2002; Animal Cell Culture: A Practical Approach, Masters, ed., 2000; 및 미국 특허 번호 5,516,681 및 5,559,022 에서 찾을 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적-관련 세포는 췌장 섬 세포 (예를 들어, 베타 세포) 또는 전체 무손상 섬 (islet) 을 포함한다.

위에 명시된 바와 같이, 본원에 공개된 주제에 따른 생체적합성 매질과 조합되는 생물학적-관련 물질의 특정 유형과 무관하게, 생물학적-관련 물질이 생체적합성 매질과 조합되면, 결과적인 현탁액의 소적은 그 후 초소수성 표면 상에 위치하는 친수성 물질 상에 바이오프린팅된다. 이와 관련하여, 현탁액이 실온에 도달할 때, 현탁액은 전형적으로 겔화하고 더욱 안정적인 기하구조를 갖는 스페로이드를 형성할 것이다. 그러나, 위에서 언급된 바와 같이, 압출 후에 그러나 중합 또는 겔화 전에 소적 또는 스페로이드의 기하구조를 유지하기 위해서, 본원에 공개된 방법은 초-소수성 표면을 갖는 기재를 사용한다.

용어 "초-소수성" 은 본원에서 물에 대해 최소 인력을 나타내는 기재를 언급하는데 사용된다. 초-소수성 표면은 전형적으로 연 효과 예컨대 물 소적이, 예를 들어, 연 또는 타로 잎과 접촉될 때 발생하는 효과를 나타낸다. 물 소적의 형성을 지지하는 초-소수성 표면의 다른 자연 발생적 예는, 예를 들어, 나미브 사막에서 발견되는, 나미브사막 풍뎅이 (스테노카라 그라실리페스 (Stenocara gracilipes)) 에서 찾을 수 있다. 이와 관련하여, 그러한 초-소수성 기재 또는 표면은 전형적으로 약 150° 초과의 물 접촉각, 또는 액체를 통해 측정할 때 액체 또는 증기 경계면이 고체 표면을 만나는 각도를 가질 것이다. 일부 실시형태에서, 본원에서 사용되는 초-소수성 표면은 150° 초과의 물 접촉각을 갖는다. 일부 실시형태에서, 예시적 초-소수성 표면의 물 접촉각은 약 150° 내지 약 170° 이다. 그러한 물 접촉각을 갖는 다수의 초-소수성 표면이 통상의 기술자에게 알려져 있고, 이용되는 특정 기재의 결과로서 또는 기재에 적용되는 코팅의 결과로서 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 초-소수성 표면은 적합한 기재 상에 발수성 코팅, 예컨대 NEVERWET™ (Rust Oleum, Vernon Hills, IL) 을 분무함으로써 생성될 수 있다. 초-소수성 표면 코팅의 추가의 예는 실리카, 산화망간 폴리스티렌 (MnO₂/PS), 산화아연 폴리스티렌 (ZnO/PS), 침강 칼슘 카르보네이트, 퍼플루오로부탄술폰산, 탄소 나노튜브 구조, 파라핀, 폴리테트라플루오로에틸렌, 왁스 등을 포함하나, 그에 제한되지 않는다.

위에서 또한 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 일정량의 친수성 물질, 즉, 물에 대해 증가된 친화도를 갖고 전형적으로 약 90° 미만의 물 접촉각을 갖는 물질이 소수성 표면의 정의된 영역 상에 배치된다. 친수성 물질의 양 및 친수성 물질이 배치되는 면적은, 물론, 생성되는 스페로이드에 따라 다를 수 있다. 일부 실시형태에서, 그러나, 약 2 ㎕ 내지 약 5 ㎕ 의 친수성 물질이 소수성 표면 상에 배치되어, 스페로이드가 프린팅 펜에 부착된 채로 남기 보다는 초-소수성 표면에 부착되는 것을 보장한다. 일부 실시형태에서, 양친매성 블록 구조를 갖는 블록 공중합체, 예컨대 Pluronic® F127 이 이용될 수 있으며, 이는 그러한 공중합체가 친수성 및 소수성 둘 모두이고, 따라서 소수성 표면 및 수성 생체적합성 배지, 예컨대 콜라겐 둘 모두에 부착할 수 있기 때문이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 기타 친수성 물질은 기타 공중합체 예컨대 P 188, 뿐만 아니라 기타 물질 예컨대 우레탄 및 실란을 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 스페로이드의 형성에서 유용한 친수성 물질은 스페로이드의 제거를 허용하는 가역적인 부착 특성을 제공한다. 그러한 가역성은, 특히, 온도 변화 또는 스페로이드의 수성 상 중 친수성 물질의 가용화에 의해 야기될 수 있다.

본원에 공개된 주제의 일부 구현예에서, 추가로 제공되는 것은 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 스페로이드이다. 임의의 특정 이론 또는 메카니즘에 구속되는 것을 바라지 않으면서, 그러한 스페로이드는 하기로서 유리하다고 여겨진다: 약물을 스크리닝하기 위한 혈관형성 및 혈관형성의 시험관내 어세이; 허혈 조직에 새로운 혈류를 제공하기 위해 환자 내로 이식될 수 있는 장치 (스페로이드); 및 지방질 유래의 줄기 및 재생 세포를 사용하여 구축될 수 있고 간 세포, 근육 세포, 지방 세포, 췌장 세포 예를 들어 섬, 뇌 세포, 생식 세포, 간 세포 등을 포함하는 기타 실질 세포를 통합시키는 장치 (스페로이드). 게다가, 본원에 공개된 스페로이드 및 방법은 물질을 조직 배양에 적용할 필요 없이 및 안정적 스페로이드의 형성을 지지하는 기타 첨가제 (예를 들어, 알기네이트) 를 이용할 필요 없이 형성되고 즉시 이식될 수 있는 장치의 생산을 허용하는 것으로 여겨진다. 또한 본원에 기재된 스페로이드는 시험관내 혈관 형성을 지지하는 것으로 여겨진다.

본원에 공개된 주제의 실시는, 다르게 명시되지 않으면, 통상의 기술에 속하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자도입 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래의 기술을 이용할 수 있다. 그러한 기술은 문헌에 의해 완전히 설명된다. 참고, 예를 들어, Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapters 16 and 17; 미국 특허 번호 4,683,195; DNA Cloning, Volumes I and II, Glover, ed., 1985; Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait, ed., 1984; Nucleic Acid Hybridization, D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984; Transcription and Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984; Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, 1986; Perbal (1984), A Practical Guide To Molecular Cloning; 참고, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1987; Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu et al., eds., Academic Press Inc., N.Y.; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987; Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986.

본원에 공개된 주제는 하기 구체적 그러나 비제한적 실시예에 의해 추가로 설명된다. 하기 실시예는 본 발명과 관련된 개발 및 실험의 과정 동안 다양한 시점에 수집된 데이타의 편집을 포함할 수 있다.

실시예

실시예 1 - 3D 바이오프린터 및 초소수성 표면을 사용하는 지방질 기질 혈관 분획 세포 함유 스페로이드의 형성.

물질 및 방법.

초소수성 표면의 제작. NEVERWET™ (Rust Oleum, Vernon Hills, IL) 의 2-단계 에어로졸 적용을 사용하여 폴리스티렌 48 멀티-웰 플레이트 (Corning, Corning, NY) 및 35 ㎜ 페트리 접시 상에 초소수성 표면을 형성했다. 첫번째 단계는 베이스 코트로서 표면에 결합제를 적용하는 단계이며, 베이스 코트는 실온에서 적어도 1 시간 동안 공기 건조된다. 이에 뒤이어 헥사메틸디실라잔으로 개질된 폴리디메틸실록산으로 구성되는 상부 시트를 적용하여 초소수성 층을 형성한다. 초소수성 층 두께는 0.07 ㎜ 인 것으로 측정되었다. 상부 시트를 후속적으로 실온에서 추가의 시간 동안 공기 건조시켰다. NEVERWET™ 는 165° 의 보고된 접촉각을 가졌고, 표면은 접촉각 150° 초과에서 초소수성으로 여겨졌다. 용액 중 물 및 미중합 (unpolymerized) 콜라겐 둘 모두의 접촉각은 측면 뷰 사진 및 후속적인 ImageJ 에서의 접촉각 측정을 통해 측정했다.

친수성 스팟 (Spot) 의 생성. 3D 바이오프린터 (Bio-Assembly Tool (BAT) 3-D 프린터; nScrypt, Inc., Orlando, FL) 를 사용하여 Pluronic F-127 (Sigma, St. Louis, MO) 을 압출하여 초소수성 표면 상에 친수성 스팟을 생성했다. 각각의 친수성 스팟에 대해, BAT 는 1X 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 3.8% (wt/wt) Pluronic F-127 의 목표 부피 2 ㎕ 를 압출했다. BAT 시간-압력 압출 시스템의 경우에, 이는 목표 부피를 분배하기에 적당한 압출력을 생성하기 위해 25G 바늘을 통해 100 ms 의 노출 시간과 2.5 PSI 를 요구하여 했다. 이들 스팟을 그 후 사용 전에 30 분 동안 공기 건조되게 했다.

기질 혈관 분획 (SVF) 세포. 이전에 공개된 효소 기반 방법에 따라 랫트 부고환 지방 패드로부터 SVF 세포를 단리했다. 모든 동물 연구를 University of Louisville, Louisville, KY 로부터의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) 승인 하에 수행했다. 간략히, 멸균 수술 절차 하에 랫트 부고환 지방 패드로부터 지방 샘플을 얻고, 3 분 동안 수동으로 다지고, 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA) 을 함유하는 PBS 로 세정하고, 2 ㎎/㎖ 유형 IV 콜라게나제 (Worthington Biochemical Company, Freehold, NJ) 에 현탁시켰다. 35 분 동안 37℃ 에서 엔비로-제니 (enviro-genie) (Scientific Industries, Bohemia, NY) 를 사용하여 지방을 소화시켰다. 지방세포로부터 원심분리 (4 분 동안 350 x g) 에 의해 SVF 세포를 분리한 후, 상청액을 폐기했다. 펠렛을 PBS 로 2 회 세정하고, 250 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 스페로이드 바이오프린팅에 즉시 사용될 내피 세포 배지에 재현탁시켰다.

SVF 함유 콜라겐 스페로이드 제작. 새롭게 단리된 SVF 을 7.4 의 최종 pH 로 적정된 1X 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (Sigma, St. Louis, MO) 와 혼합된 미중합 랫트 꼬리 콜라겐 I 에 현탁시켜 1.6 x 10⁵ SVF 세포/㎖ (최종 용액의 ㎖) 를 함유하는 3 ㎎/㎖ 콜라겐의 혼합물을 생성했다. 이 혼합물을 프린팅 전까지 4℃ 에서 유지하고, 바이오프린터 상의 냉매 시스템을 사용하여 프린팅 과정 동안 내내 동등한 온도를 유지하여 겔 중합을 방지했다. SVF-콜라겐 용액을 3 cc 프린팅 주사기 (EFD, Nordson, Westlake, OH) 에 옮기고, 3D 바이오프린터 (nScrypt, Inc., Orlando, FL) 에 배치했다. 초기 프린팅 조건은 연속 실린더 프린팅에 관한 이전에 공개된 데이타에 기초했다. 스페로이드가 프린팅된 후에 스페로이드를 37℃ 에서 조직 배양 인큐베이터 (5% CO₂) 에서 10 분 동안 인큐베이션하여 콜라겐 겔 중합을 개시했다.

스페로이드 배양 방법. 제작 후에, 스페로이드를 DMEM, 10% FBS, 5 mM HEPES 완충제, 2 mM L-글루타민, 헤파린을 함유하는 내피 성장 보충물, 페니실린 (45 U/㎖), 및 스트렙토마이신 (45 ㎍/㎖) 으로 구성된 내피 세포 성장 배지를 함유하는 세포 현탁 배양을 위한 교반 플라스크 (125-㎖ MagnaFlex Microcarrier Spinner Flask, Wheaton Industries, Millville, NJ) 에 옮겼다.

교반 플라스크를 자기 교반기 플랫폼 (MCS 104-L 생물학적 교반기, Techne Inc., Burlington, NJ) 상에 배치하여 스페로이드의 연속 현탁액을 제공하고, 배양 기간 (14 일) 동안 내내 자기 임펠러 속도를 40 rpm 으로 설정했다. 분석에 요구되는 스페로이드를 50 ㎖ 혈청학적 피펫을 통해 제거했다. 스페로이드 수축 연구를 위해, 개별 스페로이드를 96-웰 초저 부착 플레이트 (Corning, Corning, NY) 의 별개의 웰에 플레이팅했다.

스페로이드 크기 측정. 96-웰 플레이트에서 배양된 스페로이드의 광학 현미경관찰 (CKX41, Olympus, Tokyo, Japan) 을 통해 얻은 이미지로부터 스페로이드 크기 측정값을 산출했다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이들 4X 이미지의 직경 측정값을 얻었다.

생사 어세이 (Live Dead Assay). 생/사 형광 염색제 (Live/Dead Viability/Toxicity Kit, Life Technologies Inc., Carlsbad, CA) 를 사용하여 SVF 생활력을 평가했다. 스페로이드를 PBS 로 세정하고, 10 μM 칼세인 AM (생) 및 10 μM 에티디움 호모다이머-1 (사) 과 함께 실온에서 45 분 동안 인큐베이션하고, 형광 (epifluorescent) 현미경관찰 (IX71, Olympus, Tokyo, Japan) 을 통해 이미지화했다. 이미지를 4X 배율로 캡처했다. 생성된 스페로이드에서의 세포의 생활력을 정량화하기 위해서, SVF 세포를 단리하고, 생활력을 뉴클레오카운터를 사용하여 측정하고, 생 및 사 표준 곡선을 생성하는데 사용했다. 생성된 표준 곡선에 기초하여, 생활력을 제 0 일, 제 2 일, 제 6 일, 제 9 일, 및 제 13 일에 측정했다. 생/사 키트를 보충하기 위해, 15 분의 0.1% Triton-X100 (Sigma, St Louis, MO) 투과화 후에 Hoechst 33258 비스-벤즈이미드 핵 염색제 (Anaspec, CA) 로 세포의 분포를 평가했다.

공초점 현미경관찰. 시험관내 혈관형성 분석을 위해, 스페로이드 샘플을 MPE FluoView1000 공초점 현미경을 사용하여 10X 수침 대물렌즈 (Olympus, Tokyo, Japan) 를 이용하여 이미지화했다. 공초점 이미지 스택 (stack) 을 AMIRA 3D 시각화 소프트웨어 (Thermo, Waltham, MA) 에서 재구성하고, z-축 투사로서 디스플레이했다. 이미지화 전에, 스페로이드를 4% 파라포름알데히드로 10 분 동안 실온에서 고정하고, 그 후 0.1% Triton X-100 으로 15 분 동안 실온에서 (Sigma, St Louis, MO) 투과화했다. 투과화 후에, 스페로이드를 1:500 의 희석률로 FITC (GS-1) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 에 접합된 그리포니아 심플리시폴리아-1 이소렉틴 4 로 염색했다. 수반하여, 마우스 모노클로날 α-평활근 액틴 일차 항체를 1:250 (α-SMA) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) 로 첨가했다. 스페로이드를 밤새 4℃ 에서 인큐베이션했다. 다음 날, 스페로이드를 PBS 로 3 회 세정하고, 2 시간 동안 실온에서 각각 1:200 및 1:1000 희석률로 RedDot 핵 염색제 (Biotium, Fremont, CA) 및 염소 항-마우스 IgG Alexa Fluor 594 이차 항체 (Thermo Fisher, Waltham, MA) 와 함께 인큐베이션했다. 샘플을 후속적으로 PBS 로 세정하고, 앞서 언급한 바와 같이 이미지화했다. 내피 성분을 GS-1 FITC 로 녹색으로 염색했다. 혈관주위 지지 세포 뿐만 아니라 섬유모세포 성분을 Alexa Fluor 594 에 접합된 α-SMA 로 적색으로 염색하고, 핵을 RedDot 로 염색하여 청색으로 인공 채색했다.

통계적 분석. 원 웨이 ANOVA 와 던네트 다중 비교 사후 시험을 사용하여 윈도우용 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) 을 통해 제 2 일 및 모든 기타 후속 시점에서의 평균 스페로이드 직경 사이의 통계적 유의도를 확인했다.

결과

이들 연구에서 이용된 3D 바이오프린터는 여러 가지 압출 펜 팁 (pen tip) 을 사용하여 다양한 점도에서 물질의 시간 및 압력 조절되는 압출을 수행할 수 있다. 프린팅된 농도에서 물 및 세포, 배지, 및 콜라겐의 현탁액에 관해 측정된 접촉각은 각각 155° 및 156° 로 기록되었다. 표 I 은 시험된 프린팅 파라미터의 범위를 보여준다. 선택된 파라미터는 10.3 스페로이드/분 의 속도에서 균일한 크기를 갖는 스페로이드의 일관된 압출을 제공한 조건을 나타낸다. 주사기 압력, 압력 지속시간, 및 바늘 게이지는 모두 조합하여 압출 속도 및 그러므로 스페로이드 크기를 결정한다. 더 높은 압력 및 더 큰 바늘 게이지는 더욱 일관된 결과를 허용하고, 그 이유로 선택되었다. 스페로이드 부피를 유지하도록 압력 지속시간은 낮게 유지되었다. 카트리지 크기는 뱃치 부피에 가장 잘 맞게 선택되었고, 콜라겐 농도는 프린팅되지 않은 콜라겐 겔과 비교할 때 스페로이드 특성을 유지하도록 선택되었다. 세포 생활력의 유지와 함께 세포 함유 콜라겐 실린더를 압출하는데 필수적인 이전에 공개된 조건을 현재의 연구를 위한 출발점으로서 사용했다.

표 I 스페로이드를 생성하기 위한 3D 프린팅 조건

콜라겐 압출 후에 그러나 콜라겐 중합 전에 스페로이드 형태를 유지하기 위해서, 초소수성 코팅을 조직 배양 폴리스티렌 플레이트 상에 이용하고, 3D 스페로이드를 그 표면 상에 직접 바이오프린팅했다. 도 1A-1B 에서 나타난 바와 같이, 프린팅 및 겔화를 위한 인큐베이터로의 후속적 수송 동안 스테이지 이동 (X-Y 축) 동안 내내 스페로이드를 초-소수성 표면 상에 Pluronic® F127 에 의해 부동화시켰다. 초소수성 표면 상의 상기 Pluronic® F127 디스크가 도 1D 의 도해에 도시되어 있다. 스페로이드는 그 후 수성 용액 중에서 인큐베이션하여 또는 표면을 10℃ 로 냉각시켜 Pluronic® F127 로부터 쉽게 방출될 수 있었다. 전체 과정 동안 내내 뿐만 아니라 제거 후에도, 스페로이드는 초소수성 표면 상에서 그들의 모양을 유지했다.

스페로이드의 뱃치를 현탁된 SVF 세포를 함유하는 2 ㎖ 의 미중합 콜라겐 I 을 사용하여 제조하고, 크기에 따라 뱃치 당 100 내지 150 스페로이드의 양으로 생성했다. 스페로이드는 평균 직경 3.54 ㎜ (표준 편차 0.195 ㎜) 를 가졌다. 뱃치 생성 시간은 기구 제조에 20 분 및 48 스페로이드 압출에 5 분을 요구했다. 압출 후에, 스페로이드를 10 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션하여, 스페로이드 사용 전에 30-35 분의 총 생성 시간을 초래했다.

초기 콜라겐 겔화 후에 3D 바이오프린팅된 SVF 스페로이드의 전형적 형태가 도 2A-2H 에서 보여진다. 위상차 현미경관찰에 의해 시각화된, SVF 함유 스페로이드 형태는 균일했고 (도 2A), 칼세인 AM 생 염색제에 의해 보여지는 바와 같이 그래프팅된 세포는 대부분 생활력이 있었다 (도 2B). 도 2C 에서 보여지는 바와 같이 에티디움 호모다이머-1 로 표지된 몇몇 생활력 없는 세포가 존재했다. 비스-벤즈이미드로 핵 염색하여 평가된 세포의 분포 (도 2D) 는 균일했으며, 이는 특정 위치 내에서의 세포 침강의 증거 없이 콜라겐의 겔화가 스페로이드 전체에서 세포 캡슐화를 유지한다는 것을 시사한다. 교반 배양에서 6 일 후에 다시 스페로이드 내에서의 세포의 분포 및 생활력을 평가했다. 살아 있는 세포 (칼세인 AM 양성) 는 도 2F 에서 보여지고, 죽은 세포 (에티디움 호모다이머-1 양성) 는 도 2G 에서 보여지고, 핵 염색 (비스-벤즈이미드 양성) 에 의한 총 세포 분포는 도 2H 에서 보여진다. 이러한 배양 시점에서, 3D 콜라겐 I 에서의 시험관내 혈관형성의 발생을 시사하는 복잡한 기하구조 및 길어진 발아 (elongated sprouts) 가 있는 미세혈관 구조를 포함하는 캡슐화된 SVF 에서의 형태학적 변화가 눈에 띄었다.

제 0 일에 프린팅 직후에 및 제 2 일, 제 6 일, 제 9 일, 및 제 13 일에 배양 기간 동안 내내 SVF 생활력을 정량화했다 (도 3). 제 0 일 프린팅된 생활력 (68.24% ± 3.59%) 은 피펫팅된 캡슐화 대조군보다 평균 5.96% 더 낮았고, 캡슐화 전의 뉴클레오카운터에 기반하는 생활력보다 27.8% 더 낮았다.

현탁 배양 동안 스페로이드의 연구는 스페로이드가 직경의 감소와 수반하여 수축을 겪는다는 것을 시사했다. 스페로이드의 수축은 도 4A-4D 에서 위상차 현미경관찰에 의해 보여지고, 정량적으로 평가한 결과가 도 5 에 제공되어 있다. 조기 콜라겐 수축이 제 2 일 - 제 3 일에 평균 속도 0.0083 ±0.0875 ㎜/일 로 발생했고, 수축 속도는 교반 배양에서 제 6 일 - 제 7 일에 그것의 피크 속도 0.3675 ±0.1359 ㎜/일 에 도달했다. 그 피크 후에, 수축 속도는 교반 배양에서 제 9 일 - 제 13 일에 0.042 ±0.0463 ㎜/일 로 감소했다. 평균 스페로이드 직경은 배양에서 제 2 일 및 모든 후속일 사이에서 유의하게 상이했다 (도 5, p < 0.0001).

SVF 스페로이드의 일반적 형태를 교반 배양에서 14 일 후 (스페로이드가 유의한 수축을 겪은 시점) 에 평가했다. 수축된 스페로이드 중 세포의 높은 밀도로 인해, 형광은 세포 형태의 또렷한 이미지를 생성하기에 부적당했다. 따라서, 세포의 분포를 정확하게 시각화하기 위해 및 수축된 스페로이드 중 혈관 세포 표현형을 특성분석하기 위해, 14 일 스페로이드를 내피 (GS-1 FITC 양성) 및 α-평활근 액틴 (α-SMA-Alexa Fluor 594 양성) 성분에 대해 염색하고, 공초점 현미경관찰에 의해 평가했다. Amira 소프트웨어를 후속적으로 사용하여 전체 구축물의 3D 부피 렌더링 (rendering) 을 생성했다. 세포는 배양에서 시간의 흐름에 따라 생활력을 유지했을 뿐만 아니라, 세포는 또한 혈관 유사 구조를 향하여 표현형 변화를 겪었으며, 이는 SVF 을 이용하는 3D 콜라겐 I 시험관내 어세이에서 이전에 보여진 바와 같다. 관 유사 형성을 보이는 세포 성분의 예와, 외막에서 αSMA 양성 세포에 의해 둘러싸인 루멘에서 멀리 떨어진 내피 세포의 존재는, 시험관내 혈관형성의 증거를 제공하고, 도 6A-6B 에서 화살표에 의해 강조표시되어 있다.

논의

다양한 질환의 치료를 위한, 기질 혈관 분획을 포함하는, 줄기 및 재생 세포의 전달은 인간 임상 시험에 도달했다; 그러나, 이식 부위에서의 세포의 한정된 체류는 관찰된 불량한 치료 효과에서 시사되었다. 체류를 개선하는 대안적 방법은 배양에서의 세포의 자가-응집 및 생체물질 내의 세포의 캡슐화를 포함했다. 이들 연구는 이식 부위에서의 세포 체류를 확실히 개선했다. 기질 혈관 분획은 알기네이트를 포함하는 세포 체류를 개선하는 여러 가지 물질에 캡슐화되어서, SVF 함유 스페로이드를 생성했다. 알기네이트에서의 SVF 의 체류는 세포 생활력을 유지한다; 그러나, 알기네이트 겔은 임의의 형태학적 변화를 보이지 않으며, 이는 그래프팅된 세포 이주 및 증식을 알기네이트 겔이 지지하지 않으며, 그에 따라 시험관내 혈관형성 및 세포-기반 치료를 위한 잠재적 생체내 적용을 제한한다는 것을 시사한다. 이러한 이유로, SVF 세포 집단이 그 세포외 매트릭스 내에서 시험관내 혈관형성을 보이는 것으로 밝혀졌으므로, 스페로이드 생성을 위해 콜라겐 유형 I 의 사용이 탐구되었다. SVF 함유 콜라겐 겔은 시트로 생성될 수 있고 조작하기 번거롭다. 부가적으로, 종래의 조직 플레이트 상에 프린팅된 콜라겐 스페로이드는 폴리스티렌의 친수성 특징으로 인해 신속히 편평해진다. 압출 후에 및 중합 후에 콜라겐 I 을 스페로이드 모양으로 유지하기 위해서, 초소수성 코팅을 조직 배양 폴리스티렌 플레이트 상에 이용하고 이들 표면 상에 직접 3D 바이오프린팅했다.

스페로이드가 초소수성 표면에 부착하는 능력이 없어서 대부분이 프린팅 펜 팁에 부착된 채로 남았기 때문에, 초소수성 표면 상에 프린팅하려는 초기 시도는 처음에는 성공적이지 못했다. 이러한 부착의 결여를 극복하기 위해서, Pluronic F-127 의 디스크를 초소수성 표면 상에 프린팅했다. Pluronic F-127 은 친수성 및 소수성 특성을 제공하는 양친매성 블록 구조를 갖는 트리블록 공중합체이다. 이는 Pluronic F-127 이 초소수성 표면에 부착하고 수성 물질 예컨대 콜라겐에 부착하는 것을 둘다 허용한다. 확립된 양쪽친화성 표면으로, 여러 가지 크기를 제공하는 조건을 사용하여 콜라겐 스페로이드를 생성했다. 평균 직경 조정은 적용되는 압력의 변화를 통해 수행될 수 있었으며, 이는 1 ㎜ 내지 3.5 ㎜ 크기 범위의 스페로이드의 생성을 허용했다.

자가-조립 기반 스페로이드 생성 방법과 비교하면, 양쪽친화성 스페로이드 생성은 10 배 정도 더 빠르며 스페로이드 크기 및 모양에서 유사한 일관성이 있다. 자동화된 시간-압력 압출 시스템 예컨대 BAT 를 사용할 때 스페로이드 크기 변화의 일차 출처는 분배되는 유체의 점도이다. 그러나, 모든 파라미터 예를 들어 안정적 중성 pH, 낮은 온도, 및 BAT 압출 전에 미중합 콜라겐 용액의 철저한 혼합을 다루어서, 스페로이드 뱃치 내에서의 변화를 최소화했다.

이들 연구는 정적 배양에서 또는 더욱 동적 교반 배양 조건에서 14 일 세포 배양 기간 동안 내내 스페로이드 완전성 및 세포 분포가 유지된다는 것을 시사한다. 콜라겐 중에 캡슐화 전에 뉴클레오카운터에 의해 측정된 세포의 생활력은 96% 였으며, 그에 따라 제 0 일 생활력이 콜라겐 포매 과정 동안 딱 30% 미만 만큼 하락했다. 그러나, 피펫팅된 콜라겐 내에서의 생활력은 프린팅된 콜라겐보다 오직 5.96% 더 높았으며, 이는 바이오프린팅 보다는 콜라겐 캡슐화가 생활력 감소의 출처라는 결론을 초래한다. 이러한 결론은 피펫팅된 콜라겐 및 프린팅된 콜라겐에 관해 >90% 생활력을 보여주는 다른 이에 의해 수행된 피펫팅된 콜라겐 내에서의 생활력에 대한 선행 연구와 상충한다. 특히 다른 이들이 동일한 농도의 콜라겐 내에 캡슐화된 동일한 기원의 세포를 사용하는 그들의 생활력 어세이에서 동일한 마커를 사용했다는 것을 고려하면, 아마도 생활력 차이에 기여하는 두 가지 차이는 새로운 단리물의 본 발명의 사용과는 대조적으로 다른 이들이 프린팅 전에 그들의 세포를 배양했다는 것 및 그들의 콜라겐 출처가 열거되어 있지 않은 랫트 꼬리 콜라겐의 본 발명의 사용이다. 이러한 상충은 다른 이들이 형광 값에 의하기 보다는 눈에 의해서 생활력에 관한 그들의 세포 계수를 수행했다는 사실 때문일 수 있다. 눈에 의한 생활력에 관한 세포 계수는 흐릿한 대상체에 대한 사용자 편견에 취약한 데이타를 남긴다. 이러한 문제는 상대 형광 단위 (RFU) 의 면에서, 살아 있는 세포가 대등한 수의 죽은 세포보다 열 배 더 밝고, 이미지 기반 생활력 계수에 관한 밝기 보상이 빈번히 조절되지 않는다는 사실에 의해 잠재적으로 과장된다. 이는 특히 다른 이들이 세포가 계수될 어느 색으로든 밝게 염색되어야 했다는 것을 명확히 했다는 것을 고려하면 그런 것 같다. 이는 피펫팅된 및 프린팅된 세포 사이의 생활력 차이가 양쪽 연구에서 유사하다는 사실에 의해 추가로 지지된다. 형광계 기반 생활력에 관한 잠재적 문제는 비-특이적 염색 왜곡 결과의 가능성이다; 그러나, 기준선으로서의 염색된 무세포 콜라겐 스페로이드의 본 발명의 사용은 무세포 신호에 관해 보상하는 것을 도왔을 것이고, 표준 곡선은 세포성 비-특이적 염색에 관해 보상할 것이다. 제 0 일 후에, 생활력은 교반 배양의 지속시간 동안 내내 높게 유지되었지만, 제 9 일에 나중 단계 스페로이드 수축과 일치하는 생활력의 하락이 존재했다.

스페로이드를 형성하기 위해 알기네이트를 사용한 결과와 대조적으로, 세포 형태에서 현저한 변화가 있었으며, 이는 팁 세포 형성 및 보유된 미세혈관 분절로부터의 발아를 포함하나 그에 제한되지 않는 혈관형성의 초기 단계를 겪는 세포의 능력을 입증했다. SVF-콜라겐 스페로이드의 수축이 세포 배양의 6 일 후에 시작하는 것이 또한 관찰되었다. 섬유아세포 및 내피 세포의 존재 하에서의 콜라겐 수축은 잘 문서화되어 있고, 세포-의존적 수축이 활성 대사, 미세환경 재형성, 및 이들 포매된 세포의 세포 이동성의 평가를 제공한다는 것이 시사되었다. 수축된 스페로이드 중 세포 조성 및 표현형의 공초점 현미경 분석은 α-평활근 액틴과 함께 내피 세포 특이적 렉틴 그리포니아 심플리시폴리아-1 (GS-1) 에 대해 양성으로 염색된는 기관화된, 신장된, 관 구조의 존재를 시사했다. 시간의 흐름에 따른 이러한 표현형 변화는 SVF 이 미세혈관-유사 구조로 자가-조직화하거나 (맥관형성) 또는 내피 세포가 기존의 미세혈관 분절로부터 발아한다 (혈관형성) 는 증거를 제공했다. 시험관내 SVF 의 혈관형성 및 신혈관형성은 생체내 허혈 상태의 치료를 위해 콜라겐 I 스페로이드를 이용하는 치료 잠재성을 제공한다.

다이렉트 라이트 컴퓨터 지원 디자인 및 제조를 통한 자동화는 양쪽친화성 표면을 이용하여 제어되는, 정밀한, 및 효율적인 방식으로 스페로이드를 생성하는 기회를 제공했다. 그러한 시스템은 또한 약물 전달, 세포 전달, 또는 면역요법제 전달을 포함하는 다양한 목적을 위해 높은 처리율 미세환경-기반 어세이를 디자인하는 기회를 제시했다. 스페로이드의 다수의 시험관내 적용은 아직 연구되지 않았다. 생체물질 예컨대 피브린, 히알루론산, 및 기타 탐구되지 않은 하이드로겔로 구성된 다수의 세포외 매트릭스-기반 스페로이드를 생성하는 능력은 여러 가지 세포-기반 요법에 적합한 미세환경의 생성을 허용할 것이다. 실제로, 표현형 변화 및 세포 기능은 사용되는 ECM 에 따라 상이할 수 있다. 생체내 연구는 또한 단독으로 액체 현탁된 세포의 직접 주입과 비교하여, 둘러싼 숙주 조직과의 기능적 상호작용을 포함하는, 캡슐화된 세포의 치료적 유익을 다루고 특성분석하는데 필수적이다.

요약하면, 상기 연구는 양쪽친화성 표면이 사용되어 균일한 크기 및 모양의 생활력 있는 SVF 함유 스페로이드를 생성할 수 있다는 것을 입증했다. 3D 바이오프린터를 통한 자동화의 부가는 높은 처리량 및 관리의 포인트 내에서 임상 설정에 맞추기에 충분히 낮은 생성 시간을 허용한다. 추가로, 수용성 친수성 스팟의 사용 및 Pluronic F-127 의 상 전이 특성은 스페로이드 조작을 요구할 임의의 적용을 위한 최소 파괴적 스페로이드 제거를 허용한다. 이들 SVF 함유 콜라겐 스페로이드는 개선된 세포 국소화 및 체류를 통해 재생 목적의 세포 주입의 치료 효과를 증가시키는 전략을 제공할 수 있다.

실시예 2 - 섬 세포-함유 스페로이드의 생성.

방법

초소수성 표면의 제작, 친수성 스팟의 생성, 및 SVF 세포의 단리. 초소수성 표면의 제작 및 친수성 스팟의 생성을 실질적으로 위에서 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 수행했다. SVF 세포를 또한 위에서 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 이전에 공개된 효소 기반 방법에 따라 다시 랫트 부고환 지방 패드로부터 단리했다.

섬 단리. 발라마루그한 (Balamarughan) 의 방법에 따라 섬을 단리했다.

섬/SVF 함유 콜라겐 스페로이드 제작. 새롭게 단리된 SVF 및 섬을 7.4 의 최종 pH 로 적정된 1X 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (Sigma, St. Louis, MO) 와 혼합된 미중합 랫트 꼬리 콜라겐 I 에 현탁시켜 1.6 x 10⁵ SVF 세포/㎖ (최종 용액의 ㎖) 를 함유하는 3 ㎎/㎖ 콜라겐의 혼합물을 생성했다. 이 혼합물을 프린팅 전까지 4℃ 에서 유지하고, 바이오프린터 상의 냉매 시스템을 사용하여 프린팅 과정 동안 내내 동등한 온도를 유지하여 겔 중합을 방지했다. 섬/SVF-콜라겐 용액을 3cc 프린팅 주사기 (EFD, Nordson, Westlake, OH) 에 옮기고, 3D 바이오프린터 (nScrypt, Inc., Orlando, FL) 에 배치했다. 초기 프린팅 조건은 연속 실린더 프린팅에 관한 우리의 이전에 공개된 데이타에 기초했다 [4, 5, 31, 42]. 스페로이드가 프린팅된 후에 스페로이드를 37℃ 에서 조직 배양 인큐베이터 (5% CO₂) 에서 10 분 동안 인큐베이션하여 콜라겐 겔 중합을 개시했다.

스페로이드 배양 방법. 제작 후에, 스페로이드를 DMEM, 10% FBS, 5 mM HEPES 완충제, 2 mM L-글루타민, 헤파린을 함유하는 내피 성장 보충물, 페니실린 (45 U/㎖), 및 스트렙토마이신 (45 ㎍/㎖) 으로 구성된 내피 세포 성장 배지 [85] 를 함유하는 세포 현탁 배양을 위한 교반 플라스크 (125-㎖ MagnaFlex Microcarrier Spinner Flask, Wheaton Industries, Millville, NJ) 에 옮겼다. 교반 플라스크를 자기 교반기 플랫폼 (MCS 104-L 생물학적 교반기, Techne Inc., Burlington, NJ) 상에 배치하여 스페로이드의 연속 현탁액을 제공하고, 배양 기간 (14 일) 동안 내내 자기 임펠러 속도를 40 rpm 으로 설정했다. 분석에 요구되는 스페로이드를 50 ㎖ 혈청학적 피펫을 통해 제거했다. 스페로이드 수축 연구를 위해, 개별 스페로이드를 96 웰 초저 부착 플레이트 (Corning, Corning, NY) 의 별개의 웰에 플레이팅했다.

스페로이드 크기 측정. 96-웰 플레이트에서 배양된 스페로이드의 광학 현미경관찰 (CKX41, Olympus, Tokyo, Japan) 을 통해 얻은 이미지로부터 스페로이드 크기 측정값을 산출했다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이들 4X 이미지의 직경 측정값을 얻었다.

생사 어세이. 생/사 형광 염색제 (Live/Dead Viability/Toxicity Kit, Life Technologies Inc., Carlsbad, CA) 를 사용하여 섬 및 SVF 생활력을 평가했다. 스페로이드를 PBS 로 세정하고, 10 μM 칼세인 AM (생) 및 10 ㎛ 에티디움 호모다이머-1 (사) 과 함께 실온에서 45 분 동안 인큐베이션하고, 형광 현미경관찰 (IX71, Olympus, Tokyo, Japan) 을 통해 이미지화했다. 이미지를 4X 배율로 캡처했다. 생성된 스페로이드의 생활력을 정량적으로 평가하기 위해서, SVF 세포를 단리하고, 생활력을 뉴클레오카운터를 사용하여 측정하고, 생 및 사 세포의 알려진 양을 산출하는데 사용했다. 이로부터, 알려진 양의 세포를 피펫팅하고, 염색하고, 형광계로 분석하여, 각각의 세포 양에 관한 생 및 사 형광 값을 얻었다. 이들 값으로부터 생성된 표준 곡선이 아래 제시되어 있다 (n=3). 생성된 표준 곡선에 기초하여, 생활력을 제 0 일, 제 2 일, 제 6 일, 제 9 일, 및 제 13 일에 측정했다. 생/사 키트를 보충하기 위해, 15 분의 0.1% Triton-X100 (Sigma, St Louis, MO) 투과화 후에 Hoechst 33258 비스-벤즈이미드 핵 염색제 (Anaspec, CA) 로 세포의 분포를 평가했다.

인슐린 방출. ELISA 를 사용하여 인슐린 방출을 정량화했다.

사전혈관형성된 섬 이식편 연구. 스트렙토조토신의 주입에 의해 당뇨병에 걸리게 한 면역약화된 마우스 내에 사전혈관형성된 섬을 이식했다. 사전혈관형성된 섬을 피하에 이식했다. 섬 이식 후에 혈당 수준을 측정했다.

공초점 현미경관찰. 시험관내 혈관형성 분석을 위해, MPE FluoView1000 공초점 현미경을 사용하여 10X 수침 대물렌즈 (Olympus, Tokyo, Japan) 를 이용하여 스페로이드 샘플을 이미지화했다. 공초점 이미지 스택을 AMIRA 3D 시각화 소프트웨어 (Thermo, Waltham, MA) 에서 재구성하고, z-축 투사로서 디스플레이했다. 이미지화 전에, 스페로이드를 4% 파라포름알데히드로 10 분 동안 실온에서 고정하고, 그 후 0.1% Triton X-100 으로 15 분 동안 실온에서 (Sigma, St Louis, MO) 투과화했다. 투과화 후에, 스페로이드를 1:500 의 희석률로 FITC (GS-1) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 에 접합된 그리포니아 심플리시폴리아-1 이소렉틴 4 로 염색했다. 수반하여, 마우스 모노클로날 α-평활근 액틴 일차 항체를 1:250 (α-SMA) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) 로 첨가했다. 스페로이드를 밤새 4℃ 에서 인큐베이션했다. 다음 날, 스페로이드를 PBS 로 3 회 세정하고, 2 시간 동안 실온에서 각각 1:200 및 1:1000 희석률로 RedDot 핵 염색제 (Biotium, Fremont, CA) 및 염소 항-마우스 IgG Alexa Fluor 594 이차 항체 (Thermo Fisher, Waltham, MA) 와 함께 인큐베이션했다. 샘플을 후속적으로 PBS 로 세정하고, 앞서 언급한 바와 같이 이미지화했다. 내피 성분을 GS-1 FITC 로 녹색으로 염색했다. 혈관주위 지지 세포 뿐만 아니라 섬유모세포 성분을 Alexa Fluor 594 에 접합된 α-SMA 로 적색으로 염색하고, 핵을 RedDot 로 염색하여 청색으로 인공 채색했다.

통계적 분석. 원 웨이 ANOVA 와 던네트 다중 비교 사후 시험을 사용하여 윈도우용 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) 을 통해 제 2 일 및 모든 기타 후속 시점에서의 평균 스페로이드 직경 사이의 통계적 유의도를 확인했다.

결과 및 논의

3-차원 바이오프린팅은 이식용 조직 구축물의 개발에 대한 신규한 접근법을 대표한다. 본 발명의 연구는 지방질 유래의 SVF 세포 및 지방질 유래의 미세혈관 분절을 프린팅하고 후속적으로 이들 구축물을 이식하여 그들의 생활력 및 체류를 평가하는 것의 실행가능성을 보여주면서 완료되었다. 정의된 크기의 세포 캡슐화된 스페로이드를 생성하는 기술을 이용하는 섬 구축물의 바이오프린팅을 위한 추가의 실현 기술이 개발되었다. 첫번째 연구는 캡슐화 생체물질로서 알기네이트를 이용했다. 이들 연구는 지방질 SVF 및 섬을 동시-국소화하는 능력을 확립했고, 섬은 배양에서 14 일 이하 동안 생활력 있는 상태로 유지되었지만, 스페로이드 순환과 숙주 혈관 통합의 결여가 관찰되었다. 따라서, 매트릭스 분자로서 콜라겐 유형 1 의 사용에 초점을 두고 스페로이드를 생성하는 대안적 방법이 탐구되었다. 위에서 논의된 바와 같이, 비-점성 용액의 스페로이드 모양을 유지하기 위해 초소수성 및 친수성 표면을 사용하는 기술적 용액이 발견되었다. 이와 관련하여, 도 1 에서 보여지는 것과 유사하게, 바이오프린팅 시스템이 사용되어 섬 및 지방질 SVF 을 함유하는 스페로이드를 바이오프린팅했다. 도 7 은 그러한 스페로이드의 이미지이고, 섬 및 지방질-유래의 재생 세포를 동시-프린팅하는 능력을 입증한다. 도 7 은 이들 스페로이드에서의 세포 분포 및 프린팅하고 교반 배양에서 7 일 초과의 기간 동안 섬/SVF 스페로이드의 구조적 완전성을 유지하는 능력을 보여준다. 추가로, 도 8 및 도 9A-9G 에서 보여지는 바와 같이, 연구는 당뇨병 동물 모델에서 고혈당증을 치료하는 능력을 확립했고, SVF-함유 스페로이드에서 혈관-유사 구조의 형성을 보여줬다.

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참고문헌(들)

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Claims (21)

1. 하기 단계를 포함하는, 하나 이상의 세포 또는 조직을 포함하는 스페로이드의 제조 방법:
   기질 혈관 분획, 미세혈관 분절 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 또는 조직을 포함하는 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 하나 이상의 세포 또는 조직은 콜라겐 또는 피브린을 포함하는 생체적합성 매질 내에 분산되어 있는 것인 단계;
   트리블록 공중합체를 초-소수성 표면 상에 침적시켜 초-소수성 표면 상에 친수성 표면을 형성하는 단계로서, 상기 트리블록 공중합체는 친수성 및 소수성 특성을 제공하는 양친매성 블록 구조를 갖는 것인 단계; 및
   현탁액의 소적을 친수성 표면 위에 바이오프린팅하여 스페로이드를 형성하고, 트리블록 공중합체를 용해시킨 수성 용액 중에서 스페로이드를 인큐베이션하여 초-소수성 표면으로부터 스페로이드를 제거하고, 그렇게 함으로써 하나 이상의 세포 또는 조직을 포함하는 스페로이드를 얻는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 생체적합성 매질이 하이드로겔인 제조 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 하이드로겔이 콜라겐 유형 I 을 포함하는 제조 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 기질 혈관 분획, 미세혈관 분절 또는 줄기 세포가 지방질 조직으로부터 유래된 것인 제조 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 줄기 세포가 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 현탁액이 뉴런, 심장근육세포, 근육세포, 혈관 및/또는 위장 평활근 세포, 연골세포, 췌장 선포 세포, 랑게르한스섬, 섬 베타 세포, 골세포, 간세포, 쿠퍼 세포, 섬유아세포, 근아세포, 위성 세포, 내피 세포, 지방세포, 지방전구세포 및 담즙 상피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포를 추가로 포함하는 제조 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 현탁액의 소적을 바이오프린팅하는 단계가 현탁액을 다이렉트-라이트 프린팅 (direct write printing) 하는 것을 포함하는 제조 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 초-소수성 표면이 150° 초과의 물 접촉각을 갖는 제조 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 물 접촉각이 150° 초과 170° 이하인 제조 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 소적을 바이오프린팅하는 단계가 0.2 ㎜ 내지 5 ㎜ 의 직경을 갖는 소적을 바이오프린팅하는 것을 포함하는 제조 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 소적을 바이오프린팅한 후 일정 기간 동안 생리학적 온도에서 스페로이드를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
12. 제 1 항에 있어서, 소적을 바이오프린팅한 후 세포 배양 배지에서 스페로이드를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
13. 하기 단계를 포함하는, 세포 혼합물을 포함하는 스페로이드의 제조 방법:
    세포 혼합물의 하이드로겔 현탁액을 준비하는 단계로서, 상기 세포는 지방질기질 혈관 분획으로부터의 기질 혈관 세포 및 무손상 췌장 섬 또는 섬 세포를 포함하고, 상기 하이드로겔 현탁액은 콜라겐 또는 피브린을 포함하는 것인 단계;
    일정량의 트리블록 공중합체를 초-소수성 표면의 정의된 영역 상에 침적시켜 친수성 표면을 형성하는 단계로서, 상기 트리블록 공중합체는 친수성 및 소수성 특성을 제공하는 양친매성 블록 구조를 갖는 것인 단계; 및
    세포 혼합물의 하이드로겔 현탁액의 소적을 친수성 표면 위에 바이오프린팅하여 스페로이드를 형성하고, 트리블록 공중합체를 용해시킨 수성 용액 중에서 스페로이드를 인큐베이션하여 초-소수성 표면으로부터 스페로이드를 제거하고, 그렇게 함으로써 세포 혼합물을 포함하는 스페로이드를 얻는 단계.
14. 제 13 항에 있어서, 하이드로겔 현탁액이 콜라겐 유형 I 을 포함하는 제조 방법.
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