JP2003024056A - すぐに使用できる均一に分散した細胞外マトリックスを基質に提供する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 すぐに使用できる（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓ
ｅ）均一に分散した細胞外マトリックスを基質に提供す
る方法を提供すること。 【解決手段】 この方法は、細胞外マトリックス成分を
基質面に塗布すること、細胞外マトリックス成分を基質
面上でインキュベートして重合させること、重合した細
胞外マトリックス成分を、基質面上で凍結させること、
凍結させた細胞外マトリックス成分を、基質面上で凍結
乾燥すること、凍結乾燥された細胞外マトリックスの温
度を室温まで上昇させることを含む。上に記載した方法
によって形成した、乾燥させて均一に分散した細胞外マ
トリックスを含む細胞培養装置も企図される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は一般に、独特の細胞
培養用培地を提供する方法に関する。さらに詳細には、
本発明は、基質に付着した、均一に分散した細胞外マト
リックスを含む細胞培養装置から流体を抜き取る方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞と細胞の間にある繊維状および球状
タンパク質の網状構造は、細胞外マトリックス（ＥＣ
Ｍ）と呼ばれる。ＥＣＭは、細胞環境にとって不可欠な
成分である。細胞間質（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｍ
ａｔｒｉｘ）および基底膜を形成するために、様々なＥ
ＣＭ成分が細胞によって分泌され、細胞はｉｎ ｖｉｖ
ｏでこの骨格につなぎとめられている。これらの構造に
より、組織特有の組織像の構築および発達に必要な空間
配置と安定性がもたらされる。しかし、ＥＣＭは、単な
る不活性な骨格ではなく、細胞の成長および分化の調節
において必須の働きをするものでもある。ＥＣＭは、胚
発生、組織修復、炎症、腫瘍浸潤、転移などの通常の病
的リモデリング（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｍｏ
ｄｅｌｉｎｇ）過程中に、細胞機能の調節において中心
的な役割を果たす環境を提供する。例えば、ＥＣＭは、
増殖因子の誘導、隔離、貯蔵および提示の際に機能する
ことが知られている。

【０００３】ＥＣＭが、細胞の微細環境にとって不可欠
な成分であるという事実を認識して、ますます多くの研
究者が、細胞外マトリックスを彼らの細胞培養システム
に組み込んでいる。ＥＣＭをｉｎ ｖｉｔｒｏで使用す
ることにより、細胞に、ｉｎｖｉｖｏの生理的環境によ
り近い状態が提供される。ＥＣＭは、細胞に力学的支持
をもたらし、また、細胞表面の受容体を介して細胞に影
響を及ぼす生化学的な刺激を提供することによって、細
胞の挙動に影響を与える。

【０００４】基底膜は、特定のタイプの細胞外マトリッ
クスであり、主としてラミニンおよびＩＶ型コラーゲン
からなる。Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒ
ｍマウス腫瘍から抽出した、良く知られた基底膜マトリ
ックス（ＢａｓｅｍｅｎｔＭｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒ
ｉｘ）が、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）という商標名
で市販されている。このマウス腫瘍は、基底膜タンパク
質が豊富である。マトリックスの主な成分は、ラミニ
ン、コラーゲンＩＶ、エンタクチンおよびヘパラン硫酸
プロテオグリカンであり、また、増殖因子、マトリック
スメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ［コラゲナーゼ］）、
および他のプロテイナーゼ（プラスミノゲン活性化因
子）、ならびに数種の未決定の化合物も含むが、検出可
能なレベルのメタロプロテイナーゼの組織阻害因子（Ｔ
ＩＭＰ）は含まない。室温では、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登
録商標）マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）はゲル化して再
構成基底膜を形成し、その構造、成分、物理的性質およ
びｉｎ ｖｉｖｏの基底膜に典型的な機能特性をもつ能
力について類似している。

【０００５】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、腫瘍細胞によ
る基底膜マトリックスへの浸潤を調べるために、ＭＡＴ
ＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックスを使用する多くの
方法が開発されている。これらの方法は通常、細胞培養
用インサートの微孔メンブレンにＭＡＴＲＩＧＥＬ（登
録商標）マトリックスをコートするものである。ＥＣＭ
を含有する細胞培養システムを調製する従来技術は、第
一に、天然の原繊維の重合および析出を誘導するため
に、可溶性コラーゲンの中性にした冷溶液を温めること
を含む。４℃より高温でＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）
マトリックスをインキュベートすると、マトリックスが
重合する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】細胞培養で使用するた
めの、非結晶性で、化学的に架橋し、アルカリ変性させ
たコラーゲンフィルムは、保存性を向上するために、ま
た使用前にその都度細胞培養基質を調製する必要をなく
すためにしばしば乾燥させるのに対し、天然の微繊維性
コラーゲンを含有する細胞培養基質は、フィルム、天然
の原繊維の粘着性ゲルの形でのみ調製され、使用され
る。こうしたゲルは、上で言及したように、可溶性コラ
ーゲンの中性にした冷溶液を温めて、天然の原繊維の重
合および析出を誘導することによって生成されることが
最も多い。しかしこれらを保管用に乾燥することはしな
い。天然の微繊維性コラーゲンゲルを崩壊および乾燥さ
せる以前の試みでは、天然の構造が失われ、繊維形成が
最適ではなく、透過特性が不十分であるからである。し
たがって、天然の微繊維性コラーゲン細胞培養基質は、
使用する直前に作成しなければならない。そうすること
により、天然の微繊維性コラーゲンを用いた細胞培養を
含む研究に伴う労力および不便が増す。したがって、Ｍ
ＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックス中に見いださ
れるような天然の微繊維性コラーゲンを含み、予定した
使用の前に製品から調製することができる細胞培養基質
が必要とされている。

【０００７】天然の微繊維性コラーゲンを含有する細胞
培養装置を調製する従来の方法では、ゲルが重合した
後、使用する直前に、マトリックス中にある流体を取り
除くことが望ましい。ＥＣＭから流体を取り除く従来の
方法は、風乾および高温での乾燥を含む。通常の高温乾
燥条件は、乾燥空気流を用いた高温での高速乾燥を含
み、これは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリック
スの大きな塩の結晶やより顕著なパターン化を促進す
る。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックスを高速
乾燥することにより、浸潤細胞の分散が不十分になる。

【０００８】従来の流体を取り除く技術は、多孔表面の
下面を、吸湿材の上に３分から終夜の間置くこと、およ
び／または多孔表面の下面を穏やかに減圧することを含
む。温度を徐々に下げる条件、かつ空気流の無い条件下
で、ゆっくりと乾燥させることによって流体が取り除か
れると、最も均一なコーティング、すなわち浸潤細胞の
最も均一な分散がもたらされる。例えば、Ｓｗｉｄｅｒ
ｅｋ他（米国特許第５，７３１，４１７号）では、基質
を風乾することを含み、細胞培養用に天然の微繊維性コ
ラーゲンの乾燥フィルムを作成する方法を開示してい
る。

【０００９】従来の乾燥方法は、細胞培養装置の機能を
低下させる。例えば、従来のコーティングおよび乾燥方
法では、しばしば、コーティングが不均一または分断さ
れたものとなり、これによって、濃い中央の点または環
など浸潤細胞の様々なパターンの形成によって示される
不均一な細胞浸潤が起こる。その結果、顕微鏡下で浸潤
細胞を正確にカウントすることが非常に難しくなる。そ
のうえ、浸潤細胞と非浸潤細胞を識別する能力がかなり
減少する。浸潤細胞にはＨＴ−１０８０細胞が含まれ、
非浸潤細胞にはＮＩＨ ３Ｔ３細胞が含まれる。したが
って、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックスなど
の分散した微繊維性コラーゲン基質は、均一かつむらの
ない（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ）ことが望ましい。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、乾燥させた細
胞外マトリックスを含み、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにお
ける増殖のために開発された、細胞培養装置および方法
に関する。詳細には本発明は、すぐに使用できる均一に
分散した細胞外マトリックスを基質に提供する方法であ
って、ａ）細胞外マトリックス成分を基質面に塗布する
こと、ｂ）細胞外マトリックス成分を基質面上でインキ
ュベートして重合させること、ｃ）重合した細胞外マト
リックスを基質面上で凍結させること、ｄ）凍結させた
細胞外マトリックスを基質面上で凍結乾燥させること、
ｅ）凍結乾燥させた細胞外マトリックスの温度を室温ま
で上昇させることを含む方法を企図する。

【００１１】本発明の別の態様は、細胞増殖のための表
面を含み、前記表面が、乾燥させた均一に分散した細胞
外マトリックスに接着し、前記マトリックスが、ａ）細
胞外マトリックス成分を基質面に塗布すること、ｂ）細
胞外マトリックス成分を基質面上でインキュベートして
重合させること、ｃ）重合させた細胞外マトリックスを
基質面上で凍結させること、ｄ）凍結させた細胞外マト
リックスを基質面上で凍結乾燥させること、ｅ）凍結乾
燥させた細胞外マトリックスの温度を室温まで上昇させ
ることを含む諸ステップによって形成される細胞培養装
置を提供する。

【００１２】本発明はまた、細胞をその上で増殖させる
ようになされた表面、および表面の上をコートする細胞
外マトリックスを含み、マトリックスコーティングが生
理活性タンパク質溶液の重合生成物を含み、マトリック
ス中にある流体が、凍結乾燥中に実質上取り除かれるこ
とを特徴とする細胞培養装置も提供する。

【００１３】本発明は、均一に分散しており、広い範囲
のＥＣＭ濃度に対して有効であり、細胞培養表面全体に
わたる高度に均一な腫瘍細胞移動をもたらし、細胞の計
数を容易にし、また浸潤性腫瘍細胞と、非浸潤性と推定
されるコントロール細胞との区別を容易にする、細胞外
マトリックスを含む細胞培養装置を提供する方法を記載
することによって、従来技術の欠陥を解決することを試
みる。さらに、本発明はまた、予定した使用の前に調製
される細胞外マトリックスを含む細胞培養装置を含む。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明は、基質を端から端までコ
ートする非常に均一な細胞外マトリックスを提供する。
従来の液体乾燥プロセスで調製されたものよりもかなり
広い範囲の細胞外マトリックス濃度に対して有効であ
る。膜の中央で、非常に不均一に細胞移動が起こる従来
のプロセスとは異なり、コーティングの均一性により、
細胞外マトリックスの表面全体に対して高度に均一な腫
瘍細胞移動がもたらされる。均一な移動により、手動方
法（ｍａｎｕａｌ ｍｅｔｈｏｄ）または画像解析によ
る細胞の計数が容易になる。凍結乾燥させたコーティン
グにより、浸潤性腫瘍細胞と、非浸潤性と推定されるコ
ントロール細胞との区別も大いに可能になる。

【００１５】天然の微繊維性コラーゲンを有する細胞培
養装置は、当技術分野で知られるどんな細胞培養プロト
コルおよび方法においても、従来のコラーゲン細胞培養
基質に代わるものである。組織培養プレートのウェル内
で、多孔表面の下面を適切な培地に接触させ、多孔表面
上に、天然の微繊維性コラーゲン細胞培養基質を入れ
た。これにより、培地は、細胞培養基質に接触し、多孔
表面を通って流れるようになる。培地およびその中に存
在可能な他の材料は、細胞培養基質を通して拡散し、細
胞培養基質表面に接種した細胞に接触する。取り扱いを
容易にするために、細胞培養基質は、細胞培養用インサ
ートの微孔メンブレン上で調製することができる。

【００１６】冷細胞外マトリックスを多孔表面に塗布し
た後、中和させた冷コラーゲン溶液の温度を、約１５℃
から約４０℃に上昇させ、天然のコラーゲンの原繊維お
よび繊維形成を開始する。本発明のインキュベーション
ステップでは、温度は高温が望ましく、約５％二酸化炭
素、加湿チャンバー中で、約３７℃が好ましい。コラー
ゲン溶液の温度が上昇するにつれて、天然の原繊維が、
多孔表面上で重合およびゲル化を開始し、多孔表面の上
側をコートする。このゲルは、天然のコラーゲンの特性
である横紋を伴う、コラーゲンの大きな、組織化した繊
維、ならびにコラーゲン溶液（原繊維間の流体）由来の
閉じ込められた流体を含む。インキュベーションステッ
プは、細胞外マトリックスがゲルを形成するのに十分な
時間であることが望ましい。一般に、細胞培養用インサ
ートのメンブレンなどの多孔表面上で完全に重合させる
ために十分な時間は、約３７℃で約０．５から約３時間
である。

【００１７】細胞外マトリックスのコラーゲンが重合し
た後、重合したコラーゲンの原繊維間の流体は、ゲルか
ら抜き取ることが望ましい。本発明の方法では、凍結乾
燥プロセスを開始する前に、ゲルでコートしたインサー
トを、−３０℃より低温で凍結させる。コートしたイン
サートは、凍結乾燥器中で凍結させ、次いで終夜凍結乾
燥し、その間に凍結乾燥機の温度を室温まで上昇させる
ことができる。このプロセスにより、ゲルは多孔表面上
で崩壊し、天然のコラーゲン原繊維および繊維の薄い膜
を形成する。インサートメンブレンに付着した均一なケ
ークを得ることが望ましい。

【００１８】本発明の天然の微繊維性コラーゲン細胞培
養基質は、多孔表面上で、乾燥フィルムとして生成でき
る。これらは、乾燥させた形で天然の微繊維性コラーゲ
ン構造を保持することが望ましく、したがって、キャス
ト（ｃａｓｔ）コラーゲンゲルの向上した透過特性と、
非結晶性あるいは架橋したコラーゲンフィルムの保管安
定性とを有することが望ましい。乾燥させたメンブレン
は、望むなら、細胞培養のための多孔表面から取り除く
ことができるが、一般に、構造的支持を増大させ、取り
扱いを容易にするために、この多孔表面の上に天然の微
繊維性コラーゲン細胞培養基質を使用することが好まし
い。本発明の細胞培養フィルムとしての細胞培養基質
は、優れた拡散特性を有するので、細胞培養基質の表面
上側の細胞は、多孔表面下面を通る拡散によって、培
地、増殖因子、他の材料に触れることができる。

【００１９】大きな天然のコラーゲン繊維の形成を促進
するために、生理的濃度またはそれより高濃度、好まし
くは約０．１５モルから約１モルの塩濃度を使用するこ
とができる。生理的濃度よりも低い塩濃度では、コラー
ゲン繊維の形成は、あるとしても少量である。しかし、
塩がほぼ生理的濃度まで上昇すると、非結晶性のコラー
ゲンは少なくなり、ほぼ完全に繊維が形成される。さら
に、塩が生理的濃度より増大すると、形成される繊維は
より大きくなる。しかし、塩濃度が約１．１モルに到達
すると、再び、ほぼ完全に繊維が形成されなくなる。可
溶性コラーゲンが酸性溶液であるときは、ｐＨを約６〜
８、好ましくは約７．０〜７．４に上げてもよく、それ
と同時に、冷ＮａＯＨのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）などの緩衝液で塩濃度を調整し、最終の塩濃度を約
０．１５モル〜１モル、好ましくは少なくとも約０．６
モル（生理的濃度の約４倍）にする。コラーゲンは、コ
ラーゲン原繊維および繊維の重合が望まれるまで、冷や
して（通常約４℃）保管することによって、溶液中に維
持される。コラーゲン濃度は、天然のコラーゲン繊維の
形成にとって重要でないが、好ましくは細胞培養基質と
して使用される多孔表面１ｃｍ^２当たり約１０から約５
００μｇ、より好ましくは約６５から約８５μｇであ
る。

【００２０】塩または有機材料などコラーゲン以外の残
りの物質の、細胞環境に対する負の効果を気にせずに、
非生理的条件を含む様々な重合条件を用いて、細胞培養
用フィルムを生成することができる。本発明の方法に従
って、ゲルを多孔表面へ崩壊させ乾燥させて微繊維性コ
ラーゲンフィルムを形成することにより、細胞を均一に
分散させるための均一な表面、および望むならコラーゲ
ンの濃縮（約５〜１０ｍｇ／ｍｌ）がもたらされる。天
然の微繊維性コラーゲン構造により、非結晶性のコラー
ゲン細胞培養基質中には見いだせないｉｎ ｖｉｖｏに
おける細胞の受容体の結合のための空間配置がもたらさ
れる。微繊維性コラーゲンの網目により表面が粗くな
り、これにより、各フィルム上のコラーゲン表面積が、
他のコラーゲン細胞培養基質の基本的に２次元の表面上
で見られるよりも広くなる。天然の微繊維性コラーゲン
細胞培養基質は、その表面に、従来技術のコラーゲン基
質よりも、より強く均一に細胞を結合する。すなわち、
表面に塗布された多くの異なるタイプの細胞が、この表
面に迅速かつ完全に結合する（例えば、上皮細胞、内皮
細胞、および線維芽細胞）。

【００２１】本発明の重合反応は組織化エントロピー
（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｌ ｅｎｔｒｏｐｙ）に
よって進む。類似のタイプの自己集合が起こる他のタン
パク質でも物理的機構は同じなので、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で自然に組織化した重合構造を形成するどんな１種また
は複数のタンパク質でも、先述の生成プロセスにおい
て、コラーゲンに代えて使用した場合、天然の構造体
（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を生成する。こうしたタンパク
質には、ホモポリマー（例えば、フィブロネクチンまた
はラミニン）やヘテロポリマー（例えば、ラミニンとコ
ラーゲンＩＶ、またはラミニンとプロテオグリカン）を
形成するタンパク質が含まれる。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登
録商標）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄ
ｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）に含まれるも
ののような自己集合するタンパク質を含む細胞外マトリ
ックス成分を、本発明の方法に従って重合させ、乾燥さ
せて、天然の構造体を生成させることができる。このよ
うなタンパク質のすべてが、原繊維間の流体を除去した
ときに、コラーゲンゲルと同じように崩壊してフィルム
を形成するゲルを生成するわけではないが、重合した基
質から原繊維間の流体を抜き取り乾燥させても、最終生
成物中に天然の構造体を保持されたまま残すことができ
る。

【００２２】どんな膜材料も、本発明の方法で基質とし
て使用できるが、ある種の生物学的使用時には、選択さ
れる膜によって正の効果または負の効果がある。エッチ
ング膜が、移動試験に好ましいのに対し、キャスト膜
は、試験される材料の透過係数が膜の透過係数を超えな
い場合にも使用することができる（つまり、膜の透過係
数が制限因子ではない）。細胞培養の応用例で好都合な
ように、多孔膜を組み込んだ培養用プレート・インサー
トが好ましい（例えば、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＰｒｏｄｕｃｔのＢＩＯＣＯＡ
Ｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎ
ｓｅｒｔ、ＣｏｓｔａｒのＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＭＩＬＬＩＣ
ＥＬＬ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ Ｉｎｓｅｒ
ｔ）。鏡検を含む応用例では、高密度ポリカーボネート
などの材料よりも、透明度が高いため、ＰＥＴ膜が好ま
しい。これらの理由から、異なる使用法には異なる膜が
好ましく、これは当分野の技術者なら型通りの手順で選
択されることができる。

【００２３】本発明の基質として使用される適切な多孔
表面には、セルロース膜、多孔性ポリカーボネート、多
孔性ポリテトラフルオロエチレン（例えばＭｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ ＣＭなどのＴＥＦＬＯＮ ｍｅｓｈ ｍｅｍｂ
ｒａｎｅｓ）、ナイロン膜およびメッシュ、ガラスフィ
ルター、多孔性ポリエチレンテレフタラート、ポリメチ
ルペンタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、および様
々なタイプのフィルター（例えばＡＮＯＰＯＲＥ ａｌ
ｕｍｉｎｕｍ ｃｒｙｓｔａｌｆｉｌｔｅｒｓ）などの
天然または合成の重合体がある。これらの多孔表面は、
重合前にコラーゲン溶液が流失しないのに十分なほど小
さく、培地および原繊維間の流体などの流体が通過する
のに十分なほど大きい孔径であるべきである。一般に、
孔径約０．５から約３０ミクロンの膜であれば、望まし
い性質が提供される。材料の移動試験など大部分の一般
的な細胞培養に使用するためには、孔が約８ミクロンで
ある膜を含む表面が好ましい。

【００２４】乾燥させた後、本発明の細胞培養装置は、
例えば照射（例えば、紫外線、電子ビームまたはγ照
射）によって、あるいはエチレンオキシドガスにさらす
ことによって滅菌することができる。従来技術のコラー
ゲン細胞培養基質とは対照的に、本発明の天然の微繊維
性コラーゲンフィルムは、乾燥されたときにも、天然の
原繊維構造を保つので、ｉｎ ｖｉｖｏコラーゲン基質
により似ている。

【００２５】生理活性タンパク質を含めた幅広い種類の
材料を、特定の細胞培養システムに望まれるように、本
発明の細胞外マトリックスと共に重合させることがで
き、あるいはコラーゲンに吸収させることによってフィ
ルムに取り込ませることができる。これらの材料には、
それだけには限らないが、細胞、抗体、酵素、受容体、
増殖因子、細胞外マトリックスの追加の成分、サイトカ
イン、ホルモン、および薬剤が含まれる。こうした材料
は、選択された細胞培養の応用例に適した濃度で冷コラ
ーゲン溶液に加えることができる。上に記載したような
天然のコラーゲン原繊維を重合させると、材料がコラー
ゲン繊維に結合する、または材料がコラーゲン繊維と共
重合する。細胞培養基質は開いた繊維構造であるため、
加えられた生物学的作用物質が、培養細胞に直ちに使用
可能になり、細胞の性質または挙動を和らげ（ｍｏｄｅ
ｒａｔｅ）または調節する。

【００２６】培養される細胞は、基質の上側表面にほぼ
コンフルエントまたはコンフルエントに接種し、細胞増
殖に適した環境条件下に置くことができる。例えば、細
胞培養基質を、培養ディッシュのウェルに対するインサ
ートのメンブレン表面で調製する場合、ウェルに少量の
増殖培地を入れる。培地が多孔メンブレンの下側に接触
し、細胞培養基質を通して拡散して基質表面上に接種し
た細胞に接触するように、インサートをウェルに入れ
る。

【００２７】このコラーゲン細胞培養基質を使用する細
胞培養においては、上皮細胞の増殖および分化に適した
培地であれば、どんな細胞培養用培地も使用することが
できる。これらの培地には、それだけには限らないが、
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ、Ｍ
−１９９、ＲＰＭＩが含まれる。当技術分野で周知の添
加剤を培地に加えることができ、その添加剤には血清
（例えば、ＦＢＳまたは子牛血清）、血清含有添加剤
（ＮＵ−ＳＥＲＵＭ）、無血清添加剤（ＭＩＴＯ＋）が
ある。腸上皮細胞用の好ましい細胞培養用培地は、ＭＩ
ＴＯ＋ ＳｅｒｕｍＥｘｔｅｎｄｅｒ（Ｃｏｌｌａｂｏ
ｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を添加したＤＭＥＭ
であり、これは完全に定義された無血清細胞培養環境を
提供する。

【００２８】実施例 以下の実施例は、本発明のある種の実施形態を例示する
ために示したものであり、本発明を限定するものと解釈
するべきではなく、本発明は添付の特許請求の範囲およ
びその均等物によって定義される。

【００２９】実施例１ 乾燥させた均一に分散した細胞外マトリックスを有する
細胞培養装置の調製以下の実験実施例では、ポリエチレ
ンテレフタラート（ＰＥＴ）細胞培養用インサート中の
１μｍＰＥＴメンブレン上の、乾燥させた均一に分散し
た天然の微繊維性コラーゲン細胞培養基質の調製を記述
する。この実施例では、メンブレンに、約２００μｍの
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックスを加える。

【００３０】ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリック
スの酸性冷溶液は、１０×ＤＰＢＳ／ＮａＯＨを加える
ことによって６７４μｍ／ｍｌに調整し、約４×ＤＰＢ
Ｓの最終濃度、ｐＨ７．４とする。この混合物は使用す
るまで氷上に置いておく。インサートホルダーを組織培
養ディッシュ内に入れる。細胞培養用インサートを、滅
菌済みピンセットを用いてインサートホルダー内に入
れ、使用するまで、ディッシュにふたをしておく。ＭＡ
ＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コラーゲンコーティングゲル
（０．１０ｍｌ）を各メンブレンに分注し、ディッシュ
のふたを戻し、ディッシュを静かにゆすってコーティン
グ溶液をメンブレンに均等に分配させる。コートしたメ
ンブレンを、未然に乾燥してしまうことを防ぐために加
湿（ｈｕｍｉｄ）環境で、３７℃でインキュベートし、
コラーゲンを重合させる（約２．０時間）。

【００３１】コラーゲンが重合した後、コートしたイン
サートを、凍結乾燥プロセスを開始する前に、あらかじ
め冷却した凍結乾燥機に入れ、（−３０℃より低温で）
凍結させる。インサートは、終夜凍結乾燥させ、その間
凍結乾燥機の温度を室温まで上昇させる。インサートメ
ンブレンに付着した均一なケークが得られる。

【００３２】次いで、天然のコラーゲン細胞培養基質
を、組織培養ディッシュ中で、０．０５〜０．０６ジュ
ールの紫外線に当てることによって滅菌し、使用するま
でシールバッグ中で４℃で保管する。

【００３３】実施例２ 浸潤アッセイ ＮＩＨ３Ｔ３（非浸潤性）およびＨＴ−１０８０（浸潤
性）細胞を、ウシ胎児またはウシ新生児血清（ｎｅｗｂ
ｏｒｎ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）１０％を含むＤＭＥＭ
で、ほぼコンフルエントまで増殖させた。トリプシン処
理によって細胞を採取し、血清もプロテイナーゼ阻害剤
も添加しないＤＭＥＭで洗浄した。この細胞を、１×１
０^５／ｍｌで、ＤＭＥＭに懸濁させた。細胞懸濁液を調
製する前に、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリック
スの乾燥させた層を、室温で２時間、ＤＭＥＭで再水和
させた。再水和溶液を注意深く取り除き、化学走性誘因
物質として５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ０．７５ｍ
ｌを、各プレートウェルに加え、細胞懸濁液０．５ｍｌ
（５×１０^４細胞）を、各インサートに加えた。プレー
トインサートを、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で、２２時
間インキュベートした。コートしていないメンブレン・
インサートにも接種して、コントロールとした。

【００３４】コートしたインサートの固定および染色 インキュベートした後、各インサート内のメンブレンの
上側表面を、綿棒で穏やかにこすり、非浸潤細胞と、Ｍ
ＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックスをすべて取り
除いた。メンブレンの下側表面の浸潤細胞は、Ｄｉｆｆ
−Ｑｕｉｋ（Ｄａｄｅ）染色キットの３種の溶液に順次
移すことによって、固定および染色した。余分な染色液
は、各インサートを蒸留水に浸すことによって取り除い
た。メンブレンの上側表面を２回こすり、残留した水、
細胞、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックスを取
り除いた。インサートを、別の２４ウェルプレートに移
して、風乾させた。細胞をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋで染色し
た後、顕微鏡で直接カウントすることによって、メンブ
レンのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックスを通
過して浸潤した細胞数を、メンブレンの下面で定量し
た。

【００３５】細胞の数および分散に応じて４０または２
００×の倍率で顕微鏡写真を撮影し、細胞を数えた。写
真は、メンブレンをインサートハウジングから取り外さ
ずに撮影した。各写真について複数の視野（通常５）
で、細胞を、罫線格子（ｒｕｌｅｄ ｇｒｉｄ）を用い
てカウントした。データを、浸潤率、すなわち、コート
していないコントロールインサートを通過して浸潤した
細胞に対する、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリッ
クスでコートしたインサートを通過して浸潤した細胞の
割合として表した。

【００３６】コートしたインサートのタンパク質染色 コートの分散の均一性を評価するために、コートしたイ
ンサートを、インサート表面全体のタンパク質含有量を
水準化するためのクマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
Ｂｌｕｅ）で染色した。コートしたインサートを、室
温で２時間、緩衝生理食塩水（ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａ
ｌｉｎｅ）で再水和した。再水和溶液を慎重に取り除
き、クマシー染色溶液（１ｍｇ／ｍｌ クマシーブリリ
アントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎ
ｔ Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０の１０％酢酸、４０％メタノ
ール溶液）で置き換えた。３０分後、染色液を慎重に取
り除き、インサートを蒸留水で２回リンスし、風乾させ
た。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックス付着の
特性を１００×の倍率で評価した。

【００３７】実施例３ 本発明の細胞培養装置を使用した浸潤アッセイの結果 この実施例は、本発明の方法に従って調製された細胞培
養用インサートが、望ましい性能仕様に従って機能する
ことを示すものである。この仕様は下の表１に示され、
この表では、ＮＩＨ ３Ｔ３（３Ｔ３）細胞が非浸潤性
腫瘍細胞を代表し、ＨＴ−１０８０細胞が転移性腫瘍細
胞を代表している。

【００３８】

【表１】

【００３９】本発明の細胞培養用インサートを、ＮＩＨ
３Ｔ３細胞およびＨＴ−１０８０細胞の基底膜マトリ
ックスに浸潤する能力について試験した。固定および染
色したインサートを、上記のように試験し、浸潤および
パターンの程度を評価した。これらの評価の結果を以下
に詳述する。

【００４０】本発明の細胞培養装置は、コントロールＮ
ＩＨ ３Ｔ３細胞、すなわち非浸潤細胞の浸潤を本質的
に示さなかった。しかし、ＨＴ−１０８０腫瘍細胞の浸
潤の程度は高かった。細胞培養表面全体にわたる高度に
均一な腫瘍細胞移動がもたらされ、浸潤ＨＴ−１０８０
細胞は、各インサートの表面全体に均一に分散した。本
発明の細胞培養装置には、浸潤細胞のパターン、すなわ
ち濃い中央の点または環などは見られなかった。本実施
例の結果は、２４ウェルインサート、ならびに２４マル
チウェルインサートの両方でそれぞれ実証された。この
方法によってメンブレン表面全体に均一に広がるＭＡＴ
ＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックスの薄く、均一なコ
ートにより、腫瘍浸潤アッセイ完了までの時間短縮が可
能になる。

フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 アーサー マイルズ アメリカ合衆国 01718 マサチューセッ ツ州 アクトン グレート エルム ウェ イ 401 (72)発明者 スティーブン アール．イルズリー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ボ ストン シルマー ロード ７ (72)発明者 フランク ジェイ．マヌザ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ケ ルムズフォード ケンブリッジ ストリー ト ３ Ｆターム(参考） 4B029 AA01 BB11 CC02 DF10 4B065 AA90X BB25 BC46 BD11 CA60

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 すぐに使用できる（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−
   ｕｓｅ）均一に分散した細胞外マトリックスを基質に提
   供する方法であって、 ａ）細胞外マトリックス成分を基質面に塗布すること、 ｂ）前記細胞外マトリックス成分を、前記基質面上でイ
   ンキュベートして重合させること、 ｃ）前記重合した細胞外マトリックス成分を、前記基質
   面上で凍結させること、 ｄ）前記凍結させた細胞外マトリックス成分を、前記基
   質面上で凍結乾燥すること、 ｅ）前記凍結乾燥された細胞外マトリックスの温度を室
   温まで上昇させることを含むことを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 前記細胞外マトリックス成分を、前記細
   胞外マトリックスがゲルを形成するのに十分な時間イン
   キュベートすることを特徴とする、請求項１に記載の方
   法。
3. 【請求項３】 前記細胞外マトリックス成分を、高温で
   インキュベートすることを特徴とする、請求項１に記載
   の方法。
4. 【請求項４】 前記細胞外マトリックス成分を、約３７
   ℃の温度でインキュベートすることを特徴とする、請求
   項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記細胞外マトリックス成分を、二酸化
   炭素の存在下でインキュベートすることを特徴とする、
   請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記二酸化炭素の濃度が５％であること
   を特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記重合した細胞外マトリックスを、凍
   結乾燥機中で凍結させることを特徴とする、請求項１に
   記載の方法。
8. 【請求項８】 前記重合した細胞外マトリックスを、−
   ３０℃より低温で凍結させることを特徴とする、請求項
   １に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記細胞外マトリックス成分が、天然の
   コラーゲン原繊維を含むことを特徴とする、請求項１に
   記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記細胞外マトリックス成分が、さら
    にラミニン、エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）、ヘパ
    ラン硫酸プロテオグリカン、増殖因子、プロテイナー
    ゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される成
    分を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記基質が、多孔膜、エッチング（ｅｔ
    ｃｈｅｄ）膜、キャスト（ｃａｓｔ）膜、およびそれら
    の組合せからなる群から選択される膜材料であることを
    特徴とする、請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記膜が、インサートメンブレン表面
    １ｃｍ^２当たり約０．５から約３０μｇの膜孔を有する
    ことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記基質が、セルロース膜、多孔性ポ
    リカーボネート、多孔性ポリテトラフルオロエチレン、
    ナイロン膜およびメッシュ、ガラスフィルター、多孔性
    ポリエチレンテレフタラート、ポリメチルペンタン、ポ
    リプロピレン、ポリエチレンおよびそれらの組合せから
    なる群から選択される天然または合成重合体を含むこと
    を特徴とする、請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 細胞増殖を目的とした表面を含む細胞
    培養装置であって、前記表面が細胞外マトリックスでコ
    ートされ、前記マトリックスが、 ａ）細胞外マトリックス成分を基質面に塗布すること、 ｂ）前記細胞外マトリックス成分を、前記基質面上でイ
    ンキュベートして重合させること、 ｃ）前記重合した細胞外マトリックスを前記基質面上で
    凍結させること、 ｄ）前記凍結させた細胞外マトリックスを前記基質面上
    で凍結乾燥させること、 ｅ）前記凍結乾燥させた細胞外マトリックスの温度を室
    温まで上昇させることを含む諸ステップによって形成さ
    れることを特徴とする、細胞培養装置。
15. 【請求項１５】 前記装置がさらに増殖培地を含むこと
    を特徴とする、請求項１４に記載の装置。
16. 【請求項１６】 前記培地がＤＭＥＭであることを特徴
    とする、請求項１５に記載の装置。
17. 【請求項１７】 前記培養装置がさらに細胞、抗体、酵
    素、受容体、増殖因子、細胞外マトリックスの追加の成
    分、サイトカイン、ホルモン、薬剤、およびそれらの組
    合せからなる群から選択される追加の材料を含むことを
    特徴とする、請求項１４に記載の装置。
18. 【請求項１８】 細胞をその上で増殖させるようになさ
    れた表面、および前記表面をコートする細胞外マトリッ
    クスを含み、前記マトリックスコーティングが生理活性
    タンパク質溶液の重合生成物を含み、前記マトリックス
    中にある流体が凍結乾燥によって実質上取り除かれるこ
    とを特徴とする細胞培養装置。