JPH11164684A - 動物臓器の再構築方法 - Google Patents
動物臓器の再構築方法Info
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- JPH11164684A JPH11164684A JP10195755A JP19575598A JPH11164684A JP H11164684 A JPH11164684 A JP H11164684A JP 10195755 A JP10195755 A JP 10195755A JP 19575598 A JP19575598 A JP 19575598A JP H11164684 A JPH11164684 A JP H11164684A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ヒト以外の動物臓器に脈管系より細胞分
散溶液を灌流した後に、細胞培養液を灌流することによ
り臓器を再構築することを特徴とする動物臓器の再構築
方法。 【効果】 動物臓器の大部分の構成細胞を分離すること
なく臓器を再構築して長期間培養することができる。
散溶液を灌流した後に、細胞培養液を灌流することによ
り臓器を再構築することを特徴とする動物臓器の再構築
方法。 【効果】 動物臓器の大部分の構成細胞を分離すること
なく臓器を再構築して長期間培養することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物臓器より再構
築器官を作製し、その再構築器官を長期間にわたり器官
培養する方法に関する。本発明は、医薬品・化粧品・化
学品等の薬効毒性評価、人工臓器の開発、もしくは移植
臓器の保存等に有用である。
築器官を作製し、その再構築器官を長期間にわたり器官
培養する方法に関する。本発明は、医薬品・化粧品・化
学品等の薬効毒性評価、人工臓器の開発、もしくは移植
臓器の保存等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】従来、動物臓器の器官培養には、良好な
細胞生存率を維持して培養できる胎児（幼胚）器官が主
に用いられてきた。その理由は、器官が十分に小さく、
またその器官の特徴として低酸素状態にも比較的強いた
めである。一方、ラットやマウスなどの小動物の成熟臓
器は、器官培養に関し、厚さが約２mm以下にスライスさ
れていれば１週間程度培養できる尿管、精管、子宮、気
管、動脈、唾液腺、乳腺、前立腺、精嚢、肺臓、甲状
腺、副甲状腺、脳下垂体、松果体、卵巣、皮膚、白色脂
肪組織、リンパ節、交感神経節、眼などの臓器と厚さが
約２mm以下にスライスされていても数日間の培養が困難
である脳、肝臓、胸腺、脾臓、骨髄、精巣、膵臓、腎
臓、副腎、脊髄神経節などの臓器に分類されてきた［Tr
owell, O. A.,Exp. Cell Res., 16, 118-147 (195
9)］。その後、器官培養が困難であるとされていた成熟
ラットの肝臓で、厚さが約0.5 mmで断面積が1.0 〜1.5
mm2 のスライスを95％ O2 ／５％CO2 の条件下で１週間
程度培養できるという方法が確立された（Campbell, A.
K. 及びC. N. Hales, Exp. Cell Res., 68, 33-42 (19
71) ］。さらにその後、臓器を正確に数百μm の厚さで
迅速に、かつ外傷を最小限にして薄切できるスライサー
が開発され［Krumdieck, C. L.ら, Analyt. Biochem.,1
04, 118-123 (1980) 、Smith, P. F.ら, Life Sci., 3
6, 1367-1375 (1985）］、今日では肝臓、腎臓、肺臓、
心臓などの臓器についてスライス器官の至適な培養条件
（スライス用バッファー、培養液、スライスの厚さ、良
好な細胞生存率を維持できる最短培養時間と培養システ
ム等）も確立されるに至り、薬理学や毒性学の分野のみ
ならず多くの分野で利用されている［Parrish, A. R.
ら, Life Sci., 57, 1887-1901 (1995) ］。
細胞生存率を維持して培養できる胎児（幼胚）器官が主
に用いられてきた。その理由は、器官が十分に小さく、
またその器官の特徴として低酸素状態にも比較的強いた
めである。一方、ラットやマウスなどの小動物の成熟臓
器は、器官培養に関し、厚さが約２mm以下にスライスさ
れていれば１週間程度培養できる尿管、精管、子宮、気
管、動脈、唾液腺、乳腺、前立腺、精嚢、肺臓、甲状
腺、副甲状腺、脳下垂体、松果体、卵巣、皮膚、白色脂
肪組織、リンパ節、交感神経節、眼などの臓器と厚さが
約２mm以下にスライスされていても数日間の培養が困難
である脳、肝臓、胸腺、脾臓、骨髄、精巣、膵臓、腎
臓、副腎、脊髄神経節などの臓器に分類されてきた［Tr
owell, O. A.,Exp. Cell Res., 16, 118-147 (195
9)］。その後、器官培養が困難であるとされていた成熟
ラットの肝臓で、厚さが約0.5 mmで断面積が1.0 〜1.5
mm2 のスライスを95％ O2 ／５％CO2 の条件下で１週間
程度培養できるという方法が確立された（Campbell, A.
K. 及びC. N. Hales, Exp. Cell Res., 68, 33-42 (19
71) ］。さらにその後、臓器を正確に数百μm の厚さで
迅速に、かつ外傷を最小限にして薄切できるスライサー
が開発され［Krumdieck, C. L.ら, Analyt. Biochem.,1
04, 118-123 (1980) 、Smith, P. F.ら, Life Sci., 3
6, 1367-1375 (1985）］、今日では肝臓、腎臓、肺臓、
心臓などの臓器についてスライス器官の至適な培養条件
（スライス用バッファー、培養液、スライスの厚さ、良
好な細胞生存率を維持できる最短培養時間と培養システ
ム等）も確立されるに至り、薬理学や毒性学の分野のみ
ならず多くの分野で利用されている［Parrish, A. R.
ら, Life Sci., 57, 1887-1901 (1995) ］。
【０００３】良好な細胞生存率を維持した器官の培養に
は、その器官を構成する内部の全細胞への栄養供給の効
率と器官の内部で産生された老廃物除去の効率が重要で
ある。生体内の器官ではこれらの役割は毛細血管網によ
り果たされているが、器官培養系では毛細血管網は機能
していないので、これらの効率を上昇させるために従来
の器官培養法では、摘出した成熟臓器の外傷を最小限に
して可能な限り薄くスライスしていた。
は、その器官を構成する内部の全細胞への栄養供給の効
率と器官の内部で産生された老廃物除去の効率が重要で
ある。生体内の器官ではこれらの役割は毛細血管網によ
り果たされているが、器官培養系では毛細血管網は機能
していないので、これらの効率を上昇させるために従来
の器官培養法では、摘出した成熟臓器の外傷を最小限に
して可能な限り薄くスライスしていた。
【０００４】成熟臓器を摘出した器官の状態で培養でき
る技術及びある程度厚いスライスの状態（数〜数十mm）
で培養できる技術が確立されれば、医薬品、化粧品、化
学品等の薬効毒性評価、人工臓器の開発、もしくは移植
臓器の保存法としての応用などをはじめ、さまざまな医
薬学分野に貢献すると考えられる。しかしながら、現在
では器官培養が困難であるとされてきた成熟臓器をスラ
イスすることなく摘出した器官の状態で培養すること、
もしくはある程度厚いスライスの状態（数〜数十mm）で
培養することは、培養している器官の内部で良好な細胞
生存率を維持できないために行われなくなった。また、
現在でも柔らかい臓器を薄くスライスする場合におこる
外傷の問題は依然として残っている。
る技術及びある程度厚いスライスの状態（数〜数十mm）
で培養できる技術が確立されれば、医薬品、化粧品、化
学品等の薬効毒性評価、人工臓器の開発、もしくは移植
臓器の保存法としての応用などをはじめ、さまざまな医
薬学分野に貢献すると考えられる。しかしながら、現在
では器官培養が困難であるとされてきた成熟臓器をスラ
イスすることなく摘出した器官の状態で培養すること、
もしくはある程度厚いスライスの状態（数〜数十mm）で
培養することは、培養している器官の内部で良好な細胞
生存率を維持できないために行われなくなった。また、
現在でも柔らかい臓器を薄くスライスする場合におこる
外傷の問題は依然として残っている。
【０００５】上記の問題を解決するために、従来の器官
培養の方法をさまざまな観点から抜本的に改善して、培
養液を容易に通液できる毛細血管網様構造を保持した器
官の培養法を創出する検討が進められてきた。既に、毛
細血管網様構造を導入した器官様構造体を培養細胞より
再構築する技術として、イネの繊維状根もしくは綿製ガ
ーゼを動物細胞の培養液の通液路担体として応用しその
周囲に動物細胞を自己組織形成させて器官様構造体を作
製する方法が知られている（特開平7-67626 、特開平7-
298876）。
培養の方法をさまざまな観点から抜本的に改善して、培
養液を容易に通液できる毛細血管網様構造を保持した器
官の培養法を創出する検討が進められてきた。既に、毛
細血管網様構造を導入した器官様構造体を培養細胞より
再構築する技術として、イネの繊維状根もしくは綿製ガ
ーゼを動物細胞の培養液の通液路担体として応用しその
周囲に動物細胞を自己組織形成させて器官様構造体を作
製する方法が知られている（特開平7-67626 、特開平7-
298876）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、動物
臓器を摘出した器官の状態またはある程度厚いスライス
の状態（数〜数十mm）で培養する方法を提供することに
ある。
臓器を摘出した器官の状態またはある程度厚いスライス
の状態（数〜数十mm）で培養する方法を提供することに
ある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、動物器官
が保持している毛細血管網を細胞分散溶液で処理するこ
とで人工的に微細空洞化構造のネットワークに変換し
て、さらに器官の物理的強度を増すために細胞培養液等
で処理して毛細血管網様構造を有した器官を再構築する
ことを検討した結果、動物臓器に脈管系より細胞分散溶
液を灌流した後に、さらに細胞培養液を灌流することで
その臓器の大部分の構成細胞を分離することなく臓器を
再構築して培養する器官培養の方法を見出した。即ち、
本発明は、動物臓器に脈管系より細胞分散溶液を灌流し
た後に、細胞培養液を灌流することにより臓器を再構築
することを特徴とする動物臓器の再構築方法および当該
方法により再構築された動物臓器の再構築器官に関す
る。
が保持している毛細血管網を細胞分散溶液で処理するこ
とで人工的に微細空洞化構造のネットワークに変換し
て、さらに器官の物理的強度を増すために細胞培養液等
で処理して毛細血管網様構造を有した器官を再構築する
ことを検討した結果、動物臓器に脈管系より細胞分散溶
液を灌流した後に、さらに細胞培養液を灌流することで
その臓器の大部分の構成細胞を分離することなく臓器を
再構築して培養する器官培養の方法を見出した。即ち、
本発明は、動物臓器に脈管系より細胞分散溶液を灌流し
た後に、細胞培養液を灌流することにより臓器を再構築
することを特徴とする動物臓器の再構築方法および当該
方法により再構築された動物臓器の再構築器官に関す
る。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明で用いられる動物臓器は、
生体内にあるものであっても、予め生体外に取り出した
ものであってもよい。動物臓器としては、ヒト、サル、
ウシ、羊、ヒヒ、ブタ、イヌ、モルモット、ラット、マ
ウス等の哺乳動物の臓器であればとくに限定されない
が、例えば、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓または肺臓等が挙
げられる。
生体内にあるものであっても、予め生体外に取り出した
ものであってもよい。動物臓器としては、ヒト、サル、
ウシ、羊、ヒヒ、ブタ、イヌ、モルモット、ラット、マ
ウス等の哺乳動物の臓器であればとくに限定されない
が、例えば、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓または肺臓等が挙
げられる。
【０００９】本発明で用いられる細胞分散溶液として
は、細胞を分散できる能力を有する溶液であればいずれ
でも用いられるが、例えば、プロテアーゼ、糖または核
酸を分解する能力を有する酵素またはキレート剤を含む
溶液が単独もしくは組み合わせて用いられる。プロテア
ーゼとしては、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパー
ゼ、エラスターゼ、パパイン、マトリックスメタロプロ
テアーゼ[Matrix MetaloProtease (MMP) ] 等が挙げら
れる。糖または核酸を分解する能力を有するデポリメラ
ーゼとしては、ヒアルロニダーゼ等の糖を分解する能力
を有する酵素、デオキシリボヌクレアーゼ等の核酸分解
酵素等が挙げられる。キレート剤としては、とくに制限
はないが、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等が挙げられ
る。当該細胞分散液は、直接動物臓器に灌流してもよい
が、予め、平衡塩類溶液を灌流し、臓器より血液を除去
した後に灌流することが好ましい。平衡塩類溶液として
は、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水[Pho
sphate Buffer Saline (PBS)]、肝灌流液(Liver Perfus
ion Medium)等の溶液が用いられる。
は、細胞を分散できる能力を有する溶液であればいずれ
でも用いられるが、例えば、プロテアーゼ、糖または核
酸を分解する能力を有する酵素またはキレート剤を含む
溶液が単独もしくは組み合わせて用いられる。プロテア
ーゼとしては、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパー
ゼ、エラスターゼ、パパイン、マトリックスメタロプロ
テアーゼ[Matrix MetaloProtease (MMP) ] 等が挙げら
れる。糖または核酸を分解する能力を有するデポリメラ
ーゼとしては、ヒアルロニダーゼ等の糖を分解する能力
を有する酵素、デオキシリボヌクレアーゼ等の核酸分解
酵素等が挙げられる。キレート剤としては、とくに制限
はないが、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等が挙げられ
る。当該細胞分散液は、直接動物臓器に灌流してもよい
が、予め、平衡塩類溶液を灌流し、臓器より血液を除去
した後に灌流することが好ましい。平衡塩類溶液として
は、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水[Pho
sphate Buffer Saline (PBS)]、肝灌流液(Liver Perfus
ion Medium)等の溶液が用いられる。
【００１０】本発明で用いられる動物には、血液の凝固
を阻止し、細胞分散液及び／または平衡塩類溶液の通過
を容易にするために、本発明方法に供する前に、予め血
液凝固阻止剤を投与しておくか、血液凝固阻止剤を平衡
塩類溶液及び／または細胞分散溶液に添加することが好
ましい。血液凝固阻止剤としては、血液の凝固を阻止で
きるものであればいかなるものでもよく、例えば、ヘパ
リン、クマリン誘導体等が用いられる。
を阻止し、細胞分散液及び／または平衡塩類溶液の通過
を容易にするために、本発明方法に供する前に、予め血
液凝固阻止剤を投与しておくか、血液凝固阻止剤を平衡
塩類溶液及び／または細胞分散溶液に添加することが好
ましい。血液凝固阻止剤としては、血液の凝固を阻止で
きるものであればいかなるものでもよく、例えば、ヘパ
リン、クマリン誘導体等が用いられる。
【００１１】本発明に用いられる細胞培養液としては、
動物細胞を培養する能力を有する細胞培養液であればい
かなるものでも用いられる。例えば、ダルベッコ改変イ
ーグル培地等が好適に用いられる。当該細胞培養液を灌
流させることにより、カルシウムに依存した細胞の結合
を再構築することができるが、細胞外マトリックスの結
合の再構築のためには、当該細胞培養液には、血清及び
／または細胞外マトリックス成分が含有されていること
が好ましい。細胞外マトリックスとしては、コラーゲ
ン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、プ
ロテオグリカン、グリコサミノグリカン等が用いられ
る。当該血清及び／または細胞外マトリックス成分は、
同種の動物由来であっても、異種動物由来であってもよ
い。また、当該細胞培養液には、同種または異種動物由
来の培養細胞が含有されていることが好ましい。
動物細胞を培養する能力を有する細胞培養液であればい
かなるものでも用いられる。例えば、ダルベッコ改変イ
ーグル培地等が好適に用いられる。当該細胞培養液を灌
流させることにより、カルシウムに依存した細胞の結合
を再構築することができるが、細胞外マトリックスの結
合の再構築のためには、当該細胞培養液には、血清及び
／または細胞外マトリックス成分が含有されていること
が好ましい。細胞外マトリックスとしては、コラーゲ
ン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、プ
ロテオグリカン、グリコサミノグリカン等が用いられ
る。当該血清及び／または細胞外マトリックス成分は、
同種の動物由来であっても、異種動物由来であってもよ
い。また、当該細胞培養液には、同種または異種動物由
来の培養細胞が含有されていることが好ましい。
【００１２】本発明に係る細胞分散液の灌流量及び灌流
時間は、用いる動物臓器に従って適宜決められるが、通
常、２０〜３５ｍｌ／分の流量で、５〜１５分間灌流す
る。また、細胞培養液の灌流量及び灌流時間は、用いる
臓器に従って適宜決められるが、通常、０．５〜５０ｍ
ｌ／分、好ましくは、１〜３ｍｌ／分の流量で、２０秒
〜３時間、好ましくは５〜３０分間灌流する。
時間は、用いる動物臓器に従って適宜決められるが、通
常、２０〜３５ｍｌ／分の流量で、５〜１５分間灌流す
る。また、細胞培養液の灌流量及び灌流時間は、用いる
臓器に従って適宜決められるが、通常、０．５〜５０ｍ
ｌ／分、好ましくは、１〜３ｍｌ／分の流量で、２０秒
〜３時間、好ましくは５〜３０分間灌流する。
【００１３】本発明の方法により再構築した動物臓器の
器官を生体より分離し、当該再構築器官のまま、または
当該再構築器官をスライスして培養容器に移し再構築器
官を培養することができる。また、培養容器に移した
後、当該再構築器官またはそのスライスを細胞外マトリ
ックス成分を含有するハイドロゲルに包埋培養すること
により、当該再構築器官またはそのスライスをハイドロ
ゲル中で支持および保護することができる。これによ
り、再構築器官をより効果的に培養することが可能であ
る。当該方法において、ハイドロゲルとしては、再構築
器官またはそのスライスを支持または保護できるもので
あればいかなるものでもよく、例えば、コラーゲンゲル
等が挙げられる。
器官を生体より分離し、当該再構築器官のまま、または
当該再構築器官をスライスして培養容器に移し再構築器
官を培養することができる。また、培養容器に移した
後、当該再構築器官またはそのスライスを細胞外マトリ
ックス成分を含有するハイドロゲルに包埋培養すること
により、当該再構築器官またはそのスライスをハイドロ
ゲル中で支持および保護することができる。これによ
り、再構築器官をより効果的に培養することが可能であ
る。当該方法において、ハイドロゲルとしては、再構築
器官またはそのスライスを支持または保護できるもので
あればいかなるものでもよく、例えば、コラーゲンゲル
等が挙げられる。
【００１４】本発明により培養した器官の形態及び機能
の検出は、常法に従って行うことができる。例えば、ヘ
マトキシリン・エオシン染色、抗コラーゲン抗体等を用
いた免疫染色等を用いて検出することができる。本発明
の方法により、動物臓器の大部分の構成細胞を分離する
ことなく再構築して、長期間にわたり再構築器官を培養
することができる。
の検出は、常法に従って行うことができる。例えば、ヘ
マトキシリン・エオシン染色、抗コラーゲン抗体等を用
いた免疫染色等を用いて検出することができる。本発明
の方法により、動物臓器の大部分の構成細胞を分離する
ことなく再構築して、長期間にわたり再構築器官を培養
することができる。
【００１５】
【実施例】実施例１ ラット肝臓からの再構築器官の作
製 ＳＤラット（６週令、雄、170 〜200g）にエーテルを嗅
がせ軽く麻酔をかけてから、腹腔内に0.2 mlのネンブタ
ール（ネンブタール注射液）を注射して深麻酔期とし、
さらに尾静脈へ0.2 mlのヘパリン［100 units / ml；ノ
ボ社製ヘパリン注1000をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で10倍希釈したもの］を注射した。消毒用エタノー
ルを噴霧して全身を消毒した後、ラットを手術台にのせ
た。手術用ハサミで皮膚、腹筋の順に開腹した後、消毒
用エタノールを浸した滅菌ガーゼで腸を向かって右側に
寄せて門脈を十分に露出させた。門脈に縫合糸のループ
をかけ眼科用ハサミの先端で門脈に切れ目を入れた後、
切開部から溢れ出る血液をカニューレ先端から滴下する
前灌流用緩衝液［終濃度 5単位／mlヘパリン、200 単位
／mlペニシリン、および 200μg / mlストレプトマイシ
ンを添加した肝灌流溶液(Liver Perfusion Medium ；GI
BCO BRL 社製、カタログ番号 17701-038）］で洗い流し
ながら、すばやく門脈の切開面からカニューレを挿入し
縫合糸で結紮した。同時に肝臓下の下大静脈を切断し
て、20 ml ／分の流速でペリスタポンプを作動させて、
38℃に保温した前灌流用緩衝液を約２分間灌流して放血
した。切断した肝臓下の下大静脈を鉗子で結紮した後、
胸郭部を切開した。横隔膜下の下大静脈に縫合糸のルー
プをかけ眼科用ハサミの先端で下大静脈に切れ目を入れ
た後、切開部から灌流液回収用カニューレを挿入し縫合
糸で結紮した。この状態で20ml ／分の流速でペリスタ
ポンプを作動させて、38℃に保温した前灌流用緩衝液を
５分間灌流した。次に、灌流液をコラゲナーゼおよびデ
ィスパーゼを含有する肝細胞分離液［終濃度 1単位／ml
ヘパリンを添加した肝細胞分離液(Liver Digest Mediu
m；GIBCO BRL 社製、カタログ番号 17703-034）］に替
えて、20 ml ／分の流速でペリスタポンプを作動させ
て、38℃に保温したこの肝細胞分離液を１１分間灌流し
た。さらに、灌流液を0.5 ％Ｉ型アテロコラーゲン（KO
KEN CELLGENI-PC；フナコシ社製、カタログ番号KO-1115
-02）と細胞培養液（10％牛胎児血清、20 mM HEPES 、1
00 単位／mlペニシリン、および 100μg ／mlストレプ
トマイシン含有のダルベッコ改変イーグル培地）との１
対９均一混合溶液に変えて、2ml／分の流速でペリスタ
ポンプを作動させて、４℃に冷却したこの均一混合溶液
（Ｉ型アテロコラーゲンの終濃度 0.05 ％）を１０分間
灌流した。その後さらに、灌流液を0.5 ％Ｉ型アテロコ
ラーゲンと細胞培養液との１対１均一混合溶液に変え
て、2 ml／分の流速でペリスタポンプを作動させて、４
℃に冷却したこの均一混合溶液（Ｉ型アテロコラーゲン
の終濃度 0.25 ％）を１０分間灌流した。門脈および下
大静脈のカニューレ挿入部位より肝臓側を縫合糸で結紮
して各々のカニューレを脱着した後、肝臓を横隔膜の一
部と門脈および下大静脈の結紮部位までと共に摘出し
た。摘出した肝臓は、直径10 cm のシャーレ内に注いだ
40 ml の細胞培養液で２回洗浄した後、40 ml の新鮮な
細胞培養液を注いだシャーレへ移して、5.0 ％CO2 、95
%空気、37℃の保湿インキュベータ内で２時間培養する
ことで灌流したコラーゲンを完全にゲル化させた。上述
の工程で得られたコラゲナーゼおよびディスパーゼを含
有する肝細胞分離液を灌流した直後に摘出した肝臓、お
よびＩ型アテロコラーゲンと細胞培養液との均一混合溶
液を灌流した後に摘出して２時間培養した肝臓を、それ
ぞれ10％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、常法に従い
脱水し、パラフィン包埋し、葉の中心付近で４μm の厚
さの切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色およ
び抗Ｉ型コラーゲン抗体（コスモ・バイオ社製、カタロ
グ番号LB-1197)を用いた免疫染色を行った。その結果、
コラゲナーゼおよびディスパーゼを含有する肝細胞分離
液を灌流した直後に摘出した肝臓では微細空洞化構造の
ネットワークが形成されているものの大部分の肝構成細
胞は分離されることなく存在しており、抗Ｉ型コラーゲ
ン抗体の免疫染色は陰性であること、またＩ型アテロコ
ラーゲンと細胞培養液との均一混合溶液を灌流した後に
摘出して２時間培養した肝臓では形成された微細空洞化
構造のネットワーク内には抗Ｉ型コラーゲン抗体の免疫
染色が陽性となり外来性ゲル化コラーゲンが満ちている
ことが光学顕微鏡による観測により確認された（図１か
ら４参照）。
製 ＳＤラット（６週令、雄、170 〜200g）にエーテルを嗅
がせ軽く麻酔をかけてから、腹腔内に0.2 mlのネンブタ
ール（ネンブタール注射液）を注射して深麻酔期とし、
さらに尾静脈へ0.2 mlのヘパリン［100 units / ml；ノ
ボ社製ヘパリン注1000をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で10倍希釈したもの］を注射した。消毒用エタノー
ルを噴霧して全身を消毒した後、ラットを手術台にのせ
た。手術用ハサミで皮膚、腹筋の順に開腹した後、消毒
用エタノールを浸した滅菌ガーゼで腸を向かって右側に
寄せて門脈を十分に露出させた。門脈に縫合糸のループ
をかけ眼科用ハサミの先端で門脈に切れ目を入れた後、
切開部から溢れ出る血液をカニューレ先端から滴下する
前灌流用緩衝液［終濃度 5単位／mlヘパリン、200 単位
／mlペニシリン、および 200μg / mlストレプトマイシ
ンを添加した肝灌流溶液(Liver Perfusion Medium ；GI
BCO BRL 社製、カタログ番号 17701-038）］で洗い流し
ながら、すばやく門脈の切開面からカニューレを挿入し
縫合糸で結紮した。同時に肝臓下の下大静脈を切断し
て、20 ml ／分の流速でペリスタポンプを作動させて、
38℃に保温した前灌流用緩衝液を約２分間灌流して放血
した。切断した肝臓下の下大静脈を鉗子で結紮した後、
胸郭部を切開した。横隔膜下の下大静脈に縫合糸のルー
プをかけ眼科用ハサミの先端で下大静脈に切れ目を入れ
た後、切開部から灌流液回収用カニューレを挿入し縫合
糸で結紮した。この状態で20ml ／分の流速でペリスタ
ポンプを作動させて、38℃に保温した前灌流用緩衝液を
５分間灌流した。次に、灌流液をコラゲナーゼおよびデ
ィスパーゼを含有する肝細胞分離液［終濃度 1単位／ml
ヘパリンを添加した肝細胞分離液(Liver Digest Mediu
m；GIBCO BRL 社製、カタログ番号 17703-034）］に替
えて、20 ml ／分の流速でペリスタポンプを作動させ
て、38℃に保温したこの肝細胞分離液を１１分間灌流し
た。さらに、灌流液を0.5 ％Ｉ型アテロコラーゲン（KO
KEN CELLGENI-PC；フナコシ社製、カタログ番号KO-1115
-02）と細胞培養液（10％牛胎児血清、20 mM HEPES 、1
00 単位／mlペニシリン、および 100μg ／mlストレプ
トマイシン含有のダルベッコ改変イーグル培地）との１
対９均一混合溶液に変えて、2ml／分の流速でペリスタ
ポンプを作動させて、４℃に冷却したこの均一混合溶液
（Ｉ型アテロコラーゲンの終濃度 0.05 ％）を１０分間
灌流した。その後さらに、灌流液を0.5 ％Ｉ型アテロコ
ラーゲンと細胞培養液との１対１均一混合溶液に変え
て、2 ml／分の流速でペリスタポンプを作動させて、４
℃に冷却したこの均一混合溶液（Ｉ型アテロコラーゲン
の終濃度 0.25 ％）を１０分間灌流した。門脈および下
大静脈のカニューレ挿入部位より肝臓側を縫合糸で結紮
して各々のカニューレを脱着した後、肝臓を横隔膜の一
部と門脈および下大静脈の結紮部位までと共に摘出し
た。摘出した肝臓は、直径10 cm のシャーレ内に注いだ
40 ml の細胞培養液で２回洗浄した後、40 ml の新鮮な
細胞培養液を注いだシャーレへ移して、5.0 ％CO2 、95
%空気、37℃の保湿インキュベータ内で２時間培養する
ことで灌流したコラーゲンを完全にゲル化させた。上述
の工程で得られたコラゲナーゼおよびディスパーゼを含
有する肝細胞分離液を灌流した直後に摘出した肝臓、お
よびＩ型アテロコラーゲンと細胞培養液との均一混合溶
液を灌流した後に摘出して２時間培養した肝臓を、それ
ぞれ10％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、常法に従い
脱水し、パラフィン包埋し、葉の中心付近で４μm の厚
さの切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色およ
び抗Ｉ型コラーゲン抗体（コスモ・バイオ社製、カタロ
グ番号LB-1197)を用いた免疫染色を行った。その結果、
コラゲナーゼおよびディスパーゼを含有する肝細胞分離
液を灌流した直後に摘出した肝臓では微細空洞化構造の
ネットワークが形成されているものの大部分の肝構成細
胞は分離されることなく存在しており、抗Ｉ型コラーゲ
ン抗体の免疫染色は陰性であること、またＩ型アテロコ
ラーゲンと細胞培養液との均一混合溶液を灌流した後に
摘出して２時間培養した肝臓では形成された微細空洞化
構造のネットワーク内には抗Ｉ型コラーゲン抗体の免疫
染色が陽性となり外来性ゲル化コラーゲンが満ちている
ことが光学顕微鏡による観測により確認された（図１か
ら４参照）。
【００１６】実施例２ ラット肝臓より作製した再構築
器官の培養 実施例１で得られたＩ型アテロコラーゲンと細胞培養液
との均一混合溶液を灌流した後に摘出して２時間培養し
た再構築肝臓より、付着していた横隔膜、門脈、および
下大静脈を手術用ハサミで除去し、さらに手術用ハサミ
で各葉に分離した。分離した各葉は、直径35mmのシャー
レ（Falcon社製、カタログ番号1008）内に予め作製して
おいた2 mlの0.25％Ｉ型コラーゲンゲル上に一葉ずつの
せて、さらに2 〜 5 ml の0.25％Ｉ型コラーゲンゾルを
葉を覆うように注いだ後、5.0 ％CO2 、95％空気、37℃
の保湿インキュベータ内で１日培養することでコラーゲ
ンゲルに包埋した。再構築した肝臓の葉を包埋したコラ
ーゲンゲルを取り出して、それぞれ10 ml の新鮮な細胞
培養液を注いだ直径6 cmのシャーレ（Falcon社製、カタ
ログ番号 1007 ）内に移し入れて、5.0 ％CO2 、95％空
気、37℃の保湿インキュベータ内で培養した（図５参
照）。細胞培養液は、１日おきに交換した。再構築した
肝臓の葉をコラーゲンゲルに包埋培養して、１日目、１
週間目、２週間目、３週間目および１ヶ月目に、それぞ
れ 10 ％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、常法に従い
脱水し、パラフィン包埋し、葉の中心付近で４μm の厚
さの切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色およ
び抗Ｉ型コラーゲン抗体を用いた免疫染色を行った。そ
の結果、１日目以降１ヶ月間培養した後でさえ、再構築
した肝臓の葉内部には組織学的に健康な細胞を多数観察
することができ、また、細胞の周囲には抗Ｉ型コラーゲ
ン抗体の免疫染色が陽性となり外来性ゲル化コラーゲン
が満ちていることが光学顕微鏡による観測により確認さ
れた（図６から１５参照）。なお、上述の0.25％Ｉ型コ
ラーゲンゲルは、0.5 ％Ｉ型コラーゲン（KOKEN CELLGE
N I-AC；フナコシ社製、カタログ番号KO-1115-00）と細
胞培養液との１対１均一混合溶液（0.25％Ｉ型コラーゲ
ンゾル）を、5.0 ％CO2 、95 %空気、37℃の保湿インキ
ュベータ内で30分間以上十分にゲル化させて作製した。
器官の培養 実施例１で得られたＩ型アテロコラーゲンと細胞培養液
との均一混合溶液を灌流した後に摘出して２時間培養し
た再構築肝臓より、付着していた横隔膜、門脈、および
下大静脈を手術用ハサミで除去し、さらに手術用ハサミ
で各葉に分離した。分離した各葉は、直径35mmのシャー
レ（Falcon社製、カタログ番号1008）内に予め作製して
おいた2 mlの0.25％Ｉ型コラーゲンゲル上に一葉ずつの
せて、さらに2 〜 5 ml の0.25％Ｉ型コラーゲンゾルを
葉を覆うように注いだ後、5.0 ％CO2 、95％空気、37℃
の保湿インキュベータ内で１日培養することでコラーゲ
ンゲルに包埋した。再構築した肝臓の葉を包埋したコラ
ーゲンゲルを取り出して、それぞれ10 ml の新鮮な細胞
培養液を注いだ直径6 cmのシャーレ（Falcon社製、カタ
ログ番号 1007 ）内に移し入れて、5.0 ％CO2 、95％空
気、37℃の保湿インキュベータ内で培養した（図５参
照）。細胞培養液は、１日おきに交換した。再構築した
肝臓の葉をコラーゲンゲルに包埋培養して、１日目、１
週間目、２週間目、３週間目および１ヶ月目に、それぞ
れ 10 ％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、常法に従い
脱水し、パラフィン包埋し、葉の中心付近で４μm の厚
さの切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色およ
び抗Ｉ型コラーゲン抗体を用いた免疫染色を行った。そ
の結果、１日目以降１ヶ月間培養した後でさえ、再構築
した肝臓の葉内部には組織学的に健康な細胞を多数観察
することができ、また、細胞の周囲には抗Ｉ型コラーゲ
ン抗体の免疫染色が陽性となり外来性ゲル化コラーゲン
が満ちていることが光学顕微鏡による観測により確認さ
れた（図６から１５参照）。なお、上述の0.25％Ｉ型コ
ラーゲンゲルは、0.5 ％Ｉ型コラーゲン（KOKEN CELLGE
N I-AC；フナコシ社製、カタログ番号KO-1115-00）と細
胞培養液との１対１均一混合溶液（0.25％Ｉ型コラーゲ
ンゾル）を、5.0 ％CO2 、95 %空気、37℃の保湿インキ
ュベータ内で30分間以上十分にゲル化させて作製した。
【００１７】実施例３ ラット肝臓から再構築した器官
への外来性細胞の導入 ＳＤラット（７週令、雄、170 〜200g）にエーテルを嗅
がせ軽く麻酔をかけてから、腹腔内に0.2 mlのネンブタ
ール（ネンブタール注射液）を注射して深麻酔期とし、
さらに尾静脈へ0.2 mlのヘパリン（100 units / ml；ノ
ボ・ヘパリン注1000をＰＢＳで10倍希釈したもの）を注
射した。消毒用エタノールを噴霧して全身を消毒した
後、ラットを手術台にのせた。手術用ハサミで皮膚、腹
筋の順に開腹した後、消毒用エタノールを浸した滅菌ガ
ーゼで腸を向かって右側に寄せて門脈を十分に露出させ
た。門脈に縫合糸のループをかけ眼科用ハサミの先端で
門脈に切れ目を入れた後、切開部から溢れ出る血液をカ
ニューレ先端から滴下する前灌流用緩衝液（終濃度 5 u
nits / ml ヘパリン、200 units / mlペニシリン、およ
び 200μg / mlストレプトマイシンを添加した肝灌流溶
液 (Liver PerfusionMedium；GIBCO BRL 社製、カタロ
グ番号 17701-038）で洗い流しながら、すばやく門脈の
切開面からカニューレを挿入し縫合糸で結紮した。同時
に肝臓下の下大静脈を切断して、20 ml / 分の流速でペ
リスタポンプを作動させて、 38 ℃に保温した前灌流用
緩衝液を約２分間灌流して放血した。切断した肝臓下の
下大静脈を鉗子で結紮した後、胸郭部を切開した。横隔
膜下の下大静脈に縫合糸のループをかけ眼科用ハサミの
先端で下大静脈に切れ目を入れた後、切開部から灌流液
回収用カニューレを挿入し縫合糸で結紮した。この状態
で20 ml / 分の流速でペリスタポンプを作動させて、38
℃に保温した前灌流用緩衝液を５分間灌流した。次に、
灌流液をコラゲナーゼおよびディスパーゼを含有する肝
細胞分離液［終濃度1 units / ml ヘパリンを添加した
肝細胞分離液(Liver Digest Medium；GIBCOBRL 社製、
カタログ番号 17703-034) ］に変えて、20 ml / 分の流
速でペリスタポンプを作動させて、38℃に保温したこの
肝細胞分離液を１１分間灌流した。さらに、予め2 μM
カルセインAM (calcein AM; LIVE/DEAD Viability/Cyto
toxicity kit；Molecular Probes社製、カタログ番号 L
-3224 ）で約30分間蛍光標識した約1 x 105 / mlのヒト
真皮由来線維芽細胞を懸濁した細胞培養液（10 %牛胎児
血清、20 mM HEPES 、100 units / mlペニシリン、およ
び 100μg / mlストレプトマイシン含有のダルベッコ改
変イーグル培地）を20 ml / 分の流速でペリスタポンプ
を作動させて、５分間灌流した。門脈および下大静脈の
カニューレ挿入部位より肝臓側を縫合糸で結紮してカニ
ューレを脱着した後、肝臓を横隔膜の一部と門脈および
下大静脈の結紮部位までと共に摘出した。摘出した肝臓
は、直径10cm のシャーレ内に注いだ40 ml の細胞培養
液で２回洗浄した後、40 ml の新鮮な細胞培養液を注い
だシャーレへ移して、5.0 % CO2 、95 %空気、37℃の保
湿インキュベータ内で約３時間培養した。上述の工程で
得られたカルセインAMで蛍光標識したヒト真皮由来線維
芽細胞を灌流した肝臓を、十分量のリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）で洗浄して倒立蛍光顕微鏡で観察した。そ
の結果、カルセインAMで蛍光標識したヒト真皮由来線維
芽細胞は再構築した肝臓内に導入され分布していること
が確認された。
への外来性細胞の導入 ＳＤラット（７週令、雄、170 〜200g）にエーテルを嗅
がせ軽く麻酔をかけてから、腹腔内に0.2 mlのネンブタ
ール（ネンブタール注射液）を注射して深麻酔期とし、
さらに尾静脈へ0.2 mlのヘパリン（100 units / ml；ノ
ボ・ヘパリン注1000をＰＢＳで10倍希釈したもの）を注
射した。消毒用エタノールを噴霧して全身を消毒した
後、ラットを手術台にのせた。手術用ハサミで皮膚、腹
筋の順に開腹した後、消毒用エタノールを浸した滅菌ガ
ーゼで腸を向かって右側に寄せて門脈を十分に露出させ
た。門脈に縫合糸のループをかけ眼科用ハサミの先端で
門脈に切れ目を入れた後、切開部から溢れ出る血液をカ
ニューレ先端から滴下する前灌流用緩衝液（終濃度 5 u
nits / ml ヘパリン、200 units / mlペニシリン、およ
び 200μg / mlストレプトマイシンを添加した肝灌流溶
液 (Liver PerfusionMedium；GIBCO BRL 社製、カタロ
グ番号 17701-038）で洗い流しながら、すばやく門脈の
切開面からカニューレを挿入し縫合糸で結紮した。同時
に肝臓下の下大静脈を切断して、20 ml / 分の流速でペ
リスタポンプを作動させて、 38 ℃に保温した前灌流用
緩衝液を約２分間灌流して放血した。切断した肝臓下の
下大静脈を鉗子で結紮した後、胸郭部を切開した。横隔
膜下の下大静脈に縫合糸のループをかけ眼科用ハサミの
先端で下大静脈に切れ目を入れた後、切開部から灌流液
回収用カニューレを挿入し縫合糸で結紮した。この状態
で20 ml / 分の流速でペリスタポンプを作動させて、38
℃に保温した前灌流用緩衝液を５分間灌流した。次に、
灌流液をコラゲナーゼおよびディスパーゼを含有する肝
細胞分離液［終濃度1 units / ml ヘパリンを添加した
肝細胞分離液(Liver Digest Medium；GIBCOBRL 社製、
カタログ番号 17703-034) ］に変えて、20 ml / 分の流
速でペリスタポンプを作動させて、38℃に保温したこの
肝細胞分離液を１１分間灌流した。さらに、予め2 μM
カルセインAM (calcein AM; LIVE/DEAD Viability/Cyto
toxicity kit；Molecular Probes社製、カタログ番号 L
-3224 ）で約30分間蛍光標識した約1 x 105 / mlのヒト
真皮由来線維芽細胞を懸濁した細胞培養液（10 %牛胎児
血清、20 mM HEPES 、100 units / mlペニシリン、およ
び 100μg / mlストレプトマイシン含有のダルベッコ改
変イーグル培地）を20 ml / 分の流速でペリスタポンプ
を作動させて、５分間灌流した。門脈および下大静脈の
カニューレ挿入部位より肝臓側を縫合糸で結紮してカニ
ューレを脱着した後、肝臓を横隔膜の一部と門脈および
下大静脈の結紮部位までと共に摘出した。摘出した肝臓
は、直径10cm のシャーレ内に注いだ40 ml の細胞培養
液で２回洗浄した後、40 ml の新鮮な細胞培養液を注い
だシャーレへ移して、5.0 % CO2 、95 %空気、37℃の保
湿インキュベータ内で約３時間培養した。上述の工程で
得られたカルセインAMで蛍光標識したヒト真皮由来線維
芽細胞を灌流した肝臓を、十分量のリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）で洗浄して倒立蛍光顕微鏡で観察した。そ
の結果、カルセインAMで蛍光標識したヒト真皮由来線維
芽細胞は再構築した肝臓内に導入され分布していること
が確認された。
【００１８】比較例１ 放血処理したラット肝臓の器官
培養 実施例１で得られた前灌流用緩衝液を灌流した直後に摘
出した肝臓を２時間培養した後、付着していた横隔膜、
門脈、および下大静脈を手術用ハサミで除去し、さらに
手術用ハサミで各葉に分離した。分離した各葉は、それ
ぞれ 10 mlの新鮮な細胞培養液を注いだ直径6 cmのシャ
ーレ（Falcon社製、カタログ番号1007）内に移し入れ
て、5.0 ％CO2 、95％空気、37℃の保湿インキュベータ
内で培養した。細胞培養液は、毎日交換した。培養して
２時間目、および３日目に、それぞれ10％中性緩衝ホル
マリン溶液で固定し、常法に従い脱水し、パラフィン包
埋し、葉の中心付近で４μm の厚さの切片を作製し、ヘ
マトキシリン・エオシン染色を行った。その結果、培養
して２時間目の肝臓の葉では放血が十分に行われている
ので赤血球は観察できないが、肝構成細胞は健康な組織
形態を呈していること、さらに、培養して３日目の肝臓
の葉ではその肝構成細胞の大部分が壊死した組織形態を
呈していることが光学顕微鏡により観察された（図１６
から１７参照）。
培養 実施例１で得られた前灌流用緩衝液を灌流した直後に摘
出した肝臓を２時間培養した後、付着していた横隔膜、
門脈、および下大静脈を手術用ハサミで除去し、さらに
手術用ハサミで各葉に分離した。分離した各葉は、それ
ぞれ 10 mlの新鮮な細胞培養液を注いだ直径6 cmのシャ
ーレ（Falcon社製、カタログ番号1007）内に移し入れ
て、5.0 ％CO2 、95％空気、37℃の保湿インキュベータ
内で培養した。細胞培養液は、毎日交換した。培養して
２時間目、および３日目に、それぞれ10％中性緩衝ホル
マリン溶液で固定し、常法に従い脱水し、パラフィン包
埋し、葉の中心付近で４μm の厚さの切片を作製し、ヘ
マトキシリン・エオシン染色を行った。その結果、培養
して２時間目の肝臓の葉では放血が十分に行われている
ので赤血球は観察できないが、肝構成細胞は健康な組織
形態を呈していること、さらに、培養して３日目の肝臓
の葉ではその肝構成細胞の大部分が壊死した組織形態を
呈していることが光学顕微鏡により観察された（図１６
から１７参照）。
【００１９】比較例２ 無処理のラット肝臓の器官培養 ＳＤラット（６週令、雄、170 〜200g）にエーテルを嗅
がせ軽く麻酔をかけてから、腹腔内に0.2 mlのネンブタ
ールを注射して深麻酔期とした。消毒用エタノールを噴
霧して全身を消毒した後、ラットを手術台にのせた。手
術用ハサミで皮膚、腹筋の順に開腹した後、消毒用エタ
ノールを浸した滅菌ガーゼで腸を向かって右側に寄せて
門脈を十分に露出させた。次に、胸郭部を切開した。門
脈および横隔膜下の下大静脈に縫合糸のループをかけて
結紮した。この状態で10分間放置した後、肝臓を横隔膜
の一部と門脈および下大静脈の結紮部位までと共に摘出
した。摘出した肝臓を２時間培養した後、付着していた
横隔膜、門脈、および下大静脈を手術用ハサミで除去
し、さらに手術用ハサミで各葉に分離した。分離した各
葉は、それぞれ 10 mlの新鮮な細胞培養液を注いだ直径
6 cmのシャーレ（Falcon社製、カタログ番号 1007 ）内
に移し入れて、5.0 ％CO2 、95％空気、37℃の保湿イン
キュベータ内で培養した。細胞培養液は、毎日交換し
た。培養して２時間目、および３日目に、それぞれ 10
％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、常法に従い脱水
し、パラフィン包埋し、葉の中心付近で４μm の厚さの
切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行っ
た。その結果、培養して２時間目の肝臓の葉では赤血球
の存在する類洞腔や中心静脈が観察できて肝構成細胞は
健康な組織形態を呈していること、さらに、培養して３
日目の肝臓の葉ではその肝構成細胞のほとんど全てが壊
死した組織形態を呈していることが光学顕微鏡により観
察された（図１８から１９参照）。
がせ軽く麻酔をかけてから、腹腔内に0.2 mlのネンブタ
ールを注射して深麻酔期とした。消毒用エタノールを噴
霧して全身を消毒した後、ラットを手術台にのせた。手
術用ハサミで皮膚、腹筋の順に開腹した後、消毒用エタ
ノールを浸した滅菌ガーゼで腸を向かって右側に寄せて
門脈を十分に露出させた。次に、胸郭部を切開した。門
脈および横隔膜下の下大静脈に縫合糸のループをかけて
結紮した。この状態で10分間放置した後、肝臓を横隔膜
の一部と門脈および下大静脈の結紮部位までと共に摘出
した。摘出した肝臓を２時間培養した後、付着していた
横隔膜、門脈、および下大静脈を手術用ハサミで除去
し、さらに手術用ハサミで各葉に分離した。分離した各
葉は、それぞれ 10 mlの新鮮な細胞培養液を注いだ直径
6 cmのシャーレ（Falcon社製、カタログ番号 1007 ）内
に移し入れて、5.0 ％CO2 、95％空気、37℃の保湿イン
キュベータ内で培養した。細胞培養液は、毎日交換し
た。培養して２時間目、および３日目に、それぞれ 10
％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、常法に従い脱水
し、パラフィン包埋し、葉の中心付近で４μm の厚さの
切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行っ
た。その結果、培養して２時間目の肝臓の葉では赤血球
の存在する類洞腔や中心静脈が観察できて肝構成細胞は
健康な組織形態を呈していること、さらに、培養して３
日目の肝臓の葉ではその肝構成細胞のほとんど全てが壊
死した組織形態を呈していることが光学顕微鏡により観
察された（図１８から１９参照）。
【００２０】
【発明の効果】本発明により、ヒト以外の動物臓器に脈
管系より細胞分散溶液を灌流した後に、細胞培養液を灌
流することにより臓器を再構築することを特徴とする動
物臓器の再構築方法が提供される。本発明の方法によ
り、動物臓器の大部分の構成細胞を分離することなく臓
器を再構築して長期間培養することができる。
管系より細胞分散溶液を灌流した後に、細胞培養液を灌
流することにより臓器を再構築することを特徴とする動
物臓器の再構築方法が提供される。本発明の方法によ
り、動物臓器の大部分の構成細胞を分離することなく臓
器を再構築して長期間培養することができる。
【図１】は、コラゲナーゼおよびディスパーゼを含有す
る肝細胞分離液を灌流した直後に摘出した肝臓のヘマト
キシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示
す。
る肝細胞分離液を灌流した直後に摘出した肝臓のヘマト
キシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示
す。
【図２】は、コラゲナーゼおよびディスパーゼを含有す
る肝細胞分離液を灌流した直後に摘出した肝臓の抗Ｉ型
コラーゲン抗体の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を
示す。
る肝細胞分離液を灌流した直後に摘出した肝臓の抗Ｉ型
コラーゲン抗体の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を
示す。
【図３】は、Ｉ型アテロコラーゲンと細胞培養液との均
一混合溶液を灌流した後に摘出して２時間培養した肝臓
のヘマトキシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写真
像図を示す。
一混合溶液を灌流した後に摘出して２時間培養した肝臓
のヘマトキシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写真
像図を示す。
【図４】は、Ｉ型アテロコラーゲンと細胞培養液との均
一混合溶液を灌流した後に摘出して２時間培養した肝臓
の抗Ｉ型コラーゲン抗体の免疫染色切片の光学顕微鏡写
真像図を示す。
一混合溶液を灌流した後に摘出して２時間培養した肝臓
の抗Ｉ型コラーゲン抗体の免疫染色切片の光学顕微鏡写
真像図を示す。
【図５】は、本発明により再構築した肝臓の葉を包埋し
たコラーゲンゲルを直径6 cmのシャーレ内で２週間培養
した写真像図を示す。
たコラーゲンゲルを直径6 cmのシャーレ内で２週間培養
した写真像図を示す。
【図６】は、本発明により再構築した肝臓の葉をコラー
ゲンゲルに包埋培養して１日目のヘマトキシリン・エオ
シン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
ゲンゲルに包埋培養して１日目のヘマトキシリン・エオ
シン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
【図７】は、本発明により再構築した肝臓の葉をコラー
ゲンゲルに包埋培養して１日目の抗Ｉ型コラーゲン抗体
の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
ゲンゲルに包埋培養して１日目の抗Ｉ型コラーゲン抗体
の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
【図８】は、本発明により再構築した肝臓の葉をコラー
ゲンゲルに包埋培養して１週間目のヘマトキシリン・エ
オシン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
ゲンゲルに包埋培養して１週間目のヘマトキシリン・エ
オシン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
【図９】は、本発明により再構築した肝臓の葉をコラー
ゲンゲルに包埋培養して１週間目の抗Ｉ型コラーゲン抗
体の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
ゲンゲルに包埋培養して１週間目の抗Ｉ型コラーゲン抗
体の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
【図１０】は、本発明により再構築した肝臓の葉をコラ
ーゲンゲルに包埋培養して２週間目のヘマトキシリン・
エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
ーゲンゲルに包埋培養して２週間目のヘマトキシリン・
エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
【図１１】は、本発明により再構築した肝臓の葉をコラ
ーゲンゲルに包埋培養して２週間目の抗Ｉ型コラーゲン
抗体の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
ーゲンゲルに包埋培養して２週間目の抗Ｉ型コラーゲン
抗体の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
【図１２】は、本発明により再構築した肝臓の葉をコラ
ーゲンゲルに包埋培養して３週間目のヘマトキシリン・
エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
ーゲンゲルに包埋培養して３週間目のヘマトキシリン・
エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
【図１３】は、本発明により再構築した肝臓の葉をコラ
ーゲンゲルに包埋培養して３週間目の抗Ｉ型コラーゲン
抗体の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
ーゲンゲルに包埋培養して３週間目の抗Ｉ型コラーゲン
抗体の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
【図１４】は、本発明により再構築した肝臓の葉をコラ
ーゲンゲルに包埋培養して１ヶ月目のヘマトキシリン・
エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
ーゲンゲルに包埋培養して１ヶ月目のヘマトキシリン・
エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
【図１５】は、本発明により再構築した肝臓の葉をコラ
ーゲンゲルに包埋培養して１ヶ月目の抗Ｉ型コラーゲン
抗体の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
ーゲンゲルに包埋培養して１ヶ月目の抗Ｉ型コラーゲン
抗体の免疫染色切片の光学顕微鏡写真像図を示す。
【図１６】は、放血処理した肝臓の葉を培養して２時間
目のヘマトキシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写
真像図を示す。
目のヘマトキシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写
真像図を示す。
【図１７】は、放血処理した肝臓の葉を培養して３日目
のヘマトキシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写真
像図を示す。
のヘマトキシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写真
像図を示す。
【図１８】は、無処理の肝臓の葉を培養して２時間目の
ヘマトキシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像
図を示す。
ヘマトキシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像
図を示す。
【図１９】は、無処理の肝臓の葉を培養して３日目のヘ
マトキシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像図
を示す。
マトキシリン・エオシン染色切片の光学顕微鏡写真像図
を示す。
Claims (21)
- 【請求項１】 動物臓器に脈管系より細胞分散溶液を灌
流した後に、細胞培養液を灌流することにより臓器を再
構築することを特徴とする動物臓器の再構築方法。 - 【請求項２】 動物が哺乳動物である請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 動物がヒト以外の哺乳動物である請求項
１記載の方法。 - 【請求項４】 請求項１記載の方法により再構築した動
物臓器の器官を生体より分離し、当該再構築器官のま
ま、または当該再構築器官をスライスして培養容器に移
し培養することを特徴とする再構築器官の培養方法。 - 【請求項５】 動物臓器が生体内にあるものであること
を特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 動物臓器が予め生体外に取り出したもの
であることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 動物臓器が肝臓、腎臓、膵臓、脾臓また
は肺臓であることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 細胞分散溶液が蛋白質分解酵素、糖また
は核酸を分解する能力を有する酵素及びキレート剤から
選ばれる１種以上を含有する溶液であることを特徴とす
る請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 蛋白質分解酵素が、コラゲナーゼ、トリ
プシン、ディスパーゼ、エラスターゼ、パパイン及びマ
トリックスメタロプロテアーゼから選ばれる１種以上で
ある請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 糖または核酸を分解する能力を有する
酵素が、ヒアルロニダーゼ及びデオキシリボヌクレアー
ゼから選ばれる１種以上である請求項８記載の方法。 - 【請求項１１】 キレート剤がＥＤＴＡ及びＥＧＴＡか
ら選ばれる１種以上である請求項８記載の方法。 - 【請求項１２】 細胞分散溶液を灌流する前に、平衡塩
類溶液を灌流し、臓器より血液を除去することを特徴と
する請求項１の方法。 - 【請求項１３】 予め血液凝固阻止剤を投与した動物を
用いることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項１４】 血液凝固阻止剤を平衡塩類溶液及び／
または細胞分散溶液に添加することを特徴とする請求項
１または請求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】 細胞培養液が血清及び／または細胞外
マトリックス成分を含有していることを特徴とする請求
項１記載の方法。 - 【請求項１６】 細胞外マトリックス成分がコラーゲン
である請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 血清または細胞外マトリックス成分が
同種もしくは異種動物由来であることを特徴とする請求
項１５または１６記載の方法。 - 【請求項１８】 細胞培養液が同種または異種動物由来
の培養細胞を含有していることを特徴とする請求項１５
記載の方法。 - 【請求項１９】 請求項１記載の方法により再構築した
動物臓器の器官を生体より分離し、当該再構築器官のま
ま、または当該再構築器官をスライスして培養容器に移
した後、当該再構築器官またはそのスライスを細胞外マ
トリックス成分を含有するハイドロゲルに包埋培養する
ことを特徴とする再構築器官の培養方法。 - 【請求項２０】 ハイドロゲルがコラーゲンゲルである
請求項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 請求項１記載の方法により再構築され
た動物臓器の再構築器官。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10195755A JPH11164684A (ja) | 1997-07-10 | 1998-07-10 | 動物臓器の再構築方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18540097 | 1997-07-10 | ||
| JP26566297 | 1997-09-30 | ||
| JP9-185400 | 1997-09-30 | ||
| JP9-265662 | 1997-09-30 | ||
| JP10195755A JPH11164684A (ja) | 1997-07-10 | 1998-07-10 | 動物臓器の再構築方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11164684A true JPH11164684A (ja) | 1999-06-22 |
Family
ID=27325551
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10195755A Withdrawn JPH11164684A (ja) | 1997-07-10 | 1998-07-10 | 動物臓器の再構築方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11164684A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003024056A (ja) * | 2001-06-06 | 2003-01-28 | Becton Dickinson & Co | すぐに使用できる均一に分散した細胞外マトリックスを基質に提供する方法 |
| JPWO2008102602A1 (ja) * | 2007-02-22 | 2010-05-27 | 国立大学法人 東京大学 | Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを利用した臓器再生法 |
| WO2011093268A1 (ja) * | 2010-01-29 | 2011-08-04 | 株式会社オーガンテクノロジーズ | 臓器又は組織の灌流培養方法及び灌流培養装置 |
-
1998
- 1998-07-10 JP JP10195755A patent/JPH11164684A/ja not_active Withdrawn
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003024056A (ja) * | 2001-06-06 | 2003-01-28 | Becton Dickinson & Co | すぐに使用できる均一に分散した細胞外マトリックスを基質に提供する方法 |
| JPWO2008102602A1 (ja) * | 2007-02-22 | 2010-05-27 | 国立大学法人 東京大学 | Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを利用した臓器再生法 |
| JP2014121329A (ja) * | 2007-02-22 | 2014-07-03 | Univ Of Tokyo | Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを利用した臓器再生法 |
| JP2015061525A (ja) * | 2007-02-22 | 2015-04-02 | 国立大学法人 東京大学大学 | Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを利用した臓器再生法 |
| JP2016195605A (ja) * | 2007-02-22 | 2016-11-24 | 国立大学法人 東京大学 | Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを利用した臓器再生法 |
| JP2018138048A (ja) * | 2007-02-22 | 2018-09-06 | 国立大学法人 東京大学 | Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを利用した臓器再生法 |
| JP2020078327A (ja) * | 2007-02-22 | 2020-05-28 | 国立大学法人 東京大学 | Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを利用した臓器再生法 |
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| JPWO2011093268A1 (ja) * | 2010-01-29 | 2013-06-06 | 株式会社オーガンテクノロジーズ | 臓器又は組織の灌流培養方法及び灌流培養装置 |
| US8771931B2 (en) | 2010-01-29 | 2014-07-08 | Organ Technologies, Inc. | Perfusion culture method and perfusion culture device for organ or tissue |
| JP5881422B2 (ja) * | 2010-01-29 | 2016-03-09 | 株式会社オーガンテクノロジーズ | 臓器又は組織の灌流培養方法及び灌流培養装置 |
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