CN112300258B - 具有抗炎丝胶蛋白肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有抗炎丝胶蛋白肽及其应用，丝胶蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，改蛋白肽可以通过将茧片经预处理后，再用水进行提取，获得丝胶蛋白经水解制得；也可以通过人工合成；获得的丝胶蛋白具有抑制炎症因子的效果，因此可以用于制备抗炎制剂。

Description

具有抗炎丝胶蛋白肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及具有抗炎丝胶蛋白肽，还涉及具有抗炎丝胶蛋白肽的应用。
背景技术
丝胶蛋白原本是缫丝产业的废料，近年来其应用逐渐受到关注。首先，丝胶蛋白的安全性经过了一系列研究认可，其具有在组织工程材料和日化护肤方面应用的前提。其次，其抗氧化性、美白、保湿功效被广泛应用。丝胶蛋白是化妆品原料目录中的功效成分，但是丝胶-1蛋白的分子量大约为400k。作为大分子蛋白，丝胶蛋白在应用时一般要进行水解。但是，但无论是大分子丝胶蛋白，还是水解丝胶蛋白，均未对丝胶蛋白抗LPS诱导产生的炎性因子功能进行过报道。并且挖掘丝胶蛋白中的功效性小分子多肽，有利于丝胶蛋白更深入的应用。
在体外实验中，用LPS刺激RAW264.7细胞，LPS会由聚集形式转化为脂多糖结合蛋白(LPB)，然后转化为单体形式并以白蛋白依赖性方式转移至CD14。接着，LPS转移到TLR4/MD2复合物中以形成TLR4/MD2/LPS活性复合物，该复合物传递信号并激活一系列炎症反应。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁上的标志性结构，抑制LPS引发的炎症反应意味着能够抑制细菌和已被灭菌的细菌碎片作用于人体产生的炎性反应。利用这个模型，可以评估功效物是否具有抗炎能力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有抗炎丝胶蛋白肽；本发明的目的之二在于提供具有抗炎丝胶蛋白肽的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、具有抗炎丝胶蛋白肽，所述具有抗炎丝胶蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、所述具有抗炎丝胶蛋白肽在制备抗炎制剂中的应用。
本发明中，所述具有抗炎丝胶蛋白肽在制备降低炎症反应中炎症因子含量的制剂中的应用。
本发明中，所述炎症因子为IL-1β和IL6。
本发明中，所述炎症反应为LPS引发的炎症反应。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种具有抗炎丝胶蛋白肽及其应用，通过将提取的丝胶蛋白进行水解，从大于两千条多肽信息中筛选到可能具有抗炎效果的多肽，经体外实验发现获得多肽具有抑制炎性因子的功效，是丝胶蛋白中的主要抗炎功效物。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为实时定量PCR检测炎症因子结果。
图2为丝胶蛋白的抗炎效果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、丝胶蛋白的提取
丝胶蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)将蚕茧用水清洗干净；
(2)剪成2*2cm大小的茧片，在120℃烘箱中高温处理2.5h；
(3)按照1:30浴比加入Milli-Q水，在温度为120℃下分别处理1h和2h；
(4)过滤茧片残渣，收集蛋白提取液；
(5)将蛋白提取液冷冻干燥制成粉末，放于-20℃冰箱保存。
分别将高温处理1h得到的丝胶蛋白编号为HS1，高温处理2h得到的丝胶蛋白编号为HS2。
实施例2、丝胶蛋白对抗炎效果
1、细胞培养方法：
将细胞培养于37℃、5％CO2的恒温培养箱中，NIH3T3和HaCaT细胞系用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，RAW264.7细胞系用含10％胎牛血清的1640s培养基培养。所有细胞系每天换液，隔天进行传代。
将实施例1制备的HS1和HS2处理三种细胞，同时以三种市售丝胶蛋白(编号为S1，S2，S3)作为对照，然后通过实时定量PCR和ELISA检测炎症因子。
2、ELISA检测
(1)对细胞进行处理完毕后，吸取细胞培养液，13500rpm离心10min，取上清；现用或储存于-20℃备用。
(2)取微孔板，加入100μL细胞培养样品、标准品、对照至微孔中，每个样品3个重复；密封，室温孵育2h。
(3)移除样品，用清洗缓冲液重复洗涤3次。
(4)每孔加入200μL检测抗体，密封，室温孵育2h。
(5)重复步骤(3)操作。
(6)每孔加入200uL HRP标记的二抗，室温避光孵育20min。
(7)避光，重复步骤(3)操作。
(8)加入100μL TMB底物，密封，室温孵育20～30min。
(9)加入50μL STOP溶液，温和摇匀。
(10)添加STOP溶液后30min内测450nm处吸光度。
3、荧光定量PCR检测
本部分实验包含RNA提取-反转录-荧光定量PCR三部分。具体步骤如下：
RNA提取：
(1)对细胞进行处理，处理完毕后，用PBS洗涤两次。
(2)每106个细胞加入1mL TRIZOL裂解，轻柔吹打混匀后，12000rpm离心10min。
(3)每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入200uL氯仿，室温孵育20min。
(4)4℃，12000rpm离心15min。将上层水相转移到干净无RNA酶的离心管中。
(5)加等体积异丙醇，混匀，孵育10min；4℃，12000rpm离心10min。
(6)去上清，每1mL TRIZOL裂解的样品加入1mL的75％乙醇，混匀后，4℃，7000rpm离心5min。重复1～2次。
(7)去小心吸去乙醇溶液，室温干燥5-10min。
(8)加入40uL左右无RNA酶水，反复吹打使RNA完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
反转录：
(1)用Nano-drop测定RNA的纯度和浓度。
(2)去除体系中的DNA，体系如表1：
表1、去除DNA体系
Figure GDA0003225349040000031
放入金属浴42℃消化2min。
(3)加入10uL 2x super RT Mix(含gDNA digester抑制剂)。
(4)置于PCR仪中进行反转录，条件如表2：
表2、反转录条件
Figure GDA0003225349040000032
Figure GDA0003225349040000041
荧光定量PCR方法：
(1)定量引物见表3。
表3、定量PCR引物
Figure GDA0003225349040000042
(2)反应试剂如表4：
表4、荧光定量PCR反应体系
Figure GDA0003225349040000043
PCR反应过程如表5：
表5、PCR反应过程
Figure GDA0003225349040000044
检测结果如图1所示。结果显示，实施例1制备的HS1和HS2都具有抵抗LPS诱导的炎症因子的能力，并且没有显着差异。而S1，S2，S3的抗炎能力各不相同。
通过比较实时定量PCR和炎症因子ELISA的结果，结果表明丝胶可在一定程度上减轻RAW 264.7细胞的炎症反应：S1，S3，HS1，HS2显示出抑制IL-6和IL-1β产生的能力(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。S1在蛋白质水平上略微抑制TNF-α合成，S3在mRNA和蛋白质水平上略微抑制TNF-α合成，但未显示出显著性差异(P>0.05)。HS1和HS2在mRNA水平(P<0.05)和蛋白质水平(P<0.01)表现出抑制TNF-α合成的能力。S2在mRNA和蛋白质水平上增加了IL-6和IL-1β的合成(#P<0.05，##P<0.01)，也稍微增加了TNF-α的合成(P>0.05)。总体而言，只有HS1和HS2可以抑制三种炎症因子的产生。说明本发明方法提取的丝胶蛋白具有抑制炎症因子的功效，而其他品牌丝胶没有此功效。
实施例3、丝胶蛋白水解及抗炎效果
为了解丝胶蛋白水解后多肽的功能，将丝胶蛋白水解后进行LC-MS/MS检测，LC-MS/MS检测方法如下：
采用FASP酶解法，流程按照酶解-脱盐-质谱分析-蛋白鉴定进行，具体步骤如下：
酶解：
(1)取蛋白质溶液，加入终浓度为100mM的DTT，95-100℃加热5min，冷却至室温。
(2)加入200μL UA缓冲液，混匀。转入30kD超滤离心管中，14000g离心15min，弃滤液。
(3)重复步骤(2)。
(4)加入100μL 100mM的IAA缓冲液，600rpm振荡1min。
(5)置于室温，避光反应30min，14000g离心15min。
(6)加入100μL UA缓冲液，14000g离心15min。
(7)重复步骤(6)两次，以去除DTT和IAA。
(8)加入100μL 25mM NH4HCO3溶液，14000g离心15min
(9)重复步骤(8)两次，以去除UA。
(10)加入40μL Trypsin，600rpm振荡1min，密封，37℃酶解16-18h。
(11)换新收集管，14000g离心15min，再加入4、40μL 25mM NH4HCO3，14000g离心15min，收集滤液。
脱盐：
(1)用C18 Cartridge柱对肽段进行脱盐。
(2)肽段冻干后加入40μL 0.1％甲酸溶液复溶，定量。
质谱分析：
(1)按照定量结果，取3uL酶解产物按下列设置进行LC-MS/MS分析。
(2)用HPLC液相系统Easy nLC进行分离。
缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)；色谱柱以95％的A液平衡。
(3)色谱柱：Thermo scientific EASY column(2cm*100μm 5μm-C18)；
分析柱：Thermo scientific EASY column(75μm*100mm 3μm-C18)；
流速：300nL/min。
相关液相梯度如表6所示：
表6、液相梯度
Figure GDA0003225349040000061
(1)肽段经色谱分离后使用进行质谱分析。相关参数如下：
质谱仪：Q-Exactive(Thermo Scientific)；
分析时长：120min；
检测方式：正离子；
母离子扫描范围：300-1800m/z；
一级质谱分辨率：70,000at m/z 200；
AGC target：3e6；
一级Maximum IT：50ms；
多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱(MS2 scan)；
二级质谱分辨率：17,500at m/z 200,Microscans:1,Isolation window:2m/z；
二级Maximum IT：60ms；
MS2 Activation Type：HCD；
Normalized collision energy：27eV；
Dynamic exclusion：60.0s，Underfillratio：0.1％。
蛋白鉴定：
(2)原始文件通过用Mascot查库分析软件进行数据库检索。
搜库时设定如下：
Enzyme：Trypsin；
missed cleavage sites；2；
固定修饰：Carbamidomethyl(C)；
动态修饰：Oxidation(M)和Acetyl(Protein N-term)；
数据库检索肽段的筛选标准：mascot score>20分。
通过水解丝胶蛋白LC-MS/MS检测发现共得到大于两千条多肽信息。通过分子对接和动力学方法，在sybyl-x2.1.1软件进行预测。筛选到丝胶蛋白肽，序列为：
丝胶蛋白肽Ⅲ：GSESAGLSDR(SEQ ID NO.1)；
然后人工合成如SEQ ID NO.1所示的多肽，然后对合成多肽进行实验验证，实验方法采用实施例2的方法，结果如图2所示。结果显示，巨噬细胞RAW264.7经LPS处理后，产生了炎性因子IL-1β和IL6(Blank样本)，而经过丝胶蛋白肽预处理的样本产生的炎性因子则大大减少(Peptide样本)，且其效果比丝胶蛋白对照组好(Sericin样本)。阳性对照多粘菌素B同样减少了炎性因子的产生(PB样本)。结果说明丝胶蛋白肽具有抑制炎性因子的功效，是丝胶蛋白中的主要抗炎功效物。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西南大学
<120> 具有抗炎丝胶蛋白肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ser Glu Ser Ala Gly Leu Ser Asp Arg
1 5 10

Claims (4)

1.具有抗炎丝胶蛋白肽，其特征在于：所述具有抗炎丝胶蛋白肽的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.权利要求1所述具有抗炎 丝胶蛋白肽在制备抗炎制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述具有抗炎丝胶蛋白肽在制备降低炎症反应中炎症因子含量的制剂中的应用，所述炎症因子为IL-1β和IL6。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述炎症反应为LPS引发的炎症反应。
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